JP2014510746A - マクロ環状化合物及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、例えば、C型肝炎ウイルス(HCV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、及びヒト免疫不全症ウイルス(HIV)などのウイルスによるウイルス感染症の治療におけるシクロフィリン阻害剤として、並びに/又は、例えば、移植拒絶反応の予防において使用するための免疫抑制剤として、及び、例えば、炎症性障害において使用するための抗炎症剤として有用である、サングリフェリンアナログに関する。本発明は、医薬、特にHCV又はHIV感染症を治療するための医薬、及び、免疫抑制剤若しくは抗炎症剤として使用するための医薬におけるその使用方法、筋ジストロフィーなどのミトコンドリア膜透過性遷移孔(mPTP)の阻害が有用である疾病におけるその使用方法、又は医薬として有用なさらなる化合物の生成における中間体としてのその使用方法も提供する。
(C型肝炎)
C型肝炎ウイルス(HCV)はプラス鎖のRNAウイルスであり、感染は輸血後肝炎の主な原因である。HCVは最もよく見られる慢性の血液由来の感染であり、米国における肝臓疾患による死亡の主な原因である。世界保健機関は、1億7千万人を超えるHCV感染の慢性キャリアがいると推定しており、これは世界の人口の約3%である。治療していないHCV感染患者のうち、約70%〜85%は慢性HCV感染を起こし、そのため肝硬変及び肝細胞癌を起こすリスクが高い。先進国では、肝臓癌の全症例の50〜76%及び全肝臓移植の3分の2は慢性HCV感染によるものである(Mannsら、2007)。
現在の標準治療(SoC)は、24〜48週間のペグ化インターフェロンα(pIFNα)の皮下注射及び抗ウイルス薬リバビリンの経口投薬である。治療の成功は持続性ウイルス陰性化(SVR)により定義されるが、これは治療期間の最後及び6ヶ月後に血清中にHCV RNAが存在しないことにより定義される。SoCに対する全奏効率は、主に遺伝子型及び治療前HCV RNAレベルによる。遺伝子型2及び3の患者は、遺伝子型1に感染している患者よりもSoCに対して、より反応しそうである(Melnikova, 2008; Jacobsonら、2007)。
シクロフィリン(CyP)は、タンパク質のコンフォメーション変化と折りたたみを容易にするペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ活性を示す細胞タンパク質のファミリーである。CyPは、転写調節、免疫応答、タンパク質分泌、及びミトコンドリア機能などの細胞プロセスに関与している。HCVウイルスは、ヒトの感染の間その生活環のためにCyPをリクルートする。元々は、CyPが、RNA複製を促進するHCV非構造的タンパク質NS5B RNAポリメラーゼのRNA結合活性を刺激すると考えられていたが、CyP PPIアーゼ活性の要求を含む、代わりの仮説もいくつか提案されてきた。A及びBを含むCyPの種々のアイソフォームが、HCVの生活環に関与していると考えられている(Yangら、2008; Appelら、2006; Chatterjiら、2009; Gaitherら、2010)。マウス(Colganら、2000)及びヒトT細胞(Braaten及びLuban、2001)においてノックアウトを発生させる能力は、CyPAが細胞の成長及び生存にとって任意であることを示している。類似の結果が、細菌(Herrlerら、1994)、ニューロスポラ(Neurospora)(Tropschugら、1989)、及びサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(Dolinskiら、1997)におけるCyPAホモログの分裂により観察された。したがって、CyPの阻害は、HCV感染を治療するための新規で魅力的な宿主標的であり、SVRを高め、耐性の出現を防止し、治療の副作用を低減する目的で、現行のSoC又はSTAT-C/DAA薬に対する新しい潜在的な追加物である。
サングリフェリンA(SfA)及びその天然の同族体は、ストレプトマイセス属(Streptomyces) sp.A92-308110(DSM 9954としても知られる)(国際公開第97/02285号参照)により産生される混合非リボソームペプチド/ポリケチドのクラスに属し、シクロフィリンA(CyPA)に対するそれらの高い親和性に基づいて元々発見された。SfAは、発酵ブロス中に最も豊富にある成分であり、CsAに比べてCyPAに対しておよそ20倍高い親和性を示す。これは、サングリフェリンがHCVの治療に有用になり得るという示唆をもたらした(国際公開第2006/138507号)。サングリフェリンは、インビトロで試験される場合、CsAよりも低い免疫抑制活性を示すことも示された(Sanglierら、1999; Fehrら、1999)。SfAは、CyPAのCsA結合部位に高い親和性で結合する(Kallenら、2005)。
サングリフェリンは、混合型ポリケチドシンターゼ(PKS)/非リボソームペプチドシンテターゼ(NRPS)によって生合成される(国際公開第2010/034243号参照)。その22員のマクロライド骨格は、ポリケチド炭素鎖及びトリペプチド鎖からなる。該ペプチド鎖は、アミド結合によって連結された、1つの天然アミノ酸、バリン、並びに、2つの非天然アミノ酸、(S)-メタ-チロシン及び(S)-ピペラジン酸からなる。(S)-メタ-チロシンを生成するフェニルアラニンのヒドロキシル化は(NRPS上でin situで、又は、生合成前に)、sfaAの遺伝子産物を介して起こると考えられている。
SfAの免疫抑制作用機序は、CsA、FK506、及びラパマイシンなどの他の公知のイムノフィリン-結合性免疫抑制薬のものとは異なる。SfAは、CsAの標的であるカルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害せず(Zenkeら、2001)、その代わりに、その免疫抑制活性は、インターロイキン-6の阻害(Hartelら、2005)、インターロイキン-12の阻害(Steinschulteら、2003)、及びインターロイキン-2-依存性T細胞増殖の阻害(Zhang及びLiu、2001)によるものとされてきた。しかし、SfAがその免疫抑制効果を発揮する分子標的及び機構は今のところ未知である。
(ヒト免疫不全ウイルス(HIV))
CsA及びDEBIO-025などのシクロフィリン阻害剤は、HIV複製の阻害にも潜在的な効用を示した。シクロフィリン阻害剤は、HIV逆転写の進行/完了の間のCyPAの機能と干渉すると考えられている(Ptakら、2008)。しかし、臨床試験では、DEBIO-025は、それぞれ9名及び2名の患者でHIV-1 RNAレベルを≧0.5及び>1 log10 コピー/mLに低減しただけであり、治療された患者のうち27名はHIV-1 RNAレベルの低下を全く示さなかった(Steynら、2006)。この後で、DEBIO-025はHCV/HIV共感染患者で試験され、HCVに対してより良い効能を示し、HIV臨床試験は中止された(Watashiら、2010参照)。
世界中で3000万人を超える人々がHIV-1に感染しており、毎年300万の新しい症例がある。治療選択は、高活性抗レトロウイルス療法(HAART)の導入と共に劇的に向上した(Schopmanら、2010)。2008年までに、およそ25種の抗レトロウイルス薬がHIV-1の治療用に認可され、9種のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)、4種の非-ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NNRTI)、9種のプロテアーゼ阻害剤(PI)、1種の融合阻害剤、1種のCCR5阻害剤、及び1種のインテグラーゼ阻害剤(Shafer及びSchapiro、2008)が含まれる。しかし、これらの現行のレジメンはいずれも、完全なウイルス排除はもたらさず、それらは重症の副作用をもたらすことがあり、抗ウイルス耐性も未だ大きな懸念である。したがって、特に、シクロフィリン阻害剤の場合のように、認可された薬物がない作用機序クラスにおいて、新しい抗ウイルス療法の必要が未だ存在する。
B型肝炎はヘパドナウイルス科のDNAウイルスであり、B型肝炎の原因因子である。HCV及びHIVの場合とは異なり、B型肝炎ウイルスに対するシクロフィリン阻害剤の活性を発表した記述は非常に少なかった。Ptakら(2008)は、HBVに対するDebio-025の弱い活性(IC50は4.1μM)を記載したが、Xieら(2007)はHBVに対するCsAのいくらかの活性(IC50>1.3μg/mL)を記載した。これはHIV及びHCVとは対照的であり、HIV及びHCVではシクロフィリン阻害剤のナノモーラーの抗ウイルス活性の報告が多数ある。
HBVは世界中で最大4億人を感染させており、ウイルス性慢性肝炎及び肝細胞癌の主な原因である。2008年現在、HBVの治療に認可された薬物が6種ある;インターフェロンアルファ及びペグ化インターフェロンアルファ、3種のヌクレオシドアナログ(ラミブジン、エンテカビル、及びテルビブジン)、及び1種のヌクレオチドアナログ(アデホビルジピボキシル)。しかし、耐性の率の高さ、許容性の低さ、及び起こり得る副作用のため、新しい治療選択が必要とされている(Ferirら、2008)。
ミトコンドリアの高コンダクタンスの膜透過性遷移孔の開口は、ミトコンドリア透過性遷移(MPT)のオンセットを開始する。これは原因として作用する事象であり、酸化ストレス、Ca2+毒性、及び虚血/再潅流後の肝細胞における壊死及びアポトーシスをもたらす。シクロフィリン阻害剤によるシクロフィリンD(シクロフィリンFとしても知られる)の阻害は、透過性遷移孔の開口を遮断することが示されており、これらのストレスの後の細胞死を保護する。したがって、シクロフィリンD阻害剤は、筋ジストロフィー、特にウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー及びベスレムミオパチー(Millayら、2008、国際公開第2008/084368号、Palmaら、2009)、多発性硬化症(Forteら、2009)、糖尿病(Fujimotoら、2010)、筋萎縮性側索硬化症(Martin 2009)、双極性障害(Kubotaら、2010)、アルツハイマー病(Du及びYan、2010)、ハンチントン病(Perryら、2010)、心筋梗塞後の回復(Gomezら、2007)、及び慢性のアルコール消費(Kingら、2010)など、mPTP開口が原因である適応症において有用になり得る。
シクロフィリン阻害剤は、水痘帯状疱疹ウイルス(Ptakら、2008)、A型インフルエンザウイルス(Liuら、2009)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス並びに他のヒト及びネココロナウイルス(Chenら、2005、Ptakら、2008)、デングウイルス(Kaulら、2009)、黄熱病ウイルス(Qingら、2009)、西ナイルウイルス(Qingら、2009)、西部馬脳炎ウイルス(Qingら、2009)、サイトメガロウイルス(Kawasakiら、2007)、及びワクシニアウイルス(Castroら、2003)などの他のウイルスに対して潜在的な活性を有し、そのためこれらのウイルス感染症の治療において潜在的な活性を有する。
癌など、他の治療分野におけるシクロフィリン阻害剤及びシクロフィリン阻害の効用についても報告がある(Hanら、2009)。
サングリフェリンなどの化合物の薬物開発における問題の1つは、経口バイオアベイラビリティの低下をもたらす、急速な代謝及びグルクロン酸抱合である。これが、食物による影響の可能性を高め、剤形からの不完全放出をより頻繁にし、患者間のばらつきを大きくする可能性がある。
-従来技術のシクロフィリン阻害剤、シクロスポリンA、DEBIO-025 (アリスポリビル)、及びサングリフェリンAと比較して、HCV及びHIVに対する向上した抗ウイルス効力;
-従来技術の化合物サングリフェリンAと比べて、低下したクリアランス及び増加した経口曝露(oral expose);
-従来技術のシクロフィリン阻害剤シクロスポリンA、DEBIO-025(アリスポリビル)、及びサングリフェリンAと比べて、CypA PPIアーゼ活性のより効力の高い阻害;
-ビリルビントランスポーター(OATP-1B1、OATP-1B3、MRP2、及びMRP3)の阻害低減及び生体異物トランスポーター(Pgp及びBSEP)の阻害低減により示される、向上した副作用プロファイル及び低減した薬物-薬物相互作用。
を、その任意の互変異性体;及びC-53ケト及びC-15ヒドロキシル基とメタノールの組み合わせによりケタールが形成されている、そのメタノール付加物を含めて、提供する。
式(I)の定義に含められる具体的な互変異性体は、(i) C-53ケト基がC-15ヒドロキシルとヘミケタールを形成するもの、又は(ii)C-15及びC-17ヒドロキシルがC-53ケトと結合してケタールを形成できるものである。番号付けは全て、親サングリフェリンA構造の体系を使用する。
さらなる態様において、本発明は、固体結晶形(形態I)にある式(I)のマクロ環状サングリフェリンアナログを提供する。
冠詞「a」及び「an」は、1つ又は2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)の該冠詞の文法的な対象を意味するように本明細書において使用される。例としては、「アナログ」は、1つのアナログ又は2つ以上のアナログを意味する。
本明細書では、用語「アナログ(複数可)」は、互いに構造的に類似しているが組成がわずかに異なる(1つの原子を他の原子で置き換える、又は特定の官能基の有無など)化合物を意味する。
本明細書では、用語「HIV」は、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト後天性免疫不全症候群の原因因子を意味する。
用語「治療」には、予防的処置並びに治療的処置が含まれる。
用語「式II」は、式IIA及び式IIBをまとめて意味する。
本発明は、先に述べられたマクロ環状サングリフェリンアナログ、この化合物の製造方法、及び医薬におけるこの化合物の使用方法を提供する。
一実施態様において、該化合物は、C-53ケト及びC-15ヒドロキシル基とメタノールの組み合わせによりヘミケタールが形成されている、そのメタノール付加物である。別の実施態様において、それはメタノール付加物ではない。
さらなる実施態様において、固体結晶形の式(I)のマクロ環状サングリフェリンアナログが提供される。特に、式(I)の非晶質マクロ環状サングリフェリンアナログのメチルイソブチルケトン (MIBK)からの結晶化により得られる(又は得られた)マクロ環状サングリフェリンアナログの固体結晶形(形態I)が提供される。一実施態様において、該非晶形はMIBK中にスラリー化され、例えば、1時間、2時間、5 時間、24 時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、又は2週間の全期間、最低温度と最高温度の間で温度が循環される。一実施態様において、該温度は、周囲温度と60℃の間、例えば、周囲温度と40℃の間で循環される。一実施態様において、該温度は、最低温度と最高温度の間で(逆も同様)、2〜8時間ごと、例えば3〜5時間ごと、又は4時間ごとに循環する。好ましい実施態様において、該温度は、4時間ごとに、周囲温度と40℃の間で合計5日間循環される。
結晶性多形体Iの形態の式(I)のマクロ環状サングリフェリンアナログは、実質的に図2に示されるとおりのX線粉末回折(XRPD)パターンを有する。表2 (実施例8)は、ピークの一覧及び相対強度を示す。XRPDデータを得る方法は全般的方法に記載されている。
一般に、本発明の化合物は、変異合成による式(II)の化合物の生成と、それに続く半合成により製造される。
・サングリフェリン産生株(ストレプトマイセス属sp.A92-308110、DSM 9954としても知られるなど)の培養物、又は、より好ましくは、sfaA遺伝子又はsfaA遺伝子のホモログが不活化されているか又は欠失しているサングリフェリン産生株の培養物を、発酵ブロスに接種すること
・該発酵ブロスに、メタ-チロシンアナログ(式(III)で示されるとおり、例えば、(S)-メチル2-アミノ-3-(3-フルオロ-5-ヒドロキシフェニル)プロパノアート、DL-5-フルオロ-メタ-チロシン(9)、又はメチル2-アミノ-3-(3-フルオロ-5-ヒドロキシフェニル)プロパノアート(10))を供給すること
・式IIA及び式IIBの化合物が産生されるまで、発酵を継続させること
・式IIA及び式IIBの化合物を抽出及び単離すること
・式IIA及び式IIBの化合物を半合成誘導体化して、式Iの化合物を生成させること。
式(III)の化合物は、市販されているか、又は、標準的な有機合成化学技術によって製造される。式(III)の化合物に至る1つの一般的な経路は、以下のスキーム1aに示されるとおりである:
スキーム1a:a)式(IV)のアルデヒドの好適なフラグメント、例えば、(R11O)2P(O)CH(NHPG)CO2R10とのカップリング、及びb)必要に応じて、水素化及び脱保護。PG=保護基。
(a)サングリフェリンアナログのジヒドロキシ化;
(b)該1,2-ジオールの酸化開裂によるアルデヒドの生成;及び
(c)式Vの化合物を用いる、ホスホナートカルバニオンなどの安定化されたカルバニオン(又はその限界構造)と前記アルデヒドとのカップリング。
これは、逆合成の形式で下記に示される:
(式中、サングリフェリンA変異合成アナログでは、R12は
である)。
したがって、本発明の化合物を製造する方法は、式(V)の化合物をアルデヒド性マクロ環(式(VI)の化合物)と反応させることを含む。
スキーム1(下記)に示されるとおり、適切なアミンを使用して、クロロアセチルクロリド又は類似物を処理して、α-クロロアミドを形成できる。次いで、α-クロロアミドをアルブゾフ反応で処理して、式Vの化合物を生成させる。式Vの化合物に至る別な経路は当業者には明らかであろう。
式(V)のさらなる化合物は公知であり得るか、又は入手可能なカルボン酸誘導体(例えば、R3COX)(式中、R3は、スキーム2に示されている1,2-オキサジナン環である)から容易に合成できる。スキーム2(下記)に示されるとおり、カルボン酸誘導体は、メチルホスホナートが塩基により処理された後、該ホスホナートにカップリングできる。これにより式(V)の化合物が生じるが、式Vの化合物に至る他の経路は当業者に明らかであろう。
望まれる場合又は必要な場合、T. W. Green及びP. G. M. Wutsの文献、「有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」 Wiley-Interscience, New York, 1999に記載のとおり、保護基を利用して、アルデヒド性マクロ環若しくはマクロ環、又は式Vの化合物の官能基を保護することができる。
好都合なことに、保存剤及び緩衝剤などの薬剤はビヒクル中に溶かすことができる。安定性を増すために、組成物を、バイアルに充填した後に凍結でき、真空下で水が除去される。次いで、凍結乾燥された乾燥散剤をバイアルに密封し、付随する注射用の水のバイアルを供給して、使用前に液体を再構成できる。
組成物は、投与の方法により、0.1重量%から、好ましくは5〜60%、より好ましくは10〜30重量%の本発明の化合物を含み得る。
-医薬として使用するための、本発明の化合物
-HCV若しくはHIV感染などのウイルス感染症(特にRNAウイルス感染症)を治療するための医薬として使用するための、抗炎症薬として使用するための、又は臓器移植拒絶反応の予防のための、本発明の化合物
-本発明の化合物を、医薬として許容し得る希釈剤又は担体とともに含む、医薬組成物
-本発明の化合物を、医薬として許容し得る希釈剤又は担体とともに含み、第2の又は二次の有効成分、特にHCV若しくはHIV感染などのウイルス感染症の治療に適応される有効成分、抗炎症薬として使用するための有効成分、又は、臓器移植拒絶反応の予防のための有効成分をさらに含む、医薬組成物
-治療有効量の本発明の化合物を対象に投与することを含む、HCV若しくはHIV感染などのウイルス感染症(特にRNAウイルス感染症)の治療方法、抗炎症薬としての使用の方法、又は臓器移植拒絶反応の予防方法
-HCV若しくはHIV感染などのウイルス感染症の治療のための医薬、抗炎症薬として使用するための医薬、又は、臓器移植拒絶反応の予防のための医薬の製造のための、本発明の化合物の使用。
(材料及び方法)
(菌株及び増殖条件)
BIOT-4253及びBIOT-4370とも称されるサングリフェリン産生株ストレプトマイセス属種A92-308110(DSM no 9954、ドイツ、ブラウンシュヴァイクのDSMZから購入)、又はBIOT-4585などのその誘導体を、オートミール寒天培地、MAM、ISP4、又はISP2(下記参照)上で28℃で維持する。
(S)-メチル2-アミノ-3-(3-フルオロ-5-ヒドロキシフェニル)プロパノアートをNetChem社(米国)から購入した。(3-ブロモ-5-フルオロアニソール(9-1)をAccela ChemBio社(上海、中国)から購入したが、Amfinecom社(米国)又はApollo Scientific社(英国)からも購入可能である)。DL-5-フルオロ-メタ-チロシン(9)及びメチル2-アミノ-3-(3-フルオロ-5-ヒドロキシフェニル)プロパノアート(10)を以下のとおり合成した。
10(300mg、1.4mmol)のEtOH(30mL)溶液に、NaOH水溶液(2N、4mL)を加え、該反応物を室温で30分間撹拌した。該溶媒を除去し、該残渣を2N HClでpH=6に中和し、形成された白色結晶を濾過により回収すると、対象化合物9を与えた。
(3,5-ジフルオロブロモベンゼン(9a-1)をDarui Fine Chemicals社(上海、中国)から購入したが、Alfa Aesar社又はSigma Aldrich社からも購入可能である)。
BnOH(1.61mL、15.54mmol)のDMF(30 mL)溶液に、0℃のNaH(622mg、鉱油中60%の分散液、15.54mmol)を加えた。撹拌を室温で0.5時間続けると、透明な溶液を与えた。9a-1(1.79mL、15.54mmol)を、温度を40℃未満に保つような速度で加えた。該混合物を室温で一晩撹拌すると、黄色の溶液を与えた。該反応を水でクエンチし、石油エーテル(35mL×4)で抽出した。合わせた有機層を濃縮した。そして、残渣を、石油エーテルで溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製すると、9a-2(2.544g)を無色の油として与えた。
乾燥した三つ口フラスコ(three flask)に、Mg(170.1mg、7.10mmol)、無水THF(10mL)、及び少量のヨウ素を窒素下で加えた。THF(2mL)中の9a-2(1.664g、5.9192mmol)の1/3を加えた。該混合物を還流まで加熱した。この時間の間、黄色混合物は次第に明るい黄色になった。次いで、9a-2の残りの2/3を滴加し、該反応混合物をさらに0.5時間還流した。
メチル2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)アセタート、9a-4(993 mg、3.00 mmol)のDCM(30mL)溶液に、DBU(832μL、5.57mmol)を室温で加えた。10分後、9a-3(694mg、3.01mmol)を加え、生じた混合物を室温で1時間撹拌した。該溶液をHCl(1M、10mL)で洗浄し、合わせた有機層を乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣を、シリカのフラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/酢酸エチル=10/1で溶出)により精製すると、9a-5(1.11g)を与えた。
9a-5(100mg)のMeOH(50mL)溶液を、20mgの10% Pd/C上で、常圧で2時間水素化した。触媒を濾去した後、溶媒を蒸発させると、10(33mg)を与えた。
培地の調製に使用した水は、Millipore Elix Analytical Grade Water Purification Systemを使用して調製した。
BIOT-4585(構築方法論用、実施例1参照)の凍結保存胞子ストックを室温で解凍した。増殖性培養(種培養)は、胞子ストック4.0mLを、フォームプラグを備えた2Lのエルレンマイヤーフラスコ中のSM25培地400mLに移すことによって調製した。培養は、27℃、250rpm(5.0cm行程)で48時間行った。該種培養から、25mLを、フォームプラグを備えた2Lのエルレンマイヤーフラスコ中の250mLの産生培地SGP2+5%HP20に移した。24℃、250rpm(2.5cm行程)での24時間の培養の後、各産生フラスコに、1Mの塩酸中の、所望の前駆体(例えば、(S)-メチル2-アミノ-3-(3-フルオロ-5-ヒドロキシフェニル)プロパノアート、DL-5-フルオロ-メタ-チロシン(9)、又はメチル 2-アミノ-3-(3-フルオロ-5-ヒドロキシフェニル)プロパノアート(10))の250mMのラセミ溶液又は125mMの鏡像異性的に純粋な溶液を2mL、及び、250mMのDL-ピペラジン酸のメタノール溶液を2mL加えて、前駆体のそれぞれの鏡像異性体の最終濃度を1mMとした。1Mの塩酸の代わりに、DMSOを任意に使用できる。DL-ピペラジン酸を任意に省略できる。24℃、250rpm(2.5cm行程)で、さらに4日間、培養を続けた。
培養ブロス(1 mL)及び酢酸エチル(1 mL)を加え、15〜30分間混合し、次いで10分間遠心分離する。0.4 mLの有機層を回収し、蒸発乾固させ、次いで0.20 mLのアセトニトリルに再溶解させる。
HPLC条件:
C18 Hyperclone BDS C18 カラム 3μ、4.6 mm×150 mm
Phenomenex Analytical C18 Security Guard Cartridge(KJ0-4282)を備える
カラム温度50℃
流速1 mL/分
240 nmで紫外モニター
20 μLアリコートを注入
0分:55% B
1.0分:55% B
6.5分:100% B
10.0分:100% B
10.05分:55% B
13.0分:55% B
溶媒Bは、アセトニトリル+0.1%ギ酸である。
これらの条件下でSfAは5.5分に溶離する。
これらの条件下でSfBは6.5分に溶離する。
(HPLC条件)
C18 Hyperclone BDS C18カラム3μ、4.6 mm×150 mm
Phenomenex Analytical C18 Security Guard Cartridge (KJ0-4282)を備える
カラム温度50℃
流速1 mL/分
210、240、及び254 nmで紫外モニター
0分:10% B
2.0分:10% B
15分:100% B
17分:100% B
17.05分:10% B
20分:10% B
溶媒Aは、水+0.1% ギ酸である。
溶媒Bは、アセトニトリル+0.1% ギ酸である。
MSは、150〜1500amuをスキャンする、スイッチングモード(ポジティブとネガティブの間をスイッチング)で運転する。
およそ2mgの試料を、XRPD用バックグラウンドゼロの単一斜めカットシリカサンプルホルダー(single obliquely cut silica sample holder)にやさしく圧縮した。次いで、試料をPhilips X-Pert MPD回折計に入れ、以下の実験条件を利用して分析した:
管の陽極:Cu
発生装置電圧:40 kV
管電流:40mA
波長アルファ1:1.5406Å
波長アルファ2:1.5444Å
開始角[2θ]: 5
終了角[2θ]: 50
連続スキャン
遺伝子型1HCVに対する抗ウイルス効能を下記のように試験できる:試験物質の添加の1日前に、HCV遺伝子型1b I389luc-ubi-neo/NS3-3'/5.1レプリコン(Vrolijkら、2003)を含み、75cm2の組織培養フラスコ(Techno Plastic Products社製)で、細胞増殖培地[10% FCS、1%非必須アミノ酸(11140035)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン(15140148)、及び2%ジェネティシン(10131027)を補ったDMEM(カタログ番号41965039) Invitrogen社製]中で1.3〜1.4の比で継代し、3〜4日間増殖させたHuh5.2細胞を回収し、6500細胞/ウェル(100μL/ウェル)の密度で96-ウェル組織培養マイクロタイタープレート(抗代謝効果の評価にはFalcon、Beckton Dickinson社製、抗ウイルス効果の評価にはCulturPlate、Perkin Elmer社製)中で、アッセイ培地(DMEM、10% FCS、1%非必須アミノ酸、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)に播種した。マイクロタイタープレートを一晩インキュベートすると(37℃、5% CO2、相対湿度95〜99%)、非コンフルエントな細胞単層を生じる。希釈系列を準備する;各希釈系列を少なくとも二連で実施する。アッセイのセットアップ後に、マイクロタイタープレートを72時間(37℃、5% CO2、相対湿度95〜99%)インキュベートする。
レプリコン細胞(遺伝子型1a(H77)及び2a(JFH-1)のサブゲノムレプリコン)を、ダルベッコ変法必須培地(DMEM)、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(pen-strep)、1%グルタミン、1%非必須アミノ酸、250μg/ml G418で、5%CO2のインキュベーターにおいて37℃で増殖させる。すべての細胞培養試薬は、Mediatech社(ハーンドン、VA)から購入できる。
ミクロソームにおける代謝率は、以下のように分析できる:
マウス又はヒト肝臓ミクロソームを、緩衝液C(0.1Mリン酸カリウム緩衝液、1.0mM EDTA、pH7.4)で、2.5mg/mLの濃度まで希釈した。次いで、5μMの化合物添加溶液(ACN9.5μL中の10mM DMSOストック溶液0.5μLが、緩衝液C 990μLに加えられる)50μLを、ミクロソーム溶液(2.5mg/mL)50μL、緩衝液C 110μLに加えることによってミクロソーム安定性試料を調製し、よく混合した。全ての試料を、37℃でおよそ15分間プレインキュベートした。この後、NADPH溶液(12.5mM)40μLを、穏やかにかき混ぜながら加えることにより、反応を開始した。アリコート(40μL)を、0、15、30、45及び60分で抜き取り、内部標準を含むACN(120μL)でクエンチした。タンパク質を遠心分離(4000rpm、15分)により除去し、LC-MS/MSにより、試料プレートを化合物濃度について分析した。次いで、分析物の濃度を元々存在していた量と比較する標準法により、半減期を計算した。
予め液体窒素中に保存しておいた凍結保存肝細胞を、37±1℃の振盪水浴に2分±15秒間置く。次いで、該肝細胞を、10X体積の予め温めておいたKrebs-Henseleit重炭酸塩(KHB)緩衝液(2000mg/Lグルコース。炭酸カルシウム及び炭酸水素ナトリウム不含。Sigma社)に加え、穏やかにかき混ぜ、500rpmで3分間遠心分離する。遠心分離後、該上清を注意深く除去し、10X体積の予め温めておいたKHB緩衝液を加えて細胞ペレットを再懸濁する。これを穏やかにかき混ぜて、500rpmで3分間遠心分離する。次いで、該上清を除去し、廃棄する。次いで、細胞生存率及び収率を、細胞数により決定し、これらの値を利用してヒト肝細胞懸濁液を作成し適切な播種密度(生存細胞密度=2×106細胞/mL)にする。2Xの投薬溶液を、予め温めておいたKHB(1%DMSO)中で調製する(200μM添加溶液:DMSO 980μLに基質ストック溶液(10mM)20μL、2X投薬溶液:KHB 990μLに200μM添加溶液10μL(希釈後2μM))。
水への溶解度を下記のように試験できる:サングリフェリンアナログの10 mMストック溶液を室温で100% DMSOにおいて調製する。三連の0.01 mLのアリコートを、アンバーバイアル中で、pH 7.3の0.1 M PBS溶液又は100% DMSOにより0.5mLにする。得られた0.2 mM溶液を、IKA(登録商標)vibrax VXRシェーカーで、室温で6時間振盪し、次いで得られた溶液又は懸濁液を2 mLエッペンドルフチューブに移し、13200 rpmで30分間遠心分離する。次いで、上清液体のアリコートを上述のLCMS法により分析する。
細胞透過性を下記のように試験できる:被験化合物をDMSOに溶かして10mMにし、次いで緩衝液にさらに希釈して、最終10μM投薬濃度を与える。蛍光マーカールシファーイエローも含めて、膜完全性をモニターする。次いで、被験化合物をCaco-2細胞単層の頂端膜側にアプライし、基底面コンパートメントへの化合物透過を測定する。これを逆方向に実施し(基底面から頂端へ)、能動輸送を調べる。LC-MS/MSを利用して、被験化合物及び標準対照化合物(プロパノロール及びアセブトロールなど)の両方のレベルを定量化する。
インビボアッセイを利用して、化合物のバイオアベイラビリティを測定することもできる。一般的に、化合物を、静脈内(i.v.)及び経口的(p.o.)の両方で試験動物(例えば、マウス又はラット)に投与し、一定間隔で採血して、薬物の血漿濃度が時間とともに変動する様子を調査する。経時的な血漿濃度の経時変化を利用して、標準モデルを利用して化合物の絶対的なバイオアベイラビリティをパーセンテージとして計算できる。典型的なプロトコルの例を以下に記載する。
サングリフェリンアナログについて、全血を分析する。p.o.投与及びi.v.投与の両方のために、化合物を5%エタノール/5%クレモフォールEL/90%食塩水に配合する。3匹の雄CD1マウスの群に、1mg/kg i.v.又は5若しくは10mg/kg p.o.で投薬する。血液試料(40μL)を、投薬前、及び0.25、0.5、2、8、及び24時間で、伏在静脈を介して採取し、等量のdH20で希釈し、直ちにドライアイス上に置く。試料は、分析まで-70℃で保管する。試料中の本発明の化合物又は親化合物の濃度を、LCMSにより以下のように測定する:20μLの血液:H2O(1:1、v/v)/PK試料を、100ng/mLの内部標準(ヒドロキシルマクロ環、6)20μL、標準溶液/MeOH 20μL及びACN 150μLとともに加え、1500rpmで1分間ボルテックスし、12000rpmで5分間遠心分離する。次いで、該上清をLC-MS/MSに注入する。血中濃度の経時変化をプロットし、それを利用して、全血中濃度-時間曲線下面積(AUC-体循環に達する未変化の薬物の総量に正比例する)を得る。可能な場合には、これらの値を利用してPKパラメーターを得る。
ATCCから入手したHuh-7及びHepG2細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(pen-strep)及び1%グルタミンを含むダルベッコ変法必須培地(DMEM)で増殖させ;一方、CEM細胞(ATCCから入手したヒトT-細胞白血病細胞)を、10%FBS、1%pen-strep及び1%グルタミンを含むRPMI 1640培地で増殖させる。新鮮なヒトPBMCを、少なくとも2人の正常な選別ドナーから入手した全血から単離する。簡単に言うと、末梢血細胞を、低速遠心分離及びPBS中での再懸濁により、2〜3回ペレット化/洗浄し、混入している血小板を除去する。次いで、該洗浄した血液細胞を、ダルベッコリン酸塩緩衝化食塩水(D-PBS)で1:1に希釈し、50mLの遠心チューブ内のリンパ球分離培地(LSM;Mediatech社のcellgrow;密度1.078+/-0.002g/ml;カタログ番号85-072-CL)14mL上に層状に重ね、600Xgで30分間遠心分離する。層状になったPBMCを生じた界面から穏やかに吸引し、その後、低速遠心分離によりPBSで2回洗浄する。最後の洗浄の後、トリパンブルー排除により細胞を計数し、15%ウシ胎仔血清(FBS)、2mM L-グルタミン、4μg/mL PHA-Pを補ったRPMI 1640中に、1×107細胞/mLで再懸濁する。該細胞を、37℃で48〜72時間インキュベートする。インキュベート後、PBMCを遠心分離し、15%FBS、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、10μg/mLゲンタマイシン、及び20U/mLリコンビナントヒトIL-2を含むRPMI 1640に再懸濁する。
MDR1(P糖タンパク質1)及びMRP2トランスポーターの阻害及び活性化の評価には、Solvo Biotechnology社のインビトロATPアーゼアッセイ(Glavinasら、2003)が利用できる。化合物(0.1、1、10、及び100μM)を、バナジン酸塩の非存在下と存在下の両方で、MDR1又はMRP2膜小胞と共にインキュベートし、潜在的なATPアーゼ活性化を試験する。さらに、トランスポーターATPアーゼ活性の起こりうる阻害を検出するために、ベラパミル/スルファサラジンの存在下で類似のインキュベーションを実施する。ATPアーゼ活性は、無機のリン酸塩を分光測定により定量化して測定する。活性化は、ATPアーゼ活性のバナジン酸感受性増加から計算する。阻害は、ベラパミル/スルファサラジンに媒介されるATPアーゼ活性の低下から決定する。
P糖タンパク質(Pgp/MDR1)トランスポーターの阻害を評価するために、Cyprotex社のインビトロATPアーゼアッセイを使用した。NIH (ロックビル、メリーランド州、米国)から入手したMDR1-MDCK細胞を使用した。培養後、基底面と頂端側の表面のどちらも、pH 7.4で37℃の緩衝液で2回すすぐことにより、単層を調製した。次いで、頂端側及び基底面のコンパートメントにおいて、細胞をpH 7.4の緩衝液と共に37℃で相対湿度95%、5%CO2で40分間インキュベートし、生理学的パラメーターを安定化させた。頂端側から基底面への試験(A-B)では、pH 7.4の緩衝液を頂端側コンパートメントから除去し、「コンパニオン」プレートに置く前にロペラミド投薬溶液に替えた。該溶液は、ロペラミドをDMSOに緩衝液と共に希釈して調製し、5μMの最終ロペラミド濃度を与えた(最終DMSO濃度を1%に調整した)。蛍光完全性マーカールシファーイエローも投薬溶液に含めた。被験化合物の存在下又は非存在下で実験を実施した(頂端側及び基底面の両コンパートメントに適用した)。基底面から頂端側への(B-A)試験では、P糖タンパク質基質、ロペラミド(最終濃度=5μM)を基底面コンパートメントに配置した。被験化合物の存在下又は非存在下で実験を実施した(頂端側及び基底面の両コンパートメントに適用した)。インキュベーションは、5%CO2を含み相対湿度95%の37℃の雰囲気中で60分間実施した。インキュベーション期間後、コンパニオンプレートを除去し、頂端側及び基底面の試料をLC-MS/MSによる分析のために希釈した。各被験化合物の濃度の1回の測定を実施した。各プレート上で、陽性対照阻害剤もスクリーニングした。被験化合物を、0.1、0.3、1、3、10、30、及び50μMで評価した。実験全体にわたる単層の完全性を、蛍光定量的分析を利用するルシファーイエロー透過のモニタリングにより確認した。分析後、IC50を計算した(すなわち、最大阻害効果の半分を達成する阻害剤濃度(被験薬))。
OAT1B1及びOAT1B3取り込みトランスポーターの阻害を評価するために、Solvo Biotechnology 社のインビトロ取り込みトランスポーターアッセイを利用した。0.068、0.2、0.62、1.8、5.5、16.7、及び50μMの被験物質(Test Article)(TA)による取り込み実験を、ヒトSLCトランスポーターOATP1B1及びOATP1B3を安定に発現しているCHO細胞に対して実施した。親細胞系CHO-Kを陰性対照として使用した。細胞(5 mM 酪酸ナトリウムを補ったダルベッコ変法イーグル培地とHam’s F-12 DMEM(F-12、Lonza、ニュージャージー州、米国)の1:1混合物200μl中に1×105)を標準の96-ウェル培養プレートに播種し、実験24時間前に、37℃で、5%CO2及び95%空気の雰囲気中でインキュベートした。実験前に、培地を真空吸引によりアスピレートし、細胞を2 ×100μlのpH7.3のKrebs-Henseleit緩衝液(Sigma chemicals、Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州)で洗浄した。取り込み実験は、37℃で、プローブ基質及びTA又は溶媒をそれぞれ含むKrebs-Henseleit緩衝剤(pH 7.3)50μl中で実施した。有機溶媒濃度は各ウェルで等しく、1% v/v以下であった。OATP1B1アッセイのプローブ基質はE3S(0.1μM)であり、OATP1B3アッセイではFluo-3(10μM)であった。プローブ基質のトランスロケートされた量はcpmで各ウェルに対して決定した。相対活性は、以下の式から計算した:
活性%=(A-B)/(C-D)×100
(式中、A=TAの存在下でのトランスフェクトされた細胞上の基質のトランスロケートされた量、B= TAの存在下での親細胞上の基質のトランスロケートされた量、C=溶媒の存在下でのトランスフェクトされた細胞上の基質のトランスロケートされた量、及びD=溶媒の存在下での親細胞上の基質のトランスロケートされた量)。IC50は、プローブ基質の輸送を50%阻害するのに必要なTA濃度と定義した。IC50は、3パラメーターロジステック方程式(three-parameter logistic equation);非線形回帰により、相対活性対TA濃度プロットに適合させた曲線から誘導した。
MRP2、MRP3、及びBSEP排出トランスポーターの阻害を評価するために、Solvo Biotechnology社のインビトロ小胞トランスポーターアッセイを使用した。被験物質(TA)(0.068、0.2、0.62、1.8、5.5、16.7、及び50μM)を、排出トランスポーター膜小胞(Solvo Biotechnology社)と共に、4mMのATPの存在下又は非存在下の両方でインキュベートし、トランスポーターが媒介する取り込みと小胞へのTAの受動拡散との間を区別した。MRP2及びMRP3の場合、トランスポーター反応は、2 mMのグルタチオンの存在下で実施した。反応混合物を37℃で10分間プレインキュベートした。25μlの12mM MgATP(アッセイの最終濃度4 mM)又はバックグラウンド制御用のアッセイ緩衝液の添加により反応を開始した。200μlの氷冷洗浄緩衝液を加えて反応を停止し、すぐに96-ウェルフォーマット(フィルタープレート)中でガラス繊維フィルターで濾過した。シンチレーション緩衝液を、洗浄及び乾燥したフィルタープレートに加え、その後シンチレーションをカウントした。プローブ基質は、BSEP小胞にはタウロコール酸塩(2μM)であり、MRP2及びMRP3小胞にはE217βG(1μM)であった。全てのウェルで、プローブ基質のトランスロケートされた量を、cpm単位で決定した。相対活性は、以下の式により計算した:
活性%=(A-B)/(C-D)×100
(式中、A=TA及びATPの存在下での基質のトランスロケートされた量、B=TAの存在下での基質のトランスロケートされた量、C=溶媒及びATPの存在下での基質のトランスロケートされた量、及びD=溶媒の存在下での基質のトランスロケートされた量)。IC50は、プローブ基質の輸送を50%阻害するのに必要なTA濃度と定義した。IC50は、3パラメーターロジステック方程式;非線形回帰により、相対活性対TA濃度プロットに適合させた曲線から誘導した。
HIVに対する抗ウイルス効能を下記のとおり試験できる:血液由来CD4+T-リンパ球及びマクロファージを既報のとおり単離する(Bobardtら、2008)。簡単に述べると、ヒトのPBMCを、フィコール・ハイパック上で層状にする(30分、800g、25℃)ことにより鮮血から精製した。一次ヒトCD4+ T細胞を、抗-CD4ダイナビーズによるポジティブ選択及びその後のデタッチャビーズを使用する放出によりPBMCから精製した。10% FCS、MEMアミノ酸、L-グルタミン、MEMビタミン、ピルビン酸ナトリウム、及びペニシリンプラスストレプトマイシンを補った RPMI培地1640(Invitrogen社)中で細胞を培養し、その後、細菌性スーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB; 100 ng/ml)及び他のドナーから得たマイトマイシンCにより殺傷されたPBMC(10:1 PBMC:CD4細胞比)により活性化させた。刺激の3日後、細胞を、IL-2(200 単位/ml 最終濃度)を含む培地中で1:2に分けた。次いで、培養物をIL-2培地中で2日ごとに1:2に分け、刺激後7日にHIVに感染させた。初代ヒトマクロファージを生成させるために、単球をネガティブ選択によりヒトPBMCから精製し、10% FCS、MEMアミノ酸、L-グルタミン、MEMビタミン、ピルビン酸ナトリウム、及びペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシン(100 mg/ml)、並びに50 ng/mlのリコンビナントヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を補ったDMEM中で106/mlの細胞濃度で活性化及び培養し、5%CO2を補った加湿雰囲気中で37℃に維持した。単球誘導マクロファージを得るために、細胞をプラスチックに付着させ、6日間培養して分化させた。
HBVに対する抗ウイルス効能を下記のように試験できる:HepG2 2.2.15細胞を96-ウェルマイクロタイタープレートに播種する。16〜24時間後、HepG2 2.2.15細胞のコンフルエントな単層を洗浄し、三連で種々の濃度の被験化合物(例えば、6回のハーフログ濃度)を含む完全培地と替える。3日後、培地を、適切に希釈された被験化合物を含む新鮮な培地に替える。被験物質の最初の投与の6日後、細胞培養物上清を回収し、プロナーゼで処理し、次いで、リアルタイム定量的TaqMan qPCRアッセイに使用する。増幅されたHBV DNAにハイブリダイズするクエンチされた蛍光プローブ分子のエキソヌクレアーゼ分解から生じる蛍光シグナルの増加をモニタリングすることにより、PCR増幅されたHBV DNAをリアルタイムに検出する。各PCR増幅に対して、精製されたHBV DNAの希釈物を使用して、検量線が同時に生成される。抗ウイルス活性を、HBV DNAレベルの低下から計算する(IC50)。次いで、色素取り込みアッセイを利用して、細胞生存率を測定し、それを利用して毒性(TC50)を計算する。治療指数(TI)をTC50/IC50として計算する。
免疫抑制活性を下記のとおり試験した:末梢血単核細胞(PBMC)集団を、ヒストパック上での遠心分離を利用して、2名の正常な関連性のないボランティアドナー(A及びB)の血液から精製した。細胞を計数し、補助剤及び2%ヒトAB血清を含むRPMI培地中で、96ウェルプレート中で1×105細胞/ウェルで播種した。
培養条件は下記のとおりであった:それぞれ6種の異なる濃度での被験物質の存在下又は非存在下の、細胞集団A及びBのみ並びに細胞A及びBの混合集団。化合物を、1-logの増加分で10μM〜0.0001μMの範囲の投与量で試験した。対照ウェルは、被験化合物ウェルに存在するものに相当する濃度のビヒクル(0.5% DMSO)を含んでいた。培養物を三連で96ウェルプレートに確立し、加湿雰囲気中で5% CO2中37℃でインキュベートした。3H-チミジンをアッセイセットアップの6日後に加え、24時間後に採取した。次いで、異なる培養条件の間の増殖のレベルを比較した。
被験化合物の各希釈物がMLR中の増殖を阻害する能力を、阻害パーセンテージとして計算した。これにより、IC50(1分あたりのカウントの50%低減をもたらした被験化合物の濃度)の評価ができた。IC50を計算するために、X軸を対数スケールに変換した。非線形回帰を利用して、平均のデータポイントに適合させた。S状の可変の傾きを選択した。
このアッセイを利用してCyp-NS5A複合体の分裂を測定したが、これはシクロフィリンDとの相互作用の効力を示すのに使用できる。簡単に述べると、リコンビナントGST、GST-CypD、及びCon1 NS5A-Hisタンパク質の産生及び精製を既報のとおり実施した(Chatterjiら、2010)。Nunc MaxiSorb 8-ウェルストリッププレートをGST又はGST-CypDにより4℃で16時間コーティングし、ブロックした。リコンビナントNS5A-His(1 ng/mL)を、50μLの結合緩衝液(20 mM Tris pH 7.9、0.5 M NaCl、10% グリセロール、10 mM DTT、及び1% NP-40)中4℃で16時間ウェルに加えた。次いで、捕捉されたNS5A-Hisを、マウス抗His抗体(1 μg/mL)(抗-6xHis、Clontech社製)及びウサギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼホスファターゼ(HRP)抗体(1:1000希釈)を使用して検出した。実験は全て、2つの異なるバッチのリコンビナントCypD及びNS5Aタンパク質を使用して2回行った。
シクロフィリンとの相互作用を分析するための別な方法論が下記のとおり記載される:GST-CypA又はDのトロンビン開裂により生じるリコンビナントCypA又はDのPPIアーゼ活性を、キモトリプシンによるN-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリドの加水分解速度を追跡することにより決定した。キモトリプシンはトランス型のペプチドのみを加水分解し、シス型は、その濃度が470 mM LiClを含むトリフルオロエタノールに溶解しているストックを用いることにより最大になるが、その加水分解はシストランス異性化の速度により限定されている。CypA又はDを、0.1〜20 nMの薬物濃度範囲を利用して5℃で1時間選択された被験物質と平衡化させた。ペプチドの添加により反応を開始させ、吸光度の変化を1秒あたり10データポイントで分光測定によりモニターした。加水分解のブランク速度(CypA又はDの非存在下)を、CypA又はDの存在下での速度から引いた。酵素反応の初期速度を、吸光度変化の経時変化の一次回帰分析により分析した。
(1.1 sfaA欠失コンストラクトの構築)
sfaA(ヌクレオチド位置14396〜21362、NCBI配列受入番号FJ809786)を含むコスミドTL3006(配列番号3)の〜7kbのEcoRV-StuIフラグメントを、EcoRV及びStuIによる消化によって切り取り、得られた単離フラグメントを、予めEcoRVで消化され、エビアルカリホスファターゼ(Roche社)で処理されたpKC1139に直接ライゲートした。このプラスミドをpSGK268と命名した。
このクローンに含まれるsfaA遺伝子のインフレーム欠失は、Gene Bridges社により供給されるRed/ET組換えキット(カタログ番号K006)を使用して行った。
2つのオリゴヌクレオチド、SfaA17161f及びSfaA17825rを使用して、KOD DNAポリメラーゼを使用するキットで供給されるFRT-PGK-gb2-neo-FRTテンプレートDNAから、ネオマイシンマーカーを増幅した。得られた〜1.7kbの増幅産物を、ゲル電気泳動によって単離し、QiaEXレジンにより該ゲルから精製した。
プラスミドpSGK271を、標準技術を使用して大腸菌ET12567 pUZ8002に形質転換し、アプラマイシン(50μg/ml)、カナマイシン(25μg/ml)及びクロロアムフェニコール(chloroamphenicol)(10μg/ml)を含む2TYプレート上で選別した。得られた株を、アプラマイシン(50μg/ml)、カナマイシン(25μg/ml)及びクロロアムフェニコール(10μg/ml)を含む3mlの液体2TYに接種し、37℃、250rpmで、一晩インキュベートした。この培養液0.8mlを使用して、アプラマイシン(50μg/ml)、カナマイシン(25μg/ml)及びクロロアムフェニコール(10μg/ml)を含む、50mlのファルコンチューブ中の液体2TY 10mlに接種し、OD600nmが〜0.5に達するまで、37℃、250rpmでインキュベートした。得られた培養物を、4℃、3500rpmで10分間遠心分離し、2TY培地10mlによる洗浄を、各洗浄の後に遠心分離によって細胞をペレット化しつつ、2回行った。得られたペレットを、2TY 0.5mlに再懸濁し、使用に先立って氷上に保持した。このプロセスのタイミングは、以下に記載のストレプトマイセス胞子の調製の完了に合わせた。
よく胞子形成した菌株の、単一の〜7mmの寒天プラグを使用して、滅菌SM25-3培地7mlに接種し、2インチ行程振盪機において、27℃、200rpmでインキュベートした。48時間の増殖の後、この培養物0.7mlを、5%のHP20樹脂とともにSGP2培地7mlを含む滅菌ファルコンチューブに移した。回収前に、1インチ行程の振盪インキュベーターで、24℃、300rpmで5日間、培養物を増殖させた。細菌培養物0.8mlを取り出し、等分の前に培養物全体にわたって樹脂を十分に分散させることを確実にしながら、2mlのエッペンドルフチューブに等分した。アセトニトリル0.8ml及びギ酸15μLを加え、該チューブを約30分間混合した。該混合物を遠心分離によって清澄化し、該抽出物170μLをHPLCバイアルに移して、HPLCにより分析した。
菌株の抽出物をHPLCにより分析した。サングリフェリンA及びBを産生する菌株は、野生型に復帰しているので、それ以上分析しなかった。サングリフェリンA及びB産生が欠如している菌株は、サングリフェリン様発色団を表す、保持時間6.5分の低レベル(〜1〜2mg/L)のピークを示した。LCMSによる分析によって、このピークは、サングリフェリンの期待されるm/z値から-16単位の、m/z値1073を有することが示された。このピークは、メタ-ヒドロキシチロシン不存在下でのフェニルアラニンの取り込みによるものと推論した。
他の方法を使用して、sfaA欠失変異体を作製することができる。例としては、sfaA挿入不活化変異体(WO2010/034243の実施例12など)が挙げられる。この菌株を、WO2010/034243に記載されているように作製し、菌株名BIOT-4452を与えた。
を利用し、テンプレートとしてのコスミドTL3006(配列番号3)及びKOD DNAポリメラーゼを使用して、ホモロジーの上流領域を増幅する。該増幅産物をT4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB)で処理し、エビアルカリホスファターゼ(Roche社)で処理することにより脱リン酸化してあるpUC18にクローン化する。得られるコンストラクトを制限消化によりチェックし、完全に配列決定して、所望の配列が生成されており、かつポリメラーゼ増幅の間にエラーが導入されていないことを確実にする。このコンストラクトをEcoRI及びNsiIで消化し、該生成物をゲル電気泳動によって分析する。所望の配列を含むバンド(即ち、上流ホモロジー〜2kb)を該ゲルから切り取り、標準的な手順(QiaEXレジン)を使用して精製する。第2の系列のオリゴヌクレオチド:
を利用して、テンプレートとしてのコスミドTL3006(配列番号3)及びKOD DNAポリメラーゼを使用して、ホモロジーの下流領域を増幅する。該増幅産物をT4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB)で処理し、エビアルカリホスファターゼ(Roche社)で処理することによって脱リン酸化してあるpUC18にクローン化する。得られるコンストラクトを制限消化により分析し、完全に配列決定して、所望の配列が生成されており、かつポリメラーゼ増幅の間にエラーが導入されていないことを確実にする。このコンストラクトをHindIII及びNsiIで消化し、該生成物をゲル電気泳動により分析する。所望の配列を含むバンド(即ち下流ホモロジー〜2kb)を該ゲルから切り取り、標準的な手順(QiaEXレジン)を使用して精製する。ベクターpKC1139をEcoRI及びHindIIIで消化して、該大きいベクターフラグメントをゲル電気泳動により単離し、標準的な方法(QiaEXレジン)により精製する。次いで、単離された上流及び下流のホモロジーフラグメントを、このpKC1139のフラグメントにスリーウェイライゲーションでクローン化して所望のsfaA欠失コンストラクトを作製する。
これらの代替的なsfaA欠失コンストラクトを、実施例1.2に記載の方法を使用して、接合及び二次交差(secondary cross)の選択によりストレプトマイセス属sp.A92-308110(DSM9954)に導入する。このように構築した菌株の増殖及び分析も、実施例1.2に記載の方法に従う。
sfaAが破壊された変異体(BIOT-4452又はBIOT-4585)の胞子ストックを、MAM、ISP4、ISP3又はISP2培地での増殖後に調製し、蒸留水中の20%w/vグリセロールに保存して、-80℃で保管した。増殖性培養(種培養)は、胞子ストック(1%v/v)を、フォームプラグを備えた50mLの遠心チューブ内の種培地(SM25培地)7mLに接種することにより調製した。該培養チューブを、27℃、250rpm(5cm行程)で48時間インキュベートした。該種培養から、10%(v/v)を、フォームプラグを備えた50mLの遠心チューブ内の7mLの産生培地SGP-2に移した。培養を、24℃、300rpm(2.5cm行程)で実施した。サングリフェリン変異合成アナログの産生のために、フィード化合物(変異シントン(mutasynthon))の0.32M溶液(1N HCl溶液)0.05mLを、各チューブに接種後24時間で加え、最終濃度を2mMとした。さらに、ピペラジン酸(メタノール溶液)の0.32M溶液0.05mlを、各チューブに24時間で加え、最終濃度を2mMとした。培養を、フィード後さらに4日間続けた。
発酵は、メチル2-アミノ-3-(3-フルオロ-5-ヒドロキシフェニル)プロパノアート及びDL-ピペラジン酸を前駆体として利用して、全般的方法に記載のとおり行い、前駆体は両方とも26時間で加えた。
21-2(123 mg、0.75 mmol)と亜リン酸トリエチル(250 mg、1.50 mmol)の混合物を140℃で6時間撹拌した。該反応混合物を室温に冷却し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製すると21を与えた。
t-BuOK (84.0 g、0.75 mol)のテトラヒドロフラン(2.0 L)溶液に、21a-1(50.0 g、0.38 mol)を室温で少量ずつ加え、該混合物を室温で1時間撹拌した。1,4-ジブロモブタン(81.2 g、0.38 mol)を室温で滴加した。次いで、該混合物を80℃で16時間撹拌した。冷却後、水(2000 mL)を加え、該混合物を酢酸エチルで抽出した(2×1000 mL)。合わせた有機層を無水Na2SO4で16時間乾燥させ、濾過及び濃縮後、残渣を、シリカ-ゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液: 石油エーテル:酢酸エチル=100:1から10:1 )により精製すると、21a-2(57g)を無色の油として与えた。
21a-2(55 g、0.29mol)のtert-ブチルメチルエーテル、TBME(80mL)溶液に、4N HCl(600ml、TBME中)を室温で加え、該混合物を室温で3時間撹拌した。沈殿した固体を濾過し、TBME(50 mL)で洗浄すると、21a-3(30g)を白色固体として与えた。
(21の製造の全般的手順)
21a-4(35 g、0.18 mol)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)(29 g、0.21 mol)、及びEt3N(71 mL、0.51 mol)の無水ジクロロメタン(550 mL)中の撹拌溶液に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCI)(41g、0.21mol)を0℃で少しずつ加えた。該反応混合物を0℃で0.5時間撹拌し、次いで21a-3(24g、0.20mol)を0℃で加え、16時間撹拌した。そうすると、TLC(石油エーテル/酢酸エチル: 3/1)は、反応が完了したことを示した。この時間に、該反応混合物を激しく撹拌しながらゆっくりと水(500mL)に注いだ。該混合物をジクロロメタン(2×200 mL)で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し(2×100mL)、Na2SO4で乾燥させ、濾過及び濃縮すると、粗生成物を与えた。クロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル、100:1 to 10:1)により、21(38g)を黄色の油として与えた。
tert-ブチルアルコール(2.5 wt%、0.079 mmol/ml)中の14(430 mg、0.38 mmol)、(DHQ)2PHAL(18.6 mg、0.024 mmol)、四酸化オスミウム(0.156 mL、0.012 mmol)の撹拌溶液及び20mLのtert-ブチルアルコール中のメタンスルホンアミド(74 mg、0.77 mmol)に、室温で、フェリシアン化カリウム(382 mg、1.16 mmol)及び炭酸カリウム(160 mg、1.16 mmol)の20 mLの水中の溶液を加えると、茶色のエマルションが生じた。2時間後、亜硫酸ナトリウムの溶液を加え、撹拌を20分間続けた。生じた混合物を酢酸エチルで抽出した(3×50 ml)。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、23-2を白色固体として与えた。
21(42 mg、0.168 mmol)のTHF(2.0 mL)溶液に、0℃の無水THF(0.2 mL)中のNaH (1.2 mg、0.05 mmol)を撹拌しながら加えた。次いで、該溶液を、透明になるまで20℃で撹拌した。次いで、23-3(30 mg、0.042 mmol)を、該透明溶液に加え、該混合物を20℃で2時間撹拌した。該混合物を水(10 mL)でクエンチし、酢酸エチルで抽出した(3×20 mL)。有機層をブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、真空中で縮小(reduced)させた。残渣を分取HPLCにより精製すると、24を非晶質白色固体として得た。
10mgの非晶質の化合物24をメチルイソブチルケトン(MIBK)(500μL、50体積)にスラリー化し、次いで温度を、周囲温度と40℃の間で、4時間ごとに合計5日間循環させた。生じた固体を、過剰な溶媒をデカンテーションで除き、次いで真空下で乾燥させることにより単離すると、化合物24を固体結晶形(形態I)で与えた。化合物24の形態IのXRPDパターンを図2に示し、ピークとその相対強度を以下の表2に列記する。XRPDデータを得る方法は、全般的方法に記載されている。
化合物を、全般的方法に記載のとおり、Huh5.2細胞を用いる遺伝子型1bレプリコンアッセイで分析した。シクロスポリンA、1、DEBIO-025、2、サングリフェリンA、5、及びヒドロキシマクロ環、6を比較として含めた。
化合物を、全般的方法に記載されたとおりHeLa細胞を利用してHIV抗ウイルスアッセイにおいて分析した。シクロスポリンA、1、DEBIO-025、HIV抗ウイルス剤エムトリシタビン及びテノホビルを比較として含めた。
インビボの状況における化合物の薬物動態を評価するために、化合物を、poで10又は5mg/kgで、ivで1mg/kgでCD1マウスの群に投薬した。薬物動態分析は、全般的方法に記載のとおり実施した。PKパラメーターを以下に示す。
CypA ペプチジルプロリルシス-トランスイソメラーゼ(PPIアーゼ)活性の直接阻害を評価するために、全般的方法に記載の方法を利用した。シクロスポリン A、1、DEBIO-025、2 、及びサングリフェリンA、5を対照として含めた。
DEBIO-025に見られる用量制限的高ビリルビン血症の原因と考えられるビリルビントランスポーターのオフターゲット阻害の可能性を評価するために、トランスポーター阻害のインビトロ分析を、全般的方法に記載のとおり実施した。
生体異物トランスポーターの阻害による薬物薬物相互作用(DDI)の可能性を評価するために、P糖タンパク質 (Pgp/MDR1)及び胆汁酸塩排出ポンプ(BSEP)阻害のインビトロ分析を、全般的方法に記載のとおり実施した。
明細書及び以下の請求項の全体にわたって、文脈から反対の意味が要求されない限り、「含む(comprise)」という言葉並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」などの変形体は、述べられた整数若しくは工程又は整数の群の包含を意味するが、他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群の排除を意味しないと理解されるだろう。
Claims (11)
- 固体結晶形である、請求項1記載の化合物。
- 形態I結晶性多形体の形態にある、請求項2記載の化合物。
- 医薬として使用するための、請求項1〜3のいずれか1項記載の化合物。
- HCV若しくはHIV感染などのウイルス感染症を治療するための医薬として、又は免疫抑制剤若しくは抗炎症剤として使用するための、請求項1〜3のいずれか1項記載の化合物。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の化合物を、医薬として許容し得る希釈剤又は担体とともに含む、医薬組成物。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の化合物を、医薬として許容し得る希釈剤又は担体とともに含み、さらに第2の又は二次の有効成分を含む、医薬組成物。
- HCV若しくはHIV感染などのウイルス感染症の治療の方法、又は免疫抑制剤若しくは抗炎症剤としての使用の方法であって、対象に、治療上有効な量の請求項1〜3のいずれか1項記載の化合物を投与することを含む、前記方法。
- 請求項3記載の形態I結晶性多形体の形態の式(I)の化合物を製造する方法であって、式(I)の化合物をメチルイソブチルケトンから結晶化させる工程を含む、前記方法。
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