CN107090476B - Sanglifehrin衍生物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及Sanglifehrin衍生物及其制备方法，尤其提供了式(I)和(II)的化合物，及其在治疗中的用途，特别是用于治疗病毒感染。

Description

Sanglifehrin衍生物及其制备方法
本申请为2011年12月20日提交的发明名称为“Sanglifehrin衍生物及其制备方法”的PCT申请PCT/GB2011/052524的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段日期为2013年8月20日，申请号201180068004.8。
技术领域
本发明涉及Sanglifehrin类似物，其可用作亲环素抑制剂，例如在治疗病毒感染、特别是通过RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)和HIV的感染中，和/或作为免疫抑制剂例如用于预防移植排斥和作为抗炎剂例如用于炎症性病症。本发明还提供了其在医疗中使用的方法，尤其是用于治疗HCV感染，以及用作免疫抑制剂或抗炎剂，或在产生进一步在医疗上有用的化合物中用作中间体的方法。
背景技术
丙型肝炎
丙型肝炎病毒(HCV)是正链RNA病毒，其感染是输血后肝炎的主要原因。HCV是最常见的慢性血液性感染，也是美国肝病死亡的主要原因。世界卫生组织预测有超过1.7亿慢性HCV感染携带者，约为世界人口的3％。在未治疗的HCV感染患者中，约70％–85％发展成慢性HCV感染，从而具有发展成肝硬化和肝细胞癌的高风险性。在发达国家，50-76％的肝癌和三分之二的肝移植均是由于慢性HCV感染导致(Manns等,2007)。
除肝病外，慢性感染的患者还可能发展成其他慢性HCV相关的疾病，并成为向他人的传染源。HCV感染引起非肝并发症，例如关节痛(关节疼痛)、皮疹、以及内脏器官损伤(主要是肾)。HCV感染代表了一类重要的全球健康保健负担，而且当前并无用于丙型肝炎的疫苗(Strader等，2004；Jacobson等2007；Manns等,2007Pawlotsky,2005；Zeuzem&Hermann,2002)。
HCV的治疗
现有的标准护理(SoC)是皮下注射PEG化的干扰素-α(pIFNα)和口服施用抗病毒药物利巴韦林24-48周。治疗成功的定义为持续的病毒响应(SVR)，其定义为在治疗结束和6个月后血清中无HCV RNA。SoC的总体响应率主要依赖于基因型和治疗前HCV RNA水平。患有基因型2和3的患者相比感染基因型1的患者更易对SoC响应(Melnikova,2008；Jacobson等,2007)。
大量HCV患者不能对SoC治疗产生充分应答，或由于副作用不能耐受治疗，导致整个过程中频繁出现问题。SoC的总体临床SVR率仅为约50％(Melnikova,2008)。耐药性的发展是治疗失败的另一潜在因素(Jacobson等2007)。SoC在某些不被视为治疗候选患者中是禁忌的，例如以往有显著抑郁或心脏病史的患者。通常导致治疗中断的SoC副作用包括流感样疾病、发烧、疲劳、血液学疾病、贫血、白细胞减少症、血小板减少症、脱发和抑郁(Manns等,2007)。
考虑到SoC长期治疗的副作用、耐药性的出现以及总成功率的差强人意，HCV感染治疗亟需更有效和更安全的新治疗方式。新治疗的目的包括改进的效果、改进的毒性、改进的耐药性、改进的生命质量和最后改善患者的顺应性。HCV生命周期较短，因此在药物治疗期间产生耐药性是很常见的。
目前正在开发新的、靶向特异性的丙肝(STAT-C)抗病毒治疗药物，也称为直接作用的抗病毒药(DAA)，其靶向病毒蛋白如病毒RNA聚合酶NS5B或病毒蛋白酶NS3(Jacobson等,2007；Parfieniuk等,2007)。此外，还正在开发靶向人蛋白(例如亲环素)而非病毒靶标的新化合物，其预期能够使药物治疗过程中耐药性发生率降低(Manns等,2007；Pockros,2008；Pawlotsky J-M,2005)。
亲环素抑制剂
亲环素(CyP)是一族细胞内蛋白，其具有促进蛋白构象变化和折叠的肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶活性。CyP涉及细胞过程如转录调节、免疫应答、蛋白分泌和线粒体功能。人感染期间，HCV病毒在其生命周期内募集CyP。最初，认为CyP刺激促进RNA复制的HCV非结构蛋白NS5B RNA聚合酶的RNA结合活性，但是还存在若干假说，包括需要CyP PPIase活性。CyP的各种同工型，包括A和B，被认为与HCV的生命周期有关(Yang等,2008；Appel等,2006；Chatterji等,2009；Gaither等,2010)。在小鼠(Colgan等,2000)和人T细胞(Braaten和Luban,2001)中产生敲除的能力表明CyPA对于细胞生长和生存而言是任选的。在细菌(Herrler等,1994)、链孢霉属(Neurospora)(Tropschug等,1989)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Dolinski等1997)中观察到CyPA同系物中断的类似结果，因此，抑制CyP代表了治疗HCV感染的新的和有吸引力的宿主靶点，以及对现有SoC或STAT-C药物的新的可能添加，其目的是增加SVR，防止耐药性出现并降低治疗副作用。
Figure BDA0001227489520000031
已知环孢菌素A(Inoue等2003)(“CsA”)及其结构密切相关的非免疫抑制临床类似物DEBIO-025(Paeshuyse等2006；Flisiak等2008)、NIM811(Mathy等2008)和SCY-635(Hopkins等,2009)能结合亲环素，其作为亲环素抑制剂在HCV感染中显示了体外和临床的效果(Crabbe等,2009；Flisiak等2008；Mathy等2008；Inoue等,2007；Ishii等,2006；Paeshuyse等,2006)。虽然早期关于CsA的耐药性研究显示HCV NS5B RNA聚合酶中具有突变，表明仅亲环素B与HCV复制有关(Robida等,2007)，最近的研究表明亲环素A在HCV复制过程中是必要的(Chatterji等2009；Yang等,2008)。考虑到NS5A病毒蛋白中的突变同样与CsA耐药性相关，并且NS5A与CyPA和CypB都相互作用以产生特异性的肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(PPIase)活性，进一步提出了这两种亲环素在病毒生命周期中的作用(Hanoulle等,2009)。
环孢菌素类似物的抗HCV效应独立于依赖于钙调磷酸酶的免疫抑制性质。这表明CyP结合是HCV活性所必需的，而不需要钙调磷酸酶结合。临床上最新的用于治疗HCV的亲环素抑制剂DEBIO-025在体内和体外显示了对于四种最流行的HCV基因型(基因型1、2、3和4)的效果。耐药性研究显示，导致DEBIO-025耐药性的突变不同于聚合酶和蛋白酶抑制剂耐药性所报道的突变，并且没有与STAT-C/DAA抗性病毒复制子的交叉耐药性。更重要的是，DEBIO-025还能预防导致对蛋白酶和聚合酶抑制剂产生耐药性的逃逸突变的形成(Crabbe等,2009)。
然而，基于CsA的亲环素抑制剂在临床开发上具有许多问题，这些问题被认为与其共有的结构类型相关，包括：某些能引起治疗终止和限制临床剂量水平的不良事件；能引起可变效能的可变药代动力学性质；以及能引起给药问题的药物之间相互作用的风险增加。
接受DEBIO-025的患者最常见的不良事件(AEs)包括黄疸、腹痛、呕吐、疲劳和发热。临床上最重要的AE是高胆红素血症和血小板计数减少(血小板减少症)。Peg-IFN能引起显著的血小板减少症，与DEBIO-025组合能产生严重的临床问题。有关NIM-811的早期临床研究已描述了胆红素增加和血小板减少二者(Ke等,2009)。尽管DEBIO-025临床研究中观察到的高胆红素血症在治疗停止后得以逆转，但其导致了16名患者中有4名由于该原因终止治疗，并且在未来的试验中使用的剂量下调。由于亲环素抑制剂对HCV的抗病毒作用是剂量相关的，剂量下降导致抗病毒效果的下降，当采用单一疗法时，许多后续的基于CsA的亲环素抑制剂试验显示HCV病毒载量无下降或下降很少(Lawitz等,2009；Hopkins等,2009；Nelson等,2009)。DEBIO-025和环孢菌素A已知是胆汁转运蛋白例如胆盐输出泵和其他肝转运蛋白的抑制剂(尤其是MRP2/cMOAT/ABCC2)(Crabbe等,2009)。已提出与胆汁转运蛋白尤其是MRP2的相互作用可能是高剂量DEBIO-025下发现高胆红素血症的原因(Nelson等,2009Wring等,2010)。通过抑制其他药物转运蛋白例如OAT1B1和OAT1B3的CsA类相关的药物-药物相互作用(DDI)(Konig等,2010)也可能是个问题，有可能限制某些组合和在经受协同感染例如HIV治疗的一些患者中的使用(Seden等,2010)。
此外，DEBIO-025和环孢菌素A是通过细胞色素P450(尤其是CYP3A4)代谢的底物，并且已知是人P-糖蛋白(MDR1)的底物和抑制剂(Crabbe等,2009)。已显示环孢菌素A是CYP3A4的体外抑制剂(Niwa等,2007)。这表明与其他作为CYP3A4底物、诱导物或抑制剂的药物例如酮康唑、西米替丁和利福平之间可能存在增加的药物相互作用风险。此外，与由P糖蛋白转运的药物之间也可能发生相互作用(例如地高辛)，其在接受其他并发疾病的药物治疗的HCV患者中可能引起严重的药物相互作用(Crabbe等2009)。已知CsA具有高度可变的药代动力学，早期制剂显示口服生物利用度为1-89％(Kapurtzak等,2004)。患者血浓度若得不到昂贵的监测，可导致由血浆浓度升高导致的副作用发生增加，或由血浆浓度下降导致的临床应答减少。
考虑到亲环素抑制代表了HCV治疗的新的有希望的途径，需要发现和开发更有效和安全的CyP抑制剂用于HCV感染的联合治疗。
Sanglifehrin
Sanglifehrin A(SfA)及其天然同源物属于一类混合的非核糖体肽/多聚酮化合物(polyketides)，由链霉菌属物种A92-308110(也称为DSM 9954)产生(参见WO 97/02285)，其最初基于其对亲环素A(CyPA)的高亲和性而发现。SfA是发酵液中最丰富的成分，与CsA相比，其对于CyPA的亲和性要高约20倍。由此说明Sanglifehrin可能可用于治疗HCV(WO2006/138507)。体外测试表明，相对于CsA，Sanglifehrin显示更低的免疫抑制活性(Sanglier等,1999；Fehr等,1999)。SfA以高亲和性结合CyPA的CsA结合位点(Kallen等,2005)。
Figure BDA0001227489520000061
sanglifehrin的生物合成
Sanglifehrins通过混合型聚酮合酶(PKS)/非核糖体肽合成酶(NRP)生物合成(参见WO2010/034243,Qu等,2011)。22-元大环内酯骨架由聚酮碳链和三肽链组成。肽链由一个天然氨基酸、缬氨酸和通过酰胺键连接的两个非天然氨基酸：(S)-间-酪氨酸和(S)-六氢哒嗪-3-羧酸(piperazic acid)组成。苯丙氨酸的羟基化(或者在NRPS上原位或者在生物合成之前)以产生(S)-间-酪氨酸被认为通过sfaA的基因产物发生。
sanglifehrin的免疫抑制性作用
SfA作用的免疫抑制机制不同于其他已知的结合亲免素的免疫抑制药物，例如CsA、FK506和雷帕霉素。SfA不抑制作为CsA靶标的钙调磷酸酶的磷酸酶活性(Zenke等2001)，相反其免疫抑制活性归于白介素6(Hartel等,2005)、白介素12(Steinschulte等,2003)的抑制和白介素2依赖性T细胞增殖的抑制(Zhang&Liu,2001)。然而，SfA发挥其免疫抑制效果所通过的分子靶标和机制目前尚不清楚。
SfA的分子结构复杂，其与CyPA的相互作用被认为很大程度上由分子的大环部分介导。实际上，由SfA氧化裂解产生的大环化合物(羟基大环)已显示对于CyPA具有高亲和性(Sedrani等,2003)。X-射线晶体结构数据已显示，该羟基大环结合CyPA的位点与CsA相同。基于SfA大环部分的类似物同样先前显示缺乏免疫抑制性(Sedrani等,2003)，这就提供了设计非免疫抑制CyP抑制剂用于HCV治疗的机会。
与此相反，也有机会开发具有低毒性的免疫抑制剂，其用于例如预防移植排斥、自身免疫性、炎症性和呼吸病症，包括但不限于克罗恩病、贝赫切特综合征、葡萄膜炎、银屑病、特应性皮炎、类风湿性关节炎、肾炎综合征、再生障碍性贫血(aplastic anaemia)、胆汁性肝硬化、哮喘、肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和乳糜泻的领域。Sanglifehrin已显示具有新的免疫抑制活性机理(Zenke等,2001)，有可能通过树突细胞趋化因子(Immecke等,2011)起作用并且因此有机会开发具有与现行临床试剂例如环孢菌素A、雷帕霉素和FK506不同的作用机理的试剂。
亲环素抑制剂的其他治疗用途
人免疫缺陷病毒(HIV)
亲环素抑制剂如CsA和DEBIO-025已显示在抑制HIV复制中具有潜在功效。亲环素抑制剂被认为在HIV逆转录的过程中/完成后干扰CyPA的功能(Ptak等,2008)。然而，当临床实验时，DEBIO-025仅分别使9名患者和2名患者的HIV-1 RNA水平下降≥0.5和>1log10拷贝/mL，而27名治疗的患者未显示HIV-1 RNA水平的下降(Steyn等,2006)。随后，DEBIO-025在HCV/HIV共感染患者中进行了实验，显示对HCV具有较好的效果，HIV临床试验中断(参见Watashi等,2010)。
HIV的治疗
世界范围内有3000万人以上感染HIV-1，每年新增300万例。自引入高活性抗逆转录病毒治疗后(HAART)(Schopman等,2010)，治疗选择显著改善。到2008年，已批准约25种抗逆转录病毒药物用于治疗HIV-1，包括9种核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、4种非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、9种蛋白酶抑制剂(PI)、1种融合抑制剂、1种CCR5抑制剂和1种整合酶抑制剂(Shafer和Schapiro,2008)。然而，现有方案无一不能导致病毒的完全清除，其能导致严重的副作用，而且抗病毒耐药性依然是一个主要的问题。因此，仍然需要新的抗病毒治疗剂，尤其是作用机制不同于现有批准类型的药物，例如亲环素抑制剂。
乙型肝炎病毒
乙型肝炎病毒是肝DNA病毒科家族的DNA病毒，是乙型肝炎的病原体。与HCV和HIV不同，鲜有关于亲环素抑制剂对乙型肝炎病毒的活性的报道。Ptak等2008描述了Debio-025对HBV的弱活性(IC50 4.1μM)，而Xie等,2007描述了CsA对于HBV的一些活性(IC50>1.3μg/mL)。这与HIV和HCV的情况大不相同，后者有众多关于亲环素抑制剂的纳摩尔浓度级的抗病毒活性报道。
HBV的治疗
HBV在世界范围内感染4亿人群，是慢性病毒性肝炎和肝细胞癌的主要原因。2008年为止有6种药物经批准用于治疗HBV；干扰素α和PEG化的干扰素α，三种核苷类似物(拉米夫定、恩替卡韦和特比夫定(telbivudine))和一种核苷酸类似物(阿德福韦二匹伏酯)。然而，由于耐药性的高发率、耐受性较低和可能的副作用，需要新的治疗选择(Ferir等,2008)。
线粒体膜通透性转换孔(mPTP)的抑制
线粒体上高电导通透性转运孔的打开引发了线粒体通透性转换(MPT)。这是导致氧化应激、Ca2+毒性和缺血/再灌注后肝细胞坏死和凋亡的原因。通过亲环素抑制剂抑制亲环素D(也称为亲环素F)已显示能阻断通透性转运孔的开放，保护细胞在这些应激后得以存活。亲环素D抑制剂因此可用于涉及mPTP开放的适应症，例如肌营养不良症，尤其是Ullrich先天性肌营养不良症和Bethlem肌病(Millay等,2008,WO2008/084368,Palma等,2009)、多发性硬化症(Forte等,2009)、糖尿病(Fujimoto等,2010)、肌萎缩性侧索硬化(Martin2009)、双相性精神障碍(Kubota等,2010)、阿尔茨海默病(Du和Yan,2010)、亨廷顿舞蹈病(Perry等,2010)、心肌梗塞后恢复(Gomez等,2007)和慢性饮酒(King等,2010)。
其他治疗用途
亲环素抑制剂对于其他病毒具有潜在活性，因此可用于治疗其感染，例如水痘-带状疱疹病毒(Ptak等,2008)、甲型流感病毒(Liu等,2009)、严重急性呼吸器官综合征冠状病毒和其他人类和猫冠状病毒(Chen等,2005,Ptak等,2008)、登革热病毒(Kaul等,2009)、黄热病病毒(Qing等,2009)、西尼罗病毒(Qing等,2009)、西方马脑炎病毒(Qing等,2009)、巨细胞病毒(Kawasaki等,2007)和痘苗病毒(Castro等,2003)。
已有关于亲环素抑制剂和亲环素抑制在其他治疗领域的用途的报道，例如在癌症治疗中(Han等,2009)。
对sanglifehrin的一般评论
化合物例如sanglifehrin的药物开发中的问题之一是快速代谢和葡萄苷酸化，导致低口服生物利用度。这可导致增加的食物效应机会、更频繁的从剂型中的不完全释放和更高的患者间差异性。
因此仍然有需要鉴定新的亲环素抑制剂和抗炎剂，其尤其可用于治疗HCV感染和抗炎疾患，还可用于治疗其他亲环素抑制有效的疾病，例如HIV感染、肌营养不良症或有助于心肌梗塞之后的恢复或免疫抑制是有效的的情形。优选地，所述亲环素抑制剂相对于现有的亲环素抑制剂具有改善的性质，包括一种或多种下列性质：更长的半衰期或增加的口服生物利用度，这可能通过减少的P450代谢和/或减少的葡萄苷酸化实现；改善的水溶解性；改善的对HCV的效能；降低的毒性(包括肝毒性)；改善的药理学性质，例如对靶器官的高度暴露(例如在HCV的情况下是肝)和/或长的半衰期(使给药频率更低)；减少的药物相互作用，例如通过降低CYP3A4代谢和抑制水平以及减少的(Pgp)抑制(使得能够实现多药物组合)，和改善的副作用特征，例如与MRP2的低结合，使高胆红素血症几率下降；较低的免疫抑制效应；改善的对耐药性病毒株的活性，尤其是耐CsA和CsA类似物(例如DEBIO-025)病毒株；以及更高的治疗(和/或选择性)指数。本发明公开了新的Sanglifehrin类似物，其可具有一种或多种上述性质。具体而言，本发明公开了新的突变合成的Sanglifehrin类似物，其在至少一些实施方案中具有减少的通过P450的代谢或葡萄苷酸化，例如通过增加的微粒体半衰期所示，和/或具有改善的对HCV的效力，例如通过低复制子EC50和/或增加的选择性指数所示。
还需要开发新的免疫抑制剂，其可在预防移植排斥中、或在治疗自身免疫性、炎症性和呼吸病症中具有效用。优选地，此类免疫抑制剂相对于已知天然sanglifehrin具有改善的性质，包括一种或多种下列性质：更长的半衰期或增加的口服生物利用度，这可能通过减少的P450代谢和/或减少的葡萄苷酸化实现；改善的水溶解性；改善的在免疫抑制活性方面的效力，例如可在t细胞增殖测定中观察到；降低的毒性(包括肝毒性)；改善的药理学性质，例如对靶器官的高度暴露和/或长的半衰期(使给药频率更低)；减少的药物-药物相互作用，例如通过降低CYP3A4代谢和抑制水平以及减少的(Pgp)抑制(易于实现多药物组合)和改善的副作用特征。本发明公开了新的Sanglifehrin类似物，其可具有一种或多种上述性质。具体而言，本发明公开了新的Sanglifehrin类似物，其在至少一些实施方案中具有减少的通过P450的代谢或葡萄苷酸化，例如通过增加的微粒体半衰期所示，和/或具有改善的免疫抑制性效力，例如通过低t细胞增殖EC50所示。
发明内容
本发明提供了新的Sanglifehrin类似物，其通过突变合成产生。这些类似物可通过将间酪氨酸类似物饲喂至产Sanglifehrin生物体例如链霉菌属的种A92-308110(也称为DSM 9954)而产生，或更优先地，通过将间酪氨酸类似物饲喂至产Sanglifehrin生物体的遗传工程衍生物(其中sfaA或sfaA同源物是失活或缺失的)而产生。因此，本发明提供了突变合成的Sanglifehrin类似物、用于制备这些化合物的方法以及这些化合物作为药物或生产其他化合物的中间体的用途。
因此，本发明第一方面提供了根据下式(I)或式(II)的突变合成的Sanglifehrin类似物及其衍生物，或其可药用的盐：
Figure BDA0001227489520000111
其中：
R1、R2、R3、R4和R5独立地表示H、F、Cl、Br、C2-6链烯基或C1-10烷基，其中所述烷基的一个或多个碳原子任选地被选自O、N和S(O)p的杂原子替换，其中p表示0、1或2且其中所述烷基的一个或多个碳原子任选地被羰基替换且其烷基可任选地被一个或多个卤素原子取代；
X1、X2、X3、X4和X5独立地表示C或N，且在表示N的任何这些基团的情况下所连接的取代基不存在；
条件是其中R1、R3、R4和R5均表示H且X1、X2、X3、X4和X5均表示C，则R2不能表示OH；
包括其任何互变异构体；或其异构体，其中显示为反式的C26、27位C＝C处的C＝C键(参考sanglifehrin A的结构)为顺式；并且包括其甲醇加成物，其中通过C-53酮和C-15羟基以及甲醇的结合形成缩酮。
上述结构显示了代表性的互变异构体，本发明包括式(I)化合物的所有互变异构体，例如图示为烯醇化合物的酮化合物，反之亦然。
包括在式(I)定义中的特定互变异构体是(i)C-53酮与C-15羟基形成半缩酮，或(ii)C-15和C-17羟基可与C-53酮组合形成缩酮。这里所有的编号使用母体Sanglifehrin A结构的系统。
定义
本文所用冠词“一种”和“一个”是指所述冠词的语法对象的一个或一个以上(即至少一个)。例如“一种类似物”表示一种类似物或一种以上类似物。
本文所用术语“类似物”是指结构上与另一种化合物类似的化合物，但在组成上有轻微差异(例如一个原子由另一个替换，或特定官能团的存在或不存在)。
本文所用术语“炎性病症”是指由炎症引起的病症的列表，包括但不限于寻常痤疮、动脉粥样硬化、哮喘、自身免疫性疾病(如急性弥散性脑脊髓炎(ADEM)、艾迪生病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(autoimmune inner ear disease)、大疱性类天疱疮、乳糜泻(coaliacdisease)、查加斯病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、克罗恩病、皮肌炎、1型糖尿病、子宫内膜异位症、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏病、化脓性汗腺炎、川崎氏病(kawasaki disease)、IgA肾病变、特发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎、红斑狼疮、混合性结缔组织病、硬斑病、多发性硬化(MS)、重症肌无力、发作性睡眠、神经性肌强直、寻常型天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病性关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、精神分裂症、硬皮病、舍格伦综合征、僵人综合征、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、血管炎、白斑、韦格纳肉芽肿病)、炎症性肠疾病、盆腔炎症性疾病、类风湿性关节炎和移植排斥。
本文所用术语“Sanglifehrin(s)”是指结构上类似Sanglifehrin A但在组成上有轻微差异的化合物(例如一个原子由另一个替换，或特定官能团的存在或不存在)，尤其是通过链霉菌的种A92-308110发酵产生的那些。实例包括WO97/02285和WO98/07743中披露的Sanglifehrin-样化合物，例如Sanglifehrin B。
本文所用术语“突变合成的sanglifehrin(s)”或“突变合成的sanglifehrin类似物”是指与sanglifehrin A、B、C或D结构类似但组成略微不同(如在一个或多个原子被另一个原子替换方面或在存在或缺少特定官能团的情况下)的化学化合物，特别是通过链霉菌属的种A92-308110或其突变体的发酵(其中培养物用间酪氨酸类似物饲喂)而产生的那些。
本文所用术语“间酪氨酸类似物”是指与间酪氨酸结构类似但组成略微不同(如在一个或多个原子被另一个原子替换方面或在存在或缺少特定官能团的情况下)的化学化合物，特别是在式(III)中描述的那些。
本文所用术语“HCV”是指丙型肝炎病毒，是单链的RNA包膜病毒，为黄病毒科(Flaviviridae)成员。
本文所用术语“HIV”是指人类免疫缺陷病毒，是人获得性免疫缺陷综合征的病原体。
本文所用术语“生物利用度”是指施用后药物或其他物质在生物活性位点被吸收或可利用的程度或比率。该性质依赖于多种因素，包括所述化合物的溶解性、胃肠道吸收速率、蛋白结合的程度和代谢等。本文中描述的各种生物利用度试验是本领域技术人员熟知的(同样参见Egorin等2002)。
本申请中所用术语“水溶性”是指在水性介质中的溶解性，例如pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或5％的葡萄糖溶液。下文实施例部分“水溶性分析”给出了水溶性试验。
本发明化合物例如式(I)化合物的可药用盐包括从可药用的无机或有机酸或碱形成的常规盐，以及季铵的酸加成盐。适当的酸加成盐的更具体例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺羟基萘酸、氢碘酸、苹果酸、硬脂酸、鞣酸的盐等。尤其有价值的是盐酸盐。其他酸类例如草酸虽然本身不是可药用的，但可用于制备获得本发明化合物及其可药用盐的中间体的盐。适当的碱盐的具体实例包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因盐。下文所述本发明的化合物包括式(I)的化合物及其可药用的盐。
本文所用术语“烷基”表示直链或支链的烷基。示例性烷基是C1-6烷基，例如C1-4烷基。
“链烯基”是指含有2个或多个碳原子的烷基，其被一个或多个双键不饱和。
烷基的实例包括C1-4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基和正丁基。链烯基的实例包括C2-4链烯基，例如–CH＝CH2和–CH2CH＝CH2。
术语“治疗”包括预防性和治疗性治疗。
附图说明
图1：化合物结构和Sanglifehrin A编码系统
图2：化合物14的1H NMR
图3：化合物15的1H NMR
图4：化合物16的1H NMR
图5：化合物17的1H NMR
图6：化合物18的1H NMR
图7：化合物19的1H NMR
图8：化合物20的1H NMR
发明描述
如前所述，本发明提供了突变合成的Sanglifehrin类似物、制备这些化合物的方法和医疗中使用这些化合物的方法。
在一个实施方案中，所述化合物是其甲醇加成物，其中通过C-53酮和C-15羟基以及甲醇结合形成缩酮。在另一个实施方案中，并非如此。
在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个可表示的C1-10烷基(例如C1-6烷基)的碳原子被杂原子替换。
若-CH3被N替换，形成的基团为–NH2。若-CH2-被N替换，形成的基团为–NH-。若–CHR-被N替换，形成的基团为–NR-。因此R1、R2、R3、R4和R5中的氮原子可以是伯、仲或叔氮原子。
若-CH3被O替换，形成的基团为–OH。
当R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个可表示的C1-10烷基(例如C1-6烷基)的碳原子被杂原子替换时，其适当地被O、S或N、尤其是N或O、特别是O替换。
当R1、R2、R3、R4和R5中的任一个含有基团S(O)p时，变量p适当地表示0或1。在一个实施方案中，p表示0。在另一个实施方案中，p表示1。在另一个实施方案中，p表示2。
当R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个可表示的C1-10烷基(例如C1-6烷基)含有超过一个杂原子时，这些原子通常应该被两个或更多个碳原子隔开。
适当地，R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个可表示的C1-10烷基(例如C1-6烷基)的碳原子未被任何杂原子替换，要不然表示OH或NH2。
当R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个可表示的C1-10烷基(例如C1-6烷基)的碳原子被羰基替换时，羰基适当地位于另一碳原子或氮原子毗邻。适当地，羰基未位于硫或氧原子毗邻。
例如R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个可表示–COC1-3烷基例如-COMe。
适当地，R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个可表示的C1-10烷基(例如C1-6烷基)基团的碳原子未被羰基替换。
R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个可表示的C1-10烷基(例如C1-6烷基)可被一个或多个卤素原子取代。例如R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个可表示–CF3。或者，R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个可表示被一个或多个(例如一个)Cl或F原子取代的C1-10烷基(例如C1-6烷基)(例如–CH2CH2Cl)。
适当地，R1、R2、R3、R4和R5的C1-10烷基(例如C1-6烷基)未被卤素取代。
当R1、R2、R3、R4和R5基团中的一个或多个表示C1-10烷基(例如C1-6烷基)时，适当地该基团表示C1-4烷基(例如C1-2烷基如甲基)。
在一实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个表示C1-6烷基(如C1-2烷基)或C2-3链烯基例如R1、R2、R3、R4和R5中的一个或多个表示甲基。
适当地R1表示H、F、Cl、CF3、OH或C1-6烷基(例如甲基)。更适当地，R1表示H或F，尤其是H。
适当地R2表示H、F、Cl、CF3、OH、NH2或C1-6烷基(例如甲基)。更适当地，R2表示H、F、OH或NH2，尤其是OH。
适当地R3表示H、F、Cl、CF3、OH或C1-6烷基(例如甲基)。更适当地，R3表示H、Me或F。R3也可表示乙基。
适当地R4表示H、F、Cl、CF3、OH或C1-6烷基(例如甲基)。更适当地，R4表示H或F。
适当地R5表示H、F、Cl、CF3、OH或C1-6烷基(例如甲基)。更适当地，R5表示H或F。
适当地R1、R2、R3、R4或R5中的一个或更多个、更适当地两个或更多个(例如三个或更多个)不表示H。
适当地R1、R2、R3、R4或R5中的一个或更多个、例如两个或更多个表示F。
适当地R3或R4或R3和R4表示F。在另一个实施方案中，R1和R3表示F。
在一个实施方案中，X1表示N(因此R1不存在)。在另一个更优选的实施方案中，X1表示C。
适当地X2表示C。
适当地X3表示C。
适当地X4表示C。
适当地X5表示C。
在一个实施方案中，该化合物是式(I)化合物。在另一个实施方案中，该化合物是式(II)化合物。
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示OH，R3表示H，R4表示F，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000171
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示OH，R3表示F，R4表示F，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000172
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示OH，R3表示F，R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000181
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示OH，R3表示Me，R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000182
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示H，R3表示H，R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000183
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示NH2，R3表示H，R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000191
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示F，R3表示H，R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000192
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示OH，R3表示H，R4表示F，R5表示H，X1表示N且X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000193
其也可表示为：
Figure BDA0001227489520000201
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示OH，R3表示H，R4表示F，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000202
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示OH，R3表示F，R4表示F，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000203
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示OH，R3表示F，R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000211
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示OH，R3表示Me，R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000212
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示H，R3表示H，R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000213
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示NH2，R3表示H，R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000221
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示F、R3表示H，R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000222
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示OH、R3表示Et、R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000223
在本发明的适合实施方案中，R1表示F，R2表示OH，R3表示F，R4表示H，R5表示H且X1、X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000231
在本发明的适合实施方案中，R1表示H，R2表示OH，R3表示H，R4表示F，R5表示H，X1表示N且X2、X3、X4和X5表示C，如由下列结构表示：
Figure BDA0001227489520000232
其也可表示为：
Figure BDA0001227489520000233
在一些实施方案中，C26,27位处的双键(参考sanglifehrin A的结构)可呈顺式，而不是反式。
通常，本发明化合物通过突变合成制备。
通常，用于制备式(I)或(II)的某些化合物或其可药用盐的方法，其包括：
·用sanglifehrin生产者(如链霉菌属的种A92-308110(也称为DSM 9954)或更优选地，sfaA基因或sfaA基因同源物失活或缺失的sanglifehrin生产者的培养物接种发酵液；
·用间酪氨酸类似物(如示于式(III))饲喂发酵液
·允许发酵继续直至产生sanglifehrin类似物
·提取和分离sanglifehrin类似物
Figure BDA0001227489520000241
其中R7表示H或酯形成基团如烷基基团，例如C1-6烷基如Me。
适合地式(III)中的X1、X2、X3、X4、X5、R1、R2、R3、R4和R5基团如对于式(I)和(II)的化合物所定义。
供料可以是式(III)化合物的外消旋形式或L-形式。
式(III)化合物或者商购可得或者通过标准有机合成化学技术来制备。制备式(III)化合物的一种通用路径如下列流程1所示：
Figure BDA0001227489520000242
流程1：a)使式(IV)的醛与适合片段例如(R7O)2P(O)CH(NHPG)CO2R7偶联，b)如有需要，氢化和脱保护。PG＝保护基。
式(IV)的醛可商购可得或容易地通过本领域技术人员合成。保护和脱保护化学可需要用于从式(IV)化合物产生式(III)化合物。这些技术为本领域技术人员所已知并且适合的保护基描述于Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis(Wuts和Greene,第4版,2007)中。
除了本文提供的具体方法和参考之外，本领域技术人员也可请教用于合成方法的标准科教书参考，包括但不限于Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry(Furniss等,1989)和March’s Advanced Organic Chemistry(Smith和March,2001)中。
根据本发明的突变合成的sanglifehrin类似物可单独地或与其他治疗剂组合施用。两种(或更多种)试剂的共施用可允许较低剂量的待使用的每种试剂，因此降低副作用可获得改善的效力，由此更高的SVR以及耐药性的降低。
因此在一个实施方案中，突变合成的sanglifehrin类似物与一种或多种用于治疗HCV感染的治疗剂共施用，所述治疗剂来自于护理治疗标准。这可以是干扰素(例如pIFNα和/或利巴韦林)。
在一个替代实施方案中，突变合成的sanglifehrin类似物与一种或多种其他抗病毒剂共施用，如STAT-C/DAA(用于治疗HCV的特异性靶向药物)，其可以是一种或多种以下抑制剂：非核苷聚合酶抑制剂(例如IDX375、VCH-222、BI 207127、ANA598、VCH-916)、核苷或核苷酸聚合酶抑制剂(例如2’-C-甲基胞苷、2’-C-甲基腺苷、R1479,PSI-6130、R7128、R1626)、蛋白酶抑制剂(例如BILN-2061、VX-950(替拉瑞韦(Telaprevir))、SCH503034(波普瑞韦(Boceprevir))、TMC435350、MK-7009、R7227/ITMN-191、EA-058、EA-063)或病毒进入抑制剂(例如PRO 206)。
制剂可以方便地以单位剂型呈递，并可通过药学领域公知的任何方法制备。所述方法包括将活性成分(本发明的化合物)与载体混合的步骤，所述载体由一种或多种辅助成分构成。通常，所述制剂可通过将活性成分与液相载体或精细粉碎的固相载体或两者均匀且充分地混合而制备，如果需要的话，随后使产物成型。
本发明的化合物通常以包含活性成分(任选以无毒有机或无机酸或碱加成盐形式)的药物制剂形式、以可药用的剂型口服施用。根据所治疗的病症和患者，以及施用途径，所述组合物可以以不同剂量施用。
例如，本发明的化合物可以以片剂、胶囊、胚珠(ovules)、酏剂、溶液或混悬液的形式口服、经颊或舌下施用，其可以含有矫味剂或着色剂，用于即释、缓释或控释应用。
所述片剂可含有赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸，崩解剂例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐，以及颗粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外还可包括润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山嵛酸酯和滑石。
可使用类似类型的固相组合物用作明胶胶囊的填充剂。这方面优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳中的糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于水性混悬液和/或酏剂，本发明的化合物可与多种甜味剂或矫味剂、着色剂或染料、乳化剂和/或混悬剂以及如水、乙醇、丙二醇和甘油及其组合的稀释剂组合。
片剂可通过压缩或模制制备，任选使用一种或多种辅助成分。压缩片剂可通过在适当的机器中压缩活性成分制备，其中活性成分是自由流动的形式，例如粉末或颗粒，任选与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可通过在适当的机器中模制用惰性液体稀释剂湿润的粉末化化合物的混合物制备。片剂任选地被包衣或刻痕，可配制以提供活性成分的缓释或控释，例如用不同比例的羟丙基甲基纤维素来提供需要的释放性质。
根据本发明的适合口服施用的制剂可以是离散的单位形式，例如胶囊、扁囊剂或片剂，其各自含有预定量的活性成分；粉末或颗粒；在水性液体或非水性液体中的溶液或混悬液；或作为水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。活性成分也可以是大丸剂、药糖剂(electuary)或糊剂。
应当理解，除上述具体提到的成分外，本发明的制剂可包括其他本领域的常规试剂，其依据所考虑制剂的类型而定，例如适于口服施用的制剂可包括矫味剂。
有益地，如防腐剂和缓冲剂的试剂可溶于载体。为提高稳定性，组合物可在填充至容器中后冷冻，在真空下除去水分。随后将无水冻干粉末密封在小瓶中，并可提供用于在使用前重构液体的附加的一小瓶注射用水。
本发明化合物施用的剂量根据具体的化合物、涉及的疾病、患者以及所述疾病的性质和严重程度和患者的身体条件以及所选择的施用途径而不同。适当的剂量可由本领域技术人员方便的确定。
根据施用的方法，所述组合物可含有0.1％重量、优选5-60％、更优选10-30％重量的本发明的化合物。
本领域技术人员应当理解，本发明化合物的最优量和各剂量的施用间隔将由所治疗病症的性质和程度；施用的形式、途径和位点；以及所治疗的特定个体的年龄和状况决定，并且医生将最终确定使用的合适剂量。该剂量可酌情重复施用。如果出现副作用，可根据正常的临床实践调整或减少剂量和/或给药频率。
本发明的其他方面包括：
-根据本发明的化合物，其用作药物；
-根据本发明的化合物，其用作治疗病毒感染(尤其是RNA病毒感染)例如HCV或HIV感染的药物，用作抗炎剂或用于预防器官移植排斥；
-包含根据本发明的化合物和可药用稀释剂或载体的药物组合物；
-包含根据本发明的化合物和可药用稀释剂或载体以及第二种或后续的活性成分的药物组合物，所述第二种或后续的活性成分尤其是用于治疗病毒感染例如HCV或HIV感染的活性成分，用作抗炎剂或用于预防器官移植排斥；
-治疗病毒感染(尤其是RNA病毒感染)例如HCV或HIV感染、用作抗炎剂或用于预防器官移植排斥的方法，包括向对象施用治疗有效量的本发明化合物；
-根据本发明的化合物在制备用 于治疗病毒感染例如HCV或HIV感染、用作抗炎剂或用于预防器官移植排斥的药物中的用途。
-用 于产生突变合成的sanglifehrin(如式(I)或(II)的化合物)的方法，其包括对产sanglifehrin细菌如链霉菌属的种(例如A92-308110)饲喂式(III)化合物或其盐，并培养细菌以使产生突变合成的sanglifehrin。
-根据前述段落的方法，其中所述产sanglifehrin细菌是其中sfaA基因或sfaA基因同源物失活或缺失的链霉菌属的种。
-根据前述两个段落的方法，其进一步包括分离突变合成的sanglifehrin的步骤。
新的式(III)(如列于表1中的那些以及列于表1中的任何式(III)化合物的酸和酯)和式(IV)的化合物(包括其盐和酯)也形成本发明的方面。
通用方法
材料和方法
菌株和生长条件
生产Sanglifehrin的链霉菌属的种A92-308110(DSM编号9954,购自DSMZ,Braunschweig,德国)也称为BIOT-4253和BIOT-4370或其衍生物、例如BIOT-4585在培养基燕麦琼脂、MAM、ISP4或ISP2上于28℃维持(见下文)。
pKC1139(一种标准链霉菌属-大肠杆菌穿梭质粒)获自John Innes Centre,UK并且其描述于Bierman等人，1992和Kieser等人，2000。
BIOT-4585在燕麦琼脂上于28℃生长7-10天。将琼脂平板表面收集的孢子放入20％w/v无菌甘油的蒸馏水中，以0.5ml的量分存于-80℃。使用冷冻的孢子储存液接种种子培养基SGS或SM25-3。将接种的种子培养基在200和300rpm之间以5.0或2.5cm振幅(throw)在27℃振荡培养24小时。用2.5％-10％种子培养基接种发酵培养基SGP-2或BT6，在200和300rpm之间以5.0或2.5cm振幅在24℃振荡培养4-5天。随后收集培养物用于提取。
间酪氨酸类似物
(2S)-2-氨基-3-(6-羟基(2-吡啶基))丙酸甲酯、L-3-氨基苯基丙氨酸甲酯、L-4-甲基-间酪氨酸甲酯、L-4-氟-间酪氨酸甲酯和L-4,5-二氟-间酪氨酸甲酯购自Netchem(USA)。
DL-3-氟苯基丙氨酸和L-苯基丙氨酸购自Sigma(UK)。
DL-间酪氨酸购自Fluorochem(UK)。
L-间酪氨酸购自Alfa Aesar(UK)。
DL-4-氟间酪氨酸(8)、DL-5-氟间酪氨酸(9)、2-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯(10)、2-氨基-3-(2-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯(11)、2-氨基-3-(2-氟-3-羟基苯基)丙酸甲酯(12)和2-氨基-3-(2,6-二氟-3-羟基苯基)丙酸甲酯(13)如下合成：
DL-4-氟间酪氨酸(8)
Figure BDA0001227489520000291
在-70℃向8-1(3g，19.5mmol)在干燥DCM(150mL)中的溶液滴加BBr3(4M于DCM中，14.6ml，58.5mmol)。加入后，将反应混合物在-20℃搅拌3h，小心加入冰水，用DCM萃取。用水和盐水洗涤有机层，经Na2SO4干燥，过滤，浓缩。通过快速硅胶色谱纯化残余物，得到所需化合物8-2。
在室温向8-2(0.9g，6.4mmol)在丙酮(40mL)中的溶液加入K2CO3(2.2g，16mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。加入水，在真空下除去丙酮，然后用EtOAc萃取，用水和盐水洗涤有机层，经Na2SO4干燥，过滤，浓缩。通过快速硅胶色谱纯化残余物，得到所需化合物8-3.
将8-3(1g，4.34mmol)、马尿酸(860mg，4.80mmol)、NaOAc(400mg)和Ac2O(2.2mL)的混合物在80℃搅拌2h。将黄色反应混合物冷却，加入冷的EtOH(10mL)，将混合物在冰浴中冷却15min，然后倒入30mL冰水，冷冻，通过过滤收集产物。在真空中干燥固体，获得8-4。
将8-4(300mg，0.8mmol)和NaOAc(71mg，0.87mmol)在MeOH(50mL)中的溶液在室温搅拌过夜。通过旋转蒸发除去溶剂，将残余物溶于50mLEtOAc中，用水洗涤EtOAc溶液两次，浓缩，得到8-5。
将8-5(360mg，0.89mmol)在MeOH(50mL)中的溶液于标准压力下在10％Pd/C(77mg)上氢化20h。通过过滤除去催化剂后，蒸发溶剂，得到产物8-6。
将8-6(210mg)在3N HCl(10mL)中的溶液回流24h。将溶液浓缩至干，通过反相-combiflash纯化残余物，得到目标产物8。
DL-5-氟间酪氨酸(9)和2-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯(10)
Figure BDA0001227489520000301
在-78℃向9-1(20g，97.55mmol)在四氢呋喃(100mL)中的溶液滴加正丁基锂(43ml，2.5M，107.3mmol)。将其搅拌30分钟，在该温度加入N,N-二甲基甲酰胺(15.1ml，195.1mmol)。将其再搅拌30分钟，除去冷浴。1小时后，用饱和氯化铵水溶液淬灭反应。用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，干燥(硫酸钠)，过滤，浓缩。通过硅胶色谱纯化残余物，得到9-2。
在-70℃向9-2(6g，38.9mmol)在干燥DCM(200mL)中的溶液滴加BBr3(4M于DCM中，30ml，116.8mmol)。加入后，将反应混合物在-20℃搅拌3小时，小心加入冰水，用DCM萃取。用水和盐水洗涤有机层，经Na2SO4干燥，过滤，浓缩。通过快速硅胶色谱纯化残余物，得到所需化合物9-3。
在室温向2-(苄氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(4.64g，14mmol)在DCM(150mL)中的溶液加入DBU(4.26g，28mmol)。10min后，加入9-3(1.95g，14mmol)，将所得混合物在室温搅拌过夜。将溶液用EtOAc(150mL)稀释，分离，将有机层用1N HCl洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，浓缩。通过快速硅胶色谱纯化残余物，得到9-4。
将9-4(1g)在MeOH(20mL)中的溶液在标准压力下于200mg 10％Pd/C上氢化过夜。通过过滤除去催化剂后，蒸发溶剂，得到10。
向10(300mg，1.4mmol)在EtOH(30mL)中的溶液加入NaOH水溶液(2N，4mL)，将反应在室温搅拌30分钟。除去溶剂，将残余物用2N HCl中和至pH＝6，通过过滤收集形成的白色晶体，得到目标化合物9。
2-氨基-3-(2-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯(11)
Figure BDA0001227489520000311
在-78℃向化合物11-1(1.4g，9mmol)在50mL DCM中的溶液滴加BBr3(4M于DCM中，3.6ml，13.5mmol)。加入后，将反应在-20℃搅拌 4小时。然后缓慢加入冰/水，分离各层，用水和盐水洗涤有机层，经Na2SO4干燥，蒸发至干。残余物不经进一步纯化即可用于下一步骤。
在室温向2-(苄氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(3g，9mmol)在100mL DCM中的溶液加入DBU(2.8g，18mmol)，10min后，加入化合物11-2(来自最后一步的粗化合物)，在室温搅拌2小时。然后将溶液用DCM(50mL)稀释，用1N HCl(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，蒸发至干。通过硅胶色谱纯化残余物(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到11-3。
将化合物11-3(500mg，1.5mmol)在MeOH(20mL)中的混合物在标准压力下于50mg10％Pd/C上氢化过夜。通过过滤除去催化剂后，蒸发溶剂以得到粗产物，其通过反相-combiflash纯化，得到11，为白色固体。
2-氨基-3-(2-氟-3-羟基苯基)丙酸甲酯(12)
Figure BDA0001227489520000321
在-78℃向化合物12-1(1.4g，9mmol)在50mL DCM中的溶液滴加BBr3(4M于DCM中，3.6ml，13.5mmol)。加入后，将反应在-20℃搅拌4小时。缓慢加入冰/水后，分离各层，用水和盐水洗涤有机层，经Na2SO4干燥，蒸发至干。残余物不经进一步纯化即可用于下一步骤。
在室温向2-(苄氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(3g，9mmol)在100mL DCM中的溶液加入DBU(2.7ml，18mmol)，10min后加入化合物12-2(来自最后一步的粗化合物)，在室温搅拌2小时。然后将溶液用DCM(100mL)稀释，用1N HCl(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，蒸发至干。通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化残余物，得到12-3。
将化合物12-3(500mg，1.44mmol)在MeOH(10mL)中的混合物在标准压力下于100mg10％Pd/C上氢化过夜。通过过滤除去催化剂后，蒸发溶剂以得到粗产物，其通过反相-combiflash纯化，得到所需化合物12，为白色固体。
2-氨基-3-(2,6-二氟-3-羟基苯基)丙酸甲酯(13)
Figure BDA0001227489520000331
在0℃向2,4-二氟苯酚(2g，15.4mmol)在50mL DMF中的溶液加入K2CO3(3.2g，23.1mmol)和BnBr(2.2ml，18.5mmol)。将反应在室温搅拌2小时。加入水(100mL)和EA(200mL)，将有机层用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，蒸发至干。通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)纯化残余物，得到粗13-1。
在-78℃向化合物13-1(2g，9mmol)在10mL THF中的溶液滴加n-BuLi(4ml，2.5M)，搅拌30min。加入DMF(1.3g，0.018mmol)，再次搅拌30min。然后除去冷浴，将反应混合物在室温搅拌1小时，之后用水淬灭。将其用乙酸乙酯萃取(20mL x3)，经Na2SO4干燥，蒸发至干。通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)纯化残余物，得到13-2，为黄色固体。
在室温向2-(苄氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(728mg，2.2mmol)在20mL DCM中的溶液加入DBU(319mg，2.1mmol)。10min后，加入化合物13-2(500mg，2mmol)，在室温搅拌2小时。然后将溶液用DCM(50mL)稀释，用1N HCl(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，蒸发至干。通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化残余物，得到为黄色油状物的13-3。
将在MeOH(20mL)中的化合物13-3(600mg，1.32mmol)在标准压力下于60mg 10％Pd/C上氢化过夜。通过过滤除去催化剂后，蒸发溶剂以得到粗产物，其通过反相-combiflash纯化，得到所需化合物13，为白色固体。
培养基配方
用于制备培养基的水使用Millipore Elix Analytical Grade WaterPurification System制备。
SGS种子培养基
Figure BDA0001227489520000341
灭菌前pH用10M NaOH/10M H2SO4调节至pH 7.0
通过在121℃加热20-30min来灭菌(高压灭菌)
注意
*消泡剂仅在种子发酵罐中使用，而非种子培养瓶
**考虑接种体积相应调节最终体积
痕量元素溶液B
Figure BDA0001227489520000351
SGP2生产培养基
Figure BDA0001227489520000352
灭菌前pH用10M NaOH调节至pH 6.8
通过在121℃加热20-30min来灭菌(高压灭菌)
注意
*最终体积根据接种体积相应调节
**消泡剂仅在发酵罐中使用，而非培养瓶
SM25-3培养基
成分
甘油(Fisher scientific,G/0650/25) 40g
大豆蛋白胨A3 SC(Organotechnie) 10g
麦芽汁(Difco)21g
至最终体积1L
灭菌前pH未经调节(即pH 7.0)
ISP4培养基
成分
Figure BDA0001227489520000361
ISP痕量盐溶液1mL
琼脂20g
至最终体积1L
以少量体积的冷水用淀粉制备糊剂并调至500ml体积
将其他成分加至在500ml水中的溶液II，pH应该在pH 7.0至pH 7.4之间(pH 7.3)，将两种溶液混合在一起并加入琼脂
ISP痕量盐
成分
FeSO4.7H2O 1g
MnCl2.4H2O 1g
ZnSO4.7H2O 1g
至最终体积 1L
在4℃贮存
一般发酵方法
将冷藏保存的BIOT-4585孢子贮备液在室温融化。通过在具有泡沫塞(foam plug)的2L锥形烧瓶中将4.0mL孢子贮备液转移到400mL培养基SM25来制备营养培养物(种子培养物)。在27℃和250rpm(5.0cm振幅)下培养48小时。在具有泡沫塞的2L锥形烧瓶中将25mL种子培养物转移到250mL生产培养基SGP2+5％HP20中。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下培养24小时后，将2mL的所需前体在1M盐酸中的250mM外消旋体或125mM对映异构体纯的溶液以及2mL的250mM DL-六氢哒嗪-3-羧酸的甲醇溶液加至每个生产烧瓶，得到最终浓度为1mM的前体的单独对映异构体。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下继续再培养四天。
通过LC-UV和LC-UV-MS分析培养发酵液
加入培养发酵液(1mL)和乙酸乙酯(1mL)，混合15-30分钟，随后离心10分钟。收集0.4mL有机层，蒸干，随后重溶于0.20mL乙腈中。
HPLC条件：
C18 Hyperclone BDS C18柱3u,4.6mm x150mm
配备Phenomenex Analytical C18安全预柱(KJ0-4282)
柱温50℃
流速1mL/min
UV监测240nm
进样体积20uL
溶剂梯度：
0min：55％B
1.0min：55％B
6.5min：100％B
10.0min：100％B
10.05min：55％B
13.0min：55％B
溶剂A是水+0.1％甲酸
溶剂B是乙腈+0.1％甲酸
在这些条件下SfA在5.5min时洗脱
在这些条件下SfB在6.5min时洗脱
LCMS在整合的Agilent HP1100 HPLC系统与Bruker Daltonics Esquire 3000+电喷雾质谱仪(阳离子模式)上进行，使用前述的色谱和溶剂。
QC LC-MS方法
HPLC条件：
C18 Hyperclone BDS C18柱3u,4.6mm x150mm
装有Phenomenex Analytical C18安全预柱(KJ0-4282)
柱温50℃
流速1mL/min
UV监测210、240和254nm
溶剂梯度：
0min：10％B
2.0min：10％B
15min：100％B
17min：100％B
17.05min：10％B
20min：10％B
溶剂A是水+0.1％甲酸
溶剂B是乙腈+0.1％甲酸
MS条件
MS在切换模式操作(正和负之间切换)，从150扫描到1500amu.
体外分析LC-MS方法(例如用于微粒体稳定性评估)
使用API-2000、API-4000或UPLC仪器
HPLC条件：
对于15：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)
对于化合物5、14、16、17、18、19Ultimate XB-C18(2.1×50mm,5μm)
柱温50℃
流速0.6mL/min
溶剂梯度A1(例如用于化合物15)：
0.2min：20％B
0.6min：95％B
1.1min：95％B
1.15min：20％B
1.5min：停止
溶剂A是H2O-0.025％FA-1mM NH4OAC
溶剂B是ACN-0.025％FA-1mM NH4OAC
溶剂梯度A2(例如用于化合物5、14、16、17、18、19)：
0.3min：10％B
0.8min：95％B
2.3min：95％B
2.31min：10％B
3.5min：停止
溶剂A是H2O-0.1％FA
溶剂B是MeOH-0.1％FA
负扫描模式：
MRM设置：
跃迁[Da]
21 1089.7→504.2
正扫描模式：
MRM设置：
Figure BDA0001227489520000401
用于评价HCV抗病毒活性的体外复制子测定
针对基因型1HCV的抗病毒效果可如下测定：在加入测试物前1天，将含有HCV基因型1b I389luc-ubi-neo/NS3-3’/5.1复制子的Huh5.2细胞(Vrolijk等,2003)在细胞生长培养基[DMEM(目录号41965039)，补充有10％FCS、1％非必需氨基酸(11140035)、1％青霉素/链霉素(15140148)和2％遗传霉素(10131027)；Invitrogen]中以1.3-1.4的比例传代培养，在75ml组织培养瓶(Techno Plastic Products)中生长3-4天，收集并接种在测试培养基中(DMEM,10％FCS,1％非必需氨基酸,1％青霉素/链霉素)，在96孔组织培养微量滴定板(Falcon,Beckton Dickinson用于评价抗代谢效应，CulturPlate,Perkin Elmer用于评价抗病毒效应)中以密度6500细胞/孔(100μL/孔)接种。将微量滴定板温育过夜(37℃,5％CO2,95-99％相对湿度)，产生未汇合的细胞单层。制备稀释液系列；各稀释液至少制备两份。分析建立后，将微量滴定板温育72小时(37℃,5％CO2,95-99％相对湿度)。
为评价抗代谢效应，吸出测试培养基，用75μL 5％MTS(Promega)在无酞红培养基中的溶液替换，温育1.5小时(37℃,5％CO2,95-99％相对湿度)。在波长为498nm处测定吸光度(Safire2,Tecan)，将光密度(OD值)转化为未处理对照的百分数。
为评价抗病毒效应，吸出测试培养基，细胞单层用PBS洗涤。吸出洗涤缓冲液，加入25μL Glo裂解缓冲液(目录号E2661,Promega)，室温下使裂解进行5分钟。随后加入50μL荧光素酶分析系统(目录号E1501,Promega)，立即量化荧光素酶的发光信号(1000ms积分时间/孔,Safire2,Tecan)。将相对发光单位转化为未处理对照的百分数。
EC50和EC90(从剂量效应曲线获得)分别表示病毒复制被抑制50％和90％时的浓度。CC50(从剂量效应曲线获得)表示细胞的代谢活性下降至未处理细胞的50％的浓度。选择性指数(SI)表示化合物的治疗窗，按照CC50/EC50计算。
一定浓度的化合物被认为能在HCV复制子系统中产生确切的抗病毒效应，此时该特定浓度下抗复制子效应高于70％的阈值，且观察到不超过30％的代谢活性下降。
对于结果参见实施例12。
用于评价基因型1a和2a的HCV抗病毒活性的体外复制子测定
将复制子细胞(基因型1a(H77)和2a(JFH-1)的亚基因组复制子)在37℃于5％CO2培养箱中于Dulbecco’s改性必需培养基(DMEM)、10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素(pen-strep)、1％谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、250μg/ml G418中生长。所有细胞培养物试剂可购自Mediatech(Herndon,VA)。
使复制子细胞胰蛋白酶化并且以5x103个细胞/孔接种于具有不含G418的上述培养基的96-孔平板中。第二天，将培养基用含有在存在5％FBS下连续稀释的化合物的DMEM替换。HCV复制子抗病毒测定检查一系列化合物稀释液中化合物的效应。简言之，将含有HCV复制子的细胞接种于96孔平板中。试验品用DMEM+5％FBS连续稀释。将所稀释的化合物施加至平板中的适合孔。在37℃温育72小时后，处理细胞。来自每个孔的细胞内RNA用RNeasy96kit(Qiagen)提取。HCV RNA水平通过逆转录酶-实时PCR测定、使用
Figure BDA0001227489520000421
One-Step RT-PCR Master Mix Reagents(Applied Biosystems,Foster City,CA)和ABI Prism7900序列检测系统(Applied Biosystems)来测定，如前所述(Vrolijk等，2003)。用
Figure BDA0001227489520000422
核糖体RNA对照试剂(Applied Biosystems)作为细胞数的指示来测量细胞毒性效应。然后将HCV RNA和核糖体RNA的量用于获得适用的IC50值(对复制子复制抑制50％的浓度)。
微粒体代谢评价(微粒体稳定性测定)
微粒体中的代谢率可如下进行测试：
将小鼠或人类肝微粒体用缓冲液C(0.1M磷酸钾缓冲液，1.0mM EDTA,pH 7.4)稀释至2.5mg/mL的浓度。然后通过将50uL 5uM化合物加标溶液(spiking solution)(在9.5uLACN中的0.5uL 10mM DMSO储存溶液，加至990uL Buffer C)加至50μL微粒体溶液(2.5mg/mL)、110uL Buffer C且充分混合来制备微粒体稳定性样品。所有样品在37℃预温育约15分钟。随后，通过在轻轻混合下加入40uL NADPH溶液(12.5mM)来引发反应。在0、15、30、45和60分钟时移取等分试样(40uL)，且用含有内标的ACN(120uL)淬灭。通过离心(4000rpm,15min)移除蛋白，通过LC-MS/MS分析样品平板的化合物浓度。然后通过标准方法计算半衰期，将分析物浓度与最初存在的量进行比较。
对于结果参见实施例13。
肝细胞稳定性评价
将先前存于液氮中的冷藏保存的肝细胞置于37±1℃振荡水浴中2分钟±15秒。然后将肝细胞加至10X体积的预温热的Krebs-Henseleit碳酸氢盐(KHB)缓冲液(2000mg/L葡萄糖，无碳酸钙和碳酸氢钠，Sigma)，轻轻混合，以500rpm离心3分钟。离心后，小心移除上清液，加入10X体积的预温热的KHB缓冲液以使细胞沉淀物重悬。将其轻轻混合，以500rpm离心3分钟。然后移取上清液，弃去。然后通过细胞计数确定细胞存活力和产率，且这些值用来产生人类肝细胞悬浮液至适当接种密度(活细胞密度＝2×106个细胞/mL)。将2X施用溶液在预温热的KHB(1％DMSO)中制备(200uM加标溶液：在980uL DMSO中的20uL底物储存溶液(10mM)，2X施用溶液：10uL在990μL KHB中的200uM加标溶液(稀释后为2uM)。
将50uL预温热的2X施用溶液加至各孔中，加入50uL预温热的肝细胞溶液(2×106个细胞/mL)，开始计时。然后将平板在37℃温育。在轻轻混合下完成温育时间(0、15、30、60和120分钟)后将含有内标的100uL乙腈加至每个孔中，加入50uL预温热的肝细胞溶液(2×106个细胞/mL)。在结束温育后，确定细胞存活力。将样品在4℃以4000rpm离心15分钟，上清液用超纯水稀释2倍，化合物水平通过LC-MS/MS分析。
水溶性评价
水溶性可如下测定：在室温在100％DMSO中制备10mM Sanglifehrin类似物的储存溶液。在琥珀色小瓶中用0.1M PBS pH7.3的溶液或100％DMSO一式三份将0.01mL等分试样稀释至0.5mL。在室温在
Figure BDA0001227489520000431
vibrax VXR振荡器上振荡所得0.2mM的溶液6小时，随后将所得溶液或混悬液转移至2mL Eppendorf管中，在13200rpm离心30分钟。随后如前所述通过LCMS方法分析上清液等分试样。
或者，在pH7.4的PBS中的溶解度如下测定：使用50％MeOH的水溶液将测试化合物和对照化合物稀释至40μM、16μM、4μM、1.6μM、0.4μM、0.16μM、0.04μM和0.002μM，产生校准曲线。标准点随后进一步用MeOH:PBS 1:1以1:20稀释。1:20稀释后的终浓度为2000nM、800nM、200nM、80nM、20nM、8nM、2nM和1nM。标准品随后与含有内标(羟基大环,6)的同样体积ACN(1:1)混合。离心样品(5min,12000rpm)，随后通过LC/MS分析。
Figure BDA0001227489520000432
Figure BDA0001227489520000441
将测试化合物制备成10mM浓度的在DMSO中的储存液。将储存液一式两份用pH7.4的PBS在1.5mL Eppendorf管中稀释至目标浓度100μM，最终DMSO浓度为1％(例如将4μL10mM DMSO储存液稀释入396μL 100mM的磷酸缓冲液)。样品管随后在室温下轻微振荡4小时。离心样品(10min,15000rpm)以沉淀不溶的颗粒。将上清液转移至新的管中并用PBS稀释(各试验样品的稀释因子通过化合物在所用分析仪器上的信号水平验证)。将稀释的样品随后与同样体积的MeOH混合(1:1)。样品最终与同样体积(1:1)的含内标(羟基大环,6)的ACN混合用于LC-MS/MS分析。
细胞渗透性评价
细胞渗透性可如下测定：将测试化合物以10mM溶于DMSO，随后进一步在缓冲液中稀释，产生最终10μM的给药浓度。荧光标记物荧光黄同样被纳入以监测膜完整性。随后将测试化合物应用于Caco-2细胞单层的顶表面，测定渗透到基底外侧区室的化合物。以反方向进行(底外侧到顶部)来研究主动转运。使用LC-MS/MS量化测试化合物和标准对照化合物(例如普萘洛尔和醋丁洛尔)的水平。
体内药代动力学评价
体内分析也可用于测定化合物的生物利用度。通常，将化合物通过静脉内和口服施用到受试动物(例如小鼠或大鼠)体内，在预定的间隔取血样测定所述药物相对于时间的血浆浓度如何变化。血浆浓度相对于时间的变化可使用标准模型用于计算化合物的绝对生物利用度百分数。典型的方案实例如下文所述。
向小鼠静脉内或口服施用1、10或100mg/kg的本发明化合物或其母体化合物。在5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360、420和2880分钟取血样，通过HPLC测定样品中本发明化合物或母体化合物的浓度。血浆浓度的时间进程可用于产生关键参数，例如血浆浓度-时间曲线下面积(AUC–其与到达体循环的未改变的药物总量成正比)、最大(峰值)血浆浓度、最大血浆药物浓度发生时的时间(峰值时间)、其他用于精确测定生物利用度的因素包括：化合物的终末半衰期、总体内清除率、稳态分配容积和F％。这些参数随后经非区室或区室方法分析获得计算的生物利用度百分数，该类方法的例子参见Egorin等2002及其参考文献。
口服和静脉内药代动力学的体内评价(特定方法)
对于sanglifehrin类似物，进行全血分析。将化合物在5％乙醇/5％cremophorEL/90％盐水中配制，用于口服和静脉内施用。用1mg/kg静脉内或10mg/kg口服对3只雄性CD1小鼠的各组进行给药。在给药前和在0.25、0.5、2、8和24小时时通过隐静脉采集血液样品(40uL)，用等量的dH2O稀释，立即置于干冰上。样品存于-70℃直至分析。通过LCMS如下确定样品中本发明化合物或母体化合物的浓度：将20uL血液：H2O(1:1,v/v)/PK样品加入100ng/mL的20uL内标(羟基大环化合物，6)、20uL工作溶液/MeOH和150uL CAN，以1500rpm涡旋1分钟，以12000rpm离心5min。然后将上清液注入LC-MS/MS。对血液浓度的时程作图，其用于获得全血浓度-时间曲线下面积(AUC–其直接与达到体循环的未变化药物的总量成比例)。如有可能，这些值用来产生口服生物利用度(F％)和其它PK参数。
细胞毒性的体外评价
将获自ATCC的Huh-7和HepG2细胞在含有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素(pen-strep)和1％谷氨酰胺的Dulbecco’s改性必需培养基(DMEM)中生长；而将CEM细胞(获自ATCC的人类T细胞白血病细胞)在含有10％FBS、1％pen-strep和1％谷氨酰胺的RPMI1640培养基中生长。从获自至少两个正常筛选的供者的全血分离新鲜人类PBMC。简言之，通过低速离心使外周血细胞沉淀/洗涤2-3次，重悬浮于PBS中，以除去受污染的血小板。然后将经洗涤的血细胞用Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)进行1:1稀释，于50mL离心管中用14mL淋巴细胞分离培养基(Lymphocyte Separation Medium)(LSM；Mediatech,Inc.的cellgrow；密度1.078+/-0.002g/ml；Cat.#85-072-CL)分层，以600X g离心30分钟。从所产生的界面小心吸取带条纹的PBMC，随后通过低速离心用PBS洗涤2X。最终洗涤后，通过台盼蓝排阻对细胞计数，以1x107个细胞/mL在补充有15％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、4μg/mL PHA-P的RPMI 1640中重悬浮。使细胞在37℃温育48-72小时。在温育后，对PBMC进行离心，重悬浮于含有15％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素、10ug/mL庆大霉素和20U/mL重组人类IL-2的RPMI 1640中。
通过测试每种化合物(一式三份)针对上述细胞的半对数浓度来评价化合物细胞毒性。仅含有培养基的细胞用作细胞对照(CC)。将Huh-7和HepG2细胞以5x103个细胞/孔的浓度接种于96孔平板中。第二天，吸取培养基，加入含有5％FBS的100uL相应培养基。在微量滴定管中以2X浓度制备测试药物稀释液，将100uL每种浓度置于标准格式的适合孔中。72小时后，处理细胞以用于细胞毒性评价。
将PBMC稀释于新鲜培养基中，以5x104个细胞/孔(体积100L)平铺于96孔圆底微板的内部孔中。类似地，以1x104个细胞/孔平铺CEM细胞。然后，将100uL 2X试验药物制剂加至标准格式的适合孔中。将培养维持六至七天，然后处理以进行细胞毒性测定。
使用CytoTox-ONETM均质膜完整性测定试剂盒(Promega)确定细胞毒性。该测定以荧光、均质模式测量乳酸脱氢酶(LDH)从具有受损膜的细胞中的释放。用酶联测定测量释放到培养基中的LDH，该酶联测定导致刃天青转化成荧光试卤灵产物。所产生的荧光的量与所溶解细胞的数目成比例。将六个连续稀释浓度的每种化合物施加至细胞，以(适用时)获得TC50(降低细胞存活力50％的药物的毒性浓度)和TC90(降低细胞存活力90％的药物的毒性浓度)值。
MDR1和MRP2转运蛋白抑制的体外评价
为评价MDR1(P糖蛋白1)和MRP2转运蛋白的抑制和激活，可使用SolvoBiotechnology公司的体外ATP酶测定法(Glavinas等,2003)。在钒酸盐存在或不存在情况下，将化合物(0.1、1、10和100μM)与MDR1或MRP2膜囊泡孵育，研究潜在的ATP酶激活。此外，在维拉帕米/柳氮磺吡啶存在下进行类似的孵育，以检测可能的转运蛋白ATP酶活性抑制。ATP酶活性通过分光光度法定量无机磷酸盐而测定。从ATP酶活性的钒酸盐敏感性增加计算激活。通过维拉帕米/柳氮磺吡啶介导的ATP酶活性下降测定抑制。
具体实施方式
实施例1–链霉菌属的种A92-308110(DSM9954)的sfaA缺失突变体的构建
1.1 sfaA缺失构建体的构建
通过用EcoRV和StuI消化来切断包含sfaA(核苷酸位置14396-21362，NCBI序列登录号FJ809786)的粘粒TL3006(SEQ ID NO.3)的～7kb EcoRV-StuI片段，将所得的分离片段直接连接到pKC1139中，pKC1139之前已用EcoRV消化且用虾碱性磷酸酶(Roche)处理。该质粒被称为pSGK268。
使用由Gene Bridges供应的Red/ET重组试剂盒(目录号K006)进行包含在该克隆中的sfaA基因的框内缺失。
(SEQ ID NO.1)SfaA17161f 5’-CGCTCTGTGGCGCCTGGTTTCCAAGCGGCTCGCGGACCGGCACCGGCACATGCATAATTAACCCTCACTAAAGGGCG-3’
(SEQ ID NO.2)SfaA17825r 5’-TGGATGTATCGTCGCAGGACGCCCAGAATTCACCTGCGACGTCCTCCAGATGCATTAATACGACTCACTATAGGGCTC-3’
使用两个寡核苷酸SfaA17161f和SfaA17825r，使用KOD DNA聚合酶，由在试剂盒中提供的FRT-PGK-gb2-neo-FRT模板DNA扩增新霉素标记物。所产生的～1.7kb扩增产物通过凝胶电泳分离，利用QiaEX树脂从凝胶纯化。
使用标准技术将质粒pSGK268转化至大肠杆菌DH10B，在含有安普霉素(50μg/ml)的平板上选择。基本上按照Gene Bridges试剂盒方案进行缺失构建体的引入。使单个菌落在2TY安普霉素(50ug/ml)中生长过夜，用pRedET(tet)质粒转化，在30℃用安普霉素(50ug/ml)和四环素(3ug/ml)选择。在30℃于3ml 2TY安普霉素(50ug/ml)和四环素(3μg/ml)中使用单个菌落制备该菌株的过夜培养物。在30℃使用0.5ml该培养物接种10ml 2TY安普霉素(50ug/ml)和四环素(3ug/ml)，生长直到OD600nm～0.5。将1.4ml该培养物转移至2个Eppendorf管中的每个，将50ul 10％阿拉伯糖加至一个管以诱导Red/ET重组蛋白的表达。在37℃将管振摇～1小时。将经诱导的和未经诱导的细胞在台式离心机中沉淀，用冷冻的无菌水洗涤两次；每次经过再混悬和离心，沉淀细胞。将所产生的沉淀物混悬于约30-40ul水中，保持于冰上。将之前分离的1.7kb断裂片段加至经诱导的和未经诱导的管中，转移到在冰上的1mm Biorad电穿孔杯(electrocuvette)中。对样品进行电穿孔(BioradMicropulser，1.8kV，所得的时间常数～4ms)，加入1ml 2TY(无抗生素)，混合以除去杯中的细胞。将细胞在37℃于振荡(1100rpm，Eppendorf精巧型热混合器)下温育～3小时，随后平铺在含有安普霉素(50ug/ml)和卡那霉素(25ug/ml)的2TY平板上，在37℃温育过夜。将来自经诱导的样品平板的克隆挑染到含有50μg/ml卡那霉素的2TY平板上，以纯化且确认卡那霉素抗性卡带(cassette)的引入。在各个细菌菌落上使用PCR来确认卡带的引入。由这些培养物制备质粒，将其消化，以确认所期望的质粒pSGK270。然后用NsiI消化质粒以除去标记物片段，将剩余部分重新连接以生产sfaA框内缺失的构建体pSGK271。
1.2链霉菌属的种A92-308110(DSM9954)的偶联和sfaA缺失的引入
使用标准技术将质粒pSGK271转化入大肠杆菌ET12567pUZ8002中，在含有安普霉素(50ug/ml)、卡那霉素(25ug/ml)和氯霉素(10μg/ml)的2TY平板上选择。将所得菌株接种于3ml含有安普霉素(50ug/ml)、卡那霉素(25ug/ml)和氯霉素(10ug/ml)的液体2TY中，在37℃、250rpm温育过夜。在50ml Falcon管中使用0.8ml该培养物接种10ml含有安普霉素(50ug/ml)、卡那霉素(25ug/ml)和氯霉素(10ug/ml)的液体2TY，在37℃、250rpm温育直到OD600nm到达～0.5。将所得培养物在4℃以3500rpm离心10分钟，用10ml 2TY培养基洗涤两次，每次洗涤后离心沉淀细胞。将所得沉淀物再混悬于0.5ml 2TY中，在使用前保持在冰上。该过程的时间安排与下述链霉菌属孢子的完全制备保持一致。
通过再混悬于～3ml 20％甘油中，从1-2周龄的汇合平板上收集链霉菌属的种A92-308110(DSM9954)(Biot-4370)的孢子。离心(5000rpm,10分钟室温)孢子，用50mM TES缓冲液洗涤两次，之后再悬浮于1ml 50mM TES缓冲液中，在2个eppendorf管之间平分。将这些管在50℃水浴中热休克10分钟，然后加入0.5ml 2TY，在Eppendorf精巧型热混合器中于37℃温育4-5小时。
将所制备的大肠杆菌ET12567 pUZ8002 pSGK271和Biot-4370按比例1:1(各菌株250uL)和1:3(100uL大肠杆菌)混合，随即在R6平板上展开，转移到37℃培养箱中。温育约2小时后，将这些平板用2ml含有萘啶酮酸的无菌水覆盖，得到25ug/L的最终平板内浓度。将培养板放回到37℃培养箱中过夜，随后用2ml含有安普霉素的无菌水覆盖，得到20-25ug/L的最终平板内浓度。接合后体菌落在约4-7天后出现，将其置于含有安普霉素(25ug/L)和萘啶酮酸(25ug/L)的ISP4培养基上，在37℃温育。一旦观察到足够的菌丝生长，将菌株在37℃再转移到含有安普霉素(25ug/L)的ISP4培养基中，使孢子形成。随后通过转移到ISP4(无抗生素)以及在37℃温育3-4天，将菌株传代培养3次(促进去除温度敏感质粒)。最后将菌株转至ISP4，在28℃培养进行完全孢子生长(5-7天)。收集孢子，在28℃连续稀释至ISP4平板上，选择单个菌落。形成孢子的单个菌落一式二份转移至含或不含安普霉素(25μg/L)的ISP4平板，以确定质粒损失，使其生长～7天，然后测试sanglifehrin的生成。
1.3在falcon管中筛选菌株用于生产Sanglifehrin
使用孢子形成良好的菌株的单个～7mm琼脂块接种7mL无菌SM25-3培养基，在27℃、200rpm下在2”振幅的振荡器中温育。48小时生长后，将0.7mL该培养物转移到含有7mL含5％HP20树脂的SGP2培养基的无菌falcon管中。使培养物在24℃、300rpm下在1英寸振幅振荡培养箱中生长5天，然后收集。移除0.8ml细胞培养物，将其量分到2ml eppendorf管中，分装前保证树脂在整个培养物中充分分散。加入0.8mL乙腈和15ul甲酸，将所述管混合约30分钟。通过离心使混合物变澄清，将170ul提取液移入HPLC小瓶中，通过HPLC分析。
1.4回复至野生型或sfaA表型的菌株分析
通过HPLC分析菌株提取物。生产Sanglifehrin A和B的菌株没有进一步分析，因为其已回复为野生型。缺少sanglifehrin A和B生成的菌株显示低水平(～1-2mg/L)的峰保留时间6.5分钟(显示sanglifehrin样生色团)。通过LCMS分析表明，该峰具有m/z 1073，比期望的sanglifehrin m/z低16个单位。假定，该峰是由于在间羟基酪氨酸不存在下掺入苯基丙氨酸所致。
随后使显示sanglifeherin生产缺失的八个菌株再生长，评价潜在的sfaA突变是否可能用化学方法补充以使突变合成的方法生成新的sanglifehrin。将菌株在SM25-3种子培养基中生长48小时，然后转移至含有5％树脂的SGP2生产培养基。另外生长24小时后，将菌株一式三份地用2mM DL间羟基酪氨酸(添加100ul 0.16M在1M HCL中的溶液)或2mM L-苯基丙氨酸饲喂，未饲喂的菌株用作对照。也对菌株饲喂2-哌啶酸(2mM)的甲醇溶液以增强产物产率。另外4天生长后收集菌株，提取，通过HPLC分析。显示间羟基酪氨酸完全补充sfaA突变，添加L-苯基丙氨酸增加了-16amu化合物的水平。选择菌株Biot-4585作为sfaA缺失突变体用于进一步研究。
实施例2–用于构建sfaA缺失构建体的其它方法
可使用其它方法产生sfaA缺失突变体。实例包括sfaA插入失活突变体(如来自WO2010/034243的实施例12(其内容通过引用整体并入本文))。该菌株如WO2010/034243中所述产生，给予该菌株名称BIOT-4452。
在产生sfaA缺失的替代程序中，使用作为模板的粘粒TL3006(SEQ ID NO.3)和KODDNA聚合酶，使用两个寡核苷酸15209F 5’-CAGAGAATTCGCGGTACGGGGCGGACGACAAGGTGTC-3’(SEQ ID NO.4)和17219R5’-GCGCATGCATGTGCCGGTGCCGGTCCGCGAGCCGCTTGG-3’(SEQ IDNO.5)来扩增同源物上游区域。扩增产物用T4多核苷酸激酶(NEB)处理，克隆入pUC18中，通过用虾碱性磷酸酶(Roche)处理已使pUC18脱磷酸化。通过限制消化来检查所产生的构建体，完全测序，以确保产生所需序列并且在聚合酶扩增期间未引入错误。用EcoRI和NsiI消化该构建体，通过凝胶电泳分析产物。从凝胶切除含有所需序列的条带(即上游同源性～2kb)，使用标准程序(QiaEX树脂)纯化。使用作为模板的粘粒TL3006(SEQ ID NO.3)和KODDNA聚合酶，使用第二组寡核苷酸(SEQ ID NO.6)17766F5’-CCTCATGCATCTGGAGGACGTCGCAGGTGAATTCTGGGCG-3’和19763R5’-GGGCAAGCTTCTCCTGGCTGAGCTTGAACATCG-3’(SEQ ID NO.7)来扩增同源物下游区域。扩增产物用T4多核苷酸激酶(NEB)处理，克隆入pUC18中，通过用虾碱性磷酸酶(Roche)处理已使pUC18脱磷酸化。通过限制消化来检查所产生的构建体，完全测序，以确保产生所需序列并且在聚合酶扩增期间未引入错误。用HindIII和NsiI消化该构建体，通过凝胶电泳分析产物。从凝胶切除含有所需序列的条带(即下游同源物～2kb)，使用标准程序(QiaEX树脂)纯化。用EcoRI和HindIII消化载体pKC1139，将大载体片段通过凝胶电泳分离，通过标准方法(QiaEX树脂)纯化。然后将分离的上游和下游同源性片段以三方连接方式克隆入pKC1139的该片段，从而产生所需的sfaA缺失构建体。
在用于产生sfaA缺失构建体的进一步替代程序中，使用商业基因合成(即Genscript或其它供应商)产生含有所需序列(SEQ ID NO.8)的构建体。使用BamHI和XbaI消化该商购构建体，从而切除所关注的序列，通过凝胶电泳分析产物。从凝胶切除含有所需序列(～4kb)的条带，使用标准程序纯化。用BamHI和XbaI消化载体pKC1139，大片段通过凝胶电泳分离，通过标准方法来纯化。然后将两个分离片段连接在一起，从而产生所需的sfaA缺失构建体。
使用实施例部分1.2中的方法，通过接合将这些替代sfaA缺失构建体引入至链霉菌属的种A92-308110(DSM9954)中。
实施例3-sfaA缺失突变体的阵列饲喂
在MAM、ISP4、ISP3或ISP2培养基上生长后制备sfaA破坏的突变体(BIOT-4452或BIOT-4585)的孢子贮备液，保存于20％w/v甘油/蒸馏水中，存于-80℃。通过在带有泡沫塞的50mL离心管中将孢子贮备液(1％v/v)接种到7mL种子培养基(SM25培养基)中来制备营养培养物(种子培养物)。将培养管在27℃、250rpm(5cm振幅)下温育48h。在带有泡沫塞的50mL离心管中将10％种子培养物(v/v)转移到7mL生产培养基SGP-2中。在24℃和300rpm(2.5cm振幅)下进行培养。为了生产sanglifehrin突变合成类似物，接种后24小时将0.05mL 0.32M饲喂化合物(突变合成元)溶液(于1N HCl中)加至各管中，得到最终浓度为2mM。此外，在24小时时将0.05ml 0.32M六氢哒嗪-3-羧酸溶液(于甲醇中)加至各管中，得到最终浓度为2mM。饲喂后将培养继续另外四天。
通过将0.8ml全发酵液转移到2ml具塞eppendorf管中来提取样品。加入0.8ml乙腈，以及0.015ml甲酸。然后将混合物在vibrax上振摇30分钟。然后将管以13000rpm离心10分钟，移除0.15ml上清液用于分析。如通用方法所述分析提取液。
表1示出以这种方式饲喂的突变合成元，以及观察到的sanglifehrin突变合成产物的LCMS H+和Na+加成物、预期的分子量和保留时间。示出涉及sanglifehrin A类似物的主峰。在所有情况中，也观察到sanglifehrin B类似物的LCMS峰(质量–18)。
表1
Figure BDA0001227489520000531
Figure BDA0001227489520000541
实施例4–63-氟sanglifehrin A,化合物14的分离
利用2-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯和DL-六氢哒嗪-3-羧酸作为前体，如通用方法中所述进行发酵，在26小时时加入两者。
收集培养物后，将发酵液混合，用甲酸调节至约pH 3，离心(3300g)25min，从净化的发酵液分离细胞和树脂。在测试确定存在少于5％的目标化合物后，弃去净化的发酵液。使用磁力搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过离心或通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。在减压下将合并的乙腈提取液浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH 6。将其用乙酸乙酯萃取两次，在减压下将合并的有机物蒸发至干，得到最终粗品(1.3g)。
将粗提取液(1.3g)溶于乙酸乙酯(2mL)中，加载到用乙酸乙酯(500mL)调节的硅胶柱(10x2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后用逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集约250mL级分，目标化合物通过分析型LC鉴定，合并，蒸发至干。将该材料(278mg)溶于甲醇(1.8mL)中，通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cm x250mm)，溶剂以21mL/min泵送。溶剂A为水且溶剂B为乙腈。将柱等度洗脱，进样后以50％B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100％B。纯级分通过HPLC-UV鉴定，合并。在减压下将这些级分蒸发至干，获得目标化合物，为灰白色无定形固体(20mg)。
实施例5-62,63-氟sanglifehrin A,化合物15的分离
利用(S)-2-氨基-3-(3,4-二氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯和DL-六氢哒嗪-3-羧酸作为前体，如通用方法中所述进行发酵，在26小时时加入两者。
收集培养物后，将发酵液混合，用甲酸调节至约pH 3，离心(3300g)25min，从净化的发酵液分离细胞和树脂。在测试确定存在少于5％的目标化合物后，弃去净化的发酵液。使用磁力搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过离心或通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。在减压下将合并的乙腈提取液浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH 6。将其用乙酸乙酯萃取两次，在减压下将合并的有机物蒸发至干，得到最终粗品(1.6g)。
将粗提取物(1.6g)溶于2ml乙酸乙酯中，加载到用500mL乙酸乙酯调节的硅胶柱(10x2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集约250mL级分，目标化合物通过分析型LC鉴定，合并，蒸发至干。将该材料(188mg)溶于1.8ml甲醇中，通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cmx250mm)，溶剂以21mL/min泵送。溶剂A为水且溶剂B为乙腈。将柱等度洗脱，进样后以50％B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100％B。在减压下将这些级分蒸发至干，获得目标化合物，为灰白色无定形固体(15mg)。
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实施例6-62-氟sanglifehrin A,化合物16的分离
使用(S)-2-氨基-3-(4-氟-3-羟基苯基)丙酸甲酯和DL-六氢哒嗪-3-羧酸前体。根据通用方法进行，不同的是在27小时时加入前体。
收集培养物后，将发酵液混合，用甲酸调节至约pH 3，离心(3300g)25min，从净化的发酵液分离细胞和树脂。在测试确定存在少于5％的目标化合物后，弃去净化的发酵液。使用磁力搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过离心或通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。
在减压下将合并的乙腈提取液浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH 6。将其用乙酸乙酯萃取两次，在减压下将合并的有机物蒸发至干，得到最终粗品(4.2g)。
将粗提取物(4.2g)溶于4ml乙酸乙酯中，加载到用500mL乙酸乙酯调节的硅胶柱(15x2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集约250mL级分，目标化合物通过分析型LC鉴定，合并，蒸发至干。将该材料(390mg)溶于2.4ml甲醇中，通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cmx250mm)，溶剂以21mL/min泵送。溶剂A为水且溶剂B为乙腈。将柱等度洗脱，进样后以50％B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100％B。纯级分通过HPLC-UV鉴定，合并。在减压下将这些级分蒸发至干，获得目标化合物，为灰白色无定形固体(38mg)。
实施例7-62-甲基sanglifehrin A,化合物17的分离
将冷藏保存的BIOT-4585孢子贮备液在室温解冻。通过在带有泡沫塞的2L锥形烧瓶中将0.4mL孢子贮备液转移到400mL培养基SM25中来制备营养培养物(种子培养物)。将培养在27℃和250rpm(2.5cm振幅)下进行48小时。在带有泡沫塞的2L离心管中将种子培养物20mL转移到400mL生产培养基SGP2+5％HP20中。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下培养24小时后，将2mL的200mM(S)-2-氨基-3-(3-羟基-4-甲基苯基)丙酸甲酯在1M盐酸中的溶液和2mL400mM DL-六氢哒嗪-3-羧酸的甲醇溶液加至每个生产烧瓶，得到前体的个体对映异构体的1mM最终浓度。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下继续培养另外四天。
将发酵液混合，用甲酸调节至约pH 3，离心(3300g)25min，从净化的发酵液分离细胞和树脂。在测试确定存在少于5％的目标化合物后，弃去净化的发酵液。使用顶置式桨式搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过离心或通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。在减压下将合并的乙腈提取液浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH 6。将其用乙酸乙酯萃取两次，在减压下将合并的有机物蒸发至干，得到最终粗品(7.6g)。
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将粗提取物(7.6g)溶于5ml乙酸乙酯中，加载到用500mL乙酸乙酯调节的硅胶柱(15x2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集约250mL级分，目标化合物通过分析型LC鉴定，合并，蒸发至干。将该材料(319mg)溶于2.4ml甲醇中，通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cmx250mm)，溶剂以21mL/min泵送。溶剂A为水且溶剂B为乙腈。将柱等度洗脱，进样后以50％B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100％B。纯级分通过HPLC-UV鉴定，合并。在减压下将这些级分蒸发至干，获得目标化合物，为灰白色无定形固体(14.9mg)。
实施例8-61-脱羟基sanglifehrin A,化合物18的分离
将冷藏保存的BIOT-4585孢子贮备液在室温解冻。通过在带有泡沫塞的2LErlenmeyer烧瓶中将0.4mL孢子贮备液转移到400mL培养基SM25中来制备营养培养物(种子培养物)。将培养在27℃和250rpm(2.5cm振幅)下进行48小时。在7L Applikon发酵罐中将种子培养物500mL转移到4.5L生产培养基SGP2+5％HP20中，在24℃、400rpm(级联DOT对照)、2.5L/min气流和30％DOT(级联搅拌对照)下培养。在培养24小时后，将7.5mL的667mM(S)-2-氨基-3-苯基丙酸在1M盐酸中的溶液加至发酵罐，得到前体的1mM最终浓度。在24℃、400rpm(级联DOT对照)、2.5L/min气流和30％DOT(级联搅拌对照)下继续培养另外四天。
将发酵液混合，用甲酸调节至约pH 3，离心(3300g)25min，从净化的发酵液分离细胞和树脂。在测试确定存在少于5％的目标化合物后，弃去净化的发酵液。使用顶置式桨式搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取，但是第二提取液通过离心回收。在减压下将合并的乙腈提取液浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH 6。将其用乙酸乙酯萃取两次，在减压下将合并的有机物蒸发至干，得到最终粗品(55g)。
将粗提取物(55g)混悬于80％甲醇的水溶液中，用300ml己烷萃取两次。在甲醇/水部分(蒸发至干)中发现目标化合物。将该干燥的提取物(48g)溶于30ml乙酸乙酯中，加载到用1L乙酸乙酯调节的硅胶柱(20x5cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集约250mL级分，目标化合物通过分析型LC鉴定，合并，蒸发至干。将该材料(813mg)溶于甲醇中，通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cm x250mm)，溶剂以21mL/min泵送。溶剂A为水且溶剂B为乙腈。将柱等度洗脱，进样后以50％B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100％B。纯级分通过HPLC-UV鉴定，合并。在减压下将这些级分蒸发至干，获得目标化合物，为灰白色无定形固体(34mg)。
实施例9-58-脱(3-羟基苯基)-58-(3-羟基(2-吡啶基)-sanglifehrin A,化合物19的分离
采用(2S)-2-氨基-3-(3-羟基(2-吡啶基))丙酸甲酯和DL-六氢哒嗪-3-羧酸前体。根据通用方法进行，不同的是在营养(种子)培养期间培养箱振幅为2.5cm。
将发酵液混合，用甲酸调节至约pH 3，离心(3300g)25min，从净化的发酵液分离细胞和树脂。在测试确定存在少于5％的目标化合物后，弃去净化的发酵液。使用顶置式浆式搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。在减压下将合并的乙腈提取液浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH 6。将其用乙酸乙酯萃取两次，在减压下将合并的有机物蒸发至干，得到最终粗提取物(7g)。
将粗提取物(7g)溶于4ml乙酸乙酯中，加载到用500mL乙酸乙酯调节的硅胶柱(15x2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等至100％丙酮，然后1％甲醇逐步至于丙酮中的5％甲醇)。收集约250mL级分，目标化合物通过分析型LC鉴定，合并，蒸发至干。将该材料(204mg)溶于甲醇中，通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cm x250mm)，溶剂以21mL/min泵送。溶剂A为水且溶剂B为乙腈。将柱等度洗脱，进样后以50％B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100％B。纯级分通过HPLC-UV鉴定，合并。在减压下将这些级分蒸发至干，获得目标化合物，为灰白色无定形固体(4mg)。
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实施例10-61-脱羟基-61-氟sanglifehrin A,化合物20的分离
将冷藏保存的BIOT-4585孢子贮备液在室温解冻。通过在带有泡沫塞的2LErlenmeyer烧瓶中将0.4mL孢子贮备液转移到400mL培养基SM25中来制备营养培养物(种子培养物)。将培养在27℃和250rpm(2.5cm振幅)下进行48小时。在带有泡沫塞的2LErlenmeyer烧瓶中将种子培养物20mL转移到400mL生产培养基SGP2+5％HP20中。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下培养24小时后，将2mL的400mM 2-氨基-3-(3-氟苯基)丙酸在1M盐酸中的溶液和2mL 400mM DL-六氢哒嗪-3-羧酸的甲醇溶液加至每个生产烧瓶，得到前体的个体对映异构体的1mM最终浓度。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下继续培养另外四天。
将发酵液混合，用甲酸调节至约pH 3，离心(3300g)25min，从净化的发酵液分离细胞和树脂。在测试确定存在少于5％的目标化合物后，弃去净化的发酵液。使用顶置式浆式搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。通过对残留的细胞和树脂混合物离心，获得第三提取液。在减压下将合并的乙腈提取液浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH6。将其用乙酸乙酯萃取两次，在减压下将合并的有机物蒸发至干，得到最终粗品(10.5g)。
将粗提取物(10.5g)溶于7ml乙酸乙酯中，加载到用500mL乙酸乙酯调节的硅胶柱(15x2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集约250mL级分，目标化合物通过分析型LC鉴定，合并，蒸发至干。将该材料(342mg)溶于甲醇中，通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cm x250mm)，溶剂以21mL/min泵送。溶剂A为水且溶剂B为乙腈。将柱等度洗脱，进样后以53％B进行30分钟。纯级分通过HPLC-UV鉴定，合并。在减压下将这些级分蒸发至干，获得目标化合物，为灰白色无定形固体(6mg)。
实施例11-61-脱羟基-61-氨基sanglifehrin A,化合物21的分离
将冷藏保存的BIOT-4585孢子贮备液在室温解冻。通过在带有泡沫塞的2LErlenmeyer烧瓶中将0.4mL孢子贮备液转移到400mL培养基SM25中来制备营养培养物(种子培养物)。将培养在27℃和250rpm(2.5cm振幅)下进行48小时。在带有泡沫塞的2LErlenmeyer烧瓶中将种子培养物20mL转移到400mL生产培养基SGP2+5％HP20中。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下培养24小时后，将2mL的200mM(S)-2-氨基-3-(3-氨基苯基)丙酸甲酯在1M盐酸中的溶液加至每个生产烧瓶，得到前体的1mM最终浓度。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下继续培养另外四天。
将发酵液混合，用甲酸调节至约pH 3，离心(3300g)25min，从净化的发酵液分离细胞和树脂。在测试确定存在少于5％的目标化合物后，弃去净化的发酵液。使用顶置式浆式搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。通过对残留的细胞和树脂混合物离心，获得第三提取液。
在减压下将合并的乙腈提取液浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH6。将其用乙酸乙酯萃取两次，在减压下将合并的有机物蒸发至干，得到最终粗品。
将粗提取物溶于乙酸乙酯中，加载到用乙酸乙酯调节的硅胶柱上。将柱用具有递增极性的有机溶剂洗脱。收集约250mL级分，目标化合物通过分析型LC鉴定，合并，蒸发至干。将该材料溶于甲醇中，通过制备型HPLC纯化。纯级分通过HPLC-UV鉴定，合并。在减压下将这些级分蒸发至干，获得目标化合物，为灰白色无定形固体。
实施例12-生物学数据–复制子系统中HCV抗病毒活性的体外评价
使用Huh5.2细胞，如通用方法中所述在复制子测定中分析化合物。包括环孢菌素A,1、sanglifehrin A,5和羟基大环化合物6作为比较。
Figure BDA0001227489520000611
可以看出，14、15、16和17均在Huh5.2复制子测定中非常有效(由低EC50所示)，其对所述细胞系具有良好选择性(由高选择性指数所示)。先前描述的sanglifehrin A,5在HCV抑制方面的效力比14、15和17弱，且环孢菌素A,1的效力较弱，而1和5两者具有较差的选择性指数。
实施例13–微粒体稳定性
如通用方法中所述分析化合物在人类和小鼠肝微粒体中的稳定性。包括Sanglifehrin A,5作为比较。
Figure BDA0001227489520000612
可以看出，与sanglifehrin A(5)相比，本发明化合物14、15、16、17、18和19均具有增加的在人类肝微粒体中的稳定性，并且14、15和17也均在小鼠肝微粒体中更稳定。
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tggccgtggc ggcgggcgtc ggagagccgt tccacgagga gcatgccggc gccctcggac 360
cagccggtgc cgtcggccgc ggcggcgaag gacttgcagc ggccgtccac ggccaggccg 420
cgctggcggg agaagtcgac gaagacgtcg ggggcggaca tgacggtgac accgccggcc 480
agcgccatcg agcactcgcc gctgcgcagc gcctggatcg cccagtgcag ggcgaccagc 540
gacgccgagc acgcggtgtc cacggtgacc gcagggcctt ccaggccgag gacgtaggcg 600
atgcggcccg acagcacgct ggcggagttg ccgatgccga cgtagccctc cgcgctctcg 660
acggtcctgc gcacgagctg ggcatagtcc tggccgttgg tgccgaggta gacgccgacg 720
tccgcgccgc gcagggactt cgggtcgatg ccggcgcgtt cgacggcctc ccaggcggtc 780
tccagggcca gccgctgctg cgggtccatc gccagcgcct cgcgcggcga gatcccgaag 840
aagtccgcgt cgaacccggc gacgtccgcg aggaagccgc cctcccgcac gtacgacgtg 900
cccgcgtgct ccggatccgg gtggaagagg cccgcgaggt cccagccccg gtcgtcgggg 960
aacggggtga gcgcgtcgcg ctcgtcggcg agcagccgcc acaggtcctc gggcgaggtc 1020
acgccgccgg ggtaccggca cgccatgccg acgatcgcga tgggatcgtc gtcggcgggg 1080
cgggcgacgg cgggcaccgg cgccgtctcc tcggcgcgtt cgccgaggag ttcggccagc 1140
aggtggccgg ccagggagcg cgggttgggg tggtcgaaca cgagggtcgc gggcaggcgc 1200
agcccggtgg cggcggacag ccggttgcgg agttcgacgg cggtcagcga gtcgaagccc 1260
agttccttga acgcccggcc gggggtcacg gcggtgtcgt cggtgtggcc gaggaccacg 1320
gcggcgtgcg agcggacgag cgtgagcagg gtccgttcgc gttccgcggc ggtgagtccg 1380
gtgagctttc cggccagggt gtccggtccg gcgcccgcgg tggcggcgcg ccggacgggg 1440
ccacggacca gccggcgcat cagcgcgggt acggcggtga cgccggtggc gaacgaggtg 1500
aggtccagcc aggcggggac gacgacgggg gcggagccgg cggtggcgcg gtcgaacagg 1560
gcgagcgcgt cgggcgtcgg cagcggcacc acgccgtcgc gggccgcgcg ccgcaggtcg 1620
gcgccgccca ggtggccggt catgccgctg gcgtgcgccc acaggcccca cacctgggag 1680
gtggcgggca ggccctgggc gcggcggtgt gccgcgagcg cgtccacgaa ggcgttgccc 1740
gccgcgtagt tgccctgtcc gggcgccccg aagaggccgg aggtggagga gaacagcacg 1800
aagacggccg gccggtgcgg ggcggtgagt tcgtgcaggt tccaggcggc gtcgaccttg 1860
gggcggagca ccttggcgag ccgctcgggg gtctgggagg cgatgacgcc gtcgtccagg 1920
acgccggcgg cgtggacgac tccggtcagg gggtgctcgg cggtgatccg gtcgagcagg 1980
gcggccagtt cggtgcggtc ggcggcgtcg caggcggcga cggtcacctc ggcgccgagg 2040
gcgcgcagtt cgccggcgag ggtcacggcg tcgggggccg cgtcgccgcg ccgtccggcc 2100
aggaccagcc ggcgtacgcc gtgctcggtg accaggtggc gggcgcagag ggcgccgagc 2160
gtgccggtgc cgccggtgac gaggacgacg ccgtcggacg gccacagggc cgcctggctc 2220
gtgggctcgt cggtgcgcgg ggcgcggacc agccggggtg cgaggacccg gccggagcgc 2280
acggcgatct cgggttcgcc ggtggcgagg acagcgggca gctgttgcag tgcgtcgggg 2340
ccgtcgatgt cgaccagcac cagcctgccg gggtgttcgg cgcgggcgga gcggatcagg 2400
ccccacacgg gcgcgtgggc gaggtcggtg acgtcctcgt gctcgaccgg gaccgcgccg 2460
tgggtgagga cggccagacg ggtgccggcc agtcgctcgt cggcgagcca ctcctgaaga 2520
gcggtcagca cgcgccgggc gccggcgtgg gccgcgccgg cggtgtcgtc ggccgactgc 2580
tgccgacacg gcagcacgag ggtgccgggc acggtgtcca gggcggcgac ggcggcgagg 2640
tcggggcagg aggggtatcc gggcagcgga aggccgccga gcacggcgat gccgtcgacg 2700
tcggccgcgg gcagcggcac gggcgtccac tcgacccggt acagctcgtg gtcgcggccg 2760
gggccggccg tggccggcgg gcgcagggtc accgcgtcga cggtgagcac ggcggctccg 2820
ctgtcgtcgg tggcgtgcag ggtgaccgtg tgctcgcccg cggggtgcag gcgtacccgc 2880
agccgggtgg cgcccacggc gtgcagggtg acgccgtgcc aggcgccggg gaccaggccg 2940
gggtgtacgg ccgcgagggc gtcggtgagc agggcggggt gtacgcccca gccgccggcg 3000
gtctcgtcgg tcagctcaac ggtcacgtcg gtcagctcga cggtcacgtc ggtgtccggg 3060
tcccctggcg cggcggccgg ggcggtgccg gtgtgcggga ggaggacgcc ggtcgcgtgc 3120
cgggtccagg gctggtcgtc gtcggcgtcg gcggggcggg agtggacggc gaccgggcgg 3180
gcgccgtcct cgttctccgc gcccagggtg acctggaggc ggcgggcttc gccgacggtg 3240
tcgagcggtg cctcctcggt cagttcgccg agcgtcctgc cgtcggccgc gtgcagggcc 3300
aggtcgagta cggcgccggc cggcagctcg gtgccggccg gcacgcgccc ggtgaacacc 3360
tgtccgccgg atccggcgag cggggtgacg gcgccgagca gcgggtgccc ggcgccggtc 3420
aggcccaggc cggcggcgtc ggaggcgacc gggccgctgg gccagaagcg gcggcgctgg 3480
aaggcgtagg tgggcaggtc gacgtggcgt ccgtcggggc agcccaccgt ccagtcgacg 3540
gacacgccgt ggacggcggc ctcggcgagc gaggtgagga ggcggcgcgg gccgtcctcg 3600
tcgcggcgga gggtgccgac gacgacggcg gtccgctcgg tggcctccgc cgtctcctgc 3660
acggcggccg tcagcaccgg gtgcgggctg atctccacga acacggcgtg gccggagtcg 3720
agcaggccgc gcaccacggg ctcgaaccgt acgggctccc gcaggttgcg gtaccagtag 3780
ccggcgtcga gccgtgtctc gccgaggggg ccgcccagca gggtggagtg gaaggcgatg 3840
ccggcctcac cgggccgcag ttcggcgagc gcggcgcgca actcggcttc gagggactcg 3900
acatgggccg agtgggaggc gtagtcgacc gcgatgcggc gcagtcgtac cccgtcggcc 3960
gaccaggcgg ccatcacctc gtccagcgca tcggggtcgc cgctgaggac caccgacgac 4020
gggccgttga gggcggcgac gcaaacgcgt ccggaccacg gtgcgagccg ccgtgtgacg 4080
gtggcctcgg gcagggcgac ggagaccatg ccgccgcgcc cggccagccg ctcggcgatg 4140
agccgcgacc gcagggcgac gatccgggcg ccgtccgcca gcgacagcac acccgccaca 4200
caagcagccg cgatctcccc ctgcgaatga ccgaccacag ccgacggcac gacaccgtac 4260
gaacgccaca cctccgccaa cgacaccatc accgcccaca acaccggctg aacgacatcc 4320
acccgctcca acgccaccgg atcacccagc acaccacgca acgaccagcc cacgaacggc 4380
tccaacgcca ccgcacactc agccatccgc cccgcgaaca ccggcgacga atccagcaga 4440
tccaccgcca tccccaccca ctgcgccccc tgacccggga acacgaacac cacccggccc 4500
tcacccggca acccggcaac acccgacacc acaccctcca ccggctcccc cgcggccaac 4560
gccgccagag aagcccgcgc accggccaca tcagcggcca ccaccaccgc acgatgcggc 4620
aacaacgccc gcgacgcggc aagggaccag gagaggtcca ccgggtccag gccggggtgg 4680
gtgtcgaggt gggcggcgag ccgggtggcc tgctcggcga gggcggcctg ggagcgggcg 4740
gagagcagcc acggcaccca gcgcggcgcg gcgccgcgcg cgggcgcggc cggttccgcc 4800
ggggcctcct ccaggatgag gtgggcgttg gtgccgctgg cgccgaacga cgacacgccc 4860
gcgcggcgcg gccggtcggt cgggggccag acggcggcgc cggtgacgag ttcgacggag 4920
ccggaggccc agtcgatgtg cggtgagggg gcgtccacgt gcagggtgcg gggcacttcg 4980
ccggcgcgca gcgcgagcac cgtcttgatc acgccggcca cgcccgccgc ggggccggtg 5040
tggccgatgt tggacttcag cgagcccagc cgcagcggct gtgcgcggtc ctggccgtag 5100
gtggccagca gggcgttggc ctcgatgggg tcgccgaggg tggtgccggt gccgtgtgcc 5160
tccacgacgt cgacgtcggc ggcggtgagg ccggcggcgg ccagcgcgga gcggatgacc 5220
cgctgctggg cggagccgtt gggggcggtg agcccggagg aggcgccgtc ctggttgatc 5280
gccgagccgc ggaccacggc cagcacgggg tggccgttgc ggcgggcgtc ggacagccgc 5340
tccagcacga ccacgcccgc gccctcggac cagccgatgc cgtccgcggc ggcggcgaac 5400
gccttgcagc ggccgtcggg ggcgaggccg cgctgccggg agaactccac gaaggcacgc 5460
ggggtcgaca tgaccatcac gccgccggcg agggccagcg agcattcgcc gctgcgcagg 5520
gactggccgg ccaggtgcag ggcgacgagc gaggacgagc aggcggtgtc cacgctgacg 5580
gccgggcctt ccaggccgag ggtgtaggcc acccggccgg agagcacgct ggcgtagttc 5640
ccggtgccga gcagcccctc gtccacgccg gcgaccgcgc cgtgccgtga gtcgtagcgc 5700
tggtcggtga cgcccgcgaa gacgccggtg gcgctgccgc gcaggccgtg cggatcgacg 5760
ccggcgtgct cgaacgcctc ccaggcgact tcgaggaaca gccgctgctg cgggtccatc 5820
gccagcgcct cgcgcgggct gatgccgaag aagtcggcgt cgaagccggc ggcgtcgttc 5880
aggaagccgc cctggcgcag gtaggtgtgt ccggcccggt ccgggtcggg gtcgtagagg 5940
ccgtcgaggt cccagccgcg gtcggcgggg aagtcgccga tgacgtcacg gccttcggcg 6000
aggagctgcc acaggtcgtc gggcgaggcc actccgccgg ggaagcggca ggccatgccg 6060
accacggcca gcggctcgtc ggccggggtg gcgcggacgg cggggcgggc cgggacgggc 6120
gcgccgtcga gccgggtgag cagatggtcg gtgagggcgg ccgggttcgg gtggtcgaag 6180
acgacgctgc tggccagcgt caggccggtc gcctcggtca gcgcggtgcg cagccgcagg 6240
gaggcgaggg agtcgaagcc gagggcggcg aaaccgcggt gcggttcgat cgcggcgggg 6300
tcggcgtggc cgagcacggc ggcggtccgc agccgtacca ggtccatgac gcggtgccgg 6360
cgttcggcgg gggtcagccc ggccagctcg tcgcgccagg gcgtgccctc gtcggcggtc 6420
cgctgcgcgg ggagcgcgac gggggtggcg gccgggggca gcgggcgggc cgctgcgtcc 6480
acgggcggcc agtaccggtc gcgctggaag gcgtacgtcg gcaggtcggc cgggtgggct 6540
ccggtgcccc ggaagaaggc ggtccagtcg atgcgcacgc cgtgcgtgtg cgcctcggcc 6600
aggttggtca gcagggtcgg caggccggcc cggtcgcgct ggagggtgcc gacgaccgcg 6660
gctccggtct ccgtgcgctc gacggtctcc tgggtgccga cggtcagtac ggggtgcgga 6720
ctgacctcga tgaagccccg gtggccctgg gcgagcaggg cggcgacggc gtcggcgtag 6780
cggacgggtt cgcgcaggtt gcggtaccag tagccggcgt ccagcgccgt gccgtccgcc 6840
cactcccccg tcacggtgga gaacagcgga accgtgccct cacccggccg cacgccctcc 6900
agatcagcca gcagagcctc acgcaccggc tccaccagca ccgaatgcga ggcatagtcg 6960
acagcgatac gccgggcccg caccccccga cccccgcaat gagccaggaa ctcctccagc 7020
gccaccccct cacccgcgac gacgaccgac tcaggaccgt tgaccgcagc caccgccaac 7080
cggcccgccc agcccaccaa cagctcctcg acaccggacg gcccggcagc gaccgacacc 7140
atccccccac tgcccgccag cgccgtcaaa gccctgctgc gcagggcgac gacccgggcg 7200
ccgtccgcca gcgacaacac acccgccaca caagcagccg cgatctcccc ctgcgaatga 7260
ccgaccacag ccgacggcac gacaccgtac gaacgccaca cctccgccaa cgacaccatc 7320
accgcccaca acaccggctg aacgacatcc acccgctcca acgccaccgg atcacccagc 7380
acaccacgca acgaccagcc cacgaacggc tccaacgcca ccgcacactc agccatccgc 7440
cccgcgaaca ccggcgacga atccagcaga tccaccgcca tccccaccca ctgcgccccc 7500
tgacccggga acacgaagac ggcgcggccg tcgccgacgg cgcggccgcg caccacgtcg 7560
gccgactcgg cgccttccgc cacggcggtc aggccggcga gcagggtgtc gtggtccgcg 7620
ccgaggacga ccacgcggtg ttcgaaggcc gtacgggtgg tggcgagggc gagggccacg 7680
tcgtgggggg cggcgtcgtg cgcgggccgg tgggcgagga ggcgttcggc ctgggcgcgc 7740
agtccggccg ccgtccggga ggacagcgtc cacgggacga ccggcagggt gcggtccgtg 7800
gcctcgtcgg tgggctcggg ccgggcgggt gcctgctcca ggatggcgtg ggcgttggtg 7860
ccggacacgc cgaacgacga cacgcccgcg cggcgcggct gctccccgcc cggccagtcc 7920
cgctcctcgg tgagcagttc cacggcgccg gcggtccagt cgacgtgcgg tgacgcctcg 7980
tccacgtgga gcgtgcgcgg cagcgtgccg tggcgcatgg cctgcaccat cttgatcaca 8040
ccggccacac cggcggcggc ctgcgtgtgc ccgatgttgg acttcaccga accgagccac 8100
agcggctcgt cccgctcctg gccgtaggtg gcgaggaggg cctgcgcctc gatcgggtcg 8160
cccagccggg tgcccgtacc gtgcgcctcc acggcgtcga cctggctcgc ggccaggcgg 8220
gcgtcggcca gcgcctggcg gatcacgcgc tgctgggcga gtccgttggg ggcggtgagt 8280
ccgctgctcg cgccgtcctg gttgatggcg gtgccgcgga ccacggccag cacggggtgg 8340
ccgttgcggc gggcgtccga gagccgttcc aggacgagca tgcccgcgcc ctcggcgaag 8400
ccgaacccgt cggccgccgc ggcgaacgcc ttgcagcggc cgtcggccgc gagggcccgc 8460
tgccggctgt actcggtgaa cacgccgggc gtggacagca cggtcgcccc gccggtgagc 8520
gccagcgtgc actccccggc gcgcagcgag cggaccgcga ggtgcagggc gaccagggac 8580
gaggagcagg cggtgtccac ggagagggcg gggccctcca ggccgagggt gtaggcgacc 8640
cggccggaga gcacgctggg cgaggtgccg gtgacgacgt acccctccag ctcggtggcc 8700
accgggccgg tgatgtcgga gtagtcctcg ctgctgaagc cgacgaacac gccggtggcg 8760
gtggagcgca ggccggccgg gtcgatgcca gcccgctcca gggcctccca tgaggtctcc 8820
agcaccagcc gctgctgcgg gtccatggcc agcgcctcgc gcgggctgat gccgaagaag 8880
ccggcgtcga agtccgcggc gccgtcgagg aatccgcctt cgcgggcgta ggaggttccg 8940
ggccggtcgg ggtccgggtc gtagaccgag gccatgtccc agccgcggtc ggcggggaac 9000
gccgagaccg cgtcggtccc atcggtcacc agccgccaca ggtcctcggg cgaggtcacg 9060
ccgccggggt agcggcaggc catgcccacg atcgcgatcg gttcgcggtc gcgggcctcg 9120
gcctcgcgca gccggcgccg ggcgacctgg agatcgcccg tgacctgctt gaggtagtcg 9180
agcagtttgg cctcgtcagc catcggtgca cccccgtgcg gttcgttcgg cgcgggtcac 9240
gagacgcccc ggtcgatcag gtcgaagagt tcgtcggcgg tgacgccgtc cagagcggcc 9300
cgctcgggtg tgccgtcggt cgtgccggcg tcccagcggg ccgcgaggtc ccgcaggtgc 9360
gccgccaccc gggcgcggtc ggtgccgtcg gccggcagtg cgccgagcgc gctctccacg 9420
cgggccagtt cggcgatgat ccggtcggcg ctcgcctcgc cggactcgct cggcaggagc 9480
gcgtcgagga ggtggtcggc gagcgcggcc gggttcgggt ggtcgaacac gatggtggtg 9540
ggcagtcgca ggccggtggc ggtgccgagg cggttgcgca gttccacggc ggtcagcgag 9600
tcgaagccca gttccttgaa gccgcggtcg ggtgccaccg cgtcgcgtcc ccggtgtccc 9660
aggacgtcgg cgacctggcc gcggacgacg tcgagcaggg cgggggcgcg ctcgggcgcg 9720
ggcagcccgg tgatccgcgc caccagggcc gccgcaccgg gcaccgggcg ggcggcggcc 9780
gggccggccg gggtggcgac caggccgcgc agcagcggcg gggtgggcgc ggcggaggcg 9840
gtggcgaggt ccaggcgcgc ggtgacggtc acggcgtcgc cggtggcggt ggccgtgtcg 9900
aacagggcca gtccttcggc ggcggccatc ggcacgatgc ggttgcggcc ggcgcgggcg 9960
acgtcggcgg cgtccaggtg ccgggtgagg ccggtggcgt cggcccacag gccccaggcc 10020
gcggcggtgc cgggcaggcc ggcggcgcgg cgccgttcgg cgagcgcgtc gaggaaggcg 10080
ttggcggcgg cgtagttggc ctgcgcgggg gtgccgaggg tggccgccgc ggaggagaac 10140
agcacgaagg cggacaggtc cttgtcctcg gtgagttcgt gcaggtgcca ggcggcgtcg 10200
gccttcgggc gcagtacgcc cggcagccgg ccggcgccga gttcggtcag cacgccgtcg 10260
tcgagggcgc ccgcggtgtg caccaccgcg gtcagcgggg cctcggcggt cagcttggcg 10320
agcagcgcgt cgagggcggc gcggtcggtg acgtcgcagg tctcgaagcg gacggtggcg 10380
cccgccgcgg ccagttcggc gaccaggtcc gcgctgccgg gggcggcggc gccgcgccgg 10440
ctggccagca ccaggtcacg ggcgccgtgt tcggacacca gatgccgggc gagcatgccg 10500
ccgagcacgc cggcgccggt gatcaggacg gtgccgtcgg cgtacggggc gacggtgagc 10560
acgatcttgc cggtgtgccg ggcctgggcc atgaaccgga acgcggtgcg cgcgtcggcg 10620
aggggccagg tccgggtggg cagcccggtc agctcgcccg cctcggcgtg ggcgacgacc 10680
tcggtcagca ggctctggac gcggtcgggg ccggcgtcca gcagcaggtc gaacgggagg 10740
tagtcgacac cgggcaggcc ggcggggtcg cggcggtcgg tcttgccgag ttccacgaac 10800
cgtccgccgg gacggagcag tcgcagcgac gcgtccacga actcacccgt gagggagttc 10860
agcacgacgt ccatctccgg gaaccgctgc gcgaactccg tatcccgcga cgacgccaca 10920
cgcgcctcgt ccagaccggc cgcccgcagc acctcgtgct tgccgggact cgccgtcgca 10980
tacacctcgg cgcccagcag ccgcgccacc cgcaccgcgg ccatgcccac accaccggcc 11040
gccgcgtgca ccagcacccg ctcccccgcc cgcaccccgg ccacatcgcg cagcgcgaac 11100
caggcggtgg cgaacacgga cggcagggcc gcggcgcgga cccaggacca gccggcggga 11160
acgggcacca cgagccgccg gtccaccacg gcgagggtgc cgaagccgcc cggcaccatg 11220
ccgaggactc ggtcgccgac ggcgaggtcg gtgacgtccg gggcgaccgc gaccacggtg 11280
cccgcggcct cggagccgat cgcgtcgacc tcgtccgggt acatgtcgag cgcgcacagc 11340
acgtcgcgga agttcaggcc cgccgcgcgg acggcgatgc ggacctggcc gggtgccagg 11400
ggggcggtgg cgtcgggagc ggcgacggcg tcgacgccgt cgatgctgcc gggccggacc 11460
acgtcgacgc gccaggcgtc ggcgccgacg ggcgggcgca gcgcggtctc agcggcccgg 11520
gtgagccggg cgacgaggcg ttcgccgtcg cggagcgcgg tctgcggctc gtcgccgacg 11580
gccggcacag cgtccaggga ggcgggtgtg ccgtcggtgt cgacgagcag gaaccggtcg 11640
gggtgctcgg tctgcgcgga gcgcaccagg ccccagaccg cggcggcggc cgggtcgggt 11700
tcctcgccgg gccgggcggc gacggcgtgc cgggtgacga tcgcgagccg ggcctgcccg 11760
aaccggtcgt cggcgagcca ctcgtgcagc agttccagca cctgggcggt ggcccggtgg 11820
gcggcggcga ccacatcggc tcctgtgctg acgggagcga ggacgaggtc caccgcgccg 11880
gcgtcgatgt cggcgagggc ggtgctcagg ggcgcggcga ggccttccgg tccgtcgccc 11940
aggacggcgc agcgcgcggc ggcgggtgtc tcggcgtcgg gggtctgcca ggtcacgcgg 12000
aacagcgcgt cgcgcgtgcc ggcggcggcc acggcgcgga gctgcccggc cgacgcgggc 12060
cgcagccgca gcgcggccag ctccacgacg ggccggccct cgcggtcggt cgcggtgagg 12120
ctcagcgtgt cggcgctctc ccgggcggcg cgcacccgca ggacccgggc cgggccgggg 12180
tgcacggtca cgccggtcca ggtgaacggc agcagcagcg gcgcgtcctc gggctcggcg 12240
gcgggcacgg cctgggtgac ggcgtcgagc agcgccgggt gcacgagatg gccggcggtg 12300
tcgacggtgt cggggagttc gacctcggcg tagacctcgg tgtcccggcg ccacagggcg 12360
cgcaggccct ggaaggcggg cccgtagccg tagccgcggg cggcgaaacg gtcgtacacg 12420
ccgtccaccg ggaccggctc agcgcccgcc gggggccacg cgccggtctc gggctccgcc 12480
ggctcggccg gctcggccgg tgccaggacg cccgtggcgt gccgggtcca gccgtcgccg 12540
gagtgggagt ggacggcgac cgtgcggcgg ccggacccgt cggcgccgtg cacggtgacg 12600
cgcagggtca ggccgtcggc ggggacgccg atgggcgcgg ccagggtcag ctcctcgatc 12660
tgggcgcggt cgagccggtg gccggcgtgg gccaccatct ccaggacggc ggtgccgggc 12720
agcagggcgg tgcccagcac ggtgtgctcg gtcagccagg ggtgcgtctc ggggctgatc 12780
cggccggtga ggagcaggcc gtcctcgtcg gggagttcgg cctcggcggc gagcagcgga 12840
tgccctccgg cggtgaggcc gacggcggtc aggtcgccgg cggcggcctg gggggtgagc 12900
cagtagcgct cgcgctggaa ggggtaggcg ggcagttcga ccgggcgggc gccggtggcg 12960
tcgaacaggg ggcgccagtc gaccggcacg ccgtcggcgg ccacctcggc cagtgcggtg 13020
gtcaggcgca gccggtcgct ctcgtcgcgg cgcagggtgg cggcgacccg cagttcggtg 13080
cccgccgcct cggcggtctg ctgcatggcg accgtgagca cggggtgcgg gctgatctcc 13140
acgaagccgt ggtggccggc ggcgagcaga tcgctgatcg cgttctggaa gagcacgggc 13200
tcgcgcaggt tgcggtacca gtagcgggcg cccagttcgc tgccgtcgat ccagtcggcg 13260
gtgacggtgg agtagagggg cacgtcgccg tcccgggggc ggatgccctt gaggtcggcg 13320
agcagccgct gccgtacggc ctccacctgc ggggagtgcg aggcgtagtc ggcggcgacg 13380
cggccggcgc gcagcccctc gtcgtcgcag aggtcgagca gctcctccag ggcatcgcgg 13440
tcgcccgcga cgaccagcga gcgggggctg ttggcagcgg cgatgccgag ccggccgggc 13500
cagcgctcca gcatccgctc gacgttcgcc gcgggggcgg cgacgaaggc catgccgcag 13560
cggccgggca ggtcggcgac ggccttggcg cgcagcgcga cggtcttcgc ggcgtcgtcc 13620
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acgtccacga ccgaccagtc caggtagggg gcgagggcgc gctcgcactc ggccatgcgc 13860
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ttgacacacc gcgcgtcgcg aggccctccc gccatacgag ggcctcgtcc cccggtgcga 39780
gtcgcaggcc ggggaagcgc tgccacaagc gggtcagcgc gatcttcatc tggagaagaa 39840
ccagtggcgc gcccatgcac cggtgggcgc cgtgtccgaa tgtgaggtgt gcaggccggc 39900
gggcgctgct cttcgcaccc gatgtgcaaa atacttcggc gtcatgattg ccgtgcagca 39960
acgagacgat gacggcctct ccttggcgca ccgtcgtccc gcccaggaca aggtcctcga 40020
tggccactcg gggaaaactg ataggtgtgg acggcgtctt gcggagcagc tcctcaacca 40080
gatcctccac ggattgcccg tcgagcgcgt caccggtgag cagttcgagt atggcaaggc 40140
tcaattgatg ggcggtggtc tcgtaaccgg ccatgagaag tgccagtccg aggttgatca 40200
actcgatgcg ggatatctca cccgactgct caacccgcac cagcgcgctc aggagatcct 40260
gcccgggcgc atccctcttt ctttcgatca gtgaggacat gtacttgata agagtcagga 40320
tatggcggcc tcttctgcgg gttccctgag gcgtcatgtc gaacagcgca gtcacggcgg 40380
cgtcgaaaac gggccgctcc gccgccggca cgccgagcag tgagctcaac gcgaccatgg 40440
gaaggggcga agcataaccg ctgaccaggt cggcgcctgg ccccgcaacc tgtagccgat 40500
ccagcagtgc gtcggcggcc tcctcgatca ccgctgcctg tgcggtgact cgggcgctgg 40560
tgaacgctgc tccggcgacc cggcgcagcc gggcgtggtc cgcaccgtcc agactcatga 40620
tcgagttggg tgagaggtcg acggatcccc atttcggagc atcggggtgg gtggccgcag 40680
ctctgctgag acgtgtgtcg gcgagcgcgg cgcgccccac ggcgtagtcg gtgaccagcc 40740
acatgtgatc accagtgggc atccgcaccc gtttgacggc ctcacttgat ggcgctgcca 40800
ggaagggcgg cagggggccg accctgtggt gatcgaaagt gccggacatg gtcgattact 40860
cctgttcggt cggaaacgcc gcggggtgtc tgtctcccct gccgccgacg gccgtgggag 40920
acgacccatc gggtggcggc cgggtcgggc gagcgggctt tttccaccgc ccggaaggcg 40980
gcccgctgtt cggtctgcac gctgttcggg ctgcccggct tcggcggaca gaccggcttt 41040
ggcggacaga ccggctgccg gatgttcgtc acgtagcgcg cacggtgtgt tccctgcctc 41100
tcagcgcatc ccgccgtcgc ggcctgacgc gttggacgcc tgtggtctca gccgagcgtg 41160
ggcaccgaac tgcgtcggcc cgtcgacctg cgctctgcgg gacaggacga ggtcccggag 41220
tcgctgtggc agggcgtcgt caaagcggag gtggtccggc accgtgacgc cggcgttgcg 41280
cagcggcgtc gcgatctcgc ggcaggtggt gctgagccag ttgaggaccg cgggatctcc 41340
cgagcggccc gcgaccggcg tccaggtggc cacttccggc tgccggaggc cggcgtcgag 41400
gaacgtccgg gtgaggcggg ggccgaagtc ggggacggcg ccggccgcca ggaaggggcc 41460
gggccacagc gcgtagtact cgtcccactc cggcagcggc ggacgtgacg gcgacgtgtt 41520
ggtgaagtcc atctcgtgca tgacgacgat cccgtccggt ttcagcaggg acgtcagacg 41580
gcgcagtgcg gatgcgggat cgggcaggta catcaggatg tacctgccga ccaggacgtc 41640
gaacttcatc ggccaggtga agtcggccag gtccgcggct tcgtaccgca ccgagtccgc 41700
gagccccgcc tcctgtgcca ggatccgcgc cttgtggacg gttccggggt cgcgctcgat 41760
tcccacgacg tgtccgccgg gcccgaccag ttgggcggcc agcagagaga cgtatcccag 41820
tccggcaccg atgtcgagga cgctcatccc cggacgtact ccggccgacc gcagggtgcg 41880
ttcggtgaac ggcgagatcg cctcgttctg aagggtcagc ctttggtgct cgctatcgga 41940
gtaaccgagc aggtatgcgt cgtgcgccat gcgaggcctc cagggccggt cgtgcgggga 42000
gttccccacg gcaggtggcc agggggctcc gcggtgtctg gagcactgag tgccctgtag 42060
cggccgtgcg gtgtggtccg gtgttccggg tatgtcacgc accggagcgg gacatgtacg 42120
tgtccgaagg cggcgggcgg cgcagagcct tgccgctgga ggtgcgtgcg atcccgccgc 42180
gccgcacgaa ctcgatcgtg tcgggtgtga tgcccagctc ggccaccaca cgtgcgcgga 42240
tgtgttgcgt cgtggcacga cggctcgcct cgtcgtgccg cgtcgtctcg acgacgagcc 42300
cgaggcggcc tccctcgtcg ctccagatct gctcggccag gacgccgtgg acgaggaggc 42360
cgggtgtgtc ccgcacgacc gcctcgatgt cgctcgccca gtggttcgcg ccgaagacga 42420
tgatcacctc tttcgtgcgg cccacgatgt acagctcgcc gtcgtgccac aggcccaggt 42480
caccggtcgc caaccagccg cccggaagga ggacgcgacg gctctcttcg gggtggcggt 42540
cgtacccggt gctcgtgacg gacgcccccc ggacctcgac ggcgccgacc gtgccgggca 42600
cggccggtgc gccgctcgcg gtggtgagcc ggacctcggt acgccgcacc ggcgttccca 42660
cactgaccag ttcgcgacac ggcccggcgc cggacggcac cggtacgtaa cggccccggt 42720
tcagttcgtc ccggtcggca cgcagcacct tggccgggcg gccgagggga gggaaggcga 42780
ccgccagggt cgcctccgcc agtccgtagg ccggcaggaa gacgttctcg gacagtccgg 42840
cgggcgcgaa acgctcggcg aaggcgtcct gaagccgccg gtcgaccggc tcggcgccgt 42900
tcaccgcgat gcgccagcgg gagagatcga ggccggccgg cggcgccgcg tcgcgcctca 42960
ggacgtagcg gtagccggag tcaggagcca tggtgaaggt cgcccccagc cgccccatgg 43020
cccggatcca gtcacccgga ctgcgcaggt agtcctccgg tgtcagcaga tggatgtcga 43080
cgtcgtgcag cagcggtgtc aagaaggaac cgatcaggcc catgtcgtgg aagaggggca 43140
gccaggtgca gccgacgtcg gtcctggcga gccgtgtgcc atgggcgatg gccgccaccc 43200
cggccgccac gttgccgtgg ctgagcacga cgccccgcgg ttcgctgctc gtgcccgacg 43260
tgtactgaac gacggccggg tccgacgccg cccgcgcgac gtgggccgcg gacggctcgg 43320
ccacctccgg caccaggagt acgtcgaccg ggcgggcgcc gtcggacagt ccaggaccga 43380
gcagcgggcg catggccgga gccgtcagca cggtccgtac ccgagagcgg cgcagggccg 43440
cggaggtgcg ccggagatag gcgtcggacg acccgaaggg cgcgggaccg ggcagcggca 43500
ccgcgaccgc gcccgccgcc agcacgccga agaaggcgcg cgcgaagtcc accgacgtcg 43560
gcaggacgag ggcgacccgc tcgccgggtc gcaccccgcg cgacagcagc cccgcggcca 43620
cccgcccggc ctcggcgaag aggtcgctgt aggacagcgc gtcgccgtcc tggccccggc 43680
gcagcacgtg catgccccgt ccggagcctt gtgcggcgac gcggccgagc gcggcgaaca 43740
gggtcacgac agcggttccg tgccggcctc cgcgatcacc ttggtgatcg cggccgcgaa 43800
ctcccgcacg gtgctcgtct cgaagacgat gcggtcctcc acctcgatgt cgtagtgctg 43860
ctcgatctcc agcacgatct ggagcgcgtg gatcgagtcg aagcgcggca aggagcgcag 43920
atcggtgtcc acgcccacct cctcgacacc gatgcgcagt tgctcggcga cggatcggcg 43980
gacggtctgt tcgatgtcgg tgacactcgc ctgtgacatg gcgtggtgtt gtcctgttct 44040
gtgaggccgg cgcgtcgggg cgcggcggga ggcggacgcc gggactgacg gtcagcgagc 44100
gccgggccgg cgggccaggg cgcgcagctt ggctttgatg tcccgcgggg tctccaacga 44160
gtcgtcgtcc gccaggagcc ggacgatcga catcaccttg gcgtccgcgg cgtccaccga 44220
gtcgtgctgg atggtctcga tacggcggat gccggccgtg gatgtggaat gcgggtagaa 44280
catgcccgcc gggtgcttga cgccgttgct acggtccgcg agccagatgt aggccatgcg 44340
cagcgcggcg gcctgatggg ccggatcgct gtcgcacagt tcccgcatga agacggagaa 44400
cgcacggcag tgccgggcct cgtcgcgggc caggagccgc cagattctgc ggatcaccgg 44460
ctccgacaca tgggcggcga gcgccttgta gagggcggac gcgcgtgact ccgagatcac 44520
gttcatcatg agggtggcgg agcgcacgtc gccctgcgga tacggctctc gtttgtagag 44580
cgcgtgcttc gaacggagtg agaccccgat ccggtccagg tagcgggcct ggaccagtga 44640
gtgccgggat tcctccgcac cccattgcag tgcccaggag gagaagctga cctcgtcctg 44700
ccattcccgc aggaagttgt gagcgccggg tagggtgccg aactcgatga cggccgcctc 44760
ggtgaggaag tccacggtcc gttcgtcgag catgccgtgc tcgatgcggt ccaggtccac 44820
ctcggtccag tcccagcgcg tcgtctcgaa ccagtcgaag atcttgttga aggtcatgtc 44880
gaggtagtag tcggtgtaga ggtcgtccgt catcagcgcg cggtgcgccc gcagggccag 44940
ttcgaccgag gtggtgaacc cttcgggcgc caccgcggcg ggccggacga tgtcctcgac 45000
gtccagtgct tccgcccagc cgggaaccgg gcccgccgta tcgggcccga cgacgtacac 45060
ccgggtccgg ttgaacttcg agtgcgaccg cagcgcccgg acggcgggca gcggctcggc 45120
gtccgccccg atccacaccg ccgcgagctc ggatgacggt tcgaactcgt gcaggtagcg 45180
gtgccagtcg gcgtgtgccg gccggtccac ggtgacgtcg ccgaaggcgg ggacggtgag 45240
cctttcggcg ggggagactg cggtggtggg tgccagcagg gcgatggtgt gcgggggcac 45300
ggagggcgtc ctctctgtcg gtctgcgcag gccgtcggcg agcaccttgc cgcgcgttgt 45360
gtggggctcg gctccgtaac acgtgcgtgc cgcgacgtca gagccgcccg tactccgcgg 45420
cagggccgag gagtacgggc agcgcctcga tgctgttgct gacgaacgag ggcacgggcc 45480
gcacggtcca cgtgtcggac ggggccagcc gcacgtcggg gaaccgggtg aagaatccgg 45540
ccagtgccgt ctccagctgg agacgggcca ggtgtgtccc gatacagaag tgcgggccgt 45600
gcccgaagcc gaggtggccg gcctgccgcc ggcggacgtc gaagaggtcc gcgtccggcc 45660
cgtggtgcgc cgggtcccgg cccgccgagc cgaaggacgc gaggatggct tctccccggt 45720
ggatcgtctg gccggcgatg acgacgtcct cggtcgggta gcgcatcggg aactggttca 45780
ccgcgccgtt ccagcgcatc gtctcctcga ccaccgcact ccacgggacc tccccggcgc 45840
gggcggaggc cagttgctcg gggtgggtga gcagcgcgtg gcaggcgttg acgagtacgt 45900
tgatgacgct ctggtggccg gcgaagaaca tcagcaggat catgccgtgc agttcgctgt 45960
cggtgagccg gtcgtctccg tcctggcgtg ccgtgagcag gacgctgatg aggtcgtccc 46020
gggggacgtc gcgacgttcg gcgacgatct cccggagcag cgcttcgatc cgtccgtcga 46080
tctcctggac ctgttcgggg gagttgttcg tacgggtctg catgccggtg agcacgtgca 46140
gcagacgccg cttgcgctgc gggatcccca gcaggtccga gatgacggtg gtggggatgg 46200
ggtaggcgaa agccttgcgg agatccaccg gccggtcttc cggccgtgtg gcgagctggt 46260
cgaggagccc gtcgacgagg cgttccaccc ccgggcgcat ggcctccacc cgttccgggg 46320
tcagtgcctg gtcgaccagt ccgcgcagcc gccggtgatc cgcgccgtgc gaattgatga 46380
cgctgtcggt cgcgacgaag cccatcaacg gccacccgtc cggcacttcg ccgcgggccg 46440
ctgcctccca gtgcgtgatt cccttggcga ccctgggatc cgtcagcact cggcgcaggt 46500
cctcgtggtg cggaatcgcc cacgcccgca caccgccggg gagttggacc ggaacggctc 46560
tccccgccgc ccgcaggcgg gcgttctccg cgtgct 46596
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 4
cagagaattc gcggtacggg gcggacgaca aggtgtc 37
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 5
gcgcatgcat gtgccggtgc cggtccgcga gccgcttgg 39
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 6
cctcatgcat ctggaggacg tcgcaggtga attctgggcg 40
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 7
gggcaagctt ctcctggctg agcttgaaca tcg 33
<210> 8
<211> 3994
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> DNA片段
<400> 8
cagaggatcc gcggtacggg gcggacgaca aggtgtcgtt gccgcgccgg cactcggact 60
ctcgcagcct cacaacgctg ctggccgcgg cggtgtacct cacgtcgcgg gcggtggacg 120
acgcgctgga tctgctgaag gtcctgatcg cgacgaagct tgcagaccgg ctgcacatcc 180
tggacggcgg tgctggacgc cacattcgaa aagcgcctgc tcaatacccg cccccaacgg 240
agacgaggtt gaacgacaag ctcagggcgt ctgagtactt cggttgagta gttctgccca 300
tgtgaggggc agggccgtcg agacaggctg tgtacacaac gccgcggtgc gcagagcgct 360
cggcgaagag accagtagcg gtcatctatg aggggatact tcatgtccaa gcgccttgtc 420
gtctcgtcgc tcgccgtggc cgcagccgtc gttgccggca ccgtggtgtt cgtctcctcg 480
gccgacgccg ctgtgccggc caagccggag atctcaaagg ccaccgccca ctacaccagt 540
acggccggtg ggagcgcctc gctcaccttc agcgccaccg tggccgacaa ctccggaatc 600
aagagcctgc gggtgctcgc ctggccggcg agttcgggcc ttgcgcccac ggcgggcgag 660
atgcgggatg tcgaggaagc cacgtgcaag gcgacttccg cgacggcctc ggtgtgcacc 720
tacaccgtga agagctcggc caaggaagcc gccgcgttgc ccaagggcgt ctggcacgta 780
tccgtgctgg ccaccgccaa ggaccacgac acgaccttcg cgccccaagg cgccacgttc 840
accgtcaagc actgacggct ccgccccgcc ggaatgatga tcgcggcccg cgcgccgggc 900
ggaccgtatc gcgacctcca ttggacccgt tgaaccgcac gacgcggtga actccgccca 960
ccctgcccca gggcggacgg agttcacctg ggggcgacgc cgcgcatctg acgcgcgctg 1020
ccacgatgcc gcaccactcc gcgcgcgggc ggatgcaggc gaagtgactc ccagctcgac 1080
gcgctcgcca aacacggcat ctcgcgcgac tacatcttcg gcgagaagat cagcacccgg 1140
gcgcggggca gcccgaagtt ccgggaggag gcgctgaggg cggcgcggga ggtcaaggcg 1200
cacgccccac actgccgtgt catcttcacg gtgtacgagc ggaagcggct cggtcgcaac 1260
gccgccgaac tcaccgccct cgccgaccac ctcaccgccc acggcttggt cctggagata 1320
ttcgccgggc cctgtcgaag gactcccgga gccgtggaac ccggcgccca cccgacgcga 1380
cagcccgacg cggcagttgg ggcgctcccg cgcggcctgc ccggacaccg aaacgcccgg 1440
caccacaagc gaaagagcgt ccgtcggcaa gctgacgggt cctcatgaag gatttaggcc 1500
agtgatttgg gacacacccg aacgcgccgg ccggatctga ggaatcgcct agggcccgct 1560
cctatcggga acttgaagcc gccctgccga gccaacgctt gactccggtt ccggcggtgc 1620
ggatgacgat aatttccggt gagtctgccc aaaagggtac atagcgggcg catagaaaac 1680
tcttgcgagt gctgcgggtg gcttgtaggg tcctaatgaa tcggctggac aagggaaggt 1740
tgatgcgggc gtccgaacca aaatagcttc ggacagcaac tgctgccttc tgtcgatgga 1800
agtaggggga agttcgtgga aatcggctcg ggcgcgcccg aattaaccgc gtcgtcggtg 1860
tatcagcagc ggcgtgacca aatcgccgca agcgctgccg cctatgtgcc cggcgagccc 1920
attccagagg tcgagtacac ggacgccgag cacgctctgt ggcgcctggt ttccaagcgg 1980
ctcgcggacc ggcaccggca catgcatctg gaggacgtcg caggtgaatt ctgggcgtcc 2040
tgcgacgata catccattga aaaactaatg gcggttgata tatgacccgg ctcgcagagc 2100
aatcatccac tgcgcagcag agcccggaat cagaagtact ggacgtcacc ggaatcggat 2160
tcggtgccgc gaatctcgcc ctggcggtgg cgctccatga atccgaagcc gccgggaagg 2220
cccttttcct ggagaagcag aaggaattcg gctggcatcg ggggatgctc ctggggggct 2280
cctcgctcca ggtgtccttt ctcaaggaca tcgccacgat gcgcaatccc accagtgatt 2340
tcggattcct gtcctatctc caggagaagg accggctggt cgacttcatc aaccagcaca 2400
ccctgctgcc ctcccggatc gagtaccacg actacctcca gtgggccgcc gaccggctga 2460
accacctggt cgagtacggc gtggaggcca ccggtgtgcg gccggtgacc gaagccggtg 2520
aggtcgtcgc gctcgacgtg ctcgccgggg accgggtggt cgcccggacc agaaacctcg 2580
tcctcgcctc cggcctgcgc ccccggctgc ccgagggcgc ggagaccggc gaacgcgtct 2640
ggcacagctc ccagttgctg caccggctgc ccgcgttcga cgaacgcccg ccccgccggg 2700
ccgtcgtggt cggcgccggc cagagcgcgg ccgaggtcgc cgcgcacctc atggaccgct 2760
acccgcaggc cgaggtgtgc gcggtgttcg cccgctacgg ctacagcgtc gccgactcca 2820
gcccgttcgc caaccgcgtc ttcgacccgg ccgccgtgga cgacttctac ttcgccccgc 2880
ccgaggtcaa gcaggccatc atgcgctacc acggcggcac caactacgcc gtcgtcgacg 2940
aggacgtcct ccagggcctc taccgccgcc agtacgagca gaaggtgtcc ggcgccccgc 3000
ggctgcgggt gatgaacgcc tcccgcctgg tgtccgtcga accgcgccag gaatccgccg 3060
ccgtacgcgt ggagttcctg cccacgggcg aacacaccga cctggacgcc gacctggtcg 3120
tgtacgccac cgggtacgac tccaccgacc cggccgaact gctcggcggc gtctccggcg 3180
ccctccgccg ggacgaggcg ggggagttgc tgatcggccg cgactaccgg ctcggcacca 3240
ccggggattt ccggtgcggc atctacgtcc agggcgccac cgaggcgacc cacggcatcg 3300
cctccaccct gctgtccatg gtggcggtcc gcgcgggcga gatcgcccgg tcgatcaccg 3360
gcggccggtg cgacccggac cgctccaccg gaagcaaggc agcagcgggg aacaggggct 3420
gaagtgtacg aacgtccgct gtaccgggag gattgcgacg gcgtcgtcct ggcgtttctg 3480
cgacacaacc cactggcaat ggtcgtcacc tcgcacgacg acgtcccggt ggccacccac 3540
gcgccggtgc tgttccggca cggacccgac ggcgccgacg ccgaggccgt cgccgcgggc 3600
accgtcccgc tcgccggctc caccctgatc ggccacatga acgtcgagaa cccgcagtgg 3660
cgccggatgc gctccggcga ccgggcgctc atcgtcttcc agggcccgca cggctatgtc 3720
tcgccgacgg tctacggggt cacgcccgcg gcccccacct gggacttcat cgccgtccac 3780
gtgaacggca cagtggagcc caccgccgac cccgccgccg tgctggacat cgtctccgac 3840
accgcccggc ggctggagtc cggcttcggg cgcggctggg accaggagtc ctccctcgac 3900
tacttccgcc agatcgcgcc cggcgtgggc gccttcaccc tgcgggtcga ttccgtgcag 3960
acgatgttca agctcagcca ggagtctaga gccc 3994

Claims (12)

1.用于生产突变合成的sanglifehrin的方法，其包括向链霉菌属物种A92-308110饲喂式(III)化合物或其盐
Figure FDA0003174449730000011
其中X1、X2、X3、X4、X5、R1、R3、R4和R5定义如下：
R1、R3、R4和R5独立地表示H、F、Cl、Br、C2-6链烯基或C1-10烷基，其中所述烷基的一个或多个碳原子任选地被选自O、N和S(O)p的杂原子替换，其中p表示0、1或2且其中所述烷基的一个或多个碳原子任选地被羰基替换且其烷基可任选地被一个或多个卤素原子取代；
X1、X2、X3、X4和X5独立地表示C或N，且在表示N的任何这些基团的情况下所连接的取代基不存在；
条件是当R1、R3、R4和R5均表示H且X1、X2、X3、X4和X5均表示C时，则R2不能表示OH；
且R7表示H或成酯基团；
其中所述链霉菌属物种的sfaA基因或sfaA基因同源物是失活或缺失的；
以及培养所述细菌以生产出根据以下式(I)或式(II)的sanglifehrin化合物或其可药用的盐：
Figure FDA0003174449730000012
Figure FDA0003174449730000021
其中：
R1、R2、R3、R4和R5独立地表示H、F、Cl、Br、C2-6链烯基或C1-10烷基，其中所述烷基的一个或多个碳原子任选地被选自O、N和S(O)p的杂原子替换，其中p表示0、1或2且其中所述烷基可任选地被一个或多个卤素原子取代；
且其中R2选自H、F、Cl、CF3、OH、NH2和C1-6烷基；
X1、X2、X3、X4和X5独立地表示C或N，且在表示N的任何这些基团的情况下所连接的取代基不存在；
条件是当R1、R3、R4和R5均表示H且X1、X2、X3、X4和X5均表示C时，则R2不能表示OH。
2.根据权利要求1的方法，其还包括分离突变合成的sanglifehrin的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的制备式(I)或式(II)的化合物或其可药用的盐的方法，其中X1表示C。
4.根据权利要求1或2所述的制备式(I)或式(II)的化合物或其可药用的盐的方法，其中X2表示C。
5.根据权利要求1或2所述的制备式(I)或式(II)的化合物或其可药用的盐的方法，其中X3表示C。
6.根据权利要求1或2所述的制备式(I)或式(II)的化合物或其可药用的盐的方法，其中X4表示C。
7.根据权利要求1或2所述的制备式(I)或式(II)的化合物或其可药用的盐的方法，其中X5表示C。
8.根据权利要求1或2所述的制备如权利要求3-7任一项所定义的式(I)或式(II)的化合物或其可药用的盐的方法，其中R1、R3、R4和R5独立地选自H、F、Cl、CF3、OH和C1-6烷基。
9.根据权利要求1或2所述的制备如权利要求8所定义的式(I)或式(II)的化合物或其可药用的盐的方法，其中R2表示OH。
10.根据权利要求1或2所述的制备式(I)或式(II)的化合物或其可药用的盐的方法，所述化合物选自：
Figure FDA0003174449730000031
Figure FDA0003174449730000041
Figure FDA0003174449730000051
其也可表示为
Figure FDA0003174449730000052
Figure FDA0003174449730000061
Figure FDA0003174449730000071
其也可表示为：
Figure FDA0003174449730000072
或其可药用的盐。
11.根据权利要求1或2所述的制备式(I)或式(II)的化合物或其可药用的盐的方法，所述化合物选自：
Figure FDA0003174449730000081
或其可药用的盐。
12.根据权利要求10所述的方法制备的化合物，其中所述化合物选自：
Figure FDA0003174449730000082
或其可药用的盐。
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