EA023907B1 - Макроциклические соединения и способы их получения - Google Patents

Abstract

Среди прочего предложены соединения формулы (I)для применения в лечении вирусной инфекции или в качестве иммунодепрессанта.

Description

Настоящее изобретение относится к аналогам санглиферина, которые могут применяться в качестве ингибиторов циклофилина, например, при лечении вирусной инфекции, вызываемой такими вирусами, как вирус гепатита С (НСУ), вирус гепатита В (НВУ) и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), и/или в качестве иммунодепрессантов, например, для применения в профилактике отторжения трансплантата, а также в качестве противовоспалительных средств, например, для применения при воспалительных нарушениях. В настоящем изобретении также предложены способы их применения в медицине, в особенности для лечения НСУ или ВИЧ инфекции, и применения в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства при заболеваниях, при которых может применяться ингибирование митохондриальной поры транзиентной проницаемости (тРТР), таких как мышечная дистрофия, или в качестве промежуточных соединений при получении других применяемых в медицине соединений.

Уровень техники

Гепатит С.

Вирус гепатита С (НСУ) представляет собой вирус с позитивным РНК геномом, а вызываемая им инфекция является основной причиной посттрансфузионного гепатита. НСУ является наиболее распространенной хронической инфекцией, передаваемой через кровь, и основной причиной смерти от заболеваний печени в США. По оценке Всемирной организации здравоохранения существует более 170 миллионов хронических носителей НСУ инфекции, что составляет приблизительно 3% населения Земли. Приблизительно у 70-85% инфицированных НСУ пациентов, не проходивших лечение, развивается хроническая НСУ инфекция, и поэтому они подвергаются высокому риску развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. В развитых странах 50-76% всех случаев рака печени и две трети всех пересадок печени вызваны хронической инфекцией НСУ (Маппз е! а1., 2007).

В дополнение к болезням печени у пациентов с хронической инфекцией также могут развиваться другие заболевания, ассоциированные с хроническим НСУ, при этом они являются источником при передаче НСУ другим людям. Инфекция НСУ вызывает не связанные с печенью осложнения, такие как артралгии (боль в суставах), кожную сыпь и повреждение внутренних органов, преимущественно почек. Инфекция НСУ представляет важную проблему мирового здравоохранения, и в настоящее время не существует ни одной доступной вакцины против гепатита С (8!табег е! а1., 2004; 1асоЬзоп е! а1. 2007; Маппз е! а1., 2007; Ра^1о15ку. 2005; 2еи/ет & Негтапп, 2002).

Лечение НСУ.

Современным стандартом лечения (§оС) являются подкожные инъекции пэгилированного интерферона-α (ρΙΡΝα) и пероральное введение противовирусного средства рибавирина в течение 24-48 недель. Успешное лечение определяется наличием стойкого вирологического ответа (8УК), который определяется отсутствием РНК НСУ в сыворотке в конце периода лечения и 6 месяцев спустя. Суммарная эффективность §оС, главным образом, зависит от генотипа и уровней РНК НСУ перед лечением. Пациенты с генотипом 2 и 3 будут с большей вероятностью реагировать на 8оС, чем пациенты, инфицированные генотипом 1 (Ме1шкоуа, 2008; 1асоЬзоп е! а1., 2007).

Существенное количество пациентов с НСУ не реагирует на терапию 8оС должным образом или не может переносить терапию из-за побочных эффектов, что ведет к частым проблемам с прохождением полного курса лечения. Общая клиническая частота 8УК при 8оС составляет лишь приблизительно 50% (Ме1шкоуа, 2008). Развитие резистентности является другим основным фактором неудачной терапии ОасоЬзоп е! а1., 2007). Для 8оС также имеются противопоказания у некоторых пациентов, которых не рассматривают в качестве кандидатов на терапию, таких как пациенты, имевшие случаи тяжелой депрессии или болезни сердца. Побочные эффекты 8оС, которые часто приводят к прекращению лечения, включают гриппоподобные симптомы, лихорадку, усталость, гематологическое заболевание, анемию, лейкопению, тромбоцитопению, алопецию и депрессию (Маппз е! а1., 2007).

Принимая во внимание побочные эффекты, связанные с длительными терпиями с применением 8оС, развитие резистентности и субоптимальный общий процент случаев успешного лечения, для лечения НСУ инфекции срочно требуются более эффективные и более безопасные новые способы лечения. Цели новых способов лечения включают улучшенную эффективность, улучшенный профиль токсичности, улучшенный профиль резистентности, улучшенное качество жизни и итоговое повышение соблюдения пациентом режима лечения. НСУ имеет короткий жизненный цикл и поэтому распространено развитие резистентности к лекарственным средствам в ходе лекарственной терапии.

Разрабатывается новая, специфично направленная противовирусная терапия против гепатита С (8ТАТ-С), также известная как противовирусные лекарственные средства прямого действия (ΌΑΑ), которые направлены против вирусных белков, таких как вирусная РНК-полимераза Ν85Β или вирусная протеаза N83 (1асоЬзоп е! а1., 2007; Рагйепшк е! а1., 2007). Кроме того, также разрабатываются новые соединения, которые направлены против белков человека (например, циклофилины), а не против вирусных мишеней, что может привести к снижению частоты случаев развития резистентности при лекарственной терапии (Маппз е! а1., 2007; Роскгоз, 2008; Ра\\!о1зку 1-М, 2005).

Ингибиторы циклофилинов.

Циклофилины (СуР) являются семейством клеточных белков, которые проявляют пептидил-пролил

- 1 023907 цис-транс-изомеразную активность, облегчающую изменения конформации и фолдинг белка. Белки СуР участвуют в клеточных процессах, таких как регуляция транскрипции, иммунный ответ, секреция белков и митохондриальная функция. Вирус НСУ использует белки СуР в своем жизненном цикле при заражении человека. Первоначально считалось, что белки СуР стимулируют РНК-связывающую активность неструктурного белка НСУ Ν85Β, РНК-полимеразы, которая способствует репликации РНК, хотя были предложены несколько альтернативных гипотез, включая необходимость для РР1-азной активности СуР. Различные изоформы СуР, включая А и В, как полагают, вовлечены в жизненный цикл НСУ (Уаид с! а1., 2008; Арре1 с! а1., 2006; СНаОсгр с! а1., 2009; СайЬст с! а1., 2010). Способность вызывать нокауты в мышиных (Со1даи с! а1., 2000) и человеческих Т-клетках (ВгааЮп аиб ЬиЬаи, 2001) указывает, что СуРА не обязателен для роста и выживания клеток. Подобные результаты наблюдали при прерывании гомологов СуРА в бактериях (Нсгг1сг с! а1., 1994), №иго8рога (Тторксйид с! а1., 1989) и ЗассЬатотусск ссгсуыас (ИоПщЮ с! а1., 1997). Таким образом, ингибирование белков СуР представляет новую и привлекательную хозяйскую мишень для лечения инфекции НСУ, а также новое потенциальное дополнение к существующим лекарственным средствам §оС или ЗТАТ-С/ИАА с целью увеличения ЗУК, предотвращения развития резистентности и уменьшения побочных эффектов при лечении.

ческие аналоги ΌΕΒΙΘ-025 (РаскЬиукс с! а1., 2006; РЙ81ак с! а1., 2008), ΝΙΜ811 (Майу с! а1., 2008) и 8СУ635 (Норк1И8 с! а1., 2009), как известно, связываются с циклофилинами и в качестве ингибиторов циклофилина показали ίη νίΙΐΌ и клиническую эффективность при лечении инфекции НСУ (СгаЬЬс с! а1., 2009; Р1181ак с! а1., 2008; Ма!Ьу с! а1., 2008; 1иоис с! а1., 2007; ΙκΗίί с! а1., 2006; РаскЬиукс с! а1., 2006). Хотя предшествующие исследования резистентности к С'АА выявили мутации в РНК-полимеразе Ν85Β НСУ и привели к предположению, что только циклофилин В будет участвовать в процессе репликации НСУ (КоЬИа с! а1., 2007), недавние исследования указали на существенную роль циклофилина А в репликации НСУ (СЬа!!стр с! а1., 2009; Уаи§ с! а1., 2008). Принимая во внимание то, что мутации в вирусном белке №5А также связаны с резистентностью к СТА. и что №5А взаимодействует и с СуРА, и с СурВ для их специфичной пептидил-пролил цис/транс-изомеразной (РР1-азной) активности, также предполагается роль обоих циклофилинов в вирусном жизненном цикле (Наиои11с с! а1., 2009).

Действие аналогов циклоспорина против НСУ не зависит от иммунодепрессивных свойств, которые зависят от кальциневрина. Это означает, что существенным требованием для активности НСУ является связывание СуР, и связывание кальциневрина не требуется. ΌΕΒΙΘ-025, наиболее клинически совершенный ингибитор циклофилина для лечения НСУ, показал ш уйго и ш νί\Ό активность против четырех самых распространенных генотипов НСУ (генотипы 1, 2, 3 и 4). Исследования резистентности показали, что мутации, придающие устойчивость к ΌΕΒΙΘ-025, отличались от мутаций, описанных для ингибиторов полимераз и протеаз, и что не было никакой перекрестной резистентности со ЗТАТ-С/ЭАА рези- 2 023907 стентными вирусными репликонами. Что еще более важно, ΌΕΒΙΟ-025 также предотвращал развитие мутаций ускользания, которые придают резистентность к ингибиторам протеаз и полимераз (СгаЬЬе с1 а1., 2009).

Впрочем, ингибиторы циклофилина на основе СкА в клиническом исследовании имеют множество проблем, которые, как полагают, связаны с их общим структурным классом и включают некоторые нежелательные явления, которые могут приводить к прекращению терапии и ограничивать уровни клинической дозы; переменная фармакокинетика, которая может приводить к переменной эффективности; и повышенный риск взаимодействий между лекарственными средствами, что может привести к сложностям с введением доз.

Наиболее частые нежелательные явления (АЕ) у пациентов, которые получали ΌΕΒΙΟ-025, включали желтуху, боль в животе, рвоту, усталость и повышенную температуру. Наиболее клинически важными АЕ являлись гипербилирубинемия и снижение количества тромбоцитов (тромбоцитопения). ПЭГ-ΙΡΝ может вызывать сильную тромбоцитопению, и комбинация с ΌΕΒΙΟ-025 может представлять существенную клиническую проблему. Одновременное повышение билирубина и снижение тромбоцитов также было описано в ранних клинических исследованиях с ΝΙΜ-811 (Ке е1 а1., 2009). Хотя гипербилирубинемия, наблюдаемая в ходе клинических исследований ΌΕΒΙΟ-025, устранялась после прекращения терапии, она стала причиной прекращения терапии у 4 из 16 пациентов и снижения уровней дозы в будущих испытаниях. Поскольку противовирусное действие ингибиторов циклофилина при НСУ зависит от дозы, снижение дозы привело к уменьшению противовирусного действия, при этом в ряде последующих испытаний с ингибиторами циклофилина на основе СТА не было показано никаких или показано слабое снижение вирусной нагрузки НСУ при введении доз в качестве монотерапии (Бап11/ е1 а1., 2009; Норктк е1 а1., 2009; №1коп е1 а1., 2009). ΌΕΒΙΟ-025 и циклоспорин А, как известно, являются ингибиторами транспортеров желчи, таких как экспортирующие помпы солей желчных кислот, и других транспортеров печени (в особенности ΟΑΤ1Β1/ΟΑΤ1Β3/ΜΚΡ2/ΜΚΡ3/οΜΟΑΤ/ΑΒ^2) (СгаЬЬе е1 а1., 2009). Было выдвинуто предположение, что взаимодействие с транспортерами желчи, в частности с ΜΡΡ2, может являться причиной гипербилирубинемии, наблюдаемой при высоких уровнях дозы ΌΕΒΙΟ-025 (№1коп е1 а1., 2009, ХУппд е1 а1., 2010). Межлекарственные взаимодействия (ΌΌΙ) с соединениями класса СкА через ингибирование других транспортеров лекарственных веществ, таких как Р-гликопротеин (Ρ§ρ/ΜΌΚ1), ΒδΕΡ, ΟΑΤ1Β1 и ОАТ1В3 (Кош§ е1 а1., 2010), также могут представлять проблему, потенциально ограничивая некоторые комбинации и применение у некоторых пациентов, подвергающихся терапии при сопутствующих инфекциях, таких как ВИЧ-инфекция (Ъебеп е1 а1., 2010).

Кроме того, ΌΕΒΙΟ-025 и циклоспорин А являются субстратами для метаболизма под действием цитохрома Р450 (в особенности СΥΡ3Α4) и, как известно, являются субстратами и ингибиторами человеческого Р-гликопротеина (ΜΌΚ1) (СгаЬЬе е1 а1., 2009). Также было показано, что циклоспорин А является ингибитором СΥΡ3Α4 ίη νίΙΐΌ (№\\а е1 а1., 2007). Это указывает на то, что мог существовать повышенный риск межлекарственных взаимодействий с другими лекарственными средствами, которые являются субстратами, индукторами или ингибиторами СΥΡ3Α4, такими как, например, кетоконазол, циметидин и рифампицин. Кроме того, также ожидаются взаимодействия с лекарственными средствами, которые подвергаются транспорту Р-гликопротеином (например, дигоксин), что может вызывать сильные межлекарственные взаимодействия у пациентов с НСУ, получающих лекарственную терапию для лечения других сопутствующих заболеваний (СгаЬЬе е1 а1., 2009). СкА, как также известно, имеет высоковариабельную фармакокинетику, причем предшествующие лекарственные формы демонстрировали биодоступность 1-89% при приеме внутрь (КариП/ак е1 а1., 2004). Без дорогостоящего контроля уровней в крови пациента это может привести к увеличению частоты возникновения побочных эффектов, вследствие повышенных уровней в плазме или к уменьшению клинического эффекта, вследствие пониженных уровней в плазме.

С учетом того, что ингибирование циклофилинов представляет новый многообещающий подход к лечению НСУ, существует потребность в открытии и создании более эффективных и безопасных ингибиторов СуР для применения в комбинированной терапии против НСУ инфекции.

Санглиферины.

Санглиферин А (δίΆ) и родственные ему природные соединения относятся к классу смешанных нерибосомных пептид/поликетидов, продуцируемых δί^еρΐотусек. кр. А92-308110 (также известным как ΌδΜ 9954) (см., \νΟ 97/02285), которые первоначально были обнаружены, благодаря их высокой аффинности к циклофилину А (СуРА). δ^ является наиболее распространенным компонентом в ферментативных питательных средах и демонстрирует приблизительно в 20 раз более высокую аффинность к СуРА по сравнению с СкА. Это привело к предположению, что санглиферины могли бы применяться для лечения НСУ (νΟ 2006/138507). Также было показано, что санглиферины проявляют более низкую иммунодепрессивную активность, чем СкА, при анализе ίη νίΙΐΌ ЖшдПег е1 а1., 1999; РеЬг е1 а1., 1999). δίΑ связывается с высокой аффинностью с СкА-связывающим сайтом СуРА (Ка11еп е1 а1., 2005).

- 3 023907

Биосинтез санглиферинов.

Санглиферины биосинтезируются смешанной поликетидсинтазой (РК§)/нерибосомной пептидсинтетазой (ΝΚΡδ) (см. νθ 2010/034243). 22-Членный макролидный каркас состоит из поликетидной углеродной цепи и трипептидной цепи. Пептидная цепь состоит из одной природной аминокислоты, валина, и двух неприродных аминокислот: (З)-метатирозина и (З)-пиперазиновой кислоты, связанных амидной связью. Г идроксилирование фенилаланина (ίη кйи на ΝΚΡδ или перед биосинтезом), с образованием (δ)метатирозина, как полагают, проходит через продукт гена кГаА.

Иммунодепрессивное действие санглиферинов.

Иммунодепрессивный механизм действия δ£Ά отличается от механизма действия других известных иммунофилин-связывающих иммунодепрессивных лекарственных средств, таких как СкА, РК506 и рапамицин. δ£Α не ингибирует фосфатазную активность кальциневрина, мишени СкА (Хепке е! а1., 2001), вместо этого его иммунодепрессивную активность связывали с ингибированием интерлейкина-6 (Наг!е1 е! а1., 2005), интерлейкина-12 (Ъ1еткс1ш11е е! а1., 2003) и ингибированием пролиферации интерлейкин-2зависимых Т-клеток (ΖΐΗη§ & Пи, 2001). Однако молекулярная мишень и механизм, посредством которого δ£Α проявляет свое иммунодепрессивное действие, до настоящего времени остаются не известными.

Молекулярная структура δ£Α сложна и его взаимодействие с СуРА, как полагают, в значительной степени опосредовано макроциклической частью молекулы. Фактически, макроциклическое соединение (гидроксимакроцикл), полученное в результате окислительного расщепления δ£Α, показало сильную аффинность к СуРА ^ебгаш е! а1., 2003). Данные рентгено-кристаллографического анализа показали, что гидроксимакроцикл связывается с тем же активным сайтом СуРА, что и СкА. Аналоги на основе макроциклической группы δ£Α, как было также показано ранее, не обладают иммунодепрессивными свойствами (Ъебгаш е! а1., 2003), что обеспечивает возможность создания неиммунодепрессивных ингибиторов СуР для потенциального применения в терапии НСУ.

В противоположность этому также существует возможность создания иммунодепрессивных средств с низкой токсичностью для применения в таких областях, как профилактика отторжения трансплантата, аутоиммунных, воспалительных и дыхательных нарушений, включая, без ограничения, болезнь Крона, синдром Бехчета, увеит, псориаз, атопический дерматит, ревматоидный артрит, нефритический синдром, апластическую анемию, билиарный цирроз печени, астму, фиброз легких, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ) и глютеновую энтеропатию. Было показано, что санглиферины имеют новый механизм иммунодепрессивной активности (Хепке е! а1., 2001), потенциально действуя через хемокины дендритных клеток (1ттеске е! а1., 2011), и поэтому существует возможность создания средств, механизм действия которых отличается от механизма действия существующих клинических средств, таких как циклоспорин А, рапамицин и РК506. Было показано, что санглиферин А в 10 раз менее активен, чем циклоспорин А, таким образом, идеальное новое средство могло бы иметь улучшенную активность и/или терапевтическое окно.

Другие терапевтические применения ингибиторов циклофилинов.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).

Было также показано, что ингибиторы циклофилинов, такие как СкА и ИЕВЮ-025, могут потенциально применяться при ингибировании репликации ВИЧ. Ингибиторы циклофилинов, как полагают, нарушают функцию СуРА в процессе/завершении обратной транскрипции ВИЧ (Р!ак е! а1., 2008). Впрочем, при клинической проверке ИЕВЮ-025 лишь снижал уровни РНК ВИЧ-1 >0,5 и >1 1од10 копий/мл у девяти и двух пациентов соответственно, тогда как у 27 из проходивших терапию пациентов не было показано никакого уменьшения уровней РНК ВИЧ-1 (Ъ1еуп е! а1., 2006). После этого ИЕВЮ-025 испытывали у пациентов с сочетанной инфекцией НСУ/ВИЧ, при этом он показал лучшую эффективность против НСУ, и клинические испытания по ВИЧ были прекращены (см. \ν;·ιΙ;·ικ1ιί е! а1., 2010).

- 4 023907

Лечение ВИЧ.

Более 30 млн человек в мире инфицированы ВИЧ-1, при этом каждый год регистрируют 3 млн новых случаев. Варианты лечения были существенно усовершенствованы с введением высокоактивной антиретровирусной терапии (НААРТ) (§ейортаи е! а1., 2010). К 2008 г. было лицензировано почти 25 антиретровирусных средств для лечения ВИЧ-1, включая девять нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (ΝΚΤΙ), четыре ненуклеозидных ингибитора обратной транскриптазы (ΝΝΚ.ΤΙ). девять ингибиторов протеазы (ΡΙ), один ингибитор слияния, один ингибитор ССК.5 и один ингибитор интегразы (8йа£сг & §ейар1го, 2008). Однако ни один из этих существующих режимов не приводит к полному устранению вируса, при этом они могут вызывать тяжелые побочные эффекты, и резистентность к противовирусным средствам все еще остается главной проблемой. Таким образом, сохраняется потребность в новых противовирусных терапиях, в особенности по механизму действия таких классов, в которых нет никаких разрешенных лекарственных средств, как в случае ингибиторов циклофилинов.

Вирус гепатита В.

Вирус гепатита В является ДНК-вирусом семейства Нерабиаушбае (гепаднавирусы) и возбудителем гепатита В. В противоположность случаям с НСУ и ВИЧ, было очень мало опубликованных сообщений относительно активности ингибиторов циклофилинов против вируса гепатита В. Р!ак с сотр. (2008) описывали слабую активность ΌΕΒΙΟ-025 против НВУ (1С50 4,1 мкМ), тогда как Х1е с сотр. (2007) описывали некоторую активность СТА против НВУ (1С₅₀>1,3 мкг/мл). Это отличается от ВИЧ и НСУ, по которым имеются многочисленные сообщения о наномолярной противовирусной активности ингибиторов циклофилинов.

Лечение НВУ.

Вирус НВУ инфицирует до 400 млн человек во всем мире и является главной причиной хронического вирусного гепатита и гепатоцеллюлярной карциномы. На 2008 г. было зарегистрировано шесть лекарственных средств, лицензированных для лечения НВУ; интерферон-α и пэгилированный интерферон-α, три аналога нуклеозидов (ламивудин, энтекавир и телбивудин) и один аналог нуклеотидов (адефовир дипивоксил). Однако из-за высокой частоты устойчивости, плохой переносимости и возможных побочных эффектов необходимы новые терапевтические варианты (Рейт е! а1., 2008).

Ингибирование митохондриальной поры транзиентной проницаемости (тРТР).

Открытие высокопроводящих пор транзиентной проницаемости в митохондриях инициирует митохондриальную транзиентную проницаемость (МРТ). Это является причинным фактором, ведущим к некрозу и апоптозу в гепатоцитах после окислительного стресса, Са²+ токсичности и ишемии/реперфузии. Ингибирование циклофилина И (также известно как циклофилин Р) ингибиторами циклофилинов, как было показано, блокирует открытие пор транзиентной проницаемости и защищает от гибели клеток после таких стрессов. Ингибиторы циклофилина И поэтому могут применяться при таких показаниях, в которых вовлечено открытие тРТР, таких как мышечная дистрофия, в частности врожденная мышечная дистрофия Ульриха и миопатия Бетлема (МШау е! а1., 2008, \УО 2008/084368, Ра1та е! а1., 2009), рассеянный склероз (Ройе е! а1., 2009), диабет (Рирто!о е! а1., 2010), амиотрофический боковой склероз (МагИи 2009), биполярное расстройство (КиЬо!а е! а1., 2010), болезнь Альцгеймера (Ии апб Уаи, 2010), болезнь Хантингтона (Реггу е! а1., 2010), восстановление после инфаркта миокарда (Соте/ е! а1., 2007) и хроническое потребление алкоголя (Кшд е! а1., 2010).

Другие терапевтические применения.

Ингибиторы циклофилинов обладают потенциальной активностью против других вирусов и поэтому при лечении вызываемых ими инфекций, например вируса ветряной оспы (Р!ак е! а1., 2008), вируса гриппа А (Ьш е! а1., 2009), коронавируса, вызывающего тяжелый острый респираторный синдром, а также других коронавирусов человека и кошек (Сйеи е! а1., 2005, Р!ак е! а1., 2008), вируса лихорадки денге (Каи1 е! а1., 2009), вируса желтой лихорадки (Общ е! а1., 2009), вируса Западного Нила (Общ е! а1., 2009), вируса западного энцефалита лошадей Юшд и др., 2009), цитомегаловируса (КатакаИ е! а1., 2007) и вируса осповакцины (Са§1го е! а1., 2003).

Также имеются сообщения о применимости ингибиторов циклофилинов и ингибирования циклофилинов в других терапевтических областях, например при раке (Наи е! а1., 2009).

Общие замечания по поводу санглиферинов.

Одной из проблем при создании лекарственных препаратов на основе таких соединений, как санглиферины, является быстрый метаболизм и глюкуронидация, приводящие к низкой биодоступности при приеме внутрь. Это может привести к увеличению вероятности влияния пищи, к более высокой частоте неполного высвобождения из лекарственной формы и более высокой вариации в зависимости от пациента.

Таким образом, сохраняется потребность в идентификации новых ингибиторов циклофилинов, которые могут применяться в частности в лечении НСУ инфекции, но также и в лечении других заболеваний, при которых ингибирование циклофилинов может быть полезным, например, при ВИЧ инфекции, мышечной дистрофии, или для восстановления после инфаркта миокарда, или в тех случаях, когда полезны иммунодепрессия или противовоспалительное действие. Предпочтительно такие ингибиторы циклофилинов обладают улучшенными свойствами по сравнению с доступными в настоящее время ингиби- 5 023907 торами циклофилинов, включая одно или более следующих свойств: более длительный полупериод существования или увеличенная биодоступность при приеме внутрь, возможно в результате сниженного метаболизма под действием Р4 50 и/или пониженной глюкуронидации, повышенная растворимость в воде, повышенная активность против НСУ, сниженная токсичность (включая гепатотоксичность), улучшенный фармакологический профиль, например высокая экспозиция в целевых органах (например, печени в случае НСУ), и/или длительный полупериод существования (позволяющий выполнять менее частое введение доз), пониженная частота взаимодействий между лекарственными средствами, например, посредством сниженных уровней метаболизма под действием СУР3А4 и ингибирования и уменьшенное (Рдр) ингибирование (что позволяет с большей легкостью получать комбинации нескольких лекарственных средств) и улучшенный профиль побочных эффектов, например слабое связывание с МРР2, что приводит к уменьшению вероятности гипербилирубинемии, пониженное иммунодепрессивное действие, повышенная активность против резистентных вирусных штаммов, в частности резистентных к СТА и аналогу СТА (например, ΌΕΒΙΘ-025) вирусных штаммов, а также более высокий терапевтический (и/или селективный) индекс. В настоящем изобретении раскрыты новые аналоги санглиферинов, которые могут обладать одним или более вышеуказанными свойствами. В частности в настоящем изобретении раскрыты новые мутасинтетические аналоги санглиферинов, которые, как ожидают, будут характеризоваться уменьшенным метаболизмом под действием Р450 или глюкуронидацией, что, например, выражается в увеличенном полупериоде существования в микросомах и/или сниженной повышенной активностью против НСУ, например, как показано низким ЕС₅₀ репликонов.

Кроме того, также существует потребность в создании новых иммунодепрессивных средств, которые могут применяться в профилактике отторжения трансплантата или в лечении аутоиммунных, воспалительных и дыхательных нарушений.

Предпочтительно такие иммунодепрессанты обладают улучшенными свойствами по сравнению с известными природными санглиферинами, включая одно или более следующих свойств: более длительный полупериод существования или увеличенная биодоступность при приеме внутрь, возможно в результате сниженного метаболизма под действием Р450 и/или пониженной глюкуронидации, повышенная растворимость в воде, повышенная активность иммунодепрессивного действия, что можно наблюдать в анализах пролиферации Т-клеток, сниженная токсичность (включая гепатотоксичность), улучшенный фармакологический профиль, например высокая экспозиция в целевом органе и/или длительный полупериод существования (позволяющий выполнять менее частое введение доз), пониженная частота взаимодействий между лекарственными средствами, например, посредством сниженных уровней метаболизма под действием СУР3А4 и ингибирования и уменьшенное (Рдр) ингибирование (что позволяет с большей легкостью получать комбинации нескольких лекарственных средств) и улучшенный профиль побочных эффектов. В настоящем изобретении раскрыты новые аналоги санглиферинов, которые могут обладать одним или более вышеуказанными свойствами. В частности в настоящем изобретении раскрыты новые производные, которые характеризуются уменьшенным метаболизмом под действием Р450 или глюкуронидацией, что, например, выражается в увеличенном полупериоде существования в микросомах и/или повышенной иммунодепрессивной активности, например, как показано низким 1С₅₀ пролиферации Тклеток.

Таким образом, как может быть замечено из примеров, соединения изобретения обладают следующими благоприятными терапевтически релевантными свойствами:

улучшенной противовирусной активностью против НСУ и ВИЧ по сравнению с ингибиторами циклофилинов циклоспорином А, ΌΕΒΙΘ-025 (алиспоривир) и санглиферином А предшествующего уровня техники;

уменьшенным клиренсом и увеличенной экспозицией при приеме внутрь по сравнению с соединением предшествующего уровня техники санглиферином А;

более активным ингибированием РР1-азной активности СурА по сравнению с ингибиторами циклофилинов циклоспорином А, ΌΕΒΙΘ-025 (алиспоривир) и санглиферином А предшествующего уровня техники;

улучшенным профилем побочных эффектов и уменьшенной частотой взаимодействий между лекарственными средствами, что демонстрируется уменьшенным ингибированием транспортеров билирубина (ОАТР-1В1, ОАТР-1В3, МКР2 и МРР3) и уменьшенным ингибированием транспортеров ксенобиотиков (Рдр и В8ЕР).

Сущность изобретения

В настоящем изобретении предложены новые макроциклические аналоги санглиферинов, которые были получены посредством полусинтетической модификации мутасинтетических санглиферинов. Указанные аналоги могут быть получены при дигидроксилировании мутасинтетического санглиферина, например, описанного в формуле ΙΙΑ и формуле ΙΙΒ, с последующим расщеплением с образованием альдегидного макроцикла, сопровождаемым дальнейшими химическими реакциями, включая реакции по типу Хорнера-Эммонса и другие реакции конденсации с участием альдегида, с получением молекул с разнообразными заместителями, замещающими альдегид. В результате в настоящем изобретении предложены макроциклические аналоги санглиферинов, способы получения указанных соединений и способы приме- 6 023907 нения таких соединений в медицине или в качестве промежуточных соединений при получении других соединений.

Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предложены макроциклические аналоги санглиферинов и их производные согласно формуле (I) ниже или их фармацевтически приемлемая соль

в которой группа Х₁ представляет собой -ОК_Ь -ΝΚ,Κ₂ или К₃;

К.!, К₂ и К₃ независимо представляют собой С_1-10алкил, С_2-1₀алкенил, С_3-10циклоС_1-10алкил, С_3-10циклоС_2-1 _оалкенил, С_1-10алкилС_3-10циклоС_{1 -1 о}алкил, С_1-10алкилС_3-10циклоС_{2-1 о}алкенил, С_2-10алкенилС_{3-1 о}циклоС_1-10алкил, С_2-10алкенилС_3-10циклоС_2-10алкенил, С_5-10арил, С_5-10гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, С_1-10алкилС_5-10арил, С_1-10алкилС_5-10гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, С_2-10алкенилС_5-10арил или С_2-10алкенилС_5-10гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, при этом любая из указанных групп может быть необязательно замещена моноциклическим С5-10арилом или моноциклическим С5-10гетероарилом;

и где один или более атомов углерода в К₁, К₂ и К₃, не являющихся частью С_5-10ар ильной или С_5-10 гетероарильной группы, необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и 8(О)_Р, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода в К₁, К₂ и К₃ необязательно замещены карбонилом;

или К₁ и К₂ связаны таким образом, что ΝΚ₁Κ₂ представляет собой насыщенное или ненасыщенное С_4-8гетероциклическое кольцо, содержащее указанный атом азота, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены другим гетероатомом, выбранным из О, N и 8(О)_Р, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены карбонилом, при этом такое гетероциклическое кольцо необязательно может быть сконденсировано с С5-10 арильным или С5-10гетероарильным кольцом;

и где один или более атомов углерода группы К1, К2 и К3 необязательно могут быть замещены одним или более атомами галогена;

или К₁ и/или К₂ представляют собой водород;

К₉ представляет собой Н или ОН;

η представляет собой одинарную или двойную связь, за исключением того, что когда η представляет собой двойную связь, К₉ представляет собой Н;

К4, К₅, К₆, К₇ и К₈ независимо представляют собой Н, Р, С1, Вг, С_2-10алкенил или С_1-10алкил, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и 8(О)_Р, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены карбонилом, при этом такая алкильная группа необязательно может быть замещена одним или более атомами галогена;

Х₂, Х₃, Х₄, Х₅ и Х₆ независимо представляют собой С или Ν, при этом в том случае, когда любая из указанных групп представляет собой Ν, присоединенный заместитель отсутствует;

при условии, что когда все К₄, К₆, К₇ и К₈ представляют собой Н, а все Х₂, Х₃, Х₄, Х₅ и Х₆ представляют собой С, то тогда К₅ не может представлять собой ОН, -ОС_1-10алкил или -О(СО)С_1-10алкил;

или его фармацевтически приемлемая соль.

Определения.

Используемый в настоящем описании термин аналог(и) относится к химическим соединениям, которые структурно подобны другому соединению, но которые несколько отличаются по составу (как, например, в случае замены одного атома другим атомом или в случае присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы).

Используемый в настоящем описании термин санглиферин(ы) относится к химическим соединениям, которые структурно подобны санглиферину А, но которые несколько отличаются по составу (как, например, в случае замены одного атома другим атомом или в случае присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы), в особенности продуцируемым при ферментации 81тер1отусе8 8р.

- 7 023907

А92-308110. Примеры включают санглиферинподобные соединения, описанные в \УО 97/02285 и \УО 98/07743, такие как санглиферин В.

Используемый в настоящем описании термин мутасинтетический санглиферин(ы) или мутасинтетический аналог(и) санглиферина относится к химическим соединениям, которые структурно подобны санглиферину А, В, С или Ό, но которые несколько отличаются по составу (как, например, в случае замены одного или более атомов другим атомом или в случае присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы), в частности продуцируемым при ферментации 5>1гер1ошусе$ 8р. А92-308110 или их мутанта, где в культуру подается аналог метатирозина.

Используемый в настоящем описании термин аналог(и) метатирозина относится к химическим соединениям, которые структурно подобны метатирозину, но которые несколько отличаются по составу (как, например, в случае замены одного или более атомов другим атомом или в случае присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы), в частности описанным в формуле (III).

Используемый в настоящем описании термин макроциклический аналог, макроциклический аналог санглиферина или макроциклический санглиферин относится к соединению, указанному выше, представляющему изобретение в его самом широком аспекте, например соединение согласно формуле (I) выше или его фармацевтически приемлемую соль. Указанные соединения также именуются как соединения изобретения или производные санглиферина или аналоги санглиферина, при этом указанные термины используются в настоящей заявке попеременно.

Используемый в настоящем описании термин НСУ относится к вирусу гепатита С, однонитевому РНК-вирусу с оболочкой из вирусного семейства ИауМйбае.

Используемый в настоящем описании термин ВИЧ относится к вирусу иммунодефицита человека, возбудителю синдрома приобретенного иммунодефицита человека.

Используемый в настоящем описании термин биодоступность относится к степени или скорости, с которой лекарственное средство или другое вещество адсорбируется или становится доступным на участке биологической активности после введения. Данная характеристика зависит от множества факторов, включая растворимость соединения, скорость адсорбции в кишечнике, степень связывания с белками и метаболизм и т.д. в настоящей заявке описаны различные тесты на биодоступность, которые известны специалисту в данной области (см. также Едопп е! а1. 2002).

Термин растворимость в воде, используемый в настоящем описании, относится к растворимости в водных средах, например фосфатно-солевом буфере (РВ§) при рН 7,4, или в 5%-м растворе глюкозы. Тесты на растворимость в воде приведены ниже в примерах как анализ растворимости в воде.

Фармацевтически приемлемые соли соединений изобретения, таких как соединения формулы (I), включают обычные соли, образованные из фармацевтически приемлемых неорганических или органических кислот или оснований, а также четвертичных аммониевых солей присоединения кислот. Более конкретные примеры подходящих солей кислот включают соляную, бромисто-водородную, серную, фосфорную, азотную, хлорную, фумаровую, уксусную, пропионовую, янтарную, гликолевую, муравьиную, молочную, малеиновую, винную, лимонную, памовую, малоновую, гидроксималеиновую, фенилуксусную, глутаминовую, бензойную, салициловую, фумаровую, толуолсульфоновую, метансульфоновую, нафталин-2-сульфоновую, бензолсульфоновую, гидроксинафтойную, иодоводородную, яблочную, стеариновую, дубильную и т.п. Соли соляной кислоты представляют наибольший интерес. Другие кислоты, такие как щавелевая кислота, хотя и не являются сами по себе фармацевтически приемлемыми, могут применяться при получении солей, используемых в качестве промежуточных соединений при получении соединений изобретения и их фармацевтически приемлемых солей. Более конкретные примеры подходящих солей оснований включают соли натрия, лития, калия, магния, алюминия, кальция, цинка, Ν,Ν'дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, Ν-метилглюкамина и прокаина. В дальнейшем ссылки на соединение согласно изобретению включают как соединения формулы (I), так и их фармацевтически приемлемые соли.

Используемый в настоящем описании термин алкил представляет собой алкильную группу с нормальной или разветвленной цепью, обычно содержащую 1-10 атомов углерода, например С_1-6 алкильную группу. Алкенил относится к алкильной группе, содержащей два или более атомов углерода (например, 2-10 атома углерода, например С_2-6 алкенильная группа), которая является ненасыщенной, с одной или более двойными связями.

Примеры алкильных групп включают С1_-4алкильные группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил и н-бутил. Примеры алкенильных групп включают С_2-4алкенильные группы, такие как -СН=СН₂ и -СН₂СН=СН₂.

Используемый в настоящем описании термин циклоалкил обозначает циклическую алкильную группу, обычно содержащую 3-10 атомов углерода, необязательно разветвленную, например циклобутил, циклопентил, циклогексил или циклогептил. Примером разветвленной группы является 2метилциклопентил. Циклоалкенил относится к циклической алкенильной группе, обычно содержащей 5-10 атомов углерода, например циклопентил, циклогексенил или циклогептенил. Циклоалкильные и циклоалкенильные группы могут быть, например, моноциклическими или бициклическими (включая спироциклические), но предпочтительно являются моноциклическими.

- 8 023907

Используемый в настоящем описании термин циклоалкил обозначает циклическую алкильную группу, обычно содержащую 3-10 атомов углерода, необязательно разветвленную, например циклобутил, циклопентил, циклогексил или циклогептил. Примером разветвленной группы является 2метилциклопентил. Циклоалкенил относится к циклической алкенильной группе, обычно содержащей 5-10 атомов углерода, например циклопентил, циклогексенил или циклогептенил. Циклоалкильные и циклоалкенильные группы могут быть, например, моноциклическими, или бициклическими (включая спироциклические), но предпочтительно являются моноциклическими.

Используемый в настоящем описании термин гетероциклил обозначает циклоалкильную группу, в которой один или более атомов углерода в кольце (например, 1, 2 или 3 атома углерода в кольце, как 1 или 2, например 1) замещены гетероатомами, выбранными из О, N и 8. Примеры включают морфолинил, пиперидинил, пирролидинил, пиперазинил и Ν-метилпиперазинил.

Используемый в настоящем описании термин гетероцикленил обозначает циклоалкенильную группу, в которой один или более атомов углерода в кольце (например, 1, 2 или 3 атома углерода в кольце, как 1 или 2, например 1) замещены гетероатомами, выбранным из О, N и 8.

Примеры арильных групп включают (за исключением случаев, о которых указано) моноциклические группы, то есть фенил, и бициклические кольца (например, 9- и 10-членные кольца), которые являются ароматическими, или (в случае бициклических колец) содержат по меньшей мере одно ароматическое кольцо. Например, бициклическое кольцо может быть полностью ароматическим, например нафтильным, или может быть частично ароматическим (например, содержать одно ароматическое кольцо), таким как тетралин, инден или индан. Предпочтительным арилом является фенил. Арильные группы необязательно могут быть замещены, например, одним или более (например, 1, 2 или 3) заместителями, выбранными, например, из алкила (например, С^алкила), гидроксила, СР₃, галогена, алкокси (например, С1_-4алкокси), нитро, -8О₂Ме, циано и -ί'ΌΝΗ₂.

Примеры гетероарильных групп включают (за исключением случаев, о которых указано) моноциклические группы (например, 5- и 6-членные кольца) и бициклические кольца (например, 9- и 10-членные кольца), которые являются ароматическими, или (в случае бициклических колец) содержат по меньшей мере одно ароматическое кольц, и содержат один или более гетероатомов (например, 1, 2, 3 или 4 гетероатома), выбранных из Ν, О и 8. Примеры 5-членных гетероарильных колец включают пиррол, фуран, тиофен, оксазол, оксадиазол, тиазол и триазол. Примеры 6-членных гетероарильных колец включают пиридин, пиримидин и пиразин. Примеры бициклических колец включают полностью ароматические кольца, такие как хинолин, хиназолин, изохинолин, индол, циннолин, бензтиазол, бензимидазол, пурин и хиноксалин, а также частично ароматические кольца, такие как хромен, хроман, тетрагидрохинолин, дигидрохинолин, изоиндолин и индолин. Моноциклические гетероарильные группы являются предпочтительными. Вышеуказанные гетероарильные группы необязательно могут быть замещены, как описано выше для арильных групп.

В случае, когда бициклические арильные и гетероарильные группы являются частично ароматическими, связь с остальной частьют молекулы может идти через ароматическую часть или через неароматическую часть.

Термин лечение включает как профилактическую, так и терапевтическую обработку.

Термин формула II относится к формуле ΙΙΑ и формуле ΙΙΒ в совокупности.

Описание фигур

Фиг. 1 - ^!Н-ЯМР соединения 23,

Фиг. 2 - ^!Н-ЯМР соединения 24,

Фиг. 3 - ^!Н-ЯМР соединения 25,

Фиг. 4 - ¹Н-ЯМР соединения 26,

Фиг. 5 - ^!Н-ЯМР соединения 27,

Фиг. 6 - ^!Н-ЯМР соединения 28,

Фиг. 7 - ^!Н-ЯМР соединения 29,

Фиг. 8 - ^!Н-ЯМР соединения 30.

Описание изобретения

В настоящем изобретении предложены макроциклические аналоги санглиферинов, как изложено выше, способы получения указанных соединений и способы применения таких соединений в медицине.

В одном варианте осуществления соединение является соответствующим метанольным аддуктом, в котором полукеталь образован комбинацией С-53 кето и С-15 гидроксильных групп и метанола. В другом варианте осуществления оно не является метанольным аддуктом.

Переменные п, Х₂-Х₆ и К₄-К₉.

Предпочтительно п обозначает одинарную связь.

Предпочтительно К₉ представляет собой ОН.

Предпочтительно К4, К₅, Кб, К₇ и К₈ независимо представляют собой Н, Р, С1, Вг, С_2-6алкенил или Сы₀алкил, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и 8(О)_Р, где р обозначает 0, 1 или 2 и где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены карбонилом, при этом указанная алкильная

- 9 023907 группа необязательно может быть замещена одним или более атомами галогена.

В некоторых вариантах осуществления атом углерода С_1-10алкильной группы (например, С_1-балкильной группы), которую может обозначать один или больше Кд, К₅, Кб, К₇ и К₈, замещен гетероатомом.

Если -СН₃ замещен Ν, формируемой группой является -ΝΗ₂. Если -СН₂- замещен Ν, формируемой группой является -ΝΗ-. Если -СНК- замещен Ν, формируемой группой является -ΝΚ-. Следовательно, атомы азота в группе Кд, К₅, Кб, К₇ или К₈ могут быть первичными, вторичными или третичными атомами азота.

Если -СН₃ замещен О, формируемой группой является -ОН.

В случае, когда атом углерода С_1-10алкильной группы (например, С_1-балкильной группы), которую может обозначать один или больше Кд, К₅, К₆, К₇ и К₈, замещен гетероатомом, он предпочтительно замещается О, 8 или Ν, в особенности Ν или О, в частности О.

В случае, когда любой из К_д, К₅, К₆, К₇ и К₈ содержит группу 8(О)_Р, переменная р соответственно обозначает 0 или 1. В одном варианте осуществления р обозначает 0. В другом варианте осуществления р обозначает 1. В другом варианте осуществления р обозначает 2.

В случае, когда С_1-10алкильная группа (например, С_1-6алкильная группа), которую может обозначать один или больше К_д, К₅, К₆, К₇ и К₈, содержит больше одного гетероатома, они обычно могут отделяться двумя или более атомами углерода.

Предпочтительно атомы углерода С_1-10алкильной группы (например, С_1-6алкильной группы), которую может обозначать один или больше К_д, К₅, Кб, К₇ и К₈, не замещены никаким гетероатомом.

В случае, когда атом углерода С_1-10алкильной группы (например, С_1-балкильной группы), которую может обозначать один или больше К_д, К₅, К_б, К₇ и К₈, замещен карбонилом, карбонил соответственно расположен смежно с другим атомом углерода или атомом азота. Предпочтительно карбонильные группы не расположены смежно с атомами серы или кислорода.

Например, один или более Кд, К₅, К_б, К₇ и К₈ могут представлять собой -СОС_1-3алкил, например -СОМе.

Предпочтительно атомы углерода С_1-10алкильной группы (например, С_1-балкильной группы), которую может обозначать один или больше К_д, К₅, К_б, К₇ и К₈, не замещены карбонилом.

С_1-10алкильная группа (например, С_1-балкильная группа), которую может обозначать один или больше К_д, К₅, К_б, К₇ и К₈, может быть замещена одним или более атомами галогена. Например, один или более К₁, К₂, К₃, К_д и К₅ могут представлять собой -СР₃. В альтернативе один или более К_д, К₅, К_б, К₇ и К₈ могут представлять собой С_1-10алкил (например, С_1-балкил), замещенный одним или более (например, одним) атомом С1 или Р (например, -СН₂СН₂С1).

Предпочтительно С_1-10алкильные группы (например, С_1-балкильные группы), которые могут обозначать Кд, К5, Кб, К7 и К8, не замещены галогеном.

В случае, когда одна или более групп К_д, К₅, К_б, К₇ и К₈ представляют собой С_1-10алкильную группу (например, С_1-балкильную группу), предпочтительно группа(ы) представляет собой С_1-далкил (например, С_1-2алкил, такой как метил).

В варианте осуществления один или более из К_д, К₅, К_б, К₇ и К₈ представляют собой С_1-балкил (такой как С_1-2алкил) или С_2-3алкенил, например один или более из К_д, К₅, К_б, К₇ и К₈ представляют собой метил.

Предпочтительно К_д представляет собой Н, Р, С1, СР₃, ОН или С_1-балкил (например, метил). Наиболее предпочтительно К_д представляет собой Н или Р, в особенности Н.

Предпочтительно К₅ представляет собой Н, Р, С1, СР₃, ОН, ΝΗ₂ или С_1-балкил (например, метил). Более предпочтительно К₅ представляет собой Н, Р, ОН или ΝΗ₂, в особенности ОН.

Предпочтительно К_б представляет собой Н, Р, С1, СР₃, ОН или С_1-балкил (например, метил). Более предпочтительно Кй представляет собой Н, Ме или Р.

Предпочтительно К7 представляет собой Н, Р, С1, СР3, ОН или С1-балкил (например, метил). Более предпочтительно К7 представляет собой Н или Р.

Предпочтительно К₈ представляет собой Н, Р, С1, СР₃, ОН или С_1-балкил (например, метил). Более предпочтительно К₈ представляет собой Н или Р, в особенности Н.

Предпочтительно один или более, более предпочтительно два или более (например, три или больше) из К_д, К₅, К_б, К₇ и К₈ не являются Н.

Предпочтительно один или более, например два или более из К_д, К₅, К_б, К₇ и К₈ представляют собой Р.

Предпочтительно Кй и/или К₇ представляют собой Р.

Предпочтительно по меньшей мере два из Х₂, Х₃, Х_д, Х₅ и Х_б представляют собой С; более предпочтительно по меньшей мере три, более предпочтительно по меньшей мере четыре и наиболее предпочтительно все пять представляют собой С.

В одном варианте осуществления Х₂ представляет собой Ν (таким образом, К_д отсутствует). В другом более предпочтительном варианте осуществления Х2 представляет собой С.

Предпочтительно Х3 представляет собой С.

Предпочтительно Х_д представляет собой С.

Предпочтительно Х₅ представляет собой С.

- 10 023907

Предпочтительно Х_б представляет собой С.

В варианте осуществления каждый Х₂, Х₃, Х₄, Х₅ и Хб представляет собой С, Кд представляет собой Н, К₅ представляет собой ОН, К_б представляет собой Н, К₇ представляет собой Р и К₈ представляет собой Н.

В варианте осуществления каждый Х₂, Х₃, Х₄, Х₅ и Х_б представляет собой С, Кд представляет собой Н, К₅ представляет собой ОН, К_б представляет собой Ме, К₇ представляет собой Н и К₈ представляет собой Н.

В варианте осуществления каждый Х₂, Х₃, Х₄, Х₅ и Х_б представляет собой С, К₄ представляет собой Н, К₅ представляет собой ОН, К_б представляет собой Р, К₇ представляет собой Р и К₈ представляет собой Н.

Переменная Х₁.

В одном варианте осуществления Х₁ представляет собой -К₃. В одном варианте осуществления Х₁ представляет собой -ΝΚ_£Κ₂. В одном варианте осуществления Х₁ представляет собой -ОК₁.

В некоторых вариантах осуществления атом углерода в Κι, и/или К₂, и/или К₃ замещен гетероатомом.

Если -СН₃ замещен Ν, формируемой группой является -ΝΗ₂. Если -СН₂- замещен Ν, формируемой группой является -ΝΗ-. Если -СНК- замещен Ν, формируемой группой является -ΝΚ-. Следовательно, атомы азота в группе К₁, К₂, К₃ могут быть первичными, вторичными или третичными атомами азота.

Если -СН₃ замещен О, формируемой группой является -ОН.

В случае, когда атом углерода в К₁, и/или К₂, и/или К₃ замещен гетероатомом, он предпочтительно замещен О или Ν, в особенности О.

В случае, когда атом углерода в К!, и/или К₂, и/или К₃ замещен группой 8(О)_Р, переменная р соответственно обозначает 0 или 1. В одном варианте осуществления р обозначает 0, в другом варианте осуществления р обозначает 1. В другом варианте осуществления р обозначает 2.

В случае, когда К₁, и/или К₂, и/или К₃ содержат больше одного гетероатома, они могут быть, например, отделены двумя или больше атомами углерода.

Предпочтительно ни один атом углерода в К1, К2 и К3 не замещен гетероатомами.

В случае, когда атом углерода К₁, и/или К₂, и/или К₃ замещен карбонилом, карбонил предпочтительно расположен смежно с другим атомом углерода или атомом азота. Предпочтительно карбонильные группы не расположены смежно с атомами серы или кислорода.

Например, К₁, и/или К₂, и/или К₃ могут представлять собой -СОС_1-4алкил, например, -СОМе.

Предпочтительно атом углерода в К₁ не замещен карбонилом.

Предпочтительно атом углерода в К₂ не замещен карбонилом.

Предпочтительно атом углерода в К3 не замещен карбонилом.

В случае, когда один или более атомов углерода в группе К₁, и/или К₂, и/или К₃ замещен одним или более атомами галогена, примерами атомов галогена является Р, С1 и Вг, в особенности Р и С1, в частности Р. Примером галогенированной группы К₁, и/или К₂, и/или К₃ является -СР₃.

Например, один или более К₁, К₂ и К₃ может обозначать С_1-10алкил (например, С_1-балкил), замещенный одним или более (например, одним) атомом С1 или Р (например, -СН₂СН₂С1).

Предпочтительно атом углерода в К₁, К₂ и К₃ не замещен галогеном.

В случае, когда одна или более групп К₁, К₂ и К₃ представляют собой С_1-10алкильную группу (например, С_1-балкильную группу), предпочтительно группы представляют собой С_1-4 алкил (например, С_1-2 алкил, такой как метил).

В случае, когда К₁, и/или К₂, и/или К₃ представляют собой -алкиларил, пример включает С_1-2алкиларил, например бензил.

В случае, когда К₁, и/или К₂, и/или К₃ представляют собой -алкениларил, пример включает С_2-3алкениларил, например этенилфенил.

В случае, когда К₁, и/или К₂, и/или К₃ представляют собой -алкилгетероарил, пример включает С_1-2 алкилгетероарил, например -метилпиридинил.

В случае, когда К1, и/или К2, и/или К3 представляют собой -алкенилгетероарил, пример включает С_2-3алкенилгетероарил, например - этенилпиридинил.

Предпочтительно К₁ не является водородом.

Предпочтительно оба, К₁ и К₂, не являются водородом.

Предпочтительно атом углерода в К₂ не замещен никаким гетероатомом.

Когда Х₁ представляет собой ХК₁К₂.

В случае, когда Х₁ представляет ПК₁К₂, К₁ может представлять собой, например, алкил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил, алкилциклоалкил, алкилциклоалкенил, алкенилциклоалкил, алкенилциклоалкенил, арил, гетероарил, алкиларил, алкилгетероарил, алкениларил или алкенилгетероарил.

К₂ может представлять собой, например, Н, алкил (например, С_1-4алкил), алкенил (например, С_2-4 алкенил), или -Оалкил (например, -ОС1-4алкил), в особенности Н или алкил.

Примерные группы К1 включают арил или гетероарил, замещенные моноциклическим арилом или моноциклическим гетероарилом, -С_1-4алкил, -ОС_1-4алкил, -СОС_1-4алкил или -С_2-4алкенил, или К₁ может представлять собой алкил или -Оалкил. Вышеуказанные примерные группы могут быть, например, взяты вместе с К₂, представляющим Н или алкил.

- 11 023907

Другие примерные группы Κι включают метил, -СР₃, этил, изопропил, -СН₂СН=СН, изобутил, циклогексил. Вышеуказанные примерные группы могут быть, например, взяты вместе с Κ₂, представляющим Н или Ме.

Другие примерные группы Κ₁ включают необязательно замещенный пиридинил или фенил, например фенил, замещенный фенилом. Вышеуказанные примерные группы могут быть, например, взяты вместе с Κ₂, представляющим Н, Ме или -ОМе.

Другие примерные группы Κ₁ включают -ОМе, -ОСР₃, -О-этил, О-изопропил, -8Ме, О-н-пропил, -О-н-бутил, -О-трет-бутил, О-изобутил, О-СН₂С(Ме)₃. Вышеуказанные примерные группы могут быть, например, взяты вместе с Κ₂, представляющим Н, Ме, этил, изопропил или трет-бутил.

Другие примерные группы Κι включают -О-(необязательно замещенный фенил). Вышеуказанные примерные группы могут быть, например, взяты вместе с Κ₂, представляющим Н или Ме.

В альтернативе Κι и К₂ могут быть связаны таким образом, что ΝΚιΚ₂ представляет собой насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее определенный показанный атом азота.

Гетероциклическое кольцо, которое может обозначать ΝΚιΚ₂, обычно содержит 4-8 атомов в кольце, например 5-7 атомов в кольце, в частности 5 или 6 атомов в кольце.

Гетероциклическое кольцо, которое, например, может обозначать ΝΚ|Κ₂. обычно содержит только определенный атом азота (например, оно представляет собой пирролидин или пиперидин), или один или два (например, один) дополнительных гетероатома, в частности атом азота или кислорода.

Например, гетероциклическое кольцо, которое может обозначать ΝΚ_|Κ₂, может быть морфолинилом или 1,2-оксазинаном (шестичленным насыщенным кольцом, содержащим О, смежный с Ν).

В случаях, когда ΝΚ|Κ2 представляет собой насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее определенный атом азота, в котором один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и 8(О)_Р, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены карбонилом, и указанное гетероциклическое кольцо сконденсировано с арильным или гетероарильным кольцом, примером является тетрагидрохинолинил.

В альтернативе, ΝΚ₁Κ₂ предпочтительно представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, такое как пирролидиновое, пиперидиновое, морфолиновое или пиперазиновое кольцо, в котором 4азот пиперазина необязательно замещен С_1-4алкилом.

В другом варианте осуществления ΝΚ₁Κ₂ предпочтительно представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, такое как пирролидиновое, пиперидиновое, морфолиновое или пиперазиновое кольцо, в котором 4-азот пиперазина необязательно замещен С_1-4алкилом и в котором атом углерода, смежный с атомом азота в кольце, замещен карбонилом. Таким образом, например, Κ₁ и К₂ вместе с азотом, к которому они присоединены, представляют собой пиперидинон.

В другом варианте осуществления атом кислорода является смежным с атомом азота, к которому присоединены Κ1 и Κ2. Например, Κ1 может представлять собой алкил или алкенил, в котором метилен, смежный с атомом азота, к которому присоединен Κ1, замещен О. Например, Κ1 может представлять собой -ОС_1-4алкил, например ОМе. В альтернативе Κ₁ и К₂ соединены, и атом углерода, смежный с атомом азота, к которому присоединен Κ₁, замещен О, например, с образованием 1,2-оксазинанового кольца или 1,2-изоксазолидина.

В другом варианте осуществления Κ₁ и К₂ связаны таким образом, что ΝΚ_|Κ₂ представляет собой насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее указанный атом азота, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены дополнительным гетероатомом, выбранным из О, N и 8(О)_Р, где р обозначает 0, 1 или 2 и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены карбонилом, при этом указанное гетероциклическое кольцо сконденсировано с арильным или гетероарильным кольцом (например, сконденсировано с фенильным или пиридинильным кольцом).

Примеры групп, которые может вместе формировать ΝΚ₁Κ₂, включают морфолинил, оксазинан (например, 1,2-оксазинан) и группы, представленные в следующей таблице:

- 12 023907

Вышеуказанные группы -ΝΚ4Κ2, которые включают арильные или гетероарильные группы, также необязательно могут на указанных группах нести один или более (например, один или два, например

- 13 023907 один) заместителей в кольце, например группы, выбранные из С_1-4алкил (например, метил), галоген (например, С1 или Р), С]_-.₁алкокси (например, метокси), гидроксил, СР₃, циано, нитро, 8О₂Ме и ί'ΌΝΗ₂.

Вышеуказанные группы -ΝΚ4Κ2 необязательно могут быть замещены одним или более (например, одним или двумя) атомами галогена (например, Р или С1).

Когда Χι представляет собой ОВ,.

В случае, когда Χι представляет собой ОК_Ь Κι может, например, представлять собой алкил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил, алкилциклоалкил, алкилциклоалкенил, алкенилциклоалкил, алкенилциклоалкенил, арил, гетероарил, алкиларил, алкилгетероарил, алкениларил или алкенилгетероарил.

В одном варианте осуществления Κι представляет собой арил или гетероарил, необязательно замещенный моноциклическим арилом или моноциклическим гетероарилом. Κι может, например, представлять собой 4-бифенилил, в котором необязательно замещено одно из фенильных колец.

В варианте осуществления Κι может представлять собой арил или гетероарил, замещенный моноциклическим арилом или моноциклическим гетероарилом, -С_1-4алкил, -ОС_1-4алкил, -СОС1_-4алкил или -С_2-4 алкенил.

В варианте осуществления Κ₁ представляет собой С_1-6алкил (такой как С_4-6алкил), С_2-6алкенил, С_1-4 алкилС_4-7циклоалкил или С_1-4алкилС_5-7циклоалкенил.

Предпочтительно Κ₁ выбран из С_2-10алкила (например, С_2-6 алкила, такого как С_4-6алкил), С_2-10 алкенила (например, С2-6алкенила, такого как С4-6алкенил), гетероарила и арила.

Таким образом, в одном варианте осуществления Κ₁ выбран из С_4-6алкила, С_2-6алкенила, гетероарила и арила.

В одном варианте осуществления Κ₁ выбран из С_4-7циклоалкила, С_1-2алкиларила и С_1-2алкилгетероарила.

Примерные группы Κ₁ включают циклогексил, -метилциклопентил, -СН₂СН=СН₂, этил, н-пропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, СН₂С(Ме)₃, н-пентил, -СН₂СН₂С(Ме)₃, н-гексил, н-гептил, циклопентил, -метилциклогексил, фенил, -метилфенил, метилпиридинил, тиазол, триазол, имидазол, оксазол, фуран, тиофен и тетразол, например, выбранные из -СН₂СН=СН₂, н-бутила, трет-бутила, изобутила, -СН₂С(Ме)₃, н-пентила, -СН₂СН₂С(Ме)₃, н-гексила, н-гептила, -циклопентила, -метилциклогексила, фенила, -метилфенила, -метилпиридинила, тиазола, триазола, имидазола, оксазола, фурана, тиофена и тетразола.

Другие примерные группы Κ₁ включают указанные выше арильные или гетероарильные группы, в которых арильная или гетероарильная группа замещена.

Когда Х₁ представляет собой Κ₃.

В случае, когда Χ₁ представляет собой Κ₃, Κ₃ может, например, представлять собой алкил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил, алкилциклоалкил, алкилциклоалкенил, алкенилциклоалкил, алкенилциклоалкенил, арил, гетероарил, алкиларил, алкилгетероарил, алкениларил или алкенилгетероарил, при этом любая из указанных групп необязательно может быть замещена моноциклическим арилом или моноциклическим гетероарилом; и где один или более атомов углерода в Κ₃, не являющемся частью арильной или гетероарильной группы, необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и 8(О)_Р, где р обозначает 0, 1 или 2, за исключением случаев, когда смежный с карбонильной группой, к которой присоединен Κ₃, не является О или Ν, и где один или более атомов углерода в К₃ необязательно замещены карбонилом.

Предпочтительно Κ₃ может, например, представлять собой алкил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил, алкилциклоалкил, алкилциклоалкенил, алкенилциклоалкил, алкенилциклоалкенил, арил, гетероарил, алкиларил, алкилгетероарил, алкениларил или алкенилгетероарил.

Предпочтительно К₃ представляет собой С_1-6алкил, С_2-6алкенил, С_1-4алкилС_4-7циклоалкил или С_1-4 алкилС5-7циклоалкенил.

Примерные группы Κ3 включают -метилциклопентил, этилциклопентил, н-пропил, -СН(Ме)(этил), трет-бутил, -СН(этил)2, -СН(этил)(изопропил), -СН(Ме)(изобутил), СН(Ме)(н-пропил), СН(Ме)(н-бутил), -СН(метил)(н-пентил), -СН(этил)(н-пропил), циклопентил, тетрагидрофуран, циклогексил, циклогептил, гексагидрооксепин, -метилциклогексил, -этилциклогексил, СН(Ме)(Оэтил), -СН(Ме)(О-изопропил), -СН(ОМе)(этил), СН(Ме)(О-этил), -СН(ОМе)(изопропил), -СН(Ме)(ОМе), -СН(Ме)(О-н-пропил), -СН(Ме)(О-н-бутил), -СН(этил)(О-этил), -СН2С(Ме)3, СН2СН2С(Ме)3, тиазол, имидазол, триазол, тетразол, оксазол, фуран, пиридин и фенил.

Другие примерные группы Κ₁ включают указанные выше арильные или гетероарильные группы, в которых арильная или гетероарильная группа замещена.

Другие предпочтительные варианты осуществления.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения Х₁ представляет собой NМе(ΟМе), Κ4 представляет собой Н, Κ₅ представляет собой ОН, Κ₆ представляет собой Н, Κ₇ представляет собой Р, представляет собой Н, Х2 представляет собой С, Х3 представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х5 представляет собой С, Х₆ представляет собой С, η обозначает одинарную связь и Κ₉ представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:

- 14 023907

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Х₁ представляет собой ХМе(ОМе). Кд представляет собой Н, К₅ представляет собой ОН, Кб представляет собой Н, К₇ представляет собой Р, К₈ представляет собой Н, Х₂ представляет собой С, Х₃ представляет собой С, Х_д представляет собой С, Х₅ представляет собой С, Х₆ представляет собой С, η обозначает двойную связь и К₉ представляет собой Н, как представлено следующей структурой:

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Х₁ представляет собой ΝΚ₁Κ₂, в котором К₁ и К₂ вместе представляют собой СН₂СН₂СН₂СН₂О, которые соединены с формированием гетероцикла, Кд представляет собой Н, К₅ представляет собой ОН, К₆ представляет собой Н, К₇ представляет собой Р, К₈ представляет собой Н, Х₂ представляет собой С, Х₃ представляет собой С, Х₄ представляет собой С, Х5 представляет собой С, Х6 представляет собой С, η обозначает одинарную связь и К9 представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Х₁ представляет собой ΝΚ₁Κ₂, в котором К1 и К2 вместе представляют собой СН2СН2СН2СН2О, которые соединены с формированием гетероцикла, Кд представляет собой Н, К₅ представляет собой ОН, К₆ представляет собой Ме, К₇ представляет собой Н, К₈ представляет собой Н, Х₂ представляет собой С, Х₃ представляет собой С, Х_д представляет собой С, Х5 представляет собой С, Х6 представляет собой С, η обозначает одинарную связь и К9 представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Х₁ представляет собой NМе(ΟМе), К_д представляет собой Н, К₅ представляет собой ОН, К₆ представляет собой Р, К₇ представляет собой Р, К₈ представляет собой Н, Х₂ представляет собой С, Х₃ представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х5 представляет собой С, Х6 представляет собой С, η обозначает одинарную связь и К9 представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:

- 15 023907

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Х₁ представляет собой ΝΚιΚ₂, в котором Κι и К₂ вместе представляют собой СН₂СН₂СН₂СН₂О, которые соединены с формированием гетероцикла, К₄ представляет собой Н, К₅ представляет собой ОН, Кб представляет собой Р, К₇ представляет собой Р, К₈ представляет собой Н, Х₂ представляет собой С, Х₃ представляет собой С, Х₄ представляет собой С, Х₅ представляет собой С, Х₆ представляет собой С, и обозначает одинарную связь и К₉ представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Х₁ представляет собой (2пиридинил)NН, К4 представляет собой Н, К₅ представляет собой ОН, Кб представляет собой Р, К₇ представляет собой Р, К₈ представляет собой Н, Х₂ представляет собой С, Х₃ представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х₅ представляет собой С, Х₆ представляет собой С, и обозначает одинарную связь и К₉ представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения X! представляет собой (2пиридинил)NН, К₄ представляет собой Н, К₅ представляет собой ОН, К₆ представляет собой Р, К₇ представляет собой Н, К₈ представляет собой Н, Х₂ представляет собой С, Х₃ представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х₅ представляет собой С, Х₆ представляет собой С, и обозначает одинарную связь и К₉ представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:

В некоторых вариантах осуществления двойная связь в положении С26, 27 (относительно структуры санглиферина А) может находиться в цис-форме вместо транс-формы.

В подходящем варианте осуществления изобретения двойная связь находится в цис-форме, как представлено следующей формулой:

- 16 023907

Такие соединения могут быть получены в процессе химического синтеза.

Как правило, соединения изобретения получают при помощи мутасинтеза с образованием соединений формулы (II) с последующим полусинтезом.

Подходящие группы Х₂, Х₃, Х_д, Х₅, Х₆, К_д, К₅, К₆, К₇ и К₈ в формуле (II) соответствуют группам, определенным для соединений формулы (I).

Как правило, способ получения предшественников соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемой соли включает инокуляцию ферментационной питательной среды культурой продуцента санглиферина (такого как §1гер1отусе8 8р. А92-308110, также известного как Ό8Μ 995д) или более предпочтительно продуцента санглиферина с инактивированным или удаленным геном 8£аА или гомологом гена 8£аА;

введение в ферментационную питательную среду аналога метатирозина (как показано в формуле (III));

продолжение ферментации до получения соединений формулы ПА и формулы ПВ; экстракцию и выделение соединений формулы ПА и формулы ПВ;

полусинтетическую дериватизацию соединений формулы ПА и формулы ПВ с получением соединения формулы I.

Соединения формулы (III) определены следующим образом:

в которой К₁₀ представляет собой Н или группу, образующую сложный эфир, такую как алкильная группа, например С_1-6алкил, такой как Ме.

Подходящие группы Х₂, Х₃, Х_д, Х₅, Х₆, Кд, К₅, К₆, К₇ и К₈ в формуле (III) соответствуют группам, определенным для соединений формулы (I).

Вводимое соединение может быть рацемическим или являться Ь-формой соединения формулы (III). Соединения формулы (III) доступны коммерчески или могут быть получены стандартными метода- 17 023907 ми химии органического синтеза. Один из общих способов получения соединений формулы (III) показан на следующей схеме.

Схема: а) конденсация альдегида формулы (IV) с подходящим фрагментом, например (Κ.11Ο)₂Р(О)СН(NНΡΟ)СΟ₂Κ.10, и Ь) гидрирование и снятие защитных групп при необходимости. РО = защитная группа.

Альдегиды формулы (IV) могут быть доступны коммерчески или могут быть с легкостью синтезированы специалистом, квалифицированным в данной области. Химия защиты и снятия защиты может использоваться при получении соединений формулы (III) из соединений формулы (IV). Указанные методы известны специалисту, квалифицированному в данной области, и подходящие защитные группы описаны в Огеепе'к Рго!есПуе Огоирк ίη Огдапю δνηΐΐκκίκ (ЖНк апб Огеепе, 4'¹' Εάϋίοη, 2007).

После образования соединений формулы (ПА) и формулы (ИВ) соединения изобретения получают с помощью полусинтетической дериватизации. Полусинтетические методы получения макроциклического альдегида санглиферина описаны в υδ 6124453, Мейегтсй е! а1., 1999, Вашей е! а1., 2001 и δеб^аη^ е! а1., 2003.

Обычно полусинтетический способ получения некоторых соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемой соли из мутасинтетического аналога санглиферина включает:

(a) дигидроксилирование аналога санглиферина;

(b) окислительное расщепление 1,2-диола с получением альдегида и (c) конденсацию указанного альдегида со стабилизированным карбанионом (или его канонической формой), таким как фосфонатный карбанион, с использованием соединения формулы У.

Группы Кп, которые могут быть одинаковыми или различными, независимо представляют собой алкил (например, С_£-4алкил) или бензил.

- 18 023907

Следовательно, способ получения соединений изобретения включает реакцию соединения формулы (У) с альдегидным макроциклом (соединение формулы (У1)). Получение соединений формулы (У1) может быть выполнено способом, аналогичным описанному, предварительно в отношении превращения санглиферина А в его соответствующий альдегидный макроцикл (Ме!!егтсН е! а1. 1999). Вкратце, соединение формулы (ΙΙ) дигидроксилируют с использованием измененных условий Шарплесса (каталитический тетраоксид осмия). Использование хиральных лигандов способствует повышению селективности. Затем образующийся диол может быть подвергнут окислительному расщеплению с использованием, например, периодата натрия. Полученное соединение формулы У1 может затем использоваться в качестве субстрата для дериватизации в соответствующий амид, сложный эфир или кетон. Обычно соединение формулы (У) растворяют в апротонном растворителе, охлаждают и обрабатывают основанием, например гидридом натрия. Затем добавляют соединение формулы (У1) и нагревают реакционную смесь. По истечении подходящего промежутка времени реакцию останавливают и очищают соединение формулы Ι в стандартных условиях (например, с помощью препаративной ВЭЖХ, препаративной ТСХ и т.д., флешхроматографии с нормальными фазами).

Дериватизации с целью введения изменений в группы Р₉ и п могут быть выполнены перед получением соединения формулы У1 или после реакции с формированием соответствующего амида. Вкратце, гидроксил в Р₉ может быть удален при обработке подходящего субстрата в кислых условиях с получением конъюгированного триена.

Соединения формулы (У) могут быть известны или могут быть получены с использованием известных методов.

Например, соединения формулы (У), в которой Х₁ представляет собой ΝΚ₁Κ₂, могут быть с легкостью синтезированы из доступных аминов (например, ΚιΚ₂ΝΉ). Как показано на схеме 1 (ниже), амин может использоваться для обработки хлорацетилхлорида или подобного, с образованием α-хлорамида. Затем α-хлорамид обрабатывают в реакции Арбузова с получением соединения формулы У. Другие пути к соединениям формулы У будут очевидны специалисту, квалифицированному в данной области.

Схема 1

Другие соединения формулы (У), в которой Х₁ представляет собой Р₃, могут быть известны или с легкостью могут быть синтезированы из доступных производных карбоновых кислот (например, Р₃СОХ). Как показано на схеме 2 (ниже), производное карбоновой кислоты может взаимодействовать с метилфосфонатом после обработки фосфоната основанием. Это приводит к соединению формулы (У), хотя другие пути к соединениям формулы У будут очевидны специалисту, квалифицированному в данной области.

Схема 2

X = С1 или О-алкил

Другие соединения формулы (У), в которой Х₁ представляет собой ОР], могут быть известны или с легкостью могут быть синтезированы из доступных спиртов (например, К4ОН). Как показано на схеме 3 (ниже), спирт может использоваться для обработки хлорацетилхлорида или подобного, с образованием сложного α-хлорэфира. Затем α-хлорэфир обрабатывают в реакции Арбузова с получением соединения формулы ΙΙ. Другие пути к соединениям формулы ΙΙ будут очевидны специалисту, квалифицированному в данной области.

- 19 023907 'ОН ⁺ о

С1

С1 о

Схема 3

С1

Если желательно или необходимо, защитные группы могут применяться для защиты функциональных групп в альдегидном макроцикле, макроцикле, спирте (К₁ОН), производном карбоновой кислоты (К₁К₂К₃СОХ) или амине (Κ₁Κ₂ΝΗ) или в соединениях формулы V, как описано в Т.^. Сгееп, Р.С.М. \УШ5. Рго1есЦуе Сгоирк ίη Отдашс 8уп1Не818, ^|1еу-1п1ег5С1епсе. Νον Уогк, 1999.

В дополнение к определенным методам и ссылкам, предствленным в настоящей заявке, специалист в данной области также может обратиться к стандартным руководствам по методам синтеза, включая, без ограничения, ^деГк ТеХЪоок о£ РгасИса1 Отдашс Скет181гу (Ригшкк е! а1., 1989) и Матск'к Абуапсеб Отдатс Скет181гу (8тИк апб Магск, 2001).

Аналог санглиферина согласно изобретению можно вводить один или в комбинации с другими терапевтическими средствами. Совместное введение двух (или более) средств могут позволять вводить более низкие дозы каждого используемого средства, с уменьшением, таким образом, побочного эффекта, что может привести к повышению активности и поэтому, более высокого 8νΚ, а также к уменьшению резистентности.

Таким образом, в одном варианте осуществления мутасинтетический аналог санглиферина вводят совместно с одним или более терапевтическими средствами для лечения инфекции НСV, взятыми из стандарта лечения. Это может быть интерферон (например, ρΙΡΝα и/или рибавирин).

В альтернативном варианте осуществления санглифериновый макроцикл изобретения вводят совместно с одним или более другими противовирусными средствами, такими как 8ТАТ-С (средство направленного действия для лечения НС'У) или ΌΑΑ (противовирусные средства прямого действия), которые могут являться одним или несколькими из следующего: ненуклеозидные ингибиторы полимеразы (например, АВТ-333, АВТ-072, ВМ8 791325, ΙΌΧ375, νϋΗ-222, ΒΙ 207127, ΑΝΑ598, νϋΗ-916, С8 9190, РР-00868554 (филибувир) или νΧ-759), нуклеозидные или нуклеотидные ингибиторы полимеразы (например, 2'-С-метилцитидин, 2'-С-метиладенозин, К1479, К1479, Ρ8Ι-6130, К7128, К1626, Ρ8Ι 7977 или ΙΌΧ 184), ингибиторы протеазы (например, АВТ-450, АСН-1625, ΒΙ 201355, ΒΙΕΝ-2061, ВМ8-650032, СТ8 1027, данопревир, С8 9256, С8 9451, МК 5172, ΙΌΧ 320, νΧ-950 (телапревир), 8СН503034 (боцепревир), ТМС435350, МК-7009 (ванепревир), К7227/ГПМ^-191, ЕА-058, ЕА-063 или νΧ 985), ингибиторы Ν85Α (например, А-831, ВМ8 790052, ВМ8 824393, СУ-102 или ΡΡΙ-461), силимарин, ингибиторы Ν84Ε ингибиторы серин-С-пальмитоилтрансферазы, нитазоксанид или ингибиторы проникновения вируса (например, РКО 206).

В альтернативном варианте осуществления санглифериновый макроцикл изобретения вводят совместно с одним или более другими противовирусными средствами (таким как высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ)) для лечения ВИЧ, которые могут являться одним или несколькими из следующего: нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ΝΚΓΙ) (например, эмтрицитабин или тенофовир), ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ΝΝΚΓΙ) (например, рилипивирин или эфавиренц), ингибиторы протеазы (ΡΙ) (например, ритонавир или лопинавир), ингибиторы слияния (например, маравирок или энфувиртид), ингибиторы ССК5 (например, аплавирок или викривирок), ингибиторы созревания (например, бевиримат), моноклональные антитела к СЭ4 (например, ибализумаб) и ингибиторы интегразы (например, элвитегравир).

В альтернативном варианте осуществления санглифериновый макроцикл изобретения вводят совместно с одним или более другими противовирусными средствами для лечения ΗΒV, которые могут являться одним или несколькими из следующего: интерфероны (например, интерферон-α или пэгилированный интерферон-α), аналоги нуклеозидов или нуклеотидов (например, ламивудин, энтекавир, адефовир дипивоксил или телбивудин), другие иммуномодуляторы (например, тимозин-α, С.УТ107 или Όν601) или НМС ингибиторы СоА редуктазы (например, симвастатин).

Лекарственные формы предпочтительно могут быть представлены в виде единичной лекарственной формы и могут быть приготовлены любым из методов, известных в области фармации. Такие методы включают этап объединения действующего вещества (соединения изобретения) с носителем, который составляет один или большее количество дополнительных компонентов. В большинстве случаев лекарственные формы приготавливают путем однородного и тщательного смешивания действующего вещества с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или с теми и другими с последующим, в случае необходимости, формованием продукта.

Соединения изобретения обычно вводят перорально в форме фармацевтической композиции, вклю- 20 023907 чающей действующее вещество, необязательно в форме нетоксичной соли присоединения органической или неорганической, кислоты или основания, соли присоединения, в фармацевтически приемлемой лекарственной форме. В зависимости от нарушения и пациента, подлежащего лечению, а также от пути введения композиции можно вводить в различных дозах.

Например, соединения изобретения можно вводить перорально, буккально или подъязычно, в форме таблеток, капсул, суппозиториев, эликсиров, растворов или суспензий, которые могут содержать ароматизаторы или красители, для немедленного, замедленного или регулируемого высвобождения.

Такие таблетки могут содержать вспомогательные вещества, такие как микрокристаллическую целлюлозу, лактозу, цитрат натрия, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция и глицин, разрыхлители, такие как крахмал (предпочтительно кукурузный, картофельный крахмал или крахмал тапиоки), натрий-крахмалгликолят, натрий-кроскармеллозу и некоторые сложные силикаты, а также связующие добавки для гранулирования, такие как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ), гидроксипропилцеллюлозу (ГПЦ), сахарозу, желатин и гуммиарабик. Дополнительно могут быть включены смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерилбегенат и тальк.

Твердые композиции аналогичного типа также могут использоваться в качестве наполнителей в желатиновых капсулах. Предпочтительные вспомогательные вещества в этом отношении включают лактозу, крахмал, целлюлозу, молочный сахар или полиэтиленгликоли высокой молекулярной массы. В случае водных суспензий и/или эликсиров, соединения изобретения могут быть объединены с различными подсластителями или ароматизаторами, окрашивающими веществами или красителями, эмульгаторами и/или суспендирующими добавками и с разбавителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин, а также их комбинациями.

Таблетка может быть изготовлена путем прессования или формования, необязательно с одним или более дополнительными компонентами. Прессованные таблетки могут быть изготовлены путем прессования в подходящей машине действующего вещества в свободнотекучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим веществом (например, повидоном, желатином, гидроксипропилметилцеллюлозой), смазывающим веществом, инертным разбавителем, консервирующим веществом, разрыхлителем (например, натрий-крахмалгликолятом, сшитым повидоном, сшитой натрийкарбоксиметилцеллюлозой), поверхностно-активным или диспергирующим веществом. Формуемые таблетки могут быть изготовлены путем формования в подходящей машине смеси порошка соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем. Таблетки необязательно могут быть покрыты оболочкой или на них могут быть нанесены риски и могут иметь такой состав, чтобы обеспечивать медленное или регулируемое высвобождение из них действующего вещества при использовании, например, гидроксипропилметилцеллюлозы в переменных пропорциях, обеспечивая требуемый профиль высвобождения.

Лекарственные формы в соответствии с настоящим изобретением, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит установленное количество действующего вещества; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или жидкой эмульсии вода-в-масле. Действующее вещество также может быть представлено в виде болюса, электуария или пасты.

Следует понимать, что в дополнение к компонентам, конкретно указанным выше, лекарственные формы настоящего изобретения могут включать другие агенты, стандартные в данной области, относящиеся к типу рассматриваемой лекарственной формы, например, формы, подходящие для перорального введения, могут включать ароматизаторы.

Предпочтительно такие добавки, как консервирующие и буферные вещества, могут быть растворены в среде. С целью повышения стабильности композиция может быть заморожена после заполнения флакона, а вода - удалена в вакууме. Сухой лиофилизированный порошок затем закрывают во флакон, и сопровождающий флакон воды для инъекции может поставляться для восстановления жидкости перед применением.

Вводимая дозировка соединения изобретения будет изменяться в зависимости от конкретного соединения, заболевания, субъекта, природы и тяжести заболевания и физического состояния субъекта, а также выбранного пути введения. Соответствующая дозировка может быть с легкостью определена специалистом, квалифицированным в данной области.

Композиции могут содержать от 0,1%, предпочтительно от 5-60%, более предпочтительно от 10-30 мас.%, соединения изобретения, в зависимости от способа введения.

Специалисту в данной области будет очевидно, что оптимальное количество и интервал индивидуальных дозировок соединения изобретения будут определяться природой и степенью состояния, подвергаемого лечению, формой, путем и участком введения, а также возрастом и состоянием конкретного субъекта, подвергаемого лечению, и тем, что врач, в конечном счете, определит подходящие используемые дозировки. Такое введения доз может быть повторено настолько часто, насколько это необходимо. Если развиваются побочные эффекты, количество и/или частоту введения доз можно изменить или уменьшить, в соответствии с нормальной клинической практикой.

Дополнительные аспекты изобретения включают

- 21 023907 применение соединения согласно изобретению для применения в качестве фармацевтического средства для лечения вирусных инфекций, таких как НСУ или ВИЧ инфекция, для применения в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства;

фармацевтическую композицию, включающую соединение согласно изобретению вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, для лечения вирусных инфекций, таких как НСУ или ВИЧ инфекция, для применения в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства;

способ лечения вирусных инфекций (в особенности РНК-вирусных инфекций), таких как НСУ или ВИЧ инфекция, или применение в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения согласно изобретению.

Общие методы Материалы и методы

Бактериальные штаммы и условия роста.

Продуцент санглиферина 81гср!отусск кр. А92-308110 (Ό8Μ номер 9954, полученный от Ό8ΜΖ, Β^аии8сЬ№С^д, Ссттаиу), также называемый ΒIΟТ-4253 и ΒIΟТ-4370, или его производные, такие как ΒIΟТ-4585, поддерживали на овсяной среде с агаром, МАМ, ГОР4 или ГОР2 (см. ниже) при 28°С.

ΒIΟТ-4585 (относительно методики конструирования, см. пример 1) выращивали на овсяном агаре при 28°С в течение 7-10 дней. Споры с поверхности агаровой чашки собирали в 20% мас./об. стерильный глицерин в дистиллированной воде и хранили в аликвотах по 0,5 мл при -80°С. Замороженный сток спор использовали для инокуляции посевной среды 303 или 8М25-3. Инокулированную посевную среду инкубировали при встряхивании в пределах 200-300 об/мин с подбрасыванием на 5,0 или 2,5 см при 27°С в течение 24 ч. Ферментационную среду 80Р-2 или ВТ6 инокулировали 2,5-10% посевной культуры и инкубировали при встряхивании в пределах 200-300 об/мин с подбрасыванием на 5 или 2,5 см при 24°С в течение 4-5 дней. Затем культуру собирали для экстракции.

Аналоги метатирозина.

Метил-(28)-2-амино-3-(6-гидрокси(2-пиридил))пропаноат, метиловый эфир Ь-3-аминофенилаланина, метиловый эфир Ь-4-метил-метатирозина, метиловый эфир Ь-4-фтор-метатирозина и метиловый эфир Ь-4,5-дифтор-метатирозина были приобретены у №!сЬст (И8А).

ИЬ-3-фторфенилаланин и Ь-фенилаланин были приобретены у 8щта (ЦК).

ИЬ-метатирозин был приобретен у Р1иотосЬст (ИК).

Ь-метатирозин был приобретен у А1Га Аскаг (ИК).

(8)-метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат был приобретен у №!СЬст (И8А). (3Бром-5-фторанизол (9-1) был приобретен у Ассс1а СНстБю Со., Ь!б., (8НаидНац СЫиа), а также может быть приобретен у АтГшссот Ιικ. (И8А) или Аро11о 8с1си!1Йс Ь!б. (ИК)).

ПЬ-5-фтор-метагирозин (8), ИЬ-5-фтор-метатирозин (9), метил-2-амино-3-(3-фтор-5гидроксифенил)пропаноат (10), метил-2-амино-3-(2-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (11), метил-2амино-3-(2-фтор-3-гидроксифенил)пропаноат (12) и метил-2-амино-3-(2,6-дифтор-3-гидроксифенил) пропаноат (13) синтезировали следующим образом:

ПЬ-4-фтор-метатирозин (8)

К раствору 8-1 (3 г, 19,5 ммоль) в сухом ДХМ (150 мл) по каплям добавляли ΒΒτ₃ (4М в ДХМ, 14,6 мл, 58,5 ммоль) при -70°С. После добавления реакционную смесь перемешивали при -20°С в течение 3 ч, осторожно добавляли воду со льдом и экстрагировали ДХМ. Органические слои промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над №₂8О₄, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии на силикагеле, получив требуемое соединение 8-2.

К раствору 8-2 (0,9 г, 6,4 ммоль) в ацетоне (40 мл) добавляли К₂СО₃ (2,2 г, 16 ммоль) при комнат- 22 023907 ной температуре. Реакционную смесь оставляли на ночь с перемешиванием при комнатной температуре. Добавляли воду и удаляли ацетон в вакууме, а затем экстрагировали ЕЮАс, органические слои промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над Να₂δϋ₄. фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии на силикагеле, получив требуемое соединение 8-3.

Смесь 8-3 (1 г, 4,34 ммоль), гиппуровой кислоты (860 мг, 4,80 ммоль), №ЮАс (400 мг) и Ас₂О (2,2 мл) перемешивали при 80°С в течение 2 ч. Желтую реакционную смесь охлаждали и добавляли холодный ЕЮН (10 мл), смесь охлаждали в ледяной бане в течение 15 мин и затем вливали в 30 мл воды со льдом, охлаждали и собирали продукт при помощи фильтрации. Твердое вещество сушили в вакууме, получив 8-4.

Раствор 8-4 (300 мг, 0,8 ммоль) и №ЮАс (71 мг, 0,87 ммоль) в МеОН (50 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляли на роторном испарителе и растворяли остаток в 50 мл ЕЮАс, раствор ЕЮАс два раза промывали водой и выпаривали, получив 8-5.

Раствор 8-5 (360 мг, 0,89 ммоль) в МеОН (50 мл) гидрировали над 10% Рб/С (77 мг) при нормальном давлении в течение 20 ч. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали с получением продукта 8-6.

Раствор 8-6 (210 мг) в 3Н НС1 (10 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 24 ч, раствор выпаривали досуха, а остаток очищали с помощью системы СотЬтйакй с обращенными фазами, получив целевой продукт 8.

ΌΕ-5-фтор-метатирозин (9) и метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (10)

К раствору 9-1 (20 г, 97,55 ммоль) в тетрагидрофуране (100 мл) по каплям добавляли н-бутиллитий (43 мл, 2,5М, 107,3 ммоль) при -78°С. Смесь перемешивали в течение 30 мин и при указанной температуре добавляли Ν,Ν-диметилформамид (15,1 мл, 195,1 ммоль). Смесь перемешивали еще в течение 30 мин и убирали холодную баню. Через 1 ч реакцию останавливали насыщенным водным раствором хлорида аммония. Органический слой промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили (сульфат натрия), фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, получив 9-2.

К раствору 9-2 (6 г, 38,9 ммоль) в сухом ДХМ (200 мл) по каплям добавляли ΒΒγ₃ (4М и ДХМ, 30 мл, 116,8 ммоль) при -70°С. После добавления реакционную смесь перемешивали при -20°С в течение 3 ч, осторожно добавляли воду со льдом и экстрагировали ДХМ. Органические слои промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над №₂8О₄, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии на силикагеле, получив требуемое соединение 9-3.

К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (4,64 г, 14 ммоль) в ДХМ (150 мл) при комнатной температуре добавляли ΌΒΉ (4,26 г, 28 ммоль). Через 10 мин добавляли 9-3 (1,95 г, 14 ммоль) и оставляли полученную смесь на ночь с перемешиванием при комнатной температуре. Раствор разбавляли ЕЮАс (150 мл), разделяли и промывали органический слой 1Н НС1, сушили над №₂8О₄, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии на силикагеле, получив 9-4.

Раствор 9-4 (1 г) в МеОН (20 мл) гидрировали в течение ночи над 200 мг 10% Рб/С при нормальном давлении. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали с получением 10.

К раствору 10 (300 мг, 1,4 ммоль) в ЕЮН (30 мл) добавляли водн. №ЮН (2Н, 4 мл), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Растворитель удаляли и остаток нейтрализовывали до рН 6 2Н НС1, после чего образовавшиеся белые кристаллы собирали фильтрацией, получив целевое соединение 9.

- 23 023907

Альтернативный путь к метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноату (10). (3,5-Дифторбромбензол (9а-1) был приобретен у Оатш Ппе СНеписаГ Со., Ыб., (8ЬапдЬа1, СЫпа) и может быть также приобретен у А1£а Аекаг или 8гдта А1бпсН).

Получение 9а-2.

К раствору ВпОН (1,61 мл, 15,54 ммоль) в ДМФА (30 мл) добавляли NаΗ (622 мг, 60% дисперсия в минеральном масле, 15,54 ммоль) при 0°С. Перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 0,5 ч с получением прозрачного раствора. 9а-1 (1,79 мл, 15,54 ммоль) добавляли при такой скорости, чтобы поддерживать температуру ниже 40°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, получив желтый раствор. Реакцию останавливали водой и экстрагировали петролейным эфиром (35 млх4). Объединенные органические слои выпаривали. И остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, используя для элюирования петролейный эфир, с получением 9а-2 (2,544 г) в виде бесцветного масла.

Получение 9а-3.

В сухую трехгорлую колбу добавляли Мд (170,1 мг, 7,10 ммоль), безводный ТГФ (10 мл) и небольшое количество иода под азотом. Добавляли 1/3 9а-2 (1,664 г, 5,9192 ммоль) в ТГФ (2 мл). Смесь нагревали до кипения с обратным холодильником. В это время желтая смесь постепенно приобретала яркожелтый цвет. Затем по каплям добавляли остальные 2/3 9а-2 и продолжали кипятить реакционную смесь с обратным холодильником еще 0,5 ч.

К вышеуказанной смеси медленно добавляли ДМФА (0,504 мл, 6,51 ммоль) при 0°С. Перемешивание продолжали в течение 0,5 ч при комнатной температуре. Добавляли НС1 (2 М, 10 мл) и выпаривали ТГФ. Остаток экстрагировали этилацетатом (25 млх3). И объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором и выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, элюируя в градиенте от петролейного эфира до петролейного эфира/этилацетата = 20/1, получив 9а-3 (694 мг) в виде бесцветного масла.

Получение 9а-5.

К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата, 9а-4 (993 мг, 3,00 ммоль) в ДХМ (30 мл) при комнатной температуре добавляли ΌΒυ (832 мкл, 5,57 ммоль). Через 10 мин добавляли 9а-3 (694 мг, 3,01 ммоль) и перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Раствор промывали НС1 (1 М, 10 мл) и объединенные органические слои сушили и выпаривали в вакууме.

Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии на силикагеле (элюция дихлорметан/этилацетат = 10/1), получив 9а-5 (1,11 г).

Получение 10.

Раствор 9а-5 (100 мг) в МеОН (50 мл) гидрировали над 20 мг 10% Рб/С при нормальном давлении в течение 2 ч. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали, получив 10 (33 мг).

Метил-2-амино-3-(2-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (11).

К раствору соединения 11-1 (1,4 г, 9 ммоль) в 50 мл ДХМ по каплям добавляли ВВг₃ (4М в ДХМ, 3,6 мл, 13,5 ммоль) при -78°С. После добавления реакционную смесь перемешивали при -20°С в течение

- 24 023907 д ч. Затем медленно добавляли лед/воду, слои разделяли, органические слои промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над №ь8О_д и выпаривали досуха. Остаток использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.

К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (3 г, 9 ммоль) в 100 мл ДХМ добавляли ΌΒυ (2,8 г, 18 ммоль) при комнатной температуре, через 10 мин добавляли соединение 11-2 (неочищенное соединение из предыдущей стадии), перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем раствор разбавляли ДХМ (50 мл), промывали 1Н НС1 (20 мл), сушили над №-ь8О_д и выпаривали досуха. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат = 5/1), получив 11-3.

Смесь соединения 11-3 (500 мг, 1,5 ммоль) в МеОН (20 мл) гидрировали над 50 мг 10% Рк/С при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали, получив неочищенный продукт, который очищали при помощи системы СотЫйа8к с обращенными фазами, с получением 11 в виде твердого белого вещества.

Метил-2-амино-3- (2-фтор-3-гидроксифенил)пропаноат (12)

К раствору соединения 12-1 (1,д г, 9 ммоль) в 50 мл ДХМ по каплям добавляли ВВг₃ (дМ в ДХМ, 3,6 мл, 13,5 ммоль) при -78°С. После добавления реакционную смесь перемешивали при 20°С в течение д ч. После медленного добавления льда/воды слои разделяли, органический слой промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над №ь8О_д и выпаривали досуха.

Остаток использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.

К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (3 г, 9 ммоль) в 100 мл ДХМ при комнатной температуре добавляли ЭВи (2,7 мл, 18 ммоль), через 10 мин добавляли соединение 12-2 (неочищенное соединение из предыдущей стадии), перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем раствор разбавляли ДХМ (100 мл), промывали 1Н НС1 (30 мл), сушили над №-ь8О_д и выпаривали досуха. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат = 5/1), получив 12-3.

Смесь соединения 12-3 (500 мг, 1,дд ммоль) в МеОН (10 мл) гидрировали над 100 мг 10% Рк/С при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали, получив неочищенный продукт, который очищали при помощи системы СотЫПа8к с обращенными фазами, с получением требуемого соединения 12 в виде твердого белого вещества.

Метил-2-амино-3 -(2,6-дифтор-3 -гидроксифенил)пропаноат (13)

К раствору 2,д-дифторфенола (2 г, 15,д ммоль) в 50 мл ДМФА добавляли К₂СО₃ (3,2 г, 23,1 ммоль) и ВпВг (2,2 мл, 18,5 ммоль) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли воду (100 мл) и ЕА (200 мл), органические слои промывали водой (50 мл) и насыщенным солевым раствором (50 мл), сушили над №ь8О_д и выпаривали досуха. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат = 10/1), получив неочищенное 13-1.

К раствору соединения 13-1 (2 г, 9 ммоль) в 10 мл ТГФ по каплям добавляли Н-ВиЫ (д мл, 2,5 М) при -78°С и перемешивали в течение 30 мин. Добавляли ДМФА (1,3 г, 0,018 ммоль) и снова перемеши- 25 023907 вали в течение 30 мин. Затем холодную баню убирали и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч перед добавлением воды. Смесь экстрагировали этилацетатом (20 млх3), сушили над №₂δΟ₄ и выпаривали досуха. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат = 10/1), получив 13-2 в виде твердого желтого вещества.

К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (728 мг, 2,2 ммоль) в 20 мл ДХМ добавляли ΌΒυ (319 мг, 2,1 ммоль) при комнатной температуре. Через 10 мин добавляли соединение 13-2 (500 мг, 2 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем раствор разбавляли ДХМ (50 мл), промывали 1Н НС1 (20 мл), сушили над Ν;·ι₂δΟ₄ и выпаривали досуха. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат = 5/1), получив 13-3 в виде желтого масла.

Соединение 13-3 (600 мг, 1,32 ммоль) в МеОН (20 мл) гидрировали над 60 мг 10% Ρά/С при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали, получив неочищенный продукт, который очищали при помощи системы СотЫЛакН с обращенными фазами, с получением требуемого соединения 13 в виде твердого белого вещества.

Составы сред.

Воду, используемую для приготовления сред, подготавливали с использованием системы для очистки воды [^ПИроге Ε1ίχ Апа1уПса1 Огабе.

Посевная среда δθδ

Компонент (и поставщик) Состав

глюкоза (31дта, С7021) 7,50	Г
глицерин (ПзЬег ΒοίεηΟίίίο, С/0650/25)	7,50	Г
дрожжевой экстракт (ВесРоп ϋίοίοίηθοη, 212770)	1,35	г
солодовый экстракт (ВесРоп О1ск1пвоп, 218630)	3,75	г
картофельный крахмал (растворимый) (Зхдта, 32004)	7,50	г
ΝΖ-амин А (81дта, С0626)	2,50	г
жареная соевая мука, НиРгФзоу (ΑΏΜ, 063-160)	2,50	г
Ь-аспарагин (Зддта, А0884)	1, 00	г
СаСО3 (Са1с1Рес, ν/405)	0,05	г
ИаС1 (РгзНег зсФепРгЕФс, 3/3160/65)	0,05	г
КН2РО4 (Зхдта, Р3786)	0,25	г
К2НРО4 (Зхдта, Р5379)	0,50	г
Мд5О4·7Н2О (Зхдта, М7774)	0,10	г
раствор микроэлементов В	1, 00	мл
агар	1, 00	г
Пеногаситель ЗАС471 (СЕ ЗШсопез, ЗАС471)	*0,20	мл
КО Н2О до конечного объема	**1,00	л
рН перед стерилизацией доводили до рН	7,0 с

использованием ЮМ ЫаОН/ЮМ Η₂3Ο₄ стерилизовали нагреванием 121°С, 20-30 мин (автоклавирование)

Примечания.

* пеногаситель использовали только в посевных ферментерах, но не в посевных колбах, ** конечный объем доводили с учетом посевного объема.

- 26 023907

Раствор микроэлементов В.

Компонент Состав

РеЗО4-7н2О (51дта, Р8633)	5,00 г
Ζη3Ο4 7Н2О (Згдта, Ζ0251)	4,00 г
МпС12-4Н2О (Зхдта, М8530)	2,00	г
СиЗО4 · 5Н2О (А10гз.сЬ, 20,919-8)	0,20	г

(ΝΗ₄)₆Μο₇0₂₄ (РтвЬег 5с1епЫ£1с

А/5720/48)	0,20	Г
СоС12-6Н20 (Зхдта, С2644)	0,10	г
Н3ВОз (Зхдта, В6768)	0,10	г
ΚΙ (А1£а Аезаг, А12704)	0,05	г
Н2ЗО4 (95%) {Пика, 84720)	1,00	мл
КО Н2О до конечного объема	1,00	л

Состав

Продукционная среда 8СР2.

Компонент жареная соевая мука ШиЪггзоу} (ΑΌΜ,

20,00 г

063-160) глицерин (ПзНег зсгепЫЕхс,

40,00 г

0/0650/25) буфер МЕЗ (Асгоз, 172595000) 19,52 пеногаситель 5АС471 (ОЕ бШсопез, *0, 20

ЗАО471)

КО Н₂О до конечного объема **1,00 рН перед стерилизацией доводили до рН 6,8 с использованием ЮМ МаОН г

мл л

стерилизовали нагреванием 121°С, 20-30 мин (автоклавирование)

Примечания.

* конечный объем доводили с учетом посевного объема, ** пеногаситель использовали только в посевных ферментерах, но не в посевных колбах.

Среда 8М25-3 (также называемая 8М25).

Компонент

Глицерин (ПзЬег ΒοϊθηΡίίίο

¢3/0650/25)		40	Г
Соевый пептон АЗ ЗС	(Огдапобес11П1е)	10	г
Солодовый экстракт	(Гт£со)	21г	г

до конечного объема 1 л рН перед стерилизаций не доводили (то есть рН 7,0)

- 27 023907

Среда ^Р4.

Компонент

Растворимый Крахмал (Ώί£σο) 10 г

К₂НРО₄ 1 г

МдЗО₄.7Н₂О 1 г

ИаС1 1 г (ΝΗ₄)₂3Ο₄ 2 г

СаСО₃ 2 г

Раствор солей микроэлементов Ι3Ρ 1 мл

Агар 20 г до конечного объема 1 л

Приготовили пасту с крахмалом в малом объеме холодной воды и довести до объема 500 мл

Добавили другие компоненты в раствор II в 500 мл воды, рН должен быть между рН 7,0 и рН 7,4 (рЕ 7,3), Смешали два раствора и добавили агар

Соли микроэлементов ^Р.

Компонент

РеЗО₄ · 7Н₂О

МпС1₂·4Н₂О

Ζη3Ο₄ · 7Н₂О до конечного объема Хранить при 4 градусах С

Овсяный агар (]^Р3).

г овсяной муки варили в 1 л воды на электроплитке (или в СВЧ-печи) в течение 20 мин. Готовую смесь фильтровали через миткаль/марлю и доводили до рН 7,2, а объем до 1 л. Добавляли 1 мл раствора микроэлементов ^Р. Затем перед стерилизацией добавляли 18 г агара на 1 л.

Агар МАМ.

Компонент Состав

Пшеничный крахмал	(Згдша)	10,00	г
Порошок кукурузного экстракта (КодиеВВе)	2,50	г
Дрожжевой экстракт	(ВесВоп Бгсктпзоп)	3,00	г
СаСОз (Са1с1Вес)		3,00	г
РеЗО4 (Зхдта)		0,300	г
Бакто-агар (ВесВоп	Бгскхпзоп)	20,00	г
КО Н2О до конечного объема	1,00	л

рН 5,8 до автоклавирования

- 28 023907

Продукционная среда ВТ6.

Компонент Состав

Глюкоза (Зхдта)	50,00	г
Цибгхзоу (АОМ)	30,00	г
ЫаС1 (ПзЬег)	5,00	г
(ΝΗ4)23Ο4 (Зхдта)	3,00	г
СаСОз (Са1с1бес)	6,00	г
КО Н2О до конечного объема	1, 00	л
Довести рН до 7,0, затем добавить	СаСОз

Агар Σ8Ρ2.

Компонент Состав

Дрожжевой	экстракт	(Весбоп Вгскхпзоп)	4,00	г
Солодовый	экстракт	(Весбоп Огскгпзоп)	10,0	г
Декстроза	(Зхдта)		4,00	г
Бакто-агар (Весбоп	Огскгпзоп)	20,0	г
КО Н20	до конечного объема	1,00	л
Довести	рН до	7,3 перед добавлением	агара

стерилизацией

Общий метод ферментации.

Криоконсервированные споры ВЮТ-4585 (методику конструирования см. в примере 1) размораживали при комнатной температуре. Вегетативные культуры (посевные культуры) приготавливали путем переноса 4,0 мл стока спор в 400 мл среды 8М25 в 2 л колбе Эрленмейера с поропластовой пробкой. Культивирование вели в течение 48 ч при 27°С и 250 об/мин (с подбросом на 5,0 см). Из посевной культуры 25 мл переносили в 250 мл продукционной среды 8ОР2+5% НР20 в 2 л колбе Эрленмейера с поропластовой пробкой. После культивирования в течение 24 ч при 24°С и 250 об/мин (с подбросом на 2,5 см) в каждую продукционную колбу добавляли 2 мл 250 мМ раствора рацемического или 125 мМ раствора энантиомерно чистого нужного предшественника в 1М соляной кислоте и 2 мл 250 мМ метанольного раствора [Ж-пипе'разиновой кислоты, получив 1 мМ конечную концентрацию индивидуальных энантиомеров предшественников. Необязательно вместо 1М соляной кислоты можно использовать ДМСО. 1)1 .-пипе'разиновую кислоту необязательно можно исключить. Культивирование продолжали в течение еще четырех дней при 24°С и 250 об/мин (с подбросом на 2,5 см).

Анализ сред культивирования с помощью ЖХ-УФ и ЖХ-УФ-МС.

Добавляли среду культивирования (1 мл) и этилацетат (1 мл) и перемешивали в течение 15-30 мин с последующим центрифугированием в течение 10 мин, отбирали 0,4 мл органического слоя, выпаривали досуха и затем повторно растворяли в 0,20 мл ацетонитрила.

Условия ВЭЖХ:

Колонка С18 Нурегс1опе ΒΌ3 С183и, 4,6 мм х 150 мм Снабжена картриджем РЬепотпепех Апа1уб1са1 С18 Зесигъбу

СиагД СагбгШде (КДО-4282)

Температура колонки 50°С Расход 1 мл/мин УФ контроль при 240 нм

- 29 023907

Вводили аликвоту 20 мкл Градиент растворителей:

мин: 55% В

1,0 мин: 55% В 6,5 мин: 100% В 10,0 мин: 100% В 10,05 мин: 55% В 13,0 мин: 55% В

Растворитель А: вода + 0,1% муравьиной кислоты

Растворитель В: ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты

При указанных условиях 8ΓΑ элюируется при 5,5 мин.

При указанных условиях 8ίΒ элюируется при 6,5 мин.

ЖХМС выполняли на интегрированной ВЭЖХ-системе АдПеШ НР1100 в комбинации с массспектрометром Вгикег Όαΐΐοηίοδ Е^сциге 3000 + с ионизацией электрораспылением, работающим в режиме детекции положительных ионов, при использовании хроматографии и растворителей, описанных выше.

Метод ОС ЖХ-МС.

Условия ВЭЖХ:

Колонка С18 Нурегс1опе ΒΏ5 С18311, 4,6 мм х 150 мм Снабжена картриджем РЕепотепех Апа1уб1са1 С18 Зесиггбу

Сиагй Сагбгтаде (КЛО-4282)

Температура колонки 50 °С Расход 1 мл/мин

УФ контроль при 210, 240 и 254 нм Градиент растворителей:

мин: 10% В

2,0 мин: 10% В 15 мин: 100% В 17 мин: 100% В 17,05 мин: 10% В 20 мин: 10% В

Растворитель А: вода + 0,1% муравьиной кислоты Растворитель В: ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты

Условия МС:

МС работает в режиме переключения (переключение между режимом положительных и отрицательных ионов), сканирование от 150 до 1500 а.е.м.

Ιη νίΐ го анализ репликонов для оценки НСУ противовирусной активности.

Противовирусную эффективность против генотипа 1 НСУ можно проверить следующим образом: за один день перед добавлением тестируемого продукта, клетки Ηιι1ι5.2. содержащие репликон НСУ генотипа 1Ь Ι3891ιιοιώί-№;ο/Ν83-3'/5.1 (Уго1ук е1 а1., 2003) и субкультивированные в питательной клеточной среде [ΌΜΕΜ (номер по кат. 41965039) с добавкой 10% РС8, 1% незаменимых аминокислот (11140035), 1% пенициллина/стрептомицина (15140148) и 2% генетецина (10131027); ΙηνίίΓΟ^η] в соотношении 1,3-1,4 и выращенные в течение 3-4 дней во флаконах для культур тканей на 75 см² (ТесЬпо Р1а8Йс Рго6ис18), собирали и сеяли в аналитическую среду (ΌΜΕΜ, 10% РС8, 1% незаменимых аминокислот, 1% пенициллина/стрептомицина) при плотности 6500 клеток/лунка (100 мкл/лунка) в 96луночных микротитровальных планшетах для культур тканей (Ра1соп, Вескоп Эюкпъоп для оценки антиметаболического действия и Си11игР1а1е, Регкт Е1тег для оценки противовирусного действия). Микротитровальные планшеты инкубировали в течение ночи (37°С, 5% СО₂, относительная влажность 9599%), получив неконфлюентный монослой клеток.

Готовили последовательные разведения; каждое последовательное разведение делали по меньшей мере в двух повторах. После подготовки анализа микротитровальные планшеты инкубировали в течение 72 ч (37°С, 5% СО₂, относительная влажность 95-99%).

Для оценки антиметаболических эффектов аналитическую среду удаляли, заменяли 75 мкл 5% рас- 30 023907 твором МТ8 (Рготеда) в среде без фенольного красного и инкубировали в течение 1,5 ч (37°С, 5% СО₂, относительная влажность 95-99%). Оптическое поглощение измеряли при длине волны д98 нм (8айге², Тесап) и оптические плотности (значения ΟΌ) преобразовывали в процент от необработанных контролей.

Для оценки противовирусных эффектов аналитическую среду удаляли и промывали монослои клеток РВ8. Промывочный буфер удаляли, добавляли 25 мкл лизисного буфера О1о (кат. Е2бб1, Рготеда), после чего лизис проводили в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 50 мкл ЬисТегаке Лккау 8у5!ет (кат. Е1501, Рготеда) и сразу же количественно регистрировали сигнал люминесценции люциферазы (время интегрирования 1000 мс/лунка, 8айге², Тесап). Относительные единицы люминесценции преобразовывали в процент от необработанных контролей.

ЕС₅₀ и ЕС₉₀ (значения, полученные из кривой зависимости эффекта от дозы) представляют собой концентрации, при которых наблюдали, соответственно, 50% и 90% ингибирование вирусной репликации. СС50 (значение, полученное из кривой зависимости эффекта от дозы) представляет собой концентрацию, при которой метаболическая активность клеток уменьшилась бы до 50% от метаболической активности необработанных клеток. Индекс селективности (81), характеризующий терапевтическое окно соединения, вычисляли как СС₅₀/ЕС₅₀.

Концентрация соединения, как полагают, вызывает истинный противовирусный эффект в системе ΗΟν репликона, когда при соответствующей конкретной концентрации антирепликативный эффект превышает 70% порог, и при этом наблюдается не более чем 30% снижение метаболической активности.

1п νίΙΐΌ анализ репликонов для оценки противовирусной активности ΗСV в генотипах 1а и 2а.

Репликонные клетки (сугеномные репликоны генотипа 1а (Η77) и 2а (1ΕΗ-1)) выращивали в модифицированных по способу Дульбекко обогащенных средах (ΌΜΕΜ), с 10% эмбриональной бычьей сывороткой (РВ8), 1% пенициллина-стрептомицина (реп-51гер), 1% глутамина, 1% незаменимых аминокислот, 250 мкг/мл Од18 в инкубаторе с 5% СО₂ при 37°С. Все реактивы для клеточных культур могут быть приобретены у МеФа1есН (Иегпйоп. νΑ).

Репликонные клетки трипсинизировали и сеяли в количестве 5х10³ лунка в 9б-луночные планшеты с вышеуказанными средами без Од18. На следующий день питательную среду меняли на ΌΜΕΜ, содержащую соединения, последовательно разведенные в присутствии 5% РВ8. В анализе противовирусного действия против ΗСV репликона исследовали эффекты соединений в последовательных разведениях. Вкратце, клетки, содержащие ΗСV репликонов, сеяли в 9б-луночные планшеты. Тестируемые продукты последовательно разводили в ΌΜΕΜ плюс 5% РВ8. Разведенное соединение вносили в требуемые лунки в планшете. Через 72 ч инкубирования при 37°С клетки обрабатывали. Внутриклеточную РНК из каждой лунки экстрагировали при помощи набора К№а§у 9б ΚίΙ (Ц1адеп). Уровень РНК ΗСV определяли с помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскриптазой, используя реагенты Та^Μаη Опе-81ер КТРСК Μπ5^γ Μίχ (АррНеД Вю5у51ет5, Ро51ег СДу, СА) и систему определения последовательности АВ1 Рг18т 7900 (АррНеД Вю5у51ет5), как описано ранее ^го1ук е1 а1., 2003). Цитотоксическое действие измеряли с использованием реагентов Та^Μаη К1Ьо5ота1 ΡΝΑ Соп1го1 Кеадейз (АррНеД Вю5у51ет5) в качестве показателя количества клеток. Количество РНК ΗСV и рибосомной РНК затем использовали для получения применимых значений 1С₅₀ (концентрация, ингибирующая репликацию репликона на 50%).

Оценка микросомального метаболизма (анализ стабильности в микросомах).

Скорость метаболизма в микросомах можно проанализировать следующим образом.

Мышиные или человеческие микросомы печени разводили в буфере С (0,1 М калий-фосфатный буфер, 1,0 мМ ЭДТА, рН 7,д) до концентрации 2,5 мг/мл. Затем образцы стабильности в микросомах приготавливали, добавляя 50 мкл 5 мкМ стандартного раствора соединения (0,5 мкл 10 мМ стокового раствора в ДМСО в 9,5 мкл ΑΟΝ, добавленного к 990 мкл буфера С) к 50 мкл микросомального раствора (2,5 мг/мл), 110 мкл буфера С и хорошо перемешивали. Все образцы предварительно инкубировали в течение приблизительно 15 мин при 37°С. После этого реакцию начинали, добавляя д0 мкл раствора ΝΑΌΓΗ (12,5 мМ) с осторожным перемешиванием. Аликвоты (д0 мкл) отбирали в 0, 15, 30, д5 и 60 мин и останавливали реакцию, приливая ΑΟΝ, содержащий внутренний стандарт (120 мкл). Белок удаляли центрифугированием 0Ό00 об/мин, 15 мин) и планшет с образцами анализировали на концентрацию соединения с помощью ЖХ-МС/МС. Затем полупериоды существования вычисляли стандартными методами, сравнивая концентрацию аналита с изначально присутствовавшим количеством.

Оценка стабильности в гепатоцитах.

Криоконсервированные гепатоциты, предварительно хранившиеся в жидком азоте, помещали во встряхиваемую водяную баню при 37±1°С на 2 мин ± 15 с. Затем гепатоциты добавляли в 10х объем предварительно нагретого бикарбонатного буфера Кребса-Хенселейта (КНВ) (2000 мг/л глюкозы, без карбоната кальция и бикарбоната натрия, 81дта), мягко перемешивали и центрифугировали при 500 об/мин в течение 3 мин. После центрифугирования супернатант тщательно удаляли и добавляли 10х объем предварительно нагретого буфера КИВ, чтобы ресуспендировать осадок клеток. Клетки мягко перемешивали и центрифугировали при 500 об/мин в течение 3 мин. Затем супернатант удаляли и отбрасывали. После этого жизнеспособность и выход клеток определяли по числу клеток, и полученные значения

- 31 023907 использовали для получения суспензий человеческих гепатоцитов до соответствующей посевной плотности (плотность живых клеток = 2х10⁶ клеток/мл). Приготавливали 2х дозирующий раствор в предварительно нагретом КНВ (1% ДМСО) (200 мкМ стандартный раствор: 20 мкл стокового растора субстрата (10 мМ) в 980 мкл ДМСО, 2х дозирующий раствор: 10 мкл 200 мкМ стандартного раствора в 990 мкл КНВ (2 мкМ после разведения).

мкл предварительно нагретого 2х дозирующего раствора добавляли в лунки и добавляли 50 мкл предварительно нагретого раствора гепатоцитов (2х10⁶ клеток/мл) и начинали отсчет времени. Планшет при этом инкубировали при 37°С. После завершения времени инкубирования (0, 15, 30, 60 и 120 мин) в каждую лунку добавляли 100 мкл ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт, мягко перемешивали, и добавляли 50 мкл предварительно нагретого раствора гепатоцитов (2х10⁶ клеток/мл). В конце инкубирования определяли жизнеспособность клеток. Образцы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин при 4°С, супернатанты разбавляли в 2 раза ультрачистой водой и анализировали уровни соединений с помощью ЖХ-МС/МС.

Оценка растворимости в воде.

Растворимость в воде можно определить следующим образом: 10 мМ стоковый раствор аналога санглиферина приготавливают в 100% ДМСО при комнатной температуре. Аликвоты объемом 0,01 мл в трех экземплярах доводят до 0,5 мл либо 0,1 М раствором РВ8, рН 7,3, либо 100%-м ДМСО во флаконах из желтого стекла. Полученные 0,2 мМ растворы встряхивают при комнатной температуре на шейкерах 1КА® у1Ьгах νΧΚ в течение 6 ч с последующим переносом полученных растворов или суспензий в пробирки ЕррепбогГ объемом 2 мл и центрифугированием в течение 30 мин при 13200 об/мин. Затем аликвоты надосадочной жидкости анализируют методом ЖХМС, как описано выше.

В альтернативе, растворимость в РВ8 при рН 7,4 может быть проверена следующим образом.

Получают калибровочную кривую, растворяя тестируемые соединения и контрольные соединения до 40, 16, 4, 1,6, 0,4, 0,16, 0,04 и 0,002 мкМ в 50% МеОН в Н₂О. Затем стандартные точки разводят 1:20 в МеОН:РВ8 1:1. Конечные концентрации после 1:20 разведения составляют 2000, 800, 200, 80, 20, 8, 2 и 1 нМ. Затем стандарты смешивают с равным объемом (1:1) ΑΟΝ, содержащего внутренний стандарт (гидроксимакроцикл, 6). Образцы центрифугируют (5 мин, 12000 об/мин), после чего анализируют с помощью ЖХ/МС.

	Раствор (мкл)	МеОН/Н2О (1:1) (мкл)		Рабочий раствор (мкМ)	Раствор (мкл)	МеОН/Оуфер (1:1) (мкл)		Конечный раствор (нМ)
10 мМ	10	240		400
400 мкМ	50	450	-	40	20	380	-	2000
20	480	-	16	20	380	-	800
40 мкМ	50	450	-	4	20	380	-	200
16 мкМ	50	450	-	1,6	20	380	-	80
4 мкН	50	450	-	0,4	20	380	-	20
1,6 мкМ	50	450	-	0,16	20	380	-	8
0 / 4 мкМ	50	450	-	0,04	20	380	-	2
0,04 мкМ	50	950	-	0; 002	20	380	-	1

Тестируемые соединения приготавливали в виде стоковых растворов в ДМСО при концентрации 10 мМ. Стоковые растворы разводили в двух экземплярах в РВ8, рН 7,4 в 1,5 мл пробирках ЕррепбогГ до целевой концентрации 100 мкМ с конечной концентрацией ДМСО 1% (например, 4 мкл 10 мМ стоковый раствор в ДМСО в 396 мкл 100 мМ фосфатного буфера). Затем пробирки с образцами мягко встряхивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Образцы центрифугировали (10 мин, 15000 об/мин) для осаждения нерастворенных частиц. Супернатанты переносили в новые пробирки и разводили (фактор разведения для индивидуального тестируемого продукта подтверждали уровнем сигнала соединения на прикладном аналитическом приборе) в РВ8. Разведенные образцы затем смешивали с равным объемом (1:1) МеОН. В конце образцы смешивали с равным объемом (1:1) ΑΟΝ, содержащего внутренний стандарт (гидроксимакроцикл, 6), для анализа ЖХ-МС/МС.

Оценка способности проникать в клетки.

Способность проникать в клетки можно определить следующим образом.

Тестируемое соединение растворяли до 10 мМ в ДМСО и затем еще растворяли в буфере с получением конечной концентрации дозирования 10 мкМ. Маркер флюоресценции люциферовый желтый также включали, чтобы контролировать целостность мембран. Затем тестируемое соединение наносили на апикальную поверхность монослоев клеток Сасо-2 и измеряли проникновение соединения в базолатеральный компартмент. Это выполняли в обратном направлении (из базолатерального в апикальное), чтобы исследовать активный транспорт. ЖХ-МС/МС использовали для количественного определения уров- 32 023907 ней и тестируемых и стандартных контрольных соединений (таких как пропанолол и ацебутолол).

Ιη У1уо оценка фармакокинетики.

Ιη У1уо анализы можно также использовать для измерения биодоступности соединения. В большинстве случаев соединение вводят подопытному животному (например, мыши или крысе) внутривенно (в/в) и перорально (р.о.) и через равные интервалы забирают пробы крови, чтобы исследовать характер изменения концентрации лекарственного соединения в плазме с течением времени. Динамика концентрации в плазме по времени может использоваться для вычисления абсолютной биодоступности соединения в процентах при использовании стандартных моделей. Пример типовой методики описан ниже.

Мышам вводили дозы 1, 10 или 100 мг/кг соединения изобретения или исходного соединения в/в или р.о. Пробы крови забирали в 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 420 и 2880 мин и с помощью ВЭЖХ определяли концентрацию соединения изобретения или исходного соединения в пробе. Динамику концентрации в плазме по времени затем использовали для получения таких ключевых параметров, как площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени (АИС - которая прямо пропорциональна общему количеству неизменного лекарственного вещества, которое достигает системного кровотока), максимальная (пиковая) концентрация препарата лекарственного вещества в плазме, время, за которое достигается максимальная концентрация лекарственного вещества в плазме (пиковое время), при этом дополнительные факторы, которые используются при точном определении биодоступности, включают: конечный полупериод существования соединения, общий клиренс, объем распределения в равновесном состоянии и % Р. Затем указанные параметры анализируют с помощью некомпартментного или компартментного методов, получая расчетное значение биодоступности в процентах, по поводу примера данного типа метода см. Едопп е! а1., 2002, а также приведенные там ссылки.

Ιη У1уо оценка фармакокинетики при пероральном и внутривенном введении (определенный метод).

Цельную кровь анализировали на предмет аналогов санглиферина. Соединения приготавливали в 5% этаноле/5% Сгеторйог ЕЬ/90% физрастворе для р.о. и для в/в введения. Группам по 3 самца СЭ1 мышей вводили дозы 1 мг/кг в/в либо 5 или 10 мг/кг р.о. Пробы крови (40 мкл) забирали из большой подкожной вены ноги перед введением дозы и через 0,25, 0,5, 2, 8 и 24 ч, разводили в равном количестве бН₂О и сразу помещали в сухой лед. Образцы хранили при -70°С до анализа. Концентрацию соединения изобретения или исходного соединения в образце определяли с помощью ЖХМС следующим образом: в образец 20 мкл крови:Н₂О (1:1, об/об)/РК добавляли 20 мкл внутреннего стандарта (гидроксильный макроцикл, 6) до 100 нг/мл, 20 мкл рабочего раствора/МеОН и 150 мкл АСИ, встряхивали на вортексе в течение 1 мин при 1500 об/мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин. Затем супернатант вводили в ЖХ-МС/МС. Строили график зависимости концентраций в крови от времени, который использовали для получения площади под кривой зависимости концентраций в цельной крови от времени (АИС которая прямо пропорциональна общему количеству неизменного лекарственного вещества, которое достигает системного кровотока). Полученные значения использовали для получения параметров РК по возможности.

Ιη У1!го оценка цитотоксичности.

Клетки Ний-7 и НерС2, полученные из АТСС, выращивали в модифицированных по способу Дульбекко обогащенных средах (ΌΜΕΜ), содержащих 10% эмбриональной бычьей сыворотки (РВ§), 1% пенициллина-стрептомицина (реп-8!гер) и 1% глутамина; тогда как клетки СЕМ (клети Т-клеточного лейкоза человека, полученные из АТСС) выращивали в среде №ΜΙ 1640 с 10% РВ§, 1% реп-йгер и 1% глутамина. Свежие МКПК человека выделяли из цельной крови, полученной по меньшей мере от двух доноров, нормальных по результатам скрининга. Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови осаждали/промывали 2-3 раза с помощью центрифугирования на низкой скорости и ресуспендирования в РВ§ для удаления контаминирующих тромбоцитов. Промытые клетки крови затем разводили 1:1 фосфатно-солевым буфером Дульбекко (П-РВ8) и наслаивали на 14 мл среды для выделения лимфоцитов (Ъ8М; СеИдгозу, Меб1а!есй, Ιηο.; плотность 1,078 +/- 0,002 г/мл; кат. 85-072-СЬ) в 50 мл центрифужной пробирке и центрифугировали в течение 30 мин при 600хд. Полосу МКПК осторожно отбирали из образовавшегося граничного слоя и затем промывали 2х в РВ§ при центрифугировании на низкой скорости. После завершающей промывки, клетки подсчитывали по вытеснению трипанового синего и ресуспендировали в 1 х 10⁷ клеток/мл в ΚΡΜI 1640 с добавкой 15% эмбриональной бычьей сыворотки (РВ§), 2 мМ Ьглутамина, 4 мкг/мл РНА-Р. Клетки оставляли для инкубирования на 48-72 ч при 37°С. После инкубирования МКПК центрифугировали и ресуспендировали в ΚΡΜI 1640 с 15% РВ§, 2 мМ Ь-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мкг/мл гентамицина и 20 ЕД/мл рекомбинантного человеческого ΙΕ-2.

Цитотоксичность соединения против клеток, описанных выше, оценивали, определяя полулогарифмические концентрации каждого соединения в трех повторах. Клетка, содержащая только одну среду, служила в качестве клеточного контроля (СС). Клетки Ний-7 и НерС2 сеяли в 96-луночные планшеты при концентрации 5х10³ клеток в лунке. На следующий день среду удаляли и добавляли 100 мкл соответствующей среды, содержащей 5% РВ§. Разведения тестируемых лекарственных соединений приготавливали в 2х концентрации в микротитровальных пробирках и по 100 мкл каждой концентрации вно- 33 023907 сили в соответствующие лунки в стандартном формате. Через 72 ч клетки обрабатывали для оценки цитотоксичности.

МКПК разводили в свежей среде и сеяли на внутренние стенки 96-луночного планшета с круглодонными лунками в количестве 5х10⁴ клеток/лунка в объеме 100 мкл. Аналогично, клетки СЕМ сеяли в количестве 1х10⁴ клеток/лунка. Затем 100 мкл 2х препаратов тестируемых лекарственных соединений добавляли в соответствующие лунки в стандартном формате. Культуры поддерживали в течение шестисеми дней и затем обрабатывали для определения цитотоксичности.

Цитотоксичность определяли при использовании набора для определения целостности мембран Су(оТох-ΟΝΕ™ Нотодепеоиз тетЬгапе 1п!едгйу аззау кй (Рготеда). В анализе измеряли высвобождение лактатдегидрогеназы (РОН) из клеток с поврежденными мембранами во флуориметрическом, гомогенном формате. ЬОН, высвобождаемый в среду культивирования, измеряли с помощью сопряженного ферментного анализа, который приводит к превращению резазурина во флуоресцентный продукт резоруфин. Величина производимой флюоресценции пропорциональна количеству лизированных клеток. Шесть последовательно разведенных концентраций каждого соединения наносили на клетки, чтобы получить, в соответствующих случаях, значения ТС₅₀ (токсическая концентрация лекарственного соединения, уменьшающая жизнеспособность клеток на 50%) и ТС₉₀ (токсическая концентрация лекарственного соединения, уменьшающая жизнеспособность клеток на 90%).

1п уйго оценка ингибирования переносчиков МОР1 и МРР2.

Для оценки ингибирования и активации переносчиков МОР1 (Р-гликопротеин 1) и МРР2 ш уйго может использоваться АТФазный анализ 8о1уо Вю!есЪио1оду, 1пс. (О1аушаз е! а1., 2003). Соединения (в конц. 0,1, 1, 10 и 100 мкМ) инкубируют с мембранными везикулами МОР1 или МРР2 в отсутствие и в присутствии ванадата, чтобы изучить потенциальную активацию АТФазы. Кроме того, подобное инкубирование проводят в присутствии верапамила/сульфасалазина, чтобы обнаружить возможное ингибирование АТФазной активности переносчика. Активность АТФазы измеряют, определяя количество неорганического фосфата спектрофотометрически. Активацию вычисляют на основе ванадатчувствительного увеличения АТФазной активности. Ингибирование определяют по уменьшению верапамил/сульфасалазин опосредованной активности АТФазы.

1п уйго оценка ингибирования Рдр переносчиков при использовании клеток МОСК.

Для оценки ингибирования переносчика Р-гликопротеина (Рдр/МОР1) использовали ш уйго АТФазный анализ Сурго!ех. Использовали клетки МОР1-МОСК, полученные из МН (РоскуШе, МО, и8А). После получения культуры, монослои подготавливали, дважды промывая базолатеральные и апикальные поверхности буфером при рН 7,4 и 37°С. Затем клетки инкубировали с буфером рН 7,4 в апикальных и в базолатеральных компартментах в течение 40 мин при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и при относительной влажности 95% для стабилизации физиологических параметров. Для исследования транспорта в направлении от апикального к базолатеральному (А-В), буфер при рН 7,4 удаляли из апикального компартмента и меняли на дозирующий раствор лоперамида перед помещением в многолуночные планшеты с вкладышами. Растворы приготавливали, растворяя лоперамид в ДМСО с буфером, получив конечную концентрацию лоперамида 5 мкМ (конечную концентрацию ДМСО доводили до 1%). Флуоресцентный маркер целостности люциферовый желтый также включали в раствор для дозирования. Эксперимент проводили в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения (наносимого на апикальные и базолатеральные компартменты). Для транспорта в направлении от апикального к базолатеральному (В-А), субстрат Р-гликопротеина, лоперамид (конечная концентрация = 5 мкМ) помещали в базолатеральный компартмент. Эксперимент проводили в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения (наносимого на апикальные и базолатеральные компартменты). Инкубирование проводили в атмосфере 5% СО₂ с относительной влажностью 95% при 37°С в течение 60 мин. После инкубационного периода многолуночный планшет удаляли, а апикальные и базолатеральные образцы разводили для анализа ЖХМС/МС. Выполняли одиночное определение каждой концентрации тестируемого соединения. На каждом планшете также в качестве положительного контроля скринировали ингибитор. Тестируемое соединение оценивали при 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 и 50 мкМ. Целостность монослоев в ходе эксперимента проверяли, отслеживая проникание люциферового желтого, используя флюориметрический анализ. После анализа вычисляли 1С₅₀ (т.е. концентрацию ингибитора (тестируемого лекарственного соединения), при которой достигался полумаксимальный ингибирующий эффект.

1п уйго оценка ингибирования переносчиков поглощения.

Для оценки ингибирования переносчиков поглощения ОАТ1В1 и ОАТ1В3 использовали ш уйго анализ переносчиков поглощения 8о1уо Вю!есйпо1оду, 1пс. Эксперименты по поглощению с тестируемым продуктом (ТА) выполняли при 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 и 50 мкМ на клетках СНО, стабильно экспрессирующих 8ЬС транспортеры ОАТР1В1 и ОАТР1В3 человека. Исходную линию клеток СНО-К использовали в качестве отрицательного контроля. Клетки (1х10⁵ в 200 мкл смеси 1:1 модифицированной по Дульбекко среды Игла и среды Хэма Р-12 ОМЕМ (Р-12, Еоп/а, №ν 1егзеу, И8) с добавкой 5 мМ бутирата натрия) высевали на стандартные 96-луночные планшеты для культур тканей и инкубировали 24 ч до эксперимента при 37°С в атмосфере 5% СО₂ и 95% влажности воздуха. Перед началом экспери- 34 023907 ментов среду удаляли вакуумным аспиратором, клетки промывали 2x100 мкл буфера КребсаХенселейта, рН 7,3 (приготовленного из реактивов §1§та, 81дта-А1бпсЬ, δΐ Ьош8, МО). Эксперименты по поглощению проводили при 37°С в 50 мкл буфера Кребса-Хенселейта (рН 7,3), содержащего маркерный субстрат и ТА или растворитель соответственно. Концентрация органического растворителя была одинаковой в каждой лунке и не превышала 1% об./об. Маркерным субстратом для анализа ОАТР1В1 являлся Ε3δ (0,1 мкМ), а для анализа ОАТР1В3-Р1ио-3 (10 мкМ). Перемещенное количество маркерного субстрата определяли для каждой лунки в карте в имп/мин. Относительные активности вычисляли из уравнения % активности = (А-В)/(С-Э)х 100, где А - перемещенное количество субстрата в присутствии ТА на трансфицированных клетках, В - перемещенное количество субстрата в присутствии ТА на исходных клетках, С - перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя на трансфицированных клетках и Ό - перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя на исходных клетках.

ГО50 определяли как концентрацию ТА, требуемую для ингибирования транспорта маркерного субстрата на 50%. Ю50 получали из трехпараметрического логистического уравнения; аппроксимирующую кривую зависимости относительной активности от концентрации ТА строили с помощью нелинейной регрессии.

Ιη νίΐτο оценка ингибирования эффлюксных переносчиков.

Для оценки ингибирования эффлюксных переносчиков МКР2, МКР3 и ΒδΕР использовали ίη νίΐτο анализ везикулярных переносчиков δο1νο Β^οΐесЬηο1ο§у ГОс. Тестируемые продукты (ТА) (при конц. 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 и 50 мкМ) инкубировали с эффлюксными транспортными мембранными везикулами (δο1νο1ι Β^οΐесЬηο1ο§у !пс.) в отсутствие и в присутствии 4 мМ АТФ, чтобы выявить различия между опосредованным переносчиками поглощением и пассивной диффузией ТА в везикулы. В случае переносчиков МКР2 и МКР3 реакции проводили в присутствии 2 мМ глутатиона. Реакционные смеси предварительно инкубировали в течение 10 мин при 37°С. Реакции инициировали добавлением 25 мкл 12 мМ Мд АТФ (конечная концентрация в анализе 4 мМ) или аналитического буфера для контроля фона. Реакции останавливали, добавляя 200 мкл охлажденного во льду промывочного буфера, и с последующей немедленной фильтрацией через стекловолоконные фильтры в 96-луночном формате (фильтрпланшет).

Сцинтилляционный буфер добавляли в промытый и высушенный фильтр-планшет, после чего считывали сцинтилляцию. Маркерными субстратами являлись таурохолат (2 мкМ) для ΒδΕР везикул и Е₂173С (1 мкМ) для МКР2 и МКР3 везикул. Для всех лунок перемещенное количество маркерного субстрата определяли в имп/мин. Относительные активности вычисляли из следующего уравнения:

% активности = (А-В)/(С-Э)х 100, где А - перемещенное количество субстрата в присутствии ТА и АТФ, В - перемещенное количество субстрата в присутствии ТА, С - перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя и АТФ и Ό - перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя.

Ю50 определяли как концентрацию ТА, требуемую для ингибирования транспорта маркерного субстрата на 50%. Ю50 получали из трехпараметрического логистического уравнения; аппроксимирующую кривую зависимости относительной активности от концентрации ТА строили с помощью нелинейной регрессии.

Ιη νίΐτο анализ для оценки противовирусной активности в отношении ВИЧ.

Противовирусную эффективность против ВИЧ можно определить следующим образом: СО4+ Тлимфоциты и макрофаги из крови выделяют, как описано ранее (ΒοЬа^бΐ с1 а1., 2008). Вкратце, человеческие МКПК выделяли из свежей крови в градиенте Ρ^сο11-Нура^ие (30 мин, 800 г, 25°С). Первичные человеческие СО4+ Т-клетки выделяли из МКПК с помощью положительной селекции с использованием анти-СЭ4 гранул ЭупаЬсабх и последующим отделением при использовании Эс1асНаЬсаб. Клетки культивировали в среде ΚРМI 1640 (ΙηνίΙΐΌβοη) с добавкой 10% ΡСδ, МЕМ аминокислот, Ь-глутамина, МЕМ витаминов, пирувата натрия и пенициллина со стрептомицином, после чего активировали бактериальным суперантигеном стафилококковым энтеротоксином В (δΕΒ; 100 нг/мл) и полученными от другого донора МКПК, убитыми митомицином С (отношение МКПК:СЭ4 клеток 10:1). Через три дня после стимуляции клетки делили 1:2 в среде, содержащей ГО-2 (конечная концентрация 200 единиц/мл). Затем культуры делили 1:2 каждые 2 дня в среде ГО-2 и заражали ВИЧ через 7 дней после стимуляции. Для получения первичных человеческих макрофагов, моноциты очищали от человеческих МКПК с помощью отрицательной селекции, активировали и культивировали при концентрации клеток 10⁶/мл в ЭМЕМ с добавкой 10% ΡСδ, МЕМ аминокислот, Ь-глутамина, МЕМ витаминов, пирувата натрия, а также пенициллина (100 ед./мл), стрептомицина (100 мг/мл) и 50 нг/мл рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и поддерживали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Для получения макрофагов, происходящих из моноцитов, клеткам позволяли прикрепляться к поверхности пластика и культивировали их в течение 6 дней, чтобы позволить пройти дифференцировке.

- 35 023907

Клетки СЭ4+ НеЬа, клетки 1игка1, активизированные СЭ4+ Т-лимфоциты периферической крови и макрофаги (500000 клеток/100 мкл) инкубировали с р№4.3-ОРР (Х4 вирус) или р№4.3-ВаЬ-ОРР (Κ5 вирус) (100 нг р24) в присутствии увеличивающихся концентраций тестируемого продукта. Через 48 ч инфекцию оценивали, анализируя процент ОРР-положительных клеток методом РАС8 и вычисляя ЕС₅₀.

1п νίΐ го анализ для оценки противовирусной активности в отношении НВУ.

Противовирусную эффективность против НВУ можно определить следующим образом: клетки НерО2 2.2.15 высевали в 96-луночные микротитровальные планшеты. Через 16-24 ч конфлюентный монослой клеток НерО2 2.2.15 промывали и заменяли среду полной средой, содержащей различные концентрации тестируемого соединения в трех повторах (например, шесть полулогарифмических концентраций). Через три дня среду культивирования заменяли свежей средой, содержащей надлежащим образом разведенные тестируемые соединения. Через шесть дней после первоначального введения тестируемого соединения супернатант клеточной культуры собирали, обрабатывали проназой и затем использовали в количественном ТацМап кПЦР анализе в реальном времени. РСК-амплифицированную ДНК НВУ детектировали в реальном времени, контролируя усиление сигналов флюоресценции, обусловленных экзонуклеотической деградацией погашенной флуоресцентной маркерной молекулы, которая гибридизировалась с амплифицированной ДНК НВУ. При каждой ПЦР-амплификации одновременно генерировалась стандартная кривая при использовании разведений очищенной ДНК НВУ. Противовирусную активность вычисляли по снижению уровней ДНК НВУ (1С₅₀). Затем анализ с поглощением красителя использовали для измерения жизнеспособности клеток, которая использовалась для вычисления токсичности (ТС₅₀). Терапевтический индекс (Т1) вычисляли как ТС₅₀/1С₅₀.

1п νίίτο анализ реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ) для оценки иммунодепрессантной активности.

Иммунодепрессантную активность определяли следующим образом: популяции мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) выделяли из крови двух нормальных, не являющихся родственниками доноров-добровольцев (А и В) при использовании центрифугирования через НЩорасще. Клетки подсчитывали и высевали по 1х10⁵ клеток в лунку в 96-луночные планшеты со средой КРМ1, содержащей добавки и 2% человеческую АВ сыворотку. Условия культивирования включали популяции клеток А и В по отдельности и смешанную популяцию клеток А и В в отсутствие или в присутствии тестируемых соединений, каждое соединение в 6 различных концентрациях. Соединения тестировали в дозах в пределах от 10 до 0,0001 мкМ с 1-1од приращениями. Контрольные лунки содержали концентрацию среды для разведения (0,5% ДМСО), сопоставимую с концентрацией, присутствующей в лунках с тестируемыми соединениями. Культуры получали в трех экземплярах в 96-луночном планшете и инкубировали при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО₂. В день 6 после начала анализа добавляли 3Н-тимидин и собирали через 24 ч. Затем сравнивали уровни пролиферации в зависимости от различных условий культивирования.

Способность каждого разведения тестируемого соединения ингибировать пролиферацию в СКЛ вычисляли как процент ингибирования. Это позволило оценить 1С₅₀ (концентрацию тестируемого соединения, которая приводит к 50% снижению количества импульсов в минуту). Чтобы вычислить 1С₅₀, ось X преобразовали в логарифмический масштаб. Нелинейную регрессию использовали для аппроксимации точек данных в средние. Выбирали сигмоидальный переменный наклон.

Анализ ЕЬ18А взаимодействия ί’νρ-Ν85Α.

Данный анализ использовали для измерения разрушения комплексов Сур-№5А, что можно использовать для определения активности взаимодействия с циклофилином Ό. Вкратце, получение и очистку рекомбинантных белков О8Т, О8Т-СурЭ и Соп1 Ж5А-Нй выполняли, как описано ранее (СЬайегр еί а1., 2010). Планшеты Νιιικ Мах18огЬ с 8 лунками в стрипе покрывали О8Т или О8Т-СурЭ в течение 16 ч при 4°С и блокировали. Рекомбинантный Ν85Α-ΒΙ5 (1 нг/мл) добавляли в лунки в 50 мкл связывающего буфера (20 мМ Трис, рН 7,9, 0,5М №С1, 10% глицерина, 10 мМ ЭТТ и 1% №-40) в течение 16 ч при 4°С. Связанный №5А-Н18 затем детектировали, используя мышиные антитела против Н18 (1 мкг/мл) (ап116хН18, С1оп1есЬ) и кроличьи антитела против антител мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (НКР) и фосфатазой (разведение 1:1000). Все эксперименты проводили дважды, используя две различных партии рекомбинантных белков СурЭ и Ν85Α.

Анти-РР1азный анализ ингибирования циклофилинов.

Альтернативная методика анализа взаимодействия с циклофилинами описана ниже: РР1азную активность рекомбинантного СурА или Ό, образующихся при расщеплении тромбином О8Т-СурА или Ό, определяли, отслеживая скорость гидролиза ^сукцинил-А1а-А1а-Рго-РЬе-п-нитроанилида под действием химотрипсина.

Химотрипсин гидролизует только транс-форму пептида, при этом гидролиз цис-формы, концентрация которой максимально повышается при использовании стока, растворенного в трифторэтаноле, содержащем 470 мМ ЬЮ, лимитирован скоростью цис-транс-изомеризации. СурА или Ό уравновешивали в течение 1 ч при 5°С с выбранным тестируемым продуктом, используя диапазон концентраций лекарственного соединения от 0,1 до 20 нМ. Реакцию инициировали добавлением пептида и изменение оптического поглощения отслеживали спектрофотометрически со скоростью 10 точек данных в секунду. Холо- 36 023907 стые скорости гидролиза (в отсутствие СурА или Ό) вычитали из скоростей в присутствии СурА или Ό. Начальные скорости ферментативной реакции анализировали с помощью регрессионного анализа первого порядка динамики изменения оптического поглощения.

Примеры

Пример 1. Конструирование мутанта 5>1гер1отусе8 8р. А92-308110 (Э8М995д) с делецией 8£аА.

1.1 Конструирование конструкции с делецией 8£аА.

Фрагмент ЕсоКУ-Зик космиды ТЬ3006 (8ЕЦ ГО NΟ: 3) длиной ~7 тпн, охватывающий 8£аА (нуклеотидное положение М396-21362, регистрационный номер последовательности в NСΒI Р1809786), вырезали при расщеплении ЕсоКУ и δΐπ! и полученный выделенный фрагмент лигировали непосредственно в рКС1139, который предварительно расщепляли ЕсоКУ и обрабатывали щелочной фосфатазой креветки (Коске). Эту плазмиду обозначили рδΟК268.

Делецию в рамке считывания гена 8£аА, содержащегося в этом клоне, выполняли при использовании набора рекомбинации Кек/ЕТ (гесотЫпакоп кк), поставляемого Оепе Вккде8 (номер по каталогу К006).

(5Е<2 Ю N0. 1) 3£аА17161£ 5'СССТСТОТееСаССТеаТТТССААОССОСТСаСССАСССССАССОССАСАТОСАТААТ

ТААСССТСАСТАААССОСС-З ¹ (8Е0 ГО N0. 2) 3£аА17825г 5'ТССАТСТАТССТСССАССАСССССАОААТТСАССТСССАСОТССТССАОАТССАТТАА

ТАСОАСТСАСТАТАОООСТС-З’

Два олигонуклеотида, δί^Π^Η и δΠιΛ17825Γ. использовали для амплификации неомицинового маркера с ДНК-матрицы РКТ-РОК-дЬ2-пео-РКТ, поставляемой в наборе, при использовании ДНКполимеразы КОЭ. Полученный амплифицированный продукт длиной ~1,7 тпн выделяли с помощью гель-электрофореза и очищали из геля с использованием смолы Ц1аЕХ.

Плазмидой рδОК268 трансформировали Е. сок ЭН10В, используя стандартные методы, и селекцию вели на чашках, содержащих апрамицин (50 мкг/мл). Введение конструкции с делецией проводили, по существу, согласно методике в наборе Оепе Вккде8. Одиночную колонию выращивали в течение ночи в 2ТУ с апрамицином (50 мкг/мл) и трансформировали плазмидой рКекЕТ(!е!) с селекцией на апрамицине (50 мкг/мл) и тетрациклине (3 мкг/мл) при 30°С. Одну колонию использовали для получения ночной культуры данного штамма в 3 мл 2ТУ с апрамицином (50 мкг/мл) и тетрациклином (3 мкг/мл) при 30°С. 0,5 мл данной культуры использовали для инокуляции 10 мл 2ТУ с апрамицином (50 мкг/мл) и тетрациклином (3 мкг/мл) при 30°С и выращивали культуру до ОЭ_600нм ~0,5. По 1,д мл этой культуры переносили в каждую из 2 пробирок еррепкогТ и 50 мкл 10% арабинозы добавляли в одну пробирку, чтобы вызвать экспрессию белков Кек/ЕТ рекомбинации. Пробирки встряхивали в течение ~1 ч при 37°С. Индуцированные и неиндуцированные клетки осаждали в настольной центрифуге и дважды промывали охлажденной стерильной водой, каждый раз ресуспендируя и центрифугируя клетки. Полученные осадки суспендировали приблизительно в 30-д0 мкл воды и помещали в лед. Прерванный фрагмент длиной 1,7 тпн, выделенный ранее, добавляли в индуцированные и неиндуцированные пробирки и переносили на льду в 1 мм кюветы для электропорации Вюгак. Образцы электропорировали (Вюгак МюгориЦег при 1,8 кВ, конечное время затухания импульса ~д мс), добавляли 1 мл 2ТУ (без антибиотиков) и перемешивали, чтобы удалить клетки из кюветы. Клетки инкубировали в течение ~3 ч при 37°С с встряхиванием (1100 об/мин, компактный термошейкер ЕррепкогТ Ткегтот1хег) перед посевом на чашки 2ТУ, содержащие апрамицин (50 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С. Колонии с чашек с индуцированными образцами сеяли на чашки 2ТУ, содержащие 50 мкг/мл канамицина для очистки и подтверждения введения кассеты устойчивости к канамицину. ПЦР на индивидуальных бактериальных колониях использовали для подтверждения введения кассеты. Плазмиды выделяли из этих культур и расщепляли, чтобы подтвердить ожидаемую плазмиду рδОК270. Затем плазмиды расщепляли №П для удаления маркерного фрагмента, а остальную часть снова лигировали с получением конструкции рδОК271 с делецией 8£аА в рамке считывания.

1.2 Конъюгирование δкерΐотусе8 8р. А92-308110 (^δΜ995Д) и введение делеции 8£аА.

Плазмидой рδОК271 трансформировали Е. сок ЕТ12567 рГО8002 с использованием стандартных методов и отбирали клоны на 2ТУ чашках, содержащих апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл). Полученный штамм инокулировали в 3 мл жидкой 2ΊΎ, содержащей апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С, 250 об/мин. 0,8 мл этой культуры использовали для инокуляции 10 мл жидкой 2ТУ, содержащей апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл), в пробирке Ра1соп объемом 50 мл и инкубировали при 37°С и 250 об/мин до ОЭ_600НМ ~0,5. Полученную культуру центрифугировали при 3500 об/мин в течение 10 мин при д°С, дважды промывали в 10 мл среды 2ТУ, используя центрифугирование для осаждения клеток после каждой промывки. Полученный осадок ресуспендировали в 0,5 мл 2ТУ и хранили на льду перед использованием. Этот процесс рассчитывали по времени так,

- 37 023907 чтобы он совпал с полной готовностью спор δ!^ер!οтусек, описанных ниже.

Споры δ!^ер!οтусек кр. А92-308110 (ΌδΜ9954) (Вю!-4370) собирали с 1-2-недельной конфлюентной чашки, ресуспендируя их в ~3 мл 20% глицерина. Споры центрифугировали (5000 об/мин, 10 мин при комнатной температуре) и дважды промывали 50 мМ буфером ΤΕδ перед ресуспендированием в 1 мл 50 мМ буфера ΤΕδ и разделением в 2 пробирки еррепбогГ. Эти пробирки подвергали тепловому шоку при 50°С в течение 10 мин в водяной бане перед добавлением 0,5 мл 2ΤΥ и инкубированием в компактном термошейкере ЕррепбогГ Тйегтот1хег при 37°С в течение 4-5 ч.

Готовые Е. сой ЕТ12567 рГО8002 рδОК271 и Вю!-4370 смешивали в отношении 1:1 (по 250 мкл каждого штамма) и 1:3 (100 мкл Е. сой) и сразу сеяли на чашки К6 и переносили в инкубатор на 37°С. После инкубирования в течение приблизительно 2 ч на эти чашки наносили 2 мл стерильной воды, содержащей налидиксовую кислоту, чтобы получить конечную концентрацию в чашке 25 мкг/л. Чашки возвращали в инкубатор на 37°С на ночь перед нанесением 2 мл стерильной воды, содержащей апрамицин, чтобы получить конечную концентрацию в чашке 20-25 мкг/л. Эксконъюгантные колонии, появившиеся через ~4-7 дней, переносили мазками на среду КР4, содержащую апрамицин (25 мкг/л) и налидиксовую кислоту (25 мкг/л), и инкубировали при 37°С. Как только начинал наблюдаться достаточный рост мицелия, штаммы переносили мазками на среду КР4, содержащую апрамицин (25 мкг/л), при 37°С и позволяли спорулировать. Затем штаммы три раза пересевали (чтобы ускорить удаление термочувствительной плазмиды), переносили на КР4 (без антибиотика) и инкубировали при 37°С в течение 3-4 дней. Наконец штаммы переносили на КР4 и инкубировали при 28°С, чтобы позволить полное образование спор (5-7 дней). Споры собирали и последовательно разводили на чашках КР4 при 28°С, чтобы отобрать одиночных колоний. Спорулировавшие одиночные колонии дважды переносили на чашки КР4 с или без апрамицина (25 мкг/л) для подтверждения потери плазмиды и оставляли для подращивания на ~7 дней до анализа на продукцию санглиферинов.

1.3. Скрининг штаммов на продукцию санглиферинов в пробирках Ра1соп.

Один ~7 мм агаровый столбик хорошо спорулирующего штамма использовали для инокуляции 7 мл стерильной среды δΜ25-3 и инкубировали при 27°С и 200 об/мин в шейкере с подбросом на 5 см. Через 48 ч роста 0,7 мл данной культуры переносили в стерилизованные пробирки Ра1соп, содержащие 7 мл среды δОΡ2 с 5% смолы НР20. Культуры выращивали при 24°С и 300 об/мин в шейкере инкубаторе с подбросом на 2,5 см в течение 5 дней перед сбором. Аликвоты 0,8 мл бактериальной культуры отбирали и переносили в 2 мл пробирку еррепбогГ, обеспечивая надлежащее распределение смолы по всему объему культуры перед отбором аликвоты. Добавляли 0,8 мл ацетонитрила и 15 мкл муравьиной кислоты и перемешивали содержимое пробирки в течение приблизительно 30 мин. Смесь осветляли центрифугированием и отбирали 170 мкл экстракта в ВЭЖХ флакон, анализировали с помощью ВЭЖХ.

1.4. Анализ штаммов на реверсию в дикий тип или кГаА фенотип.

Экстракты штаммов анализировали с помощью ВЭЖХ. Штаммы, которые продуцировали санглиферин А и В, не анализировали далее, поскольку они возвратились к дикому типу. Штаммы, не продуцирующие санглиферин А и В, показали низкие уровни (~1-2 мг/л) пикового времени удержания 6,5 мин, что отражает присутствие санглиферинподобного хромофора. Анализ ЖХМС показал, что этот пик имел значение т/ζ 1073, -16 единиц от ожидаемого т/ζ санглиферина. Предположили, что данный пик был обусловлен включением фенилаланина в отсутствие метагидрокситирозина.

Восемь штаммов, показывающих потерю продукции санглиферинов, впоследствии повторно выращивали, чтобы оценить, может ли потенциальная кГаА мутация быть дополнена химически, обеспечивая мутасинтетический процесс получения новых санглиферинов. Штаммы выращивали в посевной среде δΜ25-3 в течение 48 ч перед переносом в продукционную среду δОΡ2 с 5% смолы. После еще 24 ч роста штаммов в среду в трех повторах вводили 2 мМ Эй метагидрокситирозин (добавка 100 мкл 0,16М раствора в 1М НС1) или 2 мМ Ь-фенилаланин, при этом штамм без таких добавок использовали в качестве контроля. Штаммы также подпитывали пипеколиновой кислотой (2 мМ) в метаноле для повышения выходов продукта. Штаммы собирали после роста еще в течение 4 дней, экстрагировали и анализировали с помощью ВЭЖХ. Было показано, что метагидрокситирозин полностью соответствует кГаА мутации, при этом добавление Ь-фенилаланина повышало уровни -16 аем соединения. Штамм Вю!-4585 выбирали для дальнейшего исследования в качестве мутанта с делецией кГаА.

Пример 2. Другие способы создания конструкции с делецией кГаА.

Другие способы могут применяться для создания мутантов с делецией кГаА. Примеры включают мутанты с инактивацией кГаА в результате вставки (такие как пример 12 из νΟ 2010/034243). Данный штамм создавали, как описано в \νθ 2010/034243, и присвоили обозначение штамма ВЮТ-4452.

В альтернативной методике для введения делеции кГаА два олигонуклеотида

1520ЭР 5'-САОАСААТТСОСОСТАСООСОССОАСОАСААССТОТС-З' (ЗЕ<2 Ιϋ

ΝΟ. 4) и 17219К 5’-ССССАТССАТСТОССССТСССОСТССОССАОССОСТТОО-З¹ (8Б<2 Ю ΝΟ. 5) использовали для амплификации расположенной против хода транскрипции области гомологии, используя космиду ТЬ3006 (ЪЕЭ ГО ΝΟ. 3) в качестве матрицы и ДНК-полимеразу КОЭ. Амплифицированный

- 38 023907 продукт обрабатывали полинуклеотидкиназой Т4 (ΝΕΒ) и клонировали в рИС18, дефосфорилированный при обработке щелочной фосфатазой креветки (КосНе). Полученную конструкцию проверяли рестрикционным анализом и тщательно секвенировали, чтобы убедиться в получении нужной последовательности и в том, что в процессе амплификации полимеразой не были введены ошибки. Эту конструкцию расщепляли по ЕсоК1 и ΝδίΙ и анализировали продукты с помощью гель-электрофореза. Полосу, содержащую нужную последовательность (т.е. левую ~2 тпн область гомологии), вырезали из геля, и очищали с использованием стандартных методик (смола ΟίαΕΧ). Вторую пару олигонуклеотидов

17766Р 5'-ССТСАТССАТСТССАССАССТСССАССТСААТТСТСССССЗ-3' (5Е0

ΙΌ N0, 6) И 19763К. 5¹-ОСССААССТТСТССТООСТеАОСТТСААСАТСС-З' (ЗЕС И) НО. 7) использовали для амплификации расположенной по ходу транскрипции области гомологии, используя космиду ТЬ3006 (8ЕЦ ГО N0. 3) в качестве матрицы и ДНК-полимераза ΚΘΌ. Амплифицированный продукт обрабатывали полинуклеотидкиназой Т4 (ΝΕΒ) и клонировали в рИС18, дефосфорилированный при обработке щелочной фосфатазой креветки (КосНе). Полученную конструкцию проверяли рестрикционным анализом и тщательно секвенировали, чтобы убедиться в получении нужной последовательности и в том, что в процессе амплификации полимеразой не были введены ошибки. Эту конструкцию расщепляли по ΗίηάΙΙΙ и ΝδίΙ и анализировали продукты с помощью гель-электрофореза. Полосу, содержащую нужную последовательность (т.е. правую ~2 тпн область гомологии), вырезали из геля, и очищали с использованием стандартных методик (смола ΟίαΕΧ). Вектор рКС1139 расщепляли по ЕсоШ и ΗίηάΙΙΙ и большой фрагмент вектора выделяли с помощью гель-электрофореза и очищали стандартными методами (смола ΟίαΕΧ). Выделенные левый и правый фрагменты гомологии затем клонировали в указанный фрагмент рКС1139 в тройном лигировании, получив требуемую конструкцию с делецией 8ГаА.

В другой альтернативной методике создания конструкции с делецией 8ГаА использовали коммерческий синтез гена (т.е. Сеп8спр1 или другого поставщика) для получения конструкции, содержащей требуемую последовательность (8ЕЦ ГО N0.8). Данную приобретенную конструкцию расщепляли, используя ВатШ и ХЬак чтобы вырезать целевую последовательность, и анализировали продукты с помощью гель-электрофореза. Полосу, содержащую нужную последовательность (~4 тпн), вырезали из геля и очищали с использованием стандартных методов. Вектор рКС1139 расщепляли по ВатШ и ХЬ;й и большой фрагмент выделяли с помощью гель-электрофореза и очищали стандартными методами. Два выделенных фрагмента затем лигировали с получением требуемой конструкции с делецией ГаА.

Указанные альтернативные конструкции с делецией ГаА вводили в 81герЮтусе8 8р. А92-308110 (Ό8Μ9954) путем конъюгирования и отбора вторичного кросса, используя методы, описанные в примере 1.2. Выращивание и анализ штаммов, сконструированных таким образом, также проводили согласно способам, описанным в примере 1.2.

Пример 3. Множественная подпитка мутанта с делецией 8ГаА.

Стоки спор мутанта с прерыванием 8ГаА (ΒΙ0Τ-4452 или ΒΙ0Τ-4585) приготавливали после роста на среде МАМ, Ι8Ρ4, Ι8Ρ3 или Ι8Ρ2, сохраняли в 20% мас./об. глицерине в дистиллированной воде и хранили при -80°С. Вегетативные культуры (посевные культуры) приготавливали путем инокуляции стока спор (1% об./об.) в 7 мл посевной среды (среда 8Μ25) в центрифужных пробирках объемом 50 мл с поропластовыми пробками. Пробирки с культурой инкубировали при 27°С, 250 об/мин (подброс на 5 см) в течение 48 ч. Из посевной культуры 10% (об./об.) переносили в 7 мл продукционной среды 8ΟΡ-2 в центрифужных пробирках объемом 50 мл с поропластовыми пробками. Культивирование проводили при 24°С и 300 об/мин (подброс на 2,5 см). Для производства мутасинтетических аналогов санглиферинов, 0,05 мл 0,32М раствора (в 1Н НС1) вносимого в среду соединения (мутасинтона) добавляли в каждую пробирку через 24 ч после инокуляции до конечной концентрации 2 мМ. Дополнительно в каждую пробирку добавляли 0,05 мл 0,32М раствора пиперазиновой кислоты (в метаноле) в 24 ч с получением конечной концентрации 2 мМ. Культивирование продолжали в течение дополнительных четырех дней.

Образцы экстрагировали, перенося 0,8 мл цельной среды культивирования в пробирку еррепйогГ объемом 2 мл с крышкой. Добавляли 0,8 мл ацетонитрила и 0,015 мл муравьиной кислоты. Затем смесь встряхивали в течение 30 мин на встряхивателе УШгах. После этого пробирку центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин и отбирали 0,15 мл супернатанта для анализа. Экстракты анализировали, как описано в общих методах.

В табл. 1 показаны мутасинтоны, которые вводили в среду, таким образом, а также ЖХМС Н+ и №+ аддукты, ожидаемая молекулярная масса и время удержания наблюдаемых мутасинтетических продуктов санглиферинов. Показаны основные пики, относящиеся к аналогам санглиферинов. Во всех случаях пики ЖХМС также наблюдали для аналогов санглиферина В (Масса -18).

- 39 023907

Таблица 1

Введенный мутасинтон	Название мутзсинтсна	[М-Н] наблюл. (ιϊι/ζ)	[М+Иа]* наблюл. (γπ/ζ)	Мол. масса (аем)	Время удержания (минуты)
	2-амино-3-(4-фтор-З- гидроксифенил}пропановая кислота	1106,4	1130,4	1107,4	5,5
и нн, Р	2-амино-3 -(3-фтор-5 - гидроксифенил)пропановая кислота	1106,4	1130,4	1107,4	5,7

р	метил 2-амино-З-(З-фтор-5- гидроксифенил)пропионат	1106,4	1130,4	1107,4	5,7
	метил (£)-2-амино-З-(3- гидрокси-4 - метилфенил)пропаноат	1102,5	1126,7	1103,5	6, 0
ХПГ	2-амино- 3 - (3 - ' фторфенил)пропановая кислота	1090,4	1114,5	1091	6,1
КН,	метил-(25)-2-амино-З-(3- гидрокси(2- пиридил))пропаноат	1089,5	1113,7	1090,5	4,4
ин·	метил-2-амино-3-(2-фтор-5 - гидроксифенил)пропаноат	1106,5	1130,6	1107,5	5,5
Р	метил-2-амино-3-(2-фтор-З- гидроксифенил)пропаноат	1106,5	1130,6	1107,5	5, 1
Р НН,	метил-2-амино-3-(2,6- дифтор-3- гидроксифенил)пропаноат	1124,4	1148,5	1125,5	5,1

Пример 4. Выделение 63-фторсанглиферина А, промежуточного соединения 14.

Ферментацию проводили, как описано в общих методах, используя метил-2-амино-3-(3-фтор-5гидроксифенил)пропаноат и ИЬ-пиперазиновую кислоту в качестве предшественников, которые добавляли в 26 ч.

После сбора среды культивирования объединяли в пулы и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой, центрифугировали (3300 д) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании магнитной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали либо центрифугированием, либо позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях. Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом, и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (1,3 г).

Неочищенный экстракт (1,3 г) растворяли в этилацетате (2 мл) и наносили на колонку с силикагелем (10x2 см), уравновешенную этилацетатом (500 мл). Колонку элюировали этилацетатом и затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (278 мг) растворяли в метаноле (1,8 мл) и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку ^а!сгк Х!сгга М8С18 (10 мкм, 19 см х 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В ацетонитрилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (20 мг).

Пример 5. Выделение 62, 63-фторсанглиферина А, промежуточного соединения 15.

Ферментацию проводили, как описано в общих методах, используя метил-(8)-2-амино-3-(3,4дифтор-5-гидроксифенил)пропаноат и ИЬ-пиперазиновую кислоту в качестве предшественников, кото- 40 023907 рые добавляли в 26 ч.

После сбора среды культивирования объединяли и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой и центрифугировали (3300 д) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании магнитной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали либо центрифугированием, либо позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях. Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (1,6 г).

Неочищенный экстракт (1,6 г) растворяли в 2 мл этилацетата и наносили на колонку с силикагелем (10x2 см), уравновешенную этилацетатом (500 мл). Колонку элюировали этилацетатом и затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (188 мг) растворяли в 1,8 мл метанола и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Vаΐе^к Х1егга ΜδΟ8 (10 мкм, 19 см х 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонитрилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (15 мг).

Пример 6. Выделение 62-фторсанглиферина А, промежуточного соединения 16.

В качестве предшественников использовали метил-^)-2-амино-3-(4-фтор-3-гидроксифенил)пропаноат и ОЬ-пиперазиновую кислоту. Работали в соответствии с общим методом за исключением того, что предшественники добавляли в 27 ч.

После сбора среды культивирования объединяли и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой и центрифугировали (3300 д) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании магнитной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали либо центрифугированием, либо позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях.

Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный маслообразный материал (4,2 г).

Неочищенный экстракт (4,2 г) растворяли в 4 мл этилацетата и наносили на колонку с силикагелем (15x2 см), уравновешенную 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом и затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (390 мг) растворяли в 2,4 мл метанола и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Х1егга ΜδΟ8 (10 мкм, 19 см х 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонитрилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (38 мг).

Пример 7. Выделение 62-метилсанглиферина А, промежуточного соединения 17.

Криоконсервированные стоки спор ΒΙΟΤ-4585 размораживали при комнатной температуре. Вегетативные культуры (посевные культуры) приготавливали, перенося 0,4 мл стока спор в 400 мл среды δΜ25 в 2 л колбах Эрленмейера с поропластовой пробкой. Культивирование проводили в течение 48 ч при 27°С и 250 об/мин (подброс на 2,5 см). Из посевной культуры 20 мл переносили в 400 мл продукционной среды δΟΡ2+5%ΉΡ20 в 2 л колбах Эрленмейера с поропластовой пробкой. После культивирования в течение 24 ч при 24°С и 250 об/мин (подброс на 2,5 см) в каждую продукционную колбу добавляли 2 мл 200 мМ раствора метил-^)-2-амино-3-(3-гидрокси-4-метилфенил)пропаноата в 1М соляной кислоте и 2 мл 400 мМ метанольного раствора ОЬ-пиперазиновой кислоты, получив конечную концентрацию 1 мМ индивидуальных энантиомеров предшественников. Культивирование было продолжено в течение еще четырех дней при 24°С и 250 об/мин (с подбросом на 2,5 см).

Среды культивирования объединяли в пулы и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой и центрифугировали (3300 г) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целе- 41 023907 вого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании верхнеприводной лопастной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали, позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях. Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (7,6 г).

Неочищенный экстракт (7,6 г) растворяли в 5 мл этилацетата и наносили на колонку с силикагелем (15х2 см), уравновешенную 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом и затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (319 мг) растворяли в 2,4 мл метанола и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Аа!ег8 Х1егга М8С18 (10 мкм, 19 см х 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонитрилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлением, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (14,9 мг).

Пример 8. Выделение 61-дегидроксисанглиферина А, промежуточного соединения 18.

Криоконсервированные стоки спор В1ОТ-4585 размораживали при комнатной температуре. Вегетативные культуры (посевные культуры) приготавливали, перенося 0,4 мл стока спор в 400 мл среды 8М25 в 2 л колбах Эрленмейера с поропластовой пробкой. Культивирование проводили в течение 48 часов при 27°С и 250 об/мин (подброс на 2,5 см). Из посевной культуры 500 мл переносили в 4,5 л продукционной среды 8СР2+5%НР20 в 7 л ферментере АррНкоп и выращивали при 24°С, 400 об/мин (каскадный контроль перемешивания), с потоком воздуха 2,5 л/мин и 30% ИОТ (каскадный контроль давления растворенного кислорода (ИОТ)). После культивирования в течение 24 ч 7,5 мл 667 мМ раствора (8)-2-амино-3фенилпропановой кислоты в 1М соляной кислоте добавляли в ферментер до конечной концентрации предшественника 1 мМ. Культивирование продолжали в течение еще четырех дней при 24°С, 400 об/мин (каскадный контроль перемешивания), с потоком воздуха 2,5 л/мин и 30% ИОТ (каскадный контроль ИОТ).

Среды культивирования объединяли в пулы и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой и центрифугировали (3300 г) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании верхнеприводной лопастной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали, позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях, но второй экстракт собирали центрифугированием. Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (55 г).

Неочищенный экстракт (55 г) суспендировали в 80% метаноле в воде и дважды экстрагировали 300 мл гексана. Целевое соединение было обнаружено в метанольно-водной части, и ее выпаривали досуха. Полученный высушенный экстракт (48 г) растворяли в 30 мл этилацетата и наносили на колонку с силикагелем (20х 5 см), уравновешенную 1 л этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом и затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (813 мг) растворяли в метаноле и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Аа1егз Х1егга М8С18 (10 мкм, 19 см х 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонитрилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (34 мг).

Пример 9. Выделение, 58-дез(3-гидроксифенил)-58-(3-гидрокси-(2-пиридил)санглиферина А, промежуточного соединения 19.

В качестве предшественников использовали метил-(28)-2-амино-3-(3-гидрокси-(2-пиридил))пропаноат и ИЬ-пиперазиновую кислоту. Работали в соответствии с общим методом за исключением того, что подброс в инкубаторе в течение вегетативного (посевного) культивирования составлял 2,5 см.

Среды культивирования объединяли в пулы и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой, центрифугировали (3300 г) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целе- 42 023907 вого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании верхнеприводной лопастной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали, позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях. Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (7 г).

Неочищенный экстракт (7 г) растворяли в 4 мл этилацетата и наносили на колонку с силикагелем (15x2 см), уравновешенную 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом, а затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате до 100% ацетона, затем в ступенчатом градиенте от 1% метанола до 5% метанола в ацетоне). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (204 мг) растворяли в метаноле и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку \Уа1ег5 Х1егга М8С18 (10 мкм, 19 см х 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонитрилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (4 мг).

Пример 10. Выделение 61-дегидрокси-61-фторсанглиферина А, промежуточного соединения 20.

Криоконсервированные стоки спор ΒΙΟΤ-4585 размораживали при комнатной температуре. Вегетативные культуры (посевные культуры) приготавливали, перенося 0,4 мл стока спор в 400 мл среды 8М25 в 2 л колбах Эрленмейера с поропластовой пробкой. Культивирование проводили в течение 48 ч при 27°С и 250 об/мин (с подбросом на 2,5 см). Из посевной культуры 20 мл переносили в 400 мл продукционной среды 8СР2+5%НР20 в 2 л колбах Эрленмейера с поропластозой пробкой. После культивирования в течение 24 ч при 24°С и 250 об/мин (подброс на 2,5 см) в каждую продукционную колбу добавляли 2 мл 400 мМ раствора 2-амино-3-(3-фторфенил)пропановой кислоты в 1М соляной кислоте и 2 мл 400 мМ метанольного раствора ОЬ-пиперазиновой кислоты, получив конечную концентрацию 1 мМ индивидуальных энантиомеров-предшественников. Культивирование продолжали в течение еще четырех дней при 24°С и 250 об/мин (с подбросом на 2,5 см).

Среды культивирования объединяли в пулы и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой, центрифугировали (3300 г) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании верхнеприводной лопастной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали, позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях. Третий экстракт получали центрифугированием остатков смеси клеток и смолы. Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (10,5 г).

Неочищенный экстракт (10,5 г) растворяли в 7 мл этилацетата и наносили на колонку с силикагелем (15x2 см), уравновешенную 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом, а затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате).

Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (342 мг) растворяли в метаноле и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку \Уа1ег5 Х1егга М8С18 (10 мкм, 19 см х 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонитрилом. Колонку элюировали изократически при 53% В в течение 30 мин после введения. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (6 мг).

Пример 11. Синтез диэтил-(2-(1,2-оксазинан-2-ил)-2-оксоэтил)фосфоната

21-1 21-2 21 К раствору 21-1 (СНетСо11ес1, Сегтапу) (100 мг, 0,81 ммоль), Εΐ₃Ν (246 мг, 2,43 ммоль) в сухом

ДХМ (5 мл) по каплям добавляли хлорацетилхлорид (138 мг, 1,22 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, вливали в воду со льдом и экстрагировали этилацета- 43 023907 том. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, и сушили над №₂8О₄, фильтровали, выпаривали в вакууме. Остаток (21-2) использовали в следующей стадии без дополнительной очистки (123 мг, выход 90%).

Смесь 21-2 (123 мг, 0,75 ммоль) и триэтилфосфита (250 мг, 1,50 ммоль) перемешивали при 140°С в течение 6 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и очищали с помощью флешхроматографии, получив 21.

Альтернативный способ синтеза диэтил-(2-(1,2-оксазинан-2-ил)-2-оксоэтил)фосфоната, 21

Общая методика получения 21а-2

К раствору Т-ВиОК (84,0 г, 0,75 моль) в тетрагидрофуране (2,0 л) порциями добавляли 21а-1 (50,0 г, 0,38 моль) при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. По каплям при комнатной температуре добавляли 1,4-дибромбутан (81,2 г, 0,38 моль). Затем смесь перемешивали при 80°С в течение 16 ч. После охлаждения добавляли воду (2000 мл), смесь экстрагировали этилацетатом (2x1000 мл). Объединенный органический слой сушили над безводным №₂8О₄ в течение 16 ч, остаток после фильтрации и концентрирования очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: петролейный эфир:этилацетат =100:1-10:1), получив 21а-2 (57 г) в виде бесцветного масла.

Общая методика получения 21а-3

К раствору 21а-2 (55 г, 0,29 моль) в метил-трет-бутиловом эфире (ТВМЕ, 80 мл) при комнатной температуре добавляли раствор 4Н НС1 (600 мл, в ТВМЕ), смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и промывали ТВМЕ (50 мл) с получением 21а-3 (30 г) в виде белого твердого вещества.

Общая методика получения 21

К перемешиваемому раствору 21а-4 (35 г, 0,18 моль), гидроксибензотриазола (НОВТ) (29 г, 0,21 моль) и Ε!₃Ν (71 мл, 0,51 моль) в безводном дихлорметане (550 мл) порциями добавляли 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимид (ЕЮС!) (41 г, 0,21 моль) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 0,5 ч, затем при 0°С добавляли 21а-3 (24 г, 0,20 моль) и перемешивали в течение 16 ч. После этого ТСХ (петролейный эфир/этилацетат 3/1) показала, что реакция прошла полностью. Тогда реакционную смесь медленно вливали в воду (500 мл) при энергичном перемешивании. Смесь экстрагировали дихлорметаном (2x200 мл). Объединенный органический слой промывали насыщенным солевым раствором (2x100 мл), сушили №₂8О₄, фильтровали и выпаривали, получив неочищенный продукт. После хроматографии (петролейный эфир/этилацетат, 100:1 - 10:1) получили 21 (38 г) в виде желтого масла.

Пример 12. Синтез диэтил-(2-оксо-2-(пиридин-2-иламино)этил)фосфоната

К раствору 22-1 (1 г, 10,6 ммоль), Ε!₃Ν (1,075 г, 10,6 ммоль) в сухом метиленхлориде (50 мл) по каплям добавляли хлорацетилхлорид (1,2 г, 10,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной

- 44 023907 температуре в течение 3 ч, вливали в воду со льдом и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над №₂8О₄, фильтровали и выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью системы СотЬШакЬ с обращенными фазами, получив 22-2.

Смесь 22-2 (170 мг, 1,00 ммоль) и триэтилфосфита (332 мг, 2,00 ммоль) перемешивали при 140°С в течение б ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и очищали с помощью флешхроматографии, получив 22.

К перемешиваемому раствору 14 (430 мг, 0,38 ммоль), (ΌΗΟ)₂ΡΗΛΚ (18,б мг, 0,024 ммоль), тетраоксида осмия (0,15б мл, 0,012 ммоль) в трет-бутиловом спирте (2,5 мас.%, 0,079 ммоль/мл) и метансульфонамида (74 мг, 0,77 ммоль) в 20 мл трет-бутилового спирта при комнатной температуре добавляли раствор феррицианида калия (382 мг, 1,1б ммоль) и карбоната калия (1б0 мг, 1,1б ммоль) в 20 мл воды, получив коричневую эмульсию. Через 2 ч добавляли раствор сульфита натрия и перемешивание продолжали еще 20 мин. Полученную смесь экстрагировали этилацетатом (3x50 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, упаривали при пониженном давлении и очищали с помощью обращенно-фазовой флешхроматографии, получив 23-2 в виде белого твердого вещества.

К перемешиваемому раствору 23-2 (240 мг, 0,21 ммоль) в 24 мл смеси 2:1 ТГФ и воды добавляли периодат натрия (91 мг, 0,42 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и затем добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия. Эту смесь экстрагировали тремя порциями этилацетата. Объединенные органические слои промывали одной частью воды и двумя частями насыщенного солевого раствора, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью обращенно-фазовой флешхроматографии, получив 23-3.

К раствору диэтил-(2-(метокси(метил)амино)-2-оксоэтил)фосфоната (91 мг, 0,3б8 ммоль) в ТГФ (5,0 мл) добавляли ΝαΗ (2,8 мг, 0,1104 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 23-3 (70 мг, 0,092 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x30 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над №₂8О₄, фильтровали и упаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 23 в виде белого твердого вещества.

К раствору 21 (42 мг, 0,1б8 ммоль) в ТГФ (2,0 мл) добавляли ΝαΗ (1,2 мг, 0,05 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 23-3 (30 мг, 0,042 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали

- 45 023907 смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над №₂8О₄, фильтровали и упаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 24 в виде белого твердого вещества.

Пример 15. Получение соединения 25

К раствору 22 (48 мг, 0,168 ммоль) в ТГФ (2,0 мл) добавляли NаΗ (1,2 мг, 0,05 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 23-3 (30 мг, 0,042 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над №₂8О₄, фильтровали и упаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 25 в виде белого твердого вещества.

Пример 16. Получение соединения 26

К раствору 23 (13 мг, 0,015 ммоль), растворенного в диоксане (1 мл), добавляли водный раствор НС1 (2М, 0,080 мл, 0,16 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 20°С в течение 24 ч и останавливали реакцию, вливая воду, после чего смесь экстрагировали этилацетатом (3x10 мл). Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и выпаривали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 26 в виде белого твердого вещества.

Пример 17. Получение соединения 27

К перемешиваемому раствору 17 (99 мг, 0,09 ммоль), (ΌΗΟ)₂ΡΗΑΡ (4,2 мг, 0,0054 ммоль), тетраоксида осмия (0,034 мл, 0,0027 ммоль) в трет-бутиловом спирте (2,5 мас.%, 0,079 ммоль/мл) и метансульфонамида (18 мг, 0,18 ммоль) в 5 мл трет-бутилового спирта при комнатной температуре добавляли раствор феррицианида калия (90 мг, 0,27 ммоль) и карбоната калия (37 мг, 0,27 ммоль) в 5 мл воды, получив коричневую эмульсию. Через 2 ч добавляли раствор сульфита натрия и перемешивание продолжали еще 20 мин. Полученную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, выпаривали при пониженном давлении и очищали с помощью обращенно-фазовой флешхроматографией, получив 27-2 в виде белого твердого вещества.

- 46 023907

К перемешиваемому раствору 27-2 (40 мг, 0,035 ммоль) в 3 мл смеси 2:1 ТГФ и воды добавляли периодат натрия (15 мг, 0,07 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и затем добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия. Эту смесь экстрагировали тремя порциями этилацетата. Объединенные органические слои промывали одной частью воды и двумя частями насыщенного солевого раствора, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью обращенно-фазовой флешхроматографии, получив 27-3 в виде белого твердого вещества.

К раствору 21 (28 мг, 0,104 ммоль) в ТГФ (2,0 мл) добавляли ИаН (0,75 мг, 0,0312 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 27-3 (19,6 мг, 0,026 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3 х 10 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над Иа₂8О₄, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 27 в виде белого твердого вещества.

К перемешиваемому раствору 15 (349 мг, 0,31 ммоль), (ПНЦ)₂РНАЬ (14 мг, 0,0186 ммоль), тетраоксида осмия (0,117 мл, 0,0093 ммоль) в трет-бутиловом спирте (2,5 мас.%, 0,079 ммоль/мл) и метансульфонамида (59 мг, 0,62 ммоль) в 15 мл трет-бутилового спирта при комнатной температуре добавляли раствор феррицианида калия (128 мг, 0,93 ммоль) и карбоната калия (306 мг, 0,93 ммоль) в 15 мл воды, получив коричневую эмульсию. Через 2 ч добавляли раствор сульфита натрия и перемешивание продолжали еще 20 мин. Полученную смесь экстрагировали этилацетатом (3х50 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, выпаривали при пониженном давлении и очищали с помощью обращенно-фазовой флешхроматографии, получив 28-2 в виде белого твердого вещества.

К перемешиваемому раствору 28-2 (170 мг, 0,1466 ммоль) в 15 мл смеси 2:1 ТГФ и воды добавляли периодат натрия (62 мг, 0,2931 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и затем добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия. Эту смесь экстрагировали тремя порциями этилацетата. Объединенные органические слои промывали одной частью воды и двумя частями насыщенного солевого раствора, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью обращенно-фазовой флешхроматографии, получив 28-3 в виде белого твердого вещества.

К раствору 21 (41 мг, 0,155 ммоль) в ТГФ (1,0 мл) добавляли ИаН (2,3 мг, 0,0575 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 28-3 (30 мг, 0,0387 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3х20 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над Иа₂8О₄, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 28 в виде белого твердого вещества.

- 47 023907

К раствору 22 (42 мг, 0,155 ммоль) в ТГФ (1,0 мл) добавляли NаΗ (2,3 мг, 0,0575 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 28-3 (30 мг, 0,0387 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над №₂8О₄, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 29 в виде белого твердого вещества.

К раствору диэтил-(2-(метокси(метил)амино)-2-оксоэтил)фосфоната (37 мг, 0,155 ммоль) в ТГФ (1,0 мл) добавляли NаΗ (2,3 мг, 0,0575 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 28-3 (30 мг, 0,0387 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над №₂8О₄, фильтровали и выпаривали.

Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 30 в виде белого твердого вещества.

Пример 21. Биологические данные - ΗСV репликон и анализ.

Соединения анализировали в анализе репликонов генотипа 1Ь, используя клетки НиБ5.2, как описано в общих методах. Циклоспорин А, 1, ОЕВЮ-025, 2, санглиферин А, 5, и гидроксимакроцикл, 6, включали для сравнения.

Соединение	ЕС50 (мкМ)	СС50 (мкМ)	Индекс селективности (СС50/ЕС50)
Циклоспорин А, 1	0,62	28	52
ΏΕΒΙΟ-025, 2	0,096	11,2	ίίί
Санглиферин А, 5	0,318	9,1	28,7
Гидроксимакроцикл, 6	8,4	83,6	9,9
23	0,067	>100	>1493
24	0,033	>100	>3030
25	0,066	>100	>1515
26	0, 1	>юо	>1000
27	0,121	>100	>826

Как можно заметить, соединения изобретения 23, 24, 25, 26 и 27 значительно более активны в анализе репликонов в НиЪ5.2 (что продемонстрировано низким значением ЕС₅₀), со значительно более высокой селективностью против линии клеток (что выражается высоким индексом селективности) по сравнению с СкА, ПеЫо-025, 8£А и гидроксимакроциклом.

Пример 22. Биологические данные - активность против ВИЧ.

Соединения анализировали в противовирусном анализе против ВИЧ, используя клетки НеЬа, как описано в общих методах. Циклоспорин А, 1, ОЕВЮ-025, 2, и противовирусные средства против ВИЧ, эмтрицитабин и тенофовир, включали для сравнения.

- 48 023907

Соединение	Клетки НеЬа ЕС5о (мкМ)
Циклоспорин А, 1	5,3
ΌΕΒΙΟ-025, 2	1,5

Эмтрицитабин	0,4
Тенофовир	1,05
24	0,13

Как можно заметить, соединение изобретения 24 значительно более активно по сравнению с СТА, ОЕВЮ-025. эмтрицитабином и тенофовиром при ингибировании ВИЧ инфекции в данном анализе.

Пример 23. Биологические данные - РК Ση νίνο при пероральном и в/в введении мышам.

Для оценки фармакокинетики соединений в ίη νίνο соединения вводили внутрь в дозах 10 или 5 мг/кг и в/в в дозе 1 мг/кг группам СЭ1 мышей. Фармакокинетический анализ проводили, как описано в общих методах. Параметры РК представлены ниже.

Соединение	Уровень дозы (мг/кг)	Клиренс (л/ч/кг)	ро АиСхазс <нг*ч/мл)
Санглиферин А, 5	10	0,054	2332
23	5	0,039	2760
24	5	0,017	8223

Как можно заметить, соединения 23 и 24 имели пониженный клиренс и повышенную экспозицию при введении внутрь (что продемонстрировано высоким значением ро АИС_1а8!) по сравнению с санглиферином А.

Пример 24. Биологические данные - ингибирование РРЫзной активности СурА.

Для оценки прямого ингибирования пептидилпролил цис-транс-изомеразной (РРЕпной) активности СурА использовали метод, описанный в общих методах. Циклоспорин А, 1, ПЕВЮ-025, 2, и санглиферин А, 5, включали в качестве контролей.

Как можно заметить, соединения изобретения 23, 24, 25 и 27 ингибировали РРйпную активность СурА более эффективно, чем санглиферин А, ОЕВЮ-025 и циклоспорин А.

Пример 25. Биологические данные - ингибирование переносчиков билирубина.

Для оценки потенциала нецелевого ингибирования переносчиков билирубина, которое считается причиной дозолимитирующей гипербилирубинемии, наблюдаемой при введении ПЕВЮ-025, ίη νίίτο анализ ингибирования переносчиков проводили, как описано в общих методах.

Соединение	ОАТР1В1 1С5о (МКМ)	ОАТР1ВЗ 1С50 (мкМ)	МЕР2 1С50 (мкМ)	МЕРЗ 1С5о (мкМ)
Циклоспорин А, 1	0,85	0, 13	4,1	3,1
ЕЕВЮ-025, 2	0,45	0,19	16, 0	>50
24	4,3	1, 8	>50	>5 0

Как можно заметить, соединение изобретения 24 показывает намного меньшее ингибирование конъюгированных и неконъюгированных переносчиков билирубина по сравнению с ЭЕВЮ-025 и циклоспорином А.

Пример 26. Биологические данные - ингибирование переносчиков ксенобиотиков.

Для оценки потенциала взаимодействий между лекарственными средствами (ΌΌ!) посредством ин- 49 023907 гибирования переносчиков ксенобиотиков, ш уйго анализ ингибирования Р-гликопротеина (Р§р/МОР1) и экспортирующей помпы желчных кислот (В8ЕР) проводили, как описано в общих методах.

Соединение	Рдр 1С50 (мкМ)	ВЗЕР 1СЬО (мкМ)
Циклоспорин А, 1	0,73	0,46
БЕВ1О-025, 2	0,72	0,18
24	>50	12,3

Как можно заметить, соединение изобретения 24 демонстрирует намного меньшее ингибирование переносчиков ксенобиотиков, потенциально участвующих во взаимодействии между лекарственными средствами, по сравнению с ОЕВЮ-025 и циклоспорином А.

Ссылки.

Арре1, Ν, , Т. ЗсЬа11ег, еР а1. (2006) . Ргош зРгисРиге Ро £ипсР1оп: петм лпзлдЬРз ίηΡο ЬераРлРлз С уггиз ΕΝΑ герНсайоп.

Й Βϊοΐ СЬет 281(15): 9833-6.

ВапРеН, Е. , Й. Надпег, еР а1. (2001). ЗупРЬезаз о£ йеЫуаРтуез о£ РЬе ηονβΐ сусйорЫПп-ЫпсНпд 1ттипозирргеззапР запдНРеЬгап А мхРЬ геЬисеа питЬегз о£ ро1аг РипсРхопз. Вхоогд Меё СЬет ЬеРР 11(12): 1609-12.

СЬаРРег]1, и., М. ВоЪагйР, еР а1. (2009). ТЬе хзотегазе асРгуе злРе о£ сус1орЫ11п а 1з сг£Р1са1 £ог НСУ герИсаРхоп.

Й ΒίοΙ СЬет.

Со1дап, й,, М. Азта1, еР а1. (2000). 1зо1аР1оп, сЬагасРегагаРаоп апй рагдерей йгзгирРгоп о£ тоизе ррга: сус1орЫИп А 13 пор еззепР1а1 £ог таттаНап се11 У1аЬШРу.

<3епот1сз 68(2) : 167-78.

СгаЬЬе, К,, С. Уиадпхаих, ер а1. (2009). Ап еуа1иаР1ОП о£

РЬе сус1орЫИп хпЫЫрог БеЫо 025 апй хРз роРепР1а1 аз а РгеаРтепР £ог сЬгоплс ЬераРлРлз С.ЕхрегР Ορίη ГпуезРгд Ргидз 18(2): 211-20.

БоЫпзкЬ, К., 3. Мигг, еР а1. (1997). АН сус1орЫ11пз апй РК506 ЫпсНпд ргоРехпз аге, хпЙ1У1Йиа11у апй со11есР1Уе1у,

ЫзрепзаЫе £ог У1аЫНРу ίη ЗассЬаготусез сегеугзаае, Ргос ИаР1 АсаЙ 5С1 Ц 3 А 94(24): 13093-8.

Е. ЬаЫРг, К. К., Т. Ыдиуеп, М. Ниапд, Й. Ке, й.

РгаезРдаагй, Б. Зегга, Μ. Κοζίβΐ, Т. Еуапз (2009). За£еРу Апй АпРхугга1 Е££1сасу О£ 14 Бауз О£ ТЬе СусорЫЫп йпЫЫРог Νίπιβίΐ Ιη СотЫпаРтоп НтРЬ Реду1аРей 1пРег£егоп ,2а 1п Ее1арзей СепоРуре 1 Нсу 1п£есРей РаРхепРз, йоигпа! о£ НераРо1оду 50 (31) : 3379.

Едоггп, М. й., Т. р, ЬадаРРиРа, еР а1. (2002).

РНагтасок1пеР1сз, Ртззие ЫзРЫЪиРтоп, апй теРаЪоЫзт о£ 17- 50 023907 (й1теРку1ат1поеРку1ат1по)-17-йетеРкохуде1йапатус1п (N50 707545) ίη СО2Р1 писе апй Рхзскег 344 гаРз.''Сапсег СкетоРкег Ркагтасо! 49 (1) : 7-19.

РеЬг, Т., О. Ка11еп, еР а1. (1999) . ЗапдИ£екг1пз А, В, С апй ϋ, ηονβΐ сус1орк111п-Ыпййпд сотроипйз йзойаРей £гот ЗРгерРотусез зр. А92-308110, II, ЗРгисРиге е1ис1йаРгоп, зРегеоскетхзРгу апй ркуз1со-скетйса1 ргорегр!ез.Й АпРйЫоР (Токуо) 52(5): 474-9.

РИзгак, К,, А. НогЬап, ей а1. (2008). Тке сусЬоркШп

1пк1Ь1Рог ОеЫо-025 зкомз роРепР апЫ-кераНЫз С е££есР ίη раРъепРз ссйпРесРей мхрк кераРхРхз С апй китап 1ттипойе£1с1епсу УЙгиз. НераРоТоду 47(3): 817-26.

Ригпйзз, В. 3., Ригпйзз, Α.Ι., Уоде1, Α.Ι., ЕЙ. (1989). Уоде!¹з ТехРЬоок о£ Ргасрйса! Огдаптс СкетйзРгу, РгепРйсе На11.

байРкег, Ь. А., Вога^зкй, Апйегзоп, Ь. δ'., Ва1аЬапЙ5,

К. А. ек а1., (2010). Ми1Ргр1е сус1орк111пз ίηνοίνβά ίη йй££егепР се11и1аг раРкиауз теййаРе НСУ герИсаРаоп У1го1оду 397: 43-55.

С1ау1п.аз, Н., Кгаэсзй, Р., Сзегерез, Л., 8агкай1, В, (2004). Тке го1е о£ АВС ргапзрогРегз ίη йгид гезйзРапсе, теРаЬоНзт апй рохйсйРу.Сигг. Ргид. Ре1ЙУ. 1(1): 27-42.

Сотег, ь. , Н. Тк1Ьаи1Р, еР а1. (2007). 1пк1Ъ1Ргоп о£ т1Роскопйгйа1 регтеаЫПру РгапзгРйоп йтргоуез £ипсРйопа1 гесоуегу апй гейисез тогРаЦру £о11о^йпд асиРе туосагй1а1 йп£агсРгоп ίη т!се. Ат 8 Ркузйо! НеагР Сйгс Ркуз1о1 293(3): Н1654-61.

Соро, К,, ИаРазкй, К., Тпоие, Р., НйдйкаРа, М., ЗЫтоРокпо, К. (2009) 1йепР1£1саРйоп о£ се11и1аг апй У1га1 £асРогз ге1аРей Ро апРй-кераРйРйз С уйгиз асРЙУЙРу о£ сусйоркШп йпЫЫРог Сапсег Зсйепсе 100(10): 1943-1950,

НапоиНе, X., ВайШо А, Мйегизгезкй 8М, Уегйедет Р, Ъапйгйеи I, ВагРепзск1адег К, Ρβηίη Р, Ыррепз С (2009), НераРйРйз С уйгиз Ν35Α ргоРейп йз а зиЬзРгаРе £ог Рке РерС1йу1-Рго1у1 сйз/Ргапз йзотегазе асРЙУЙРу о£ СусйоркШпз А апй В. 8 Вιοί Скет.

Нагре!, С., Р. 1Ыкег, еР а1, (2006). Тттипозирргеззйуе

- 51 023907 асРх’ЮРу о£ РЬе 1ттгхпорЫИп-ЫпЫпд Ьгид 5апдИ£еЬг1п А ίη Ьитап «Ьо1е ЫооЬ: роРепР ίηΠίΠίΡίοη о£ 1пРег1еик1п-6 ргоЬисеЬ Ьу 1утарЬосуРез апс! топосуРез. Зсапй_^1_1тптпо1 63(1): 26-34.

Негг1ег, Μ., Н. Вапд, ер а1. (1994). С1оп1пд апс!

сЬагасРегхгаРхоп о£ ρρίΒ, а ВасШие зиЪРШз депе мМсН епсойез а сус1озрог1п Α-ΞβηΞίΡίνβ рерР1ду1-рго!у1 с1н-Ргапз гзотегазе.”Мо1 МхсгоЫо! 11(6) : 1073-83.

ΗίΡβ, М, , Тигпег, 5-, Рейегхсх, С. (2003), РагР 1: Ога1 <1е1Юегу о£ роог1у зо1иЫе Ьгидз . РЬагтасеиР1са1 Мапи£асРиг1пд апс! Раскхпд Зоигсег. Витте г 2003 хззие.

1ттеске, 3.Ν., Ваа1,, Ν, еР а1. (2011). ТЬе Сус1орЬШпВхпсИпд АдепР Запд11£еЬг1п А 1з а ОепЬгхРхс Се11 СЬетокхпе ап<3 МхдгаРхоп 1пЫЫРог. РЬОЗ опе 6(3):е18406.

1поие, К., К. Векгуата, еР а1. (2003). СотЫпеЭ

1пРег£егоп а1рЬа2Ь апс! сус1озрог1п А ίη РЬе РгеаРтепР о£ сЬгопхс ЬераРхРхз С: сопРгоИеЬ Рг1а1, 3_ОазРгоепРего1 38(6): 567-72.

1поие, К., Т. итеЬага, ер а1. (2007) . '^,Ενа1иаΡ^οη о£ а сус1орЬШп гпЫЫРог ίη ЬераРРРхз С '/1гиз-1п£есРе<1 сЫтегхс тхсе ίη νίνο.НераРоХоду 45(4): 921-8.

Ι3ΐιίί, Н,, К. МаРазЫ, еР а1. (2006). 'ΌίνβΓεε е££есРз о£ сус1озрог1пе оп ЬераРхРхз С ухгиз зРгахп герИсаРхоп. ΰ_νίτο1 80(9): 4510-20.

Ке, О., Е. Ь,, Е. Εοζίετ, Т, МагЬигу, Ы. Ыдиуеп, Ό. Бегга, К. ϋοΐβ, ,Ί. РгаезРдаагН, М. Ниапд, т, Е-/апз (2009) . За£еРу, Апс! То1егаЬШРу О£ Νίπιθίΐ, А Νονεί Сус1орЬШп 1пЫЫРог Рог Ησν, РоИомхпд 31пд1е Αηά Ми1Р1р1е АзсепЫпд Оозез 1п Неа1РЬу Уо1ипРеегз Αηά. Ηον-Ιη£βοΡθύ РархепРз. Ооигпа! о£ НераРо1оду 50(31): 3229.

ДасоЬзоп, I,, МсНиРсЫзоп, д<3, Зи1кокзк1, М. (2007), ОазРгоепРего! & НераРо! 3(334): 1-10.

Ка11еп, Д,, Е. Зес1гаЫ, еР а1, (2005). ЗРгисРиге о£ Питан сус1орЫ11п А ίη сотр1ех νίΡΗ РЬе ηονθΐ хттипозирргеззапР запдЫ£еЬг1п А аР 1.6 А гезо1иРхоп. 3 ΒίοΙ СЬет 280(23):

21965-71.

Камазак!, Η., Е. 3. Мосагзк!, еР а1. (2007). СусТозрогхпе

- 52 023907 хпЫЫРз тоизе суРотеда1оу!гиз ίη£βοΡίοη '.На а сус1орЫИпберепбепР раРЬиау ересз.£1са11у ίη пеига1 зРет/ргодеп1Рог се11в. б νίΓΟί 81(17): 9013-23.

Копхд, Л. Н,, С1аезег, М. Ке1зег, К. Мапбегу, и. ΚΙοΡζ апб. М. Е, Еготт (2010), Ргид МеРаЬ Разроз, 39, 1097-1102.

Иаппз, Μ. Ρ,, Θ. Е. РозРег, еР а1. (2007). ТЬе мау £огмагб ίη НОТ РгеаРтепР--£гпсИпд РЬе ггдЬР рарЬ, ЫаР Ееу Ргид Разсоу 6(12): 991-1000.

МагРап СаЬге]аз, Ь, М,, 5, ЕоНгЬасЬ, еР а1. (1999).

МасгоНбе Апа1одиез о£ РЬе Νονβΐ ИттипозирргеззапР 5апд11£еЬг1п: Ией/ АррИсаРаоп о£ РЬе Е1пд-С1оз1пд МеРаРЬезгз ЕеасПоп.” Апдезд СЬет 1пР Еб Епд! 38(16): 2443-2446.

МаРЬу, б. Е., 5. Ма, еР а1. (2008). СотЫпаРаопз о£ сус1орЫ11п апЫЫРог ΝΙΜ811 ИРЬ ЬераРаРаз С Нгиз Ν33-4Α Ргореазе ог Ы35В ро1утегазе апЫЫгогз епЬапсе апР1уага1 асР1У1Ру апб зирргезз РЬе етегдепсе о£ гезазРапсе. АпПтасгоЬ АдепРз СЬетоРЬег 52 (9) : 3267-75.

Ме1пакоуа, I. (2008). НераР1Р13 С РЬегартез.ЫаРиге Ееу Ргид Р1зс 7: 799-800.

МеРРегпасЬ, Е. , Ρβηηί, Р., ТЬа1, В, Зебгапа, Е. (1999). Томагб а ТоРа1 ЗупРЬез13 о£ РЬе 1ттипозирргеззапР Запд11£еЬг1п А. РгерагаРаоп о£ Тио Ее1ау Сошроипбз Ьу РедгабаРаоп апб ТЬеаг изе ίη РЬе ЕеаззетЫу о£ РЬе ЫаРига1 РгобисР. б. Огд. СЬет. 64: 9632-9639.

Ма11ау, Ώ. Ρ,, М. А. ЗагдепР, еР а1. (2008). ОепеРгс апб рЬагтасо1од1с ίηΗίΡίΡίοη о£ т1РосЬопбг!а1-берепбепР песгозаз аРРепиаРез тизси!аг бузРгорЬу. ЫаР Меб 14(4): 442-7.

Ые1зоп, Ό. Е. , <ЗЬа11Ь, Е.Н., Зи1комзк1, Μ. , 5сЫ££, Е.,

ЕизРд1, V., Роскгоз, Р.6., Иапд, С., РесозРегб КегЬие1, Р., апб Р. Сгоздиг1п, РогсЬеР, Н,, СгаЬЬе, Е. (2009). ^,[Е£Нсасу Апб За£еРу О£ ТЬе Сус1орЫ11п 1пЫЫРог РеЫо 025 1п СотЫпаРаоп И1РЬ Реду1аРеб 1пРег£егоп А1рЬа-2а Апб ЕаЬауагап 1п РгеУ1оиз1у Ыи11-Еезропбег ОепоРуре 1 Нсу РаРаепРз. боигпа! о£ НераРо1оду 50(31): 340.

Ы1«а, Т., УататоРо, 5, ЗааРо, М, ЗЫгада, Т, Такада, А.

(2007) . Е££есР о£ Сус1озрогапе апб ТасгоПтиз оп СуРосЬготе

- 53 023907

Р450 АсЛОЛез ίη Нитап Ьауег Масгозотез. Уакидаки 2аззк1 127 (1) : 209--216.

Раезкиузе, Л., А. Каи1, е£ а1. (2006). Тке попаштшюзирргеззхуе сус1озрог1п ΌΕΒΙΟ-025 1з а ро£еп£ апЫЬабог о£ керагаказ С νίηαβ герЛса£1оп ίη νίίΓΟ. Нера£о1оду 43(4): 761-70. '

Раг£1еп1ик, А., б. багозгеЛсг, е£ а1, (2007).

ЗреЛЛсаНу £агде£еб апЛу!га1 Ькегару £ог ЬераЛЛз С ’Лгиз. Ног1б б Оаз£гоеп£его1 13(43): 5673-81.

Рам1о£зку, ·Ί. М. (2000) . НераЪтказ С νίπΐ3 гез1з£.апсе £о ап£1У1га1 Ъкегару.Нера£о1оду 32(5): 889-96.

Рам1о£зку, б. М. (2005). СиггепС апб £и£иге сопсеркз ίη НераСаСаз С ккегару. Зетгп Ыуег Раз 25(1): 72-83.

Ра«1оСзку, б, М, (2006) . У1го1оду о£ кераСаЛз В апб С уагизез апб апЛуага1 ЪагдеЪз,б Нера£о1 44(1 Зирр1): 810-3,

РетЬегЬоп, Т. б. апб б, Е. Кау (2003) . Сус1оркЛ1П 3βη3ί£ίνί£γ со запдЛ£екг1п А сап Ье согге1а£еб Со Ске зате зрес1£1с СгурСоркап гезабие аз сус1озрог1п А, РЕВЗ ЬеСС 555(2): 335-40.

Роскгоз, Р. (2008). Етегдапд Ткегар1ез £ог Скготс НераС1С13 С νίηΐ5. (ЗазСгоепСего! апб Нера£о1оду 4 (10): 729734.

РСак, К. С., Р. А. (За11ау, еС а1. (2008). ЫЛЫСгоп о£ китап 1тптипобе£1с1епсу уагиз Суре 1 герИсаСбоп ίη Нитап се11з Ьу РеЬ1о-025, а ηονβΐ сус1орк111п Ыпбхпд адепс. АпЛтЛгоЬ АдепЬз СНетоСкег 52(4): 1302-17,

Ои, X., Лапд, Ν. еС а1., (2011). С1оп1пд, зедиепЛпд апб скагасСеЛгаЛоп о£ Ске ЫозупСкеЛс депе с1изСег' о£ запдН£екЛп А, а роСепС сус1оркШп апЛЫСог. Мо1. ВаозузС. 7 : 852-861

КоЛба, б. м. , Н. В. Не1зоп, еС а1. (2007).

СкагасСеЛ гаЛоп о£ кераЛЛз С уггиз зикдепотас герЛсоп гезазСапсе Со суЛозроЛпе ίη ухСго. б νίηοΐ 81(11); 5829-40.

Норк1пз, 3. Ό. Η., Е. Сауаз, б. Ьа1егаЛ, Е. С1иЛег, В. 01Мазз1то, Р. Еизпак, 3. ИЛпд, С. ЗгЛЛеу, Υ. апб Р.1ЪЛ11 (2009). За£еСу, р1азта ркагтасокхпеЛсз, апб апЛ-ухга!

- 54 023907 асР1У1Ру о£ ЗСУ-635 ίη аби1Ъ раРхепРз М1РЬ сЬгопхс Иерархехз С ухгиз хп£есРхоп.Лоигпа! οί НераРо1оду 50(31): 336.

еР а1. (1999). сус1орЬх1хп-Ьхпахпд зр. А92-308110.I.

Запд1хег, а. а., V. фиезпхаих,

Запд1х£еЬгхпз А, В, С апа В, ηονβΐ сотпроипйз хзо1аРеа £гот Зргерротусез

Тахопоту, £егтепРаРхоп, хзо1аРхоп апа Ьхо1одхса1 αοΡίνίΡγ. а АпрхЬхоР (Токуо) 52(5): 466-73.

ЗсИпехаег, Μ. ϋ. (2005) . СусИорЫНп Ό: кпоскхпд оп ЦеаРЬ'з аоог. Зсх 5ТКЕ 2005(287): ре26 .

Зеагапх, Е. , И, Ка11еп, еР а1. (2003). Запд1х£еЬгхпсус1орЬх1хп хпРегасРхоп: аедгаааРхоп иогк, зупрЬеРхс тасгосусЫс апа1одиез, Х-гау сгузРа1 зргисРиге, апа Ьхпахпд ааРа. а Ат СЬет Зое 125(13): 3849-59.

КЬоо

АпРхтхсгоЬ (2010),

ЕЙ. (2001). МагсЬ'заауапсеа

Зеаеп,К. О. Васк апа СЬетоРЬег, 65, 1079-1085.

ЗтхРЬ, М. В. а. Μ., а.

огдапхе сЬетхзРгу, аоЬп Их1еу апа Зопз 1пс. , ик,

ЗРехпзсЬи1Ре, С., Т. Тапег, еР а!. (2003). СирРхпд еаде:

запд1х£еЬгхп А, а ηονβΐ сус1орЬх1хп-Ьхпахпд хттипозирргеззапР Ыоскз ЬхоасРхх’е ΙΓ.-12 ргоЭисРхоп Ьу Ьитап аепагхрхс се11з. Тттипо! 171(2): 542-6.

ЗРгааег, О. В., Т. НгхдЬР, еР а1. (2004). Охадпозхз, тападетепр, апа РгеаРтепР о£ ЬераРхРхз С.НераРоТоду 39(4): 1147-71.

ТгорзсЬид, Μ., I. в. ВагРЬе1тезз, еР а1. (1989) .

'’3εη3ίΡίνίΡγ Ро сус1озрогхп А хз теахаРеа Ьу сус1орЬх1хп ίη Кеигозрога сгазза апа ЗассЬаготусез сегеухзхае. НаРиге 342(6252): 953-5.

Уро11]к, . М., А, Каи1, еР а1. (2003). А гер1хсоп-Ьазеа Ьхоаззау £ог РЬе теазигетепр о£ хпРег£егопз ίη раРхепРз ν/ίΡΗ сЬгопхс ЬераРхРхз С. а Ухго! МеРЬоаз 110(2): 201-9.

Мгхпд, 3. ,С. Нх11е, С. ЕемегРз, Е. Еапао1рЬ, А. ЗсгхЬпег апа 3. Норкхпз (2010), СГоигпа! о£ НераРо1оду, 52, 3263.

Уапд, Р., а. М. ЕоЬоРЬат, еР а1. (2008) , Сус1орЬхЫп А хз ап еззепРха1 со£асРог £ог ЬераРхРхз С ухгиз хп£есРхоп апа РЬе ргхпехра! теахаРог о£ сус1озрогхпе гезхзРапсе ίη ухРго. а

- 55 023907 γίτοί 82(11): 5269-78.

гепке, С., и. ЗРгхРРтаРРег, еР а1. (2001). Запд11£еЬг1п

А, а ηον©1 сус1орЫ1тп-Ыпб1пд сотроипб зЬоихпд хтптпозирргеззп-’/е асЬтЕу νίίΡΗ а пе>.' тесЬапхзт о£ асРгоп. б 1п>пшпо1 166(12): 7165-71.

геигет, 3. апб Е. Неггтапп (2002).Еупатгсе о£ ЬераРхРхз С νίπΐΗ 1п£есЫоп. Апп НераРо! 1(2): 56-63.

гЬапд, Ь. Н. апб Л. О. Ыи (2001). Запд11£еЬг1п А, а ηονεί сус1орЬ£11п-Ъ£пб1пд £ттипозирргеззапР, гпЫЫРз 1Ь-2берепбепР Т се11 ргоИ£егаР1оп аР РЬе <31 рЬазе о£ РЬе се11 сус1е.'‘ 3 Тттипо! 166(9): 5611-8.

Все ссылки, включая патенты и заявки на патенты, указанные в настоящей заявке, включены посредством отсылки в наиболее полной степени.

По всему тексту описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, если из контекста не следует иного, слово включает и такие вариации, как включающий, следует понимать как включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий.

Claims (23)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы (Ι) в которой группа Х₁ представляет собой -ОК_Ь -ΝΚιΚ₂ или К₃;

   Κι, К₂ и К₃ независимо представляют собой С_1-10алкил, С_2-1₀алкенил, С₃,_-10циклоС_1-10алкил, С₃.₁₀циклоС_2-1₀алкенил, С _-10алкилС_3-10циклоС1 _-10алкил, С _-10алкилС_3-10циклоС_2-10алкенил, С₂.₁₀алкенилС_3-10цикло С_1-10алкил, С_2-1₀алкенилС_3-1₀циклоС_2-1₀алкенил, С_5-1₀арил, С_5-1₀гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, С1_-1₀алкилС_5-1₀арил, С1_-1₀алкилС_5-1₀гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, С_2-1₀алкенилС_5-1₀арил или С_2-1₀алкенилС_5-1₀гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, при этом любая из указанных групп может быть необязательно замещена моноциклическим С_5-10арилом или моноциклическим С_5-10гетероарилом;

   и один или более атомов углерода в Κι, К₂ и К₃, не являющихся частью С_5-10арильной или С_5-10гетероарильной группы, необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и 8(О)_Р, где р обозначает 0, 1 или 2, и один или более атомов углерода в Κι, К₂ и К₃ необязательно замещены карбонилом;

   или К₁ и К₂ связаны таким образом, что НК₁К₂ представляет собой насыщенное или ненасыщенное С_4-8гетероциклическое кольцо, содержащее указанный атом азота, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены другим гетероатомом, выбранным из О, N и 8(О)_Р, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены карбонилом, при этом такое гетероциклическое кольцо необязательно может быть сконденсировано с С_5-10 арильным или С_5-10гетероарильным кольцом;

   и где один или более атомов углерода группы К₁, К₂ и К₃ необязательно могут быть замещены одним или более атомами галогена;

   или К1 и/или К2 представляют собой водород;

   К₉ представляет собой Н или ОН;

   п представляет собой одинарную или двойную связь, за исключением того, что когда п представляет собой двойную связь, К9 представляет собой Н;

   К₄, К₅, К₆, К₇ и К₈ независимо представляют собой Н, Р, С1, Вг, С_2-1₀алкенил или Сы₀алкил, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены гетероатомом, вы- 56 023907 бранным из О, N и δ(Ο)_ρ, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены карбонилом, при этом такая алкильная группа необязательно может быть замещена одним или более атомами галогена;

   Х₂, Х₃, Х₄, Х₅ и Х₆ независимо представляют собой С или Ν, при этом в том случае, когда любая из указанных групп представляет собой Ν, присоединенный заместитель отсутствует;

   при условии, что когда все Кд, К₆, К₇ и К₈ представляют собой Н, а все Х₂, Х₃, Х₄, Х₅ и Х₆ представляют собой С, то тогда К₅ не может представлять собой ОН, -ССр^алкил или ^(СО^р^алкил;

   или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение по п.1, где η представляет собой одинарную связь.
3. 3. Соединение по п. 1 или 2, где К₉ представляет собой ОН.
4. 4. Соединение по любому из пп. 1-3, где Х₂ представляет собой С.
5. 5. Соединение по любому из пп.1-4, где Х₃ представляет собой С.
6. 6. Соединение по любому из пп. 1-5, где Хд представляет собой С.
7. 7. Соединение по любому из пп.1-6, где Х₅ представляет собой С.
8. 8. Соединение по любому из пп. 1-7, где Х₆ представляет собой С.
9. 9. Соединение по любому из пп. 1-8, где К₄ представляет собой Н.
10. 10. Соединение по любому из пп.1-9, где К₈ представляет собой Н.
11. 11. Соединение по любому из пп.1-10, где К₅ представляет собой ОН.
12. 12. Соединение по любому из пп.1-11, где К₆ представляет собой Н, \1е или Р.
13. 13. Соединение по любому из пп.1-12, где К₇ представляет собой Н или Р.
14. 14. Соединение по любому из пп.1-13, где К₆ и/или К₇ представляет собой Р.
15. 15. Соединение по любому из пп.1-14, где Х₁ представляет собой \К|К₂.
16. 16. Соединение по п.15, где Κι представляет собой Сц^алкил, С_2-1₀алкенил, С^щциклоСцщалкил, С₃.₁₀ циклоС_2-1₀алкенил, С_1-10алкилС_3-10ци1к1оС_1-10алкил, С1_-1₀алкилС_3-1₀циклоС_2-1₀алкенил, С_2-1₀алкенилС_3-1₀ циклоСц^алкил, С_2-1₀алкенилС_3-1₀циклоС_2-1₀алкенил, С_5-1₀арил, С_5-10гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, С_1-10алкил(\_-10арил, С_1-10алкил(\_-10гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, С₂.₁₀ алкенилС_5-1₀арил или С_2-1₀алкенилС5_-1₀гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, а К₂ представляет собой Н, Сы₀алкил, С_2-1₀алкенил или -ОСы₀алкил.
17. 17. Соединение по п.15, где ΝΚιΚ₂ представляет собой морфолинил, оксазинан или одну из групп, раскрытых в следующей таблице:

    - 57 023907
18. 18. Соединение по п.1, выбранное из

    - 58 023907 включая любой его таутомер или изомер, в которых С26, 27 С=С связь, показанная как транс, является цис-связью; и включая его метанольный аддукт, в котором кеталь образуется при соединении С-53 кето (если таковая присутствует) и С-15 гидроксильной группы и метанола;

    или его фармацевтически приемлемая соль.
19. 19. Применение соединения по любому из пп.1-18 в качестве фармацевтического средства для лечения вирусных инфекций, таких как НСУ или ВИЧ-инфекция, или в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства.
20. 20. Фармацевтическая композиция для лечения вирусных инфекций, таких как НСУ или ВИЧинфекция, или в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства, включающая соединение по любому из пп.1-18 вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
21. 21. Способ лечения вирусных инфекций, таких как НСУ или ВИЧ-инфекция, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-18.
22. 22. Способ получения соединения по любому из пп.1-18, который включает реакцию соединения формулы У

    О О Л Р ^Χι 0Р°*¹¹ Формула V в которой X! определен в любом из пп.1-18, а каждый К_п независимо является С_1-4 алкилом или бензилом;

    с альдегидным макроциклом (соединение формулы УТ)

    - 59 023907 где Х2, Х3, Х4, Х5, Хб, К4, К5, Кб, К7, К9, К9 и η определены в любом из пп.1-18.
23. 23. Соединение формулы (νΙ) в которой Х2, Х3, Х4, Х5, Х6, К4, К5, К.6, К7, К9, К9 и η определены в любом из пп.1-18.