EA023848B1 - Макроциклическое соединение и способы его получения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к соединению формулы (I), являющемуся аналогом санглиферина, которое полезно в качестве ингибитора циклофилина для лечения вируса гепатита С (HCV) или вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), а также в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства. Представлена также твердая кристаллическая форма указанного соединения, способ его получения, в частности в виде кристаллического полиморфа.

Description

Настоящее изобретение относится к соединению - аналогу санглиферина, которое полезно в качестве ингибитора циклофилина. Настоящее изобретение также относится к применению указанного соединения в качестве лекарственного средства для лечения вируса гепатита С (НСУ) или вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), а также в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, предназначенной для применения в качестве ингибитора циклофилина, которая содержит вышеуказанное соединение в сочетании с фармацевтических приемлемым разбавителем или носителем. Настоящее изобретение также относится к способу лечения вирусных инфекций, выбранных из вируса гепатита С (НСУ) или вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), а также к способу получения указанного соединения, в частности к способу получения предложенного соединения в виде кристаллического полиморфа.

Предпосылки создания изобретения Гепатит С

Вирус гепатита С (НСУ) представляет собой РНК-вирус с положительной цепью, и инфицирование им является основной причиной посттрансфузионного гепатита. НСУ является наиболее распространенной хронической инфекцией, передаваемой через кровь, и основной причиной смерти от заболеваний печени в Соединенных Штатах. Всемирная организация здравоохранения считает, что в мире имеется более 170 млн хронических носителей вируса гепатита С, что составляет около 3% населения всего мира. Среди НСУ-инфицированных пациентов, которые не были подвергнуты лечению, приблизительно у 7085% развивается хронический гепатит С, и, следовательно, у них имеется высокий риск развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. В развитых странах 50-76% всех случаев рака печени и две трети случаев трансплантации печени являются результатом хронической инфекции НСУ (Маппз е! а1., 2007).

В дополнение к заболеваниям печени, у хронически инфицированных пациентов могут развиться другие хронические заболевания, связанные с НСУ, а также они являются источником передачи инфекции другим людям. НСУ инфекция вызывает осложнения, которые не связаны с печенью, такие как артралгии (боль в суставах), кожная сыпь и повреждения внутренних органов, преимущественно почек. НСУ представляет важную глобальную проблему для здравоохранения, и в настоящее время не существует вакцины от гепатита С (81табет е! а1., 2004; 1асоЬзоп е! а1. 2007; Маппз е! а1., 2007; Ра\у1о1зку· 2005; 2ен/ет & Негтапп, 2002).

Лечение гепатита С

Существующий стандарт терапии (8оС) состоит в подкожных инъекциях ПЭГилированного интерферона-α (ρΙΡΝα) и пероральном приеме противовирусного препарата рибавирина в течение 24-48 недель. Успех в лечении определяется устойчивым вирусологическим ответом (8УК), который определяется как отсутствие РНК вируса гепатита С в сыворотке крови в конце периода лечения и через 6 месяцев. Общий уровень ответа на 8оС в основном зависит от генотипа и от уровней РНК НСУ до лечения. Пациенты с генотипами 2 и 3 более успешно отвечают на 8оС, чем пациенты, инфицированные генотипом 1 (Ме1шкоуа, 2008; НсоЬзоп е! а1., 2007).

Значительное число больных гепатитом С неадекватно реагирует на лечение 8оС или не может переносить лечение из-за побочных эффектов, что приводит к частым проблемам с завершением полного курса. Показатель общеклинического 8УР на 8оС составляет всего около 50% (Ме1шкоуа, 2008). Развитие резистентности представляет собой другой основной фактор неэффективности лечения НасоЬзоп е! а1., 2007). 8оС также противопоказан некоторым пациентам, которые не считаются кандидатами на лечение, как пациенты, имевшие в прошлом значительные эпизоды депрессии или сердечных заболеваний.

Побочные эффекты 8оС, которые часто приводят к прекращению лечения, включают гриппоподобное заболевание, лихорадку, усталость, гематологическое заболевание, анемию, лейкопению, тромбоцитопению, алопецию и депрессию (Маппз е! а1., 2007).

Принимая во внимание побочные эффекты, связанные с длительным лечением с использованием 8оС, развитие резистентности и субоптимальный общий уровень успеха, для лечения НСУ-инфекции крайне необходимы более эффективные и безопасные новые способы лечения. Цели новых способов лечения включают улучшение эффективности лечения, улучшение профиля токсичности, улучшение профиля резистентности, улучшение качества жизни и, в итоге, улучшение режима лечения пациента. НСУ имеет короткий жизненный цикл и, следовательно, развитие лекарственной резистентности во время лекарственной терапии является распространенным явлением.

В настоящее время разрабатывается новая, специфически нацеленная противовирусная терапия гепатита С (8ТАТ-С), также известная как лечение с помощью лекарственных препаратов прямого противовирусного действия (ИАА), направленная на целевые вирусные белки, такие как вирусная РНКполимераза Ν85Β или вирусная протеаза N83 ЦасоЬзоп е! а1., 2007; Ратйешик е! а1., 2007). Кроме того, в настоящее время также разрабатываются новые соединения, направленные на целевые белки человека (например, циклофилины), а не на вирусные цели, что, как можно ожидать, приведет к снижению случаев резистентности во время лекарственной терапии (Маппз е! а1., 2007; Роскгоз, 2008; Ра\у1о1зку 1.-М., 2005).

- 1 023848

Ингибиторы циклофилина

Циклофилины (СуР) представляют собой семейство клеточных белков, которые отражают активность пептидил-пролил(цис-транс)-изомеразы по изменению конформации белка и укладки. СуР участвуют в клеточных процессах, таких как регуляция транскрипции, иммунного ответа, секреции белка и митохондриальной функции. Вирус НСУ вовлекает СуР в свой жизненный цикл во время инфекции у человека. Первоначально считалось, что СуР стимулируют активность РНК-полимеразы неструктурного белка Ν35Β НСУ по связыванию РНК, что способствует репликации РНК, хотя были предложены некоторые альтернативные гипотезы, в том числе условие в части активности СуР РР1-азы. Как считается, в жизненном цикле НСУ участвуют различные изоформы СуР, включая А и В (Уапд е! а1., 2008; Арре1 е! а1., 2006; Сйа!!егр е! а1., 2009; Саййег е! а1., 2010). Способность продуцировать нокауты у мышей (Со1дап е! а1., 2000) и Т-клетки человека (Вгаа1еп апй ЬиЬап, 2001), указывает на то, что СурА является факультативным для роста и выживания клеток. Аналогичные результаты были получены при разрушении гомологов СурА в бактериях (Негг1ег е! а1., 1994), в №игокрога (Тгорксйид е! а1., 1989) и в ЗассНаготусек сегеУ151ае (Эойпкк! е! а1., 1997). Таким образом, ингибирование СуР представляет собой новую и привлекательную цель у хозяина для лечения НСУ-инфекции, а также новое эффективное дополнение к лекарственным препаратам существующей ЗоС или ЗТАТ-С/ЭАА, с целью повышения ЗУК, предотвращения возникновения резистентности и снижения побочных эффектов при лечении.

Циклоспорин (1поие е! а1., 2003) (СкА) и близкосвязанные с ним по структуре неиммуносупрессорные клинические аналоги ΌΕΒΙΘ-025 (РаекНиуке е! а1., 2006; РНыак е! а1., 2008), ΝΙΜ811 (Ма!Ну е! а1., 2008) и ЗСУ-635 (Норктк е! а1., 2009), как известно, связываются с циклофилинами, и в качестве ингибиторов циклофилина показали в ш уйго и клинических условиях свою эффективность при лечении гепатита С (СгаЬЬе е! а1., 2009; ИШак е! а1. 2008; МаШу е! а1., 2008; 1поие е! а1., 2007; ΙκΗίί е! а1., 2006; РаекНиуке е! а1., 2006). Хотя более ранние исследования по резистентности для СкА показали мутации в РНК полимеразе Ν35Β НСУ, и это предполагало, что только циклофилин В будет вовлечен в процесс репликации НСУ (КоЫйа е! а1., 2007), но недавние исследования показали важную роль циклофилина А в репликации НСУ (СНаПегр е! а1., 2009; Уапд е! а1., 2008). Учитывая, что мутации в вирусном белке Ж5А также связаны с резистентностью к СкА, и что №5А взаимодействует как с СурА, так и с СурВ, в части специфической активности пептидил-пролил(цис/транс)-изомеразы (РР1-азы), то также предлагается, что циклофилины играют определенную роль в жизненном цикле вируса (Напои11е е! а1., 2009).

Действие аналогов циклоспорина против НСУ не зависит от иммуносупрессивных свойств, которые зависят от кальциневрина. Это показывает, что важнейшим условием активности в отношении НСУ является связывание СуР, и связывание кальциневрина не является необходимым. ΌΕΒΙΘ-025, наиболее клинически передовой ингибитор циклофилина, используемый при лечении НСУ, показал в условиях ш уйго и ш νί\Ό свою активность против четырех наиболее распространенных генотипов НСУ (генотипов 1, 2, 3 и 4). Исследования по резистентности показали, что мутации, придающие устойчивость к ΌΕΒΙΘ- 2 023848

025, отличаются от известных мутаций для ингибиторов полимеразы и протеазы, и что не было какойлибо перекрестной устойчивости с вирусными репликонами, устойчивыми к ЗТАТ-С/ОЛЛ. Что еще более важно, ΌΕΒΙΟ-025 также предотвращает развитие мутаций, которые придают устойчивость как к ингибиторам протеазы, так и к полимеразам (СгаЬЬе е! а1., 2009).

Тем не менее, в отношении ингибиторов циклофилина на основе СкА, находящихся на стадии клинической разработки, имеется ряд вопросов, которые, как считается, связаны с общими структурами этого класса, включая: наличие некоторых неблагоприятных событий, которые могут привести к прекращению лечения и ограничению уровней клинических доз; изменчивая фармакокинетика, которая может привести к различной эффективности и повышенным рискам лекарственных взаимодействий, что в итоге может привести к проблемам дозирования.

Наиболее часто встречающиеся побочные эффекты (АЕ) у пациентов, получавших ΌΕΒΙΟ-025, включают желтуху, боли в животе, рвоту, усталость, лихорадку. Наиболее клинически значимые ПЭ представляют собой гипербилирубинемию и уменьшение количества тромбоцитов (тромбоцитопению). ПЭГ -ΙΡΝ может вызвать сильную тромбоцитопению, и в сочетании с ΌΕΒΙΟ-025 может создавать значительные клинические проблемы. Увеличение билирубина и снижение тромбоцитов также были описаны в ранних клинических исследованиях с ΝΙΜ-811 (Ке е! а1., 2009). Несмотря на то что наблюдавшаяся гипербилирубинемия при клинических исследованиях ΌΕΒΙΟ-025 прекращалась по завершении лечения, это явилось причиной для прекращения лечения у 4 из 16 пациентов, а также для снижение уровней доз в последующих испытаниях. В отношении противовирусного эффекта ингибиторов циклофилина, в случае НСУ отмечена связь с дозой, при этом снижение дозы привело к уменьшению противовирусного эффекта, и ряд более поздних исследований с ингибиторами циклофилина на основе СкА также показали отсутствие или очень слабое снижение вирусной НСУ нагрузки при введении дозы в виде монотерапии (Ъа\\й/ е! а1., 2009; Норктк е! а1., 2009; №1коп е! а1., 2009). Как известно, ΌΕΒΙΟ-025 и циклоспорин А представляют собой ингибиторы желчных транспортеров, таких как экспортирующая помпа желчных кислот и других печеночных транспортеров, в частности, ОАТ1В1, ОАТ1В3, ΜΚΡ2, ΜΚΡ3, сМОАТ и ЛΒСС2 (СгаЬЬе е! а1., 2009). Было высказано предположение, что взаимодействие с желчными транспортерами, в частности с ΜΚΡ2, может быть причиной гипербилирубинемии, наблюдаемой при высоких уровнях доз ΌΕΒΙΟ-025 (№1коп е! а1., 2009, Аппд е! а1., 2010). Лекарственные взаимодействия (ΌΌΙ), связанные с классом СкА, за счет ингибирования другими лекарственными средствами, воздействующими на транспортеры, такими как Р-гликопротеин (Рдр/ΜΌΚ!), ΒδΕΡ, ΟΑΤ1Β1 и ОАТ1В3 (Кошд е! а1., 2010), также может быть проблемой, потенциально ограничивающей применение определенных комбинации лекарственных средств, и их применение для некоторых пациентов, проходящих лечение сопутствующих инфекций, таких как ВИЧ (Ьейеп е! а1., 2010).

Кроме того, ΌΕΒΙΟ-025 и циклоспорин А являются субстратами для метаболизма цитохромом Р450 (особенно СУР3А4) и они известны как субстраты и ингибиторы Р-гликопротеина человека (ΜΌΚ1) (СгаЬЬе е! а1., 2009). Также было показано в условиях ίη νί!ΐΌ, что циклоспорин А является ингибитором для СУР3А4 (№\уа е! а1., 2007). Это означает, что в данном случае отсутствует повышенный риск лекарственного взаимодействия с другими препаратами, которые являются субстратами, индукторами или ингибиторами СУР3А4, такими как, например, кетоконазол, циметидин и рифампицин. Кроме того, также ожидается взаимодействие с препаратами, которые являются мишенями для транспорта Ргликопротеином (например, с дигоксином), что может привести к серьезным лекарственным взаимодействиям у пациентов с НСУ, получающих медицинское лечение в отношении других сопутствующих заболеваний (СгаЬЬе е! а1. 2009). Также известно, что СкА имеет значительные вариации в фармакокинетике, и ранее исследовавшиеся препараты показали биодоступность от 1 до 89% (Карий/ак е! а1., 2004). Без выполнения дорогого мониторинга уровней в крови пациента, это может привести к развитию и росту побочных эффектов из-за увеличенных плазменных уровней, или к снижению клинического ответа за счет снижения плазменных уровней препарата.

Учитывая, что ингибирование циклофилинов представляет собой новый перспективный подход к лечению гепатита С, существует необходимость в создании и разработке более эффективных и безопасных ингибиторов СуР для применения в комбинированной терапии против инфекции НСУ.

С англиферины

Санглиферин А (8ГА) и его природные формы относятся к классу смешанных нерибосомальных пептидов/поликетидов, продуцируемых 8!гер!отуеек кр. А92-308110 (также известный как ΌδΜ 9954) (см. ΑΟ 97/02285), которые были первоначально обнаружены на основе их высокой аффинности к циклофилину А (СуРА). δ^ является наиболее распространенным компонентом в ферментационных бульонах и проявляет приблизительно в 20 раз более высокую аффинность в отношении СуРА, чем СкА. Это привело к предположению, что санглиферины могут быть полезны для лечения инфекций НСУ (ΑΟ 2006/138507). Также было показано, что санглиферины обладают более низкой иммуносупрессивной активностью, чем СкА, при испытании ίη уйго ^апдйег е! а1., 1999; Рейг е! а1., 1999). δ^ связывается с высокой аффинностью с сайтом связывания СкА в СуРА (Ка11еп е! а1., 2005).

- 3 023848

(РК§)/нерибосомальной пептидной синтетазы (ΝΚΡδ) (см. \УО 2010/034243). 22-членная макролидная цепь состоит из поликетидной углеродной цепи и трипептидной цепи. Пептидная цепь состоит из одной природной аминокислоты, валина, и двух неприродных аминокислот: (§)-мета-тирозина и (§)пиперазиновой кислоты, связанных амидной связью.

Гидроксилированием фенилаланина (либо на стадии ΝΚΡδ ίη δίΐιι. либо до биосинтеза) получают (8)-мета-тирозин, что, как считается, происходит через продукт гена кГаА.

Иммуносупрессивное действие санглиферинов

Механизм иммуносупрессивного действия §£А отличается от механизма других известных иммунофилин-связывающих иммуносупрессивных лекарственных средств, таких как СкА, РК506 и рапамицин. §£А не ингибирует фосфатазную активность кальциневрина, мишени для СкА (ΖοηΚο с1 а1., 2001), и вместо этого его иммуносупрессивная активность обусловлена ингибированием интерлейкина-6 (Наг1е1 с1 а1., 2005), интерлейкина-12 ^1еткс1ш11е е1 а1., 2003) и ингибированием пролиферации зависимых от интерлейкина-2 Т-клеток (ΖΗπη§, Ьш, 2001). Однако молекулярная мишень и механизм, посредством которого 8£А оказывает свое иммуносупрессивное действие, до сих пор не известны.

Молекулярная структура 8ГА является сложной и его взаимодействие с СурА, как полагают, опосредованно основной макроциклической частью молекулы. Действительно, макроциклическое соединение (гидроксимакроцикл), полученное окислительным расщеплением §ГА, показало сильное сродство к СурА (§ейгаш е1 а1., 2003). Данные рентгеновского исследования кристаллической структуры показали, что гидроксимакроцикл связывается с тем же активным сайтом СурА, как и СкА. Также ранее было показано, что аналоги на основе макроцикла фрагмента 8ГА, лишенные иммуносупрессивных свойств (§ейгаш е1 а1., 2003), обеспечивают возможность получения неиммуносупрессорных ингибиторов СуР для возможного использования в терапии инфекций НСУ.

В противоположность этому, также существует возможность разработки иммуносупрессивных средств с низкой токсичностью для использования в таких областях, как профилактика отторжения трансплантата, лечения аутоиммунных, воспалительных и респираторных заболеваний, включая, но, не ограничиваясь ими, болезнь Крона, синдром Бехчета, увеит, псориаз, атопический дерматит, ревматоидный артрит, нефротический синдром, апластическую анемию, билиарный цирроз печени, астму, легочный фиброз, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ) и целиакию. Как было показано, санглиферины имеют новый механизм иммуносупрессивной активности ^епке е1 а1., 2001), действуя, возможно, через дендритные клетки хемокинов (1ттеске е1 а1., 2011), и поэтому существует возможность разработки средств с механизмом действия, отличающимся от механизма известных клинических средств, таких как циклоспорин, рапамицин и РК 506. Было показано, что санглиферин А действует в 10 раз менее сильно, чем циклоспорин А, так что идеальное новое средство должно обладать улучшенной эффективностью и/или улучшенным терапевтическим окном.

- 4 023848

Другие терапевтические применения ингибиторов циклофилина Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)

Ингибиторы циклофилина, такие как СТА и ΌΕΒΙΘ-025, также показали потенциальную полезность в ингибировании репликации ВИЧ. Считается, что ингибиторы циклофилина влияют на функции СурА в ходе и/или завершении обратной транскрипции ВИЧ (Р1ак е! а1., 2008). Тем не менее, при клинических испытаниях ΌΕΒΙΘ-025 только снижал уровни РНК ВИЧ-1 на >0,5 и >1 1од10 копий/мл у девяти и двух пациентов соответственно, в то время как 27 пациентов не показали снижения уровней РНК ВИЧ-1 (8!еуп е! а1., 2006). После этого ΌΕΒΙΘ-025 был опробован для лечения НСУ/ВИЧ инфицированных пациентов, показав при этом, более высокую эффективность против НСУ, и клинические испытания в отношении ВИЧ были прекращены (см. \ν;·ιΙ;·ΐ5ΐιί е! а1., 2010).

Лечение ВИЧ

Во всем мире имеется более 30 млн человек, инфицированных ВИЧ-1, и каждый год возникает 3 млн новых случаев. С внедрением высокоактивной антиретровирусной терапии (НААКТ) варианты лечения значительно улучшились (8сйортап е! а1., 2010), и к 2008 году для лечения ВИЧ-1 было лицензировано около 25 антиретровирусных лекарственных средств, включая девять нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (ΝΚΤΙ), четыре ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (ΝΝΚΤΙ), девять ингибиторов протеаз (ΡΙ), один ингибитор слияния, один ингибитор ССК5 и один ингибитор интегразы (8ЬаТег аиб 8сйарпо, 2008). Тем не менее, ни один из этих известных режимов лечения не приводит к полной элиминации вируса, и они могут привести к серьезным побочным эффектам и устойчивости к противовирусным препаратам, что по-прежнему вызывает серьезную озабоченность. Таким образом, до сих пор существует потребность в новых противовирусных терапиях, особенно с использованием классов соединений с новым механизмом действия, где нет утвержденных лекарственных средств, в частности таких, как ингибиторы циклофилина.

Вирус гепатита В

Гепатит В является ДНК-содержащим вирусом из семейства Нерабпаушбае и является возбудителем гепатита В. В отличие от случаев инфекции НСУ и ВИЧ, было очень мало публикаций, касающихся активности ингибиторов циклофилина против вируса гепатита В. В работе Р!ак е! а1., 2008 описана слабая активность ОеЫо-025 против НВУ ДС» 4,1 мкМ), в то время как в работе Х1е е! а1., 2007 описана некоторая активность СТА против НВУ (ТС₅₀ >1,3 мкг/мл). Это представляет собой отличие от случаев в отношении ВИЧ и НСУ, где имеются многочисленные сообщения о противовирусной активности ингибиторов циклофилина в наномолярных количествах.

Лечение ИВУ

Вирусом гепатита В во всем мире заражено до 400 млн человек, и он является основной причиной хронического вирусного гепатита и гепатоцеллюлярной карциномы. В 2008 году было лицензировано шесть препаратов для лечения НВУ: интерферон-альфа и пэгилированный интерферон-альфа, три нуклеозидных аналога (ламивудин, энтекавир и телбивудин) и один нуклеотидный аналог (дипивоксил адефовира). Однако из-за высоких уровней резистентности, плохой переносимости и возможных побочных эффектов, необходимы новые терапевтические возможности (Рейт е! а1., 2008).

Ингибирование митохондриальных пор с транзиторной проницаемостью (тРТР)

Открытие пор с транзиторной проницаемостью в митохондриях приводит к высокой проводимости этих пор и инициирует начало процесса мембранной проницаемости в митохондриях (МРТ). Это событие является причиной, приводящей к некрозу и апоптозу гепатоцитов после окислительного стресса, Са²+-токсичности и ишемии/реперфузии. Было показано, что ингибирование циклофилина Ό (также известного как циклофилин Р) ингибиторами циклофилина блокирует открытие пор с транзиторной проницаемостью и защищает клетки от гибели после такого стрессового воздействия. Ингибиторы циклофилина Ό могут применяться при состояниях, когда имеет место открытие тРТР, таких как мышечная дистрофия, в частности, при врожденной мышечной дистрофии Ульриха и миопатии Бетлема (Мб1ау е! а1., 2008, \νϋ 2008/084368, Ра1та е! а1., 2009), при рассеянном склерозе (Ройе е! а1., 2009), сахарном диабете (Рирто!о е! а1., 2010), боковом амиотрофическом склерозе (Магйи, 2009), биполярном расстройстве (КиЬо1а е! а1., 2010), болезни Альцгеймера (Эи, Уап, 2010), болезни Хантингтона (Репу е! а1., 2010), восстановлении после инфаркта миокарда (Соте/ е! а1., 2007) и хроническом потреблении алкоголя (Кшд е! а1., 2010).

Дополнительные терапевтические применения

Ингибиторы циклофилина имеют потенциальную противовирусную активность и, следовательно, могут применяться в лечении инфекций других вирусов, таких как вирус ветряной оспы (Р!ак е! а1., 2008), вирус гриппа А (Пи е! а1., 2009), коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома и другие коронавирусы человека и кошачьих (Сйеи е! а1., 2005, Р!ак е! а1., 2008), вирус Денге (Каи1 е! а1., 2009), вирус желтой лихорадки (Отд е! а1., 2009), вирус западного Нила (Ошд е! а1., 2009), вирус западного лошадиного энцефалита (Общ е! а1., 2009), цитомегаловирус (Ка\\а5а1б е! а1., 2007) и вирус коровьей оспы (Са§!го е! а1., 2003).

Также имеются сообщения о полезности ингибиторов циклофилина и ингибирования циклофилина в других терапевтических областях, таких как лечение рака (Нап е! а1., 2009).

- 5 023848

Общие замечания по санглиферинам

Одной из проблем, возникающей в ходе разработки лекарственных средств, таких как санглиферины, является быстрый метаболизм и глюкуронидация, которые приводят к низкой биодоступности. Это может привести к увеличению вероятности возникновения эффекта от приема пищи, большей частоте неполного высвобождения из дозированной формы и высокой вариабельности показателей между пациентами.

Поэтому сохраняется необходимость в идентификации новых ингибиторов циклофилина, которые могут быть полезны, в частности, при лечении инфекции НСУ, а также при лечении других заболеваний, при которых ингибирование циклофилинов может быть полезно, например, в случае ВИЧ-инфекции, мышечной дистрофии, или для помощи при восстановлении после инфаркта миокарда, или в случаях, когда иммуносупрессия или противовоспалительное действие являются полезными. Предпочтительно, когда такие ингибиторы циклофилина обладают улучшенными свойствами по сравнению с применяемыми в настоящее время ингибиторами циклофилина, включая одно или более следующих свойств: более длительный период полувыведения или повышенную биодоступность, возможно через пониженный метаболизм Р450 и/или сниженную глюкуронизацию, улучшенная растворимость в воде, повышенная эффективность против НСУ, пониженная токсичность (включая гепатотоксичность), улучшенный фармакологический профиль, такой как направленное воздействие на органы-мишени (например, на печень, в случае НСУ) и/или длительный период полувыведения (обеспечивающий меньшую частоту дозирования), снижение лекарственного взаимодействия, такого как протекающего через сниженные уровни метаболизма СУР3А4, и ингибирование и снижение ингибирования РОР (что облегчает случаи взаимодействия при множественной лекарственной комбинации), улучшение профиля побочных эффектов, таких как низкое связывание с МРР2, которое ведет к снижению вероятности возникновения гипербилирубинемии, снижение иммунодепрессивного действия, улучшенная активность против устойчивых видов вирусов, в частности, против видов вирусов, устойчивых к СТА и к аналогу СкА (например, ΌΕΒΙΘ-025), высокий терапевтический индекс и/или индекс селективности. Настоящее изобретение раскрывает новый аналог санглиферина, который может обладать одним или более свойствами, указанными выше. В частности, настоящее изобретение раскрывает новый мутасинтетический аналог санглиферина, который, как ожидается, имеет сниженный метаболизм за счет Р450 или глюкуронизацию, что, например, показано повышенным временем полужизни микросом, и/или уменьшенную активность против НСУ, что, например, показано снижением ЕС₅₀ для репликона.

Кроме того, также существует необходимость в разработке нового иммуносупрессивного средства, которое может быть полезно для профилактики отторжения трансплантата, или при лечении аутоиммунных, воспалительных и респираторных заболеваний. Предпочтительно, когда такой иммунодепрессант будет обладать улучшенными свойствами, по сравнению с известными природными санглиферинами, включая одно или более следующих свойств: более длительный период полувыведения или повышенную биодоступность, возможно через пониженный метаболизм Р450 и/или сниженную глюкуронизацию, улучшенную растворимость в воде, повышенную эффективность в части иммуносупрессивной активности, такая как наблюдаемая в Т-клеточных анализах пролиферации, сниженную токсичность (включая гепатотоксичность), улучшенный фармакологический профиль, такой как направленное воздействие на органы-мишени и/или длительный период полувыведения (обеспечивающий меньшую частоту дозирования), снижение лекарственного взаимодействия, такого как протекающего через сниженные уровни метаболизма СУР3А4, и ингибирование и снижение ингибирования РОР (что облегчает случаи взаимодействия при множественной лекарственной комбинации), улучшение профиля побочных эффектов. Настоящее изобретение раскрывает новый аналог санглиферина, который может обладать одним или более свойствами, указанными выше. В частности, настоящее изобретение раскрывает новое производное, которое имеет сниженный метаболизм за счет Р450 или глюкуронизации, что, например, показано повышенным временем полужизни микросом, и/или улучшенный иммуносупрессивный эффект, что, например, показано снижением 1С₅₀ для пролиферации Т-клеток.

Таким образом, как можно видеть из примеров, соединение по настоящему изобретению обладает следующими положительными терапевтическими свойствами:

улучшенной противовирусной активностью против ВИЧ и НСУ, по сравнению с используемым в уровне техники ингибиторами циклофилина: циклоспорин А, ΌΕΒΙΘ-025 (алиспоривир) и санглиферин А;

уменьшенным клиренсом и увеличенным действием при пероральном приеме, по сравнению с используемым в уровне техники соединением санглиферин А;

более мощным ингибированием СурА в части РР1-азной активности по сравнению с используемым в уровне техники ингибиторами циклофилина: циклоспорин А, ΌΕΒΙΘ-025 (алиспоривир) и санглиферин А;

улучшенным профилем побочных эффектов и снижением лекарственного взаимодействия, что показано пониженным ингибированием транспортеров билирубина (ОАТР-1В1, ОАТР-1В3, МРР2 и МРР3) и снижением ингибирования транспортеров ксенобиотиков (РОР и В8ЕР).

- 6 023848

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к новому макроциклическому аналогу санглиферина, в частности, к соединению формулы (I)

Р

Формула (I) или его изомеру, в котором С=С связь в положении С 26, 27, показанная в транс-форме, представляет собой цис-форму; или его фармацевтически приемлемой соли.

Соединение формулы (I) может быть представлено в виде твердой кристаллической формы. Причем твердая кристаллическая форма соединения формулы (I) может представлять собой кристаллический полиморф формы I, пики на порошковой рентгеновской дифрактограмме (ΧΡΚΌ) которой имеют следующие характеристики:

- 7 023848

Еще одним аспектом настоящего изобретения является применение указанного соединения формулы (I) в качестве лекарственного средства для лечения вируса гепатита С (НСУ) или вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), а также в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства.

Еще одним другим аспектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, предназначенная для применения в качестве ингибитора циклофилина, содержащая указанное соединение формулы (I) в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ лечения вирусных инфекций, выбранных из вируса гепатита С (НСУ) или вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества указанного соединения формулы (I).

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ получения указанного соединения формулы (I), заключающийся во взаимодействии соединения формулы (У)

Формула (V) где каждый К.ц представляет собой независимо С_|-4алкил или бензил; с макроциклическим альдегидом (соединение формулы VI)

Кроме того, предлагается способ получения указанного соединения формулы (I) в виде кристаллического полиморфа формы I, заключающийся в кристаллизации соединения формулы (I) из метилизобутилкетона.

- 8 023848

Определения

Термины в единственном числе используются в данном описании для обозначения один или более чем один (например, по меньшей мере один) грамматический объект. В качестве примера, термин аналог означает один аналог или несколько аналогов.

Используемый в данном описании термин аналог(и) относится к химическим соединениям, которые являются схожими друг с другом по структуре, но которые немного отличаются по составу (за счет замены одного атома на другой, или присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы).

Используемый в данном описании термин санглиферин(ы) относится к химическим соединениям, которые подобны по структуре санглиферину А, но немного отличаются по составу (за счет замены одного атома на другой, или присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы), в частности, которые получают путем ферментации 81гсрЮтуес5 8р. А92-308110. Примеры соединений включают санглиферин-подобные соединения, раскрытые в АО 97/02285 и АО 98/07743, например санглиферин В.

Используемый в данном описании термин мутасинтетический санглиферин(ы) или мутасинтетический аналог(и) санглиферина относится к химическим соединениям, которые подобны по структуре санглиферину А, В, С или Ό, но которые немного отличаются по составу (за счет замены одного атома на другой, или присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы), в частности, которые получают путем ферментации §1тер1отусе8 8р. А92-308110 или его мутанта, где культура запитывается мета-тирозиновым аналогом.

Используемый в данном описании термин мета-тирозиновый аналог(и) относится к химическим соединениям, которые подобны по структуре мета-тирозину, но которые немного отличаются по составу (за счет замены одного атома на другой, или присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы), в частности, которые описываются формулой (III).

Используемый в данном описании термин макроциклический аналог, макроциклический аналог санглиферина или макроциклический санглиферин относится к соединению, указанному выше, как представляющие изобретение в его широком аспекте, например, к соединению формулы (I), представленной выше, или к его фармацевтически приемлемой соли. Эти соединения также называют соединения по изобретению, или производные санглиферина, или аналоги санглиферина, при этом в настоящем описании эти термины используются взаимозаменяемо.

Используемый в данном описании термин НСУ относится к вирусу гепатита С, одноцепочечному, содержащему РНК, оболочечному вирусу в вирусном семействе ИауМпбае.

Используемый в данном описании термин ВИЧ относится к вирусу иммунодефицита человека, возбудителя синдрома приобретенного иммунодефицита у человека.

Используемый в данном описании термин биодоступность относится к показателю или скорости, с которой лекарственное средство или другое вещество поглощается или становится доступным на участке биологической активности после его введения. Это свойство зависит от ряда факторов, включая растворимость соединения, скорость абсорбции в кишечнике, степень связывания белка, метаболизма и т.п. Различные тесты по биологической доступности, которые должны быть известны специалисту в данной области техники, раскрыты в описании (также см. Едотш е! а1. 2002).

Термин растворимость в воде, используемый в данном описании, относится к растворимости в водной среде, например, в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8) при рН 7,4 или в 5% растворе глюкозы. Тесты на растворимость в воде приведены ниже в примерах как анализ растворимости в воде.

Фармацевтически приемлемые соли соединений по изобретению, такие как соединения формулы (I), включают обычные соли, полученные с фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими кислотами или основаниями, а также кислотно-аддитивные соли четвертичного аммония. Более конкретные примеры подходящих кислот для получения солей включают хлористо-водородную, бромисто-водородную, серную, фосфорную, азотную, хлорную, фумаровую, уксусную, пропионовую, янтарную, гликолевую, муравьиную, молочную, малеиновую, винную, лимонную, пальмоиновую, малоновую, гидроксималеиновую, фенилуксусную, глутаминовую, бензойную, салициловую, фумаровую, толуолсульфоновую, метансульфоновую, нафталин-2-сульфоновую, гидроксинафтойную, бензолсульфоновую, иодисто-водородную, яблочную, стероиновую, танниновую кислоты и т.п. Соли хлористоводородной кислоты имеют особое значение. Другие соли, например соль щавелевой кислоты, которые сами по себе не являются фармацевтически приемлемыми, могут быть полезными в качестве промежуточных продуктов при получении соединений по изобретению и их фармацевтически приемлемых солей. Более конкретные примеры подходящих основных солей включают соли натрия, лития, калия, магния, алюминия, кальция, цинка, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, Ν-метилглюкамина и прокаина. Указание по тексту на соединение по изобретению включает соединение формулы (I) и его фармацевтически приемлемые соли.

Используемый в данном описании термин алкил означает линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую, как правило, 1-10 атомов углерода, например С1_-6алкильная группа. Примеры алкильных групп включают С1_-4алкильные группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил и

- 9 023848 н-бутил.

Термин лечение охватывает профилактическое и терапевтическое лечение.

Термин формула II относится как к формуле ПЛ, так и к формуле ПВ.

Описание фигур

На фиг. 1 представлен 'Н-ЯМР спектр соединения 24.

На фиг. 2 представлена порошковая рентгеновская дифрактограмма соединения 24 в твердой кристаллической форме (форма I).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к макроциклическим аналогам санглиферина, как указано выше, к способам получения данного соединения и к способам применения данного соединения в медицине.

В одном варианте осуществления изобретения соединение представляет собой метанольный аддукт, в котором полукеталь образован комбинацией С-53 кетогруппы, С-15 гидроксильной группы и метанола. В другом варианте осуществления это не так.

В другом варианте осуществления изобретения двойная связь в положении С 26, 27 представлена в цис-форме, как показано в следующей формуле:

Такое соединение может быть получено путем химического синтеза.

В дополнительном варианте осуществления изобретения предоставляется макроциклический аналог санглиферина формулы (I) в твердой кристаллической форме. В частности, предоставляется твердая кристаллическая форма (форма I) макроциклического аналога санглиферина формулы (I), который может быть получен (или был получен) путем кристаллизации аморфного макроциклического аналога санглиферина формулы (I) из метилизобутилкетона (МГВК). В одном варианте осуществления изобретения указанную аморфную форму суспендируют в МГВК и циклически изменяют температуру между максимальным и минимальным значением в течение общего периода времени, составляющем, например, 1, 2, 5, 24 ч, 1 день, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней или 2 недели. В одном варианте осуществления изобретения температуру циклически изменяют в интервале от комнатной температуры до температуры 60°С, например, от комнатной температуры до 40°С. В одном варианте осуществления изобретения температурные циклы между величинами минимальной и максимальной температуры (и наоборот) выполняют каждые 2-8 ч, например каждые 3-5 ч или каждые 4 ч. В предпочтительном варианте осуществления изобретения температуру циклически изменяют от комнатной температуры до 40°С каждые 4 ч в течение, в общей сложности, 5 дней.

Способ кристаллизации аморфной формы макроциклического аналога санглиферина формулы (I) подробно описано в примере 8.

Макроциклический аналог санглиферина формулы (I) в виде кристаллической полиморфной формы I имеет порошковую рентгеновскую дифрактограмму (ΧΚΡΌ), по существу такую, как показано на фиг. 2. В табл. 2 (пример 8) указаны пики и их относительная интенсивность. Методика получения данных ΧΚΡΌ описана в разделе Общие способы.

Таким образом, в изобретении предложен макроциклический аналог санглиферина формулы (I) в кристаллической форме (форма I), имеющий в дифрактограмме ΧΚΡΌ по меньшей мере один (например, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать или даже семнадцать) сигналов при 8,3, 8,5, 11,1, 12,6, 13,9, 14,3, 15,0, 16,9, 17,7, 18,6, 19,0, 20,1, 20,5, 20,9, 21,2, 21,7 и 23,0 градусах (±0,2°) угла 2-тета, при этом указанные сигналы представляют собой основные сигналы в дифрактограмме ΧΚΡΌ полиморфа формы I. Сигналы при 8,3, 8,5, 11,1, 13,9, 17,7, 18,6, 19,0, 20,5, 20,9 и 23,0° угла 2-тета обладают сравнительно высокой относительной интенсивностью (более 26%, см. фиг. 2) и, следовательно, являются предпочтитель- 10 023848 ными, чтобы зарегистрировать по меньшей мере один (например, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или даже десять) из них. Сигналы при 13,9, 17,7, 19,0, 20,5 и 23,0° угла 2-тета, имеют более высокую относительную интенсивность (более 50%, см. фиг. 2) и, следовательно, является предпочтительным, чтобы зарегистрировать по меньшей мере один (например, один, два, три, четырех или всех пяти) из них.

Термин относительная интенсивность означает интенсивность, приведенную в процентах, по отношению к сигналу наибольшей интенсивности в спектре (что соответствует пику при 13,9° угла 2-тета), как показано на фиг. 2.

Как правило, соединение по изобретению получают мутасинтезом с получением соединений формулы (II), с последующим полусинтезом.

Как правило, способ получения предшественников соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли включает:

инокулирование ферментационного бульона культурой-продуцентом санглиферина (например, 81гер1отусек кр. А92-308110, также известной как Ό8Μ 9954), или более предпочтительно продуцентом санглиферина, у которого ген кГаА или гомолог гена кГаА инактивирован или удален;

подпитку ферментационного бульона аналогом мета-тирозина (как показано в формуле (III), например, (8)-метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноатом, ΌΤ-5-фтор-мета-тирозином (9) или метил-2 -амино -3-(3 -фтор-5 -гидроксифенил)пропаноатом (10));

проведение ферментации до получения соединений формулы II и формулы НВ; экстракцию и выделение соединений формулы НА и формулы НВ;

полусинтетическую дериватизацию соединений формулы НА и формулы НВ с получением соединения формулы I.

Соединения формулы (III) определяются следующей структурой:

где К.₁₀ представляет собой Н или группу, образующую сложный эфир, такую как алкильная группа, т.е. С1_-6алкил, такой как Ме.

Подпитывающее соединение может быть рацемическим или представлять собой Ь-форму соединения формулы (III).

- 11 023848

Соединения формулы (III) являются либо коммерчески доступными, либо их получают стандартными методами синтеза, применяемыми в органической химии. Один общий путь получения соединений формулы (III) показан на следующей схеме 1а.

Схема 1а

На схеме 1а: а) связывание альдегида формулы (IV) с соответствующим фрагментом, например, (К₁₁О)₂Р(О)СН(ПНРС)СО₂К₁₀, и Ь) гидрирование и удаление защитной группы, если это необходимо. РС представляет собой защитную группу.

Альдегиды формулы (IV) могут быть коммерчески доступны или могут быть легко синтезированы специалистами в данной области техники. Применение химии защиты и удаления защиты может быть необходимым для получения соединений формулы (III) из соединений формулы (IV). Эти способы известны специалистам в данной области техники, и подходящие защитные группы описаны в источнике Сгееие'з Рго!есйуе Сгоирз ίη Огдашс §уи!йе818 (Ан1в апй Сгеепе, 4'¹' Еййюи, 2007).

После получения соединений формулы (ПА) и формулы (ПВ) соединения по изобретению получают полусинтетической дериватизацией. Полусинтетические способы получения макроциклических альдегидов санглиферина описаны в патенте США 6124453, в работах МеЦегшсН е! а1., 1999, Ваи!ей е! а1., 2001 и §ейгаи1 е! а1., 2003.

Как правило, полусинтетический способ получения некоторых соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей из мутасинтетического аналога санглиферина включает:

(a) дигидроксилирование аналога санглиферина;

(b) окислительное расщепление 1,2-диола с получением альдегида;

(c) сочетание указанного альдегида со стабилизированным карбанионом (или с его канонической формой), например, с карбанионфосфонатом, используя соединение формулы V.

где К₁₂, в случае мутасинтетического аналога санглиферина А, представляет собой:

- 12 023848

где группы К.ц. которые могут быть одинаковыми или различными, независимо друг от друга представляют собой алкил (например, С^алкил) или бензил.

Таким образом, способ получения соединения по изобретению включает взаимодействие соединения формулы (V) с альдегидным макроциклом (соединение формулы (VI)).

Получение соединений формулы (VI) может быть осуществлено способом, аналогично описанному ранее, для конверсии санглиферина А в соответствующий альдегидный макроцикл (Мейегшсй с1 а1. 1999). Кратко, соединение формулы (II) дигидроксилируют с использованием модифицированных условий §йагр1е88 (катализ с четырехокисью осмия). Использование хиральных лигандов помогает обеспечить селективность. Затем полученный диол может быть расщеплен окислением, используя, например, периодат натрия. Полученное соединение формулы VI может быть далее использовано в качестве субстрата для дериватизации в гомологичный амид, сложный эфир или кетон. Обычно соединение формулы (V) растворяют в апротонном растворителе, охлаждают и обрабатывают основанием, например, гидридом натрия. Затем добавляют соединение формулы (VI), и реакционную смесь нагревают при повышенной температуре. После соответствующего периода времени реакцию останавливают, и соединение формулы I очищают стандартными методами (например, препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией, препаративной тонкослойной хроматографией, флэш-хроматографией с нормальными фазами и т.п.).

Соединения формулы (V) могут быть известны или могут быть получены с использованием известных способов.

Как показано на схеме 1 (см. ниже), для обработки хлорангидрида хлоруксусной кислоты может быть использован соответствующий амин или подобное соединение, чтобы получить альфа-хлорамид. Затем альфа-хлорамид подвергают реакции Арбузова с получением соединения формулы V. Другие пути получения соединений формулы V для специалистов в данной области очевидны.

Дополнительные соединения формулы (V) могут быть известны или могут быть легко синтезированы из доступных производных карбоновых кислот (например, из К₃СОХ), где К₃ представляет собой 1,2оксазинановое кольцо, показанное на схеме 2. Как показано на схеме 2 (см. ниже), производное карбоновой кислоты может быть соединено с метилфосфонатом после обработки фосфоната основанием. Это приводит к соединению формулы (V), хотя другие пути получения соединений формулы V также очевидны для специалистов в данной области.

Схема 2

X = С1 или О-алкил

Если желательно или необходимо, то для защиты функциональности могут быть использованы защитные группы в альдегидном макроцикле или в макроцикле, или в соединении формулы V, как описано в Т.^. Огееи, Р. О. М. ^и18, Рго1ееДуе Огоирк ίη Огдашс §уи1йе818, ^йеу-Шещаеисе, №\ν Уогк, 1999.

В дополнение к конкретным способам и цитированным в данном описании ссылкам, специалисты в данной области техники могут получить дополнительные сведения из стандартных справочников по методам синтеза, включая, но, не ограничиваясь ими, справочник Фогеля по практической органической химии (Ригп188 е1 а1., 1989) и расширенный справочник по органической химии Марча (8тйй аиб Магсй, 2001).

Композиции, как правило, могут быть представлены в виде единичной дозированной формы и мо- 13 023848 гут быть получены любым из способов, хорошо известных в области фармации. Такие способы включают стадию объединения активного ингредиента (соединения по изобретению) с носителем, который состоит из одного или более вспомогательных ингредиентов. Как правило, композиции получают путем равномерного и тщательного смешивания активного ингредиента с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями, или с тем и другим типом носителей, и последующим, если необходимо, формованием продукта.

Соединения по изобретению обычно вводят перорально в форме фармацевтической композиции, содержащей активный ингредиент, необязательно в форме нетоксичной органической или неорганической кислотно- или основно-аддитивной соли, в фармацевтически приемлемой дозированной форме. В зависимости от тяжести заболевания и состояния пациента, которого подвергают лечению, а также от пути введения, композиции могут вводиться в различных дозах.

Например, соединения по изобретению могут быть введены перорально, трансбуккально или сублингвально в форме таблеток, капсул, каплет, эликсиров, растворов или суспензий, которые могут содержать ароматизаторы или красители, при этом формы могут быть предназначены для немедленного, замедленного или контролируемого высвобождения.

Таблетки могут содержать эксципиенты, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция и глицин; дезинтегранты, такие как крахмал (предпочтительно кукурузный, картофельный или тапиоки), натрийгликолят крахмала, натрийкроскармеллоза и некоторые комплексные силикаты; связующие для гранулирования, такие как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), гидроксипропилцеллюлоза (НРС), сахароза, желатин и аравийская камедь. Кроме того, могут быть включены лубриканты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерилбегенат и тальк.

Сухие композиции подобного типа также могут быть использованы для наполнения желатиновых капсул. В этой связи, предпочтительные эксципиенты включают лактозу, крахмал, целлюлозу, молочный сахар или полиэтиленгликоли с высокой молекулярной массой. Для водных суспензии и/или эликсиров, соединения по изобретению могут быть объединены с различными подсластителями или ароматизаторами, окрашивающими веществами или красителями, с эмульгирующими и/или суспендирующими средствами и с разбавителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин, а также с их комбинациями.

Таблетка может быть изготовлена прессованием или формованием, необязательно с одним или более вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены прессованием активного ингредиента в подходящем аппарате в свободно-текучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим веществом (например, с повидоном, желатином, гидроксипропилметилцеллюлозой), лубрикантом, инертным разбавителем, консервантом, дезинтегрантом (например, натрийгликолята крахмала, поперечно сшитым повидоном, поперечно сшитой натрийкарбоксиметилцеллюлозы), поверхностно-активным веществом или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть изготовлены формованием смеси соединения в порошкообразной форме в подходящем аппарате, увлажненного инертным жидким разбавителем. На таблетки можно необязательно наносить покрытие или наносить бороздки, и они могут быть изготовлены таким образом, чтобы обеспечить замедленное или регулируемое высвобождение активного ингредиента, используя, например, гидроксипропилметилцеллюлозу в различных пропорциях для обеспечения желаемого профиля высвобождения.

Композиции по изобретению, пригодные для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит заранее определенное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или в неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или в виде жидкой эмульсии вода-в-масле. Активный ингредиент также может быть предоставлен в виде болюса, электуария или пасты.

Следует понимать, что в дополнение к ингредиентам, отмеченных, в частности, выше, композиции по изобретению могут содержать другие средства, обычно используемые в данной области в соответствии с типом композиции, например, ингредиенты, используемые в формах для перорального введения могут включать флаворанты.

Средства, такие как консерванты и буферирующие агенты, преимущественно могут быть растворены в носителе. Для повышения стабильности, композиция может быть заморожена после заполнения ею сосуда, и вода может быть удалена в вакууме. Затем сухой лиофилизированный порошок запаивают в ампулы, при этом к ампуле может прилагаться флакон с водой для инъекций для восстановления в жидкую форму перед применением.

Дозировка, в которой вводят соединение по изобретению, будет варьироваться в зависимости от конкретного соединения, заболевания, состояния пациента, характера и тяжести заболевания, физического состояния пациента и выбранного пути введения. Соответствующие дозы могут быть без труда определены специалистом в данной области.

Композиции могут содержать от 0,1 мас.%, предпочтительно 5-60%, более предпочтительно 10-30

- 14 023848 мас.%, соединения по изобретению, в зависимости от способа их введения.

Специалистом в данной области следует принимать во внимание, что оптимальное количество и промежутки между введениями отдельных доз соединения по изобретению будут зависеть от характера и степени тяжести состояния, подлежащего лечению, формы, способа и места введения, а также от возраста и состояния конкретного пациента, подвергаемого лечению, и что врач, в конечном счете, будет определять соответствующие дозы, которые будут использоваться при лечении. Введение дозы может быть выполнено столько раз, сколько это необходимо. Если развиваются побочные эффекты, то количество доз и/или частота введения доз могут быть изменены или уменьшены, в соответствии с обычной клинической практикой.

Общие способы Материалы и методы Бактериальные штаммы и условия роста

Продуцентом санглиферина является §1гер!отусе8 8р. А92-308110 (ΌδΜ 9954, который может быть приобретен в ΌδΜΖ, Брауншвейг, Германия), также обозначаемый как ΒΙΟΤ-4253 и ΒΙΟΤ-4370, или его производные, такие как ΒΙΟΤ-4585, рост которых поддерживается на овсяной агаровой среде, средах ΜΑΜ, Ι8Ρ4 или Ι8Ρ2 (см. ниже) при температуре 28°С.

ΒΙΟΤ-4585 (для получения конструкта, см. пример 1) выращивали на овсяной агаровой среде при температуре 28°С в течение 7-10 дней. Споры с поверхности чашки с агаром собирали в 20% мас./об. стерильный раствор глицерина в дистиллированной воде, и хранили в 0,5-мл аликвотах при -80°С. Запас замороженных спор использовали для посева на среды §С8 или 8Μ25-3. Инокулированную среду для посева инкубировали при встряхивании в режиме от 200 до 300 об/мин при амплитуде 5,0 или 2,5 см, при температуре 27°С в течение 24 ч. Ферментационную среду 8ΟΡ-2 или ВТб инокулировали 2,5-10% посевной культурой и инкубировали при встряхивании в режиме от 200 до 300 об/мин при амплитуде 5 или 2,5 см при температуре 24°С в течение 4-5 дней. Затем культуру собирали для экстракции.

Аналог мета-тирозина (8)-Метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат был приобретен у №Юйет (США). (3Бром-5-фторанизол (соединение 9-1) был приобретен у Ассе1а СНетЕю Со., Ш. (Шанхай, Китай), а также он может быть приобретен у Атйиесот Шс (США) или у Аро11о ЗОепНПс ПШ (Великобритания). ΌΌ-5-фтор-мета-тирозин (соединение 9) и метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (соединение 10) синтезировали следующим образом.

ΌΕ-5-фтор-мета-тирозин (9) и метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (10)

К раствору соединения 9-1 (20 г, 97,55 ммоль) в тетрагидрофуране (100 мл) добавляли по каплям нбутиллитий (43 мл, 2,5 М, 107,3 ммоль) при температуре -78°С. Смесь перемешивали в течение 30 мин и добавляли Ν,Ν-диметилформамид (15,1 мл, 195,1 ммоль) при этой же температуре. Смесь перемешивали еще в течение 30 мин и удаляли охлаждающую баню. Через 1 ч реакционную смесь гасили насыщенным водным раствором хлорида аммония. Органический слой промывали водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем сушили (над сульфатом натрия), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали хроматографией на силикагеле с получением соединения 9-2.

К раствору соединения 9-2 (6 г, 38,9 ммоль) в сухом Όί',’Μ (200 мл) по каплям добавляли ΒΒγ₃ (4 Μ в дихлорметане, 30 мл, 116,8 ммоль) при температуре -70°С. После добавления ΒΒγ₃ реакционную смесь перемешивали при температуре -20°С в течение 3 ч, осторожно добавляли воду со льдом и экстрагировали ΌΟΜ. Органические слои промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над №₂δΟ₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле с получением желаемого соединения 9-3.

К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (4,64 г, 14 ммоль) в ΌΟΜ (150 мл) при комнатной температуре добавляли ΌΒυ (4,26 г, 28 ммоль). Через 10 мин добавляли соединение 9-3 (10,95 г, 14 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор разбавляли ЕЮАс (150 мл), разделяли и органический слой промывали 1н. НС1, сушили над №₂δΟ₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией на силика- 15 023848 геле с получением соединения 9-4.

Раствор соединения 9-4 (1 г) в метаноле (20 мл) подвергали гидрированию с использованием 200 мг 10% Ρά/С при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора фильтрованием растворитель выпаривали с получением соединения 10.

К раствору соединения 10 (300 мг, 1,4 ммоль) в ЕЮН (30 мл) добавляли водный раствор ΝαΟΗ (2Н, 4 мл), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Растворитель удаляли, остаток нейтрализовали до рН 6 с использованием 2н. НС1 и собирали фильтрованием образовавшиеся белые кристаллы с получением целевого соединения 9.

Альтернативный путь получения метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноата (10).

3,5-Дифторбромбензол, соединение (9а-1) был приобретен у ΌαΓίιί Рше СНетюак Со., Иб., (Шанхай, Китай), а также это соединение может быть приобретено у А1Га Аекаг или 81дта А1бпск

Получение соединения 9а-2.

К раствору ВпОН (1,61 мл, 15,54 ммоль) в ΌΜΡ (30 мл) добавляли ΝαΗ (622 мг, 60% дисперсия в минеральном масле, 15,54 ммоль) при температуре 0°С. Продолжали перемешивание при комнатной температуре в течение 0,5 ч с получением прозрачного раствора. Соединение 9а-1 (10,79 мл, 15,54 ммоль) добавляли с такой скоростью, чтобы поддерживалась температура ниже 40°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи с получением желтого раствора. Реакцию гасили водой и экстрагировали петролейным эфиром (35 мл х4). Объединенные органические слои концентрировали. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя петролейный эфир в качестве элюента, с получением соединения 9а-2 (2,544 г) в виде бесцветного масла.

Получение соединения 9а-3.

В сухую трехгорлую колбу в атмосфере азота добавляли Мд (170,1 мг, 7,10 ммоль), безводный ТНР (10 мл) и небольшое количества йода. Затем добавляли 1/3 количества соединения 9а-2 (10,664 г, 5,9192 ммоль) в ТНР (2 мл). Полученную смесь нагревали при кипячении с обратным холодильником. В это время желтая смесь постепенно становилась ярко-желтого цвета. Затем по каплям добавляли остальные 2/3 количества соединения 9а-2 и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 0,5 ч.

К вышеуказанной смеси при температуре 0°С медленно добавляли ΌΜΡ (0,504 мл, 6,51 ммоль). Перемешивание продолжали в течение 0,5 ч при комнатной температуре. Добавляли НС1 (2 М, 10 мл) и выпаривали ТНР. Остаток экстрагировали этилацетатом (25 мл, трехкратно). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором соли и концентрировали в вакууме. Остаток очищали хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента градиента петролейный эфир^петролейный эфир/этилацетат=20/1 с получением соединения 9а-3 (694 мг) в виде бесцветного масла.

Получение соединения 9а-5.

К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата, соединение 9а-4 (993 мг, 3,00 ммоль), в ΌΟΜ (30 мл) добавляли ОВИ (832 мкл, 5,57 ммоль) при комнатной температуре. Через 10 мин добавляли соединение 9а-3 (694 мг, 3,01 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Раствор промывали НС1 (1 М, 10 мл) и объединенные органические слои сушили и концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле (элюирование смесью дихлорметан/этилацетат=10/1) с получением соединения 9а-5 (10,11 г).

Получение соединения 10.

Раствор соединения 9а-5 (100 мг) в метаноле (50 мл) подвергали гидрированию с использованием 20 мг 10% Рб/С при нормальном давлении в течение 2 ч. После удаления катализатора фильтрованием выпаривали растворитель с получением соединения 10 (33 мг).

- 16 023848

7, 50	г
7, 50	г
1, 35	г
3, 75	г
7, 50	г
2, 50	г
2, 50	г
1, 00	г
0, 05	г
0, 05	г
0, 25	г
0, 50	г
0, 10	г
1,00	мл
1, 00	г
*0, 20	мл
* * * ** |	л

Составы сред

Воду, используемую для изготовления сред, получают, используя систему очистки воды Мбйроге Εΐίχ Лпа1убса1 Огабе.

Посевная среда 8О8.

Ингредиент (и поставщик) Количество

Глюкоза (Зтдта, С7021)

Глицерин (НзЬег Зс1епИ£1с, С/0650/25)

Дрожжевой экстракт (Весбоп Ц1ск£пзоп, 212770)

Солодовый экстракт (Весбоп Бтсктпзоп, 218630)

Картофельный крахмал (растворимый) (Зтдпта, 32004)

ΝΖ-амин А (31дта, С0626)

Термообработанная соевая мука, ЫибгФзоу (ΑϋΜ, 063160)

Ъ-аспарагин (Зьдта, А0884)

СаСОз (Са1с1бес, ν/405)

ЫаС1 (НзЬег Зс1епб±£1с, 5/3160/65)

КН₂РО₄ (31дта, Р3786)

К₂НРО₄ (51дта, Р5379)

Мд8О₄-7Н₂О (31дта, М7774)

Раствор микроэлементов В Агар

Пеногаситель 8А6471 (СЕ ЗШсопез, ЗАС471)

КО Н₂О, до конечного объема

Примечания.

* Пеногаситель использовали только в посевных ферментерах, но не в посевных колбах.

** Конечный объем доводили до заданной величины с учетом посевного объема.

Перед стерилизацией рН доводили до 7,0 с использованием 10 М ΝαΟΗ/10 М Н₂§0₄.

Стерилизацию проводили нагреванием при температуре 121°С в течение 20-30 мин (автоклавирование).

Раствор микроэлементов В.

Ингредиент (и поставщик) Количество

ЕеЗО4· 7Н2О	(Зьдта, Е8633)	5, 00	г
Ζη3Ο4· 7Н2О	(Зьдта, Ζ0251)	4, 00	г
МпС12· 4Н2О	(31дта, М8530)	2, 00	г
СиЗО4-5Н2О	(А1агтсЬ, 20,919-8)	0, 20	г
(ΝΗ4) 6Мо7024	(НзЬег Зс£епб£££с, А/5720/48)	0, 20	г
СоС12· 6Н2О	(31дта, С2644)	0, 10	г
Н3ВОз (Зтдта, В6768)	0, 10	г
ΚΙ (А1£а Аезаг, А12704)	0, 05	г
Н2ЗО4 (95%)	(Пика, 84720)	1,00	мл
КО Н2О, ДО	конечного объема	1, 00	л

Продукционная среда 8ОР2.

Ингредиент (и поставщик)

Количество

20,0 г

40,0 г 19,52 г *0,20 мл **1,00 л

Термообработанная соевая мука (Ыибг1зоу) (АПМ, 063-160)

Глицерин (ПгЪег 5с1епб1£1с, С/0650/25)

Буфер МЕЗ (Асгоз, 172595000)

Пеногаситель ЗАС471 (СЕ ЗШсопез, ЗАС471)

КО Н₂О, до конечного объема

Примечания.

* Пеногаситель использовали только в ферментерах, но не в колбах.

** Конечный объем доводили до заданной величины с учетом посевного объема.

- 17 023848

Перед стерилизацией рН доводили до 6,8 с использованием 10 М №ЮН.

Стерилизацию проводили нагреванием при температуре 121°С в течение 20-30 мин (автоклавирование).

Среда 8М25-3 (также обозначаемая как 8М25).

Количество

Перед стерилизацией рН не регулировали (т.е. рН равен 7,0). СредаΙ8Ρ4.

Ингредиент

Растворимый крахмал (ϋίίοο) 10 г

К₂НРО₄ 1 г

Мд5О₄-7Н₂О 1 г

ИаС1 1 г (ЫН₄)₂ЗО₄ 2 г

СаСО₃ 2 г

Раствор солей микроэлементов Ι5Ρ 1 мл

Агар 20 г

КО Н₂О, до конечного объема 1 л

Готовили пасту с крахмалом в небольшом объеме холодной воды и затем объем доводили до 500 мл.

К раствору ΙΙ добавляли другие ингредиенты в 500 мл воды, при этом значение рН должно находиться в пределах от 7,0 до 7,4 (рН 7,3). Смешивали два раствора вместе и затем добавляли агар.

Раствор солей микроэлементов Ι8Ρ.

Ингредиент

Количество

ГеЗО₄-7Н₂О МпС1₂· 4Н₂О Ζη 3Ο₄·7Η₂Ο

КО Н₂О, до конечного объема

Раствор хранили при температуре 4°С. Овсяная агаровая среда (Ι3Ρ3) .

Ингредиент г

г г

л

Количество

Овсяная мука 20,0 г

Раствор солей микроэлементов Ι3Ρ 1,00 мл Бактоагар (Весбоп Ббскбпзоп) 18,00 г

КО Н₂О, до конечного объема 1,00 л г овсяной муки варили в 1 л воды на плите (или в микроволновой печи) в течение 20 мин. Приготовленную смесь фильтровали через муслин/марлю, рН доводили до 7,2 и объем доводили до 1 л. Добавляли 1 мл раствора солей микроэлементов Ι8Ρ. Затем перед стерилизацией добавляли 18 г агара на 1 л раствора.

Агар МАМ.

Ингредиент (и поставщик)

Количество

Пшеничный крахмал (Збдта)

Порошок кукурузного экстракта (Коциеббе) Дрожжевой экстракт (Весбоп Б1ск1пзоп) СаСОз (Са1с1бес)

РеЗО₄ (51дта)

Бактоагар (Весбоп Бтсктпзоп)

КО Н₂О, до конечного объема Значение рН составляло 5,8 (до автоклавирования).

10, 00	Г
2, 50	г
3, 00	г
3, 00	г
0,300	г
20, 00	г
1, 00	л

- 18 023848

Продукционная среда ВТ6.

Ингредиент (и поставщик,

Количество

Глюкоза (31дта)	50, 00	Г
Соевая мука, ЫиДгДзоу (АШ)	30, 00	г
ИаС1 (ЕТэЬег)	5, 00	г
(ΝΗ4)23Ο4 (31дта)	3,00	г
СаСОз (Са1с1Дес)	6, 00	г
КО Н2О, до конечного объема	1,00	л

Значение рН устанавливали 7,0 перед добавлением СаСО₃. Агаровая среда ΙδΡ2.

Ингредиент (и поставщик,

Количество

Дрожжевой	экстракт	(ВесДоп ϋίο]<ίη3οη)	4,	00	г
Солодовый	экстракт	(ВесДоп Бгскгпзоп)	10	,0	г
Декстроза	(51дта)		4,	00	г
Бактоагар	(Веской	БДскгпзоп)	20	,0	г
КО НС·, до	конечного объема	1,	00	л

рН устанавливали 7,3 перед добавлением агара и стерилизацией.

Общие методы ферментации

Криоконсервированные запасы спор В1ОТ-4585 (для получения конструкта, см. пример 1) оттаивали при комнатной температуре. Вегетативные культуры (посевные культуры) получали путем переноса 4,0 мл запаса спор в 400 мл среды δΜ25 в колбы Эрленмейера емкостью 2 л с противопенной вставкой.

Культивирование проводили в течение 48 ч при температуре 27°С и 250 об/мин (амплитуда 5,0 см). Из посевной культуры 25 мл переносили в продукционную среду δΟΡ2+5% ΗΡ20 объемом 250 мл в колбу Эрленмейера емкостью 2 л с противопенной вставкой. После 24 ч культивирования при температуре 24°С и 250 об/мин (амплитуда 2,5 см) добавляли 2 мл 250 мМ рацемического или 125 мМ энантиомерно чистого раствора желаемого предшественника (например, (§)-метил-2-амино-3-(3-фтор-5гидроксифенил)пропаноата, ИЬ-5-фтор-мета-тирозина (9) или метил-2-амино-3-(3-фтор-5гидроксифенил)пропаноата (10)), в 1 М хлористо-водородной кислоте и 2 мл 250 мМ метанольного раствора ИЬ-пиперазиновой кислоты к каждой производственной колбе с получением конечной концентрации 1 мМ отдельных энантиомеров предшественников. При необходимости можно использовать ДМСО вместо 1 М хлористо-водородной кислоты. Добавление ИЬ-пиперазиновой кислоты может быть необязательным. Культивирование продолжали еще в течение четырех дней при температуре 24°С и при 250 об/мин (амплитуда 2,5 см).

Анализ культуральных бульонов при использовании жидкостной хроматографии с контролем в ультрафиолете (ЖХ-УФ) и жидкостной хроматографии с контролем в ультрафиолете и массспектрометрией (ЖХ-УФ-МС)

К культуральному бульону (1 мл) добавляли этилацетат (1 мл) и перемешивали в течение 15-30 мин с последующим центрифугированием в течение 10 мин. Собирали 0,4 мл органического слоя, досуха выпаривали и затем повторно растворяли в 0,20 мл ацетонитрила.

Условия ВЭЖХ:

Колонка Нурегс1опе С18 ΒΌδ С18 Со1итп 3и, 4,6 ммх150 мм, с подключенным картриджем Рйепотепех Апа1уПса1 С18 8есигйу Сиагй (К1О-4282);

Температура колонки 50°С;

Скорость потока 1 мл/мин;

Измерение УФ при длине волны 240 нм;

Объем вводимой аликвоты 20 мкл.

Градиент растворителя:

мин: 55% В;

1,0 мин: 55% В;

6,5 мин: 100% В;

10,0 мин: 100% В;

10,05 мин: 55% В;

13,0 мин: 55% В;

Растворитель А: вода+0,1% муравьиной кислоты;

Растворитель В: ацетонитрил+0,1% муравьиной кислоты.

В этих условиях δίΑ элюируется на 5,5 мин.

В этих условиях δίΒ элюируется на 6,5 мин.

ЖХМС осуществляли на комплексной системе ВЭЖХ АдПеШ НР1100 НРЬС в сочетании с масс- 19 023848 спектрометром с электрораспылением Вгикег ОаНошсв Евсцйге 3000, работающим в режиме положительных ионов, используя хроматографию и растворители, описанные выше.

Метод количественного контроля жидкостной хроматографией с масс-спектрометрией (ОС ЖХ-МС)

Условия ВЭЖХ:

Колонка Нурегс1оие С18 ΒΌδ С18 Со1ити 3и, 4,6 ммх150 мм, с подключенным картриджем РНеиотеиех Ат1\йса1 С18 δеси^^ιу Сиагй (К1О-4282);

Температура колонки 50°С;

Скорость потока 1 мл/мин;

Измерение УФ при длинах волн 210, 240 и 254 нм.

Градиент растворителя:

мин: 10% В;

2,0 мин: 10% В;

мин: 100% В;

мин: 100% В;

17,05 мин: 10% В;

мин: 10% В;

Растворитель А: вода+0,1% муравьиной кислоты.

Растворитель В: ацетонитрил+0,1% муравьиной кислоты.

Условия масс-спектрометрии (МС):

МС осуществляли в режиме переключения (переключение между режимами положительных и отрицательных ионов), сканирование в диапазоне от 150 до 1500 а.е.м.

Метод порошковой рентгеновской дифракции (ΧΚΡϋ)

Около 2 мг образца аккуратно прессовали с один косым срезом на держатель образца для ХРРЭ из кремнезема с нулевым потенциалом относительно земли. Затем образец помещали в дифрактометр РЫ1ΐρδ Х-Рей МРИ и проводили анализ в следующих условиях эксперимента:

Анод трубки: Си;

Напряжение генератора: 40 кВ;

Ток трубки: 40 мА;

Длина волны альфа1: 0,5406 А;

Длина волны альфа2: 1,5444 А;

Начальный угол [2 тета]: 5°;

Конечный угол [2 тета]: 50°;

Режим: непрерывное сканирование.

Анализ репликона ΐη уйго для оценки противовирусной активности в отношении НСУ

Противовирусная эффективность против НСV генотипа 1 может быть определена следующим образом: за день до добавления тестируемых проб, клетки Ний5.2, содержащие репликон 13891ис-иЫиео/Ы33-3'/5.1 НСV генотипа 1Ь Аго1ук е! а1., 2003), пересевали в клеточную среду для роста [ΌΜΕΜ (кат. номер 41965039), дополненную 10% ΡСδ, 1% заменимых аминокислот (11140035), 1% пенициллина/стрептомицина (15140148) и 2% генетицина (10131027), Шуйгодеи] в соотношении 1,3-1,4, и выращивали в течение 3-4 дней в колбах для культуры ткани размером 75 см² (ТесЬио Р1аз11с РгойиФз), затем собирали и высевали в среду для анализа (ΌΜΕΜ, 10% ΡСδ, 1% заменимых аминокислот, 1% пенициллина/стрептомицина) при плотности 6500 клеток на лунку (100 мкл/лунка) в 96-луночные планшеты для микротитрования культуры тканей (Ра1сои, Веск!ои Оюктвои для оценки антиметаболического эффекта; Си11игР1а1е, Регкш Е1тег - для оценки противовирусного эффекта). Микропланшеты инкубировали в течение ночи (37°С, 5% СО₂, относительная влажность 95-99%) с получением неконфлюентного монослоя клеток.

Готовили серийные разведения, из расчета получения каждого разведения в серии, по меньшей мере, в повторе. После подготовки микропланшетов для анализа их инкубируют в течение 72 ч (37°С, 5% СО₂, относительная влажность 95-99%).

Для оценки антиметаболических эффектов среду для анализа отсасывали, заменяя ее на 75 мкл 5% раствора ΜΤδ (Рготеда) в среде без фенолового красного, и микропланшеты инкубировали в течение 1,5 ч (37°С, 5% СО₂, относительная влажность 95-99%). Поглощение измеряли при длине волны 498 нм (δ;-ιйге², Тесаи) и оптическую плотность (значения ОЭ) пересчитывали в относительную величину, выраженную в процентах, по отношению к необработанному контролю.

Для оценки противовирусных эффектов аналитическую среду отсасывали и клеточные монослои промывали РΒδ. Промывочный буфер отсасывали, добавляли 25 мкл буфера для лизиса (С1о Ьу818 Вийег, кат. номер Е2661, Рготеда), Е2661, Рготеда), затем проводили лизис в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 50 мкл аналитической люциферазной системы (ЬисгГегазе Аззау δу8ΐет, катал, номер Е1501, Рготеда) (кат. номер Е1501, Рготеда) и немедленно количественно регистрировали сигнал люминесценции люциферазы (время интегрирования 1000 мс на лунку, δай^е2, Тесаи). Относительные единицы люминесценции пересчитывали в относительную величину, выраженную в процентах,

- 20 023848 по отношению к необработанному контролю.

Показатели ЕС₅₀ и ЕС₉₀ (значения, полученные из кривой доза-ответ) представляют собой концентрации, при которых соответственно можно наблюдать 50 и 90% ингибирования вирусной репликации. Показатель СС₅₀ (значение, полученное из кривой доза-ответ) представляет собой концентрацию, при которой метаболическая активность клетки снижена до величины 50% от метаболической активности необработанных клеток. Индекс селективности (§1), который указывает на терапевтическое окно соединения, рассчитывается как СС₅₀/ЕС₅₀.

Концентрация соединения рассматривается как вызывающая реальное противовирусное действие в системе репликона НСУ, когда при этой конкретной концентрации антирепликоновый эффект превышает 70%-ный порог, и при этом наблюдается не более чем 30%-ное снижение метаболической активности.

Анализ репликона ΐη уйго для оценки противовирусной активности в отношении НСУ генотипов 1а и 2а

Клетки-репликоны (субгеномные репликоны генотипа 1 (Н77) и генотипа 2а (1ЕН-1)) выращивали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (ΌΜΕΜ), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (ЕВ§), 1% пенициллина/стрептомицина (реп/зйер), 1% глутамина, 1% заменимых аминокислот, 250 мкг/мл 0418, в инкубаторе с атмосферой, содержащей 5% СО₂ при температуре 37°С. Все реагенты клеточной культуры могут быть приобретены у Меб1а1есН (Нетпбоп, УА).

Клетки-репликоны обрабатывали трипсином и высевали в количестве 5х10³ клеток на лунку в 96луночные планшеты с указанной средой без 0418. На следующий день культуральную среду заменяли средой ΌΜΕΜ, содержащей тестируемые соединения в серийном разведении в присутствии 5% ЕВ§. Противовирусный анализ репликона НСУ оценивали по эффекту действия соединений в последовательных разведениях. Кратко, клетки, содержащие репликон НСУ, высевали в 96-луночные планшеты. Тестируемые образцы соединений серийно разводили средой ΌΜΕΜ. содержащей 5% ЕВ§. Разведения соединений вводили в соответствующие лунки в планшетах. Клетки обрабатывали после 72 ч инкубации при температуре 37°С. Из каждой лунки экстрагировали внутриклеточную РНК, используя набор К№азу 96 (Ц1адеп). Уровень РНК в НСУ определяли с помощью анализа ПЦР с транскриптазой в реальном масштабе времени, с использованием набора реагентов ΤαςΜαη® Опе-§1ер КТ-РСК Μа8ΐе^ Μίχ Кеадейз (АррНеб Вю8у81ет8, ЕоЧег Сйу, СА) и систему АВ1 Рпзп 7900 §ециепсе Ое1есНоп (АррНеб Вю^уЧетЦ как описано ранее (Уго1ук е1 а1., 2003). Цитотоксические эффекты измеряли с использованием набора реагентов ΤηςΜηη® КЪозотй ΚΝΛ Сойго1 Кеадейз (Аррйеб Вю^уЧетЭ с регистрацией количества клеток в качестве показателя. Количество РНК вируса гепатита С и рибосомной РНК использовали для получения значений 1С₅₀ (концентрация ингибирования репликации репликона на 50%).

Оценка метаболизма микросом (анализ стабильности микросом)

Скорость метаболизма в микросомах может быть определена следующим образом.

Микросомы печени мыши или человека разводили буфером С (0,1 М калий-фосфатный буфер, 1,0 мМ ЭДТА, рН 7,4) до концентрации 2,5 мг/мл. Затем готовили образцы микросом для оценки стабильности добавлением 50 мкл 5 мкМ раствора тестируемого соединения (0,5 мкл 10 мМ маточного раствора ДМСО в 9,5 мкл АСЦ с добавлением 990 мкл буфера С) к 50 мкл раствора микросом (2,5 мг/мл) и 110 мкл буфера С, и затем все тщательно перемешивали. Все образцы были предварительно инкубированы в течение приблизительно 15 мин при температуре 37°С. После этого реакцию инициировали добавлением 40 мкл раствора NΛ^РН (12,5 мМ) при осторожном перемешивании. Аликвоты (40 мкл) отбирали на 0, 15, 30, 45 и 60 минутах и гасили АСЦ содержащим внутренний стандарт (120 мкл). Белок удаляли центрифугированием (4000 об/мин, 15 мин) и планшеты с образцами анализировали для определения концентрации соединения с использованием ЖХ-МС/МС. Затем рассчитывали время полужизни стандартными методами, сравнивая концентрацию анализируемого вещества с количеством, которое присутствовало первоначально.

Оценка стабильности гепатоцитов

Замороженные гепатоциты, хранившиеся в жидком азоте, помещали на водяную баню со встряхиванием при температуре 37±1°С на время 2 мин±15 с. Затем добавляли гепатоциты к 10-кратному объему нагретого бикарбонатного буфера Кребса-Хенселейта (КНВ) (2000 мг/л глюкозы, не содержащего карбоната кальция и бикарбоната натрия, §1дта), осторожно перемешивали и центрифугировали при 500 об/мин в течение 3 мин. Супернатант после центрифугирования осторожно удаляли и добавляли 10кратный объем предварительно подогретого буфера КНВ к ресуспендируемому осадку клеток. Полученную смесь осторожно перемешивали и центрифугировали при 500 об/мин в течение 3 мин. Затем супернатант удаляли. Жизнеспособность клеток и выход определяли подсчетом клеток, и эти значения использовали для получения необходимой плотности посева суспензий гепатоцитов человека (плотность жизнеспособных клеток=2х10⁶ клеток/мл). Двухкратный раствор (2Х) для дозирования готовили в предварительно нагретом буфере КНВ (с 1% ДМСО) (200 мкМ испытуемый раствор: 20 мкл исходного раствора субстрата (10 мМ) в 980 мкл ДМСО, дозируемый 2Х раствор: 10 мкл 200 мкМ тестируемого раствора в 990 мкл КНВ (2 мкМ после разведения)).

В лунки вносили 50 мкл предварительно нагретого 2Х раствора для дозирования, затем добавляли

- 21 023848 мкл предварительно нагретого раствора гепатоцитов раствор (2х10⁶ клеток/мл) и начинали отсчет времени. Затем планшет инкубировали при 37°С. После завершения времени инкубации (0, 15, 30, 60 и 120 мин) к каждой лунке добавляли 100 мкл ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт, осторожно перемешивали и затем добавляли 50 мкл предварительно нагретого раствора гепатоцитов (2х10⁶ клеток/мл). В конце инкубации определяли жизнеспособность клеток. Образцы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4°С, надосадочную жидкость разводили в 2 раза сверхчистой водой, и уровни соединений анализировали ЖХ-МС/МС.

Оценка растворимости в воде

Растворимость в воде может быть проверена следующим образом. Исходный 10 мМ раствор аналога санглиферина готовили в 100% ДМСО при комнатной температуре. Аликвоты объемом 0,01 мл в тройной повторности готовили в 0,5 мл или в растворе 0,1 М ΡΒδ, рН 7,3, или в 100% ДМСО в ампулах янтарного цвета. Полученные 0,2 мМ растворы встряхивали при комнатной температуре в шейкере 1КА® УЪгах УХК. в течение 6 ч, с последующим переносом полученных растворов или суспензий в пробирки Эппендорфа емкостью 2 мл, и центрифугировали в течение 30 мин при 13200 об/мин. Аликвоты надосадочной жидкости анализировали методом ЖХМС, как описано выше.

Также, растворимость в ΡΒδ при рН 7,4 может быть проверена следующим образом. Калибровочную кривую получали путем разведения исследуемых и контрольных соединений до концентрации 40; 16; 4; 1,6; 0,4; 0,16; 0,04 и 0,002 мкМ с использованием 50% метанола в Н₂О. Стандартные точки затем дополнительно разводили в соотношении 1:20 в смеси ΙΌΟΗ:ΡΒδ 1:1. Конечные концентрации после разведения в соотношении 1:20 составляли 2000; 800; 200; 80; 20; 8; 2 и 1 нМ. Затем стандарты смешивали с таким же объемом (1:1) АС^ который содержал внутренний стандарт (гидроксимакроцикл, соединение 6). Образцы центрифугировали (5 мин, 12000 об/мин) и затем анализировали методом ЖХ/МС.

	Раствор (мкл)	МеОН/ Н2О(1:1) (мил)		Рабочий раствор (мкл)	Раствор (мкл)	МеОН/ буфер (1:1) (мкл)		Конечный раствор (чМ)
10 нМ	10	240	-*	400
400 мкМ	50	450	-*	40	20	380		2000
20	480	—Ϊ	16	20	380		800
40 «Ш	50	450		4	20	380		200
16μκΜ	50	450	-*	1,6	20	380		80
4 мкМ	50	450	-*	0,4	20	380		20
1,6 мкМ	50	450		0,16	20	380	-*	8
0,4 мкМ	50	450		0,04	20	380	-*	2
0,04 мкМ	50	950		0,002	20	380	-*	1

Тестируемые соединения готовили в виде маточных растворов в ДМСО с концентрацией 10 мМ. Маточные растворы разводили в двух повторах в ΡΒδ, рН 7,4, в пробирках Эппендорфа емкостью 1,5 мл до целевой концентрации 100 мкМ с конечной концентрацией ДМСО, равной 1% (например, 4 мкл 10 мМ ДМСО маточного раствора в 396 мкл 100 мМ фосфатного буфера). Затем пробирки с образцами осторожно встряхивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Образцы центрифугировали (10 мин, 15000 об/мин) для осаждения нерастворенных частиц. Супернатанты переносили в новые пробирки и разводили ΡΒδ (коэффициент разведения для отдельного тестируемого образца подтверждался уровнем сигнала соединения в используемом аналитическом приборе). Затем разведенные образцы смешивали с таким же объемом (1:1) МеОН. Окончательно, образцы смешивали с равным объемом (1:1) АСN который содержал внутренний стандарт (гидроксимакроцикл, соединение 6), для проведения анализа методом ЖХ-МС/МС.

Оценка клеточной проницаемости

Клеточная проницаемость может быть проверена следующим образом. Тестируемое соединение растворяли до концентрации 10 мМ в ДМСО и далее разводили в буфере до получения конечной концентрации для дозирования, равной 10 мкМ. Маркер флуоресценции (люцифер желтый) также включали для контроля целостности мембран. Затем тестируемое соединение наносили на апикальную поверхность монослоя клеток Сасо-2 и измеряли проникновение соединения в базолатеральной компартмент. Эта оценка выполнялась в обратном направлении (от базолатеральной к апикальной поверхности) тестируемого активного транспорта. Для количественного определения уровней тестируемых и стандартных контрольных соединений (например, пропанолола и ацебутолола) использовали ЖХ-МС/МС.

- 22 023848

Оценка фармакокинетики ΐη νίνο

Для измерения биологической доступности соединения также могут быть использованы анализы ш У1уо. Как правило, соединение вводят тестируемому животному (например, мыши или крысе) внутривенно (в/в) и перорально (п/о), и затем через регулярные промежутки времени берут пробы крови для определения изменения концентрации лекарственного средства в плазме во времени. Изменения концентрации в плазме крови во времени могут быть использованы для расчета абсолютной биодоступности соединения в виде процентных долей с использованием стандартных моделей. Пример конкретного протокола описан ниже.

Мышам вводили 1, 10 или 100 мг/кг соединения по изобретению или исходного соединения внутривенно или перорально. Образцы крови отбирали через 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 420 и 2880 мин и концентрации соединения по изобретению или исходного соединения в образце определяли методом ВЭЖХ. Показатели изменения концентрации в плазме во времени могут быть использованы для получения ключевых параметров, таких как площадь под кривой зависимости концентрации в плазме крови от времени (АИС - величина, которая прямо пропорциональна общему количеству лекарственного средства, которое достигает системного кровотока в неизмененном виде), максимальная концентрация (пиковая) лекарственного средства в плазме, время, в течение которого достигается максимальная концентрация лекарственного средства в плазме (пиковое время), дополнительные факторы, используемые для точного определения биодоступности, которые включают конечное время полужизни лекарственного средства, общий клиренс, стационарный объем распределения и показатель Ρ%. Затем эти параметры анализировали некомпартментными и компартментными методами, получая расчетную величину биодоступности, выраженную в процентах. Пример метода анализа такого типа описан в Едопп е! а1. 2002, и в цитированных в данном описании документах.

Оценка фармакокинетики ΐη νίνο при пероральном и внутривенном введениях (специфический способ)

Для оценки аналогов санглиферина анализу подвергали цельную кровь. Соединения для в/в и п/о введения растворяли в смеси 5% этанола, 5% кремофора ЕЬ и 90% физиологического раствора. Группам из 3 самцов мышей СЭ1 внутривенно вводили дозу 1 мг/кг или перорально вводили дозу 5 или 10 мг/кг. Пробы крови (40 мкл) забирали через подкожную вену лапы перед введением дозы и через 0,25, 0,5, 2, 8 и 24 ч после введения. Пробы крови разводили равным количеством дистиллированной воды и немедленно помещали в сухой лед. До проведения анализа образцы хранили при -70°С. Концентрацию соединения по изобретению или исходного соединения в образце определяли ЖХМС следующим образом: к пробе объемом 20 мкл, содержащей кровь и Н₂О (1:1, об./об.), добавляли 20 мкл внутреннего стандарта (гидроксильный макроцикл, соединение 6) в концентрации 100 нг/мл, к 20 мкл рабочего раствора добавляли метанол и 150 мкл ΆΟΝ, затем встряхивали в течение 1 мин при 1500 об/мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант анализировали методом ЖХ-МС/МС. Строили график зависимости концентрации соединения в крови от времени, и использовали его для расчета площади под фармакокинетической кривой для случая цельной крови (АИС - величина, которая прямо пропорциональна общему количеству лекарственного средства, которое достигает системного кровотока в неизмененном виде). Полученные значения, когда это возможно, использовали для получения фармакокинетических параметров.

Оценка цитотоксичности ΐη νϊΐΐ'ο

Клетки НиН-7 и НерО2, полученные из АТСС, выращивали в основной среде Игла, модифицированной по Дульбекко (ΌΜΕΜ), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (ΡΒδ), 1% пенициллина/стрептомицина (реп/с!гер) и 1% глутамина; клетки СЕМ (лейкемические Т-клетки человека, полученные из АТСС) выращивали в среде ΚΓΜΙ 1640 с добавлением 10% ΡΒδ, 1% реп/с!гер и 1% глутамина. Свежи мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) человека выделяли из цельной крови, полученной по меньшей мере от двух здоровых скринированных доноров. Кратко, клетки периферической крови осаждали и промывали 2-3 раза с центрифугированием при низкой скорости, и затем ресуспендировали в РΒЗ для удаления загрязняющих тромбоцитов. После этого промытые клетки крови разводили в соотношении 1:1 буферным фосфатным раствором по Дульбекко (Ό-ΓΒδ) и наслаивали на 14 мл среды для отделения лимфоцитов (среда для роста клеток ЬЗМ; МеЙ1а!есН, Ыс. плотность 1,078±0,002 г/мл; кат. номер 85-072-СЬ) в центрифужной пробирке емкостью 50 мл, и затем центрифугировали в течение 30 мин при 600 д. Пластинчатые РВМС осторожно отсасывали из образованного межслойного пространства и затем их дважды промывали РΒЗ и подвергали низкоскоростному центрифугированию. После последней промывки клетки подсчитывали путем эксклюзии красителя трипанового синего и ресуспендировали с получением концентрации 1 х 10⁷ клеток/мл в среде ΚΓΜΙ 1640 с добавлением 15% фетальной телячьей сыворотки (ΡΒδ), 2 мМ Ь-глутамина, 4 мкг/мл РНА-Р. Клетки инкубировали в течение 48-72 ч при 37°С. После инкубации РВМС центрифугировали и ресуспендировали в среде ΚΓΜΙ 1640, содержащей 15% ΡΒδ, 2 мМ Ь-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мкг/мл гентамицина и 20 ед./мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека.

Цитотоксичность соединений по изобретению оценивали путем тестирования полулогарифмиче- 23 023848 ских концентраций каждого соединения в трех повторах в отношении клеток, описанных выше. Клетки с чистой средой служили клеточным контролем (СС). Клетки НиЬ-7 и НерО2 высевали в 96-луночные планшеты при концентрации 5х10³ клеток на лунку. На следующий день среду отсасывали и добавляли 100 мкл соответствующей среды, содержащей 5% ΡΒδ. Разведения тестируемых лекарственных средств готовили в двухкратных концентрациях в микротитрационных пробирках и 100 мкл каждой концентрации помещали в соответствующие лунки в стандартном формате. Через 72 ч клетки подвергали обработке для оценки цитотоксичности.

РВМС разводили в свежей среде и высевали во внутренние лунки 96-луночного планшета, имеющего лунки с круглым дном, в количестве 5х10⁴ клеток на лунку, в объеме 100 мкл. Аналогично, клетки СЕМ высевали в количестве 1х10⁴ клеток на лунку. Затем добавляли по 100 мкл растворов тестируемых лекарственных средств в двукратной концентрации в соответствующие лунки в стандартном формате. Культуры поддерживали в течение от шести до семи дней и затем подвергали обработке для определения цитотоксичности.

Цитотоксичность определяли с использованием набора для анализа однородности целостности мембран СуЮТох-ΟΝΕ™ (Рготеда). При помощи анализа измеряли высвобождение лактатдегидрогеназы ОН) из клеток с поврежденными мембранами в однородном флуорометрическом формате. Высвобождение ШН в культуральной среде измеряли с использованием количественного анализа ферментативного связывания, которое приводит к превращению резазурина во флуоресцентный продукт резоруфин. Продуцируемая флуоресценция пропорциональна количеству лизированных клеток. Для получения, где это применимо, значений ТС₅₀ (токсичные концентрации соединения, снижающие жизнеспособность клеток на 50%) и ТС₉₀ (токсичные концентрации соединения, снижающие жизнеспособность клеток на 90%), на клетки наносили шесть серийных разведений концентраций каждого соединения.

Оценка ингибирования транспортеров МБК1 и МКР2 ΐη νίίτο

Для оценки ингибирования и активации транспортеров МЭК1 (Р-гликопротеина 1) и МКР2 ίη νίίτο может быть использован анализ для АТФазы производимый δοϊνο Вю1ес1то1оду 1пс. (О1ауФа5 еί а1., 2003). Тестируемые соединения (0,1, 1, 10 и 100 мкМ) инкубировали с мембранными везикулами МЭК1 или МКР2 при отсутствии и в присутствии ванадата для изучения потенциала активации АТФазы. Кроме того, аналогичные инкубации проводили в присутствии верапамила/сульфасалазина с целью выявления возможного ингибирования активности транспортера АТФазы. Активность АТФазы измеряли количественно, путем спектрофотометрии неорганического фосфата. Активацию вычисляли, исходя из чувствительности ванадата, которая увеличивается в случае АТФазной активности. Ингибирование определяли по снижению активности АТФазы, опосредованной верапамилом/сульфасалазином.

Оценка ингибирования транспортеров Рдр с использованием клеток МБСК ΐη νίίτο

Для оценки ингибирования транспортера Р-гликопротеина (Рдр/МОК!) ίη νίΙΐΌ, использовали набор для анализа АТФазы, производимый СургоЮх. Для анализа использовали клетки МОК1-МЦСК, полученные из МН (КоскуШе, Мэриленд, США). После культивирования были подготовлены монослои базолатеральной и апикальной поверхностей путем двухкратной промывки буфером при рН 7,4 и температуре 37°С. Затем клетки инкубировали с буфером рН 7,4 и в апикальном и базолатеральном компартментах в течение 40 мин при температуре 37°С в атмосфере 5% СО₂ с относительной влажностью от 95% до стабилизации физиологических параметров. Для исследования проникновения от апикальной к базолатеральной поверхности (А-В), буфер с рН 7,4 удаляли из апикального компартмента и заменяли на дозированный раствор лоперамида перед помещением в пластины-спутники. Растворы готовили путем разведения лоперамида в ДМСО буфером с получением конечной концентрации лоперамида, равной 5 мкМ (конечную концентрацию ДМСО доводили до 1%). Флуоресцентный маркер целостности мембран люцифер желтый также включали в дозирующий раствор. Эксперимент проводили в присутствии и при отсутствии тестируемого соединения (наносимого на апикальный и базолатеральный компартменты). Для исследования проникновения от базолатеральной к апикальной поверхности (В-А), субстрат Ргликопротеина, лоперамид (конечная концентрация=5 мкМ) помещали в базолатеральный компартмент. Эксперимент проводили в присутствии и при отсутствии тестируемого соединения (наносимого на апикальный и базолатеральный компартменты). Инкубацию проводили в атмосфере 5% СО₂ с относительной влажностью 95% при 3°С в течение 60 мин. После инкубационного периода, пластины-спутники удаляли и образцы из апикального и базолатерального компартментов разводили для анализа методом ЖХ-МС/МС. Для каждой тестируемой концентрации соединений проводили одно определение в каждом тесте. На каждой пластине также подвергали скринированию положительный контроль ингибитора. Тестируемое соединение оценивали при концентрациях 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 и 50 мкМ. Целостность монослоя в течение всего эксперимента контролировали путем мониторинга по проникновению красителя люцифера желтого с использованием флуориметрического анализа. После выполнения анализа рассчитывали значение 1С₅₀ (т.е. концентрацию ингибитора (тестируемого лекарственного средства), которая обеспечивает достижение половины максимального эффекта ингибирования).

- 24 023848

Оценка ингибирования поглощения транспортеров ΐη νίίτο

Для оценки ингибирования поглощения транспортеров ОАТ1 В1 и ОАТ1 В3 ίη νίίτο использовали набор для анализа, производимый δοϊνο В|о1ескпо1оду Шс. Эксперименты по поглощению тестируемых образцов соединений (ТА) при концентрациях 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 и 50 мкМ проводили на клетках СНО, стабильно экспрессирующих человеческие 8ЬС транспортеры ОАТР1 В1 и ОАТР1 В3. Исходную клеточную линию СНО-К использовали в качестве отрицательного контроля. На стандартные 96луночные планшеты для культуры ткани высевали клетки (1х10⁵ в 200 мкл смеси 1:1 среды Игла, модифицированную по Дульбекко, и среды Хэма ΌΜΕΜ Р-12 (Р-12, Боп/а, Нью-Джерси, США) с добавлением 5 мМ бутирата натрия) и их инкубировали за 24 ч до начала эксперимента при температуре 37°С в атмосфере 5% СО₂ и 95% воздуха. Перед экспериментами среду удаляли вакуумным отсасыванием, клетки дважды промывали 100 мкл буфера Кребса-Хенселейта, рН 7,3 (изготовитель - 8щта СЬет1са18, 81дта-А1бг1сЬ, δί Ьош8, Миссури, США). Эксперименты по поглощению проводили при температуре 37°С в 50 мкл буфера Кребса-Хенселейта (рН 7,3), содержащего, соответственно, субстрат для пробы и ТА или растворитель. Концентрация органического растворителя в каждой лунке была одинаковой, и не превышала 1% об/об. Субстрат для пробы в случае анализа ОАТР1 В1 представлял собой Ε3δ (0,1 мкМ), и в случае анализа ОАТР1 В3, субстратом являлся Р1ио-3 (10 мкМ). Для каждой лунки определяли количество перенесенного субстрата для пробы. Относительные активности рассчитывали по уравнению:

Активность (%)=(А-В)/(С-Э)х 100, где А = перемещенное количество субстрата в присутствии ТА на трансфицированных клетках;

В = перемещенное количество субстрата в присутствии ТА на исходных клетках;

С = перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя на трансфицированных клетках;

Ό = перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя на исходных клеток.

Значение Κ.'₅₀ определяли как концентрацию ТА, необходимую для ингибирования транспорта субстрата для пробы на 50%. Значение Κ.'₅₀ было получено из трехпараметрического логистического уравнения; кривая на графике была выровнена по величине относительной активности в зависимости от концентрации ТА путем нелинейной регрессии.

Оценка ингибирования эффлюксных транспортеров ΐη νίίτο

Для оценки ингибирования эффлюксных транспортеров МКР2, МКР3 и ΒδΕΡ ίη уйго использовали набор для везикулярного транспортерного анализа, производимый δοίνο В|о1ескпо1оду Шс. Тестируемые образцы соединений (ТА) (в концентрациях 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 и 50 мкМ) инкубировали с везикулами мембранных эффлюксных транспортеров ^оШо В|о1ескпо1оду Шс.) как при отсутствии, так и в присутствии 4 мМ АТФ для установления различия между поглощением, опосредованным транспортером, и пассивной диффузии ТА в везикулы. В случае использования транспортеров МКР2 и МКР3, реакции проводили в присутствии 2 мМ глутатиона. Реакционные смеси инкубировали в течение 10 мин при 37°С. Реакции инициировали добавлением 25 мкл раствора Мд-АТР с концентрацией 12 мМ (конечной концентрации в анализе составляла 4 мМ), или буфера, для контроля уровня фона. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл ледяного промывочного буфера и после этого сразу выполняли фильтрацию на фильтрах из стекловолокна в 96-луночном формате (нанесение на фильтровальные пластины). На промытую и высушенную фильтровальную пластину добавляли сцинтилляционный буфер, и затем выполняли сцинтилляционный анализ с подсчетом импульсов. Субстратом для тестируемых соединений являлся таурохолат (2 мкМ) в случае везикул ΒδΕΡ, и Ε₂17βΟ (1 мкМ) в случае везикул МКР2 и МКР3. Для каждой лунки определяли количество перенесенного субстрата для тестируемых соединений в относительных единицах, выраженных в импульсах за минуту. Относительную активность рассчитывали по следующей формуле:

Активность (%)=(А-В)/(СЮ)х 100, где А = перемещенное количество субстрата в присутствии ТА и АТФ;

В = перемещенное количество субстрата в присутствии ТА;

С = перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя и АТФ;

Ό = перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя.

Значение Κ\₀ определяли как концентрацию ТА, необходимую для ингибирования транспорта субстрата для пробы на 50%. Значение Κ\₀ было получено из трехпараметрического логистического уравнения; кривая на графике была выровнена по величине относительной активности в зависимости от концентрации ТА путем нелинейной регрессии.

Анализ для оценки противовирусной активности против ВИЧ ΐη νίίτο

Противовирусная эффективность против ВИЧ может быть протестирована следующим образом. Как описано ранее (ВоЬатб! е! а1., 2008), выделяли СЭ4+ Т-лимфоциты и макрофаги, полученные из крови. Кратко, РВМС человека очищали из свежей крови градиентным разделением на РкоП-Нурацие (30 мин, 800 г, 25°С). Первичные человеческие СЭ4+ Т-клетки очищали от РВМС позитивной селекцией гранулами анти-СО4 ЭупаЬеаб8 с последующим их высвобождением с использованием системы Эе1аскаЬеаб. Клетки культивировали в среде ΚΡΜI 1640 ОпуПгодеп) дополненной 10% РСδ, МЕМ аминокисло- 25 023848 тами, Ь-глутамином, МЕМ витаминами, пируватом натрия и пенициллином/стрептомицином, и затем их активировали бактериальным суперантигеном стафилококкового энтеротоксина В (ЗЕВ, 100 нг/мл) и клетками РВМС от другого донора, которые были обработаны митомицином С (соотношение РВМС:клетки СЭ4 составило 10:1). Через три дня после стимуляции клетки разделяли в соотношении 1:2 в среде, содержащей ГЬ-2 (конечная концентрация 200 ед./мл). Затем культуры разделяли в соотношении 1:2 один раз в 2 дня в среде, содержащей ГЬ-2, и инфицировали ВИЧ на 7 день после стимуляции. Для образования первичных человеческих макрофагов, моноциты очищали от РВМС человека путем негативной селекции и активировали, и затем их культивировали при концентрации 10⁶ клеток/мл в среде ΌΜΕΜ, дополненной 10% РСЗ, МЕМ аминокислотами, Ь-глутамином, МЕМ витаминами, пируватом натрия, пенициллином (100 ед./мл), стрептомицином (100 мкг/мл) и 50 нг/мл рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-С8Р), и выдерживали при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО₂. Для получения макрофагов из моноцитов, клеткам давали возможность прилипнуть к полимерным пластинам, и затем их культивировали в течение 6 дней для дифференциации.

Клетки СЭ4+ НеЬа, клетки 1игка1. активированные СЭ4+ Т-лимфоциты и макрофаги периферической крови (500000 клеток/100 мкл) инкубировали с рЫЬ4.3-ОРР (вирус Х4) или с рХЬ4.3-ВАЬ-ОРР (вирус К5) (из расчета 100 нг р24) 48 ч в присутствии возрастающих концентраций образцов тестируемых соединений, заражение оценивали путем анализа процентной доли ОРР-положительных клеток путем РАСЗ, и рассчитывали значение ЕС₅₀.

Анализ для оценки противовирусной активности против ИВУ ΐη уйго

Противовирусная эффективность против НВУ может быть протестирована следующим образом. Клетки НерО2 2.2.15 высевали в 96-луночные планшеты для микротитрования. Через 16-24 ч конфлюентный монослой клеток НерО2 2.2.15 промывали и среду заменяли полной средой, содержащей различные концентрации тестируемого соединения в трех повторах (например, с шестью полулогарифмическими концентрациями). Через три дня культуральную среду заменяли свежей средой, содержащей тестируемые соединения, разведенные соответствующим образом. Через шесть дней после первоначального введения тестируемого соединения собирали супернатант культуры клеток, обрабатывали проназой и затем использовали для количественного анализа с помощью ПЦР ТадМаи в режиме реального времени.

Амплифицированную в ПЦР ДНК НВУ обнаруживали в режиме реального времени путем мониторинга роста флуоресцентных сигналов, которые являются результатом экзонуклеолитической деградации погашенных молекул флуоресцентных зондов, которые гибридизуются с амплифицированной ДНК НВУ. Для каждой ПЦР-амплификации получали стандартную кривую, используя разведения очищенной ДНК НВУ. Противовирусную активность рассчитывали по снижению уровней ДНК НВУ 0С₅₀). Затем для оценки жизнеспособности клеток использовали анализ поглощения красителя, и результаты использовали для расчета токсичности (ТС₅₀). Терапевтический индекс (Т^ рассчитывали как ТС₅₀ЛС₅₀.

Анализ на основе смешанной реакции лимфоцитов (МЬК) ΐη уйго для оценки иммунодепрессантной активности

Испытания по оценке иммунодепрессантной активности выполняли следующим образом. Популяции мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) выделяли из крови двух здоровых неродственных доноров-добровольцев (А и В), используя центрифугирование в градиенте плотности НМорасще. Клетки подсчитывали, и помещали их в количестве 1х10⁵ клеток на лунку в 96-луночные планшеты со средой ΚРΜI с добавками, и вводили 2% сыворотки АВ человека.

Условия культивирования включали следующее. Использовали отдельные популяции клеток А и В, смешанную популяцию клеток А и В, при отсутствии или в присутствии тестируемых соединений, применяя каждое в 6 различных концентрациях. Соединения тестировали в дозах от 10 до 0,0001 мкМ с инкрементом в 1 логарифм. Контрольные лунки содержали сопоставимые концентрации носителя (0,5% ДМСО), которые присутствуют в лунках, где было добавлено тестируемое соединение. Культуры были представлены в трех повторах в 96-луночных планшетах, и их инкубировали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂. На 6 день после начала анализа добавляли 3Н-тимидин, и пробы собирали через 24 ч. После этого сравнивали уровни пролиферации клеток, культивируемых в различных условиях.

Способность каждого разведения тестируемого соединения ингибировать пролиферацию в МЬК рассчитывали как величину ингибирования, выраженную в процентах. Это дало возможность определить значение ГС50 (концентрация тестируемого соединения, которая приводит к 50%-ному снижению количества импульсов в минуту). Для того чтобы вычислить значение ТС₅₀, ось X была представлена в логарифмической шкале. Для выравнивания средних точечных значений использовали нелинейную регрессию. При этом была выбрана сигмоидальная форма наклона кривой.

- 26 023848

Анализ ЕЫ8А для оценки €γρ-Ν85Α взаимодействия

Данный анализ применяли для оценки разложения комплексов Сур-\85Л и использовали для оценки активности взаимодействия с циклофилином 1). Кратко, получение и очистку рекомбинантного О8Т, белков О8Т-СурЭ и Сои1 Ν85Ά-Ηΐδ проводили, как описано ранее (СйаНегр е! а1., 2010). В 8-луночные узкие планшеты \ипс Мах1§огЪ наносили О8Т или О8Т-СурЭ, инкубировали в течение 16 ч при температуре 4°С и блокировали. В лунки добавляли 50 мкл рекомбинантного Ν85Ά-Ηΐδ (1 нг/мл) в связывающем буфере (20 мМ Трис, рН 7,9, 0,5 М №С1, 10% глицерин, 10 мМ ΏΤΤ и 1% ΝΡ-40), и инкубировали в течение 16 ч при температуре 4°С. Затем связанный Ν85Ά-Ηΐδ определяли с использованием мышиных антител против Ηίδ (1 мкг/мл) (апй-бхШк, С1оп1есН) и кроличьих антител против мышиного антитела к пероксидазе-фосфатазе хрена (ΗΚΡ) (разбавление 1:1000). Все эксперименты проводили дважды с использованием двух различных партий рекомбинантного СурЭ Ν85Ά и белков.

Анализ ингибирования циклофилина с использованием РР1А-азы

Могут быть использованы альтернативные методики анализа взаимодействия с циклофилинами, состоящие в следующем. ΡΡΣ-азная активность рекомбинантного СурА или СурЭ, который получен расщеплением О8Т-СурЛ или О8Т-СурЭ тромбином, определяют по скорости гидролиза \-сукцинил-Л1аА1а-Рго-Рйе-п-нитроанилида под действием химотрипсина. Химотрипсин гидролизует только трансформу пептида, и гидролиз цис-формы, концентрация которой является максимальной при использовании исходного раствора в трифторэтаноле, содержащем 470 мМ ЫС1, ограничена скоростью цис-трансизомеризации. СурА или Сур1) уравновешивали в течение 1 ч при температуре 5°С с выбранным тестируемым соединением, используя диапазон концентраций лекарственного средства от 0,1 до 20 нМ. Реакцию начинали добавлением пептида, и изменение поглощения контролировали спектрофотометрически со скоростью считывания 10 измерений в секунду. Начальную скорость гидролиза (при отсутствии СурА или С'ур[)) вычитали из скорости, определенной в присутствии СурА или С'ур[). Начальные скорости ферментативной реакции анализировали с использованием регрессионного анализа для уравнения первого порядка изменения поглощения света во времени.

Примеры

Пример 1.

Получение делеционного мутанта к£аЛ 8&ер1отусек кр. А92-308110 (Ώ8Μ9954).

1.1. Получение делеционного конструкта кГаА.

Фрагмент ЕсоКУ-ЗМ, размером приблизительно 7 т.п.о., из космиды ТЬ3006 (8ЕР ГО ΝΟ:3), охватывающий кГаА (в положении нуклеотидов 14396-21362, последовательность под номером доступа в NСΒI ΡΣ809786), вырезали расщеплением под действием ЕсоКУ и δίπΣ, затем полученный выделенный фрагмент непосредственно лигировали в вектор рКС1139, который ранее был расщеплен с помощью ЕсоКУ, и обрабатывали щелочной фосфатазой креветки (Косйе). Полученная плазмида была обозначена как р8ОК268.

Делецию в рамке гена кГаА, содержащегося в данном клоне, проводили с использованием набора для рекомбинации Кеб/ЕТ, который производится Оепе Впбуек (катал, номер К006).

5£аА17161£: 5’СССТСТСТССССССТССТТТСС7О\СССССТСССССАСССССАСССССАСАТССАТ7\АТТ7\АСС

СТСАСТАААССССС-3' (ЗЕО Ю N0:1)

5£аА17825г: 5’Т ССАТ СТАТ С С Т СССАССАС СС С САСААТ Т САС С Т СС САССТ С СТС САСАТ ССАТ ТААТАССА

СТСАСТАТАССССТС-3' (ЗЕО ΙΏ N0:2)

Два олигонуклеотида, 8£аА17161£ и 8£аА17825г использовали для амплификации маркера неомицина РКТ-РОК-§Ъ2-пео-РКТ из матрицы ДНК, которая поставляется в наборе, где используется ДНКполимераза КО1). Полученный амплифицированный продукт, размером приблизительно 1,7 т.п.о., выделяли с использованием гель-электрофореза и очищали из геля с использованием смолы (')ί;·ι1 А.

Плазмиду р8ОК268 трансформировали в Е.соП ΏΗ10Β с применением стандартных методов и отбор проводили на чашках, содержащих апрамицин (50 мкг/мл). Включение делеционных конструкций осуществляли в основном по протоколу для набора Оепе Впбуек. Единичные колонии выращивали в течение ночи в присутствии раствора апрамицина (50 мкг/мл) в среде 2ТУ и трансформировали с помощью плазмиды рКебЕТ (1е1) и затем подвергали селекции по апрамицину (50 мкг/мл) и тетрациклину (3 мкг/мл) при 30°С. Единичную колонию использовали для получения ночной культуры этого штамма в 3 мл среды 2ТУ с апрамицином (50 мкг/мл) и тетрациклином (3 мкг/мл) при 30°С. 0,5 мл полученной культуры использовали для инокуляции 10 мл среды 2ТУ с апрамицином (50 мкг/мл) и тетрациклином (3 мкг/мл) при температуре 30°С, затем культуру выращивали до величины ОЭ_{600 нм}, приблизительно равной 0,5. 1,4 мл полученной культуры переносили в каждую из двух пробирок Эппендорфа и в одну из пробирок добавляли 50 мкл 10% арабинозы для индукции экспрессии рекомбинантных белков Кеб/ЕТ. Пробирки встряхивали приблизительно 1 ч при температуре 37°С. Индуцированные и неиндуцированные клетки дважды осаждали центрифугированием на верхнем ярусе ротора центрифуги и промывали

- 27 023848 охлажденной стерильной водой, каждый раз подвергая клетки ресуспендированию и центрифугированию для их осаждения. Полученные осадки суспендировали в 30-40 мкл воды и хранили на льду. Выделенный фрагмент размером 1,7 т.п.о., полученный ранее вырезанием, добавляли в пробирки с индуцированными и неиндуцированными клетками и пробы переносили 1 мм электрокюветы Вюгаб на льду. Образцы подвергали электропорации (Вю-Каб МюгориЦег, напряжение 1,8 кВ, результирующая постоянная времени ~4 мс), добавляли 1 мл среды 2ΤΥ (без антибиотиков) и перемешивали для удаления клеток из кюветы. Клетки инкубировали в течение 3 ч при температуре приблизительно 37°С со встряхиванием (1100 об/мин, компактный термомиксер ЕррепбогГ), затем их высевали на чашки со средой 2ΤΥ, содержащей апрамицин (50 мкг/мл) и 25 мкг/мл канамицина, и инкубировали в течение ночи при температуре 37°С. Колонии из чашек с индуцированными пробами переносили штрихом на чашки со средой 2ΤΥ, содержащей канамицин (50 мкг/мл), для очистки и подтверждения включения кассеты устойчивости к канамицину. Для подтверждения введения кассеты применяли ПЦР для индивидуальных бактериальных колоний.

Из этих культур были получены плазмиды и их подвергали расщеплению для подтверждения экспрессии плазмиды р8СК270. Плазмиды затем подвергали расщеплению с использованием ΝδίΙ для удаления маркерного фрагмента и остаток снова лигировали с получением конструкта р8СК271 с рамочной делецией 5ГаА.

1.2. Коньюгирование 8!гер!отусе5 8р. А92-308110 (О8М9954) и введение делеции 5ГаЛ.

Клетки Е.соН ЕТ12567 рИ28002 трансформировали плазмидой р8СК271 с использованием стандартных методов, и клетки подвергали отбору на чашках со средой 2ΤΥ, содержащей апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл). Полученный штамм инокулировали в 3 мл жидкой среды 2ΤΥ, содержащей апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С, 250 об/мин. 0,8 мл полученной культуры использовали для инокуляции 10 мл жидкой среды 2ΤΥ, содержащий апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл), в 50 мл пробирках Ра1соп, и инкубировали при 37°С, 250 об/мин, до достижения оптической плотности ΘΌ_{600 нм}, равной 0,5. Полученную культуру центрифугировали при 3500 об/мин в течение 10 мин при 4°С, дважды промывали 10 мл среды 2ΤΥ с использованием центрифугирования для осаждения клеток после каждой промывки. Полученный осадок ресуспендировали в 0,5 мл среды 2ΤΥ и сохраняли на льду до использования. Этот процесс был выполнен к моменту полной подготовки спор 8!гер!отусе5, как описано ниже.

Споры 8!гер!отусе5 5р. А92-308110 (О8М9954) (Вю!-4370) собирали из чашки с конфлюентным слоем в возрасте 1-2 недели путем ресуспендирования приблизительно в 3 мл 20% глицерина. Споры центрифугировали (5000 об/мин, 10 мин, при комнатной температуре) и дважды промывали 50 мМ буфером ТЕ8 перед суспендированием в 1 мл 50 мМ буфера ТЕ8 и распределением их в 2 пробирки Эппендорфа. Пробирки были подвергнуты тепловому шоку при температуре 50°С в течение 10 мин на водяной бане перед добавлением 0,5 мл среды 2ΤΥ и инкубации в компактном термомиксере ЕррепбогГ при температуре 37°С в течение 4-5 ч.

Подготовленные клетки Е.соН ЕТ12567 рИ28002 р8СК271 и Вю!-4370 смешивали в соотношении 1:1 (250 мкл каждого штамма) и 1:3 (100 мкл Е.соН), немедленно распределяли на чашки К6 и переносили в инкубатор с температурой 37°С. Примерно через 2 ч инкубации чашки покрывали 2 мл стерильной воды, содержащей налидиксовую кислоту, с конечной концентрацией в чашке 25 мкг/л. Чашки возвращали в инкубатор с температурой 37°С и инкубировали в течение ночи перед нанесением 2 мл стерильной воды, содержащей апрамицин, с конечной концентрацией в чашке 20-25 мкг/л. Эксконъюгатные колонии, появившиеся приблизительно через 4-7 дней, наносили на среду [8Р4, содержащую апрамицин (25 мкг/л) и налидиксовую кислоту (25 мкг/л), и инкубировали при температуре 37°С. После приемлемого роста мицелия наблюдаемые штаммы переносили на среду [8Р4, содержащую апрамицин (25 мкг/л), при температуре 37°С и оставляли до споруляции. Затем штаммы пересевали в три раза (с целью удаления чувствительных к температуре плазмид), с нанесением их на среду !8Р4 (без антибиотиков) и инкубированием при температуре 37°С в течение 3-4 дней. Затем штаммы наносили на среду !8Р4 и инкубировали при температуре 28°С для обеспечения полного спорообразования (5-7 дней). Споры собирали и серийно разводили на чашках со средой !8Р4 при температуре 28°С, чтобы обеспечить отбор отдельных колоний. Единичные спорулированные колонии были дважды пересеяны на чашках со средой !8Р4 с или без апрамицина (25 мкг/л), чтобы подтвердить потерю плазмиды, и им давали расти приблизительно 7 дней до тестирования на продуцирование санглиферинов.

1.3. Скрининг штаммов для продукции санглиферинов в пробирках Ра1соп.

Одну агаровую пробку, размером приблизительно 7 мм, полностью спорулированного штамма использовали для инокуляции 7 мл стерильной среды 8М25-3, которую затем инкубировали при температуре 27°С при 200 об/мин в шейкере с двухдюймовым (50,8 мм) ходом. После 48 ч роста 0,7 мл полученной культуры переносили в стерилизованную пробирку Ра1соп, содержащую 7 мл среды 8СР2 с 5% смолы НР20. Культуры выращивали при температуре 24°С и 300 об/мин в инкубаторе с шейкером с однодюймовым (25,4 мм) ходом в течение 5 дней до сбора культуры. Отбирали 0,8 мл бактериальной культуры, и аликвоты переносили в пробирку Эппендорфа объемом 2 мл, обеспечивая при этом равномерное

- 28 023848 диспергирование смолы в культуре до отбора аликвот. Добавляли 0,8 мл ацетонитрила и 15 мкл муравьиной кислоты, после чего пробирки перемешивали в течение приблизительно 30 мин. Смесь осветляли центрифугированием и 170 мкл экстракта переносили во флакон для ВЭЖХ с последующим анализом пробы высокоэффективной жидкостной хроматографией.

1.4. Анализ штаммов на реверсию в дикий тип или в §£аА фенотип.

Экстракты штаммов были проанализированы с помощью ВЭЖХ. Штаммы, которые продуцируют санглиферины А и В, не подвергали дополнительному анализу, поскольку они реверсируются в дикий тип. Штаммы, которые не продуцируют санглиферины А и В, показали небольшие уровни (приблизительно 1-2 мг/л) пика со временем удерживания, равным 6,5 мин, который отображает санглиферин как хромофор. Анализ ЖХМС показал, что этот пик имел величину т/ζ, равную 1073, т.е. -16 единиц от ожидаемого значения т/ζ для санглиферина. Было сделано предположение, данный пик обусловлен включением фенилаланина на место отсутствующей группы мета-окситирозина.

Восемь штаммов, которые показали отсутствие продукции санглиферина, впоследствии использовали для оценки того, насколько потенциальная мутация §£аА могла быть дополнена химическими модификациями, чтобы обеспечить возможность мутасинтетического процесса получения новых санглиферинов. Штаммы были выращены в посевной среде 5Μ25-3 в течение 48 ч перед переносом в продукционную среду 5ΘΡ2, содержащую 5% смолы. После дополнительных 24 ч роста штаммы трехкратно подпитывали 2 мМ ЭЬ-мета-окситирозином (добавлением 100 мкл 0,16 М раствора в 1 М НС1) или 2 мМ 1,фенилаланином, при этом в качестве контроля использовали штаммы без подпитки. Для повышения выхода продукта штаммы также подпитывали пипеколиновой кислотой (2 мМ в метаноле). Штаммы собирали после дополнительного роста в течение 4 дней и подвергали экстракции с анализом проб методом ВЭЖХ. Было показано, что мета-гидрокситирозин полностью дополняет мутации §£аА, и добавление Ьфенилаланина повышает уровни соединения с -16 а.е.м. Для дальнейшего изучения был выбран штамм Βί()1-4585, как делеционный мутант по §£аА.

Пример 2.

Другие способы получения конструкта с делецией §£аА.

Могут быть использованы и другие способы получения мутантов с делецией §£аА. Примеры этого включают инсерционные мутанты с инактивацией §£аА (см., например, пример 12 в \ΥΟ 2010/034243). Данный штамм был получен способом, описанным в \ΥΟ 2010/034243, и данный штамм был обозначен как ΒΙΟΤ-4452.

Для получения делеции §£аА по альтернативной методике использовали два олигонуклеотида: 15209Е 5'-САСАСААТТСОСССТАСССОССССАССАСААССТСТС-3' (ЗЕО ГО

N0:4) и

17219В 5'-ССССАТССАТОТСССССТеССеСТСССССАСССССТТСС-З' (5Е<2

ГО N0:5), для амплификации области гомологии в положении апстрим, с использованием космиды ΤΕ3006 (δΕΟ ΙΙ) ΝΟ:3) в качестве матрицы, и ДНК-полимеразы ΚΟΙ). Продукт амплификации обрабатывали полинуклеотидкиназой Т4 (ΝΕΒ) и клонировали в вектор риС18, который дефосфорилировали под воздействием щелочной фосфатазы креветки (КосЬе). Полученный конструкт тщательно проверяли рестрикционным расщеплением и секвенировали для определения того, была ли получена желаемая последовательность, и что во время полимеразной амплификации в последовательность не были включены ошибки. Полученный конструкт расщепляли с помощью ЕсоК! и ΝδΐΙ, и продукты анализировали с использованием гель-электрофореза. Полосы, содержащие нужную последовательность (т.е. ~2 т.п.н. участок гомологии в положении апстрим) вырезали из геля и очищали с использованием стандартных методик (со смолой (ДаКХ).

Второй набор олигонуклеотидов:

17766Е 5'-ССТСАТССАТСТССАССАССТСССАС6ТСААТТСТСССС6-3' (5Е<2

ГО N0:6) и

19763В. 5' -ССОСААССТТСТССТСССТСАССТТСААСАТСС-З' (5Е0 ГО

N0:7) использовали для амплификации области гомологии в положении даунстрим с использованием космиды ΤΕ3006 (δΕΡ ΙΙ) ΝΟ:3) в качестве матрицы и ДНК-полимеразы ΚΟΏ. Продукт амплификации обрабатывали полинуклеотидкиназой Т4 (ΝΕΒ) и клонировали в вектор риС18, который дефосфорилировали под воздействием щелочной фосфатазы креветки (КосЬе). Полученный конструкт тщательно проверяли рестрикционным расщеплением и секвенировали для определения того, была ли получена желаемая последовательность, и что во время полимеразной амплификации в последовательность не были

- 29 023848 включены ошибки. Данный конструкт расщепляли с помощью НшбП и ΝκΠ, и продукты анализировали с использованием гель-электрофореза. Полосы, содержащие нужную последовательность (т.е. ~2 т.п.н. участок гомологии в положении апстрим) вырезали из геля и очищали с использованием стандартных методик (со смолой ΟίοΕΧ). Вектор рКС1139 расщепляли с помощью ЕсоШ и НшбП, и больший фрагмент вектора выделяли с использованием гель-электрофореза и очищали стандартными методами (со смолой ΟίαΕΧ). Выделенные гомологичные фрагменты, находившиеся в положениях апстрим и даунстрим, затем клонировали в данном фрагменте в рКС1139 путем трехкратного лигирования с получением желаемого конструкта с делецией кГаА.

В другом альтернативном способе получения конструкта с делецией кГаА используется коммерческий набор для синтеза генов (например, от Сеп8спр1 или другого производителя) для получения конструкта, содержащего нужную последовательность (8ЕЦ ГО N0:8). Коммерческий конструкт расщепляли с использованием ВатН и ХЪа! с вырезанием последовательности, представляющей интерес, и продукты анализировали гель-электрофорезом. Полосу, содержащую желаемую последовательность (~4 т.п.о.), вырезали из геля и очищали, используя стандартные методики. Вектор рКС1139 расщепляли с помощью ВатШ и ХЪа! и больший фрагмент вектора выделяли с использованием гель-электрофореза и очищали стандартными методами. Затем оба выделенных фрагмента лигировали вместе с получением желаемого конструкта с делецией кГаА.

Альтернативные конструкты с делецией кГаА вводили в 81гер!отусек кр. А92-308110 (Ό8Μ9954) путем конъюгации, и проводили отбор вторичного кросса, используя способы, описанные в примере 1.2. Выращивание и анализ штаммов, полученных таким и другими способами, описано в примере 1.2.

Пример 3.

Схема подпитки мутанта с делецией кГаА.

Концентраты спор мутантов с делецией кГаА (ВЮТ-4452 или ВЮТ-4585) получали после роста на средах МАМ, ШР4, ШР3 или ЦР2, и их хранили в 20% мас./об. растворе глицерина в дистиллированной воде при температуре -80°С. Вегетативные культуры (посевные культуры) получали путем посева концентрата спор (1% об./об.) в 7 мл посевной среды (среда 8Μ25) в 50-мл центрифужных пробирках с противопенной вставкой. Пробирки с культурой инкубировали при температуре 27°С и 250 об/мин (амплитуда 5 см) в течение 48 ч. Аликвоту посевной культуры (10% (об./об.)) переносили в 50-мл центрифужные пробирки с противопенной вставкой, содержащие 7 мл продукционной питательной среды 8СР-2. Культивирование проводили при температуре 24°С и 300 об/мин (амплитуда 2,5 см). Для продуцирования мутасинтетических аналогов санглиферина через 24 ч после инокуляции в каждую пробирку добавляли 0,05 мл раствора 0,32 М (в 1н. НС1) подпитывающего соединения (мутасинтон) до конечной концентрации 2 мМ. Кроме того, на 24 часе культивирования в каждую пробирку добавляли 0,05 мл раствора 0,32 М пиперазиновой кислоты (в метаноле) до конечной концентрации 2 мМ. Культивирование продолжали еще в течение четырех дней после подпитки.

Образцы подвергали экстракции путем переноса 0,8 мл полного бульона в 2-мл закрытую пробирку Эппендорфа. В нее добавили 0,8 мл ацетонитрила вместе с 0,015 мл муравьиной кислоты. Затем смесь встряхивали в течение 30 мин на вибростоле АЪЪгах. Затем пробирки поместили в центрифуги и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин, после чего отбирали 0,15 мл супернатанта для анализа. Экстракты анализировали, как описано в разделе Общие способы.

В табл. 1 показаны мутасинтоны, которыми подпитывали культуры таким способом, вместе с результатами ЖХМС для Н+ и №Е аддуктов, ожидаемые молекулярные массы и время удерживания продуктов мутасинтеза санглиферинов. Показаны также основные пики, относящиеся к аналогам санглиферина А. Во всех случаях также показаны пики ЖХМС для аналогов санглиферина В (масса - 18).

Таблица 1

>5 8 В δ С И О с	к О в щ 2 ϋ £5 в &	Название мутасинтона	Наблюдаемая	N я \ К Р а з· а > <5 а т 1 2	Наблюдаемая	+ я έ Л “ N Я > § η	Молекулярная	2 Ф пЗ Я О О §	са а * ф ч
		2-амино-З-(3-фтор-
у	т ΝΗ3	5-гидроксифенил)
т		пропаноевая
		кислота	1106, 4	ИЗО, 4	1107,4	5,7
		метил-2-амино-З-
	χν. ,,ι_υ»ινΐ6
О	Ύ.	(З-фтор-5-
т		гидроксифенил)
		пропионат	1106, 4	ИЗО, 4	1107,4	5,7

- 30 023848

Пример 4.

Выделение 63-фтор-санглиферина А, промежуточного соединения 14.

Ферментацию проводили, как описано в разделе Общие способы, с использованием метил-2амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноата и ОЬ-пиперазиновой кислоты в качестве предшественников, которые были добавлены на 26 часе культивирования.

После сбора культуральных бульонов их объединяли, и их рН доводили приблизительно до 3 с использованием муравьиной кислоты, затем бульон центрифугировали (3300 §) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы из осветленного бульона. Осветленный бульон удаляли после анализа, в котором подтвердили, что в нем присутствует менее 5% целевого соединения настоящего изобретения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч с использованием магнитной мешалки. Ацетонитрильный экстракт отделяли центрифугированием или под действием силы тяжести. Вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом проводили в тех же условиях. Объединенные ацетонитрильные экстракты концентрировали до остаточного водного объема при пониженном давлении, и затем рН доводили до 6. Полученную смесь дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические слои сушили досуха при пониженном давлении с получением конечного неочищенного продукта (1,3 г).

Полученный неочищенный экстракт (1,3 г) растворяли в этилацетате (2 мл) и наносили на колонку с силикагелем (10x2 см), кондиционированную этилацетатом (500 мл). Колонку элюировали этилацетатом и затем этилацетатом со ступенчатым увеличением концентрации ацетона (10, 20, 30% и т.д.) в этилацетате. Собирали приблизительно 250 мл фракций, объединяли и сушили досуха. Целевое соединение определяли аналитической жидкостной хроматографией. Полученный материал (278 мг) растворяли в метаноле (1,8 мл) и очищали препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Аа1егк Х!егга ΜδΟ8 (10 мкм, 19 смх250 мм) с расходом растворителя 21 мл/мин. Растворитель А представлял собой воду, растворитель В представлял собой ацетонитрил. Колонка работала в изократическом режиме: 50% растворителя В в течение 6 мин после введения пробы, с последующим градиентом до 100% В за 30 мин. Чистые фракции определяли методом ВЭЖХ с ультрафиолетой детекцией и их объединяли. Полученные фракции выпаривали досуха при пониженном давлении с получением целевого соединения в виде не совсем белого аморфного твердого вещества (20 мг).

Пример 5.

Синтез диэтил(2-( 1,2-оксазинан-2-ил)-2-оксоэтил)фосфоната п ° О О

-Ж^С1 Р(0Е1), >Ч|ЛЛ!~ов —- О ^ой

21-1 21-2 21

К раствору соединения 21-1 (СЬетСо11ес1, Германия) (100 мг, 0,81 ммоль) и Ε!₃Ν (246 мг, 2,43 ммоль) в сухом ЭСУ (5 мл) добавляли по каплям хлорангидрид хлоруксусной кислоты (138 мг, 1,22 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, выливали в ледяную воду и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным раствором соли и сушили над №₂δΟ₄, затем фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток (соединение 21-2) использовали для следующей стадии без какой-либо дополнительной очистки (123 мг, выход 90%).

Смесь соединения 21-2 (123 мг, 0,75 ммоль) и триэтилфосфита (250 мг, 1,50 ммоль) перемешивали при 140°С в течение 6 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и очищали флэшхроматографией с получением соединения 21.

Альтернативный синтез диэтил(2-( 1,2-оксазинан-2-ил)-2-оксоэтил)фосфоната

а-1 21а-2 21а-3

Общая методика получения соединения 21а-2

НО, ,Вос N Н

21а-2 а-1

К раствору трет-ΒиΟК (84,0 г, 0,75 моль) в тетрагидрофуране (2,0 л) добавляли порциями при комнатной температуре соединение 21-1 (50,0 г, 0,38 моль) и смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем добавляли по каплям при комнатной температуре 1,4-дибромбутан (81,2 г, 0,38 моль). Смесь перемешивали при температуре 80°С в течение 16 ч. После охлаждения добавляли воду (2000 мл) и смесь экстрагировали этилацетатом (2x1000 мл). Затем объединенные органические слои

- 31 023848 сушили над безводным №-ь8О₄ в течение 16 ч и после фильтрования и концентрирования остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: петролейный эфир:этилацетат в соотношении от 100:1 до 10:1) с получением соединения 21а-2 (57 г) в виде бесцветного масла.

Общая методика получения соединения 21а-3

21а-2 21а-3

К раствору соединения 21а-2 (55 г, 0,29 моль) в трет-бутилметиловом эфире при комнатной температуре добавляли ТВМЕ (80 мл) в виде раствора в 4н. НС1 в (600 мл, в ТВМЕ), смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Осажденное твердое вещество отфильтровывали и промывали ТВМЕ (50 мл) с получением соединения 21а-3 (30 г) в виде белого твердого вещества.

Общая методика получения соединения 21

21а-3

ГН θΙΗ НС!

Είθ' ОЕ1 .ОН

ΕϋΟΙ/ΗΟΒΤ

21а-4

К перемешиваемому раствору соединения 21а-4 (35 г, 0,18 моль), гидроксибензотриазолу (НОВТ) (29 г, 0,21 моль) и Ε!₃Ν (71 мл, 0,51 моль) в безводном дихлорметане (550 мл) добавляли порциями при температуре 0°С 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ΈΌί'.Ί) (41 г, 0,21 моль).

Реакционную смесь перемешивали при температуре 0°С в течение 0,5 ч, затем добавляли соединение 21а-3 (24 г, 0,20 моль) при температуре 0°С и перемешивали в течение 16 ч. ТСХ (петролейный эфир/этилацетат: 3/1) показала, что реакция завершена. Затем реакционную смесь медленно выливали в воду (500 мл) при энергичном перемешивании.

Смесь экстрагировали дихлорметаном (2x200 мл). Объединенный органический слой промывали насыщенным раствором соли (2x100 мл), сушили над №₂8О₄, фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта. После проведения хроматографии (петролейный эфир/этилацетат, от 100:1 до 10:1) получали соединение 21 (38 г) в виде желтого масла.

Пример 6.

Получение промежуточного соединения 23-3

К перемешиваемому раствору соединения 14 (430 мг, 0,38 ммоль), (ПНЦ)₂РНАЬ (18,6 мг, 0,024 ммоль), тетраоксида осмия (0,156 мл, 0,012 ммоль) в трет-бутиловом спирте (2,5 мас.%, 0,079 ммоль/мл) и метансульфонамида (74 мг, 0,77 ммоль) в 20 мл трет-бутилового спирта добавляли при комнатной температуре раствор феррицианида калия (382 мг, 1,16 ммоль) и карбоната калия (160 мг, 1,16 ммоль) в 20 мл воды с получением коричневой эмульсии. Через 2 ч добавляли раствор сульфита натрия и перемешивание продолжали в течение 20 мин. Полученную смесь экстрагировали этилацетатом (3x50 мл). Объе- 32 023848 диненные органические слои промывали насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении и затем очищали хроматографией с обращенной фазой с получением соединения 23-2 в виде твердого белого вещества.

К перемешиваемому раствору соединения 23-2 (240 мг, 0,21 ммоль) в 24 мл смеси 2:1 ТНР и воды добавляли периодат натрия (91 мг, 0,42 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и затем добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия. Полученную смесь экстрагировали тремя порциями этилацетата. Объединенные органические слои промывали одной порцией воды и двумя порциями насыщенного солевого раствора, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали флэшхроматографией с обращенной фазой с получением соединения 23-3.

Пример 7.

в безводном ТНР (0,2 мл) при 0°С при перемешивании. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не стал прозрачным. Затем к прозрачному раствору добавляли соединение 23-3 (30 мг, 0,042 ммоль) и смесь перемешивали при 20°С в течение 2 ч. Смесь гасили водой (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой промывали насыщенным раствором соли, сушили над Ыа^О₄, фильтровали и выпаривали в вакууме. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ с получением соединения 24 в виде твердого белого аморфного вещества.

Пример 8.

Получение соединения 24 в твердой кристаллической форме (форма I).

мг аморфного соединения 24 суспендировали в метилизобутилкетоне (ΜΕΚ) (500 мкл, 50 объемов) и затем циклически изменяли температуру между температурой окружающей среды и температурой 40°С каждые 4 ч в течение в общей сложности 5 дней. Полученное твердое вещество выделяли путем декантации избытка растворителя с последующей сушкой в вакууме, получая соединение 24 в твердой кристаллической форме (форма I). Дифрактограмма ΧΚΓΌ формы I соединения 24 показана на фиг. 2, и пики и их относительные интенсивности приведены в табл. 2 ниже. Метод получения данных ΧΚΓΌ описан в разделе Общие способы.

- 33 023848

Таблица 2

Пример 9.

Биологические данные анализа для репликона НСУ.

В анализе для репликона генотипа 1Ь с использованием клеток НиН5.2, как описано в разделе Общие способы, были проанализированы следующие соединения, которые были включены в анализ для сравнения: циклоспорин А (соединение 1), ΌΕΒΙΘ-025 (соединение 2), санглиферин А (соединение 5) и гидроксимакролид (соединение 6).

Соединение	ЕСбо (мкм)	СС5о (мкм)	Индекс селективности (ССбо/ЕСзо)
Циклоспорин А, 1	0, 62	2Θ	52
Г)еЫо-025, 2	0,096	11,2	111
Санглиферин А, 5	0,31Θ	9, 1	2Θ, 7
Гидроксимакролид, 6	8,4	Θ3, б	9, 9
Соединение 24	0,033	>100	>3030

Как видно из данных таблицы, соединение 24 (соединение по изобретению) является значительно более эффективным по данным анализа репликона в НиН5.2 (как показано низким значением величины ΕС5сι) и имеет значительно лучшую селективность в отношении клеточной линии (как показано высоким индексом селективности) по сравнению с СкА, ОеЫо-025, ЗГА и гидроксимакролидом.

Пример 10.

Биологические данные по активности против ВИЧ.

В противовирусном анализе для ВИЧ с использованием клеток НеЬа, как описано в разделе Общие способы, были проанализированы соединения, которые были включены в анализ для сравнения: циклоспорин А (соединение 1), ΌΕΒΙΘ-025 (соединение 2) и противовирусные препараты эмтрицитабин и

- 34 023848 тенофовир, применяемые в случае ВИЧ-инфекции.

Соединение	ЕСьо для клеток НеЬа (мкМ)
Циклоспорин А, 1	5, 3
ΏΕΒΙΟ-025, 2	1,5
Эмтрицитабин	0,4
Тенофовир	1, 05
Соединение 24	0, 13

Как видно из данных, приведенных в таблице, соединение 24 (соединение по изобретению) при ингибировании ВИЧ-инфекции в данном анализе является значительно более эффективным, чем СзА, ΌΕΒΙΟ-025, эмтрицитабин и тенофовир.

Пример 11.

Биологические данные по фармакокинетике на мышиных моделях ш νί\Ό при пероральном и внутривенном введении.

Для оценки фармакокинетики соединений в условиях ш У1уо, соединения вводили в дозах 10 мг/кг или 5 мг/кг (п/о) и в дозе 1 мг/кг (в/в) группам мышей СО 1. Фармакокинетический анализ проводили, как описано в разделе Общие способы. Полученные фармакокинетические параметры приведены ниже.

Соединение	Доза (мг/кг)	Клиренс (л/час/кг)	АиС1ае^ при п/о введении (нг*час/мл)
Санглиферин А, 5	10	0, 054	2332
Соединение 24	5	0, 017	8223

Как видно из данных, приведенных в таблице, соединение 24 (соединение по изобретению) имеет сниженный клиренс и повышенное пероральное действие (как показывает высокое значение АИС_1аз! (величина АИС за 24 ч) при пероральном введении), по сравнению с санглиферином А.

Пример 12.

Биологические данные по ингибированию РРЕазной активности СурА.

Для оценки прямого ингибирования пептидил-пролил(цис-транс)-изомеразной (РРЕазной) активности СурА, был использован метод, как описано в разделе Общие способы. Циклоспорин А (соединение 1), ΌΕΒΙΟ-025 (соединение 2) и санглиферин А (соединение 5) использовали в качестве контроля.

Соединение	1С50 ДЛЯ СурА, (нМ)
Циклоспорин А, 1	9,7
ϋΕΒΙΟ-025, 2	0, 8
Санглиферин А, 5	2, 4
Соединение 24	0,31

Как видно из данных, приведенных в таблице, соединение 24 (соединение по изобретению) ингибирует РРЕазную активность СурА более эффективно, чем санглиферин А, ΌΕΒΙΟ-025 и циклоспорин А.

Пример 13.

Биологические данные по ингибированию транспортеров билирубина.

Для оценки возможности нецелевого ингибирования транспортеров билирубина, что считается причиной ограничения дозы при гипербилирубинемии, наблюдаемой в случае применения ΌΕΒΙΟ-025, проводили анализ ингибирования транспортеров, как описано в разделе Общие способы.

Соединение	ОАТР1В1, 1С5О (мкМ)	ОАТР1ВЗ, 1С5о (мкМ)	МКР2, 1С5о (ыкМ)	МЕРЗ, 1С50 (мкМ)
Циклоспорин А, 1	0, 85	0, 13	4,1	3,1
ЬЕВЮ-025, 2	0, 45	0, 19	16, 0	>50
Соединение 24	4,3	1,8	>50	>50

Как видно из данных, приведенных в таблице, соединение 24 (соединение по изобретению) демонстрирует существенно меньшее ингибирование конъюгированных и неконъюгированных транспортеров билирубина, по сравнению с ΌΕΒΙΟ-025 и циклоспорином А.

Пример 14.

Биологические данные по ингибированию транспортеров ксенобиотиков.

Для оценки эффективности предотвращения лекарственных взаимодействиях (ΌΌΙ) путем ингибирования транспортеров ксенобиотиков, проводили ш уПго анализ ингибирования Р-гликопротеина (Рдр/МОК1) и эффлюксного насоса желчных солей (Β8ΕΡ), как описано в разделе Общие способы.

Соединение	Рдр 1С50, (мкМ)	ВЗЕР 1С5о, (мкМ)
Циклоспорин А, 1	0, 73	0, 46
ϋΕΒΙΟ-025, 2	0, 72	0, 18
Соединение 24	>50	12, 3

Как видно из данных, приведенных в таблице, соединение 24 (соединение по изобретению) показывают существенно меньшее ингибирование транспортеров ксенобиотиков, которые вовлечены в лекарственные взаимодействия, по сравнению с ΌΕΒΙΟ-025 и циклоспорином А.

- 35 023848

Цитированные источники.

ΑρρεΙ, Ν , Т ЗсРаНег, е( а1 (2006) Ргот з1гис(иге ΐο ίιιηοΐιοη пей/ тз1дР1з ιηίο Рераййз С игиз ΡΝΑ герНсайоп *' ΰ ΒιοΙ СЬет 281(15) 9833-6

Вап1ей, Α,, Р. Мадпег, е! а1, (2001), Зуп1Рез13 οΐ Рег|уайуез οί 1Ре πονθΙ сус1орр|1т-ЫпсНпд 1ттипобирргез5ап1 запд1НеРпп А чл/ιΐή геРисеР питЬегз οί ро1аг Гиηοίΐοπε. Вюогд Мер СЬет Дей 11(12): 1609-12.

СРайер!, и., М. ВоЬагРД е! ак (2009). ТРе 1зотегазе асйуе 8ΐίβ οΐ сус1орЫНп а 18 спйса! 1ог НС\/ герНсайоп, ΰ ΒιοΙ СЬет.

Со1дап, Ρ., М. Дата!, е! а1. (2000). 1&о1аГюп, сРагас1епга1юп апб 1агде1еР Ρίεηιρίίοη οί тоизе рр1а: сус1орр|1т Α ΐε ηοί еззепйа! Гог таттаПап се11 маРНКу. Оепотюз 68(2): 167-78.

СгаЬЬе, К., С, Уиадтаих, е1 а1. (2009), Ап еуа1иа!юп οΐίΡθ ογοίορίιίϋπ ίηΡϊΡιΐοΓ ϋ«Ρία 025 апр Из ро1епйа1 аз а 1геэ(теп1 Гог сРгопю Рераййз С. ЕхреР Ορίη 1пуезйд Ргцдз 18(2): 21120.

ΡοΙίηβΜ, К., 3. Μιιιγ, е! а1. (1997). АН εγοΙορΓιιΙιηε апр РК506 Ьтртд ρΓοΙθΐηε аге, тр|у|риа11у апр соНесйуе1у, Р1зрепзаЫе ίοΓ у1аЫ1Иу ιη ЗассРаготусез сегеУ151ае. Ргос Май АсаР За и 3 А 94(24): 13093-8.

Е. ДачуИг, Р. Р„ Т. Ыдиуеп, М. Ниапд, Р, Ке, Р. Ргаев1даагР, ϋ. Зегга, Μ. ΚοζίθΙ, Т. Еуапв (2009). 5а1е1у Апр АпЙУ1га1 ЕТПсасу Οί 14 Рауз Οί ТРе СусорЫНп ΙηΡίΡιίοΓ Νιιτιδί 1 Ιη СотЫпаПоп ννϊΙΡ Реду1а1еР ΙηίβιίβΓοη ,2а Ιη Ре1арзеР Оепо(уре 1 Ηον IпГес(еР Райеп(з. Роигпа! οί Нера1о1оду 50(51): 5379.

Едопп, Μ. Τ, Τ. Р. ДадаКи1а, е1 а1. (2002). РРагтасокшейсз, Иззие р1з1пЬийоп, апр те1аЬоНзт οί 17-(р|те1Ру1ат1пое1Ру1ат1по)-17-Рете1Рохуде1Рапатус1п (N50 707545) т СР2Р1 писе апр ΡίεοΡβΓ 344 га1з. Сапсег СРето1Рег РРагтасо! 49(1): 7-19.

РеРг, Τ., Р. КаНеп, е1 а1. (1999). ’Запд1ГеРппз А, В, С апр Ρ, ηονθΙ сус1орРШп-Ыпр1пд οοηηρουηΡε 1зо1а1ер Ггот 51гер1отусез зр. А92-308110. II. 51шс1иге е1ис1Райоп, 5(егеосРет1з1гу апр рРуз1СО-сРет1са1 ргорегйез. Ρ Αηίίβιοί (Токуо) 52(5): 474-9.

РНаак, А. НогЬап, е1 а1. (2008). ТРе сус1орр|1ш ίηΡίΡΐΙΟΓ РеЬю-025 εΡον/ε ро1еп1 апйРераДйз С е(Тес1 ίη райеп!з со1пТес1еР ννιΙΡι Рераййз С апр Ритап 1ттипоРейс1епсу угиз. Нера1о1оду 47(3): 817-26.

Ригтзз, В. 3., Ригтзз, Α.Ι., Уоде1, Α.Ι., ЕР. (1989). УодеГз ТехФоок οΐ Ргасйса! Огдап1с СРет1з1гу. РгепЙсе На11.

ОаКРег, Д. А., Вогау/зкк Р„ АпРегзоп, Д, Р„ Ва1аЬатз, К, А. е1ак, (2010). “Ми1Йр1е сус!орРН1пз ϊηνοΙνβΡ ίη ΡιΐίθΓθηΙ сеНи1аг ра!Ру/ауз тер1а1е НСУ геоПсайоп У|го1оду 397: 43-55 <31аутаз, Н., Кгадсзь Р., Сзегерез, Р., ЗагкаРД В. (2004). ТРе го1е οί АВС (гапзроПегз ϊη ргид ге®1з1апсе, те1аЬо11зт апр Ιοχίαίγ. Сигг. Ргид. РеНу. 1(1): 27-42.

- 36 023848

Οογπθζ, Ь, Η. ТЫЬаиИ, е( ак (2007). Iηήίόίϋοη οί тЬосЬопбпа! регтеаЬНКу (гапзбюп 1тргоуез 1ипс(юпа1 гесоуегу апб гебисез тоба1Иу То11о\лбпд аси(е туосэгб1а11пТагс1юп ίη ιτιίοβ. Ат б РЬуз1о1 Неаб Скс ΡήνΒίοΙ 293(3): Н1654-61.

Οοίο, К., \Л/а1азМ, К., 1поие, б., Н[рка1а. Μ., 5Ыто1оЬпо, К. (2009)‘1беп(1Йса1юп οΐ се11и1аг апб νϊΐΒΐ Тас1огз ге1а1еб (о ап(|-Ьера1Шз С νίπιε ас(м(у οί ογοίορΚϊΙίη <пЫЬ<1ог” Сапсег баепсе 100(10): 1943-1950

НапоиПе, X., Ваб|По А, (Л/1егиз2езк16М, Уегбедет ϋ, Ьапбпеи I, ВаПепзсЫадег В, РеЫп Р, Ыррепз С (2009). НераООз С νΐηΐ5 Ν55Α ρτοίθΐη ϊε а зиЬз1га!е ϊογ 1Не РерЙбу1-Рго1у1 азЛгапз 18отегазе асйуйу οί Сус1орЬН1пз А апб В. б ΒίοΙ СЬет.

Набе1, С,, Р. 1ЫЬег, е1 а1. (2006). 1ттипозирргезз|уе асйуКу о((Ье 1ттипорЫНп-Ыпб1пд бгид ЗапдПТеЬбп Α ίη Китаи νΦοίβ Ыооб: ро1еп! ίηήίΚίΙίοη οΐ 1п(ебеик1п-6 ргобисеб Ьу 1утрЬосу1ез апб топосу1ез. Зсапб б 1пптипо1 63(1): 26-34.

Негбег, Μ,, Н. Вапд, а( ак (1994). С1оп1пд апб сЬагас(ебга(юп οί ρρίΒ, а ВасН1из зиЫН18 депе ууЫсЬ епсобез а сус1озропп А-зепз^уе рерМбу1-рго1уI С13-1гапз 1зотегазе. Мо1 МюгоЬю! 11(6): 1073-83.

НКе, М., Титег, 5., Ребапа, С. (2003). “Раб 1: Ога! беНуагу οί рообу зоЮЫа бгидз”. РЬагтасеиНса! Мат/ас1иппд апб РаскИд 5оигсег. Зиттег 2003 1$зие.

1ттеске, 5.Ν., Ваа1., Ν, е1 ак (2011). “ТЬе Сус1орЫНп-В|пб1пд Адеп! 5апд1НеЬпп А 1з а ОепббИс Се11 СЬеток1пе апб кПдгайоп ΙηΙηίβίΙΟΓ.” РЬОЗ опе 6(3):е18406

1поие, К., К. 5ек!уагт1а, е1 а1. (2003). СотЫпеб 1п(ебегоп а1рЬа2Ь апб сус1озропп Α ίη 1Ье 1геа1теп1 οί сЬгопс Ьера1Шз С: соп(го11еб 1па1. б Оаз(гоеп(его1 38(6): 567-72,

1поие, К., Т, итеЬага, е1 а1. (2007), Еуа1иайоп οΐ а сус1орЬШп 1пЫЬИог ίη ЬераШз С уииз1пТес1еб сЫтепс ηιίοε ίη νίνο. Нера1о1оду 45(4): 921-8.

1зЬн, Ν., К. \Л/а1азЬ|, е1 а1. (2006). 'ΌίνβΓεβ еТГес1з οί сус1озроппе оп Ьераййз С νίτυδ з(га1п герНсайоп. б У1го1 80(9): 4510-20.

Ке, б., Е. Ь, К. Βοζιθγ, Т. МагЬигу, Ν. Ыдиуеп, ϋ. Зегга, К. Оо1е, б. Ргаез1даагб, М. Ниапд, Т. Еуапз (2009). “5аГе1у, Апб То1егаЬШ(у Οί Νίιτπδ 11, Α ΝονβΙ Сус1орЫ1т 1пЫЬбог Рог Нсу, РоНоибпд 5пд1е Апб МиШр1е Азсепбюд Оозез 1п НеаИЬу \/о1ип(еегз Апб Нсу-1пТес1еб РаИеЫз. боигпа! οί Нера1о1оду 50(51): 5229.

басоЬзоп, I., МсНи(сЫзоп, 60, 5и1коуузк|, М. (2007). Оаз(гоеп(его! & Неиа1о1 3(534): 1-10.

КаИеп, б., К. Зебгапк е1 ак (2005). 31гис(иге οί Ьишап сус1орЬίΐίη Α ίη сотр1ех ννίίή (Ье ηονβί 1ттипозирргеззап1 запд!ИеЬпп А а( 1.6 А гезо!и(юп. б ΒίοΙ СЬет 280(23): 21965-71.

- 37 023848

Камуазакь Η., Ε. 5. Мосагзк!, е! а1. (2007). Сус1озроппе ίηίιίϋϊΐΒ тоизе су1отеда1оу|гиз ΐηΐθοίΐοη νϊθ а сус1орЬШп-йерепйеФ рафу/ау зресШсаИу ίη пеига! з1ет/ргодепКог се11з. й У1го1 81(17): 9013-23.

Котд, ϋ. Н., О1аезег, Μ. ΚθίβθΓ, К. Мапйегу, и. ΚΙοΙζ апй Μ, Р. Рготт (2010), Ргид Ме1аЬ ΡΙ3ΡΟ5, 39, 1097-1102.

Маппз, Μ. Р., С. В. Роз(ег, е( ак (2007). ТЬе ууау ίοηΑ/агй ίη НСУ 1геа1теп1-ЯпсПпд (Не пдЫ раФ. 14а1 Кеу Ргид Ρίβοον 6(12): 991-1000.

МагОп СаЬге)аз, Ь. М., 3. РоЬгЬасЬ, е1 а1. (1999). МасгоНйе Апа1одиез οίΦβ Νονβί 1ттипозирргеззап13апд1ИеЬпп: Νβνν ΑρρίκΦίοη οίΙΗβ РФд-С1оз1пд Ме1аФе813 Реасйоп. Апдеу/ СЬет Ιηί Εά Епд! 38(16): 2443-2446.

МаФу, Й. Е., 3. Ма, е1 а1. (2003). СотЫпайопз οί сус1орЫНп ίπήίΟίΙοΓ ΝΙΜ811 ννΐίή ЬераНйз С \/ίгиз Ν53-4Α РгФеазе ог Ν35Β ро!утегазе ΐηήίЬНогз епЬапсе аФмга! ас1м1у апй зирргезз Фе етегдепсе οί гез151апсе. АпИтюгоЬ АдеФз СЬетоФег 52(9): 3267-75.

Ме1п1коуа, I. (2008). НераИйз С Фегар1ез. ЫаФге Кеу Ргид Р8зс 7: 799-800.

МеНегп1сН, Ρ., Ρθηηί, Р., ТКак В, 5ейгап( Р. (1999). Толагй а То1а1 ЗупФез15 οίίΐιβ 1ттипозирргеззап15апд1№еЬпп А. Ргерагайоп οΐΤννο Ре1ау Сотроипйз Ьу Редгайайоп апй ΤήβϊΓ изе ίη 1Ье РеаззетЫу оНЬе ЫаФга! Ргойисй Й. Огд. СЬет. 64: 9632-9639.

МП1ау, Ρ. Ρ., М. А. ЗагдеФ, е! а1. (2008). бепейс апй рЬагтаса1одю ίηίιϊόίΐίοη οί тИосЬопйпа1-йерепйеп1 песгоз15 аНепиа1ез тизси1аг йузкорЬу. Ыэ1 Мей 14(4): 442-7.

ΝεΙβοη, Р. В., ОЬаИЬ, Р.Н., Зи1коу/зк1, М., ЗсФф Е., Риз1д|, V., Роскгоз, Р.Й., Аапд, С., РесозФгй КегЬие1, Р,, апй Р. Сгоздигт, РогсЬе1, Н., СгаЬЬе, Р, (2009), Е1йсасу Апй 5а1е1у Οί ТЬе Сус1орЬНФ 1пЫЬИог РеЬю 025 1п СотЫпаЙоп \МФ Реду1а(ей 1Фейегоп А1рЬа-2а Апй Ρίόβνίπη Ιη Ргеу|оиз1у ЫиП-Резропйег Оепо1уре 1 Нст РайеФз. йоигпа! οί Нера1о1оду 50(51):540.

Νίνι/а, Т., УатятФо, 3, ЗаИо, М, ЗЫгада, Т, Такадц А. (2007). ΕίΦοί οί Сус1озроппе апй ТасгоПтиз оп СуФсЬготе Р450 АсФчйеб ΐη Нитап Ьйег Мюгозотез. Уакиоаки газзЫ 127(1):209-216.

РаезЬиузе, Й„ А. Каи1, е1 а1. (2006). ТЬе попчттипозирргеззке сус1озропп РЕВЮ-025 13 а ро1еп11пЬ|Ы1ог οί Ьераййз С 'Физ герНсаЙоп ίη νίίτο. Нера1о1оду 43(4): 761-70.

Рагйетик, А., Й. Йагозгеудсг, е1 а1. (2007). 5рес№са11у 1агде1ей ап1мга1 1Ьегару 1ог Ьераййз С νίπΐ5. УУогФ й 0аз1гоеп1его113(43): 5673-81.

- 38 023848

РамЫзку, б. Μ. (2000). Нераббз С νίπιβ гез1з1апсе Ιο ап1мга1 1Ьегару. Неоа1о1оду 32(5): 889-96.

Ра\л/1о1зку, <λ М. (2005). Сиггеп! апб Ю1иге сопсер1з ΐη Ьераййз С 1Ьегару. 8βηηίη Цуег Ρί3 25(1): 72-83.

Раи/1о1зку, б. М, (2006). 'Мго1оду οί Ьера11бз В апб С У1гизез апб ап1Мга11агде1з, б НераЮ! 44(1 5ирр1): 510-3.

РетЬебоп, Т, б. апб б. Е. Кау (2003), Сус1орЫНп δεηεΐΐΐνίίγ ίο запд1НеЬбп А сап Ье согге1а1еб 1о 1Ке зате зреете 1гур1орНап геыбие аз сус1озропп А.” РЕВ5 1_еб 555(2): 335-40.

Роскгоз, Р. (2008). Етегдтд ТЬегар1ез Тог СЬгопю Нераййз С \бгиз. Оаз1гоеп1его1 апб НераЫоду 4Η01: 729-734.

Р1ак, Р. С., Р. А. СаНау, е1 ак (2008). IпЫЬШоп οί Ьитап 1ттипобебдепсу νίιυβ ΐγρθ 1 герОсайоп ΐη Ьитап сеПз Ьу ОеЬю-025, а ηονεΙ сус1орЬίΙΐη Ыпбюд адеп1, АпбтюгоЬ АдеШз СЬегтюбтег 52(4): 1302-17.

С5и, X., б!апд, Ν. е1 ак, (2011). С1отпд, зедиепсид апб сЬагаскепгабоп оНЬе ЬюзуШЬебс депе с1из1ег οί запдП1еЬпп А, а ροϊβηί сус1орЬίΐίη ϊηΐηΐόϊΙΟΓ. ΜοΙ. Вюзуз!. 7:852-861

РоЫба, б. Μ., Н. В. Νβΐ3οη, θί ак (2007). СЬагайепгабоп οί Ьераббз С νίιυβ зиЬдепопгис герКсоп гез181апсе ίο сус1озроппе ΐη νίίΓο. б У1го1 81(11): 5829-40.

Норктз, 5. ϋ. Η., Е. 6ау|з, б, Ьа1егал, Е. О1и1гег, В, ΟίΜβεβίΓηο, Р. Ризпак, 5. Аппд, С. Згтнбеу, Υ. апб ИЬей1 (2009). 5а1е1у, р1азта рМагтасоМпебсз, апб апб-У1га1 асбуку οί 5СУ635 ΐη аби11 рабеп1з м1Ь сЬгопю Ьераббз С У1гиз ίπίθοΰοη. боигпа! οί НеракЯоду 50(51): 536,

5апдбег, б. б,, V. Оиезтаих, е! а1. (1999). 5апд1ИеЬг1пз А. В, С апб ϋ, ηονθΙ сус1орЬШпЬ1пб1пд сотроипбз 1зо1а1еб кот 51гер1отусез зр. А92-308110.1. Тахопоту, бетлеШабоп, ΐβοίθίίοη апб Ью1од1са1 асбуКу.'¹ б АпбЬю! (Токуо) 52(5): 466-73.

5сЬпе1бег, Μ. ϋ. (2005). ''Сус1орЫНп О: кпоскюд оп беаИУз боог. £α ЗТКЕ 2005(287): ре26.

5ебгат, Р., б. КаНеп, е1 а1. (2003). 5апд1кеЬИп-сус1орЬШп ю1егасбоп: бедгабабоп чл/огк, зупбпебс тасгосусбс апа1одиез, Х-гау сгуз1а1 з1гис1иге, апб Ыпбтд ба1а. б Ат СЬет 5ос 125(13): 3849-59.

5ебеп,К. ϋ. Васк апб 3. КНоо (2010), б АпбтюгоЬ СЬетоШег. 65,1079-1085.

5т1(Ь, М. В. а, М., б,, Еб. (2001). МагсЬ’з абуапсеб огдатс сЬет1з!гу. боЬп УУЛеу апб 5опз 1пс., ик.

- 39 023848

51е1пзсМи11е, С., Т. Тапег, е1 а1. (2003). СиШпд ебде: запдПТеКпп А, а ηονθΙ сус1орЬШпЫпбтд 1ттипозирргез8ап1 Ыоскз Ыоасйуе IЬ-12 ргобисйоп Ьу Ьитап бепбпйс сеНз. б 1ттипо1171(2): 542-6.

31габег, ϋ. В., Т. \Л/пдЫ, е1 а1. (2004). О1адпоз18, тападетеп!, апб 1геа1теп1 οΐ Ьераййз С.”

Нера1о1оду 39(4): 1147-71.

ТторзсЬид, Μ., I. В. Ваг1Ье1тез5, е1 а1. (1989). 5епз11м1у 1о сус1озропп А15 теб1а1еб Ьу сус1орЫ11п ϊη Иеигозрога сгазза апб ЗассЬаготусез сегеу|31ае. №1иге 342(6252): 953-5.

ντοίϋк, ΰ. М., А. Каи1, е1 ак (2003). А герНсоп-Ьазеб Ьюаззау 1ог (Ье теазигетеп! οί Хебегопз ίη райеп1з ννίίή сЬгоп1с Ьераййз С. б У|го1 Ме1Ьобз 110(21: 201-9.

УУппд, 5. ,С. ννϊΙΙθ, С. Ке^егК К, Капбо1рЬ, А. ЗспЬпег апб 3. Норктз (2010), боигпа! οί Нера1о1оду, 52, 3263

Уапд, Ρ., б. М. КоЬоЮат, е1 ак (2008). Сус1орЬШп А13 ап еззепйа! соТасЮг Тог Ьераййз С У1гиз ίηίθοϋοη апб 1Ье рппс1ра1 тесНа1ог οΐ сус1озроппе гез1з1апсе ίη νίίτο. ϋ_\/ϊτοΙ 82(11):

5269-78.

гепке, Θ., и. 31п(1таИег, е1 а1. (2001). Запд1№еЬпп А, а ηονβί сус1орЬН1п-Ь1пб1пд сотроипб зЬомпд 1ттипозирргезз|уе ас1м1у \νίΙίι а пем тесЬатзт οί асйоп.” б 1ттипо1166(12):

7165-71.

Ζβυζβηη, 3. апб Е. Неггтапп (2002). Оупатюз οί Ьераййз С νίπΐ5 ϊηίθοίίοη.” Апп Нера1о1 1(2): 56-63.

2Ьапд, Ь Н. апб б. О. Ыи (2001). Запд1№еЬпп А, а ηονβί сус1орЬШп-Ыпб1пд 1гптипозиррге58ап1, ίηΝόϊΐβ IЬ-2-берепбеп1 Т се11 ргоЧегаЙоп аИЬе <31 рЬазе оНЬе сеИ сус1е. б 1ттипо! 166(9): 5611-8.

Все цитированные источники, включая патенты и патентные заявки, приведенные в настоящем описании, включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

В описании и формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово включать и его вариации, такие как включает и включающий, понимаются как включение указанного целого объекта или стадии, или группы целых объектов, но не исключает любой другой целый объект или стадии, или группы целых объектов или стадий.

Claims (9)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы (I) или его изомер, в котором С=С связь в положении С 26, 27, показанная в транс-форме, представляет собой цис-форму; или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Твердая кристаллическая форма соединения формулы (I) по п.1.
3. 3. Твердая кристаллическая форма по п.2, представляющая собой кристаллический полиморф формы I, пики на порошковой рентгеновской дифрактограмме (ХРКЭ) которой имеют следующие характеристики:

   - 40 023848

   Номер пика Положение [угол 2 тета,⁰] Относительная интенсивность [%] 1 6,2097 6,86 2 6,5031 7,76 3 8,2581 27,43 4 8,4838 33,64 5 9,5994 23,88 6 10,0981 8,54 7 11,0546 29, 76 8 12,5883 14,81 9 13,1703 ι 7,1 10 13,9184 100 11 14,2891 13,04 12 14,9759 10,37 13 15,3159 5,81 14 16,8844 18,15 15 17,1816 9,72 16 17,7384 53,03 17 18,1703 9,02 18 18,5613 32,19 19 19,0241 52,81 20 19,4201 5,06 21 20,0954 13,7 22 20,449 63,25 23 20,8962 43,44 24 21,1871 15,02 25 21,6388 16,08 26 23,0029 50,8 27 23,2869 17,19 28 23,6883 17,16 29 24,1071 13,7 30 24,2587 19,55 31 24,9948 13,34 32 25,209 26,16 33 25,9577 10,06 34 26,4298 9,38 35 27,3687 11,1

   29,0171

   29,5603

   30,0609

   7,95

   5,14

   7,35

   30,5824

   6,5

   32,1814
4. 4,39

   32,6521

   6,74

   33,5957

   6,6

   34,7946

   9,04

   4. Применение соединения по любому из пп.1-3 в качестве лекарственного средства для лечения вируса гепатита С (НСУ) или вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).
5. 5. Применение соединения по любому из пп.1-3 в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства.
6. 6. Фармацевтическая композиция, предназначенная для применения в качестве ингибитора циклофилина, содержащая соединение по любому из пп.1-3, в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
7. 7. Способ лечения вирусных инфекций, выбранных из вируса гепатита С (НСУ) или вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.
8. 8. Способ получения соединения формулы (I) по п.1, заключающийся во взаимодействии соединения формулы (У)

   Формула (V) где каждый К.ц представляет собой независимо Спалкил или бензил; с макроциклическим альдегидом (соединение формулы VI)

   - 41 023848
9. 9. Способ получения соединения формулы (I) в виде кристаллического полиморфа формы I по п.3, заключающийся в кристаллизации соединения формулы (I) по п. 1 из метилизобутилкетона.

   Фиг. 1

   Фиг. 2