BRPI0613142A2

BRPI0613142A2 - uso de sangliferina em hcv

Info

Publication number: BRPI0613142A2
Application number: BRPI0613142-5A
Authority: BR
Inventors: Kai Lin; Beat Weidmann; Kaspar Zimmermann
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-15
Publication date: 2010-12-21
Also published as: MA29600B1; AU2006259348A1; KR20080033274A; RU2427372C2; AR054778A1; EP1893211A1; GT200600262A; US20090221598A1; ECSP078029A; CA2611151A1; EP1893211B1; NO20080351L; ATE524183T1; PE20070118A1; RU2008100587A; ZA200710551B; WO2006138507A1; TNSN07477A1; AU2006259348B2; TW200740438A

Abstract

USO DE SANGLIFERINA EM HCV. A presente invenção refere-se o uso de um composto macrolideo tal como uma sangliferina para o tratamento de prevenção de hepatite C e doenças relacionadas tais como fibrose hepática, cirrose hepática e carcinoma hepatocelular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE SANGLIFERINA EM HCV".

A presente invenção refere-se a um novo uso para compostosmacrolídeos tais como sangliferinas que se ligam a ciclofilinas.

As sangliferinas são uma classe de compostos macrolídeos poli-cíclicos inicialmente isolados de caldos de fermentação de actinomicetos.Foi descoberto que sangliferinas exibem atividades de se ligar a ciclofilinase, no caso de sangliferinas A-D, atividades imunossupressoras e atividadesinibitórias da proliferação de células B e de células T. Entretanto, diferentedos compostos imunossupressores e antiinflamatórios conhecidos tais comociclosporina A e FK506, as sangliferinas não têm atividade de ligação aFKBP ou atividade inibitória de calcineurina. Assim, as sangliferinas forne-cem uma nova categoria de substância de fármaco tanto em termos de es-trutura química como perfis de atividade diferentes.

As sangliferinas e os métodos para sua preparação estão descri-tos em WO 97/02285, WO 98/07743, e US 006124453. Uma série de deri-vados de sangliferina, mini-sangliferinas, estão descritas em J. Am. Chem.Soc 2003, 125 (13), 3849-3859; J. Org. Chem. 2000, 65, 9255-9260; e An-gew. Chem. Int. Ed. 1999, 38(16), 2443-2446.

Surpreendentemente, foi descoberto agora que as sangliferinasde ligação a ciclofilina têm um efeito inibitório contra o vírus da hepatite C(HCV).

Conseqüentemente, a presente invenção fornece o uso de umcomposto de ligação a ciclofilina tal como uma sangliferina para a prevençãoou tratamento de infecções de hepatite C, distúrbios induzidos por HCV ouinibidores da atividade da peptidilprolil cis-trans isomerase, ou condiçõesassociadas com doenças do fígado. Os agentes também podem ser usados,por exemplo, como um tratamento profilático em neonatos nascidos de mãesinfectadas por HCV ou em profissionais de saúde expostos ao vírus ou emreceptores de transplante, por exemplo, receptores de transplante de fígado,para eliminar a possível infecção por HCV recorrente após o transplante.

A presente invenção refere-se ao uso de macrolídeos, referidosaqui coletivamente com "sangliferinas" na prevenção ou tratamento de infec-ções de hepatite C. As sangliferinas são isoladas de caldos de fermentaçãode actinomicetos. As sangliferinas comumente conhecidas incluem sanglife-rina A até D, por exemplo, da fórmula

<formula>formula see original document page 3</formula>

O anel macrocíclico da Sangliferina A a D é caracterizado emque i) as posições 1 a 6 compreendem um resíduo de ácido 3-carboxipiperidazinil carboxílico, ii) as posições 7 a 9, um resíduo de alfa-aminoácido aromático e iii) as posições 10 a 12, um resíduo de alfa-aminoácido alifático. O restante do anel macrocíclico é compreendido por umresíduo de ácido hidróxi carboxílico, que fornece, no caso de Sangliferinas Aaté D, mais 11 átomos de carbono no anel macrocíclico primário.

De acordo com a prática convencional na química de macrolí-deos, os átomos do anel macrocíclico primário de Sangliferina são numera-dos como indicado acima para Sangliferina A, começando com o átomo dogrupo carbonila da ligação de Iactona macrocíclica como posição 1.

As sangliferinas A até D também podem ser caracterizadas pelapresença de um novo sistema Espiro bicíclico acoplado na posição 23 doanel macrocíclico através de um grupo Iigante de hidrocarbila.

As sangliferinas A a D podem ser submetidas à extensa manipu-lação química para se obter ainda macrolídeos adicionais da classe dasSangliferinas. Tais manipulações incluem a clivagem do anel macrocíclico,em particular no grupo óxi da lactona, clivagem do grupo Iigante entre ossistemas de anel de macrolídeo e Espiro e manipulação, por exemplo, prote-ção, derivatização ou outra modificação química de grupamentos substituin-tes; por exemplo, como descrito a seguir. Meios adicionais de modificaçãoficarão aparentes para aqueles versados na técnica.

De acordo com a invenção, foi descoberto que as Sangliferinastêm um perfil característico e totalmente novo em termos de suas atividadesbiológicas contra infecções por hepatite C. Em particular, foi descoberto queelas exibem a combinação de atividades como descrito a seguir.

As sangliferinas tem um perfil de atividade que difere daqueledos compostos imunossupressores e antiinflamatórios previamente conheci-dos, tais como ciclosporinas e macrolídeos, por exemplo, da rapamicina eNIM811, indicando que as Sangliferinas tem um modo de ação diferente detais compostos. Assim, as Sangliferinas fornecem uma nova categoria desubstância de fármaco tanto em termos de estrutura como de atividade, oque pode ser esperado ampliar materialmente os limites da terapia imunos-supressora, antiinflamatória e antiviral; por exemplo, para evitar ou reduzirefeitos colaterais indesejáveis das terapias imunossupressora e antiinflama-tória prévias e/ou melhorar ou ampliar tal terapia para novas áreas de doen-ça ou novas categorias de pacientes.

As sangliferinas, por exemplo, nas quais o anel macrolídeo estána forma de anel aberto, no qual as posições 26 e 27 no Iigante de hidrocar-bila entre os sistemas de anel macrolídeo e espiro são ambas substituídaspor hidróxi, ou no qual o resíduo espiro acoplado ao anel macrocíclico tenhasido clivado ou truncado, geralmente não têm algumas ou todas as combi-nações atividades características de Sangliferina. Por exemplo, Sangliferinasnas quais o resíduo espiro está clivado, possuem tipicamente atividade deligação a ciclofilina mas não possuem atividade imunossupressora significa-tiva. Como ficará aparente para aqueles versados na técnica, entretanto, taiscompostos fornecem componentes, intermediários ou blocos de construçãochave valiosos para a preparação de novas Sangliferinas adicionais, e assimampliam ainda mais o potencial terapêutico da classe das Sangliferinas.

Já que sua presença parece ser essencial para a atividade bio-lógica, por exemplo, das Sangliferinas A a D, o sistema espiro bicíclico tam-bém pode ser visto como fornecendo um componente estrutural com umsignificado biológico chave, útil como um componente estrutural para deriva-tização ou modificação adicional tanto em relação à produção de mais San-gliferinas como para aplicação na derivatização ou modificação de outrassubstâncias de fármaco, por exemplo, para modificar a atividade de outrassubstâncias de fármaco imunossupressoras da classe dos macrolídeos.

Assim sendo, em um primeiro aspecto, a invenção fornece: ummacrolídeo no qual i) as posições 2 a 6 incluídas no anel macrocíclico sãofornecidas por um resíduo de ácido piperidazinil carboxílico; e/ou ii) as posi-ções 7 a 9 incluídas no anel macrocíclico são fornecidas por um resíduo dealfa-aminoácido aromático; e/ou iii) as posições 10 a 12 incluídas no anelmacrocíclico são fornecidas por um resíduo de alfa-aminoácido alifático, naforma livre ou protegida ou um sal desse.

Adequadamente, os macrolídeos da invenção compreendemdois, especialmente todos os três aspectos estruturais característicos i), ii) eiii).

O resíduo de ácido piperidazinil carboxílico é adequadamenteum resíduo de 1,2-piperidazin-3-carbóxi-1-ila do qual a porção carbóxi ocupaa posição 1 e o átomo de nitrogênio 1, a posição 6 do anel macrocíclico, porexemplo um resíduo de fórmula I

<formula>formula see original document page 5</formula>

em que os números designados representam a posição dos átomos do resí-duo no anel macrocíclico. Esse resíduo pode ser substituído ou não substitu-ído no anel. Adequadamente é não substituído.

A porção carbóxi do resíduo de alfa-aminoácido aromático ocupaadequadamente a posição 7 do anel macrocíclico e a porção alfa-amino, aposição 9. Adequadamente, o alfa-aminoácido aromático é uma fenilalaninasubstituída ou não substituída, especialmente por resíduos hidróxi, metóxi,etóxi, OnPr, OiPr, na forma livre, protegida ou ativada.A porção carbóxi do resíduo de alfa-aminoácido alifático ocupaadequadamente a posição 10 do anel macrocíclico, e a porção alfa-amino aposição 12. Adequadamente, o resíduo de alfa-aminoácido alifático é umresíduo de valina na forma livre, protegida ou ativada.

O restante do anel macrocíclico compreende adequadamente,um resíduo de ácido hidróxi carboxílico, cuja porção óxi completa a ligaçãode Iactona macrocíclica e cuja porção carbonila forma uma ligação de amidacom o grupo alfa-amino na posição 12 do anel macrocíclico. O dito resíduode ácido hidróxi carboxílico tem adequadamente uma extensão de cadeia de6 a 20, mais adequadamente de 11 átomos de carbono. Ele pode ser substi-tuído ou não substituído e/ou conter uma ou mais ligações insaturadas, emparticular ligações duplas cumulativas ao longo de sua extensão. Mais ade-quadamente, o restante do anel macrocíclico compreende um resíduo de 11-óxi-undecanoil-11-ila, especialmente 11-óxi-undeca-6,8-dienoil-11-ila, opcio-nalmente substituído, por exemplo, nas posições 2, 3, 4, e/ou 5. Mais ade-quadamente, o dito resíduo de ácido hidróxi carboxílico é um resíduo defórmula Il

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em que R1 é H, OH ou representa uma ligação extra e R2 é H ou representauma ligação extra; R3 é H, e R4 é -CO-CH3 ou -CH(OH)-CH3 ou R3 e R4representam juntos uma estrutura de fórmula

<formula>formula see original document page 6</formula>

na forma livre ou protegida, ou sal desse.

Macrolídeos preferidos de acordo com a invenção são conse-qüentemente aqueles que compreendem um anel macrocíclico de fórmula IV<formula>formula see original document page 7</formula>

em que, X1 Y e Z são resíduos i), ii) e iii) como definido acima e A é um resí-duo de ácido hidróxi carboxílico como definido acima, na forma livre ou pro-tegida ou sal desse; em particular, o anel macrocíclico de fórmula V

<formula>formula see original document page 7</formula>

na forma livre ou protegida, ou sal desse.

Geralmente, nas Sangliferinas, o anel macrocíclico é substituídono átomo de carbono adjacente à porção óxi da ligação de lactona. Tipica-mente esse substituinte compreende um resíduo de 1-oxo-7-aza-espiro-{5.

5}-undecan-8-ona-2-ila, por exemplo, da fórmula Vl

<formula>formula see original document page 7</formula>

em que -a-b- é -(Me)C=CH- ou -(Me)CH-CH(OH)- e R, é H ou Me (em queMe e Et representam metila e etila, respectivamente) na forma livre ou pro-tegida, ou um sal desse ligado ao anel macrolídeo através de um Iigante quecompreende uma seqüência linear de 6 a 11, tipicamente 9 átomos de car-bono entre o resíduo espiro e o anel macrolídeo.

O grupo Iigante pode ser substituído ou não substituído e/ouconter uma ou mais ligações insaturadas, em particular ligações duplas cu-mulativas ao longo de sua extensão. Adequadamente, o grupo Iigante podeser substituído por metila, por exemplo por dois grupos metila. Adequada-mente, o grupo Iigante pode ainda ser substituído por hidróxi, por exemplo,por três substituintes hidróxi e/ou pode ser etilenicamente insaturado, porexemplo, conter ligações duplas carbono-carbono. Mais adequadamente, ogrupo Iigante compreende um resíduo de 1,7-dimetil- nonan-9-ila, especial-mente 1,7-dimetil-non-1-en-9-ila ou 1,7-dimetil-nona-1,3-dien-9-ila, opcio-nalmente substituído, por exemplo, na posição 3, 4 e/ou 8. Preferivelmente1o grupo Iigante é um grupo de fórmula Vll

<formula>formula see original document page 8</formula>

em que c representa ligação ao resíduo espiro; d representa a ligação aoanel macrocíclico e R6 e R7 são cada OH ou juntos representam uma liga-ção adicional, na forma livre ou protegida.

O grupo ligante geralmente estará acoplado ao anel macrocíclicono átomo de carbono imediatamente adjacente ao grupo óxi da lactona, istoé, quando o anel macrocíclico compreende um resíduo de 11-oxi-undecanoil-11 -ila na posição 11 desse.

Conseqüentemente, a invenção fornece compostos de fórmula

<formula>formula see original document page 8</formula>

em que S representa um resíduo espiro bicíclico como previamente definido;L representa um grupo Iigante como previamente definido e M representaum anel macrolídeo como previamente definido, na forma livre ou protegida,ou sais desses.

Compostos particulares da invenção são aqueles de fórmulasIXa e IX.<formula>formula see original document page 7</formula>

em que -a-b—é como definido acima, -e-f- é -CH(OH)-CH(OH)- ou -CH=CH--g-h- é como definido acima para -a-b-, e R3, R4 e R5 são como definidosacima, na forma livre ou protegida ou sais desses.

Os compostos de fórmulas I a IX contêm átomos de carbonoassimétrico e assim podem existir em várias formas epiméricas. Todos osepímeros possíveis assim como as misturas diastereoisoméricas desses sãoabrangidas pela invenção. Entretanto, compostos de fórmulas Vlll e IX nosquais o anel macrolídeo está na forma de um anel fechado e que são de es-tereoquímica apropriada possuem atividades que são características deSangliferinas, como aqui referidas. Epímeros que possuem atividades carac-terísticas de sangliferina são preferidos. Em geral, por exemplo, para usofarmacêutico de acordo com a invenção, epímeros que possuem atividadescaracterísticas de sangliferina na forma pura ou substancialmente pura (istoé, livre ou substancialmente livre de epímeros que não têm de atividadescaracterísticas de sangliferina), por exemplo que compreendem pelo menos90%, por exemplo pelo menos 95% de epímero ativo (isto é, que compreen-dem menos do que 10%, por exemplo, menos do que 5% de epímero inati-vo) serão preferidos.

Preferivelmente, o resíduo de ácido 3-carboxipiperidazinil carbo-xílico i) nas posições 1 a 6 do anel macrocíclico tem a seguinte conformação:

<formula>formula see original document page 10</formula>

Preferivelmente, o aminoácido aromático ii) nas posições 7 a 9do anel macrocíclico tem a configuração L, por exemplo é de configuração

Preferivelmente, o aminoácido alifático iii) nas posições 10 a 12do anel macrocíclico tem a configuração L, por exemplo é de configuração

Quando o restante do anel macrocíclico compreende um resíduode fórmula II, ele preferivelmente tem a configuração<formula>formula see original document page 11</formula>

ou

Quando R3 e R4 juntos preferivelmente são da configuração

Preferivelmente, o resíduo de 1-oxo-7-aza-espiro-{5.5}-undecan-8-ona-2-ila tem a configuração

em que quando -a-b- é -(Me)CH-CH(OH)-, ele preferivelmente tem a configuração

<formula>formula see original document page 11</formula>

Quando o Iigante é de fórmula VII, ele é preferivelmente de configuração

<formula>formula see original document page 11</formula>

Quando R6 e R7 são cada OH, a configuração nas posições 26e 27 é preferivelmente tanto 26(S), 27(S) quanto 26(R), 27(R). Quando R6 eR7 juntos representam uma ligação adicional, a configuração nas posições26 e 27 é preferivelmente

<formula>formula see original document page 12</formula>

Compostos da invenção de fórmula IX têm preferivelmente aseguinte conformação

<formula>formula see original document page 12</formula>

em que quando -a-b- é -(Me)CH-CH(OH)-, ele preferivelmente tem a configu-ração:

<formula>formula see original document page 12</formula>

quando -e-f- é -CH(OH)-CH(OH)-, ele preferivelmente tem a configuração(S)1(S) ou a configuração (R)1(R); quando -g-h- é -(Me) CH-CH(OH)-, ele pre-ferivelmente tem a configuração:

<formula>formula see original document page 12</formula>quando -g-h- é - (Me)C=CH-, ele preferivelmente tem a configuração:

<formula>formula see original document page 13</formula>

e quando R3 e R4 estão fundidos juntos, eles são preferivelmente de configuração:

<formula>formula see original document page 13</formula>

Os compostos da invenção podem estar na forma livre ou prote-gida, por exemplo, nas formas protegidas como descrito em "ProtectiveGroups in Orgariic Synthesis" por T. W. Greene e P. G. M. Wuts, 2- edição,1991, John Wiley & Sons Inc., Nova Iorque. Em particular, grupos OH podemestar na forma protegida, por exemplo, na forma de silil éteres (por exemplo,como descrito nas páginas 68-86 de Greene & Wuts ibid.), ésteres (veja, porexemplo, páginas 87-103 de Greene & Wuts ibid) e carbonatos (veja, porexemplo, páginas 104- 111 de Greene & Wuts ibid). Tais formas protegidastambém incluem formas protegidas internamente; por exemplo, no caso demacrolídeos de fórmula IX, em que -g-h- é -CH(CH3)-CH(OH)-, a forma pro-tegida, onde as posições 14 a 17 do anel macrocíclico compreendem umresíduo de fórmula X:

<formula>formula see original document page 13</formula>

Também por exemplo, 1,3 dióis presentes em Sangliferinas po-dem estar protegidos como estruturas de anel apropriadas, por exemplo co-mo descrito nas páginas 118-142 de Greene & Wuts ibid.

Compostos da invenção também existem na forma de sal. E-xemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis adequados para uso de acor-do com a invenção incluem sais de adição de ácido e de base como apropri-ado, levando em consideração os substituintes particulares presentes nocomposto, por exemplo formas de sal de HCI.

Como indicado anteriormente, o anel macrocíclico dos compos-tos da invenção pode ser clivado, em particular, no grupo óxi da lactona, pa-ra fornecer compostos em que o anel macrocíclico está na forma de anelaberto. Geralmente, a clivagem do grupo óxi da lactona ocorre por hidrólise(solvólise), por exemplo para fornecer compostos macrocíclicos de anel a-berto de fórmula XI:

R6 O-X-Y-Z-A-OH Xl

por exemplo de fórmula Xll

<formula>formula see original document page 14</formula>

por exemplo um composto de fórmula IX1

<formula>formula see original document page 14</formula>

em que Χ, Υ, Z, A, -a-b-, -e-f-, -g-h-, R3, R4 e R5 são como definidos acimae R6 é H ou C1-4 alquila, por exemplo, metila.

Tais formas de anel aberto fornecem meios intermediários paraa modificação do sistema de anel macrocíclico básico de Sangliferina e tam-bém são parte da presente invenção.

Conseqüentemente, em um aspecto adicional a presente inven-ção fornece: um macrolídeo como definido aqui anteriormente em forma deanel aberto, o dito macrocíclico de anel aberto estando na forma livre ou pro-tegida, ou sal desse; um composto R6 O-X-Y-Z-A-OH como definido acima,na forma livre ou protegida, ou sal desse; um composto R6 O-X-Y-Z-A'-CH(OH)-L-S, em que -A'- CH(OH)-é um resíduo de ácido hidróxi carboxíli-co, por exemplo, um resíduo de fórmula II, como definido acima e os outrossímbolos são como definidos acima, na forma livre ou protegida ou um saldesses;

um composto de fórmula Xll'

<formula>formula see original document page 15</formula>

na forma livre ou protegida ou um sal desse;

um composto de fórmula IX'

<formula>formula see original document page 15</formula>

na forma livre ou protegida ou um sal desse.

Em modalidades particulares desse aspecto, a invenção forneceum composto de fórmula IX"<formula>formula see original document page 16</formula>

em que -a-b- é -(Me)C=CH- ou -(Me) CH-CH(OH)-; R8 é H ou -C(O)-ORIO1em que R10 é H ou Me; R9 é H ou, quando -a-b- é -(Me)CH-CH(OH)- e R é -C(O)- OMe, R9 é Me, e X é H quando -N-N- representa uma ligação simplesentre os dois átomos de N, ou X junto com -N--N- representa uma dupla li-gação entre os dois átomos de N, na forma livre ou protegida ou um sal des-se.

Mais particularmente, a invenção fornece compostos das fórmu-

<formula>formula see original document page 16</formula><formula>formula see original document page 17</formula>

A invenção também inclui compostos nos quais o sistema deanel 1 -oxo-7-aza-espiro-{5, 5}-undecan-8-ona-2-ila está na forma de anelaberto, por exemplo um composto de fórmula Xlll

<formula>formula see original document page 17</formula>

em que a, b, L e M são como definidos acima, na forma livre ou protegida ouum sal desse.

Os compostos de anel aberto da invenção são preferivelmentede conformação semelhante às conformações preferidas definidas acimapara compostos de anel fechado.

O sistema de anel espiro biciclo de anel aberto de compostos dafórmula Xlll é preferivelmente de conformação:

<formula>formula see original document page 18</formula>

em que quando -a-b- é -(Me) CH-CH(OH)-,

Em particular, a invenção fornece um composto de fórmula 2(Sangliferina E)

<formula>formula see original document page 18</formula>

na forma livre ou protegida ou um sal desse.

Os compostos das fórmulas IX", S, T, W, Y, Xlll e Z são interme-diários úteis para a preparação de sangliferinas em geral incluindo as formasde anel fechado e as formas de anel fechado de anel expandido.

Os compostos de fórmula IX" podem ser preparados pela cliva-gem do anel macrolídeo de uma sangliferina de anel fechado por exemplo,sangliferina A ou B no grupo óxi da Iactona ou na vizinhança dele. Assini,por exemplo, os compostos de fórmula YeT são preparados pelo tratamen-to de sangliferina A sob condições básicas, por exemplo para o composto defórmula Ill na presença de um hidróxido de metal alcalino e, por exemplo,para o composto de fórmula IV na presença de metanol e um carbonato demetal alcalino.

Alternativamente, compostos de fórmula IX" podem ser obtidoscomo isolados de culturas de um microrganismo que produz sangliferina. Porexemplo, os compostos de fórmulas YeS podem ser obtidos como isoladosde culturas de Streptomyces sp. A92-308110 como descrito aqui a seguir.

O isolamento dos compostos de fórmulas Y e S de culturas deStreptomyces sp. A92-308110 está descrito em US6124453.

O composto de fórmula Z pode ser obtido por clivagem do sis-tema de anel espirobicíclico entre o átomo de nitrogênio e o átomo central dosistema espiro. Alternativamente, o composto de fórmula Z pode ser obtidocomo um isolado de uma cultura de um microrganismo que produz sanglife-rina. Por exemplo, o isolamento do composto de fórmula Z de culturas deStreptomyces sp. A92-308110 está descrito em US6124453.

Macrolídeos de acordo com a invenção que têm um resíduo es-piro biciclo acoplado ao anel macrocíclico também podem ser submetidos àclivagem do grupo Iigante interveniente, por exemplo, em relação a fórmulaIX, em particular na ligação dos resíduos 26 e 27, para produzir novos com-postos Espirobiciclo separados e macrolídeos adicionais. Com também indi-cado anteriormente, esses compostos são úteis como intermediários, a por-ção espiro bicíclica das Sangliferinas tendo, em particular, um papel funcio-nal integral na atividade biológica das Sangliferinas como uma classe.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece um 1-oxo-7-aza-espiro-{5. 5}-undecan-8-ona-2-ila, na forma livre ou protegida ou um saldesse, em particular um composto de fórmula Vl'

<formula>formula see original document page 19</formula>

em que R7 é H, um grupo OH opcionalmente protegido, um grupo reativofuncional ou um grupo -CH2 -CH(OH)- CH(CH3)-CH2 -CH2 -CHO ou o equi-valente de delta Iactol desse, na forma livre ou protegida ou um sal desse.

Preferivelmente, o composto de fórmula Vl' tem a seguinte confi-guração

<formula>formula see original document page 20</formula>

em que quando -a-b- é -(Me)CH-CH(OH)-, ele tem preferivelmente a configu-ração definida anteriormente.

A invenção também inclui um 1 -oxo-7-aza-espiro-{5.5}-undecan-8-ona-2-ila de anel aberto, na forma livre ou protegida ou um sal desse, emparticular um composto de Formula XIII'

<formula>formula see original document page 20</formula>

em que -a-b- e R7 são como definidos anteriormente, na forma livre ou pro-tegida ou um sal desse. O sistema de anel espiro biciclo de anel aberto decompostos de fórmula Xlll1 é preferivelmente de conformação:

<formula>formula see original document page 20</formula>

em que quando -a- b- é -(Me)CH-(OH)-, ele tem preferivelmente a configura-ção definida anteriormente.

A invenção também fornece um macrolídeo de fórmula XIV<formula>formula see original document page 21</formula>

em que M é um anel macrolídeo como definido acima, em particular um ma-crolídeo de macrolídeo de fórmula XV

<formula>formula see original document page 21</formula>

em que quando -g-h- é -(Me) CH-CH(OH)-, ele tem preferivelmente a confi-guração definida anteriormente e quando -g-h- é -(Me)C=CH-, ele tem prefe-rivelmente a configuração como definida anteriormente e quando R3 e R4estão fundidos juntos, eles têm preferivelmente a configuração aqui definida,na forma livre ou protegida ou de anel aberto, ou um sal desse.

A invenção também fornece um macrolídeo particular de fórmula

<formula>formula see original document page 21</formula><formula>formula see original document page 22</formula>

em que X é Η, metóxi, etóxi, OnPr, OiPr;

R14 e R15 são independentemente H, metila, alquila, (CrC^alquila, (CrC4)-CO-CH3, ou R14 e R15 estão fundidos para formar uma cicloalquila de 5 a 7membros substituída ou não substituída, selecionado por exemplo da fórmu-la XVII;

<formula>formula see original document page 22</formula>

R16 é H, ou Me ou (C1-^alquila;

R17 é H, OH, -0-(Ci-4)alquila ou RIA R15 e R17 estão fundidos para formar

<formula>formula see original document page 22</formula>

R23 é H, (Ci-io)alquila de cadeia ramificada ou linear e/ou contém uma oumais ligações insaturadas em particular ligações duplas ou triplas cumulati-vas ao longo de sua extensão, preferivelmente -CH=CH2,-CH2-OH1 -CH2-OCH3, -CHO1-COOH1 ou de fórmula XIX1<formula>formula see original document page 23</formula>

R23 pode ser substituído adequadamente como descrito aqui.

Em outro aspecto da invenção, macrolídeos particulares são se-lecionados da fórmula XX

<formula>formula see original document page 23</formula>

Em um aspecto adicional a invenção inclui os macrolídeos ecompostos da invenção, em particular aqueles que são produtos naturais naforma substancialmente purificada, por exemplo, pelo menos em 90%, prefe-rivelmente em pelo menos 95% especialmente em pelo menos 98% de for-ma pura.

Em uma modalidade particular da invenção, Sangliferinas A, B,CeD, entre outras, são isoladas da nova Streptomyces sp. A92- 308110.Amostras de Streptomyces sp. A92-308110 estão depositadas no DeutscheSammlung νοη Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH, Mascheroder Weg1b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 3 de maio de 1995 sob os termosdo Tratado de Budapeste e foram designadas com o número de depósitoDSM 9954. O isolamento de Sangliferinas A, B, C, e D de culturas de Strep-tomyces sp. A92-30810 está descrito em US6124453.

Macrolídeos de acordo com a invenção, por exemplo compostosde fórmula IX; por exemplo Sangliferinas A, B, C e D e seus sais farmaceuti-camente aceitáveis, daqui por diante genericamente "agentes da invenção"exibem atividades características de sangliferina, isto é, a seguinte combina-ção de atividades:

têm atividade de ligação à ciclofilina;

têm atividade inibitória contra a peptidilprolil cis-trans isomerase;

têm atividade imunossupressora;

inibe a proliferação tanto de células B como de células T;mas não têm atividade de ligação à proteína que se liga a FK enão inibe a atividade da calcineurina.

A atividade biológica de macrolídeos da invenção, por exemplode fórmula XVI, pode ser demonstrada em métodos de teste padronizados invitro e in vivo, por exemplo como se segue.

A Resposta Proliferativa de Linfócitos ao Estímulo Alogênico po-de ser preparada como segue. Células esplênicas (2x105) de camundongosBalb/c (fêmeas, 8-10 semanas) são co-incubadas por 4 dias com 2x105 célu-las esplênicas de camundongos CBA (fêmeas, 8-10 semanas). As célulasalogênicas induzem uma resposta proliferativa na população de célula es-plênica que responde que é medida pela incorporação de um precursor mar-cado no DNA. Os macrolídeos da invenção, por exemplo, compostos defórmula IX e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, Sanglife-rinas A, B, C e D, têm IC50 na faixa de cerca de 30 até cerca de 200 nMquando comparada com a IC50 de cerca de 20 nM para ciclosporina A quan-do testada nesse ensaio. (T. Meo (1979) The MLR in the mouse. Em: "Im-munological Methods", L. Lefkovits & B. Pernis, Eds. Academic Press, N.Y.pp. 227-239).Células esplênicas (2x105) de camundongos CBA são incubadaspor 48 horas com 50 .mu.g/ml de LPS mais o composto de teste. A prolifera-ção é medida pela incorporação de precursor marcado no DNA. Macrolídeosda invenção, por exemplo, compostos de fórmula IX e seus sais farmaceuti-camente aceitáveis, por exemplo Sangliferinas A, B, C e D, inibem a prolife-ração de célula B e têm IC5o na faixa de cerca de 40 até cerca de 100 mi-cromolar. (Greaves, M. & J. Janossy, 1972, "Elicitation of selective T and BIymphocyte response by cell surface binding ligands." Transplant Rev.,11:87; Janossy, G. & M. F. Greaves, 1971, "Lymphocyte activation, I, Res-ponse of T and B Iymphocytes to phytomitogens.", Clin. Exp. Immunol.9:483-498).

A citotoxicidade é determinada pelo uso da linhagem celular mo-nocítica humana THP1 (5x104 células/poço) que são incubadas na presençade IFNgama (100 U/ml) e LPS (5 microgramas/ml) mais o composto de teste(até 10 micromolar) por 24 a 72 h a 37°C. As células vivas são quantificadasusando a leitura colorimétrica de MTT que mede a atividade enzimática dadesidrogenase mitocondrial em células vivas (Mossman 1983). Macrolídeosda invenção, por exemplo, compostos de fórmula IX e seus sais farmaceuti-camente aceitáveis, por exemplo, Sangliferinas A, B, C e D, têm IC50 na fai-xa de cerca 1000-5000 nM após 24 h de incubação nesse ensaio (MossmanT. J. (1983), "Rapid calorimetric assay for cellular growth and survival: appli-cation to proliferation and cytotoxic assays", J. Imm. Methods, 65, 55-63).

Células mononucleares são preparadas a partir de sangue peri-férico de voluntários saudáveis usando a separação por densidade de Ficoll-Hypaque de acordo com o método de Hansell et al. (1991). Células (105 cé-lulas/poço em 200 microlitros de RPMI 10% de FCS por volume) são incu-badas com diluições seriadas dos compostos de teste por 30 min a 37°Cantes da adição de estímulo. Interferon gama (100 U/ml) e LPS (5 microgra-mas/ml) são usados como estímulos para induzir a liberação de Fator deNecrose de Tumor (TNF) alfa pelas células mononucleares do sangue peri-férico. Após 3 h de incubação, as células são centrifugadas (1200 rpm por10 min) e os sobrenadantes são coletados. A quantidade de TNF presentenos sobrenadantes celulares é determinada usando um kit de ensaio imuno-absorvente ligado a enzima comercialmente disponível. Macrolídeos da in-venção, por exemplo, compostos de fórmula IX e seus sais farmaceutica-mente aceitáveis, por exemplo, Sarigliferinas A, B, C e D, têm IC50 na faixade cerca 200 a cerca de 1000 nM quando testados nesse ensaio.

Um ensaio de ligação à ciclofilina adequado é o teste de ELISAcompetitivo descrito por Quesniaux em Eur. J. Immunol. 1987 17 1359-1365.Nesse teste, o composto a ser testado é adicionado durante a incubação deciclofilina (ciclofilina A humana recombinante) com BSA-ciclosporina A re-vestida e a concentração necessária para dar uma inibição de 50% da rea-ção de controle sem competidor é então calculada (IC50)· Um ensaio alterna-tivo é o teste de ligação competitiva descrito por Schneider et ai em Bio-chemistry (1994), 33, 8218-8224, que envolve a adição de composto de tes-te durante a incubação de ciclofilina biotinilada (ciclofilina A humana recom-binante) com BSA-ciclosporina A revestida. A quantidade de ciclofilina bioti-nilada ligada na presença e ausência de um composto de teste é determina-da pela incubação com fosfatase alcalina acoplada à estrepavidina. Macrolí-deos da invenção, por exemplo, compostos de fórmula IX e seus sais farma-ceuticamente aceitáveis, por exemplo, Sangliferinas A, B, C e D, tem IC50 nafaixa de cerca de 10 até cerca de 100 nM, em comparação com a IC50 decerca de 80 nM para ciclosporina A quando testada nesses ensaios.

Ensaios in vitro adicionais que podem ser usados para demons-trar a atividade biológica de Sangliferinas são os ensaios com gene repórterde IL-2 e ensaios com células esplênicas estimuladas por ConA (indicativodo efeito sobre a ativação de célula T).

Macrolídeos da invenção, por exemplo compostos de fórmula IX,por exemplo, Sangliferina A, B, C e D não tem atividade de ligação à proteí-na de ligação de FK e não inibem a atividade de calcineurina quando testa-dos em testes padronizados para essas atividades.

Agentes da invenção são úteis como agentes farmacêuticos, porexemplo, como imunossupressores assim como antiinflamatórios e/ou antivi-rais.Eles são, em particular, úteis para prevenção de distúrbios asso-ciados com infecção viral de hepatite, particularmente hepatite C. Adicional-mente, os agentes da invenção têm uso terapêutico na inibição de distúrbiosassociados com atividade de peptidilprolil cis-trans isomerase (PPIase). PPI-ases são um tipo de ciclofilina que servem para acelerar o dobramento deproteína pela catálise da isomerização cis-trans de ligações peptídicas imídi-cas de prolina em oligopeptídeos. Macrolídeos da invenção se ligam a ciclo-filinas e inibem a atividade de PPI.

Agentes da invenção também são úteis para o tratamento dedoenças auto-imunes e condições inflamatórias, em particular condiçõesinflamatórias com uma etiologia que inclui um componente auto-imune talcomo artrite (por exemplo, artrite reumatóide, artrite crônica progressiva eartrite deformante) e doenças reumáticas.

Em uma série de modalidades específicas adicionais ou alterna-tivas, a presente invenção também fornece:

1.1 Um método para prevenir ou tratar infecções por hepatite C ou distúr-bios induzidos por HCV tais como fibrose hepática, cirrose hepática ecarcinoma hepatocelular em um indivíduo em necessidade disso, quecompreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeutica-mente eficaz de um composto de ligação à ciclofilina, tal como umasangliferina, por exemplo um composto de fórmula _ sozinho ou emcombinação com um ou mais co-agentes.

1.2 Um método para inibir a replicação de HCV em um meio, que compre-ende aplicar a esse meio uma quantidade terapeuticamente eficaz deum composto de ligação à ciclofilina, tal como uma sangliferina, por e-xemplo um composto de fórmula _.

1.3 Um método para inibir a replicação de HCV em um em um paciente emnecessidade disso, que compreende administrar a esse indivíduo umaquantidade terapeuticamente eficaz de um composto de ligação à ciclo-filina, tal como uma sangliferina, por exemplo, um composto de fórmula

1.4 Um método para prevenir a recorrência de infecção por HCV em umreceptor de transplante em necessidade disso, que compreende admi-nistrar ao dito receptor uma quantidade terapeuticamente eficaz de umcomposto de ligação à ciclofilina, tal como uma sangliferina, por exem-plo, um composto de fórmula.

2. Uso de um composto de ligação à ciclofilina tal como uma sangli-ferina na preparação de uma composição farmacêutica para usoem qualquer método definido acima.

3. Uma composição farmacêutica para uso em qualquer método de-finido acima, que compreende um composto de ligação à ciclofili-na tal como uma sangliferina junto com um ou mais diluentes ouveículos farmaceuticamente aceitáveis para isso.

Além disso, as sangliferinas da invenção que possuem atividadede ligação à ciclofilina podem ser úteis como reagentes em imunoensaios dedeslocamento para ciclosporinas e outros compostos de ligação à ciclofilina,por exemplo no procedimento do ensaio descrito no pedido de patente WO95/07468. Esse pedido de patente refere-se a um procedimento de ensaiopara determinar a concentração de um produto farmacêutico de ligação àimunofilina, por exemplo, Ciclosporina, no sangue; o procedimento compre-ende adicionar um competidor de ligação que desloca o produto farmacêuti-co dos complexos imunossupressor-imunofilina no sangue; adicionar umreceptor que se liga ao produto farmacêutico, mas não significativamente aocompetidor de ligação; separar o complexo receptor-produto farmacêutico daamostra; e determinar a quantidade do produto farmacêutico. As sangliferi-nas podem ser usadas como competidoras de ligação em tais ensaios; porexemplo, para deslocar ciclosporinas de ciclofilinas, dessa maneira liberandoa ciclosporina para quantificação, por exemplo, por um anticorpo monoclonalque é específico para ciclosporina.

De acordo com o antecedente, a presente invenção fornece ain-da um aspecto adicional:

4. Uma combinação farmacêutica que compreende a) um primeiroagente que é um composto de ligação à ciclofilina tal como umasangliferina, por exemplo, um composto de fórmula I e b) um co-agente, por exemplo, um ou mais agentes farmacêuticos forneci-dos aqui.

5. Um método como definido acima que compreende a co-administração, por exemplo, concomitantemente ou em seqüên-cia, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um compostode ligação à ciclofilina tal como uma sangliferina, por exemplo, umcomposto de fórmula I e um co-agente, por exemplo, um ou maisagentes farmacêuticos fornecidos aqui.

O composto da invenção pode ser administrado por qualquer viaconvencional, em particular enteralmente, por exemplo, oralmente, por e-xemplo na forma de soluções para beber, comprimidos ou cápsulas ou pa-renteralmente, por exemplo na forma de soluções ou suspensões injetáveis.

As composições farmacêuticas preferidas podem ser, por exemplo, aquelasbaseadas em micro-emulsões como descrito em UK 2.222.770 A.

Em outro aspecto, co-agentes adequados podem ser co-administrados em tratamentos de combinação ou de alternação. Os termos"co-administração" ou "administração combinada" ou semelhantes como uti-lizados aqui pretendem abrangir a administração dos agentes terapêuticosselecionados a um paciente, e pretendem incluir regimes de tratamento nosquais os agentes não são necessariamente administrados pela mesma viade administração ou ao mesmo tempo. Combinações fixas também estãodentro do escopo da presente invenção. A administração de uma combina-ção farmacêutica da invenção resulta em efeito benéfico, por exemplo, umefeito terapêutico sinérgico ou aditivo, comparado à monoterapia na qualapenas um dos ingredientes farmaceuticamente ativos é aplicado. Co-agentes adequados para co-administração com o composto da invençãoincluem mas não são limitados a:

(1) Interferons ou conjugados de interferons tais como:

(a) lntron-A®, interferon alfa-2b (Schering Corporation, Kenilworth, NJ),

(b) PEG-Intron®, peginteferon alfa-2b (Schering Corporation, Kenilwor-th, NJ),

(c) Roferon®, interferon alfa-2a recombinante (Hoffmann-La Roche,Nutley, NJ),

(d) Pegasys®, peginterferon alfa-2a (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ),

(e) Berefor®, interferon alfa 2 disponível (Boehringer Ingelheim Phar-maceutical, Inc., Ridgefield, CT),

(f) Sumiferon®, uma mistura purificada de interferons alfa naturais(Sumitomo, Japão),

(g) Wellferon®, interferon alfa n1 linfoblastóide (GIaxoSmithKIine),

(h) Infergen®, interferon alfa consenso (InterMune Pharmaceuticals,Inc., Brisbane, CA e Amgen, Inc., Newbury Park, CA),

(i) Alferon®, uma mistura de interferons alfa naturais (Interferon Scien-ces, e Purdue Frederick Co., CT),

(j) Viraferon®;

(k) Interferons conjugados incluem, por exemplo, Albuferon (HumanGenome Science) que é conjugado à albumina humana. Interferonconjugado a um polímero solúvel em água ou homopolímeros de ó-xido de polialquileno tais como polietileno glicol (PEG) ou polipropi-Ieno glicóis, polióis polioxietilenados, copolímeros desses e copolí-meros de bloqueio desses. Como uma alternativa a polímeros à ba-se de oxido de polialquileno, materiais efetivamente não antigênicostais como dextrano, polivinil pirrolidonas, poliacrilamidas, alcoóis po-livinílicos, polímeros à base de carboidratos e-semelhantes podemser usados. Conjugados de interferon-polímero estão descritos emUS 4766106, US 4917888, EPA O 236 987, EPA O 510 356 e WO95/13090. Já que a modificação polimérica reduz suficientementeas respostas antigênicas, o interferon estranho não precisa sercompletamente autólogo. Interferon usado para preparar conjuga-dos de polímero podem ser preparados a partir de um extrato demamífero, tais como interferon humano, de ruminante ou bovino ouproduzidos de forma recombinante.

Outras formas de interferons incluem interferon-beta, gama, tauomega, tais como Rebif (Interferon beta 1a) de Serono, Omniferon (interfe->n natural) de Viragen, ou Omega Interferon de Boehringer Ingelheim;Interferons orais tais como interferon alfa oral de Amarillo Biosciences;

Em outro aspecto, exemplos adicionais de interferons inclueminterferon alfa peguilado, por exemplo, interferon a-2a peguilado, interferona-2b peguilado, interferon consenso peguilado, ou produto purificado de in-terferon-α peguilado. Interferon a-2a peguilado está descrito na Patente Eu-ropéia 593.868 (incorporada aqui por referência em sua totalidade) e dispo-nível comercialmente, por exemplo, sob o nome comercial de PEGASYS®(Hoffmann-La Roche). lnterferon-a-2b peguilado está descrito, por exemplo,na Patente Européia 975.369 (incorporada aqui por referência em sua totali-dade) e disponível comercialmente, por exemplo, sob o nome comercial dePEG-INTRON A® (Schering Plough). Interferon de consenso peguilado estádescrito em WO 96/11953 (incorporado aqui por referência em sua totalidade).

(2) Antivirais

Agentes antivirais podem ser compostos ou biológicos que sãoeficazes para inibir a formação e/ou replicação de um vírus em um mamífe-ro. Isso inclui agentes que interferem com os mecanismos do hospedeiro ecom os virais, necessários para a formação e/ou replicação de um vírus emum mamífero, tais como ribavirina (1-beta-D-ribofuranosil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxamida) de Valeant Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA, Rebetol®de Schering-Plough Corporation, Kenilworth1 NJ, e Gopegus® de Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ1 análogos de ribavirina em desenvolvimento, tais comoLevovirina e Viramidina de Valeant1 e Monofosfato de Mizoribina;

(3) Inibidores de Protease

Inibidores da serina protease NS3-4A de HCV tais como inibido-res de protease à base de substrato (Attwood et ai, "Antiviral peptide deriva-tives.", PCT WO 98/22496, 1998; Attwood et al., Antiviral Chemistry andChemotherapy 1999, 10, 259-273; Attwood et al, "Preparation and use ofamino acid derivatives as anti-viral agents.", Pub de Patente alemã DE19914474; Tung et al. "Inhibitors of serine proteases, particularly hepatitis Cvirus NS3 protease"; PCT WO 98/17679), incluindo alfacetoamidas e hidra-zinouréias e inibidores que terminam em um eletrófilo tal como ácido ou fos-fonato borônico (Llinas-Brunet et ai. "Hepatitis C inhibitor peptide analogues",PCT WO 99/07734);

Inibidores de protease descritos em patentes U.S. para trata-mento de HCV, por exemplo, Patente U.S. Nq 6.004.933 para Spruce et aique descreve uma classe de inibidores de cisteína protease para inibir en-dopeptidase 2 de HCV; Patente U.S. Nq 5.990.276 para Zhang et ai quedescreve inibidores sintéticos de protease NS3 de vírus de hepatite C; Pa-tente U.S. Ne 5.538.865 para Reyes et ai:, Peptídeos como inibidores de se-rina protease NS3 de HCV que são descritos em WO 02/008251 para Cor-vas International, Inc., e WO 02/08187 e WO 02/008256 para Schering Cor-poration; Tripeptídeos inibidores de HCV que são descritos nas PatentesU.S. Nos. 6.534.523, 6.410.531 e 6.420.380 para Boehringer Ingelheim eWO 02/060926 para Bristol Myers Squibb (incorporadas aqui por referênciaem suas totalidades); Peptídeos de Diarila como inibidores de serina protea-se NS3 de HCV que estão descritos em WO 02/48172 para Schering Corpo-ration; Imidazoleidinonas como inibidores de serina protease NS3 de HCVque estão descritos em WO 02/18198 para Schering Corporation e WO02/48157 para Bristol Myers Squibb (incorporadas aqui por referência emsuas totalidades); WO 98/17679 para Vertex Pharmaceuticals e WO02/48116 para Bristol Myers Squibb também descrevem inibidores de prote-ase de HCV (incorporadas aqui por referência em suas totalidades).

(4) Inibidores de protease NS3 não baseados em substrato tais como deri-vados de 2,4,6-triidróxi-3-nitro-benzamida (Sudo K. et al., Biochemical andBiophysical Research Communications, 1997, 238 643-647; Sudo K. et al.Antivirai Chemistry and Chemotherapy, 1998, 9, 186), incluindo RD3-4082 eRD3-4078;

(5) Uma fenantrenoquinona que possui atividade contra protease em um en-saio de SDS-PAGE e autoradiografia, isolada do caldo de cultura de fermen-tação de Streptomyces sp., Sch 68631 (Chu M. et al., Tetrahedron Letters,1996, 37, 7229-7232), (Chu M et al., Tetrahedron Letters 37:7229-7232,1996); Sch 351633, isolado do fungo PenieiIIium grieofulvum (Chu M. et al.,Bioorganie and Medicinal Chemistry Letters 9:1949-1952); inibidores seleti-vos projetados com base na macromolécula de eglin c., que é isolada dasanguessuga e é um potente inibidor de diversas serina proteases tais comoproteases A e B de S. griseus, V-quimotripsina, quimase e subtílisina (QasimM.A. et ai, Biochemistry 36:1598-1607, 1997).

(6) Tiazolidinas e benzanilidas identificadas em Kakiuchi N. et ai. J. FEBSLetters 421, 217-220; Takeshita N. et ai Analytical Biochemistry, 1997, 247,242-246. Derivados de tiazolidina que mostram inibição relevante em umensaio de HPLC de fase reversa com uma proteína de fusão NS3/4A e subs-trato NS5A/5B (Sudo K. et ai, Antiviral Research, 1996, 32, 9-18); especial-mente o composto RD-16250 que possui uma porção de cinamoila fundidasubstituída com uma cadeia de alquila longa, RD4 6205 e RD4 6193.

(7) Inibidores da serina protease NS3-4A de HCV, que incluem BILN 2061de Boehringer Ingelheim, VX-950 por Vertex, SCH-503034 e SCH-351633,de Schering-Plough, e outros inibidores de protease de HCV em desenvol-vimento pré-clínico e clínico por GIaxoSmithKIine, Bristol Myers Squibb, Ab-bot, Roche, Merck, Pfizer, e Gilead;

(8) Análogos de nucleosídeoTelbivudina de Idenix (US 6444652, US6596700, eW00196353). Inibidores de nucleosídeo ou não-nucleosídeo de RNA poli-merase dependente de RNA NS5B de HCV, tal como éster de 2'-C-metil-3'-CX-L-valina ribofuranosil citidina (NM283, Idenix) como descrito em WO2004/002422.

Nucleosídeos ramificados descritos por Idenix Pharmaceuticalspara uso no tratamento de flavivírus (incluindo HCV) e pestivírus nas Publi-cações Internacionais Nos. WO 01/90121 e WO 01/92282 (incorporadas a-qui por referência nas suas totalidades). Especificamente, um método detratamento de infecção por hepatite C (e flavivírus e pestivírus) em humanose outros animais hospedeiros está descrito nas publicações de Idenix queinclui administrar uma quantidade eficaz de um nucleosídeo B-D ou B-L 1',2', 3' ou 4'-ramificado biologicamente ativo ou um sal ou pró-farmaco farma-ceuticamente aceitável desses, administrado tanto sozinho quanto em com-binação com outro agente antiviral, opcionalmente em um veículo farmaceu-ticamente aceitável

Análogos de nucleosídeos em outros pedidos de patente quedescrevem o uso de tratamento de um vírus de hepatite C incluem: PCT-CA00/01316 (WO 01/32153; depositado em 3 de novembro de 2000) ePCT/CA01/00197 (WO 01/60315; depositado em 19 de fevereiro de 2001)depositados por BioChem Pharma, Inc., (agora Shire Biochem, Inc.);PCT/US02/01531 (WO 02/057425; depositado em 18 de janeiro de 2002) ePCT/US02/03086 (WO 02/057287; depositado em 18 de janeiro de 2002)depositados por Merck & Co., Inc., PCT/EP01/09633 (WO 02/18404; publi-cado em 21 de agosto de 2001) depositado por Roche, e Publicações PCTNss WO 01/79246 (depositada em 13 de abril de 2001), WO 02/32920 (de-positada em 18 de outubro de 2001) e WO 02/48165 por Pharmasset, Ltd.(cujas descrições estão aqui incorporadas por referência em suas totalida-des)

2'-fluoronucleosídeos descritos na Publicação PCT Ns WO99/43691 para Emory University (incorporada aqui por referência em suatotalidade), intitulada "2'-Fluoronucleosides";

Nucleosídeos 2'-modificados descritos por Eldrup et al. (SessãoOral V, "Hepatitis C Virus, Flaviviridae"; 16e Conferência Internacional sobrePesquisa Antiviral (27 de abril de 2003, Savannah, GA));

Análogos de nucleosídeos e nucleosídeos 2'-modificados descri-tos em Bhat et al. (Sessão Oral V, "Hepatitis C Virus, Flaviviridae" 2003(Sessão Oral V, "Hepatitis C Virus, Flaviviridae"; 16a Conferência Internacio-nal sobre Pesquisa Antiviral (27 de abril de 2003, Savannah, GA); ρ A75);

Nucleosídeos 2'-modificados descritos em Olsen et al. (SessãoOral V, "Hepatitis C Virus, Flaviviridae"; 16s Conferência Internacional sobrePesquisa Antiviral (27 de abril de 2003, Savannah, GA) ρ A76)

Compostos pré-clínicos incluem R803 (Rigel), JTK-003 (JapanTabacco), HCV-086 (ViroPharma/Wyeth), R-1479 (Roche);(9) Inibidores da nucleotídeo polimerase e gliotoxina (Ferrari R. et ai Journalof Virology, 1999, 73, 1649-1654), e o produto natural cerulenina (LohmannV. et ai Virology, 1998, 249, 108-118);(10) Inibidores da helicase NS3 de HCV1 tais como VP_50406 de ViroPhamae compostos de Vertex1 outros inibidores de helicase descritos em PatenteU.S Nq 5.633.388 e PCT WO 97/36554;

(11) Moléculas anti-sentido direcionadas contra o genoma de HCV ou qual-quer componente celular que é necessário para a replicação viral.

Oligodesoxinucleotídeos de fosforotioato (S-ODN) complementa-res aos trechos de seqüência na região não-codificante (NCR) 5' do vírus(Alt M. etal., Hepatology, 1995, 22, 707-717), ou nucleotídeos 326-348 quecompreendem a terminação 3' da NCR e nucleotídeos 371-388 localizadosna região codificante central do. RNA de HCV (Alt M. et al., Archives of Viro-logy, 1997, 142, 589-599; Galderisi U. et ai, Journal of Cellular Physiology,199, 181, 251-257); tais como ISIS 14803 por Isis Pharm/Elan, oligonucleotí-deos anti-sentido por Hybridon, AVI bioPharma e Chugai, AVI-4065 (AVI Bi-oPharma), ou uma seqüência anti-sentido complementar a qualquer parte dogenoma de HCV que aumenta a eficácia da terapia;

(12) Inibidores da tradução dependente de IRES (lkeda N et ai, "Agent forthe prevention and treatment of hepatitis C.", Pub. Patente Japonesa JP-08268890; Kai Y et ai "Prevention and treatment of viral diseases", Pub. Pa-tente Japonesa JP-10101591); tais como ISIS 14803 por Isis Pharm/Elan,inibidores de IRES por PTC Therapeutics, Anadys, Immusol, RiboTargets, eSomaGenics;

(13) Ribozimas, tais como ribozimas resistentes à nuclease (Maccjak, D.J. etal., Hepatology 1999, 30, resumo 995) e aquelas na Patente U.S. NQ6.043.077 de Barber et al., e. Patentes U.S Nos. 5.869.253 e 5.610.054 deDraper et al. (incorporadas aqui por referência em suas totalidades) por e-xemplo, HEPTAZYME de RPI, e Sirna Therapeutics Inc.;

(14) Um inibidor de outros alvos no ciclo de vida de HCV incluindo entradaviral, montagem e maturação tal como Celgosivir (MBI 3253), um inibidor deprocessamenro de glicoproteína por Migenix, inibidor de fusão por Trimeris,ACH-0137171 por Achillion;

(15) Agentes imuno-moduladores

Agonistas de receptor tais como agonistas do receptor seme-lhante a "toll" (TLR) incluem ANA245, ANA971, ANA975 (US 5041426,4880784) por Anadys; CpG-10101 um agonista de TLR-9 (Coley Pharma-ceuticals); um inibidor de IMPDH, ácido micofenólico, um sal ou pró-fármacodesse, micofenolato de sódio ou mofetil micofenolato ou Merimebodib (VX-497, por Vertex); timosina alfa-1 (Zadaxin ou sua combinação, por SciCIone);SCV-07 (SciCIone), Belerofon (IFN-α melhorada por Nautilus); CIVACIR (I-munoglobulina de hepatite C) por NABI, ou um agonista do receptor S1P,por exemplo, FTY720 ou análogo desse opcionalmente fosforilado, por e-xemplo, como descrito em EP627406A1, EP778263A1, EP1002792A1,W002/18395, W002/76995, WO 02/06268, JP2002316985, W003/29184,W003/29205, W003/62252 e W003/62248, cujas descrições estão incorpo-radas aqui pela referência em suas totalidades; Resiquimod [VML 600] por3M Pharmaceuticals, um análogo de imiquimod que é um potente indutor deinterferon-α e outras citocinas;

(16) Um agente anti-fibrótico, tal como um derivado N-fenil-2-pirimidina-amina, imatinibe (Gleevec), IP-501 por Indevus1 e Interferon gama 1b porInterMune, Pirfenidona (Múltiplo: agonista de TGF Beta, antagonista de FGF,antagonista de PDGF) por Intermune, Marnac, Shionogi;

(17) Vacinas terapêuticas por Intercell (vacina de peptídeo terapêutico IC41HCV), Epimmune/Genecor, Merix, Tripep (Chiron-VacC), imunoterapia (The-rapore) por Avant, terapia de célula T por GeIIExSys, anticorpo monoclonalXTL-002 por STL, ANA 246 e ANA 246 por Anadys, uma vacina terapêuticadirecionada para E2 por Innogenetics1 mAb contra a proteína do envelopeE2 por XTL Bio, GI-5005 (Globelmmune lnc), InnoVac-C (WO 9967285, In-nogenetics), IC-41 (Intercell), interferon alfa-n3 (Interferon Sciences), EngerixB (SmithKIine Beecham);

(18) Outros compostos incluem Ursodiol (EP00269516, Axcan Pharma), HE-2000 (um análogo de DHEA1 Colthurst Ltd), EHC-18 (um imunomodulador,Enzo biochem), diidrocloreto de histamina (um agonista H2, W009104037,Estero-Anstalt), 1-amino-alquilcicloexanos (Patente U.S Ns 6.034.134), lipí-deos de alquila (Pat. U.S. N9 5.922.757), vitamina E e outros antioxidantes(Patente U.S. N9 5.922.757), ácidos biliares (U.S. Pat. N9 5.846.99964), áci-do N-(fosfonoacetil)-L-aspártico) Pat. U.S. Ng 5.830.905), benzenodicarbo-xamidas (Pat. U.S. Ng 5.633.388), derivados de ácido poliadenílico (Pat U.S.N9 5.496.546), 2'3'-didesoxiinosina (Pat. U.S. N9 5.026.687), benzimidazóis(Pat. U.S. N9 5.891.874), extratos de plantas (Pat. U.S. N2 5.837.257, Pat.U.S. N9 5.725.859 e Pat. U.S. N9 6.056.961) e piperidinas (Pat. U.S. N95.830.905); ácido N-(fosfonoacetil)-L-aspártico, benzenodicarboxamidas,derivados de ácido poliadenílico, inibidores da glicosilação, e agentes cito-protetores não específicos que bloqueiam a injúria celular causada por infec-ção viral;

(19) Qualquer outro composto atualmente em desenvolvimento pré-clínicoou clínico para o tratamento de HCV, incluindo lnterleucina-10 (Schering-Plough), AMANTADINE (SymmetreI) por Endo Labs Solvay, inibidor de cas-pase IDN-6556 por Idun Pharma, HCV/MF59 por Chiron, CEPLENE (diclore-to de histamina) por Maxim, IDN-6556 por Idun PHARM, T67, um inibidor debeta-tubulina porTularik, FK788 por Fujisawa Healthcare, IdBI 016 (Siliphos,fitossomo de silibin-fosfatidil colina oral), Dication por Immtech, hemopurifi-cador por Aethlon Medicai, UT 231B por United Therapeutics; HepeX-CSM1, PPVO-Bay55-8800 (Parapoxvirus ovis) por Bayer; Refanalin (miméticode HGF) por Angion, R803 (Rigel), JTK-003, JTK-002, e JTK-109 (todos deJapan Tobacco), HCV-086 (ViroPharma/Wyeth), ISIS-14803 (ISIS Pharma-ceuticals), GS-9132 (um inibidor de polimerase por Achillion Pharmaceuti-cals), HCV-793 (Pharmasset e Roche), R1626 (Roche).

Compostos ou fármacos em desenvolvimento pré-clínico podemser facilmente identificados por aquele versado na técnica pela pesquisa deinformação de ensaio clínico na internet, por exemplo, e informação publica-da pelas respectivas empresas.

(20) Compostos que aumentam a eficácia de uma terapia de combinaçãoincluindo um antifolato, uma 5-fluoropirimidina (incluindo 5-fluorouracil), umanálogo de citidina tal como β-L-l ,3-dioxolanil citidina ou β-L-l ,3-dioxolanil 5-fluorocitidina, antimetabólitos (incluindo antimetabólitos de purina, citarabina,fludarabina, floxuridina, 6-mercaptopurina, metotrexato, e 6-tioguanina), hi-droxiuréia, inibidores mitóticos (incluindo CPT-11, etoposídeo (VP-21), taxol,e alcalóides da vinca tais como vincristina e vinblastina, um agente alquilante(incluindo mas não limitado a busulfan, clorambucil, ciclofosfamida, ifosfami-da, mecloretamina, melfalan, e tiotepa), agentes alquilantes não clássicos,compostos que contêm platina, bleomicina, um antibiótico anti-tumor, umaantraciclina tal como doxorrubicina e daunomicina, uma antracenediona, ini-bidores da topoisomerase II, agentes hormonais (incluindo mas não limita-dos a corticosteróides (dexametasona, prednisona, e metilprednisona), an-drógenos tais como fluoximesterona e metiltestosterona, estrogênios taiscomo dietilestilbesterol, antiestrogênios tais como tamoxifeno, análogos deLHRH tais como leuprolídeo, antiandrogênios tais como flutamida, aminoglu-tetimida, acetato de megestrol, e medroxiprogesterona), asparaginase, car-mustina, Iomustina1 hexametil-melamina, dacarbazina, mitotane, estreptozo-cina, cisplatina, carboplatina, levamasol, e leucovorin. Os compostos da pre-sente invenção também podem ser usados em combinação com agentes deterapia com enzima e moduladores do sistema imune, tais como interleucina,fator de necrose tumoral, fator estimulador de colônia de macrófago e fatorestimulador de colônia.

A utilidade de um composto ou agente terapêutico de ligação aciclofilina, tal como sangliferina, no tratamento de doenças e condições co-mo as especificadas anteriormente acima pode ser demonstrada em testespadronizados clínicos ou in vitro, por exemplo, de acordo com os métodosanteriormente descritos.

A. In vitro

Os efeitos de várias sangliferinas da invenção sobre a replicaçãodo genoma de HCV são examinados usando as células de replicon de HCV.

A linhagem celular de replicon de HCV, clone A, é licenciada porApath, LLC. As células são cultivadas em meio de Eagle modificado por Dul-becco (DMEM, Gibco), contendo 10% de soro fetal bovino inativado por calor(FBS, Gibco), L-glutamina 2 mM, 1x aminoácidos não essenciais (Gibco), e 1mg/ml de G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Para determinar o efeito antiviral dos compostos, as células dereplicon de HCV (clone A) são tratadas com compostos diluídos seriadamen-te em DMEM suplementado com 2% de FBS e 0,5% de DMSO por 48 h, en-tão, o RNA intracelular total foi extraído e o nível de RNA de HCV é determi-nado por RT-PCR quantitativo em tempo real (Taqman) usando iniciadoresespecíficos para HCV (5'-TCT TCA CGC AGA AAG CGT CTA-3' e 5'-CTGGCA ATT CCG GTG TAC T-3') Seqüência ID No: 1 e sonda (5'-6-FAM-TCCTGG AGG CTG CAC GAC ACT CAT A-TAMRA-31) Seqüência ID No: 2. Paracada tratamento, a quantidade de RNA de HCV é normalizada contra aquantidade total de RNA extraído, que é determinada em um ensaio Quant-iT (Molecular Probe). Cada dado obtido representa a média de seis réplicasem cultura celular. IC50 é a concentração do composto na qual o nível deRNA de HCV nas células de replicon está reduzido em 50%. Para monitoraro efeito citotóxico dos compostos, a viabilidade de células de replicon após48 h de tratamento com o composto é determinada usando um ensaio base-ado num composto de tetrazólio (MTS) (CeIITiter 9(f AQueous One SolutionCell Proliferation Assay, Promega, Madison, Wl). CC5o é a concentração docomposto na qual a viabilidade celular está reduzida em 50%.

B. Ensaio Clínico

Um total de 15-30 pacientes com infecção viral por hepatite Csão arrolados em um estudo de 2-12 semanas. Cada paciente recebe umadose terapêutica eficaz de um composto de ligação à ciclofilina, tal comosangliferina. Os níveis séricos de carga de RNA viral são monitorados duran-te o curso do tratamento e em um período de acompanhamento de 2 sema-nas tipicamente para todos os pacientes.

A extensão do tratamento e as dosagens necessárias para seobter respostas virológicas mantidas em pacientes com hepatite C devemser determinadas em ensaios clínicos adicionais envolvendo um númeromaior de pacientes e um período de tratamento mais longo de até 12 mesescom 6 meses de acompanhamento.

As dosagens diárias necessárias para a prática do método dapresente invenção variarão na dependência, por exemplo, do composto deligação à ciclofilina empregado, do hospedeiro, do modo de administração eda severidade da condição a ser tratada.Sangliferina pode ser administrada como único ingrediente oujunto com outros fármacos, por exemplo, um fármaco que tem atividadesanti-HCV, por exemplo, um interferon alfa, interferon alfa peguilado, ribaviri-na, um inibidor da polimerase de HCV tal como NM283, ou um inibidor deprotease de HCV tal como SCH503034 e VX-950. Dosagens diárias comrelação aos co-agentes usados variarão na dependência, por exemplo, dosefeitos sinérgicos com o composto empregado, do hospedeiro, do modo deadministração e da severidade da condição a ser tratada.

Claims

1. Método para prevenir ou tratar hepatite C e doenças relacio-nadas tais como fibrose hepática, cirrose hepática e carcinoma hepatocelularem um indivíduo em necessidade disso, que compreende administrar ao ditoindivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de liga-ção a ciclofilina, tal como um macrolídeo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 no qual o macrolídeoé uma sangliferina de fórmula VllS-L-Mem que S representa uma cadeia (Ci-io)alqiiila ramificada ou linear;L representa um Iigante que compreende uma seqüência linear de 6 a 11átomos de carbono; e M representa um anel macrocíclico em que as posi-ções 2 a 6 do dito anel macrocíclico são fornecidas por um resíduo de ácidopiperidazinil carboxílico substituído ou não substituído de fórmula I; em queas posições 7 a 9 do dito anel macrocíclico são fornecidas por um resíduo dealfa-aminoácido aromático em que a porção carbóxi do resíduo de alfa-aminoácido aromático ocupa a posição 7 do dito anel macrocíclico e a por-ção alfa-amino do resíduo de alfa-aminoácido aromático ocupa a posição 9do dito anel macrocíclico, as posições 10 a 12 do dito anel macrocíclico sãofornecidas por um resíduo de alfa-aminoácido alifático em que a porção car-bóxi do resíduo de alfa-aminoácido alifático ocupa a posição 10 do dito anelmacrocíclico e a porção alfa-amino do resíduo de alfa-aminoácido alifáticoocupa a posição 12 do dito anel macrocíclico, o restante do anel macrocícli-co que compreende um resíduo de ácido hidróxi-carboxílico que tem uma deextensão de cadeia de 6 a 20 átomos, a porção óxi do qual completa umaligação Iactona macrocíclica e cuja porção carbonila forma uma ligação ami-da com o grupo alfa.-amino na posição 12 do anel macrocíclico, na formalivre ou protegida ou um sal desse.

3. Método para inibir a replicação de HCV em um meio, quecompreende aplicar a esse meio uma quantidade eficaz de um composto deligação à ciclofilina tal como uma sangliferina.

4. Método para inibir a replicação de HCV em um paciente emnecessidade disso, que compreende administrar a esse indivíduo uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de um composto de ligação à ciclofilina talcomo uma sangliferina.

5. Método para prevenir a recorrência de infecção por HCV emum receptor de transplante em necessidade disso, que compreende adminis-trar ao dito receptor uma quantidade terapeuticamente eficaz de um compos-to de ligação a ciclofilina tal como uma sangliferina.

6. Uso de um composto de ligação a ciclofilina tal como umasangliferina na prevenção ou tratamento de hepatite C e doenças relaciona-das e tais como fibrose hepática, cirrose hepática e carcinoma hepatocelular.

7. Uso de um composto de ligação a ciclofilina tal como umasangliferina na preparação de uma composição farmacêutica para uso emum método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Composição farmacêutica para uso em um método como de-finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que compreende um com-posto de ligação a ciclofilina tal como uma sangliferina junto com um ou maisdiluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis para isso.

9. Combinação farmacêutica que compreende a) um primeiroagente que é um composto de ligação a ciclofilina tal como uma sangliferina,e b) um co-agente que tem propriedades anti-HCV.

10. Método como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 6, compreendendo co-administração concomitante ou em seqüência deuma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de ligação a ciclo-filina tal como uma sangliferina e um co-agente que tem propriedades anti- HCV.

11. Método, uso, composição ou combinação como definido emqualquer uma das reivindicações anteriores, em que o composto de ligaçãoa ciclofilina é um composto da fórmulaem que X é Η, metóxi, etóxi, OnPr, OiPr;R14 e R15 são independentemente H, metila, alquila, (CrC^alquila, (C1-C4)-CO-CH3, ou R14 e R15 são fundidos para formar uma cicloalquila de 5 a 7membros substituída ou não substituída: selecionada da fórmula<formula>formula see original document page 43</formula>R16 é H, ou Me ou (Ci-4)alquila;R17 é H, OH, -0-(Ci-4)alquila ou R14, R15 e R17 são fundidos para formaruma cicloaquila da fórmulaR23 é H, (Ci-io)alquila de cadeia ramificada ou linear e/ou contém uma oumais ligações insaturadas em particular ligações duplas ou triplas cumulati-vas ao longo de sua extensão.

12. Método, uso, composição ou combinação de acordo com areivindicação 11 em que R23 é selecionado a partir do grupo que consisteem -CH=CH2l-CH2-OH, -CH2-OCH3, -CHO, -COOH, ou de fórmula XIX'.<formula>formula see original document page 44</formula>

13. Método, uso, composição, ou combinação substancialmentecomo definido e descrito acima.