PT2691412E - Composto macrocíclico e métodos para a sua produção - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO COMPOSTO MACROCÍCLICO E MÉTODOS PARA A SUA PRODUÇÃO Introdução A presente invenção refere-se a um análogo de sangliferina, que é útil tanto como inibidor de ciclofilina, por exemplo, no tratamento de uma infeção virai produzida por virus tais como o virus da hepatite C (VHC), o virus da hepatite B (VHB) e o virus da imunodeficiência humana (VIH) e/ou como imunossupressor, por exemplo, para a sua utilização na profilaxia de rejeição de transplantes, e como agente anti-inflamatório, por exemplo, para a sua utilização em transtornos inflamatórios. A presente invenção também proporciona o composto para a sua utilização em métodos em medicina, em particular para o tratamento de uma infeção por VHC ou VIH e para a sua utilização como agente imunossupressor ou anti-inflamatório, em doenças em que é útil a inibição do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) tal como distrofia muscular ou como produto intermediário na geração de outros compostos úteis em medicina.

Antecedentes da invenção

Hepatite C 0 virus da hepatite C (VHC) é um virus ARN de cadeia positiva, e a sua infeção é a principal causa de hepatite após uma transfusão. 0 VHC é a infeção crónica portada pelo sangue mais comum e é a principal causa de morte por doença hepática nos Estados Unidos. A Organização Mundial da Saúde estima que há mais de 170 milhões de portadores crónicos de infeção por VHC, o que constitui aproximadamente 3% da população mundial. Entre os pacientes infetados por VHC não tratados, aproximadamente 70%-85% desenvolvem infeção crónica por VHC, e, portanto estão em alto risco de desenvolver cirrose hepática e carcinoma hepatocelular. Nos países desenvolvidos, 50-76% de todos os casos de cancro hepático e dois terços dos transplantes de fígado devem-se a infeção crónica por VHC (Manns et al, 2007) .

Além das doenças hepáticas, os pacientes infetados de maneira crónica também podem desenvolver outras doenças crónicas relacionadas com o VHC, e servem como fonte de transmissão a outros. A infeção por VHC produz complicações não hepáticas tais como artralgias (dor articular), exantema cutâneo e dano a órgãos internos, principalmente ao rim. A infeção por VHC representa uma importante carga para a atenção sanitária global, e atualmente não há nenhuma vacina disponível para a hepatite C (Strader et al., 2004; Jacobson et al. 2007; Manns et al., 2007; Pawlotsky, 2005; Zeuzem & Hermann, 2002) .

Tratamento do VHC O tratamento de referência (standard of care, SoC) atual são injeções subcutâneas de interferão-a pegilado (pIFNCC) e dosagem oral do fármaco antiviral ribavirina durante um período de 24-48 semanas. O êxito no tratamento define-se por uma resposta virológica sustentada (SVR), que se define pela ausência de ARN de VHC no soro ao final do período de tratamento e 6 meses depois. As taxas de resposta global a SoC dependem principalmente do genótipo e os níveis de ARN de VHC antes do tratamento. É mais provável que os pacientes com genótipo 2 e 3 respondam a SoC que os pacientes infetados com o genótipo 1 (Melnikova, 2008; Jacobson et al., 2007).

Um número significativo de pacientes com VHC não respondem adequadamente ao tratamento SoC, ou não podem tolerar a terapia devido a efeitos secundários, o que conduz a problemas frequentes relacionados com a finalização do ciclo completo. A taxa de SVR clinica global de SoC é só de aproximadamente 50% (Melnikova, 2008). O desenvolvimento de resistência é outro fator subjacente para o fracasso do tratamento (Jacobson et al. 2007). O SoC também está contraindicado em alguns pacientes que não se consideram candidatos para o tratamento, tais como pacientes com episódios significativos passados de depressão ou doença cardíaca. Os efeitos secundários do SoC, que conduzem frequentemente a interrupção do tratamento, incluem doença pseudogripal, febre, fadiga, doenças hematológicas, anemia, leucopenia, trombocitopenia, alopecia e depressão (Manns et al., 2007) .

Considerando os efeitos secundários associados com os prolongados tratamentos a utilizar SoC, o desenvolvimento de resistência e a taxa global de êxito por debaixo do nível ótimo, necessitam-se urgentemente novos tratamentos mais eficazes e mais seguros para o tratamento da infeção por VHC. Os objetivos dos novos tratamentos incluem potência melhorada, perfil de toxicidade melhorado, perfil de resistência melhorado, qualidade de vida melhorada e a melhora resultante no cumprimento dos pacientes. O VHC tem um ciclo de vida curto e, portanto é comum o desenvolvimento de resistência a fármacos durante a terapia farmacológica.

Se está a desenvolver uma terapia antiviral dirigida especificamente para a hepatite C (STAT-C) nova, também conhecida como fármacos antivirais de ação direta (DAA) que seleciona como alvo proteínas virais tais como a ARN polimerase viral NS5B ou a protease viral NS3 (Jacobson et al, 2007; Parfieniuk et al.r 2007) . Além disso, também estão a desenvolver compostos novos que selecionam como alvo proteínas humanas (por exemplo, ciclofilinas) em lugar de alvos virais, o que poderia esperar-se que conduziria a uma redução na incidência de resistência durante a terapia farmacológica (Manns et al., 2007; Pockros, 2008; Pawlotsky J-M, 2005) .

Inibidores de ciclofilina

As ciclofilinas (CyP) são uma família de proteínas celulares que desempenham uma atividade peptidil-prolil cis-trans isomerase que facilita as alterações conformacionais e o enrolamento da proteína. As CyP estão implicadas em processos celulares tais como regulação da transcrição, resposta imunitária, secreção de proteínas e função mitocondrial. O vírus VHC recruta CyP para o seu ciclo de vida durante a infeção de seres humanos. Originalmente, pensou-se que os CyP estimulam a atividade de união ao ARN da proteína não estrutural do VHC ARN polimerase NS5B que promove a replicação do ARN, embora foram propostas várias hipóteses alternativas a incluir uma necessidade da atividade PPIase de CyP. Acredita-se que diversas isoformas de CyP, a incluir A e B, estão implicadas no ciclo de vida do VHC (Yang et al., 2008; Appel et al., 2006; Chatterji et al., 2009; Gaither et al., 2010). A capacidade para gerar desativações em células T de ratos (Colgan et al., 2000) e seres humanos (Braaten e Luban, 2001) indica que CyPA é opcional para o crescimento e a sobrevivência celulares. Foram observados resultados similares com a alteração de homólogos de CyPA em bactérias (Herrler et al., 1994), Neurospora (Tropschug et al., 1989) e Saccharomyces cerevisiae (Dolinski et al. 1997) .

Portanto, a inibição de CyP representa um objetivo no hóspede novo e atrativo para tratar a infeção por VHC, e uma possível nova adição a SoC ou STAT-C/fármacos DAA, com o objetivo de aumentar a SVR, prevenir a aparição de resistência e diminuir os efeitos secundários do tratamento.

Sabe-se que a ciclosporina A (Inoue et al. 2003) ("CsA") e os seus análogos clínicos não imunossupressores estruturalmente relacionados de maneira estreita DEBIO-025 (Paeshuyse et al. 2006; Flisiak et al. 2008), NIM811 (Mathy et al. 2008) e SCY-635 (Hopkins et al., 2009) unem-se às ciclofilinas, e como inibidores de ciclofilina mostraram eficácia in vitro e clínica no tratamento da infeção por VHC (Crabbe et al., 2009; Flisiak et al. 2008; Mathy et al. 2008; Inoue et al., 2007; Ishii et al., 2006; Paeshuyse et al., 2006) . Embora estudos de resistência anteriores em CsA mostraram mutações na ARN polimerase NS5B de VHC e sugeriram que só a ciclofilina B estaria implicada no processo de replicação do VHC (Robida et al., 2007), estudos recentes sugeriram um papel essencial para a ciclofilina A na replicação do VHC (Chatterji et al. 2009; Yang et al., 2008) . Considerando que as mutações na proteína viral NS5A também estão associadas com a resistência a CsA e que NS5A interage tanto com CyPA como com CypB para a sua atividade peptidil-prolil cis/trans isomerase (PPIase) específica, sugere-se adicionalmente um papel para ambas ciclofilinas no ciclo de vida virai (Hanoulle et al., 2009). O efeito anti-VHC dos análogos de ciclosporina é independente da propriedade imunossupressora, que é dependente de calcineurina. Isto indicou que a necessidade essencial para a atividade de VHC é a união de CyP e que não é necessária a união de calcineurina. DEBIO-025, o inibidor de ciclofilina clinicamente mais avançado para o tratamento do VHC, mostrou potência in vitro e in vivo contra os quatro genótipos mais prevalentes de VHC (genótipos 1, 2, 3 e 4) . Estudos de resistência mostraram que as mutações que conferiam resistência a DEBIO-025 eram diferentes das notificadas para inibidores de polimerase e protease, e que não havia resistência cruzada com replicões virais resistentes a STAT-C/DAA. E o que é mais importante, DEBIO-025 também prevenia o desenvolvimento de mutações de escape que conferem resistência a inibidores tanto de protease como de polimerase (Crabbe et al., 2009).

Sem embargo, os inibidores de ciclofilina baseados em CsA em desenvolvimento clínico apresentam vários problemas, que se acredita que estão relacionados com a sua classe estrutural compartida, a incluir: determinados acontecimentos adversos que podem conduzir a uma retirada da terapia e limitaram os niveis de dose clínicos; farmacocinética variável que pode conduzir a eficácia variável; e um aumento do risco de interações fármaco-fármaco que podem conduzir a problemas de dosagem.

Os acontecimentos adversos (AA) que se produziram com mais frequência em pacientes que receberam DEBIO-025 incluíram icterícia, dor abdominal, vómitos, fadiga e pirexia. Os AA mais importantes clinicamente foram hiperbilirrubinemia e redução na contagem de plaquetas (trombocitopenia). Peg-IFN pode produzir trombocitopenia profunda e a combinação com DEBIO-025 poderia representar um problema clínico significativo. Também foi descrito tanto um aumento na bilirrubina como uma diminuição nas plaquetas em estudos clínicos anteriores com NIM-811 (Ke et al., 2009) . Embora a hiperbilirrubinemia observada durante os estudos clínicos com DEBIO-025 reverteu-se após o cesse do tratamento, foi a causa de abandono do tratamento em 4 de 16 pacientes, e uma redução nos níveis de dose para ensaios futuros. Posto que o efeito antiviral dos inibidores de ciclofilina em VHC está relacionado com a dose, uma redução na dose conduziu a uma redução no efeito antiviral, e vários ensaios posteriores com inibidores de ciclofilina baseados em CsA mostraram ausência de reduções ou reduções escassas na carga virai de VHC quando se administra como monoterapia (Lawitz et al., 2009; Hopkins et al., 2009; Nelson et al., 2009) . Sabe-se que DEBIO-025 e ciclosporina A são inibidores de transportadores biliares tais como bombas de exportação de sais biliares e outros transportadores hepáticos (especialmente OATlBl/OATlB3/MRP2/MRP3/cMOAT/ ABCC2) (Crabbe et al., 2009) . Sugeriu-se que a interação com transportadores biliares, em particular MRP2, pode ser a causa da hiperbilirrubinemia observada a altos niveis de dose de DEBIO-025 (Nelson et al. , 2009, Wring et al. , 2010). As interações fármaco-fármaco (DDI) relacionadas com a classe de CsA através da inibição de outros transportadores de fármacos tais como glicoproteina P (Pgp/MDRl), BSEP, OAT1B1 e OAT1B3 (Konig et al., 2010) também podem constituir uma preocupação, limitando potencialmente determinadas combinações e utilização em alguns pacientes que se submetem a tratamento para coinfecções tais como VIH (Seden et al., 2010).

Além disso, DEBIO-025 e ciclosporina A são substratos para o metabolismo mediado pelo citocromo P450 (especialmente CYP3A4), e sabe-se que são substratos e inibidores da glicoproteina P humana (MDR1) (Crabbe et al., 2009) . Também foi mostrado que a ciclosporina A é um inibidor de CYP3A4 in vitro (Niwa et al., 2007) . Isto indica que poderia ter um aumento do risco de interações fármaco-fármaco com outros fármacos que são substratos, indutores ou inibidores de CYP3A4 tais como, por exemplo, cetoconazol, cimetidina e rifampicina. Além disso, esperam-se também interações com fármacos que se submetem a transporte pela glicoproteina P (por exemplo, digoxina), o que poderia produzir graves interações fármaco-fármaco em pacientes com VHC que recebem tratamentos médicos por outras doenças concomitantes (Crabbe et al. 2009) . Sabe-se também que a CsA tem farmacocinética altamente variável, mostrando as formulações iniciais biodisponibilidade oral de 1-89% (Kapurtzak et al., 2004) . Sem um caro monitoramento dos niveis em sangue dos pacientes, isto pode conduzir a uma prevalência aumentada de efeitos secundários devido a niveis em plasma aumentados, ou a uma resposta clinica reduzida devido a niveis em plasma diminuídos.

Considerando que a inibição de ciclofilinas representa um novo enfoque prometedor para o tratamento de VHC, existe a necessidade de descobrir e desenvolver inibidores de CyP mais potentes e mais seguros para a sua utilização em terapia de combinação contra infeção por VHC.

Sangliferinas A sangliferina A (SfA) e os seus congéneres naturais pertencem a uma classe de policétidos/peptídeos não ribossómicos mistos, produzidos por Streptomyces sp. A92-308110 (também conhecido como DSM 9954) (veja-se o documento WO 97/02285), que se descobriram originalmente baseando-se na sua alta afinidade por ciclofilina A (CyPA). SfA é o componente mais abundante em caldos de fermentação e apresenta uma afinidade aproximadamente 20 vezes superior para CyPA em comparação com CsA. Isto conduziu a sugerir que as sangliferinas poderiam ser úteis para o tratamento do VHC (documento WO2006/138507). Também foi mostrado que as sangliferinas apresentam uma atividade imunossupressora inferior que CsA quando se testam in vitro (Sanglier et ai., 1999; Fehr et ai., 1999). SfA une-se com alta afinidade ao sitio de união a CsA de CyPA (Kallen et ai., 2005) .

Sangliferina B, 7 Biosintese de sangliferina

As sangliferinas biosintetizam-se por uma policétido sintase (PKS)/peptídeo sintetase não ribossómica (NRPS) mista (veja-se o documento W02010/034243). A estrutura principal de macrólido de 22 membros consiste numa cadeia carbonada de policétido e uma cadeia tripeptídica. A cadeia peptídica consiste num aminoácido natural, valina, e dois aminoácidos não naturais: (S)-meta-tirosina e (S)-ácido piperázico, unidos mediante um enlace amida. Acredita-se que a hidroxilação de fenilalanina (ou in situ na NRPS ou antes da biossíntese) para gerar (S)-meta-tirosina produz-se através do produto gênico de sfaA. Ação imunossupressora das sangliferinas O mecanismo de ação imunossupressor de SfA é diferente do de outros fármacos imunossupressores de união a imunofilina conhecidos tais como CsA, FK506 e rapamicina. SfA não inibe a atividade fosfatase da calcineurina, o alvo de CsA (Zenke et ai. 2001), em troca a sua atividade imunossupressora foi atribuída à inibição da interleucina-6 (Hartel et ai., 2005), a interleucina-12 (Steinschulte et ai., 2003) e a inibição da proliferação de células T dependente de interleucina-2 (Zhang & Liu, 2001) . Sem embargo, até agora desconhecem-se o alvo molecular e o mecanismo através do qual SfA exerce o seu efeito imunossupressor. A estrutura molecular de SfA é complexa e acredita-se que a sua interação com CyPA está mediada em grande medida pela parte macrociclica da molécula. De facto, um composto macrociclico (hidroximacrociclo) derivado da excisão oxidativa de SfA mostrou forte afinidade por CyPA (Sedrani et al. , 2003) . Os dados de estrutura cristalina por raios X mostraram que o hidroximacrociclo une-se ao mesmo sitio ativo de CyPA que CsA. Mostrou-se também previamente que análogos baseados no resto macrociclo de SfA estão desprovidos de propriedades imunossupressoras (Sedrani et al., 2003), proporcionando a oportunidade para desenhar inibidores de CyP não imunossupressores para a sua utilização potencial em terapia contra VHC.

Em oposição a isto, também existe a oportunidade de desenvolver agentes imunossupressores com baixa toxicidade para a sua utilização em áreas tais como a profilaxia de rejeição de transplantes, transtornos autoimunitários, inflamatórios e respiratórios, a incluir, mas sem limitar-se a, doença de Crohn, sindrome de Behcet, uveite, psoriase, dermatite atópica, artrite reumatoide, sindrome nefritica, anemia aplásica, cirrose biliar, asma, fibrose pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crónica (EPOC) e doença celíaca. Mostrou-se que as sangliferinas têm um mecanismo novo de atividade imunossupressora (Zenke et al., 2001), atuando potencialmente através de quimiocinas de células dendríticas (Immecke et al., 2011), e, portanto existe a oportunidade de desenvolver agentes com um mecanismo de ação diferente aos agentes clínicos atuais, tais como ciclosporina A, rapamicina e FK506. Mostrou-se que a sangliferina A é 10 vezes menos potente que a ciclosporina A, pelo que o agente novo ideal teria potência e/ou janela terapêutica melhoradas.

Outras utilizações terapêuticas de inibidores de ciclofilina Vírus da imunodeficiência humana (VIH)

Os inibidores de ciclofilina, tais como CsA e DEBIO-025 também mostraram utilidade potencial na inibição da replicação do VIH. Acredita-se que os inibidores de ciclofilina interferem com a função de CyPA durante a progressão/finalização da transcrição inversa do VIH (Ptak et al., 2008). Sem embargo, quando se testaram clinicamente, DEBIO-025 só reduziu os níveis de ARN de VIH-1 >0,5 e >1 loglO cópias/ml em nove e dois pacientes respetivamente, enquanto que 27 dos pacientes tratados não mostraram redução nos níveis de ARN de VIH-1 (Steyn et al., 2006) . Após isto, submeteu-se a ensaio DEBIO-025 em pacientes coinfetados por VHC/VIH e mostrou melhor eficácia contra VHC, e interromperam-se os ensaios clínicos de VIH (veja-se Watashi et al., 2010).

Tratamento do VIH

Mais de 30 milhões de pessoas estão infetadas por VIH-1 em todo o mundo, com 3 milhões de casos novos cada ano. As opções de tratamento melhoraram espetacularmente com a introdução da terapia antirretroviral altamente ativa (HAART) (Schopman et al., 2010) . Até 2008, tinham-se autorizado quase 25 fármacos antirretrovirais para o tratamento do VIH-1, a incluir nove inibidores nucleosídeos da transcriptase inversa (NRTI), quatro inibidores não nucleosídeos da transcriptasa inversa (NNRTI), nove inibidores de protease (PI), um inibidor de fusão, um inibidor de CCR5 e um inibidor de integrase (Shafer e Schapiro, 2008) . Sem embargo, nenhum destes regimes atuais conduz a aclaramento viral completo, podem conduzir a efeitos secundários graves e a resistência antiviral é ainda uma preocupação importante. Portanto, segue a ter a necessidade de novas terapias antivirais, especialmente em classes de mecanismos de ação em gue não há fármacos aprovados, tal como é o caso para inibidores de ciclofilina.

Virus da hepatite B A hepatite B é um virus ADN da família Hepadnaviridae, e é o agente causativo da hepatite B. Ao contrário dos casos com VHC e VIH, tem tido muito poucos informes publicados da atividade de inibidores de ciclofilina contra o vírus da hepatite B. Ptak et al. 2008 descreveram uma débil atividade de Debio-025 contra VHB (CI50 de 4,1 μΜ), enguanto gue Xie et al., 2007 descreveram certa atividade de CsA contra VHB (CI50 >1,3 μg/ml) . Isto é em contraste com VIH e VHC, onde há numerosos informes de atividade antiviral nanomolar de inibidores de ciclofilina.

Tratamento do VHB O VHB infecta até 400 milhões de pessoas em todo o mundo e é uma causa principal de hepatite virai crónica e carcinoma hepatocelular. Em 2008, havia seis fármacos autorizados para o tratamento do VHB; interferão alfa e interferão alfa pegilado, três análogos de nucleosídeo (lamivudina, entecavir e telbivudina) e um análogo de nucleotídeo (adefovir dipivoxil). Sem embargo, devido às altas taxas de resistência, à escassa tolerância e aos possíveis efeitos secundários, necessitam-se novas opções terapêuticas (Ferir et al., 2008).

Inibição do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) A abertura dos poros de transição de permeabilidade de alta condutância em mitocôndrias inicia o começo da transição de permeabilidade mitocondrial (MPT). Este é o acontecimento causativo, que conduz a necrose e apoptose em hepatócitos após stress oxidativo, toxicidade de Ca2+ e isquemia/reperfusão. Foi mostrado que a inibição da ciclofilina D (também conhecida como ciclofilina F) por inibidores de ciclofilina bloqueia a abertura dos poros de transição de permeabilidade e protege da morte celular após este stress. Os inibidores de ciclofilina D podem ser úteis, portanto em indicações em que está envolvida a abertura de mPTP, tal como distrofia muscular, em particular distrofia muscular congénita de Ullrich e miopatia de Bethlem (Millay et al., 2008, documento W02008/084368, Palma et al., 2009), esclerose múltipla (Forte et al., 2009), diabetes (Fujimoto et al., 2010), esclerose lateral amiotrófica (Martin 2009), transtorno bipolar (Kubota et al., 2010), doença de Alzheimer (Du e Yan, 2010), doença de Huntington (Perry et al., 2010), recuperação após infarto do miocárdio (Gomez et al., 2007) e consumo de álcool crónico (King et al., 2010) .

Outras utilizações terapêuticas

Os inibidores de ciclofilina têm atividade potencial contra, e, portanto no tratamento de, infeções de outros virus, tais como o virus da varicela-zóster (Ptak et al., 2008), virus influenza A (Liu et al., 2009), coronavirus da sindrome respiratória aguda grave e outros coronavirus humanos e felinos (Chen et al., 2005, Ptak et al., 2008), vírus da dengue (Kaul et al., 2009), vírus da febre-amarela (Qing et al., 2009), vírus do Nilo ocidental (Qing et al., 2009), vírus da encefalite eguina ocidental (Qing et al., 2009), citomegalovírus (Kawasaki et al., 2007) e vírus vaccinia (Castro et al., 2003).

Também há informes de utilidade de inibidores de ciclofilina e inibição de ciclofilina em outras áreas terapêuticas, tal como em cancro (Han et al. , 2009) .

Comentários gerais sobre as sangliferinas

Um dos problemas no desenvolvimento de fármacos de compostos tais como sangliferinas é o rápido metabolismo e a glucuronidação, gue conduzem a baixa biodisponibilidade oral. Isto pode conduzir a uma possibilidade aumentada de efeito dos alimentos, libertação incompleta mais freguente da forma farmacêutica e variabilidade entre pacientes superior.

Portanto segue a ter a necessidade de identificar inibidores de ciclofilina novos, gue podem ter utilidade, particularmente no tratamento de infeção por VHC, mas também no tratamento de outras áreas de doença em que pode ser útil a inibição de ciclofilinas, tal como infeção por VIH, distrofia muscular ou ajuda na recuperação após infarto do miocárdio ou quando é útil o efeito de imunossupressão ou anti-inflamatório. Preferivelmente, tais inibidores de ciclofilina têm propriedades melhoradas em relação com os inibidores de ciclofilina disponíveis atualmente, a incluir uma ou mais das propriedades seguintes: semivida mais longa ou biodisponibilidade oral aumentada, possivelmente através de glucuronidação reduzida e/ou metabolismo por P450 reduzido, solubilidade em água melhorada, potência melhorada contra VHC, toxicidade (a incluir hepatotoxicidade) reduzida, perfil farmacológico melhorado, tal como alta exposição ao órgão alvo (por exemplo, o fígado no caso de VHC) e/ou semivida longa (gue permite a dosagem menos frequente) , interações fármaco-fármaco reduzidas, tal como através de níveis reduzidos de metabolismo por CYP3A4 e inibição e inibição reduzida (Pgp) (que permite combinações de múltiplos fármacos mais fáceis) e perfil de efeitos secundários melhorado, tal como baixa união a MRP2, que conduz a uma possibilidade reduzida de hiperbilirrubinemia, efeito imunossupressor inferior, atividade melhorada contra espécies de vírus resistentes, em particular espécies de vírus resistentes a CsA e análogos de CsA (por exemplo DEBIO-025) e um índice terapêutico (e/ou seletividade) superior. A presente invenção revela um análogo de sangliferina novo que pode ter uma ou mais das propriedades anteriores. Em particular, a presente invenção revela um análogo de sangliferina mutassintético novo, que se prevê que tem metabolismo reduzido através de P450 ou glucuronidação, por exemplo, tal como se mostra mediante semivida de microssoma aumentada e/ou potência melhorada reduzida contra VHC, por exemplo, tal como se mostra por uma CE50 de replicão baixa.

Além disso, também existe a necessidade de desenvolver um agente imunossupressor novo, que pode ter utilidade na profilaxia de rejeição de transplantes, ou no tratamento de transtornos autoimunitários, inflamatórios e respiratórios. Preferivelmente, um imunossupressor deste tipo terá propriedades melhoradas em relação com as sangliferinas naturais conhecidas, a incluir uma ou mais das propriedades seguintes: semivida mais longa ou biodisponibilidade oral aumentada, possivelmente através de glucuronidação reduzida e/ou metabolismo por P450 reduzido, solubilidade em água melhorada, potência melhorada em atividade imunossupressora, tal como poderia observar-se em ensaios de proliferação de células T, toxicidade (a incluir hepatotoxicidade) reduzida, perfil farmacológico melhorado, tal como alta exposição ao órgão alvo e/ou semivida longa (que permite a dosagem menos frequente) , interações fármaco-fármaco reduzidas, tal como através de níveis reduzidos de metabolismo por CYP3A4 e inibição reduzida (Pgp) (que permite combinações de múltiplos fármacos mais fáceis) e perfil de efeitos secundários melhorado. A presente invenção revela um análogo de sangliferina novo que pode ter uma ou mais das propriedades anteriores. Em particular, a presente invenção revela um derivado novo, que tem metabolismo reduzido através de P450 ou glucuronidação, por exemplo, tal como se mostra mediante semivida de microssoma aumentada e/ou potência imunossupressora melhorada, por exemplo, tal como se mostra por uma CI50 de proliferação de células T baixa.

Portanto, tal como pode observar-se a partir dos exemplos, o composto da invenção tem as seguintes propriedades terapeuticamente relevantes favoráveis: potência antiviral melhorada contra VHC e VIH em comparação com os inibidores de ciclofilina da técnica anterior ciclosporina A, DEBIO-025 (alisporivir) e sangliferina A; aclaramento reduzido e exposição oral aumentada em comparação com o composto da técnica anterior sangliferina A; - inibição mais potente da atividade PPIase de CypA em comparação com os inibidores de ciclofilina da técnica anterior ciclosporina A, DEBIO-025 (alisporivir) e sangliferina A; perfil de efeitos secundários melhorado e interações fármaco-fármaco reduzidas tal como se demonstra mediante a inibição reduzida de transportadores de bilirrubina (OATP-1B1, 0ATP-1B3, MRP2 e MRP3) e inibição reduzida de transportadores xenobióticos (Pgp e BSEP).

Sumário da invenção A presente invenção proporciona um análogo de sangliferina macrociclico novo, gue foi gerado mediante a modificação semissintética de sangliferinas mutassintéticas. Este análogo pode gerar-se mediante a di-hidroxilação de uma sangliferina mutassintética, tal como se descreve na fórmula IIA e a fórmula IIB, seguido por excisão para gerar o macrociclo aldeidico, seguido por guimica adicional, a incluir reações de tipo Horner-Emmons e outras reações de acoplamento gue envolvem um aldeído. Como resultado, a presente invenção proporciona um análogo de sangliferina macrociclico, métodos para a preparação deste composto, e métodos para a utilização deste composto em medicina ou como produto intermediário na produção de outros compostos.

Portanto, num primeiro aspeto, a presente invenção proporciona um análogo de sangliferina macrociclico de acordo com a fórmula (I) a seguir, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

Fórmula (I) a incluir qualquer tautómero do mesmo; e a incluir um aduto de metanol do mesmo em que se forma um cetal mediante a combinação do grupo ceto em C-53 e o grupo hidroxilo em C-15 e metanol. A estrutura anterior mostra um tautómero representativo e a invenção abarca todos os tautómeros do composto de fórmula (I), por exemplo, um composto ceto em que se ilustra um composto enol e vice-versa.

Os tautómeros específicos que se incluem dentro da definição da fórmula (I) são aqueles em que (i) o grupo ceto em C-53 forma um hemicetal com o hidroxilo em C-15, ou (ii) o hidroxilo em C-15 e C-17 pode combinar-se com o ceto em C-53 para formar um cetal. Todas as numerações utilizam o sistema para a estrutura de sangliferina A original. 0 composto de fórmula (I), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode estar presente opcionalmente na forma de um solvato farmaceuticamente aceitável, tal como um hidrato.

Em um aspeto adicional, a presente invenção proporciona um análogo de sangliferina macrociclico de acordo com a fórmula (I) na forma cristalina sólida (forma I).

Definições

Os artigos "um" e "uma" utilizam-se no presente documento para fazer referência a um ou a mais de um (isto é, pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. A modo de exemplo "um análogo" significa um análogo ou mais de um análogo.

Tal como se utiliza no presente documento, o termo "análogo(s)" refere-se a compostos guimicos gue são estruturalmente similares a outro, mas que diferem ligeiramente na composição (como na substituição de um átomo por outro ou em presença ou ausência de um grupo funcional particular).

Tal como se utiliza no presente documento, o termo "sangliferina(s)" refere-se a compostos químicos que são estruturalmente similares a sangliferina A, mas que diferem ligeiramente na composição (como na substituição de um átomo por outro ou em presença ou ausência de um grupo funcional particular), em particular os gerados pela fermentação de Streptomyces sp. A92-308110. Os exemplos incluem os compostos similares a sangliferina comentados nos documentos WO97/02285 e WO98/07743, tal como sangliferina B.

Tal como se utiliza no presente documento, o termo "sangliferina(s) mutassintética(s)" ou "análogo(s) de sangliferina mutassintético(s)" refere-se a compostos químicos que são estruturalmente similares a sangliferina A, B, C ou D, mas que diferem ligeiramente na composição (como na substituição de um ou mais átomos por outro ou em presença ou ausência de um grupo funcional particular), em particular, os gerados pela fermentação de Streptomyces sp. A92-308110 ou um mutante do mesmo, guando o cultivo se alimenta com um análogo de meta-tirosina.

Tal como se utiliza no presente documento, o termo "análogo(s) de meta-tirosina" refere-se a compostos guimicos gue são estruturalmente similares a meta-tirosina, mas gue diferem ligeiramente na composição (como na substituição de um ou mais átomos por outro ou em presença ou ausência de um grupo funcional particular) , em particular, os descritos na fórmula (III) .

Tal como se utiliza no presente documento, o termo "análogo macrocíclico", "análogo de sangliferina macrocíclico" ou "sangliferina macrocíclica", refere-se a um composto mencionado antes como gue representa a invenção no seu aspeto mais amplo, por exemplo, um composto de acordo com a fórmula (I) anterior, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Estes compostos também se denominam "compostos da invenção" ou "derivados de sangliferina" ou "análogos de sangliferina" e estes termos utilizam-se de maneira intercambiável no presente pedido.

Tal como se utiliza no presente documento, o termo "VHC" refere-se a virus da hepatite C, um virus com envolta, ARN, monocatenário da família virai Flaviviridae.

Tal como se utiliza no presente documento, o termo "VIH" refere-se a virus da imunodeficiência humana, o agente causativo da síndrome da imunodeficiência adguirida humana.

Tal como se utiliza no presente documento, o termo "biodisponibilidade" refere-se ao grau em gue ou a taxa à que o fármaco ou outra substância se absorve ou se faz disponível no sitio da atividade biológica após a administração. Esta propriedade depende de vários fatores a incluir a solubilidade do composto, a taxa de absorção no intestino, o grau de união a proteínas e o metabolismo, etc. No presente documento se descrevem diversos testes para a biodisponibilidade que resultarão familiares para um especialista (veja-se também Egorin et al. 2002) . O termo "solubilidade em água" tal como se utiliza neste pedido refere-se à solubilidade em meios aquosos, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS) a pH 7,4, ou em solução de glucose a 5%. Os testes para a solubilidade em água facilitam-se a seguir nos exemplos como "ensaio de solubilidade em água".

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção tal como o composto de fórmula (I) incluem sais convencionais formados a partir de sais de adição de bases ou ácidos orgânicos ou inorgânicos assim como de ácido de amónio quaternário farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos mais específicos de sais de ácidos adequados incluem clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, perclórico, fumárico, acético, propiônico, succínico, glicólico, fórmico, lático, maleico, tartárico, cítrico, palmoico, malónico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzoico, salicílico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, naftaleno-2-sulfónico, bencenosulfónico, hidroxinaftoico, iodhídrico, málico, esteroico, tânico e similares. Os sais de ácido clorídrico são de particular interesse. Outros ácidos tais como o oxálico, embora não sejam farmaceuticamente aceitáveis por si mesmos, podem ser úteis na preparação de sais úteis como produtos intermediários na obtenção dos compostos da invenção e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos mais específicos de sais básicos adequados incluem sais de sódio, lítio, potássio, magnésio, alumínio, cálcio, zinco, N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, N-metilglucamina e procaína. As referências a seguir no presente documento a um composto de acordo com a invenção incluem tanto um composto de fórmula (I) como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Tal como se utiliza no presente documento, o termo "alquilo" representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificado, que contém normalmente 1-10 átomos de carbono, por exemplo, um grupo alquilo Ci-6. Os exemplos de grupos alquilo incluem grupos alquilo C1-4 tais como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo e n-butilo. O termo "tratamento" inclui tratamento profilático assim como terapêutico. O termo "fórmula II" refere-se a fórmula IIA e fórmula IIB coletivamente.

Legendas das figuras

Figura 1: 1H-RMN do composto 24.

Figura 2: Padrão de difração de raios X de pó do composto 24 na forma cristalina sólida (forma I).

Descrição da invenção A presente invenção proporciona um análogo de sangliferina macrocíclico, tal como se expôs anteriormente, métodos para a preparação deste composto e métodos para a utilização deste composto em medicina.

Numa forma de realização, o composto é um aduto de metanol do mesmo em que se forma um hemicetal mediante a combinação dos grupos ceto em C-53 e hidroxilo em C-15 e metanol. Em outra realização não o é.

Numa forma de realização da invenção, o duplo enlace na posição C26, 27 está na forma cis, tal como se representa por a seguinte fórmula:

Um composto deste tipo pode produzir-se durante síntese química.

Numa forma de realização adicional, proporciona-se um análogo de sangliferina macrocíclico de acordo com a fórmula (I) na forma cristalina sólida. Em particular, proporciona-se uma forma cristalina sólida (forma I) de um análogo de sangliferina macrocíclico de acordo com a fórmula (I) que pode obter-se (ou se obtém) mediante a cristalização do análogo de sangliferina macrocíclico amorfo de acordo com a fórmula (I) em metil isobutil cetona (MIBK). Numa realização, dita forma amorfa suspende-se em MIBK e realizam-se ciclos de temperatura entre uma temperatura mínima e uma máxima durante um período de tempo total de, por exemplo, 1 hora, 2 horas, 5 horas, 24 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias ou 2 semanas. Numa forma de realização, realizam-se ciclos de temperatura entre temperatura ambiente e 60°C, por exemplo, entre temperatura ambiente e 40°C. Numa forma de realização, realizam-se ciclos de temperatura entre a temperatura mínima e a máxima (e vice-versa) cada 2-8 horas, por exemplo, cada 3-5 horas ou cada 4 horas. Numa forma de realização preferida, realizam-se ciclos de temperatura entre temperatura ambiente e 40°C cada 4 horas durante um total de 5 dias.

No exemplo 8 descreve-se em detalhe um método de cristalização da forma amorfa do análogo de sangliferina macrocíclico de acordo com a fórmula (I).

Um análogo de sangliferina macrocíclico de acordo com a fórmula (I) na forma do polimorfo cristalino de forma I tem um padrão de difração de raios X de pó (XRPD) substancialmente tal como se mostra na figura 2. A tabela 2 (do exemplo 8) mostra a lista de picos e as intensidades relativas. O método de obtenção dos dados de XRPD descreve-se nos Métodos gerais.

Portanto, proporciona-se um análogo de sangliferina macrocíclico de acordo com a fórmula (I) na forma cristalina (forma I) que tem um padrão de XRPD com pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezasseis ou os dezassete) sinal a 8,3, 8,5, 11,1, 12,6, 13,9, 14,3, 15, 0, 16, 9, 17, 7, 18,6, 19, 0, 20, 1, 20,5, 20, 9, 21,2, 21,7 e 23,0 (± 0,2 graus, valores de 2-theta), sinais que constituem os sinais principais no padrão de XRPD do polimorfo de forma I. Os sinais em 8,3, 8,5, 11,1, 13,9, 17, 7, 18,6, 19, 0, 20,5, 20, 9 e 23,0 graus 2-theta têm comparativamente alta intensidade relativa (mais de 26% -veja-se a figura 2) e, portanto prefere-se observar pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou os dez) destes. Os sinais a 13,9, 17,7, 19,0, 20,5 e 23,0 graus 2-theta têm particularmente alta intensidade relativa (mais de 50% - veja-se a figura 2) e, portanto prefere-se observar pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, quatro ou os cinco) destes. O termo "intensidade relativa" entender-se-á que significa a intensidade dada como percentagem como a intensidade do sinal mais alto no espectro (que corresponde ao pico a 13,9 graus 2-theta), tal como se ilustra mediante a figura 2.

Em geral, o composto da invenção prepara-se mediante mutassintese para gerar compostos de fórmula (II), seguido por semissintese.

Fórmula (IIA)

Fórmula (IIB)

Em geral, um procedimento para preparar precursores de um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos compreende: • inocular um caldo de fermentação com um cultivo de um produtor de sangliferina (tal como Streptomyces sp. A92-308110, também conhecido como DSM 9954) ou mais preferivelmente, um produtor de sangliferina com o gene sfaA ou o homólogo do gene sfaA inativado ou delecionado; • alimentar o caldo de fermentação com um análogo de meta- tirosina (tal como se mostra na fórmula (III), por exemplo, (S)-2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo, DL-5-fluoro-meta-tirosina (9) ou 2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo (10))

• permitir que continue a fermentação até que se produzam os compostos de fórmula IIA e fórmula IIB

• extrair e isolar os compostos de fórmula IIA e fórmula IIB • derivatizar de maneira semissintética os compostos de fórmula IIA e fórmula IIB para gerar o composto de fórmula I.

Os compostos de fórmula (III) definem-se tal como segue:

Fórmula (III) em gue Rio representa H ou um grupo de formação de éster tal como um grupo alquilo, por exemplo alquilo Ci-6 tal como Me. A alimentação pode ser racêmica ou a forma L de um composto de fórmula (III) .

Os compostos de fórmula (III) ou estão comercialmente disponíveis ou preparam-se mediante técnicas de química de síntese orgânica convencionais. Uma rota genérica para os compostos de fórmula (III) é tal como se mostra no seguinte esquema la.

Esquema la: a) acoplamento de aldeído de fórmula (IV) com um fragmento adequado, por exemplo, (RuO) 2P (0) CH (NHPG) CO2R10, e b) hidrogenação e desproteção de acordo com o que for necessário. PG = grupo protetor.

Os aldeídos de fórmula (IV) podem estar comercialmente disponíveis ou sintetizar-se facilmente por um especialista. Pode ser necessário empregar química de proteção e desproteção na geração de compostos de fórmula (III) a partir de compostos de fórmula (IV) . Um especialista conhece estas técnicas e os grupos protetores adequados tal como se descreve em Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (Wuts e Greene, 4a Edição, 2007).

Após a geração dos compostos de fórmula (IIA) e fórmula (IIB), preparam-se os compostos da invenção mediante derivatização semissintética. Os métodos semissintéticos para gerar o aldeído de sangliferina macrocíclico se descrevem no documento US6.124.453, Metternich et al. , 1999, Banteli et al., 2001 e Sedrani et al., 2003.

Em geral, o procedimento semissintético para preparar determinados compostos de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos a partir de um análogo de sangliferina mutassintético compreende: (a) di-hidroxilação do análogo de sangliferina; (b) excisão oxidativa do 1,2-diol para produzir um aldeído; e (c) acoplamento de dito aldeído com um carbanião estabilizado (ou forma canónica do mesmo), tal como um carbanião de fosfonato, utilizando um composto de fórmula V.

Isto mostra-se de maneira retrossintética a seguir:

Em que para os análogos de sangliferina A mutassintéticos,

Os grupos Rn, que podem ser iguais ou diferentes, representam independentemente alquilo (por exemplo alquilo Cl-4) ou benzilo.

Portanto, um procedimento para preparar um composto da invenção compreende reagir um composto de fórmula (V) com um macrociclo aldeídico (composto de fórmula (VI)). A preparação de compostos de fórmula (VI) pode realizar-se mediante um procedimento análogo ao descrito anteriormente para a conversão de sangliferina A no seu macrociclo aldeídico correspondente (Metternich et al. 1999). Brevemente, o composto de fórmula (II) di-hidroxila-se utilizando condições de Sharpless modificadas (tetraóxido de ósmio catalitico). A utilização dos ligandos quirais ajuda a promover a seletividade. Então pode escindir-se oxidativamente o diol resultante, utilizando, por exemplo, periodato de sódio. Então pode utilizar-se o composto de fórmula VI resultante como substrato para derivatização a uma amida, éster ou cetona homologados. Normalmente, dissolve-se um composto de fórmula (V) num solvente aprótico, esfria-se e logo trata-se com uma base, por exemplo, hidreto de sódio. Adiciona-se então um composto de fórmula (VI) e aumenta a temperatura da reação. Após um período de tempo adequado, detém-se a reação e purifica-se o composto de fórmula I mediante condições convencionais (por exemplo, HPLC preparativa, CCF preparativa, etc., cromatografia ultrarrápida em fase normal).

Os compostos de fórmula (V) podem conhecer-se ou podem preparar-se utilizando métodos conhecidos.

Tal como se mostra no esquema 1 (a seguir) pode utilizar-se a amina apropriada para tratar cloreto de cloroacetilo ou similar para formar uma alfa-cloroamida. Trata-se então a alfa-cloroamida numa reação de Arbuzov para gerar um composto de fórmula V. Outras rotas para os compostos de fórmula V resultarão evidentes para um especialista.

Esquema 1

Outros compostos de fórmula (V) podem conhecer-se ou podem sintetizar-se facilmente a partir de derivados de ácido carboxílico disponíveis (por exemplo, R3COX) em que R3 é o anel de 1,2-oxazinano mostrado no esquema 2. Tal como se mostra no esquema 2 (a seguir) o derivado de ácido carboxílico pode acoplar-se num fosfonato de metilo uma vez que o fosfonato foi tratado com uma base. Isto produz um composto de fórmula (V) , embora outras rotas para obter compostos de fórmula V resultarão evidentes para um especialista.

X = Cl ou O-alquilo

Esquema 2

Se se deseja ou é necessário, podem empregar-se grupos protetores para proteger a funcionalidade no macrociclo ou macrociclo aldeidico, ou em compostos de fórmula V tal como se descreve em T. W. Green, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, Nova Iorque, 1999.

Além dos métodos específicos e as referências proporcionadas no presente documento, um especialista também pode consultar referências em livros de texto convencionais para métodos de síntese, a incluir, mas sem limitar-se a Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry (Furniss et al. , 1989) e March's Advanced Organic Chemistry (Smith e March, 2001) .

Um análogo de sangliferina de acordo com a invenção pode administrar-se sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos. A coadministração de dois (ou mais) agentes pode permitir que se utilizem menores doses de cada um, a reduzir assim os efeitos secundários, pode conduzir a potência melhorada e, portanto a SVR superior, e a uma redução na resistência.

Portanto numa realização, o análogo de sangliferina mutassintético coadministra-se com um ou mais agentes terapêuticos para o tratamento de infeção por VHC, tomado dos tratamentos de referência. Este poderia ser um interferão (por exemplo, pIFNCC e/ou ribavirina) .

Numa forma de realização alternativa, coadministra-se macrociclo de sangliferina da invenção com um ou mais agentes antivirais distintos, tais como um STAT-C (agente dirigido especificamente para o tratamento de VHC) ou DAA (antivirais de ação direta), que poderia ser um ou mais dos seguintes: inibidores não nucleosídeos da polimerase (por exemplo, ABT-333, ABT-072, BMS 791325, IDX375, VCH-222, BI 207127, ANA598, VCH-916, GS 9190, PF-00868554 (Filibuvir) ou VX-759), inibidores nucleosídeos ou nucleotídeos da polimerase (por exemplo, 2'-C-metilcitidina, 2'-C-metiladenosina, R1479, PSI-6130, R7128, R1626, PSI 7977 ou IDX 184), inibidores de protease (por exemplo ABT-450, ACH-1625, BI 201355, BILN-2061, BMS-650032, CTS 1027, Danoprevir, GS 9256, GS 9451, MK 5172, IDX 320, VX-950 (Telaprevir), SCH503034 (Boceprevir), TMC435350, MK-7009 (Vaneprivir), R7227/ITMN-191, EA-058, EA-063 ou VX 985), inibidores de NS5A (por exemplo, A-831, BMS 790052, BMS 824393, CY-102 ou PPI-461), silimarina, inibidores de NS4b, inibidores de serina C-palmitoiltransferase, nitazoxanida ou inibidores da entrada virai (por exemplo PRO 206).

Numa forma de realização alternativa, coadministra-se macrociclo de sangliferina da invenção com um ou mais agentes antivirais distintos (tal como terapia antirretroviral altamente ativa (HAART)) para o tratamento de VIH, que poderia ser um ou mais dos seguintes: inibidores nucleosídeos da transcriptasa inversa (NRTI) (por exemplo emtricitabina ou tenofovir), inibidores não nucleosídeos da transcriptase inversa (NNRTI) (por exemplo rilipivirina ou efavirenz), inibidores de protease (PI) (por exemplo ritonavir ou lopinavir), inibidores de fusão (por exemplo, maraviroc ou enfuvirtida), inibidores de CCR5 (por exemplo, aplaviroc ou vicriviroc), inibidores de maduração (por exemplo bevirimat), anticorpos monoclonais anti-CD4 (por exemplo, Ibalizumab) e inibidores de integrase (por exemplo eltiegravir).

Numa forma de realização alternativa, coadministra-se um macrociclo de sangliferina da invenção com um ou mais agentes antivirais distintos para o tratamento de VHB, que poderia ser um ou mais dos seguintes: interferões (por exemplo, interferão alfa ou interferão alfa pegilado), análogos de nucleosideo ou nucleotideo (por exemplo, lamivudina, entecavir, adefovir dipivoxil ou telbivudina), outros imunomoduladores (por exemplo, timosina alfa, CYT107 ou DV-601) ou inibidores de HMG CoA redutase (por exemplo, simvastatina).

As formulações podem apresentar-se convenientemente na forma farmacêutica unitária e podem preparar-se mediante qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Tais métodos incluem a etapa de associar o principio ativo (composto da invenção) com o portador que constitui um ou mais componentes adicionais. Em geral, as formulações preparam-se associando uniforme e intimamente o principio ativo com portadores líquidos ou portadores sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se é necessário, forma-se o produto.

Os compostos da invenção normalmente administrar-se-ão por via oral na forma de uma formulação farmacêutica que compreende o princípio ativo, opcionalmente na forma de um sal de adição de base ou ácido orgânico ou inorgânico não tóxico, numa forma farmacêutica farmaceuticamente aceitável. Dependendo do transtorno e do paciente a ser tratado, assim como da via de administração, as composições podem administrar-se em doses variáveis.

Por exemplo, os compostos da invenção podem administrar-se por via oral, bucal ou sublingual na forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentes aromatizantes ou colorantes, para aplicações de libertação imediata, retardada ou controlada.

Tais comprimidos podem conter excipientes tais como celulose microcristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina, desintegrantes tais como amido (preferivelmente amido de milho, batata ou tapioca), glicolato sódico de amido, croscarmelose de sódio e determinados silicatos complexos, e aglutinantes de granulação tais como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e goma arábiga. Adicionalmente, podem incluir-se agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, behenato de glicerilo e talco.

Também podem empregar-se composições sólidas de tipo similar como cargas em cápsulas de gelatina. Os excipientes preferidos a este respeito incluem lactose, amido, uma celulose, açúcar de leite ou polietilenglicóis de alto peso molecular. Para suspensões aquosas e/ou elixires, os compostos da invenção podem combinar-se com diversos agentes edulcorantes ou aromatizantes, colorantes ou matéria colorante, com agentes de emulsão e/ou suspensão e com diluentes tais como água, etanol, propilenglicol e glicerina, e combinações dos mesmos.

Um comprimido pode obter-se mediante compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais componentes adicionais. Os comprimidos submetidos a compressão podem preparar-se comprimindo numa máquina adequada o principio ativo na forma fluida tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturado com um aglutinante (por exemplo povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulose), lubrificante, diluente inerte, conservante, desintegrante (por exemplo glicolato sódico de amido, povidona reticulada, carboximetilcelulose de sódio reticulada), agente tensioativo ou dispersante. Os comprimidos modelados podem obter-se a modelar numa máquina adequada uma mistura do composto em pó humedecido com um diluente liquido inerte. Os comprimidos podem cobrir-se ou ranhurar-se opcionalmente e podem formular-se para proporcionar a libertação lenta ou controlada do principio ativo utilizando nos mesmos, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose em proporções variáveis para proporcionar um perfil de libertação desejado.

As formulações de acordo com a presente invenção adequadas para administração oral podem apresentar-se como unidades diferenciadas tais como cápsulas, selos ou comprimidos, contendo cada um uma quantidade predeterminada do principio ativo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão num liquido aquoso ou um liquido não aquoso; ou como uma emulsão liquida de óleo em água ou uma emulsão liquida de água em óleo. 0 principio ativo também pode apresentar-se como um bolo, electuário ou pasta.

Deve entender-se que além dos componentes mencionados particularmente antes, as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais na técnica a levar em conta o tipo de formulação em questão, por exemplo, os adequados para administração oral podem incluir agentes aromatizantes.

Vantajosamente, podem dissolver-se agentes tais como conservantes e agentes tamponantes no veiculo. Para potenciar a estabilidade, pode congelar-se a composição após o enchimento no frasco e pode retirar-se a água a vácuo. 0 pó liofilizado seco sela-se então no frasco e pode fornecer-se um frasco adjunto de água para injeção para reconstituir o liquido antes da sua utilização. A dosagem a ser administrada de um composto da invenção variará de acordo com o composto particular, a doença envolvida, o sujeito, e a natureza e a gravidade da doença e o estado fisico do sujeito, e a via de administração selecionada. A dosagem apropriada pode determinar-se facilmente por um especialista.

As composições podem conter desde 0,1% em peso, preferivelmente desde 5-60%, mais preferivelmente desde 10-30% em peso, de um composto de invenção, dependendo do método de administração.

Reconhecer-se-á por um especialista que a quantidade e separação ótimas das dosagens individuais de um composto da invenção determinar-se-ão pela natureza e o grau do estado que esteja a tratar-se, a forma, a via e o sitio de administração, e a idade e estado do sujeito particular que esteja a tratar-se, e que um médico determinará em última instância as dosagens apropriadas que estão a ser utilizadas. Esta dosagem pode repetir-se com tanta frequência como seja apropriado. Se se desenvolvem efeitos secundários, pode alterar-se ou reduzir-se a quantidade e/ou frequência da dosagem, de acordo com a prática clinica normal.

Os aspetos adicionais da invenção incluem: um composto de acordo com a invenção para a sua utilização como produto farmacêutico; um composto de acordo com a invenção para a sua utilização como produto farmacêutico para o tratamento de infeções virais (especialmente infeções por virus ARN) tal como infeção por VHC ou VIH, para a sua utilização como anti-inflamatório ou para profilaxia de rejeição de transplantes de órgãos; - uma composição farmacêutica que compreende um composto de acordo com a invenção junto com um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável; - uma composição farmacêutica que compreende um composto de acordo com a invenção junto com um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável que compreende ademais um segundo principio ativo ou principio ativo posterior, especialmente um principio ativo indicado para o tratamento de infeções virais tais como infeção por VHC ou VIH, para a sua utilização como anti-inflamatório ou para profilaxia de rejeição de transplantes de órgãos;

Descrevem-se também: - um método de tratamento de infeções virais (especialmente infeções por virus ARN) tal como infeção por VHC ou VIH, para a sua utilização como anti-inflamatório ou para profilaxia de rejeição de transplantes de órgãos que compreende administrar a um sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a invenção; - utilização de um composto de acordo com a invenção para o fabrico de um medicamento para o tratamento de infeções virais tais como infeção por VHC ou VIH, para a sua utilização como anti-inflamatório ou para profilaxia de rejeição de transplantes de órgãos. Métodos generais

Materiais e métodos

Estirpes bacterianas e condições de crescimento 0 produtor de sangliferina Streptomyces sp. A92-308110 (DSM n.° 9954, adquirido de DSMZ, Braunschweig, Alemanha) também denominado BIOT-4253 e BIOT-4370 ou os seus derivados, tais como BIOT-4585 mantêm-se em meio de agar de farinha de aveia, MAM, ISP4 ou ISP2 (veja-se a seguir) a 28°C.

Fez-se crescer BIOT-4585 (para a metodologia de construção, veja-se o exemplo 1) em agar de farinha de aveia a 28°C durante 7-10 dias. Recolheram-se as esporas da superfície da placa de agar em glicerol estéril a 20% p/v em água destilada e armazenaram-se em alíquotas de 0,5 ml a -80°C. Utilizou-se a reserva de esporas congeladas para inocular meios de inoculação SGS ou SM25-3. Incubou-se o meio de inoculação inoculado com agitação entre 200 e 300 rpm com um deslocamento vertical de 5,0 ou 2,5 cm a 27°C durante 24 horas. Inoculou-se o meio de fermentação SGP-2 ou BT6 com 2,5%-10% do cultivo inoculado e incubou-se com agitação entre 200 e 300 rpm com um deslocamento vertical de 5 ou 2,5 cm a 24°C durante 4-5 dias. Recolheu-se então o cultivo para a sua extração.

Análogo de meta-tirosina

Adquiriu-se (S)-2-amino-3-(3-fluoro-5- hidroxifenil)propanoato de metilo de NetChem (E.U.A). Adquiriu-se 3-bromo-5-fluoroanisol (9-1) de Accela ChemBio Co., Ltd., (Shanghai, China) e também pode adquirir-se de Amfinecom Inc (E.U.A.) ou Apollo Scientific Ltd. (RU)). Sintetizaram-se DL-5-fluoro-meta-tirosina (9) e 2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo (10)) tal como segue. DL-5-fluoro-meta-tirosina (9) e 2-amino~3-(3-fluoro~5-hidroxifenil)propanoato de metilo (10)

A uma solução de 9-1 (20 g, 97,55 mmol) em tetrahidrofurano (100 ml) foi adicionado gota a gota n-butil-lítio (43 ml, 2,5 M, 107,3 mmol) a -78°C. Agitou-se durante 30 minutos e adicionou-se N,N-dimetilformamida (15,1 ml, 195,1 mmol) a esta temperatura. Agitou-se durante outros 30 minutos e retirou-se o banho frio. Após 1 hora, extinguiu-se a reação com cloreto de amónio saturado aguoso. Lavou-se a fase orgânica com água e cloreto de sódio saturado aquoso, secou-se (sulfato de sódio), filtrou-se e concentrou-se. Purificou-se o resíduo mediante cromatografia em sílice para dar 9-2. A uma solução de 9-2 (6 g, 38,9 mmol) em DCM seco (200 ml) foi adicionado gota a gota BBr3 (4 M em DCM, 30 ml, 116,8 mmol) a -70°C. Após a adição, agitou-se a mistura de reação a -20°C durante 3 horas, adicionou-se água gelada cuidadosamente e extraiu-se com DCM. Lavaram-se as fases orgânicas com água e salmoura, secaram-se sobre Na2SC>4, filtraram-se e concentraram-se. Purificou-se o resíduo mediante cromatografia ultrarrápida em sílice para dar o composto desejado 9-3. A uma solução de 2-(benziloxicarbonilamino)-2-(dimetoxifosforil)acetato de metilo (4,64 g, 14 mmol) em DCM (150 ml) foi adicionado DBU (4,26 g, 28 mmol) a temperatura ambiente. Após 10 min, adicionou-se 9-3 (1,95 g, 14 mmol) e agitou-se a mistura resultante a temperatura ambiente durante a noite. Diluiu-se a solução com EtOAc (150 ml), separou-se e lavou-se a fase orgânica com HC1 1 N, secou-se sobre Na2SC>4, filtrou-se e concentrou-se. Purificou-se o resíduo mediante cromatografia ultrarrápida em sílice para dar 9-4.

Hidrogenou-se uma solução de 9-4 (1 g) em MeOH (20 ml) sobre 200 mg de Pd a 10%/C a pressão normal durante a noite. Após a eliminação do catalisador mediante filtração, evaporou-se o solvente para dar 10. A uma solução de 10 (300 mg, 1,4 mmol) em EtOH (30 ml) foi adicionado NaOH aq. (2 N, 4 ml), agitou-se a reação a temperatura ambiente durante 30 minutos. Eliminou-se o solvente e neutralizou-se o resíduo até pH=6 com HC1 2 N e recolheram-se os cristais brancos que se formaram mediante filtração para dar o composto 9 alvo.

Via alternativa para 2-amino~3-(3-fluoro~5-hidroxifenil)propanoato de metilo (10)

Adquiriu-se (3,5-difluorobromobenzeno (9a-l) de Darui Fine Chemicals Co., Ltd., (Shanghai, China) e também pode adquirir-se de Alfa Aesar ou Sigma Aldrich.)

Preparaçao de 9a-2 A uma solução de BnOH (1,61 ml, 15,54 mmol) em DMF (30 ml) foi adicionado NaH (622 mg, dispersão a 60% em óleo mineral, 15,54 mmol) a 0°C. Continuou-se com a agitação a temperatura ambiente durante 0,5 h para dar uma solução transparente. Adicionou-se 9a-l (1,79 ml, 15,54 mmol) a uma taxa tal para manter a temperatura por debaixo de 40 °C. Agitou-se a mistura a temperatura ambiente durante a noite para dar uma solução amarela. Extinguiu-se a reação mediante água e extraiu-se com éter de petróleo (35 ml X 34). Concentraram-se as fases orgânicas combinadas. E purificou-se o resíduo mediante cromatografia em gel de sílice a eluir com éter de petróleo para proporcionar 9a-2 (2,544 g) como óleo incolor.

Preparação de 9a-3 A um balão seco de três bocas foram adicionados Mg (170,1 mg, 7,10 mmol), THF anidro (10 ml) e uma pequena quantidade de iodo sob nitrogénio. Adicionou-se 1/3 de 9a-2 (1,664 g, 5,9192 mmol) em THF (2 ml). Aqueceu-se a mistura a refluxo. Durante este tempo, a mistura amarela converteu-se gradualmente em amarelo brilhante. Então, adicionaram-se os restantes 2/3 de 9a-2 gota a gota, e submeteu-se a refluxo a mistura de reação durante outras 0,5 h. À mistura anterior foi adicionado DMF (0,504 ml, 6,51 mmol) lentamente a 0°C. Continuou-se com a agitação durante 0,5 h a temperatura ambiente. Adicionou-se HC1 (2 M, 10 ml) e evaporou-se o THF. Extraiu-se o resíduo com acetato de etilo (25 ml X 3). E lavaram-se as fases orgânicas combinadas com salmoura e concentraram-se a vácuo. Purificou-se o resíduo mediante cromatografia em gel de sílice a eluir com de éter de petróleo a éter de petróleo/acetato de etilo = 20/1 para dar 9a-3 (694 mg) como óleo incolor.

Preparação de 9a-5 A uma solução de 2-(benziloxicarbonilamino)-2-(dimetoxifosforil)acetato de metilo, 9a-4 (993 mg, 3,00 mmol) em DCM (30 ml) foi adicionado DBU (832 ul, 5,57 mmol) a temperatura ambiente. Após 10 min, adicionou-se 9a-3 (694 mg, 3,01 mmol) e agitou-se a mistura resultante a temperatura ambiente durante 1 h. Lavou-se a solução com HC1 (1 M, 10 ml), e secaram-se as fases orgânicas combinadas e concentraram-se a vácuo. Purificou-se o resíduo mediante cromatografia ultrarrápida em sílice (a eluir com diclorometano/acetato de etilo = 10/1) para dar 9a-5 (1,11 g).

Preparação de 10

Hidrogenou-se uma solução de 9a-5 (100 mg) em MeOH (50 ml) sobre 20 mg de Pd a 10%/C a pressão normal durante 2 h. Após a eliminação do catalisador mediante filtração, evaporou-se o solvente para dar 10 (33 mg). Fórmulas dos meios

Preparou-se a água utilizada para preparar os meios utilizando o sistema de purificação de água de qualidade analítica Elix de Millipore

Meio de inoculação SGS

Componente (e fornecedor) Fórmula

Glucose (Sigma, G7021) 7,50 g

Glicerol (Fisher scientific, 7,50 g G/0650/25)

Extrato de levedura (Becton 1,35 g

Dickinson, 212770)

Extrato de malte (Becton 3,75 g

Dickinson, 218630)

Amido de batata (solúvel) (Sigma, 7,50 g S2004) NZ-amina A (Sigma, C0626) 2,50 g

Farinha de soja tostada, Nutrisoy 2,50 g (ADM, 063-160) L-asparagina (Sigma, A0884) 1,00 g

CaCCh (Calcitec, V/40S) 0,05 g

NaCl (Fisher scientific, 0,05 g S/3160/65) KH2PO4 (Sigma, P3786) 0,25 g K2HPO4 (Sigma, P5379) 0,50 g

MgSC>4.7H20 (Sigma, M7774) 0, 10 g

Solução de oligoelementos B 1,00 ml

Agar 1,00 g

Antiespumante SAG471 (GE * 0,20 ml

Silicones, SAG471) H2O 01 até urn vol. final de 1 1,00 1

Ajusta-se 0 pH antes da esterilização a pH 7,0 com NaOH 10 M/H2SO4 10 M

Esteriliza-se a aquecer a 121°C, 20-30 min (em autoclave)

Notas * 0 antiespumante utiliza-se só em fermentadores de inoculação, NÃO em balões de inoculação 1

Volume final ajustado em consequência para ter em conta 0 volume de inoculação

Solução de oligoelementos B

Componente Fórmula

FeS04.7H20 (Sigma, F8633) 5,00 g

ZnSC>4.7H20 (Sigma, Z0251) 4, 00 g

MnCÍ2.4H20 (Sigma, M8530) 2,00 g CUSO4.5H2O (Aldrich, 20,919-8) 0,20 g (NH4) 6M07O24 (Fisher scientific, 0,20 g A/5 72 0/48) C0CI2, 6H20 (Sigma, C2644) 0, 10 g H3BO3 (Sigma, B6768) 0, 10 g KI (Alfa Aesar, A12704) 0,05 g H2SO4 (95%) (Fluka, 84720) 1,00 ml H2O 01 até um vol. final de 1,00 1

Meio de produção SGP2

Componente Formula

Farinha de soja tostada 20,00 g (Nutrisoy) (ADM, 063-160)

Glicerol (Fisher scientific, 40,00 g G/0650/25)

Tampão MES (Acros, 172595000) 19,52 g

Antiespumante SAG471 (GE *0,20 ml

Silicones, SAG471) H2O 01 até um vol. final de **1,00 1

Ajusta-se 0 pH antes da esterilização a pH 6,8 com NaOH 10 M

Esteriliza-se a aquecer a 121°C, 20-30 min (em autoclave)

Notas * Volume final ajustado em consequência para ter em conta 0 volume de inoculação ** O antiespumante utilizou-se só em fermentadores, não em balões

Meio SM25-3 (também denominado SM25)

Componente

Glicerol (Fisher scientific, G/0650/25) 40 g

Peptona de soja A3 SC (Organotechnie) 10 g

Extrato de malta (Difco) 21 g até um vol. final de 11 Não se ajusta o pH antes da esterilização (isto é, pH 7,0)

Meio ISP4 Componente

Amido solúvel (Difco) 10 g K2HPO4 1 g

MgS04.7H20 1 g

NaCl 1 g (NH4)2S04 2 g

CaCCú 2 g

Solução de sais de oligoelementos ISP 1 ml

Agar 20 g até um volume final de 11

Fazer uma pasta com o amido num pequeno volume de água fria e levar até um volume de 500 ml

Adicionar outros componentes à solução II em 500 ml de água. O pH deve estar entre pH 7,0 e pH 7,4 (pH 7,3). Misturar duas soluções juntas e adicionar agar

Sais de oligoelementos ISP

Componente

FeS04.7H20 1 g

MnCl2.4H20 1 g

ZnS04.7H20 1 g até um volume final de 11

Armazenar a 4 graus C

Agar de farinha de aveia (ISP3)

Componente Fórmula

Farinha de aveia 20,00 g

Solução de oligoelementos ISP 1,00 ml

Agar Bacto (Becton Dickinson) 18,00 g H20 IO até um volume final de 1,00 1

Cozinham-se 20 g de farinha de aveia em 1 1 de água sobre uma placa quente (ou micro-ondas) durante 20 minutos. Filtra-se a mistura cozida através de gaze retilíneo/muselina e leva-se a pH 7,2 e volta-se a levar a 1 1. Adiciona-se 1 ml de solução de oligoelementos ISP.

Adicionam-se então 18 g por 1 de agar antes de esterilizar.

Agar MAM

Componente Fórmula

Amido de trigo (Sigma) 10,00 g Pó de maceração de milho (Roquette) 2,50 g

Extrato de levedura (Becton 3,00 g

Dickinson)

CaCCc (Calcitec) 3,00 g

FeSCd (Sigma) 0,300 g

Agar Bacto (Becton Dickinson) 20,00 g H2O IO até um volume final de 1,00 1 pH 5,8 antes de submeter a autoclave

Meios de produção BT6

Componente Fórmula

Glucose (Sigma) 50,00 g

Nutrisoy (ADM) 30,00 g

NaCl (Fisher) 5,00 g (NH4) 2SO4 (Sigma) 3,00 g

CaCC>3 (Calcitec) 6,00 g H2O IO até um volume final de 1,00 1

Ajustar 0 pH a 7,0, então adicionar CaC03

Agar ISP2

Componente Formula

Extrato de levedura (Becton Dickinson) 4,00 g

Extrato de malte (Becton Dickinson) 10,00 g

Dextrose (Sigma) 4,00 g

Agar Bacto (Becton Dickinson) 20,0 g H2O IO até um volume final de 1,00 1

Ajustar 0 pH a 7,3 antes de adicionar agar e esterilizar Método de fermentação geral

Descongelaram-se reservas de esporas crioconservadas de BIOT-4585 (para a metodologia de construção, veja-se o exemplo 1) a temperatura ambiente. Prepararam-se cultivos vegetativos (cultivos de inoculação) a transferir 4,0 ml de reserva de esporas a 400 ml de meio SM25 em balões Erlenmeyer de 2 1 com tampão de espuma. Levou-se a cabo o cultivo durante 48 horas a 27°C e 250 rpm (deslocamento vertical de 5,0 cm) . A partir do cultivo de inoculação, transferiram-se 25 ml a 250 ml de meio de produção SGP2 + HP20 a 5% em balões Erlenmeyer de 2 1 com tampão de espuma. Após 24 horas de cultivo a 24°C e 250 rpm (deslocamento vertical de 2,5 cm), adicionaram-se 2 ml de uma solução racémica 250 mM ou enant iomericamente pura 125 mM do precursor desejado (por exemplo (S)-2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo, DL-5-fluoro-meta- tirosina (9) ou 2-amino-3-(3-fluoro-5- hidroxifenil)propanoato de metilo (10)), em ácido clorídrico 1 M e 2 ml de uma solução metalónica 250 mM de ácido DL-piperázico a cada balão de produção para dar uma concentração final 1 mM dos enantiómeros individuais dos precursores. Pode utilizar-se opcionalmente DMSO em lugar de ácido clorídrico 1 M. Pode omitir-se opcionalmente o ácido DL-piperázico. Continuou-se com o cultivo durante quatro dias a 24°C e 250 rpm (deslocamento vertical de 2,5 cm) .

Análise de caldos de cultivo mediante CL-UV e CL-UV-EM

Adicionam-se caldo de cultivo (1 ml) e acetato de etilo (1 ml) e misturam-se durante 15-30 min seguido por centrifugação durante 10 min. Recolhem-se 0,4 ml da fase orgânica, evaporam-se até a secura e então voltam-se a dissolver em 0,20 ml de acetonitrilo.

Condições de HPLC:

Coluna C18 Hyperclone BDS C18, 3 u, 4,6 mm x 150 mm

Dotada de um cartucho de segurança C18 analítico de Phenomenex (KJO-4282)

Temperatura da coluna a 50°C

Velocidade de fluxo 1 ml/min Monitorizar UV a 240 nm Injetar alíquota de 20 ul Gradiente de solventes:

0 min: 55% de B

1.0 min: 55% de B

6.5 min: 100% de B

10.0 min: 100% de B

10.05 min: 55% de B

13.0 min: 55% de B O solvente A é água + ácido fórmico a 0,1% O solvente B é acetonitrilo + ácido fórmico a 0,1%

Nestas condições SfA elui aos 5,5 min Nestas condições SfB elui aos 6,5 min

Realiza-se CL-EM num sistema de HPLC HP1100 de Agilent integrado em combinação com um espectrômetro de massas por eletropulverização Esquire 3000+ de Bruker Daltonics que funciona em modo de ião positivo utilizando a cromatografia e os solventes descritos anteriormente.

Método de CL-EM QC

Condições de HPLC:

Coluna C18 Hyperclone BDS C18, 3 u, 4,6 mm x 150 mm

Dotada de um cartucho de segurança C18 analítico de Phenomenex (KJO-4282)

Temperatura da coluna a 50°C

Velocidade de fluxo 1 ml/min

Monitorizar UV a 210, 240 e 254 nm

Gradiente de solventes:

0 min: 10% de B

2,0 min: 10% de B

15 min: 100% de B

17 min: 100% de B

17,05 min: 10% de B

20 min: 10% de B O solvente A é água + ácido fórmico a 0,1% O solvente B é acetonitrilo + ácido fórmico a 0,1%

Condições de EM: A EM funciona em modo de intercalação (a intercalar entre positivo e negativo), a explorar desde 150 até 1500 uma. Método de difração de raios X de pó (XRPD)

Comprimiram-se de maneira suave aproximadamente 2 mg de amostra no suporte de amostras de sílice cortado em oblíquo individual com ruído de fundo zero de XRPD. Carregou-se então a amostra num difratómetro X-Pert MPD de Philips e analisou-se utilizando as seguintes condições experimentais: Ânodo do tubo: Cu

Tensão do gerador: 40 kV

Corrente do tubo. 40 mA

Comprimento de onda alfal: 1,5406 À

Comprimento de onda alfa2: 1,5444 À Ângulo de início [2 theta]: 5 Ângulo de finalização [2 theta]: 50

Exploração contínua

Ensaio de replicão in vitro para a avaliação da atividade antiviral contra VHC

Pode testar-se a eficácia antiviral contra o genótipo 1 de VHC tal como segue: Um dia antes da adição do artigo de teste, recolheram-se células Huh5.2 que continham o genótipo lb, replicão 13891uc-ubi-neo/NS3-3'/5.1 de VHC (Vrolijk et ai., 2003) e subcult ivadas em meio de crescimento de células [DMEM (n.° de catálogo 41965039) complementado com FCS a 10%, aminoácidos não essenciais a 1% (11140035), penicilina/estreptomicina a 1% (15140148) e geneticina a 2% (10131027); Invitrogen] a uma razão de 1,3-1,4 e crescidas durante 3-4 dias em balões de cultivo tissular de 75 cm2 (Techno Plastic Products), e semearam-se em meio de ensaio (DMEM, FCS a 10%, aminoácidos não essenciais a 1%, penicilina/estreptomicina a 1%) a uma densidade de 6500 células/poço (100 μΐ/poço) em placas de microtitulação de cultivo tissular de 96 poços (Falcon, Becton Dickinson para a avaliação do efeito antimetabólico e CulturPlate, Perkin Elmer para a avaliação do efeito antiviral). Incubam-se as placas de microtitulação durante a noite (37°C, 5% de CO2, humidade relativa de 95-99%), produzindo uma monocamada de células não confluente.

Preparam-se séries de diluição; cada série de diluição realiza-se pelo menos por duplicado. Após configurar o ensaio, incubam-se as placas de microtitulação durante 72 horas (37°C, 5% de CO2, humidade relativa de 95-99%).

Para a avaliação dos efeitos antimetabólicos, aspira-se o meio de ensaio, substitui-se por 75 μΐ de uma solução a 5% de MTS (Promega) em meio livre de vermelho fenol e incuba-se durante 1,5 horas (37°C, 5% de CO2, humidade relativa de 95-99%). Mede-se a absorbância a um comprimento de onda de 498 nm (Safire2, Tecan) e as densidades óticas (valores de DO) convertem-se em percentagens dos controlos não tratados.

Para a avaliação dos efeitos antivirais, aspira-se o meio de ensaio e lavam-se as monocamadas de células com PBS. Aspira-se o tampão de lavagem, adicionam-se 25 μΐ de tampão de lise Glo (n.° de catálogo E2661, Promega) após o gual se permite gue continue a lise durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, adicionam-se 50 μΐ de sistema de ensaio de luciferase (n.° de catálogo E1501, Promega) e quantifica-se imediatamente o sinal de luminescência de luciferase (tempo de integração de 1000 ms/poço, Safire2, Tecan). Convertem-se as unidades de luminescência relativa em percentagens dos controlos não tratados.

As CE50 e CE90 (valores obtidos a partir da curva de dose-resposta) representam as concentrações às que se observaria inibição de replicação virai de 50% e 90%, respetivamente. A CC50 (valor obtido a partir da curva de dose-resposta) representa a concentração à que a atividade metabólica das células se reduziria a 50% da atividade metabólica das células não tratadas. O indice de seletividade (IS), indicativo da janela terapêutica do composto, calcula-se como CC50/CE50.

Considera-se que uma concentração de composto provoca um efeito antiviral genuíno no sistema de replicão de VHC quando, a essa concentração particular, o efeito anti-replicão está por cima de 70% do umbral e não se observa uma redução de mais de 30% na atividade metabólica.

Ensaio de replicão in vitro para a avaliação da atividade antiviral contra VHC nos genótipos la e 2a

Fazem-se crescer células com replicão (replicões subgenómicos de genótipo la (H77) e 2a (JFH-1)) em meios essenciais modificados por Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal (FBS) a 10%, penicilina-estreptomicina (pen-estrep) a 1%, glutamina a 1%, aminoácidos não essenciais a 1%, G418 250 μg/ml num incubador com 5% de CO2 a 37°C. Todos os reagentes do cultivo celular podem adquirir-se de Mediatech (Herndon, VA).

Submetem-se as células com replicão a tripsinização e semeiam-se a 5 x 103 células por poço em placas de 96 poços com os meios anteriores sem G418. Ao dia seguinte, substitui-se o meio de cultivo com DMEM que contêm compostos diluídos em série em presença de FBS a 5%. 0 ensaio antiviral de replicão de VHC examina os efeitos dos compostos numa série de diluições de compostos. Brevemente, semeiam-se as células que contêm replicão de VHC em placas de 96 poços. Dilui-se em série o artigo de teste com DMEM mais FBS a 5%. Aplica-se o composto diluído aos poços apropriados e a placa. Após 72 h de incubação a 37°C, processam-se as células. Extrai-se o ARN intracelular de cada poço com um kit RNeasy 96 (Qiagen) . Determina-se o nível de ARN de VHC mediante um ensaio de PCR em tempo real com transcriptase inversa utilizando os reagentes de mistura padrão de RT-PCR de uma etapa TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) e um sistema de deteção de sequências ABI Prism 7900 (Applied Biosystems) tal como se descreveu anteriormente (Vrolijk et al., 2003). Medem-se os efeitos citotóxicos com os reagentes de controlo de ARN ribossómico TaqMan® (Applied Biosystems) como uma indicação do número de células. Utiliza-se então a quantidade de ARN de VHC e ARN ribossómico para obter os valores de CI50 aplicáveis (concentração que inibe a replicação do replicão em 50%).

Avaliação do metabolismo de microssomas (ensaio de estabilidade de microssomas)

Pode testar-se a taxa de metabolismo em microssomas tal como segue:

Diluíram-se microssomas de fígado de rato ou ser humano com tampão C (tampão fosfato de potássio 0,1 M, EDTA 1,0 mM, pH 7,4) até uma concentração de 2,5 mg/ml. Prepararam-se então amostras para determinar a estabilidade microssómica adicionando 50 μΐ de solução com adições conhecidas de composto 5 μΜ (0,5 μΐ de solução mãe de DMSO 10 mM em 9,5 μΐ de ACN, adicionados a 990 μΐ de tampao C) a 50 μΐ de solução microssómica (2,5 mg/ml), 110 μΐ de tampão C e misturaram-se bem. Pré-incubaram-se todas as amostras durante aproximadamente 15 minutos a 37°C. Após isto, iniciou-se a reação adicionando 40 μΐ da solução de NADPH (12,5 mM) com mistura suave. Retiraram-se aliquotas (40 μΐ) a 0, 15, 30, 45 e 60 minutos e extinguiu-se com padrão interno que continha ACN (120 μΐ) . Retiraram-se as proteínas mediante centrifugação (4000 rpm, 15 min) e analisou-se a placa de amostra para determinar a concentração do composto mediante CL-EM/EM. Calcularam-se então as semividas mediante métodos convencionais, comparando a concentração do analito com a quantidade originalmente presente.

Avaliação da estabilidade de hepatócitos

Colocam-se hepatócitos crioconservados, previamente armazenados em nitrogénio líquido, num banho de água com agitação a 37 ± 1°C durante 2 min ±15 s. Adicionam-se então os hepatócitos a volumes 10X de tampão bicarbonato de Krebs-Henseleit (KHB) pré-aquecido (glucose 2000 mg/1, sem carbonato de cálcio nem bicarbonato de sódio, Sigma), misturam-se suavemente e centrifugam-se a 500 rpm durante 3 minutos. Após a centrifugação, retira-se cuidadosamente o sobrenadante e adiciona-se um volume 10X de tampão KHB pré-aquecido para resuspender o sedimento de células. Isto mistura-se suavemente e centrifuga-se a 500 rpm durante 3 minutos. Retira-se então o sobrenadante e descarta-se. Determinam-se então a viabilidade e o rendimento celulares mediante contagens de células, e estes valores utilizam-se para gerar suspensões de hepatócitos humanos à densidade de inoculação apropriada (densidade de células viáveis = 2 x 106 células/ml) . Prepara-se uma solução de dosagem 2X em KHB pré-aquecido (DMSO a 1%) (solução com adições conhecidas 200 μΜ: 20 μΐ de solução mãe de substrato (10 mM) em 980 μΐ de DMSO, solução de dosagem 2X: 10 μΐ de solução com adições conhecidas 200 μΜ em 990 μΐ de KHB (2 μΜ após a diluição).

Adicionam-se 50 μΐ de solução de dosagem 2X pré-aquecida aos poços e adicionam-se 50 μΐ de solução de hepatócitos pré-aquecida (2 X 106 células/ml) e começa-se a medição do tempo. Incuba-se então a placa a 37°C. Adicionam-se 100 μΐ de padrão interno que contém acetonitrilo a cada um dos poços após a finalização do tempo de incubação (0, 15, 30, 60 e 120 minutos), mistura-se suavemente e adicionam-se 50 μΐ de solução de hepatócitos pré-aquecida (2 X 106 células/ml). Ao final da incubação, determina-se a viabilidade celular. Centrifugam-se as amostras a 4000 rpm durante 15 minutos a 4°C, diluem-se duas vezes os sobrenadantes com água ultrapura e analisam-se os niveis de composto mediante CL-EM/EM.

Avaliação da solubilidade em água

Pode testar-se a solubilidade em água tal como segue: Prepara-se uma solução mãe 10 mM do análogo de sangliferina em DMSO a 100% a temperatura ambiente. Levam-se aliquotas de 0,01 ml por triplicado a 0,5 ml com ou solução de PBS 0,1 M, pH 7,3 ou DMSO a 100% em frascos de cor âmbar. Agitam-se as soluções 0,2 mM resultantes, a temperatura ambiente num agitador IKA® vibrax VXR durante 6 h, seguido pela transferência das soluções ou suspensões resultantes a tubos Eppendorf de 2 ml e centrifugação durante 30 min a 13200 rpm. Analisam-se então alíquotas do fluido sobrenadante mediante o método de CL-EM tal como se descreveu anteriormente.

Alternativamente, pode testar-se a solubilidade em PBS a pH 7,4 tal como segue: Gera-se uma curva de calibração diluindo os compostos de teste e os compostos controlo até 4 0 μΜ, 16 μΜ, 4 μΜ, 1,6 μΜ, 0,4 μΜ, 0,16 μΜ, 0,0 4 μΜ e 0, 002 μΜ, com MeOH a 50% em H2O. Diluem-se então adicionalmente os pontos padrão 1:20 em MeOH:PBS 1:1. As concentrações finais após a diluição 1:20 são 2000 nM, 800 nM, 200 nM, 80 nM, 20 nM, 8 nM, 2 nM e 1 nM. Misturam-se então os padrões com o mesmo volume (1:1) de padrão interno que contém ACN (hidroximacrociclo, 6). Centrifugam-se as amostras (5 min, 12000 rpm), logo analisam-se mediante CL/EM.

Preparam-se os compostos de teste como soluções mãe em DMSO a uma concentração de 10 mM. Diluem-se as soluções mãe por duplicado em PBS, pH 7,4 em tubos Eppendorf de 1,5 ml a uma concentração alvo de 100 μΜ com uma concentração de DMSO final de 1% (por exemplo 4 μΐ de solução mãe de DMSO 10 mM em 396 μΐ de tampão fosfato 100 mM) . Agitam-se então suavemente os tubos de amostra durante 4 horas a temperatura ambiente. Centrifugam-se as amostras (10 min, 15000 rpm) para precipitar as partículas não dissolvidas. Transferem-se os sobrenadantes a tubos novos e diluem-se (o fator de diluição para o artigo de teste individual confirma-se mediante o nivel de sinal do composto no instrumento analítico aplicado) com PBS. Misturam-se então as amostras diluídas com o mesmo volume (1:1) de MeOH. Misturam-se finalmente as amostras com o mesmo volume (1:1) de padrão interno que contém ACN (hidroximacrociclo, 6) para análise de CL-EM/EM.

Avaliação da permeabilidade celular

Pode testar-se a permeabilidade celular tal como segue: Dissolve-se o composto de teste até 10 mM em DMSO e dilui-se então adicionalmente em tampão para produzir uma concentração de dosagem final de 10 μΜ. Inclui-se também o marcador de fluorescência amarelo Lucifer para monitorizar a integridade da membrana. Aplica-se então o composto de teste à superfície apical de monocamadas de células Caco-2 e mede-se a permeação do composto ao interior do compartimento basolateral. Realiza-se isto no sentido inverso (de basolateral a apical) para investigar o transporte ativo. Utiliza-se CL-EM/EM para quantificar os níveis tanto de compostos de teste como compostos controlo padrão (tal como propanolol e acebutolol) .

Avaliação in vivo da farmacocinética

Podem utilizar-se também ensaios in vivo para medir a biodisponibilidade de um composto. Geralmente, um composto administra-se a um animal de teste (por exemplo, rato ou ratazana) tanto por via intravenosa (i.v.) como por via oral (v.o.) e extraem-se amostras de sangue a intervalos regulares para examinar como varia a concentração plasmática do fármaco ao longo do tempo. Pode utilizar-se a evolução no tempo da concentração plasmática ao longo do tempo para calcular a biodisponibilidade absoluta do composto como percentagem utilizando modelos convencionais. A seguir descreve-se um exemplo de um protocolo típico.

Administrou-se a ratos 1, 10 ou 100 mg/kg do composto da invenção ou o composto original por via i.v. ou por v.o. Extraem-se amostras de sangue a 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 420 e 2880 minutos e determina-se a concentração do composto da invenção ou o composto original nas amostras mediante HPLC. Podem utilizar-se então a evolução no tempo das concentrações plasmáticas para obter parâmetros clave tais como a área sob a curva de concentração plasmática-tempo (AUC - que é diretamente proporcional à quantidade total de fármaco sem alterar que alcança a circulação sistémica) , a concentração plasmática do fármaco máxima (pico), o tempo em que se produz a concentração plasmática do fármaco máxima (tempo de pico); os fatores adicionais que se utilizam na determinação precisa da biodisponibilidade incluem: a semivida terminal do composto, o aclaramento corporal total, o volume de distribuição em estado estacionário e % de F. Analisam-se então estes parâmetros mediante métodos compartimentais e não compartimentais para dar uma biodisponibilidade em percentagem calculada, para um exemplo deste tipo de método veja-se Egorin et ai. 2002, e referências no mesmo.

Avaliação in vivo de farmacocinética oral e intravenosa (método especifico)

Para determinar análogos de sangliferina, analisa-se sangue completo. Os compostos formulam-se em 5% de etanol / 5% de Cremophor EL / 90% de solução salina para administração tanto por v.o. como por via i.v. Administra-se a grupos de 3 ratos CD1 macho ou 1 mg/kg por via i.v. ou 5 ou 10 mg/kg por v.o. Extraem-se amostras de sangue (40 μΐ) através da veia safena, antes da administração e às 0,25, 0,5, 2, 8 e 24 horas, e diluem-se com uma quantidade igual de dfhO e colocam-se em gelo seco imediatamente. Armazenam-se as amostras a -70°C até a análise. Determina-se a concentração do composto da invenção ou composto original na amostra mediante CL-EM tal como segue: adicionam-se 20 μΐ de sangue:H20 (1:1, v/v)/amostra PK com 20 μΐ de padrão interno (hidroximacrociclo, 6 ) a 20 μΐ de solução de trabalho 100 ng/ml/MeOH e 150 μΐ de ACN, agita-se com vortex durante 1 minuto a 1500 rpm, e centrifuga-se a 12000 rpm durante 5 min. Injeta-se então o sobrenadante em CL-EM/EM. Representa-se graficamente a evolução no tempo das concentrações em sangue e utiliza-se para obter a área sob a curva de concentração em sangue completo-tempo (AUC - que é diretamente proporcional à quantidade total de fármaco sem alterar que alcança a circulação sistémica). Estes valores utilizam-se para gerar parâmetros PK quando for possível.

Avaliação in vitro da citotoxicidade

Fazem-se crescer células Huh-7 e HepG2 obtidas da ATCC em meios essenciais modificados por Dulbecco (DMEM) que contêm soro bovino fetal (FBS) a 10%, penicilina-estreptomicina (pen-estrep) a 1% e glutamina a 1%; enquanto que se fazem crescer células CEM (células de leucemia de células T humanas obtidas da ATCC) em meio RPMI 1640 com FBS a 10%, pen-estrep a 1% e glutamina a 1%. Isolam-se CMSP humanas recentes de sangue completo obtido pelo menos de dois dadores examinados normais. Brevemente, as células de sangue periférico sedimentam-se/lavam-se 2-3 vezes mediante centrifugação a baixa velocidade e resuspensão em PBS para eliminar as plaquetas contaminantes. As células sanguíneas lavadas diluem-se então 1:1 com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) e estratificam-se sobre 14 ml de meio de separação de linfócitos (LSM; crescimento celular realizado por Mediatech, Inc.; densidade 1,078+/-0,002 g/ml; N.° de catálogo 85-072-CL) num tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugam-se durante 30 minutos a 600 X g. Aspiram-se suavemente as CMSP dispostas em bandas da superfície de contato resultante e posteriormente lavam-se 2X com PBS mediante centrifugação a baixa velocidade. Após a lavagem final, contam-se as células mediante exclusão com azul de tripano e resuspendem-se a 1 x 107 células/ml em RPMI 1640 complementado com soro bovino fetal (FBS) a 15%, L-glutamina 2 mM, PHA-P 4 μρ/ιηΐ. Permite-se incubar as células durante 48-72 horas a 37°C. Após a incubação, centrifugam-se as CMSP e resuspendem-se em RPMI 1640 com FBS a 15%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 μρ/ιηΐ, gentamicina 10 μg/ml e IL-2 humana recombinante 20 U/ml.

Avalia-se a citotoxicidade do composto testando concentrações semilogarítmicas de cada composto por triplicado contra as células descritas anteriormente. O meio que continha células só serve como controlo celular (CC) . Semeiam-se células Huh-7 e HepG2 em placas de 96 poços a uma concentração de 5 x 103 células por poço. Ao dia seguinte, aspiram-se os meios e adicionam-se 100 μΐ de meios correspondentes que contêm FBS a 5%. Preparam-se diluições do fármaco de teste a uma concentração 2X em tubos de microtitulação e colocam-se 100 μΐ de cada concentração nos poços apropriados num formato convencional. Após 72 horas, processam-se as células para a avaliação da citotoxicidade.

Diluem-se CMSP em meio recente e semeiam-se nos poços interiores de uma microplaca de 96 poços de fundo redondo a 5 x 104 células/poço num volume de 100 1. De maneira similar, semeiam-se em placa células CEM a 1 x 104 células/poço. Então, adicionam-se 100 μΐ de preparações 2X dos fármacos de teste nos poços apropriados num formato convencional. Mantêm-se os cultivos durante de seis a sete dias e processam-se então para a determinação da citotoxicidade. A citotoxicidade determina-se utilizando o kit de ensaio de integridade de membrana homogéneo CytoTox-ONE™ (Promega). O ensaio mede a libertação de lactato deshidrogenase (LDH) de células com membranas danificadas num formato fluorométrico homogéneo. A LDH liberada ao meio de cultivo mede-se com um ensaio enzimático acoplado que dá como resultado a conversão de resazurina num produto de resorufina fluorescente. A quantidade de fluorescência produzida é proporcional ao número de células Usadas. Aplicam-se seis concentrações diluídas em série de cada composto às células para obter quando for aplicável os valores de CT50 (concentração tóxica do fármaco que diminui a viabilidade celular em 50%) e CT90 (concentração tóxica do fármaco que diminui a viabilidade celular em 90%).

Avaliação in vitro da inibição de transportadores MDR1 e MRP2

Para avaliar a inibição e a ativação dos transportadores MDR1 (glicoproteína P 1) e MRP2, pode utilizar-se um ensaio de ATPase in vitro de Solvo Biotechnology Inc. (Glavinas et al.r 2003) . Incubam-se os compostos (a 0,1, 1, 10 e 100 μΜ) com vesículas de membrana MDR1 ou MRP2 tanto em ausência como em presença de vanadato para estudar a possível ativação de ATPase. Além disso, realizam-se incubações similares em presença de verapamilo/sulfasalazina com o fim de detetar a possível inibição da atividade ATPase do transportador. A atividade ATPase mede-se quantificando o fosfato inorgânico espectrofotometricamente. A ativação calcula-se a partir do aumento sensível a vanadato na atividade ATPase. A inibição determina-se mediante a diminuição na atividade ATPase mediada por verapamilo/sulfasalazina.

Avaliação in vitro da inibição de transportadores Pgp utilizando células MDCK

Para avaliar a inibição do transportador glicoproteína P (Pgp/MDRl), utilizou-se um ensaio de ATPase in vitro de Cyprotex. Utilizaram-se células MDR1-MDCK obtidas do NIH (Rockville, MD, E.U.A.). Após o cultivo, prepararam-se as monocamadas aclarando as superfícies tanto basolateral como apical duas vezes com tampão a pH 7,4 e 37°C. Incubaram-se então as células com tampão a pH 7,4 nos compartimentos tanto apical como basolateral durante 40 min a 37°C e 5% de CO2 com uma humidade relativa de 95% para estabilizar os parâmetros fisiológicos. Para o estudo de apical a basolateral (A-B), retirou-se o tampão a pH 7,4 do compartimento apical e substituiu-se por soluções de dosagem de loperamida antes de colocar-se nas placas "complementares". Prepararam-se as soluções diluindo loperamida em DMSO com tampão para dar uma concentração final de loperamida de 5 μΜ (a concentração final de DMSO ajusta-se a 1%) . Incluiu-se também o marcador de integridade fluorescente amarelo Lucifer na solução de dosagem. Realizou-se a experiência em presença e ausência do composto de teste (aplicado aos compartimentos tanto apical como basolateral). Para o estudo de basolateral a apical (B-A), colocou-se o substrato da glicoproteína P, loperamida (concentração final = 5 μΜ) no compartimento basolateral. Realizou-se a experiência em presença e ausência do composto de teste (aplicado aos compartimentos apical e basolateral). Levaram-se a cabo incubações numa atmosfera de 5% de CO2 com uma humidade relativa de 95% a 37°C durante 60 min. Após o período de incubação, retirou-se a placa complementar e diluíram-se as amostras apical e basolateral para a sua análise mediante CL-EM/EM. Realizou-se uma única determinação de cada concentração de composto de teste. Em cada placa, examinou-se também um inibidor de controlo positivo. Avaliou-se o composto de teste a 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 e 50 μΜ. Comprovou-se a integridade das monocamadas ao longo de toda a experiência monitorando a permeação de amarelo Lucifer utilizando análise fluorimétrica. Após a análise, calculou-se uma CI50 (isto é, concentração de inibidor (fármaco de teste) que logra a metade do efeito de inibição máxima).

Avaliação in vitro de inibição de transportadores de captação

Para avaliar a inibição dos transportadores de captação 0AT1B1 e 0AT1B3, utilizou-se um ensaio de transportador de captação in vitro de Solvo Biotechnology Inc. Realizaram-se experiências de captação com artigo de teste (AP) a 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 e 50 μΜ, em células CHO que expressam de maneira estável os transportadores SLC humanos OATP1B1 e OATP1B3. Utilizou-se a linha celular parental CHO-K como controlo negativo. Semearam-se em placa células (1 x 105 em 200 μΐ de mistura 1:1 de meio de Eagle modificado por Dulbecco e DMEM-F12 de Ham (F-12, Lonza, Nova Jersey, E.U.A.) complementado com butirato de sódio 5 mM) em placas de cultivo tissular de 96 poços convencionais e incubaram-se 24 horas antes da experiência a 37°C numa atmosfera de 5% de CO2 e 95% de ar. Antes das experiências, aspirou-se o meio mediante sucção a vácuo, lavaram-se as células com 2 x 100 μΐ de tampao de Krebs-Henseleit, pH 7,3 (preparado a partir de Sigma chemicals, Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Levaram-se a cabo as experiências de captação a 37°C em 50 μΐ de tampão de Krebs-Henseleit (pH 7,3) que continha o substrato de sonda e o AP ou solvente, respetivamente. A concentração do solvente orgânico foi igual em cada poço e não superou 1% v/v. O substrato de sonda para o ensaio de OATP1B1 foi E3S (0,1 μΜ) e para o ensaio de OATP1B3 foi Fluo-3 (10 μΜ) . Determinou-se a quantidade translocada de substrato de sonda para cada poço em cpm. Calcularam-se as atividades relativas a partir da equação:

% de atividade = (A-B)/(C-D)xlOO

Em que A= quantidade translocada de substrato em presença de AP em células transfectadas, B= quantidade translocada de substrato em presença de AP em células parentais, C= quantidade translocada de substrato em presença de solvente em células transfectadas e D= quantidade translocada de substrato em presença de solvente em células parentais. A CI50 definiu-se como a concentração de AP necessária para inibir o transporte do substrato de sonda em 50%. A CI50 obteve-se da equação loqística de três parâmetros; uma curva ajustada na representação gráfica da atividade relativa frente à concentração de AP mediante regressão não linear.

Avaliação in vitro de inibição de transportadores de fluxo de saida

Para avaliar a inibição dos transportadores de fluxo de saida MRP2, MRP3 e BSEP, utilizou-se um ensaio de transportador vesicular in vitro de Solvo Biotechnology Inc. Incubaram-se os artículos de teste (AP) (a 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 e 50 μΜ) com vesículas de membrana de transportador de fluxo de saída (Solvo Biotechnology Inc.) tanto em ausência como em presença de ATP 4 mM para distinguir entre captação mediada por transportador e difusão passiva de AP ao interior das vesículas. No caso dos transportadores MRP2 e MRP3, levaram-se a cabo as reações em presença de glutationa 2 mM. Pré-incubaram-se as misturas de reação durante dez minutos a 37°C. Iniciaram-se as reações mediante a adição de 25 μΐ de MgATP 12 mM (concentração final de 4 mM no ensaio) ou tampão de ensaio para os controlos de fundo. Detiveram-se as reações adicionando 200 μΐ de tampao de lavagem gelado e seguido imediatamente por filtração em filtros de fibra de vidro num formato de 96 poços (placa de filtro). Adicionou-se tampão de cintilação à placa de filtro lavada e secada e posteriormente realizou-se a contagem de cintilação. Submeteram-se os substratos de sonda a taurocolato (2 μΜ) para as vesículas de BSEP e a Ε2ΐ7βΘ (1 μΜ) para as vesículas de MRP2 e MRP3. Para todos os poços, determinou-se a quantidade translocada do substrato de sonda em unidades de cpm. Calcularam-se as atividades relativas com a seguinte equação: % de atividade = (A-B)/(C-D)xlOO, em que A= quantidade translocada de substrato em presença de AP e ATP, B= quantidade translocada de substrato em presença de AP, C= quantidade translocada de substrato em presença de solvente e ATP e D= quantidade translocada de substrato em presença de solvente. A CI50 definiu-se como a concentração de AP necessária para inibir o transporte do substrato de sonda num 50%. A CI50 obteve-se da equação logística de três parâmetros; uma curva ajustada na representação gráfica da atividade relativa frente à concentração de AP mediante regressão não linear.

Ensaio in vitro para avaliar a atividade antiviral contra VIH

Pode testar-se a eficácia antiviral contra VIH tal como segue: Isolam-se macrófagos e linfócitos T CD4+ derivados de sangue tal como se descreveu anteriormente (Bobardt et ai., 2008). Brevemente, purificaram-se CMSP humanas de sangue recente a obter bandas em Ficoll-Hypaque (30 min, 800 g, 25°C). Purificaram-se células T CD4+ humanas a partir das CMSP mediante seleção positiva com pérolas Dynabead anti-CD4 e posterior libertação utilizando Detachabead. Cultivaram-se as células em meio RPMI 1640 (Invitrogen) complementado com FCS a 10%, MEM-aminoácidos, L-glutamina, MEM-vitaminas, piruvato de sódio e penicilina mais estreptomicina e ativaram-se posteriormente com o superantigeno bacteriano enterotoxina B de Staphylococcus (SEB; 100 ng/ml) e células CMSP destruídas com mitomicina C de outro dador (razão de células CMSP:CD4 10:1). Três dias após a estimulação, repartiram-se as células 1:2 em meio que continha IL-2 (concentração final 200 unidades/ml). Repartiram-se então os cultivos 1:2 cada 2 dias em meio de IL-2 e infetaram-se com VIH aos 7 dias após a estimulação. Para gerar macrófagos humanos primários, purificaram-se monócitos a partir de CMSP humanas mediante seleção negativa e ativaram-se e cultivaram-se a uma concentração celular de 106/ml em DMEM, complementado com FCS a 10%, MEM-aminoácidos, L-glutamina, MEM-vitaminas, piruvato de sódio e penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 mg/ml) e fator estimulador de colónias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) humano recombinante 50 ng/ml e mantiveram-se a 37°C numa atmosfera humidificada complementada com 5% de CO2. Para obter macrófagos derivados de monócitos, permitiu-se que as células se aderissem ao plástico e cultivaram-se durante 6 dias para permitir a diferenciação.

Incubaram-se células HeLa CD4+, células de Jurkat, linfócitos T de sangue periférico CD4+ ativados e macrófagos (500.000 células/100 μΐ) com pNL4.3GFP (virus X4) ou pNL4.3-BaL-GFP (vírus R5) (100 ng de p24) em presença de concentrações crescentes do artigo de teste. Quarenta e oito horas depois, pontuou-se a infeção analisando a percentagem de células positivas para GFP mediante FACS e calculou-se a CE50.

Ensaio in vitro para avaliar a atividade antiviral contra VHB

Pode testar-se a eficácia antiviral contra VHB tal como segue: Semeiam-se em placa células HepG2 2.2.15 em placas de microtitulação de 96 poços. Após 16-24 horas, lava-se a monocamada confluente de células HepG2 2.2.15 e substitui-se o meio por meio completo que contém diversas concentrações de um composto de teste por triplicado (por exemplo, seis concentrações semilogaritmicas) . Três dias depois, substitui-se o meio de cultivo por meio recente que contém os compostos de teste diluídos de maneira apropriada. Seis dias após a administração inicial do composto de teste, recolhe-se o sobrenadante do cultivo celular, trata-se com pronase e logo utiliza-se num ensaio de qPCR TaqMan quantitativo em tempo real. Deteta-se o ADN de VHB amplificado por PCR em tempo real monitorando os aumentos nos sinais de fluorescência que resultam da degradação exonucleotídica de uma molécula de sonda fluorescente extinguida que se híbrida com o ADN de VHB amplificado. Para cada amplificação por PCR gera-se simultaneamente uma curva padrão utilizando diluições de ADN de VHB purificado. Calcula-se a atividade antiviral a partir da redução nos níveis de ADN de VHB (CI50) · Emprega-se então um ensaio de captação de colorante para medir a viabilidade celular, que se utiliza para calcular a toxicidade (CT50) . Calcula-se o índice terapêutico (IT) como CT50/CI50.

Ensaio de reação linfocitária mista (MLR) in vitro para a avaliação da atividade imunossupressora

Testou-se a atividade imunossupressora tal como segue: Purificaram-se populações de células mononucleares de sangue periférico (CMSP) do sangue de dois dadores voluntários não relacionados normais (A e B) , utilizando centrifugação em Histopaque. Contaram-se as células e semearam-se em placa a 1 x IO5 células por poço em placas de 96 poços em meios RPMI, com complementos e soro de AB humano a 2%.

As condições de cultivo incluíram: populações de células A e B solas e população de células A e B mista em ausência ou presença de compostos de teste, cada um a 6 concentrações diferentes. Testaram-se os compostos a doses que oscilavam entre 10 μΜ e 0, 0001 μΜ em incrementos de 1 log. Os poços controlo continham uma concentração comparável de veículo (DMSO a 0,5%) à presente nos poços com composto de teste. Estabeleceram-se os cultivos por triplicado numa placa de 96 poços e incubaram-se a 37°C em 5% de CO2 numa atmosfera humidificada. Adicionou-se 3H-timidina no dia 6 após estabelecer o ensaio e recolheram-se 24 h depois. Compararam-se então os níveis de proliferação entre as diferentes condições de cultivo.

Calculou-se a capacidade de cada diluição de composto de teste para inibir a proliferação na MLR como inibição em percentagem. Isto permitiu uma estimação da CI50 (concentração de composto de teste que deu como resultado uma redução de 50% das contagens por minuto). Com o fim de calcular a CI50, transformou-se o eixo X numa escala logarítmica. Utilizou-se regressão não linear para ajustar aos pontos de dados médios. Selecionou-se uma pendente variável sigmoide.

Análise de ELISA da interação Cyp-NS5A.

Utilizou-se este ensaio para medir a alteração de complexos Cyp-NS5A, o que pode utilizar-se para mostrar a potência de interação com ciclofilina D. Brevemente, levou-se a cabo a produção e purificação das proteínas recombinantes GST, GST-CypD e Conl NS5A-His tal como se descreveu anteriormente (Chatterji et al., 2010). Cobriram-se placas em tiras de 8 poços Nunc MaxiSorb com GST ou GST-CypD durante 16 h a 4°C e bloquearam-se. Adicionou-se NS5A-His recombinante (1 ng/ml) aos poços em 50 μΐ de tampão de união (Tris 20 mM, pH 7,9, NaCl 0,5 M, glicerol a 10%, DTT 10 mM e NP-40 a 1%) durante 16 h a 4°C. Detetou-se posteriormente NS5A-His capturada utilizando anticorpos de rato anti-His (1 μρ/ιηΐ) (anti-6xHis, Clontech) e anticorpos de coelho anti-fosfatase-peroxidasa do rábano (HRP) de rato (diluição 1:1000) . Todas as experiências realizaram-se duas vezes utilizando dois lotes diferentes de proteínas recombinantes CypD e NS5A.

Análise anti-PPIase da inibição de ciclofilina

Descreve-se uma metodologia alternativa para analisar a interação com ciclofilinas tal como segue: Determinou-se a atividade PPIase de CypA ou D recombinante, produzida pela excisão por trombina de GST-CypA ou D, seguindo a taxa de hidrólise de N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida mediante quimiotripsina. A quimiotripsina só hidrolisa a forma trans do peptídeo, e a hidrólise da forma cis, cuja concentração maximiza-se utilizando uma solução mãe dissolvida em trifluoroetanol que contém LiCl 470 mM, está limitada pela taxa de isomerização cis-trans. Equilibrou-se CypA ou D durante lha 5°C com o artigo de teste selecionado utilizando uma concentração de fármaco que oscila entre 0,1 e 20 nM. A reação começou mediante a adição do peptídeo, e monitorou-se espetrofotometricamente a alteração na absorbância a 10 pontos de dados por segundo. Restaram-se as taxas de hidrólise do branco (em ausência de CypA ou D) das taxas em presença de CypA ou D. Analisaram-se as taxas iniciais da reação enzimática mediante análise de regressão de primeira ordem da evolução no tempo da alteração na absorbância.

Exemplos

Exemplo 1 - Construção de um mutante de deleção de sfaA de Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954)

1.1 Construção do construto de deleção de sfaA

Escindiu-se o fragmento de EcoRV-StuI de ~7 kb do cosmideo TL3006 (SEQ ID NO. 3) que engloba sfaA (posição de nucleotideo 14396-21362, número de registro de sequência de NCBI, FJ809786) mediante digestão com EcoRV e StuI e ligou-se o fragmento isolado resultante diretamente em pKC1139 que tinha sido digerido previamente com EcoRV e tratou-se com fosfatase alcalina de camarão (Roche). Este plasmídeo denominou-se pSGK268.

Realizou-se uma deleção em marco do gene sfaA contido dentro deste clone utilizando o kit de recombinação Red/ET fornecido por Gene Bridges (número de catálogo K006). (SEQ ID NO. 1) SfaA17161f 5’-

CGCTCTGTGGCGCCTGGTTTCCAAGCGGCTCGCGGACCGGCACCGGCACATGCATAATTA ACCCTCACTAAAGGGCG-3’ (SEQ ID NO. 2) SfaA17825r 5'- TGGATGTATCGTCGCAGGACGCCCAGAATTCACCTGCGACGTCCTCCAGATGCATTAATAC G ACT CACT AT AGG G CTC-3’

Utilizaram-se dos oligonucleotideos, SfaA17161f e

SfaA17825r para amplificar o marcador de neomicina do ADN de molde FRTPGK-gb2-neo-FRT fornecido no kit utilizando a ADN polimerase de KOD. Isolou-se o produto amplificado resultante de ~1,7 kb mediante eletroforese em gel e purificou-se o gel com resina QiaEX.

Transformou-se o plasmídeo pSGK268 em E. coli DH10B utilizando técnicas convencionais e selecionou-se em placas que continham apramicina (50 μρ/ιηΐ) . A introdução do construto de deleção realizou-se essencialmente seguindo o protocolo do kit de Gene Bridges. Fez-se crescer uma única colónia durante a noite em 2TY-apramicina (50 μg/ml) e transformou-se com o plasmídeo pRedET (tet) e selecionou-se em apramicina (50 μρ/ιηΐ) e tetraciclina (3 μρ/ιηΐ) a 30°C. Utilizou-se uma única colónia para preparar um cultivo durante a noite desta estirpe em 3 ml de 2TY-apramicina (50 μρ/ιηΐ) e tetraciclina (3 μρ/ιηΐ) a 30°C. Utilizaram-se 0,5 ml deste cultivo para inocular 10 ml de 2TY-apramicina (50 μρ/ιηΐ) e tetraciclina (3 μρ/ιηΐ) a 30°C e fizeram-se crescer até uma DCúoonm ~0,5. Transferiram-se 1,4 ml deste cultivo a cada um de 2 tubos Eppendorf e adicionaram-se 50 μΐ de arabinose a 10% a um tubo para induzir a expressão das proteínas de recombinação Red/ET. Agitaram-se os tubos durante ~1 hora a 37°C. Sedimentaram-se as células induzidas e não induzidas numa centrífuga de sobremesa e lavaram-se duas vezes com água estéril fria, resuspendendo e centrifugando para sedimentar as células cada vez. Suspenderam-se os sedimentos resultantes em aproximadamente 30-40 μΐ de água e mantiveram-se em gelo. Adicionou-se o fragmento de alteração de 1,7 kb isolado previamente aos tubos induzidos e não induzidos e transferiu-se a eletrocubas de 1 mm de Biorad em gelo. Submeteram-se as amostras a eletroporação (micropulsador de Biorad a 1,8 kV, constante de tempo resultante ~4 ms) e adicionou-se 1 ml de 2TY (sem antibióticos) e misturou-se para retirar as células da cuba. Incubaram-se as células durante ~3 horas a 37°C com agitação (1100 rpm, termomisturador compacto Eppendorf) antes de semear em placas com 2TY que continha apramicina 50 μρ/ιηΐ e kanamicina 25 μρ/ιηΐ e incubaram-se durante a noite a 37°C. Dispuseram-se as colónias das placas de amostra induzidas em franjas sobre placas com 2TY que continha kanamicina a 50 μρ/ιηΐ para purificar e confirmar a introdução do cassete de resistência a kanamicina. Utilizou-se PCR em colónias de bactérias individuais para confirmar a introdução do cassete. Prepararam-se plasmideos a partir destes cultivos e digeriram-se para confirmar o plasmideo esperado pSGK270. Digeriram-se então os plasmideos com Nsil para eliminar o fragmento marcador, e voltou-se a ligar o resto para produzir o construto de deleção em marco de sfaA pSGK271. 1.2 Conjugação de Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) e

introdução de uma deleção de sfaA

Transformou-se o plasmideo pSGK271 em E. coli ET12567 pUZ8002 utilizando técnicas convencionais e selecionou-se em placas com 2TY que continha apramicina (50 μρ/ιηΐ), kanamicina (25 μρ/ιηΐ) e cloranfenicol (10 μρ/ιηΐ). Inoculou-se a estirpe resultante em 3 ml de 2TY liquido que continha apramicina (50 μρ/ιηΐ), kanamicina (25 μρ/ιηΐ) e cloranf enicol (10 μρ/ιηΐ) e incubou-se durante a noite a 37°C, 250 rpm. Utilizaram-se 0,8 ml deste cultivo para inocular 10 ml de 2TY liquido que continha apramicina (50 μρ/ιηΐ) , kanamicina (25 μρ/ιηΐ) e cloranf enicol (10 μρ/ιηΐ) num tubo Falcon de 50 ml e incubou-se a 37°C, 250 rpm, até que se alcançou uma DCboonm ~0,5. Centrifugou-se o cultivo resultante a 3500 rpm durante 10 minutos a 4°C, lavou-se duas vezes com 10 ml de meios 2TY utilizando centrifugação para sedimentar as células após cada lavagem.

Resuspendeu-se o sedimento resultante em 0,5 ml de 2TY e manteve-se em gelo antes da sua utilização. Cronometrou-se este procedimento para que coincidisse com a preparação completa de esporas de Streptomyces descrita a seguir.

Recolheram-se esporas de Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) (Biot-4370) de uma placa confluente de 1-2 semanas resuspendendo em ~3 ml de glicerol a 20%. Centrifugaram-se as esporas (5000 rpm, 10 minutos a temperatura ambiente) e lavaram-se duas vezes com tampão TES 50 mM antes de resuspender em 1 ml de tampão TES 50 mM e repartir entre 2 tubos Eppendorf. Submeteram-se a choque térmico estes tubos a 50°C durante 10 minutos num banho de água antes de adicionar 0,5 ml de 2TY e incubar num termomisturador compacto Eppendorf a 37°C durante 4-5 horas.

Misturaram-se as E. coli ET12567 pUZ8002 pSGK271 e Biot-4370 preparadas a razões de 1:1 (250 μΐ de cada estirpe) e 1:3 (100 μΐ de E. coli) e estenderam-se imediatamente sobre placas R6 e transferiram-se a um incubador a 37°C. Após aproximadamente 2 horas de incubação cobriram-se estas placas com 2 ml de água estéril que continha ácido nalidixico para dar uma concentração final em placa de 25 [lq/1. Devolveram-se as placas ao incubador a 37°C durante a noite antes de cobrir com 2 ml de água estéril que continha apramicina para dar uma concentração final em placa de 20-25 [lq/1. Dispuseram-se em parches as colónias exconjugantes que apareceram após ~4-7 dias em meios ISP4 que continham apramicina (25 μρ/1) e ácido nalidixico (25 μρ/1) e incubaram-se a 3 7°C. Uma vez que se observou crescimento micelial adequado, voltaram-se a dispor em parches as colónias em meios ISP4 que continham apramicina (25 μρ/1) a 37°C e permitiu-se que esporulassem.

Subcultivaram-se então as estirpes três vezes (para promover a eliminação do plasmídeo sensível a temperatura) dispondo em parches em ISP4 (sem antibiótico) e incubando a 37°C durante 3-4 dias. Finalmente dispuseram-se em parches as estirpes em ISP4 e incubaram-se a 28°C para permitir a esporulação completa (5-7 dias). Recolheram-se as esporas e realizaram-se diluições em série em placas com ISP4 a 28°C para permitir a seleção de colónias individuais. Dispuseram-se em parches duplamente as colónias individuais esporuladas em placas com ISP4 com ou sem apramicina (25 μρ/1) para confirmar a perda do plasmídeo e permitiu-se que crescessem ~7 dias antes de testar a produção de sangliferinas. 1.3 Exame de estirpes para a produção de sangliferinas em tubos Falcon

Utilizou-se um único tampão de agar de ~7 mm de uma estirpe bem esporulada para inocular 7 ml de meios SM25-3 estéreis e incubou-se a 27°C, 200 rpm, num agitador com um deslocamento vertical de 2". Após 48 horas de crescimento, transferiram-se 0,7 ml deste cultivo a um tubo Falcon esterilizado que continha 7 ml de meios SGP2 com resina HP20 a 5%. Fizeram-se crescer os cultivos a 24°C, 300 rpm, num incubador com agitação com deslocamento vertical de 1 polegada durante 5 dias antes da recolhida. Retiraram-se 0,8 ml de cultivo bacteriano e adicionaram-se alíquotas a um tubo Eppendorf de 2 ml, assegurando-se da dispersão adequada da resina por todo o cultivo antes de adicionar as alíquotas. Adicionaram-se 0,8 ml de acetonitrilo e 15 μΐ de ácido fórmico e misturou-se o tubo durante aproximadamente 30 minutos. Aclarou-se a mistura mediante centrifugação e retiraram-se 170 μΐ do extrato num frasco de HPLC e analisaram-se mediante HPLC. 1.4 Análise das estirpes para determinar a reversão ao tipo natural ou fenótipo de sfaA.

Analisaram-se extratos de estirpes mediante HPLC. As estirpes que produziam sangliferina A e B não se analisaram adicionalmente, já que tinham revertido ao tipo natural. As estirpes que careciam de produção de sangliferina A e B mostraram pequenos níveis (~l-2 mg/1) de um pico com um tempo de retenção de 6,5 minutos que apresentou a sangliferina como um cromóforo. A análise mediante CL-EM indicou que este pico tinha uma m/z 1073, -16 unidades da m/z esperada de sangliferina. Postulou-se que este pico se devia à incorporação de fenilalanina em ausência de meta-hidroxitirosina.

Posteriormente fizeram-se crescer de novo oito estirpes que mostraram perda de produção de sangliferina para avaliar se a possível mutação de sfaA podia complementar-se quimicamente permitindo um procedimento mutassintético para obter sangliferinas novas. Fizeram-se crescer as estirpes em meios de inoculação SM25-3 durante 48 horas antes de transferir aos meios de produção SGP2 com resina a 5%. Após um crescimento adicional de 24 horas alimentaram-se as estirpes por triplicado com DL-meta-hidroxitirosina 2 mM (adição de 100 ul de uma solução 0,16 M em HC1 1 M) ou L-fenilalanina 2 mM com uma estirpe não alimentada utilizada como controlo. Alimentou-se também às estirpes com ácido pipecólico (2 mM) em metanol) para potenciar os rendimentos de produto. Recolheram-se as estirpes após um crescimento adicional de 4 dias e extraíram-se e analisaram-se mediante HPLC. Mostrou-se que a meta-hidroxitirosina complementava completamente a mutação de sfaA e a adição de L-fenilalanina aumentava os níveis do composto -16 uma.

Elegeu-se a estirpe Biot-4585 para estudar adicionalmente como mutante de deleção de sfaA.

Exemplo 2 - Outros métodos para a construção do construto de deleção de sfaA

Podem utilizar-se outros métodos para gerar mutantes de deleção de sfaA. Os exemplos incluem mutantes de inativação por inserção de sfaA (tal como exemplo 12 do documento W02010/034243). Esta estirpe gerou-se tal como se descreve no documento W02010/034243, e foi dada a designação de estirpe BIOT-4452.

Num procedimento alternativo para gerar a deleção de sfaA, utilizam-se dois oligonucleotídeos 15209F 5'-CAGAGAATTCGCGGTACGGGGCGGACGACAAGGTGTC-3' (SEQ ID NO. 4) e

17219R 5'-GCGCATGCATGTGCCGGTGCCGGTCCGCGAGCCGCTTGG-3' (SEQ ID NO. 5) para amplificar uma região de homologia no sentido de 5' utilizando o cosmídeo TL3006 (SEQ ID NO. 3) como molde e a ADN polimerase de KOD. Trata-se o produto amplificado com a polinucleotídeo cinase de T4 (NEB) e clona-se em pUC18 que foi desfosforilado mediante tratamento com fosfatase alcalina de camarão (Roche). Comprova-se o construto resultante mediante digestão de restrição e sequencia-se completamente para garantir que se gera a sequência desejada e que não foram introduzidos erros durante a amplificação com polimerase. Digere-se este construto com .EcoRI e Nsi I e analisam-se os produtos mediante eletroforese em gel. Escinde-se a banda que contém a sequência desejada (isto é, homologia no sentido de 5' de ~2 kb) do gel e purifica-se utilizando procedimentos convencionais (resina QiaEX). Utiliza-se uma segunda série de oligonucleotídeos:

17766F 5'-CCTCATGCATCTGGAGGACGTCGCAGGTGAATTCTGGGCG-3' (SEQ ID NO. 6) e 19763R 5'-GGGCAAGCTTCTCCTGGCTGAGCTTGAACATCG-3' (SEQ ID NO. 7) para amplificar uma região de homologia no sentido de 3' utilizando o cosmídeo TL3006 (SEQ ID NO. 3) como molde e a ADN polimerase de KOD. Trata-se o produto amplificado com a polinucleotídeo cinase de T4 (NEB) e clona-se em pUC18 que foi desfosforilado mediante tratamento com fosfatase alcalina de camarão (Roche). Analisa-se o construto resultante mediante digestão de restrição e sequencia-se completamente para garantir que se gera a sequência desejada e que não foram introduzidos erros durante a amplificação com polimerase. Digere-se este construto com HindiII e Nsil e analisam-se os produtos mediante eletroforese em gel. Escinde-se a banda que contém a sequência desejada (isto é, homologia no sentido de 3' de ~2 kb) do gel e purifica-se utilizando procedimentos convencionais (resina QiaEX). Digere-se o vetor pKC1139 com BcoRI e HindiII e isola-se o fragmento de vetor grande mediante eletroforese em gel e purifica-se mediante métodos convencionais (resina QiaEX). Clonam-se então os fragmentos de homologia no sentido de 5' e de 3' isolados neste fragmento de pKC1139 numa ligação de três vias para gerar o construto de deleção de sfaA desejado.

Num procedimento alternativo adicional para a geração de um construto de deleção de sfaA utiliza-se síntese génica comercial de construto de deleção (isto é, Genscript ou outro fornecedor) para gerar um construto que contém a sequência desejada (SEQ ID NO. 8). Digere-se este construto adquirido utilizando BamHI e XbaI para escindir a sequência de interesse e analisam-se os produtos mediante eletroforese em gel. Escinde-se a banda que contém a sequência desejada (~4 kb) do gel e purifica-se utilizando procedimentos convencionais. Digere-se o vetor pKC1139 com BamHI e XbaI e isola-se o fragmento grande mediante eletroforese em gel e purifica-se mediante métodos convencionais. Ligam-se então entre si os dois fragmentos isolados para gerar o construto de deleção de sfaA desejado.

Estes construtos de deleção de sfaA alternativos introduzem-se em Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) mediante conjugação e seleção para o cruzamento secundário utilizando os métodos descritos no exemplo 1.2. 0 crescimento e a análise das estirpes construídas desta forma também seguem os métodos descritos no exemplo 1.2.

Exemplo 3 - Alimentação em série de mutante de deleção de sfaA

Prepararam-se reservas de esporas de um mutante com alteração em sfaA (BIOT-4452 ou BIOT-4585) após o crescimento em meio MAM, ISP4, ISP3 ou ISP2, e conservaram-se em glicerol a 20% p/v em água destilada e armazenaram-se a -80°C. Prepararam-se cultivos vegetativos (cultivos de inoculação) inoculando a reserva de esporas (1% v/v) em 7 ml de meio de inoculação (meio SM25) em tubos de centrífuga de 50 ml com tampões de espuma. Incubaram-se os tubos de cultivo a 27°C, 250 rpm (deslocamento vertical de 5 cm) durante 48 h. A partir do cultivo de inoculação transferiu-se 10% (v/v) a 7 ml de meio de produção SGP-2 em tubos de centrífuga de 50 ml com tampões de espuma. Levou-se a cabo o cultivo a 24°C e 300 rpm (deslocamento vertical de 2,5 cm) . Para a produção de análogos mutassintéticos de sangliferina, adicionaram-se 0,05 ml de uma solução 0,32 M (em HC1 1 N) do composto alimentado (mutassínton) a cada tubo às 24 horas após a inoculação para dar uma concentração final de 2 mM. Adicionalmente, adicionaram-se 0,05 ml de uma solução 0,32 M de ácido piperázico (em metanol) a cada tubo às 24 horas para dar uma concentração final de 2 mM. Continuou-se com o cultivo durante quatro dias adicionais após a alimentação.

Extraíram-se amostras transferindo 0,8 ml do caldo completo a um tubo Eppendorf tampado de 2 ml. Adicionaram-se 0,8 ml de acetonitrilo, junto com 0,015 ml de ácido fórmico. Agitou-se então a mistura durante 30 minutos num dispositivo Vibrax. Centrifugou-se então o tubo a 13000 rpm durante 10 minutos e retiraram-se 0,15 ml do sobrenadante para a sua análise. Analisaram-se os extratos tal como se descreve nos Métodos gerais. A tabela 1 mostra os mutassíntons que se alimentaram desta forma, junto com os adutos de H+ e Na+ mediante CL-EM, a massa molecular prevista e o tempo de retenção dos produtos mutassintéticos de sangliferina observados. Mostram-se os picos principais, relacionados com os análogos de sangliferina A. Em todos os casos, observaram-se também os picos de CL-EM para os análogos de sangliferina B (Massa -18) .

Exemplo 4 - Isolamento de 63-fluoro-sangliferina A, composto intermediário 14

Levou-se a cabo a fermentação tal como se descreveu nos Métodos gerais utilizando 2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo e ácido DL-piperázico como precursores, adicionando-se ambos às 26 horas.

Após a recolhida, reuniram-se os caldos de cultivo e ajustaram-se a aproximadamente pH 3 com ácido fórmico e centrifugaram-se (3300 g) durante 25 min para separar as células e a resina do caldo clarificado. Descartou-se o caldo clarificado após o ensaio ter confirmado que estava presente menos de 5% do composto alvo. Agitaram-se as células e a resina com 2 volumes de acetonitrilo durante 1 h utilizando um agitador magnético. Recuperou-se o extrato de acetonitrilo ou mediante centrifugação ou permitindo que se sedimentasse por gravidade. Realizou-se então uma segunda extração com acetonitrilo das células e a resina nas mesmas condições. Concentraram-se os extratos de acetonitrilo combinados até um volume aquoso residual a pressão reduzida e logo ajustaram-se a pH 6. Extraiu-se isto duas vezes com acetato de etilo e os extratos orgânicos combinados levaram-se até a secura a pressão reduzida para dar o produto em bruto final (1,3 g).

Dissolveu-se o extrato em bruto (1,3 g) em acetato de etilo (2 ml) e carregou-se numa coluna de gel de sílice (10 x 2 cm) acondicionada com acetato de etilo (500 ml). Eluiu-se a coluna com acetato de etilo e logo com incrementos graduais em acetona (10%, 20%, 30%, etc., em acetato de etilo). Recolheram-se frações de aproximadamente 250 ml e identificou-se o composto alvo mediante CL analítica, combinaram-se e levaram-se até a secura. Dissolveu-se este material (278 mg) em metanol (1,8 ml) e purificou-se mediante HPLC preparativa. Utilizou-se uma coluna Xterra MSC18 de Waters (10 micrómetros, 19 cm x 250 mm) com solvente bombeado a 21 ml/min. O solvente A foi água e o solvente B foi acetonitrilo. Executou-se a coluna isocraticamente a 50% de B durante 6 minutos após a injeção seguido por um gradiente até 100% de B aos 30 minutos. Identificaram-se as frações puras mediante HPCL-UV e combinaram-se. Levaram-se estas frações até a secura a pressão reduzida para produzir o composto alvo como um sólido amorfo esbranquiçado (20 mg).

Exemplo 5 - Síntese de (2-(1,2-oxazinan-2-il)-2- oxoetil)fosfonato de dietilo

A uma solução de 21-1 (ChemCollect, Alemanha) (100 mg, 0,81 mmol), Et3N (246 mg, 2,43 mmol) em DCM seco (5 ml) foi adicionado gota a gota cloreto de cloracetilo (138 mg, 1,22 mmol). Agitou-se a mistura de reação a temperatura ambiente durante 3 h, verteu-se em água gelada e extraiu-se com acetato de etilo. Lavou-se a fase orgânica com salmoura e secou-se sobre Na2SC>4, filtrou-se, concentrou-se a vácuo. Utilizou-se o resíduo (21-2) para a seguinte etapa sem purificação adicional. (123 mg, rendimento de 90%).

Agitou-se uma mistura de 21-2 (123 mg, 0,75 mmol) e fosfito de trietilo (250 mg, 1,50 mmol) a 140°C durante 6 h. Esfriou-se a mistura de reação até temperatura ambiente e purificou-se mediante cromatografia ultrarrápida para produzir 21 . Síntese alternativa de (2-(1,2-oxazinan-2-il)-2- oxoetil)fosfonato de dietilo, 21

Procedimento geral para a preparação de 21a-2

A uma solução de t-BuOK (84,0 g, 0,75 mol) em tetrahidrofurano (2,0 1) foi adicionado 21a-l (50,0 g,

0,38 mol) em porções a temperatura ambiente. Agitou-se a mistura durante lha temperatura ambiente. Adicionou-se 1,4-dibromobutano (81,2 g, 0,38 mol) gota a gota a temperatura ambiente. Agitou-se então a mistura a 80°C durante 16 h. Após esfriar, adicionou-se água (2000 ml), extraiu-se a mistura com acetato de etilo (2 x 1000 ml) . Secou-se a fase orgânica combinada sobre Na2SC>4 anidro durante 16 h, após filtração e concentração, purificou-se ο resíduo mediante cromatografia em coluna em gel de sílice (eluente: éter de petróleo:acetato de etilo = de 100:1 a 10:1) para dar 21a-2 (57 g) como um óleo incolor.

Procedimento geral para a preparação de 21a-3

A uma solução de 21a-2 (55 g, 0,29 mol) em terc-butil metil éter, TBME (80 ml) foi adicionada uma solução de HC1 4 N (600 ml, em TBME) a temperatura ambiente, agitou-se a mistura durante 3 h a temperatura ambiente. Filtrou-se o sólido precipitado e lavou-se com TBME (50 ml) para dar 21a-3 (30 g) como um sólido branco.

Procedimento geral para a preparação de 21

A uma solução agitada de 21a-4 (35 g, 0,18 mol), hidroxibenzotriazol (HOBT) (29 g, 0,21 mol) e Et3N (71 ml, 0,51 mol) em diclorometano anidro (550 ml) foi adicionada 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCI) (41 g, 0,21 mol) em porções a 0°C. Agitou-se a mistura de reação a 0°C durante 0,5 h, adicionou-se então 21a-3 (24 g, 0,20 mol) a 0°C e agitou-se durante 16 h. Então a CCF (éter de petróleo/acetato de etilo: 3/1) mostrou gue a reação estava completa. Nesse momento, verteu-se lentamente a mistura de reação em água (500 ml) com agitação vigorosa.

Extraiu-se a mistura com diclorometano (2x200 ml). Lavou-se a fase orgânica combinada com salmoura (2x100 ml), secou-se com Na2SC>4, filtrou-se e concentrou-se para proporcionar o produto em bruto. A cromatografia (éter de petróleo/acetato de etilo, de 100:1 a 10:1) deu 21 (38 g) como um óleo amarelo.

Exemplo 6 - Preparação do composto intermediário 23-3

A uma solução agitada de 14 (430 mg, 0,38 mmol), (DHQ)2PHAL (18,6 mg, 0,024 mmol), tetraóxido de ósmio (0,156 ml, 0,012 mmol) em álcool terc-butílico (2,5% em peso, 0,079 mmol/ml) e metanosulfonamida (74 mg, 0,77 mmol) em 20 ml de álcool terc-butílico foi adicionada a temperatura ambiente uma solução de ferricianeto de potássio (382 mg, 1,16 mmol) e carbonato de potássio (160 mg, 1,16 mmol) em 20 ml de água, dando como resultado uma emulsão marrom. Após 2 h, adicionou-se uma solução de sulfito de sódio, e continuou-se com a agitação durante 20 min. Extraiu-se a mistura resultante com acetato de etilo (3 x 50 ml) . Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com salmoura, secaram-se sobre sulfato de sódio anidro, filtraram-se e concentraram-se a pressão reduzida, purificaram-se mediante cromatografia ultrarrápida de fase inversa para produzir 23-2 como um sólido branco. A uma solução agitada de 23-2 (240 mg, 0,21 mmol) em 24 ml de uma mistura 2:1 de THF e água foi adicionado periodato de sódio (91 mg, 0,42 mmol). Agitou-se a mistura resultante a temperatura ambiente durante 3 h, e adicionou-se então bicarbonato de sódio saturado aquoso. Extraiu-se esta mistura com três porções de acetato de etilo. Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com uma porção de água e duas porções de salmoura saturada, secaram-se sobre sulfato de sódio anidro, filtraram-se e concentraram-se a pressão reduzida. Purificou-se o resíduo mediante cromatografia ultrarrápida de fase inversa para produzir 23-3.

Exemplo 7 - Preparação do composto 24

A uma solução de 21 (42 mg, 0,168 mmol) em THF (2,0 ml) foi adicionado NaH (1,2 mg, 0,05 mmol) em THF anidro (0,2 ml) a 0°C com agitação. Agitou-se então a solução a 20°C até que se voltou transparente. Adicionou-se então 23-3 (30 mg, 0,042 mmol) à solução transparente e agitou-se a mistura a 20°C durante 2 h. Extinguiu-se a mistura com água (10 ml) e extraiu-se com acetato de etilo (3 x 20 ml) . Lavou-se a fase orgânica com salmoura e secou-se sobre Na2SC>4, filtrou-se e reduziu-se a vácuo. Purificou-se o resíduo mediante HPLC preparativa para obter 24 como um sólido branco amorfo.

Exemplo 8 - Preparação do composto 24 na forma cristalina sólida (forma I)

Suspenderam-se 10 mg de composto 24 amorfo em metil isobutil cetona (MIBK) (500 μΐ, 50 volumes) e logo realizaram-se ciclos de temperatura entre temperatura ambiente e 40 °C cada 4 horas durante um total de 5 dias. Isolou-se o sólido resultante eliminando por decantação o solvente em excesso seguido por secagem a vácuo para produzir o composto 24 na forma cristalina sólida (forma I) . O padrão de XRPD da forma I do composto 24 ilustra-se na figura 2 e os picos e as suas intensidades relativas enumeram-se na tabela 2 a seguir. O método de obtenção dos dados de XRPD se descreve nos Métodos gerais.

Tabela 2

Exemplo 9 - Dados biológicos - replicão de VHC e análise

Analisaram-se os compostos no ensaio de replicão de genótipo lb utilizando células Huh5.2 tal como se descreve nos Métodos gerais. Incluíram-se ciclosporina A, 1, DEBIO-025, 2, sangliferina A, 5, e o hidroximacrociclo, 6 como comparação.

Tal como pode observar-se, o composto da invenção, 24 é significativamente mais potente no ensaio de replicão Huh5.2 (tal como se mostra pela baixa CE50) , com uma seletividade significativamente melhor frente à linha celular (tal como se mostra mediante um alto índice de seletividade) em comparação com CsA, Debio-025, SfA e o hidroximacrociclo.

Exemplo 10 - Dados biológicos - atividade contra VIH

Analisaram-se os compostos num ensaio antiviral contra VIH utilizando células HeLa tal como se descreve nos Métodos gerais. Incluíram-se ciclosporina A, 1, DEBIO-025, 2 e os antivirais contra VIH emtricitabina e tenofovir como comparação.

Tal como pode observar-se, o composto da invenção, 24, é significativamente mais potente que CsA, DEBIO-025, emtricitabina e tenofovir na inibição da infeção por VIH em este ensaio.

Exemplo 11 - Dados biológicos - PK oral e i.v. in vivo em rato

Para avaliar a farmacocinética dos compostos num entorno in vivo, administraram-se os compostos por v.o. a 10 ou 5 mg/kg e por via i.v. a 1 mg/kg a grupos de ratos CD1. Levaram-se a cabo análises farmacocinéticas tal como se descreve nos Métodos gerais. Os parâmetros PK mostram-se a seguir.

Tal como pode observar-se, os compostos 24 têm aclaramento reduzido e exposição oral aumentada (tal como se mostra mediante uma alta AUCfinai por v.o.), em comparação com sangliferina A.

Exemplo 12 - Dados biológicos - inibição de atividade

PPIase de CypA

Para avaliar a inibição direta da peptidil-prolil cis-trans isomerase (PPIase) de CypA, utilizou-se um método tal como se descreve nos Métodos gerais. Incluíram-se ciclosporina A, 1, DEBIO-025, 2 e sangliferina A, 5 como controlos.

Tal como pode observar-se, o composto da invenção, 24, inibe a atividade PPIase de CypA de maneira mais potente que sangliferina A, DEBIO-025 e ciclosporina A.

Exemplo 13 - Dados biológicos - inibição de transportadores de bilirrubina

Para avaliar o potencial de inibição inespecífica dos transportadores de bilirrubina, que se pensa que é o motivo da hiperbilirrubinemia limitante da dose observada com DEBIO-025, levou-se a cabo um análise in vitro de inibição de transportador tal como se descreve nos Métodos gerais.

Tal como pode observar-se, o composto da invenção, 24, mostra muito menos inibição de transportadores de bilirrubina conjugados e não conjugados em comparação com DEBIO-025 e ciclosporina A.

Exemplo 14 - Dados biológicos - inibição de transportadores xenobióticos

Para avaliar o potencial das interações fármaco-fármaco (DDI) através da inibição de transportadores xenobióticos, levou-se a cabo uma análise in vitro da inibição de glicoproteína P (Pgp/MDRl) e bomba de exportação de sais biliares (BSEP) tal como se descreve nos Métodos gerais.

Tal como pode observar-se, o composto da invenção, 24, mostra muito menos inibição de transportadores xenobióticos, envolvidos potencialmente nas interações fármaco-fármaco, em comparação com DEBIO-025 e ciclosporina A.

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Todas as referências incluindo patentes e pedidos de patente citadas neste pedido incorporam-se no presente documento como referência no grau mais amplo possível.

Ao longo de toda a memória descritiva e as reivindicações que seguem, a menos que o contexto requeira outra cosa, entender-se-á que a palavra "compreender", e variações tais como "compreende" e "que compreende", implicam a inclusão de um número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros estabelecido, mas não a exclusão de nenhum outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.

Lista de sequências <110> Biotica Technology Limited Moss, Steven James Gregory, Matthew Alan Wilkinson, Barrie

<120> COMPOSTO NOVO E MÉTODOS PARA A SUA PRODUÇÃO

<130> BOA-PI257PCT <150> Documento GB1105293.3 <151> 29-03-2011 <150> Documento GB1113629.8 <151> 08-08-2011 <150> Documento GB1202060.8 <151> 07-02-2012 <160> 8 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 77

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <40 0> 1 cgctctgtgg cgcctggttt ccaagcggct cgcggaccgg caccggcaca tgcataatta 60 accctcacta aagggcg 77 <210> 2 <211> 78 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 2 tggatgtatc gtcgcaggac gcccagaatt cacctgcgac gtcctccaga tgcattaata 60 cgactcacta tagggctc 78 <210> 3 <211> 46596

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<210> 4 <211> 37

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador <400> 4 cagagaatte geggtaeggg gcggacgaca aggigie 37 <210> 5 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 5 gegcaigca! gtgccggigc cggtccgega gccgcttgg 39 <210> 6 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 6 cetcatgcai elggaggaag icgcaggiga aftctgggcg 40 <210> 7 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 7 gggcaagdi deeiggdg ageigaaea teg S3 <210> 8 <211> 3994 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Fragmento de ADN <400> 8 cagaggatcc gcggtacggg gcggacgaca âggtgtcgtt gccgcgccgg cactcggact ¢0 ctcgcagcct cacaacgctg ctggccgcgg eggtgtacct cacgtcgcgg gcggfcggacg 120 aegesgefegga fcctgctgaag gtcctgatcg cgacgaagct tgcagaccgg efegçâgãfecc ISO Iggacggcgg tgetggacge eecattcgaa aagcgcctgc tcaatacccg ççcgeàacgg 240 agacgaggtt gaacgacaag ctcagggcgt ctgagtactt cggttgagta gttctgccca 300 fcgtgaggggG agggccgtcg agacaggctg tgtacacaac gccgcggtgc gcagagcgct 360 cggcgaagag accagtagcg gtcatctatg 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aaaactaatg gcggfctgata tatgacccgg ctcgcagagc 2100 aafccatccac tgegeagcag agcccggaat cagaagtact ggacgtcacc ggaatcggat 2160 tcggtgccgc gaatctcgcc ctggcggtgg cgctccatga atccgaagcc gccgggaagg 2220 cccttttcct ggagaagcag aaggaattcg gctggcatcg ggggatgctc ctggggggcfc 2280 cctcgctcca ggtgtacttt ctcaaggaca tcgccacgat gcgcaatccc accagtgatt 2340 fccggattcct gtcctatctc caggagaagg accggctggt cgacttcate aaccagcaca 2400 ccctgctgcc ctcccggatc gagtaecacg actacctcca gtgggccgcc gaccggctga 2460 àccáccfeggt cgagtacgge gtggâggcGà ccggtgfcgcg gccggfcgacc gaagccggtg 2520 aggtcgtcgc gctcgacgtg ctcgccgggg accgggtggt cgcccggacc agaaacctcg 2580 tectcgcctc cggccfegcgc ccccggctgc ecgagggcgc ggagaccggc gaacgcgtct 2640 ggeacagotc ceagtfcgctg eaceggetge ccgcgttcga cgaacgcccg ccccgccggg 2700 ccgtcgtqgt cggcgccggc eagagcgcgg ccgaggfccgc cgcgcacctc atggaacgct 2760 acccgcaggc cgaggtgtgc gcggtgttcg cccgctacgg ctacagcgtc gccgactcca 2820 gcccgttcgc caaccgcgtc ttcgaeecgg ccgccgtgga egaetfcetac· ttcgccccgc 2880 ccgaggtcaa gcaggccatc atgcgctacc acggcggoao caactacgcc gtcgbcgacg 2940 aggacgtcct ccagggcctc taccgccgcc agtacgagca gaaggtgtcc ggcgccccgc 3000 ggetgcgggt gatgaacgcc tcccgcctgg tgtccgtcga accgcgccag gaatccgccg 3060 ccgfcacgcgfc ggagfctcatg cccacgggcg aacacaccga cctggacgcc gaccfcggtcg 3120 tgtacgccac cgggtacgac tccaccgacc cggccgaaet gctcggcggc gtctccggcg 3180 ccetccgccg ggacgaggcg ggggagttgc tgatcggccg cgactaccgg ctcggcacca 3240 ccggggattt ccggtgcggc atctacgtcc agggcgccac cgaggcgacc cacggcatcg 3300 cctecacect gctgtccatg gtggcggtcc gcgcgggcga gatcgcccgg tcgatcaccg 3360 gcggeeggtg cgacccggac cgctccaccg gaagcaaggc agcagcgggg aacaggggct 3420 gaagtgtacg aacgtccgct gtaccgggag gattgcgacg gcgtcgtcct ggcgtttctg 3480 cgacacaacc cactggcaat ggtcgtcacc tcgcacgacg acgtcccggt ggccacccac 3540 gcgccggtgc tgttccggca cggacocgao ggcgccgacg ccgaggccgt cgccgegggc 3600 accgtcccge tcgccggctc caccctgatc ggccacatga acgfccgagaa cccgcagtgg 3660 cgecggatgc gctccggcga ccgggcgctc atcgtcttcc agggcccgca eggctafcgtc 3720 tcgccgacgg tctacggggt cacgcccgcg gcccccaccfc gggacttcafc cgccgtccac 3780 gtgaacggca cagtggagcc caccgccgac cccgccgccg tgctggacat cgtctccgac 3840 accgcccggc ggctggagtc cggcttcggg cgcggctggg accaggagtc ctccctcgac 3900 fcacttccgcc agatcgcgcc cggcgtgggc gccfctcaccc tgcgggtcga ttccgtgcag 3960 acgatgttna agcfccagcca ggagtefc.aga gccc. 3994

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula (I):

   caracterizado por incluir qualquer tautómero do mesmo; ou um isómero do mesmo em que o enlace C=C em C26, 27 mostrado como trans é cis; e por incluir um aduto de metanol do mesmo em que se forma um cetal mediante a combinação do grupo ceto em C-53 (se está presente) e o grupo hidroxilo em C-15 e metanol; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. 2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por estar na forma cristalina sólida.
3. 3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por estar na forma do seu polimorfo cristalino de forma I que tem os seguintes dados de XRPD:
4. 4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para a sua utilização como produto farmacêutico.
5. 5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para a sua utilização como produto farmacêutico para o tratamento de infeções virais tais como infeção por VHC ou VIH ou como agente imunossupressor ou anti-inflamatório.
6. 6. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, junto com um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, junto com um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável que compreende ademais um segundo princípio ativo ou princípio ativo posterior.
8. 8. Procedimento para preparar um composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender reagir um composto de fórmula (V)

   em que cada Rn é independentemente alquilo Cm ou benzilo; com um macrociclo aldeidico (composto de fórmula VI):
9. 9. Composto de fórmula (VI):
10. 10. Procedimento para a preparação de um composto de fórmula (I) na forma do seu polimorfo cristalino de forma I, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender a etapa de cristalizar um composto de fórmula (I) em metil isobutil cetona.