ES2533438T3 - Compuestos macrocíclicos y métodos para su producción - Google Patents

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Abstract

Compuesto de fórmula (I): **Fórmula** en la que: el resto X1 representa -OR1, -NR1R2 o R3; R1, R2 y R3 representan independientemente alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquenilcicloalquenilo, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, alquenilarilo o alquenilheteroarilo, pudiendo estar cualquiera de estos grupos opcionalmente sustituido con arilo monocíclico o heteroarilo monocíclico; y en la que uno o más átomos de carbono de R1, R2 y R3 que no forman parte de un grupo arilo o heteroarilo están opcionalmente reemplazados por un heteroátomo seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 y en el que uno o más átomos de carbono de R1, R2 y R3 están opcionalmente reemplazados por carbonilo; o R1 y R2 están unidos de manera que NR1R2 representa un anillo heterocíclico saturado o insaturado que contiene el átomo de nitrógeno especificado y en el que uno o más átomos de carbono de dicho anillo están opcionalmente reemplazados por un heteroátomo adicional seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 y en el que uno o más átomos de carbono de dicho anillo están opcionalmente reemplazados por carbonilo y pudiendo estar el anillo heterocíclico opcionalmente condensado con un anillo de arilo o heteroarilo; y en la que uno o más átomos de carbono de un grupo R1, R2 y R3 pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno; o R1 y/o R2 representa hidrógeno; R9 representa H u OH; n representa un enlace sencillo o doble, con la salvedad de que cuando n representa un doble enlace R9 representa H; R4, R5, R6, R7 y R8 representan independientemente H, F, Cl, Br, alquenilo o alquilo en los que uno o más átomos de carbono de dicho grupo alquilo están opcionalmente reemplazados por un heteroátomo seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 y en los que uno o más átomos de carbono de dicho grupo alquilo están opcionalmente reemplazados por carbonilo y pudiendo estar el grupo alquilo opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno; X2, X3, X4, X5 y X6 representan independientemente C o N, y en el caso de que cualquiera de estos grupos represente N, el sustituyente unido está ausente; con la condición de que cuando R4, R6, R7 y R8 representan todos H y X2, X3, X4, X5 y X6 representan todos C, entonces R5 no puede representar OH, -O-alquilo u -O(CO)-alquilo; incluyendo cualquier tautómero del mismo; e incluyendo un aducto de metanol del mismo en el que se forma un cetal mediante la combinación del grupo ceto en C-53 y el grupo hidroxilo en C-15 y metanol. o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Compuestos macrocíclicos y métodos para su producción
Introducción 5
La presente invención se refiere a análogos de sangliferina, que son útiles tanto como inhibidores de ciclofilina, por ejemplo en el tratamiento de una infección viral producida por virus tales como el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y/o como inmunosupresores por ejemplo para su uso en la profilaxis de rechazo de trasplantes, y como agentes antiinflamatorios, por ejemplo para 10 su uso en trastornos inflamatorios. La presente invención también proporciona los compuestos para su uso en medicina, en particular para el tratamiento de una infección por VHC o VIH y para su uso como agente inmunosupresor o antiinflamatorio, en enfermedades en las que es útil la inhibición del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) tal como distrofia muscular o como productos intermedios en la generación de otros compuestos útiles en medicina. 15
Antecedentes de la invención
Hepatitis C
El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus ARN de cadena positiva, y su infección es la principal causa de hepatitis tras una transfusión. El VHC es la infección crónica portada por la sangre más común y es la principal causa de muerte por enfermedad hepática en los Estados Unidos. La Organización Mundial de la Salud estima que hay más de 170 millones de portadores crónicos de infección por VHC, lo que constituye aproximadamente el 3% de la población mundial. Entre los pacientes infectados por VHC no tratados, aproximadamente el 70%-85% desarrollan 25 infección crónica por VHC, y por tanto están en alto riesgo de desarrollar cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular. En los países desarrollados, el 50-76% de todos los casos de cáncer hepático y dos tercios de los trasplantes de hígado se deben a infección crónica por VHC (Manns et al, 2007).
Además de las enfermedades hepáticas, los pacientes infectados de manera crónica también pueden desarrollar 30 otras enfermedades crónicas relacionadas con el VHC, y sirven como fuente de transmisión a otros. La infección por VHC produce complicaciones no hepáticas tales como artralgias (dolor articular), exantema cutáneo y daño a órganos internos, principalmente al riñón. La infección por VHC representa una importante carga para la atención sanitaria global, y actualmente no hay ninguna vacuna disponible para la hepatitis C (Strader et al., 2004; Jacobson et al. 2007; Manns et al., 2007; Pawlotsky, 2005; Zeuzem & Hermann, 2002). 35
Tratamiento del VHC
El tratamiento de referencia (standard of care, SoC) actual son inyecciones subcutáneas de interferón- pegilado (pIFN) y dosificación oral del fármaco antiviral ribavirina durante un periodo de 24-48 semanas. El éxito en el 40 tratamiento se define por una respuesta virológica sostenida (SVR), que se define por la ausencia de ARN de VHC en el suero al final del periodo de tratamiento y 6 meses después. Las tasas de respuesta global a SoC dependen principalmente del genotipo y los niveles de ARN de VHC antes del tratamiento. Es más probable que los pacientes con genotipo 2 y 3 respondan a SoC que los pacientes infectados con el genotipo 1 (Melnikova, 2008; Jacobson et al., 2007). 45
Un número significativo de pacientes con VHC no responden adecuadamente al tratamiento SoC, o no pueden tolerar la terapia debido a efectos secundarios, lo que conduce a problemas frecuentes relacionados con la finalización del ciclo completo. La tasa de SVR clínica global de SoC es sólo de aproximadamente el 50% (Melnikova, 2008). El desarrollo de resistencia es otro factor subyacente para el fracaso del tratamiento (Jacobson et 50 al. 2007). El SoC también está contraindicado en algunos pacientes que no se consideran candidatos para el tratamiento, tales como pacientes con episodios significativos pasados de depresión o enfermedad cardiaca. Los efectos secundarios del SoC, que conducen frecuentemente a interrupción del tratamiento, incluyen enfermedad seudogripal, fiebre, fatiga, enfermedad hematológicas, anemia, leucopenia, trombocitopenia, alopecia y depresión (Manns et al., 2007). 55
Considerando los efectos secundarios asociados con los prolongados tratamientos usando SoC, el desarrollo de resistencia y la tasa global de éxito por debajo del nivel óptimo, se necesitan urgentemente nuevos tratamientos más eficaces y más seguros para el tratamiento de la infección por VHC. Los objetivos de los nuevos tratamientos incluyen potencia mejorada, perfil de toxicidad mejorado, perfil de resistencia mejorado, calidad de vida mejorada y 60 la mejora resultante en el cumplimiento de los pacientes. El VHC tiene un ciclo de vida corto y por tanto es común el desarrollo de resistencia a fármacos durante la terapia farmacológica.
Se está desarrollando una terapia antiviral dirigida específicamente para la hepatitis C (STAT-C) novedosa, también conocida como fármacos antivirales de acción directa (DAA) que selecciona como diana proteínas virales tales como 65 la ARN polimerasa viral NS5B o la proteasa viral NS3 (Jacobson et al, 2007; Parfieniuk et al., 2007). Además,
también se están desarrollando compuestos novedosos que seleccionan como diana proteínas humanas (por ejemplo ciclofilinas) en lugar de dianas virales, lo que podría esperarse que conduciría a una reducción en la incidencia de resistencia durante la terapia farmacológica (Manns et al., 2007; Pockros, 2008; Pawlotsky J-M, 2005).
Inhibidores de ciclofilina 5
Las ciclofilinas (CyP) son una familia de proteínas celulares que desempeñan una actividad peptidil-prolil cis-trans isomerasa que facilita los cambios conformacionales y el plegamiento de la proteína. Las CyP están implicadas en procesos celulares tales como regulación de la transcripción, respuesta inmunitaria, secreción de proteínas y función mitocondrial. El virus VHC recluta CyP para su ciclo de vida durante la infección de seres humanos. Originalmente, 10 se pensó que las CyP estimulan la actividad de unión al ARN de la proteína no estructural del VHC ARN polimerasa NS5B que promueve la replicación del ARN, aunque se han propuesto varias hipótesis alternativas incluyendo una necesidad de la actividad PPIasa de CyP. Se cree que diversas isoformas de CyP, incluyendo A y B, están implicadas en el ciclo de vida del VHC (Yang et al., 2008; Appel et al., 2006; Chatterji et al., 2009; Gaither et al., 2010). La capacidad para generar desactivaciones en células T de ratones (Colgan et al., 2000) y seres humanos 15 (Braaten y Luban, 2001) indica que CyPA es opcional para el crecimiento y la supervivencia celulares. Se han observado resultados similares con la alteración de homólogos de CyPA en bacterias (Herrler et al., 1994), Neurospora (Tropschug et al., 1989) y Saccharomyces cerevisiae (Dolinski et al. 1997). Por tanto, la inhibición de CyP representa un objetivo en el huésped novedoso y atractivo para tratar la infección por VHC, y una posible nueva adición a SoC o STAT-C/fármacos DAA, con el objetivo de aumentar la SVR, prevenir la aparición de resistencia y 20 disminuir los efectos secundarios del tratamiento.
Ciclosporina A, 1 DEBIO-025, 2 25
Se sabe que la ciclosporina A (Inoue et al. 2003) (“CsA”) y sus análogos clínicos no inmunosupresores estructuralmente relacionados de manera estrecha DEBIO-025 (Paeshuyse et al. 2006; Flisiak et al. 2008), NIM811 30 (Mathy et al. 2008) y SCY-635 (Hopkins et al., 2009) se unen a las ciclofilinas, y como inhibidores de ciclofilina han mostrado eficacia in vitro y clínica en el tratamiento de la infección por VHC (Crabbe et al., 2009; Flisiak et al. 2008; Mathy et al. 2008; Inoue et al., 2007; Ishii et al., 2006; Paeshuyse et al., 2006). Aunque estudios de resistencia anteriores en CsA mostraron mutaciones en la ARN polimerasa NS5B de VHC y sugirieron que sólo la ciclofilina B estaría implicada en el proceso de replicación del VHC (Robida et al., 2007), estudios recientes han sugerido un 35 papel esencial para la ciclofilina A en la replicación del VHC (Chatterji et al. 2009; Yang et al., 2008). Considerando
que las mutaciones en la proteína viral NS5A también están asociadas con la resistencia a CsA y que NS5A interacciona tanto con CyPA como con CypB para su actividad peptidil-prolil cis/trans isomerasa (PPIasa) específica, se sugiere adicionalmente un papel para ambas ciclofilinas en el ciclo de vida viral (Hanoulle et al., 2009).
El efecto anti-VHC de los análogos de ciclosporina es independiente de la propiedad inmunosupresora, que es 5 dependiente de calcineurina. Esto indicó que la necesidad esencial para la actividad de VHC es la unión de CyP y que no es necesaria la unión de calcineurina. DEBIO-025, el inhibidor de ciclofilina clínicamente más avanzado para el tratamiento del VHC, ha mostrado potencia in vitro e in vivo contra los cuatro genotipos más prevalentes de VHC (genotipos 1, 2, 3 y 4). Estudios de resistencia mostraron que las mutaciones que conferían resistencia a DEBIO-025 eran diferentes de las notificadas para inhibidores de polimerasa y proteasa, y que no había resistencia cruzada con 10 replicones virales resistentes a STAT-C/DAA. Y lo que es más importante, DEBIO-025 también prevenía el desarrollo de mutaciones de escape que confieren resistencia a inhibidores tanto de proteasa como de polimerasa (Crabbe et al., 2009).
Sin embargo, los inhibidores de ciclofilina basados en CsA en desarrollo clínico presentan varios problemas, que se 15 cree que están relacionados con su clase estructural compartida, incluyendo: determinados acontecimientos adversos que pueden conducir a una retirada de la terapia y han limitado los niveles de dosis clínicos; farmacocinética variable que puede conducir a eficacia variable; y un aumento del riesgo de interacciones fármaco-fármaco que pueden conducir a problemas de dosificación.
Los acontecimientos adversos (AA) que se produjeron con más frecuencia en pacientes que recibieron DEBIO-025 incluyeron ictericia, dolor abdominal, vómitos, fatiga y pirexia. Los AA más importantes clínicamente fueron hiperbilirrubinemia y reducción en el recuento de plaquetas (trombocitopenia). Peg-IFN puede producir trombocitopenia profunda y la combinación con DEBIO-025 podría representar un problema clínico significativo. También se ha descrito tanto un aumento en la bilirrubina como una disminución en las plaquetas en estudios 25 clínicos anteriores con NIM-811 (Ke et al., 2009). Aunque la hiperbilirrubinemia observada durante los estudios clínicos con DEBIO-025 se revirtió tras el cese del tratamiento, fue la causa de abandono del tratamiento en 4 de 16 pacientes, y una reducción en los niveles de dosis para ensayos futuros. Puesto que el efecto anti-viral de los inhibidores de ciclofilina en VHC está relacionado con la dosis, una reducción en la dosis ha conducido a una reducción en el efecto anti-viral, y varios ensayos posteriores con inhibidores de ciclofilina basados en CsA han 30 mostrado ausencia de reducciones o reducciones escasas en la carga viral de VHC cuando se administra como monoterapia (Lawitz et al., 2009; Hopkins et al., 2009; Nelson et al., 2009). Se sabe que DEBIO-025 y ciclosporina A son inhibidores de transportadores biliares tales como bombas de exportación de sales biliares y otros transportadores hepáticos (especialmente OAT1B1/OAT1B3/MRP2/MRP3/cMOAT/ABCC2) (Crabbe et al., 2009). Se ha sugerido que la interacción con transportadores biliares, en particular MRP2, puede ser la causa de la 35 hiperbilirrubinemia observada a altos niveles de dosis de DEBIO-025 (Nelson et al., 2009, Wring et al., 2010). Las interacciones fármaco-fármaco (DDI) relacionadas con la clase de CsA a través de la inhibición de otros transportadores de fármacos tales como glicoproteína P (Pgp/MDR1), BSEP, OAT1B1 y OAT1B3 (Konig et al., 2010) también pueden constituir una preocupación, limitando potencialmente determinadas combinaciones y uso en algunos pacientes que se someten a tratamiento para coinfecciones tales como VIH (Seden et al., 2010). 40
Además, DEBIO-025 y ciclosporina A son sustratos para el metabolismo mediado por el citocromo P450 (especialmente CYP3A4), y se sabe que son sustratos e inhibidores de la glicoproteína P humana (MDR1) (Crabbe et al., 2009). También se ha mostrado que la ciclosporina A es un inhibidor de CYP3A4 in vitro (Niwa et al., 2007). Esto indica que podría haber un aumento del riesgo de interacciones fármaco-fármaco con otros fármacos que son 45 sustratos, inductores o inhibidores de CYP3A4 tales como por ejemplo ketoconazol, cimetidina y rifampicina. Además, también se esperan interacciones con fármacos que se someten a transporte por la glicoproteína P (por ejemplo digoxina), lo que podría producir graves interacciones fármaco-fármaco en pacientes con VHC que reciben tratamientos médicos por otras enfermedades concomitantes (Crabbe et al. 2009). También se sabe que la CsA tiene farmacocinética altamente variable, mostrando las formulaciones iniciales biodisponibilidad oral del 1-89% 50 (Kapurtzak et al., 2004). Sin una cara monitorización de los niveles en sangre de los pacientes, esto puede conducir a una prevalencia aumentada de efectos secundarios debido a niveles en plasma aumentados, o a una respuesta clínica reducida debido a niveles en plasma disminuidos.
Considerando que la inhibición de ciclofilinas representa un nuevo enfoque prometedor para el tratamiento del VHC, 55 existe la necesidad de descubrir y desarrollar inhibidores de CyP más potentes y más seguros para su uso en terapia de combinación contra infección por VHC.
Sangliferinas
La sangliferina A (SfA) y sus congéneres naturales pertenecen a una clase de policétidos/péptidos no ribosómicos mixtos, producidos por Streptomyces sp. A92-308110 (también conocido como DSM 9954) (véase el documento WO 97/02285), que se descubrieron originalmente basándose en su alta afinidad por ciclofilina A (CyPA). SfA es el componente más abundante en caldos de fermentación y presenta una afinidad aproximadamente 20 veces superior para CyPA en comparación con CsA. Esto ha conducido a sugerir que las sangliferinas podrían ser útiles para el 65 tratamiento del VHC (documento WO2006/138507). También se ha mostrado que las sangliferinas presentan una
actividad inmunosupresora inferior que CsA cuando se someten a prueba in vitro (Sanglier et al., 1999; Fehr et al., 1999). SfA se une con alta afinidad al sitio de unión a CsA de CyPA (Kallen et al., 2005).
Sangliferina A, 5 Hidroximacrociclo, 6 5
Sangliferina B, 7
Biosíntesis de sangliferinas
Las sangliferinas se biosintetizan por una policétido sintasa (PKS)/péptido sintetasa no ribosómica (NRPS) mixta (véase el documento WO2010/034243). La estructura principal de macrólido de 22 miembros consiste en una cadena carbonada de policétido y una cadena tripeptídica. La cadena peptídica consiste en un aminoácido natural, 15 valina, y dos aminoácidos no naturales: (S)-meta-tirosina y (S)-ácido piperázico, unidos mediante un enlace amida. Se cree que la hidroxilación de fenilalanina (o bien in situ en la NRPS o bien antes de la biosíntesis) para generar (S)-meta-tirosina se produce a través del producto génico de sfaA.
Acción inmunosupresora de las sangliferinas 20
El mecanismo de acción inmunosupresor de SfA es diferente del de otros fármacos inmunosupresores de unión a inmunofilina conocidos tales como CsA, FK506 y rapamicina. SfA no inhibe la actividad fosfatasa de la calcineurina, la diana de CsA (Zenke et al. 2001), en cambio su actividad inmunosupresora se ha atribuido a la inhibición de la interleucina-6 (Hartel et al., 2005), la interleucina-12 (Steinschulte et al., 2003) y la inhibición de la proliferación de 25 células T dependiente de interleucina-2 (Zhang & Liu, 2001). Sin embargo, hasta ahora se desconocen la diana molecular y el mecanismo a través del cual SfA ejerce su efecto inmunosupresor.
La estructura molecular de SfA es compleja y se cree que su interacción con CyPA está mediada en gran medida por la parte macrocíclica de la molécula. De hecho, un compuesto macrocíclico (hidroximacrociclo) derivado de la 30 escisión oxidativa de SfA ha mostrado fuerte afinidad por CyPA (Sedrani et al., 2003). Los datos de estructura cristalina por rayos X han mostrado que el hidroximacrociclo se une al mismo sitio activo de CyPA que CsA. También se ha mostrado previamente que análogos basados en el resto macrociclo de SfA están desprovistos de propiedades inmunosupresoras (Sedrani et al., 2003), proporcionando la oportunidad para diseñar inhibidores de CyP no inmunosupresores para su uso potencial en terapia contra VHC. 35
En oposición a esto, también existe la oportunidad de desarrollar agentes inmunosupresores con baja toxicidad para su uso en áreas tales como la profilaxis de rechazo de trasplantes, trastornos autoinmunitarios, inflamatorios y respiratorios, incluyendo pero sin limitarse a, enfermedad de Crohn, síndrome de Behcet, uveítis, psoriasis, dermatitis atópica, artritis reumatoide, síndrome nefrítico, anemia aplásica, cirrosis biliar, asma, fibrosis pulmonar, 40 enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y enfermedad celiaca. Se ha mostrado que las sangliferinas
tienen un mecanismo novedoso de actividad inmunosupresora (Zenke et al., 2001), actuando potencialmente a través de quimiocinas de células dendríticas (Immecke et al., 2011), y por tanto existe la oportunidad de desarrollar agentes con un mecanismo de acción diferente a los agentes clínicos actuales, tales como ciclosporina A, rapamicina y FK506. Se ha mostrado que la sangliferina A es 10 veces menos potente que la ciclosporina A, por lo que el agente novedoso ideal tendría potencia y/o ventana terapéutica mejoradas. 5
Otros usos terapéuticos de inhibidores de de ciclofilina
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Los inhibidores de ciclofilina, tales como CsA y DEBIO-025 también han mostrado utilidad potencial en la inhibición de la replicación del VIH. Se cree que los inhibidores de ciclofilina interfieren con la función de CyPA durante la progresión/finalización de la transcripción inversa del VIH (Ptak et al., 2008). Sin embargo, cuando se sometieron a prueba clínicamente, DEBIO-025 sólo redujo los niveles de ARN de VIH-1 ≥0,5 y >1 log10 copias/ml en nueve y dos pacientes respectivamente, mientras que 27 de los pacientes tratados no mostraron reducción en los niveles de ARN 15 de VIH-1 (Steyn et al., 2006). Tras esto, se sometió a ensayo DEBIO-025 en pacientes coinfectados por VHC/VIH y mostró mejor eficacia contra VHC, y se interrumpieron los ensayos clínicos de VIH (véase Watashi et al., 2010).
Tratamiento del VIH
Más de 30 millones de personas están infectadas por VIH-1 en todo el mundo, con 3 millones de casos nuevos cada año. Las opciones de tratamiento han mejorado espectacularmente con la introducción de la terapia antirretroviral altamente activa (HAART) (Schopman et al., 2010). Hacia 2008, se habían autorizado casi 25 fármacos antirretrovirales para el tratamiento del VIH-1, incluyendo nueve inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa (NRTI), cuatro inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (NNRTI), nueve inhibidores de proteasa (PI), un 25 inhibidor de fusión, un inhibidor de CCR5 y un inhibidor de integrasa (Shafer y Schapiro, 2008). Sin embargo, ninguno de estos regímenes actuales conduce a aclaramiento viral completo, pueden conducir a efectos secundarios graves y la resistencia antiviral es todavía una preocupación importante. Por tanto, sigue habiendo la necesidad de nuevas terapias antivirales, especialmente en clases de mecanismos de acción en las que no hay fármacos aprobados, tal como es el caso para inhibidores de ciclofilina. 30
Virus de la hepatitis B
La hepatitis B es un virus ADN de la familia Hepadnaviridae, y es el agente causante de la hepatitis B. A diferencia de los casos con VHC y VIH, ha habido muy pocos informes publicados de la actividad de inhibidores de ciclofilina 35 contra el virus de la hepatitis B. Ptak et al. 2008 han descrito una débil actividad de Debio-025 contra VHB (CI50 de 4,1 M), mientras que Xie et al., 2007 describieron cierta actividad de CsA contra VHB (CI50 >1,3 g/ml). Esto es en contraste con VIH y VHC, donde hay numerosos informes de actividad antiviral nanomolar de inhibidores de ciclofilina.
Tratamiento del VHB
El VHB infecta hasta 400 millones de personas en todo el mundo y es una causa principal de hepatitis viral crónica y carcinoma hepatocelular. En 2008, había seis fármacos autorizados para el tratamiento del VHB; interferón alfa e interferón alfa pegilado, tres análogos de nucleósido (lamivudina, entecavir y telbivudina) y un análogo de nucleótido 45 (adefovir dipivoxil). Sin embargo, debido a las altas tasas de resistencia, a la escasa tolerancia y a los posibles efectos secundarios, se necesitan nuevas opciones terapéuticas (Ferir et al., 2008).
Inhibición del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP)
La apertura de los poros de transición de permeabilidad de alta conductancia en mitocondrias inicia el comienzo de la transición de permeabilidad mitocondrial (MPT). Éste es el acontecimiento causante, que conduce a necrosis y apoptosis en hepatocitos tras estrés oxidativo, toxicidad de Ca2+ e isquemia/reperfusión. Se ha mostrado que la inhibición de la ciclofilina D (también conocida como ciclofilina F) por inhibidores de ciclofilina bloquea la apertura de los poros de transición de permeabilidad y protege de la muerte celular tras este estrés. Los inhibidores de ciclofilina 55 D pueden ser útiles por tanto en indicaciones en las que está implicada la apertura de mPTP, tal como distrofia muscular, en particular distrofia muscular congénita de Ullrich y miopatía de Bethlem (Millay et al., 2008, documento WO2008/084368, Palma et al., 2009), esclerosis múltiple (Forte et al., 2009), diabetes (Fujimoto et al., 2010), esclerosis lateral amiotrófica (Martin 2009), trastorno bipolar (Kubota et al., 2010), enfermedad de Alzheimer (Du y Yan, 2010), enfermedad de Huntington (Perry et al., 2010), recuperación tras infarto de miocardio (Gomez et al., 60 2007) y consumo de alcohol crónico (King et al., 2010).
Otros usos terapéuticos
Los inhibidores de ciclofilina tienen actividad potencial contra, y por tanto en el tratamiento de, infecciones de otros 65 virus, tales como el virus de la varicela-zóster (Ptak et al., 2008), virus influenza A (Liu et al., 2009), coronavirus del
síndrome respiratorio agudo grave y otros coronavirus humanos y felinos (Chen et al., 2005, Ptak et al., 2008), virus del dengue (Kaul et al., 2009), virus de la fiebre amarilla (Qing et al., 2009), virus del Nilo occidental (Qing et al., 2009), virus de la encefalitis equina occidental (Qing et al., 2009), citomegalovirus (Kawasaki et al., 2007) y virus vaccinia (Castro et al., 2003).
También hay informes de utilidad de inhibidores de ciclofilina e inhibición de ciclofilina en otras áreas terapéuticas, tal como en cáncer (Han et al., 2009).
Comentarios generales sobre las sangliferinas
Uno de los problemas en el desarrollo de fármacos de compuestos tales como sangliferinas es el rápido metabolismo y la glucuronidación, que conducen a baja biodisponibilidad oral. Esto puede conducir a una posibilidad aumentada de efecto de los alimentos, liberación incompleta más frecuente de la forma farmacéutica y variabilidad entre pacientes superior.
Por tanto sigue habiendo la necesidad de identificar inhibidores de ciclofilina novedosos, que pueden tener utilidad, particularmente en el tratamiento de infección por VHC, pero también en el tratamiento de otras áreas de enfermedad en las que puede ser útil la inhibición de ciclofilinas, tal como infección por VIH, distrofia muscular o ayuda en la recuperación tras infarto de miocardio o cuando es útil el efecto de inmunosupresión o antiinflamatorio. Preferiblemente, tales inhibidores de ciclofilina tienen propiedades mejoradas con respecto a los inhibidores de 20 ciclofilina disponibles actualmente, incluyendo una o más de las propiedades siguientes: semivida más larga o biodisponibilidad oral aumentada, posiblemente a través de glucuronidación reducida y/o metabolismo por P450 reducido, solubilidad en agua mejorada, potencia mejorada contra VHC, toxicidad (incluyendo hepatotoxicidad) reducida, perfil farmacológico mejorado, tal como alta exposición al órgano diana (por ejemplo, el hígado en el caso de VHC) y/o semivida larga (que permite la dosificación menos frecuente), interacciones fármaco-fármaco reducidas, 25 tal como a través de niveles reducidos de metabolismo por CYP3A4 e inhibición e inhibición reducida (Pgp) (que permite combinaciones de múltiples fármacos más fáciles) y perfil de efectos secundarios mejorado, tal como baja unión a MRP2, que conduce a una posibilidad reducida de hiperbilirrubinemia, efecto inmunosupresor inferior, actividad mejorada contra especies de virus resistentes, en particular especies de virus resistentes a CsA y análogos de CsA (por ejemplo DEBIO-025) y un índice terapéutico (y/o selectividad) superior. La presente invención da a 30 conocer análogos de sangliferina novedosos que pueden tener una o más de las propiedades anteriores. En particular, la presente invención da a conocer análogos de sangliferina mutasintéticos novedosos, que se prevé que tienen metabolismo reducido a través de P450 o glucuronidación, por ejemplo tal como se muestra mediante semivida de microsoma aumentada y/o potencia mejorada reducida contra VHC, por ejemplo tal como se muestra por una CE50 de replicón baja. 35
Además, también existe la necesidad de desarrollar agentes inmunosupresores novedosos, que pueden tener utilidad en la profilaxis de rechazo de trasplantes, o en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios, inflamatorios y respiratorios. Preferiblemente, tales inmunosupresores tendrán propiedades mejoradas con respecto a las sangliferinas naturales conocidas, incluyendo una o más de las propiedades siguientes: semivida más larga o 40 biodisponibilidad oral aumentada, posiblemente a través de glucuronidación reducida y/o metabolismo por P450 reducido, solubilidad en agua mejorada, potencia mejorada en actividad inmunosupresora, tal como podría observarse en ensayos de proliferación de células T, toxicidad (incluyendo hepatotoxicidad) reducida, perfil farmacológico mejorado, tal como alta exposición al órgano diana y/o semivida larga (que permite la dosificación menos frecuente), interacciones fármaco-fármaco reducidas, tal como a través de niveles reducidos de metabolismo 45 por CYP3A4 e inhibición e inhibición reducida (Pgp) (que permite combinaciones de múltiples fármacos más fáciles) y perfil de efectos secundarios mejorado. La presente invención da a conocer análogos de sangliferina novedosos que pueden tener una o más de las propiedades anteriores. En particular, la presente invención da a conocer derivados novedosos, que tienen metabolismo reducido a través de P450 o glucuronidación, por ejemplo tal como se muestra mediante semivida de microsoma aumentada y/o potencia inmunosupresora mejorada, por ejemplo tal 50 como se muestra por una CI50 de proliferación de células T baja.
Por tanto, tal como puede observarse a partir de los ejemplos, los compuestos de la invención tienen las siguientes propiedades terapéuticamente relevantes favorables:
-
potencia antiviral mejorada contra VHC y VIH en comparación con los inhibidores de ciclofilina de la técnica anterior ciclosporina A, DEBIO-025 (alisporivir) y sangliferina A;
-
aclaramiento reducido y exposición oral aumentada en comparación con el compuesto de la técnica anterior sangliferina A; 60
-
inhibición más potente de la actividad PPIasa de CypA en comparación con los inhibidores de ciclofilina de la técnica anterior ciclosporina A, DEBIO-025 (alisporivir) y sangliferina A;
-
perfil de efectos secundarios mejorado e interacciones fármaco-fármaco reducidas tal como se demuestra 65 mediante la inhibición reducida de transportadores de bilirrubina (OATP-1B1, OATP-1B3, MRP2 y MRP3) e
inhibición reducida de transportadores xenobióticos (Pgp y BSEP).
Sumario de la invención
La presente invención proporciona análogos de sangliferina macrocíclicos novedosos, que se han generado 5 mediante la modificación semisintética de sangliferinas mutasintéticas. Estos análogos pueden generarse mediante la dihidroxilación de una sangliferina mutasintética, tal como se describe en la fórmula IIA y la fórmula IIB, seguido por escisión para generar el macrociclo aldehídico, seguido por química adicional, incluyendo reacciones de tipo Horner-Emmons y otras reacciones de acoplamiento que implican un aldehído, para generar moléculas con una variedad de sustituyentes para sustituir al aldehído. Como resultado, la presente invención proporciona análogos de 10 sangliferina macrocíclicos, métodos para la preparación de estos compuestos, y métodos para el uso de estos compuestos en medicina o como productos intermedios en la producción de otros compuestos.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona análogos de sangliferina macrocíclicos y derivados de los mismos según la fórmula (I) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos: 15
Fórmula (I)
en la que:
el resto X1 representa -OR1, -NR1R2 o R3;
R1, R2 y R3 representan independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, 25 alquilcicloalquilo, alquilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquenilcicloalquenilo, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, alquenilarilo o alquenilheteroarilo, pudiendo estar cualquiera de estos grupos opcionalmente sustituido con arilo monocíclico o heteroarilo monocíclico;
y en la que uno o más átomos de carbono de R1, R2 y R3 que no forman parte de un grupo arilo o heteroarilo están 30 opcionalmente reemplazados por un heteroátomo seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 y en el que uno o más átomos de carbono de R1, R2 y R3 están opcionalmente reemplazados por carbonilo;
o R1 y R2 están unidos de manera que NR1R2 representa un anillo heterocíclico saturado o insaturado que contiene el átomo de nitrógeno especificado y en el que uno o más átomos de carbono de dicho anillo están opcionalmente 35 reemplazados por un heteroátomo adicional seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 y en el que uno o más átomos de carbono de dicho anillo están opcionalmente reemplazados por carbonilo y pudiendo estar el anillo heterocíclico opcionalmente condensado con un anillo de arilo o heteroarilo;
y en la que uno o más átomos de carbono de un grupo R1, R2 y R3 pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o 40 más átomos de halógeno;
o R1 y/o R2 representa hidrógeno;
R9 representa H u OH; 45
n representa un enlace sencillo o doble, con la salvedad de que cuando n representa un doble enlace R9 representa
H;
R4, R5, R6, R7 y R8 representan independientemente H, F, Cl, Br, alquenilo o alquilo en los que uno o más átomos de carbono de dicho grupo alquilo están opcionalmente reemplazados por un heteroátomo seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 y en los que uno o más átomos de carbono de dicho grupo alquilo están 5 opcionalmente reemplazados por carbonilo y pudiendo estar el grupo alquilo opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno;
X2, X3, X4, X5 y X6 representan independientemente C o N, y en el caso de que cualquiera de estos grupos represente N, el sustituyente unido está ausente; 10
con la condición de que cuando R4, R6, R7 y R8 representan todos H y X2, X3, X4, X5 y X6 representan todos C, entonces R5 no puede representar OH, -O-alquilo u –O(CO)-alquilo;
incluyendo cualquier tautómero del mismo; e incluyendo un aducto de metanol del mismo en el que se forma un 15 cetal mediante la combinación del grupo ceto en C-53 y el grupo hidroxilo en C-15 y metanol.
La estructura anterior muestra un tautómero representativo y la invención abarca todos los tautómeros de los compuestos de fórmula (I) por ejemplo compuestos ceto en los que se ilustra un compuesto enol y viceversa.
Los tautómeros específicos que se incluyen dentro de la definición de la fórmula (I) son aquellos en los el que (i) el grupo ceto en C-53 forma un hemicetal con el hidroxilo en C-15, o (ii) el hidroxilo en C-15 y C-17 puede combinarse con el ceto en C-53 para formar un cetal. Todas las numeraciones usan el sistema para la estructura de sangliferina A original.
Los compuesto de fórmula (I), o sales farmacéuticamente aceptable de los mismos, pueden estar presentes opcionalmente en forma de solvatos farmacéuticamente aceptables, tal como un hidrato.
Definiciones
Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o a más de uno (es decir al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo “un análogo” significa un análogo o más de un análogo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “análogo(s)” se refiere a compuestos químicos que son 35 estructuralmente similares a otro pero que difieren ligeramente en la composición (como en la sustitución de un átomo por otro o en presencia o ausencia de un grupo funcional particular).
Tal como se usa en el presente documento, el término “sangliferina(s)” se refiere a compuestos químicos que son estructuralmente similares a sangliferina A pero que difieren ligeramente en la composición (como en la sustitución 40 de un átomo por otro o en presencia o ausencia de un grupo funcional particular), en particular los generados por la fermentación de Streptomyces sp. A92-308110. Los ejemplos incluyen los compuestos similares a sangliferina comentados en los documentos WO97/02285 y WO98/07743, tal como sangliferina B.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sangliferina(s) mutasintética(s)” o “análogo(s) de sangliferina 45 mutasintético(s)” se refiere a compuestos químicos que son estructuralmente similares a sangliferina A, B, C o D pero que difieren ligeramente en la composición (como en la sustitución de uno o más átomos por otro o en presencia o ausencia de un grupo funcional particular), en particular, los generados por la fermentación de Streptomyces sp. A92-308110 o un mutante del mismo, cuando el cultivo se alimenta con un análogo de meta-tirosina. 50
Tal como se usa en el presente documento, el término “análogo(s) de meta-tirosina” se refiere a compuestos químicos que son estructuralmente similares a meta-tirosina pero que difieren ligeramente en la composición (como en la sustitución de uno o más átomos por otro o en presencia o ausencia de un grupo funcional particular), en particular, los descritos en la fórmula (III). 55
Tal como se usa en el presente documento, el término “análogo macrocíclico”, “análogo de sangliferina macrocíclico” o “sangliferina macrocíclica”, se refiere a un compuesto mencionado antes como que representa la invención en su aspecto más amplio, por ejemplo un compuesto según la fórmula (I) anterior, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Estos compuestos también se denominan “compuestos de la invención” o “derivados de sangliferina” o 60 “análogos de sangliferina” y estos términos se usan de manera intercambiable en la presente solicitud.
Tal como se usa en el presente documento, el término “VHC” se refiere a virus de la hepatitis C, un virus con envuelta, ARN, monocatenario de la familia viral Flaviviridae.
Tal como se usa en el presente documento, el término “VIH” se refiere a virus de la inmunodeficiencia humana, el
agente causante del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida humana.
Tal como se usa en el presente documento, el término “biodisponibilidad” se refiere al grado en el que o la tasa a la que el fármaco u otra sustancia se absorbe o se hace disponible en el sitio de la actividad biológica tras la administración. Esta propiedad depende de varios factores incluyendo la solubilidad del compuesto, la tasa de 5 absorción en el intestino, el grado de unión a proteínas y el metabolismo, etc. En el presente documento se describen diversas pruebas para la biodisponibilidad que resultarán familiares para un experto en la técnica (véase también Egorin et al. 2002).
El término “solubilidad en agua” tal como se usa en esta solicitud se refiere a la solubilidad en medios acuosos, por 10 ejemplo solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4, o en disolución de glucosa al 5%. Las pruebas para la solubilidad en agua se facilitan a continuación en los ejemplos como “ensayo de solubilidad en agua”.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención tales como los compuestos de fórmula (I) incluyen sales convencionales formadas a partir de sales de adición de bases o ácidos orgánicos o inorgánicos 15 así como de ácido de amonio cuaternario farmacéuticamente aceptables. Ejemplos más específicos de sales de ácidos adecuados incluyen clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, perclórico, fumárico, acético, propiónico, succínico, glicólico, fórmico, láctico, maleico, tartárico, cítrico, palmoico, malónico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, naftaleno-2-sulfónico, bencenosulfónico, hidroxinaftoico, yodhídrico, málico, esteroico, tánico y similares. Las sales de ácido clorhídrico son 20 de particular interés. Otros ácidos tales como el oxálico, aunque no son farmacéuticamente aceptables por sí mismos, pueden ser útiles en la preparación de sales útiles como productos intermedios en la obtención de los compuestos de la invención y sus sales farmacéuticamente aceptables. Ejemplos más específicos de sales básicas adecuadas incluyen sales de sodio, litio, potasio, magnesio, aluminio, calcio, zinc, N,N’-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, N-metilglucamina y procaína. Las referencias a continuación en 25 el presente documento a un compuesto según la invención incluyen tanto compuestos de fórmula (I) como sus sales farmacéuticamente aceptables.
Tal como se usa en el presente documento, el término “alquilo” representa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificado, que contiene normalmente 1-10 átomos de carbono, por ejemplo un grupo alquilo C1-6. “Alquenilo” se 30 refiere a un grupo alquilo que contiene dos o más carbonos (por ejemplo 2-10 carbonos, por ejemplo un grupo alquenilo C2-6) que está insaturado con uno o más dobles enlaces.
Los ejemplos de grupos alquilo incluyen grupos alquilo C1-4 tales como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo y n-butilo. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen grupos alquenilo C2-4 tales como –CH=CH2 y –CH2CH=CH2. 35
Tal como se usa en el presente documento, el término “cicloalquilo” representa un grupo alquilo cíclico, que contiene normalmente 3-10 átomos de carbono, opcionalmente ramificado, por ejemplo ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo. Un ejemplo ramificado es 2-metilciclopentilo. “Cicloalquenilo” se refiere a un grupo alquenilo cíclico que contiene normalmente 5-10 átomos de carbono, por ejemplo ciclopentilo, ciclohexenilo o cicloheptenilo. Los grupos 40 cicloalquilo y cicloalquenilo pueden ser por ejemplo monocíclicos o bicíclicos (incluyendo espirocíclicos) pero de manera adecuada, son monocíclicos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cicloalquilo” representa un grupo alquilo cíclico, que contiene normalmente 3-10 átomos de carbono, opcionalmente ramificado, por ejemplo ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo o 45 cicloheptilo. Un ejemplo ramificado es 2-metilciclopentilo. “Cicloalquenilo” se refiere a un grupo alquenilo cíclico que contiene normalmente 5-10 átomos de carbono, por ejemplo ciclopentilo, ciclohexenilo o cicloheptenilo. Los grupos cicloalquilo y cicloalquenilo pueden ser por ejemplo monocíclicos o bicíclicos (incluyendo espirocíclicos) pero de manera adecuada, son monocíclicos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “heterociclilo” representa un grupo cicloalquilo en el que uno o más átomos de carbono del anillo (por ejemplo, 1, 2 o 3 átomos de carbono del anillo tal como 1 ó 2 por ejemplo, 1) están reemplazados por heteroátomos seleccionados de O, N y S. Los ejemplos incluyen morfolinilo, piperidinilo, pirrolidinilo, piperazinilo y N-metilpiperazinilo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “heterociclenilo” representa un grupo cicloalquenilo en el que uno o más átomos de carbono del anillo (por ejemplo, 1, 2 ó 3 átomos de carbono del anillo tal como 1 ó 2 por ejemplo, 1) están reemplazados por heteroátomos seleccionados de O, N y S.
Los ejemplos de grupos arilo incluyen (excepto cuando esté indicado) grupos monocíclicos es decir anillos de fenilo 60 y bicíclicos (por ejemplo, anillos de 9 y 10 miembros) que son aromáticos o (en el caso de anillos bicíclicos) que contienen al menos un anillo aromático. Por ejemplo, un anillo bicíclico puede ser completamente aromático, por ejemplo naftilo, o puede ser parcialmente aromático (por ejemplo que contiene un anillo aromático), tal como tetralina, indeno o indano. Un arilo preferido es fenilo. Los grupos arilo pueden estar opcionalmente sustituidos por ejemplo, con uno o más (por ejemplo, 1, 2 ó 3) sustituyentes por ejemplo, seleccionados de alquilo (por ejemplo, 65 alquilo C1-4), hidroxilo, CF3, halógeno, alcoxilo (por ejemplo, alcoxilo C1-4), nitro, -SO2Me, ciano y -CONH2.
Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen (excepto cuando esté indicado) grupos monocíclicos (por ejemplo, anillos de 5 y 6 miembros) y anillos bicíclicos (por ejemplo, anillos de 9 y 10 miembros) que son aromáticos o (en el caso de anillos bicíclicos) que contienen al menos un anillo aromático y contienen uno o más heteroátomos (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4), heteroátomos seleccionados de N, O y S. Los ejemplos de anillos de heteroarilo de 5 miembros 5 incluyen pirrol, furano, tiofeno, oxazol, oxadiazol, tiazol y triazol. Los ejemplos de anillos de heteroarilo de 6 miembros incluyen piridina, pirimidina y pirazina. Los ejemplos de anillos bicíclicos incluyen anillos completamente aromáticos tales como quinolina, quinazolina, isoquinolina, indol, cinolina, benzotiazol, bencimidazol, purina y quinoxalina y anillos parcialmente aromáticos tales como cromeno, cromano, tetrahidroquinolina, dihidroquinolina, isoindolina e indolina. Se prefieren los grupos heteroarilo monocíclicos. Los grupos heteroarilo mencionados 10 anteriormente pueden estar opcionalmente sustituidos tal como se describió anteriormente para los grupos arilo.
Cuando los grupos arilo y heteroarilo bicíclicos son parcialmente aromáticos, la conexión con el resto de la molécula puede ser a través de la parte aromática o a través de la parte no aromática.
El término “tratamiento” incluye tratamiento profiláctico así como terapéutico.
El término “fórmula II” se refiere a fórmula IIA y fórmula IIB colectivamente.
Leyendas de las figuras 20
Figura 1: 1H-RMN del compuesto 23.
Figura 2: 1H-RMN del compuesto 24.
Figura 3: 1H-RMN del compuesto 25.
Figura 4: 1H-RMN del compuesto 26.
Figura 5: 1H-RMN del compuesto 27. 30
Figura 6: 1H-RMN del compuesto 28.
Figura 7: 1H-RMN del compuesto 29.
Figura 8: 1H-RMN del compuesto 30.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona análogos de sangliferina macrocíclicos, tal como se expuso anteriormente, 40 métodos para la preparación de estos compuestos y estos compuestos para su uso en medicina.
En una realización, el compuesto es un aducto de metanol del mismo en el que se forma un hemicetal mediante la combinación de los grupos ceto en C-53 e hidroxilo en C-15 y metanol. En otra realización no lo es.
Variables n, X2-X6 y R4-R9
De manera adecuada, n representa un enlace sencillo.
De manera adecuada, R9 representa OH. 50
De manera adecuada, R4, R5, R6, R7 y R8 representan independientemente H, F, Cl, Br, alquenilo C2-6 o alquilo C1-10 en los que uno o más átomos de carbono de dicho grupo alquilo están opcionalmente reemplazados por un heteroátomo seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 y en los que uno o más átomos de carbono de dicho grupo alquilo están opcionalmente reemplazados por carbonilo y pudiendo estar el grupo alquilo 55 opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno.
En determinadas realizaciones, un átomo de carbono del grupo alquilo C1-10 (por ejemplo, grupo alquilo C1-6), que puede representar uno o más de R4, R5, R6, R7 y R8, está reemplazado por un heteroátomo.
Si -CH3 está reemplazado por N, el grupo formado es –NH2. Si -CH2- está reemplazado por N, el grupo formado es -NH-. Si -CHR- está reemplazado por N el grupo formado es -NR-. Por tanto, los átomos de nitrógeno dentro del grupo R4, R5, R6, R7 o R8 pueden ser átomos de nitrógeno primarios, secundarios o terciarios.
Si -CH3 está reemplazado por O, el grupo formado es –OH. 65
Cuando un átomo de carbono del grupo alquilo C1-10 (por ejemplo, grupo alquilo C1-6), que puede representar uno o más de R4, R5, R6, R7 y R8, está reemplazado por un heteroátomo, está reemplazado de manera adecuada, por O, S o N, especialmente N u O, particularmente O.
Cuando uno cualquiera de R4, R5, R6, R7 y R8 contiene un grupo S(O)p, la variable p representa de manera 5 adecuada 0 ó 1. En una realización, p representa 0. En otra realización, p representa 1. En otra realización, p representa 2.
Cuando un grupo alquilo C1-10 (por ejemplo, grupo alquilo C1-6), que puede representar uno o más de R4, R5, R6, R7 y R8, contiene más de un heteroátomo, éstos pueden estar separados normalmente por dos o más átomos de 10 carbono.
De manera adecuada, los átomos de carbono de un grupo alquilo C1-10 (por ejemplo, grupo alquilo C1-6), que puede representar uno o más de R4, R5, R6, R7 y R8, no están reemplazados por ningún heteroátomo.
Cuando un átomo de carbono del grupo alquilo C1-10 (por ejemplo, grupo alquilo C1-6) que puede representar uno o más de R4, R5, R6, R7 y R8, está reemplazado por un carbonilo, el carbonilo se ubica de manera adecuada adyacente a otro átomo de carbono o un átomo de nitrógeno. De manera adecuada, los grupos carbonilo no se ubican adyacentes a átomos de azufre u oxígeno.
Por ejemplo, uno o más de R4, R5, R6, R7 y R8 pueden representar –CO-alquilo C1-3 por ejemplo -CO-Me.
De manera adecuada, los átomos de carbono del grupo alquilo C1-10 (por ejemplo, grupo alquilo C1-6), que puede representar uno o más de R4, R5, R6, R7 y R8, no están reemplazados por un carbonilo.
El grupo alquilo C1-10 (por ejemplo, grupo alquilo C1-6), que puede representar uno o más de R4, R5, R6, R7 y R8, puede estar sustituido con uno o más átomos de halógeno. Por ejemplo, uno o más de R1, R2, R3, R4 y R5 pueden representar –CF3. Alternativamente, uno o más de R4, R5, R6, R7 y R8 pueden representar alquilo C1-10 (por ejemplo, alquilo C1-6) sustituido con uno o más (por ejemplo uno) átomos de Cl o F (por ejemplo -CH2CH2Cl).
De manera adecuada, los grupos alquilo C1-10 (por ejemplo, grupos alquilo C1-6), que pueden representar R4, R5, R6, R7 y R8, no están sustituidos con halógeno.
Cuando uno o más de los grupos R4, R5, R6, R7 y R8 representan un grupo alquilo C1-10 (por ejemplo, grupo alquilo C1-6) de manera adecuada, el/los grupo(s) representa(n) alquilo C1-4 (por ejemplo, alquilo C1-2 tal como metilo). 35
En una realización, uno o más de R4, R5, R6, R7 y R8 representan alquilo C1-6 (tal como alquilo C1-2) o alquenilo C2-3 por ejemplo uno o más de R4, R5, R6, R7 y R8 representan metilo.
De manera adecuada, R4 representa H, F, Cl, CF3, OH o alquilo C1-6 (por ejemplo, metilo). De la manera más 40 adecuada, R4 representa H o F, especialmente H.
De manera adecuada, R5 representa H, F, Cl, CF3, OH, NH2 o alquilo C1-6 (por ejemplo, metilo). De manera más adecuada, R5 representa H, F, OH o NH2, especialmente OH.
De manera adecuada, R6 representa H, F, Cl, CF3, OH o alquilo C1-6 (por ejemplo, metilo). De manera más adecuada, R6 representa H, Me o F.
De manera adecuada, R7 representa H, F, Cl, CF3, OH o alquilo C1-6 (por ejemplo, metilo). De manera más adecuada, R7 representa H o F. 50
De manera adecuada, R8 representa H, F, Cl, CF3, OH o alquilo C1-6 (por ejemplo, metilo). De manera más adecuada, R8 representa H o F, especialmente H.
De manera adecuada, uno o más, de manera más adecuada dos o más (por ejemplo, tres o más) de R4, R5, R6, R7 y 55 R8 no representan H.
De manera adecuada, uno o más, por ejemplo, dos o más de R4, R5, R6, R7 y R8 representan F.
De manera adecuada, R6 y/o R7 representa F. 60
De manera adecuada, al menos dos de X2, X3, X4, X5 y X6 representan C; de manera más adecuada al menos tres, de manera más adecuada al menos cuatro y de la manera más adecuada los cinco representan C.
En una realización, X2 representa N (por tanto R4 está ausente). En otra realización más preferible X2 representa C. 65
De manera adecuada, X3 representa C.
De manera adecuada, X4 representa C.
De manera adecuada, X5 representa C. 5
De manera adecuada, X6 representa C.
En una realización, X2, X3, X4, X5 y X6 representan cada uno C, R4 representa H, R5 representa OH, R6 representa H, R7 representa F y R8 representa H. 10
En una realización, X2, X3, X4, X5 y X6 representan cada uno C, R4 representa H, R5 representa OH, R6 representa Me, R7 representa H y R8 representa H.
En una realización, X2, X3, X4, X5 y X6 representan cada uno C, R4 representa H, R5 representa OH, R6 representa F, 15 R7 representa F y R8 representa H.
Variable X1
En una realización, X1 representa -R3. En una realización, X1 representa -NR1R2. En una realización, X1 representa 20 -OR1.
En determinadas realizaciones, un átomo de carbono de R1 y/o R2 y/o R3 está reemplazado por un heteroátomo.
Si -CH3 está reemplazado por N, el grupo formado es –NH2. Si -CH2- está reemplazado por N, el grupo formado es 25 -NH-. Si –CHR- está reemplazado por N, el grupo formado es –NR-. Por tanto, los átomos de nitrógeno dentro del grupo R1, R2, R3 pueden ser átomos de nitrógeno primarios, secundarios o terciarios.
Si -CH3 está reemplazado por O, el grupo formado es –OH.
Cuando un átomo de carbono de R1 y/o R2 y/o R3 está reemplazado por un heteroátomo, está reemplazado de manera adecuada, por O o N, especialmente O.
Cuando un átomo de carbono de R1 y/o R2 y/o R3 está reemplazado por un grupo S(O)p, la variable p representa de manera adecuada 0 ó 1. En una realización, p representa 0, en otra realización, p representa 1. En otra realización, 35 p representa 2.
Cuando R1 y/o R2 y/o R3 contienen más de un heteroátomo, estos pueden estar separados, por ejemplo, por dos o más átomos de carbono.
De manera adecuada, ningún átomo de carbono de R1, R2 y R3 está reemplazado por heteroátomos.
Cuando un átomo de carbono de R1 y/o R2 y/o R3 está reemplazado por un carbonilo, el carbonilo se ubica de manera adecuada adyacente a otro átomo de carbono o un átomo de nitrógeno. De manera adecuada, los grupos carbonilo no se ubican adyacentes a átomos de azufre u oxígeno. 45
Por ejemplo, R1 y/o R2 y/o R3 pueden representar –CO-alquilo C1-4 por ejemplo -CO-Me.
De manera adecuada, un átomo de carbono de R1 no está reemplazado por un carbonilo.
De manera adecuada, un átomo de carbono de R2 no está reemplazado por un carbonilo.
De manera adecuada, un átomo de carbono de R3 no está reemplazado por un carbonilo.
Cuando uno o más átomos de carbono de un grupo R1 y/o R2 y/o R3 están sustituidos por uno o más átomos de 55 halógeno, a modo de ejemplo los átomos de halógeno son F, Cl y Br, especialmente F y Cl, particularmente F. Un resto R1 y/o R2 y/o R3 halogenado a modo de ejemplo es –CF3.
Por ejemplo, uno o más de R1, R2 y R3 pueden representar alquilo C1-10 (por ejemplo, alquilo C1-6) sustituido con uno o más (por ejemplo uno) átomos de Cl o F (por ejemplo, –CH2CH2Cl). 60
De manera adecuada, un átomo de carbono de R1, R2 y R3 no está sustituido por halógeno.
Cuando uno o más grupos R1, R2 y R3 representan un grupo alquilo C1-10 (por ejemplo, grupo alquilo C1-6) de manera adecuada los grupos representan alquilo C1-4 (por ejemplo, alquilo C1-2 tal como metilo). 65
Cuando R1 y/o R2 y/o R3 representan –alquilarilo, un ejemplo incluye alquil C1-2–arilo por ejemplo bencilo.
Cuando R1 y/o R2 y/o R3 representan –alquenilarilo, un ejemplo incluye alquenil C2-3–arilo por ejemplo –etenilfenilo.
Cuando R1 y/o R2 y/o R3 representan –alquilheteroarilo, un ejemplo incluye alquil C1-2–heteroarilo por ejemplo 5 -metilpiridinilo.
Cuando R1 y/o R2 y/o R3 representan –alquenilheteroarilo, un ejemplo incluye alquenil C2-3–heteroarilo por ejemplo -etenilpiridinilo.
De manera adecuada, R1 no representa hidrógeno.
De manera adecuada, R1 y R2 no representan ambos hidrógeno.
De manera adecuada, un átomo de carbono de R2 no está reemplazado por ningún heteroátomo. 15
Cuando X1 representa NR1R2
Cuando X1 representa NR1R2, R1 puede representar por ejemplo, alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquenilcicloalquenilo, arilo, heteroarilo, alquilarilo, 20 alquilheteroarilo, alquenilarilo o alquenilheteroarilo.
R2 puede representar por ejemplo H, alquilo (por ejemplo, alquilo C1-4), alquenilo (por ejemplo, alquenilo C2-4), u –O-alquilo (por ejemplo,-O-alquilo C1-4), especialmente H o alquilo.
Los grupos R1 a modo de ejemplo incluyen arilo o heteroarilo sustituidos con arilo monocíclico o heteroarilo monocíclico, –alquilo C1-4, –O-alquilo C1-4, –CO-alquilo C1-4 o –alquenilo C2-4 o R1 puede representar alquilo u –O-alquilo. Los grupos a modo de ejemplo mencionados anteriormente pueden tomarse, por ejemplo, junto con R2 que representa H o alquilo.
Los grupos R1 a modo de ejemplo adicionales incluyen metilo, -CF3, etilo, isopropilo, -CH2CH=CH, isobutilo, ciclohexilo. Los grupos a modo de ejemplo mencionados anteriormente pueden tomarse, por ejemplo, junto con R2 que representa H o Me.
Los grupos R1 a modo de ejemplo adicionales incluyen piridinilo o fenilo opcionalmente sustituido, por ejemplo, fenilo 35 sustituido con fenilo. Los grupos a modo de ejemplo mencionados anteriormente pueden tomarse, por ejemplo, junto con R2 que representa H, Me o -O-Me.
Los grupos R1 a modo de ejemplo adicionales incluyen –O-Me, -OCF3, –O-etilo, O-isopropilo, -SMe, O-n-propilo, -O-n-butilo, -O-t-butilo, O-isobutilo, O-CH2C(Me)3 . Los grupos a modo de ejemplo mencionados anteriormente pueden 40 tomarse, por ejemplo, junto con R2 que representa H, Me, etilo, isopropilo o terc-butilo.
Los grupos R1 a modo de ejemplo adicionales incluyen –O-(fenilo opcionalmente sustituido). Los grupos a modo de ejemplo mencionados anteriormente pueden tomarse, por ejemplo, junto con R2 que representa H, o Me.
Alternativamente, R1 y R2 pueden unirse de manera que NR1R2 representa un anillo heterocíclico saturado o insaturado que contiene el átomo de nitrógeno especificado mostrado.
El anillo heterocíclico que puede representar NR1R2 contiene normalmente 4-8 átomos en el anillo, por ejemplo 5-7 átomos en el anillo, particularmente 5 ó 6 átomos en el anillo. 50
El anillo heterocíclico que puede representar NR1R2, por ejemplo, contiene normalmente sólo el átomo de nitrógeno especificado (por ejemplo, representa pirrolidina o piperidina) o uno o dos (por ejemplo, uno) heteroátomos adicionales, especialmente un átomo de nitrógeno u oxígeno.
Por ejemplo, el anillo heterocíclico que puede representar NR1R2 puede ser morfolinilo o 1,2-oxazinano (un anillo saturado de seis miembros que contiene O adyacente a N).
Cuando NR1R2 representa un anillo heterocíclico saturado o insaturado que contiene el átomo de nitrógeno especificado y en el que uno o más átomos de carbono de dicho anillo están opcionalmente reemplazados por un 60 heteroátomo seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 y en el que uno o más átomos de carbono de dicho anillo están opcionalmente reemplazados por carbonilo y estando condensado el anillo heterocíclico con un anillo de arilo o heteroarilo, siendo un ejemplo tetrahidroquinolinilo.
Alternativamente, de manera adecuada, NR1R2 representa un anillo heterocíclico de 5-7 miembros, tal como un 65 anillo de pirrolidina, piperidina, morfolina o piperazina en el que el nitrógeno en 4 de piperazina está opcionalmente
sustituido con alquilo C1-4.
En otra realización, de manera adecuada, NR1R2 representa un anillo heterocíclico de 5-7 miembros, tal como un anillo de pirrolidina, piperidina, morfolina o piperazina en el que el nitrógeno en 4 de piperazina está opcionalmente sustituido con alquilo C1-4, y en el que un átomo de carbono adyacente a un átomo de nitrógeno dentro del anillo está 5 reemplazado con carbonilo. Por tanto, por ejemplo, R1 y R2 junto con el nitrógeno al que están unidos representan piperidinona.
En otra realización, un átomo de oxígeno es adyacente al átomo de nitrógeno al que están unidos R1 y R2. Por ejemplo, R1 puede representar alquilo o alquenilo en los que el metileno adyacente al átomo de nitrógeno al que está 10 unido R1 está reemplazado por O. Por ejemplo, R1 puede representar –O-alquilo C1-4 por ejemplo O-Me. Alternativamente, R1 y R2 están unidos y el átomo de carbono adyacente al átomo de nitrógeno al que está unido R1 está reemplazado por O por ejemplo para formar un anillo de 1,2-oxazinano o una 1,2-isoxazolidina.
En otra realización, R1 y R2 están unidos de manera que NR1R2 representa un anillo heterocíclico saturado o 15 insaturado que contiene el átomo de nitrógeno especificado y en el que uno o más átomos de carbono de dicho anillo están opcionalmente reemplazados por un heteroátomo adicional seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 y en el que uno o más átomos de carbono de dicho anillo están opcionalmente reemplazados por carbonilo y estando el anillo heterocíclico condensado con un anillo de arilo o heteroarilo (por ejemplo, está condensado con un anillo de fenilo o piridinilo). 20
Los restos a modo de ejemplo que NR1R2 pueden formar juntos incluyen morfolinilo, oxazinano (por ejemplo, 1,2-oxazinano) y los dados a conocer en la siguiente tabla:
Los restos -NR1R2 mencionados anteriormente que comprenden grupos arilo o heteroarilo también pueden portar opcionalmente en dichos grupos uno o más (por ejemplo, uno o dos, tal como uno) sustituyentes de anillo por ejemplo grupos seleccionados de alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo), halógeno (por ejemplo, Cl o F), alcoxilo C1-4 (por ejemplo, metoxilo), hidroxilo, CF3, ciano, nitro, SO2Me y CONH2.
Los restos -NR1R2 mencionados anteriormente pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más (por ejemplo, uno o dos) átomos de halógenos (por ejemplo, F o Cl).
Cuando X1 representa OR1
Cuando X1 representa OR1, R1 puede representar por ejemplo alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquenilcicloalquenilo, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, alquenilarilo o alquenilheteroarilo.
En una realización, R1 representa arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido con arilo monocíclico o heteroarilo 15 monocíclico. R1 puede representar, por ejemplo, 4-bifenililo en el que cualquiera de los anillos de fenilo está opcionalmente sustituido.
En una realización, R1 puede representar arilo o heteroarilo sustituido con arilo monocíclico o heteroarilo monocíclico, –alquilo C1-4, –O-alquilo C1-4, –CO-alquilo C1-4 o –alquenilo C2-4. 20
En una realización, R1 representa alquilo C1-6 (tal como alquilo C4-6), alquenilo C2-6, alquil C1-4-cicloalquilo C4-7 o alquil C1-4-cicloalquenilo C5-7.
De manera adecuada R1 se selecciona de alquilo C2-10 (por ejemplo, alquilo C2-6 tal como alquilo C4-6), alquenilo C2-10 25 (por ejemplo, alquenilo C2-6 tal como alquenilo C4-6), heteroarilo y arilo.
Por tanto, en una realización, R1 se selecciona de alquilo C4-6, alquenilo C2-6, heteroarilo y arilo.
En una realización, R1 se selecciona de cicloalquilo C4-7, alquil C1-2-arilo y alquil C1-2-heteroarilo. 30
Los grupos R1 a modo de ejemplo incluyen ciclohexilo, -metilciclopentilo, –CH2CH=CH2, etilo, n-propilo, n-butilo, t-butilo, i-butilo, -CH2C(Me)3, n-pentilo, -CH2CH2C(Me)3, n-hexilo, n-heptilo, -ciclopentilo, -metilciclohexilo, fenilo, -metilfenilo, -metilpiridinilo, tiazol, triazol, imidazol, oxazol, furano, tiofeno y tetrazol, por ejemplo, se seleccionan de -CH2CH=CH2, n-butilo, t-butilo, i-butilo, -CH2C(Me)3, n-pentilo, -CH2CH2C(Me)3, n-hexilo, n-heptilo, -ciclopentilo, 35 -metilciclohexilo, fenilo, -metilfenilo, -metilpiridinilo, tiazol, triazol, imidazol, oxazol, furano, tiofeno y tetrazol.
Los grupos R1 a modo de ejemplo adicionales incluyen aquellos grupos arilo o heteroarilo que acaban de mencionarse en los que el grupo arilo o heteroarilo está sustituido.
Cuando X1 representa R3
Cuando X1 representa R3, R3 puede representar por ejemplo alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquenilcicloalquenilo, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, alquenilarilo o alquenilheteroarilo, pudiendo estar cualquiera estos grupos opcionalmente sustituido 45 con arilo monocíclico o heteroarilo monocíclico; y en el que uno o más átomos de carbono de R3 que no forma parte de un grupo arilo o heteroarilo están opcionalmente reemplazados por un heteroátomo seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 con la salvedad de que el átomo adyacente al grupo carbonilo al que está unido R3 no es O o N y en el que uno o más átomos de carbono de R3 están opcionalmente reemplazados por carbonilo.
De manera adecuada, R3 puede representar por ejemplo alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquenilcicloalquenilo, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, alquenilarilo o alquenilheteroarilo.
De manera adecuada R3 representa alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquil C1-4-cicloalquilo C4-7 o alquil C1-4-cicloalquenilo 55 C5-7.
Los grupos R3 a modo de ejemplo incluyen –metilciclopentilo, –etilciclopentilo, n-propilo, -CH(Me)(etilo), t-butilo, -CH(etilo)2, -CH(etil)(i-propilo), -CH(Me)(i-butilo), CH(Me)(n-propilo), -CH(Me)(n-butilo), -CH(metil)(n-pentilo), -CH(etil)(n-propilo), ciclopentilo, tetrahidrofurano, ciclohexilo, cicloheptilo, hexahidrooxepina, -metilciclohexilo, 60 -etilciclohexilo, -CH(Me)(O-etilo), -CH(Me)(O-isopropilo), -CH(O-Me)(etilo), -CH(Me)(O-etilo), -CH(O-Me)(i-propilo), -CH(Me)(O-Me), -CH(Me)(O-n-propilo), -CH(Me)(O-n-butilo), -CH(etil)(O-etilo), -CH2C(Me)3, -CH2CH2C(Me)3, tiazol, imidazol, triazol, tetrazol, oxazol, furano, piridina y fenilo.
Los grupos R1 a modo de ejemplo adicionales incluyen aquellos grupos arilo o heteroarilo que acaban de 65 mencionarse en los que el grupo arilo o heteroarilo está sustituido.
Realizaciones adecuadas adicionales
En una realización adecuada de la invención, X1 representa NMe(O-Me), R4 representa H, R5 representa OH, R6 representa H, R7 representa F, R8 representa H, X2 representa C, X3 representa C, X4 representa C, X5 representa 5 C, X6 representa C, n representa un enlace sencillo y R9 representa OH tal como se representa mediante la siguiente estructura:
En otra realización adecuada de la invención, X1 representa NMe(O-Me), R4 representa H, R5 representa OH, R6 representa H, R7 representa F, R8 representa H, X2 representa C, X3 representa C, X4 representa C, X5 representa C, X6 representa C, n representa un doble enlace y R9 representa H tal como se representa mediante la siguiente estructura:
En otra realización adecuada de la invención, X1 representa NR1R2 en el que R1 y R2 juntos representan CH2CH2CH2CH2O que están unidos para formar un heterociclo, R4 representa H, R5 representa OH, R6 representa H, R7 representa F, R8 representa H, X2 representa C, X3 representa C, X4 representa C, X5 representa C, X6 20 representa C, n representa un enlace sencillo y R9 representa OH tal como se representa mediante la siguiente estructura:
En otra realización adecuada de la invención, X1 representa NR1R2 en el que R1 y R2 juntos representan CH2CH2CH2CH2O que están unidos para formar un heterociclo, R4 representa H, R5 representa OH, R6 representa Me, R7 representa H, R8 representa H, X2 representa C, X3 representa C, X4 representa C, X5 representa C, X6 representa C, n representa un enlace sencillo y R9 representa OH tal como se representa mediante la siguiente estructura: 5
En otra realización adecuada de la invención, X1 representa NMe(O-Me), R4 representa H, R5 representa OH, R6 representa F, R7 representa F, R8 representa H, X2 representa C, X3 representa C, X4 representa C, X5 representa C, 10 X6 representa C, n representa un enlace sencillo y R9 representa OH tal como se representa mediante la siguiente estructura:
En otra realización adecuada de la invención, X1 representa NR1R2 en el que R1 y R2 juntos representan CH2CH2CH2CH2O que están unidos para formar un heterociclo, R4 representa H, R5 representa OH, R6 representa F, R7 representa F, R8 representa H, X2 representa C, X3 representa C, X4 representa C, X5 representa C, X6 representa C, n representa un enlace sencillo y R9 representa OH tal como se representa mediante la siguiente estructura: 20
En otra realización adecuada de la invención, X1 representa NH(2-piridinilo), R4 representa H, R5 representa OH, R6 representa F, R7 representa F, R8 representa H, X2 representa C, X3 representa C, X4 representa C, X5 representa C, 25 X6 representa C, n representa un enlace sencillo y R9 representa OH tal como se representa mediante la siguiente estructura:
En otra realización adecuada de la invención, X1 representa NH(2-piridinilo), R4 representa H, R5 representa OH, R6 representa F, R7 representa H, R8 representa H, X2 representa C, X3 representa C, X4 representa C, X5 representa 5 C, X6 representa C, n representa un enlace sencillo y R9 representa OH tal como se representa mediante la siguiente estructura:
En algunas realizaciones, el doble enlace en la posición C26, 27 (haciendo referencia a la estructura de la sangliferina A) puede estar en la forma cis en lugar de en la forma trans.
En una realización adecuada de la invención, el doble enlace en la posición C26, 27 está en la forma cis, tal como se representa por la siguiente fórmula: 15
Tales compuestos pueden producirse durante síntesis química.
En general, los compuestos de la invención se preparan mediante mutasíntesis para generar compuestos de fórmula
(II), seguido por semisíntesis.
Fórmula (IIA) 5
Fórmula (IIB)
Los grupos X2, X3, X4, X5, X6, R4, R5, R6, R7 y R8 adecuados en la fórmula (II) son tal como se definieron para los compuestos de fórmula (I).
En general, un procedimiento para preparar precursores de los compuestos de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos comprende: 15
• inocular un caldo de fermentación con un cultivo de un productor de sangliferina (tal como Streptomyces sp. A92-308110, también conocido como DSM 9954) o más preferiblemente, un productor de sangliferina con el gen sfaA o el homólogo del gen sfaA inactivado o delecionado;
• alimentar el caldo de fermentación con un análogo de meta-tirosina (tal como se muestra en la fórmula (III),
• permitir que continúe la fermentación hasta que se produzcan los compuestos de fórmula IIA y fórmula IIB
• extraer y aislar los compuestos de fórmula IIA y fórmula IIB 25
• derivatizar de manera semisintética los compuestos de fórmula IIA y fórmula IIB para generar el compuesto de fórmula I.
Los compuestos de fórmula (III) se definen tal como sigue: 30
Fórmula (III)
en la que R10 representa H o un grupo de formación de éster tal como un grupo alquilo, por ejemplo alquilo C1-6 tal 5 como Me.
Los grupos X2, X3, X4, X5, X6, R4, R5, R6, R7 y R8 adecuados en la fórmula (III) son tal como se definieron para los compuestos de fórmula (I).
La alimentación puede ser racémica o la forma L de un compuesto de fórmula (III).
Los compuestos de fórmula (III) o bien están comercialmente disponibles o bien se preparan mediante técnicas de química de síntesis orgánica convencionales. Una ruta genérica para los compuestos de fórmula (III) es tal como se muestra en el siguiente esquema 1. 15
Esquema 1: a) acoplamiento de aldehído de fórmula (IV) con un fragmento adecuado, por ejemplo (R11O)2P(O)CH(NHPG)CO2R10, y b) hidrogenación y desprotección según sea necesario. PG = grupo protector. 20
Los aldehídos de fórmula (IV) pueden estar comercialmente disponibles o sintetizarse fácilmente por un experto en la técnica. Puede ser necesario emplear química de protección y desprotección en la generación de compuestos de fórmula (III) a partir de compuestos de fórmula (IV). Un experto en la técnica conoce estas técnicas y los grupos protectores adecuados tal como se describe en Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis (Wuts y Greene, 4ª 25 Edición, 2007).
Tras la generación de los compuestos de fórmula (IIA) y fórmula (IIB), se preparan los compuestos de la invención mediante derivatización semisintética. Los métodos semisintéticos para generar el aldehído de sangliferina macrocíclico se describen en el documento US6.124.453, Metternich et al., 1999, Banteli et al., 2001 y Sedrani et al., 30 2003.
En general, el procedimiento semisintético para preparar determinados compuestos de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos a partir de un análogo de sangliferina mutasintético comprende:
(a) dihidroxilación del análogo de sangliferina;
(b) escisión oxidativa del 1,2-diol para producir un aldehído; y
(c) acoplamiento de dicho aldehído con un carbanión estabilizado (o forma canónica del mismo), tal como un 40 carbanión de fosfonato, usando un compuesto de fórmula V.
Esto se muestra de manera retrosintética a continuación:
En la que para los análogos de sangliferina A mutasintéticos, R12 =
Los grupos R11, que pueden ser iguales o diferentes, representan independientemente alquilo (por ejemplo alquilo 5 C1-4) o bencilo.
Por tanto, un procedimiento para preparar compuestos de la invención comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (V) con un macrociclo aldehídico (compuesto de fórmula (VI)).
La preparación de compuestos de fórmula (VI) puede realizarse mediante un procedimiento análogo al descrito anteriormente para la conversión de sangliferina A en su macrociclo aldehídico correspondiente (Metternich et al. 1999). Brevemente, el compuesto de fórmula (II) se dihidroxila usando condiciones de Sharpless modificadas (tetraóxido de osmio catalítico). El uso de los ligandos quirales ayuda a promover la selectividad. Entonces puede escindirse oxidativamente el diol resultante, usando por ejemplo peryodato de sodio. Entonces puede usarse el 15 compuesto de fórmula VI resultante como sustrato para derivatización a una amida, éster o cetona homologados. Normalmente, se disuelve un compuesto de fórmula (V) en un disolvente aprótico, se enfría y luego se trata con una base, por ejemplo hidruro de sodio. Entonces se añade un compuesto de fórmula (VI) y aumenta la temperatura de la reacción. Tras un periodo de tiempo adecuado, se detiene la reacción y se purifica el compuesto de fórmula I mediante condiciones convencionales (por ejemplo HPLC preparativa, CCF preparativa, etc., cromatografía 20 ultrarrápida en fase normal).
Pueden llevarse a cabo derivatizaciones para introducir cambios en grupos R9 y n antes de la generación del
compuesto de fórmula VI o tras la reacción para formar la amida homologada. Brevemente, puede eliminarse el hidroxilo en R9 mediante el tratamiento de un sustrato adecuado en condiciones ácidas con el fin de generar un trieno conjugado.
Los compuestos de fórmula (V) pueden conocerse o pueden prepararse usando métodos conocidos. 5
Por ejemplo, los compuestos de fórmula (V) en los que X1 representa NR1R2 pueden sintetizarse fácilmente a partir de aminas disponibles (por ejemplo, R1R2NH). Tal como se muestra en el esquema 1 (a continuación) puede usarse la amina para tratar cloruro de cloroacetilo o similar para formar una alfa-cloroamida. Entonces se trata la alfa-cloroamida en una reacción de Arbuzov para generar un compuesto de fórmula V. Otras rutas para los compuestos 10 de fórmula V resultarán evidentes para un experto en la técnica.
Esquema 1 15
Otros compuestos de fórmula (V) en los que X1 representa R3 pueden conocerse o pueden sintetizarse fácilmente a partir de derivados de ácido carboxílico disponibles (por ejemplo R3COX). Tal como se muestra en el esquema 2 (a continuación) el derivado de ácido carboxílico puede acoplarse en un fosfonato de metilo una vez que el fosfonato se ha tratado con una base. Esto produce un compuesto de fórmula (V), aunque otras rutas para obtener compuestos 20 de fórmula V resultarán evidentes para un experto en la técnica.
X = Cl u O-alquilo 25
Esquema 2
Otros compuestos de fórmula (V) en los que X1 representa OR1 pueden conocerse o pueden sintetizarse fácilmente a partir de alcoholes disponibles (por ejemplo,R1OH). Tal como se muestra en el esquema 3 (a continuación), el 30 alcohol puede usarse para tratar cloruro de cloroacetilo o similar para formar un alfa-cloroéster. Entonces se trata el alfa-cloroéster en una reacción de Arbuzov para generar el compuesto de fórmula II. Otras rutas para obtener compuestos de fórmula II resultarán evidentes para un experto en la técnica.
35
Esquema 3
Si se desea o es necesario, pueden emplearse grupos protectores para proteger la funcionalidad en el macrociclo aldehídico, macrociclo, alcohol (R1OH), derivado de ácido carboxílico (R1R2R3COX) o la amina (R1R2NH), o en compuestos de fórmula V tal como se describe en T. W. Green, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, Nueva York, 1999. 5
Además de los métodos específicos y las referencias proporcionadas en el presente documento, un experto en la técnica también puede consultar referencias en libros de texto convencionales para métodos de síntesis, incluyendo, pero sin limitarse a Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry (Furniss et al., 1989) y March’s Advanced Organic Chemistry (Smith y March, 2001). 10
Un análogo de sangliferina según la invención puede administrarse solo o en combinación con otros agentes terapéuticos. La coadministración de dos (o más) agentes puede permitir que se usen menores dosis de cada uno, reduciendo así los efectos secundarios, puede conducir a potencia mejorada y por tanto a SVR superior, y a una reducción en la resistencia. 15
Por tanto en una realización, el análogo de sangliferina mutasintético se coadministra con uno o más agentes terapéuticos para el tratamiento de infección por VHC, tomado de los tratamientos de referencia. Éste podría ser un interferón (por ejemplo pIFN y/o ribavirina).
En una realización alternativa, se coadministra macrociclo de sangliferina de la invención con uno o más agentes antivirales distintos, tales como un STAT-C (agente dirigido específicamente para el tratamiento de VHC) o DAA (antivirales de acción directa), que podría ser uno o más de los siguientes: inhibidores no nucleósidos de la polimerasa (por ejemplo ABT-333, ABT-072, BMS 791325, IDX375, VCH-222, BI 207127, ANA598, VCH-916, GS 9190, PF-00868554 (Filibuvir) o VX-759), inhibidores nucleósidos o nucleótidos de la polimerasa (por ejemplo 2’-C-25 metilcitidina, 2’-C-metiladenosina, R1479, PSI-6130, R7128, R1626, PSI 7977 o IDX 184), inhibidores de proteasa (por ejemplo ABT-450, ACH-1625, BI 201355, BILN-2061, BMS-650032, CTS 1027, Danoprevir, GS 9256, GS 9451, MK 5172, IDX 320, VX-950 (Telaprevir), SCH503034 (Boceprevir), TMC435350, MK-7009 (Vaneprivir), R7227/ITMN-191, EA-058, EA-063 o VX 985), inhibidores de NS5A (por ejemplo A-831, BMS 790052, BMS 824393, CY-102 o PPI-461), silimarina, inhibidores de NS4b, inhibidores de serina C-palmitoiltransferasa, nitazoxanida o inhibidores de 30 la entrada viral (por ejemplo PRO 206).
En una realización alternativa, se coadministra macrociclo de sangliferina de la invención con uno o más agentes antivirales distintos (tal como terapia antirretroviral altamente activa (HAART)) para el tratamiento de VIH, que podría ser uno o más de los siguientes: inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa (NRTI) (por ejemplo 35 emtricitabina o tenofovir), inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (NNRTI) (por ejemplo rilipivirina o efavirenz), inhibidores de proteasa (PI) (por ejemplo ritonavir o lopinavir), inhibidores de fusión (por ejemplo maraviroc o enfuvirtida), inhibidores de CCR5 (por ejemplo aplaviroc o vicriviroc), inhibidores de maduración (por ejemplo bevirimat), anticuerpos monoclonales anti-CD4 (por ejemplo Ibalizumab) e inhibidores de integrasa (por ejemplo eltiegravir). 40
En una realización alternativa, se coadministra un macrociclo de sangliferina de la invención con uno o más agentes antivirales distintos para el tratamiento de VHB, que podría ser uno o más de los siguientes: interferones (por ejemplo interferón alfa o interferón alfa pegilado), análogos de nucleósido o nucleótido (por ejemplo lamivudina, entecavir, adefovir dipivoxil o telbivudina), otros inmunomoduladores (por ejemplo timosina alfa, CYT107 o DV-601) 45 o inhibidores de HMG CoA reductasa (por ejemplo simvastatina).
Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Tales métodos incluyen la etapa de asociar el principio activo (compuesto de la invención) con el portador que constituye uno o más componentes 50 adicionales. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el principio activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y entonces, si es necesario, se conforma el producto.
Los compuestos de la invención normalmente se administrarán por vía oral en forma de una formulación 55 farmacéutica que comprende el principio activo, opcionalmente en forma de una sal de adición de base o ácido orgánico o inorgánico no tóxico, en una forma farmacéutica farmacéuticamente aceptable. Dependiendo del trastorno y del paciente que va a tratarse, así como de la vía de administración, las composiciones pueden administrarse en dosis variables.
Por ejemplo, los compuestos de la invención pueden administrarse por vía oral, bucal o sublingual en forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, disoluciones o suspensiones, que pueden contener agentes aromatizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retardada o controlada.
Tales comprimidos pueden contener excipientes tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, 65 carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico y glicina, disgregantes tales como almidón (preferiblemente almidón
de maíz, patata o tapioca), glicolato sódico de almidón, croscarmelosa de sodio y determinados silicatos complejos, y aglutinantes de granulación tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y goma arábiga. Adicionalmente, pueden incluirse agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco.
También pueden emplearse composiciones sólidas de tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina. Los excipientes preferidos a este respecto incluyen lactosa, almidón, una celulosa, azúcar de leche o polietilenglicoles de alto peso molecular. Para suspensiones acuosas y/o elixires, los compuestos de la invención pueden combinarse con diversos agentes edulcorantes o aromatizantes, colorantes o materia colorante, con agentes de emulsión y/o suspensión y con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos. 10
Un comprimido puede obtenerse mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más componentes adicionales. Los comprimidos sometidos a compresión pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada el principio activo en forma fluida tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante (por ejemplo povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por 15 ejemplo glicolato sódico de almidón, povidona reticulada, carboximetilcelulosa de sodio reticulada), agente tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden obtenerse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden recubrirse o ranurarse opcionalmente y pueden formularse para proporcionar la liberación lenta o controlada del principio activo usando en los mismos, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar un perfil 20 de liberación deseado.
Las formulaciones según la presente invención adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades diferenciadas tales como cápsulas, sellos o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del principio activo; como un polvo o gránulos; como una disolución o una suspensión en un líquido 25 acuoso o un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El principio activo también puede presentarse como un bolo, electuario o pasta.
Debe entenderse que además de los componentes mencionados particularmente antes, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en 30 cuestión, por ejemplo los adecuados para administración oral pueden incluir agentes aromatizantes.
Ventajosamente, pueden disolverse agentes tales como conservantes y agentes tamponantes en el vehículo. Para potenciar la estabilidad, puede congelarse la composición tras el llenado en el vial y puede retirarse el agua a vacío. El polvo liofilizado seco se sella entonces en el vial y puede suministrarse un vial adjunto de agua para inyección 35 para reconstituir el líquido antes de su uso.
La dosificación que va a administrase de un compuesto de la invención variará según el compuesto particular, la enfermedad implicada, el sujeto, y la naturaleza y la gravedad de la enfermedad y el estado físico del sujeto, y la vía de administración seleccionada. La dosificación apropiada puede determinarse fácilmente por un experto en la 40 técnica.
Las composiciones pueden contener desde el 0,1% en peso, preferiblemente desde el 5-60%, más preferiblemente desde el 10-30% en peso, de un compuesto de invención, dependiendo del método de administración.
Se reconocerá por un experto en la técnica que la cantidad y separación óptimas de las dosificaciones individuales de un compuesto de la invención se determinarán por la naturaleza y el grado del estado que esté tratándose, la forma, la vía y el sitio de administración, y la edad y estado del sujeto particular que esté tratándose, y que un médico determinará en última instancia las dosificaciones apropiadas que han de usarse. Esta dosificación puede repetirse tan a menudo como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios, puede alterarse o reducirse la 50 cantidad y/o frecuencia de la dosificación, según la práctica clínica normal.
Los aspectos adicionales de la invención incluyen:
-
un compuesto según la invención para su uso como producto farmacéutico; 55
-
un compuesto según la invención para su uso como producto farmacéutico para el tratamiento de infecciones virales (especialmente infecciones por virus ARN) tal como infección por VHC o VIH, para su uso como antiinflamatorio o para profilaxis de rechazo de trasplantes de órganos;
-
una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la invención junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable;
-
una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la invención junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable que comprende además un segundo principio activo o principio activo posterior, 65 especialmente un principio activo indicado para el tratamiento de infecciones virales tales como infección por VHC o
VIH, para su uso como antiinflamatorio o para profilaxis de rechazo de trasplantes de órganos;
-
uso de un compuesto según la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones virales tales como infección por VHC o VIH, para su uso como antiinflamatorio o para profilaxis de rechazo de trasplantes de órganos. 5
Métodos generales
Materiales y métodos
Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento
El productor de sangliferina Streptomyces sp. A92-308110 (DSM n.º 9954, adquirido de DSMZ, Braunschweig, Alemania) también denominado BIOT-4253 y BIOT-4370 o sus derivados, tales como BIOT-4585 se mantienen en medio de agar de harina de avena, MAM, ISP4 o ISP2 (véase a continuación) a 28ºC. 15
Se hizo crecer BIOT-4585 (para la metodología de construcción, véase el ejemplo 1) en agar de harina de avena a 28ºC durante 7-10 días. Se recogieron las esporas de la superficie de la placa de agar en glicerol estéril al 20% p/v en agua destilada y se almacenaron en alícuotas de 0,5 ml a -80ºC. Se usó la reserva de esporas congeladas para inocular medios de siembra SGS o SM25-3. Se incubó el medio de siembra inoculado con agitación entre 200 y 20 300 rpm con un desplazamiento vertical de 5,0 ó 2,5 cm a 27ºC durante 24 horas. Se inoculó el medio de fermentación SGP-2 o BT6 con el 2,5%-10% del cultivo sembrado y se incubó con agitación entre 200 y 300 rpm con un desplazamiento vertical de 5 ó 2,5 cm a 24ºC durante 4-5 días. Entonces se recogió el cultivo para su extracción.
Análogos de meta-tirosina 25
Se adquirieron (2S)-2-amino-3-(6-hidroxi(2-piridil))propanoato de metilo, éster metílico de L-3-aminofenilalanina, éster metílico de L-4-metil-meta-tirosina, éster metílico de L-4-fluoro-meta-tirosina y éster metílico de L-4,5-difluoro-meta-tirosina de Netchem (EE.UU.).
Se adquirieron DL-3-fluorofenilalanina y L-fenilalanina de Sigma (RU).
Se adquirió DL-meta-tirosina de Fluorochem (RU).
Se adquirió L-meta-tirosina de Alfa Aesar (RU). 35
Se adquirió (S)-2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo de NetChem (EE.UU.). Se adquirió 3-bromo-5-fluoroanisol (9-1) de Accela ChemBio Co., Ltd., (Shanghai, China) y también puede adquirirse de Amfinecom Inc (EE.UU.) o Apollo Scientific Ltd. (RU)).
Se sintetizaron DL-5-fluoro-meta-tirosina (8), DL-5-fluoro-meta-tirosina (9), 2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo (10), 2-amino-3-(2-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo (11), 2-amino-3-(2-fluoro-3-hidroxifenil)propanoato de metilo (12) y 2-amino-3-(2,6-difluoro-3-hidroxifenil)propanoato de metilo (13) tal como sigue.
DL-4-fluoro-meta-tirosina (8)
A una disolución de 8-1 (3 g, 19,5 mmol) en DCM seco (150 ml) se le añadió gota a gota BBr3 (4 M en DCM, 14,6 ml, 58,5 mmol) a -70ºC. Tras la adición, se agitó la mezcla de reacción a -20ºC durante 3 h, se añadió agua helada cuidadosamente y se extrajo con DCM. Se lavaron las fases orgánicas con agua y salmuera, se secaron sobre 5 Na2SO4, se filtraron y se concentraron. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en sílice para dar el compuesto deseado 8-2.
A una disolución de 8-2 (0,9 g, 6,4 mmol) en acetona (40 ml) se le añadió K2CO3 (2,2 g, 16 mmol) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió agua y se eliminó la 10 acetona a vacío, y entonces se extrajo con EtOAc, se lavaron las fases orgánicas con agua y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice para dar el compuesto deseado 8-3.
Se agitó una mezcla de 8-3 (1 g, 4,34 mmol), ácido hipúrico (860 mg, 4,80 mmol), NaOAc (400 mg) y Ac2O (2,2 ml) a 15 80ºC durante 2 h. Se enfrió la mezcla de reacción amarilla y se añadió EtOH frío (10 ml), se enfrió la mezcla en un baño con hielo durante 15 min y entonces se vertió en 30 ml de agua helada, se enfrió y se recogió el producto mediante filtración. Se secó el sólido a vacío para producir 8-4.
Se agitó una disolución de 8-4 (300 mg, 0,8 mmol) y NaOAc (71 mg, 0,87 mmol) en MeOH (50 ml) a temperatura 20 ambiente durante la noche. Se eliminó el disolvente mediante evaporación rotatoria y se disolvió el residuo en 50 ml de EtOAc, se lavó la disolución de EtOAc dos veces con agua y se concentró para dar 8-5.
Se hidrogenó una disolución de 8-5 (360 mg, 0,89 mmol) en MeOH (50 ml) sobre Pd al 10%/C (77 mg) a presión normal durante 20 h. Tras la eliminación del catalizador mediante filtración , se evaporó el disolvente para dar el 25 producto 8-6.
Se sometió a reflujo una disolución de 8-6 (210 mg) en HCl 3 N (10 ml) durante 24 h. Se concentró la disolución hasta la sequedad y se purificó el residuo mediante cromatografía Combiflash inversa para dar el producto objetivo 8. 30
DL-5-fluoro-meta-tirosina (9) y 2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo (10)
A una disolución de 9-1 (20 g, 97,55 mmol) en tetrahidrofurano (100 ml) se le añadió gota a gota n-butil-litio (43 ml, 2,5 M, 107,3 mmol) a -78ºC. Se agitó durante 30 minutos y se añadió N,N-dimetilformamida (15,1 ml, 195,1 mmol) a esta temperatura. Se agitó durante otros 30 minutos y se retiró el baño frío. Tras 1 hora, se extinguió la reacción con 5 cloruro de amonio saturado acuoso. Se lavó la fase orgánica con agua y cloruro de sodio saturado acuoso, se secó (sulfato de sodio), se filtró y se concentró. Se purificó el residuo mediante cromatografía en sílice para dar 9-2.
A una disolución de 9-2 (6 g, 38,9 mmol) en DCM seco (200 ml) se le añadió gota a gota BBr3 (4 M en DCM, 30 ml, 116,8 mmol) a -70ºC. Tras la adición, se agitó la mezcla de reacción a -20ºC durante 3 horas, se añadió agua helada 10 cuidadosamente y se extrajo con DCM. Se lavaron las fases orgánicas con agua y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en sílice para dar el compuesto deseado 9-3.
A una disolución de 2-(benciloxicarbonilamino)-2-(dimetoxifosforil)acetato de metilo (4,64 g, 14 mmol) en DCM 15 (150 ml) se le añadió DBU (4,26 g, 28 mmol) a temperatura ambiente. Tras 10 min, se añadió 9-3 (1,95 g, 14 mmol) y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante la noche. Se diluyó la disolución con EtOAc (150 ml), se separó y se lavó la fase orgánica con HCl 1 N, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en sílice para dar 9-4.
Se hidrogenó una disolución de 9-4 (1 g) en MeOH (20 ml) sobre 200 mg de Pd al 10%/C a presión normal durante la noche. Tras la eliminación del catalizador mediante filtración, se evaporó el disolvente para dar 10.
A una disolución de 10 (300 mg, 1,4 mmol) en EtOH (30 ml) se le añadió NaOH ac. (2 N, 4 ml), se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se eliminó el disolvente y se neutralizó el residuo hasta pH=6 con HCl 25 2 N y se recogieron los cristales blancos que se formaron mediante filtración para dar el compuesto 9 objetivo.
Vía alternativa para 2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo (10)
Se adquirió (3,5-difluorobromobenceno (9a-1) de Darui Fine Chemicals Co., Ltd., (Shanghai, China) y también puede 30 adquirirse de Alfa Aesar o Sigma Aldrich.)
Preparación de 9a-2
A una disolución de BnOH (1,61 ml, 15,54 mmol) en DMF (30 ml) se le añadió NaH (622 mg, dispersión al 60% en 5 aceite mineral, 15,54 mmol) a 0ºC. Se continuó con la agitación a temperatura ambiente durante 0,5 h para dar una disolución transparente. Se añadió 9a-1 (1,79 ml, 15,54 mmol) a una tasa tal para mantener la temperatura por debajo de 40ºC. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche para dar una disolución amarilla. Se extinguió la reacción mediante agua y se extrajo con éter de petróleo (35 ml X 34). Se concentraron las fases orgánicas combinadas. Y se purificó el residuo mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con éter de 10 petróleo para proporcionar 9a-2 (2,544 g) como aceite incoloro.
Preparación de 9a-3
A un matraz seco de tres bocas se le añadieron Mg (170,1 mg, 7,10 mmol), THF anhidro (10 ml) y una pequeña 15 cantidad de yodo bajo nitrógeno. Se añadió 1/3 de 9a-2 (1,664 g, 5,9192 mmol) en THF (2 ml). Se calentó la mezcla a reflujo. Durante este tiempo, la mezcla amarilla se convirtió gradualmente en amarillo brillante. Entonces, se añadieron los restantes 2/3 de 9a-2 gota a gota, y se sometió a reflujo la mezcla de reacción durante otras 0,5 h.
A la mezcla anterior se le añadió DMF (0,504 ml, 6,51 mmol) lentamente a 0ºC. Se continuó con la agitación durante 20 0,5 h a temperatura ambiente. Se añadió HCl (2 M, 10 ml) y se evaporó el THF. Se extrajo el residuo con acetato de etilo (25 ml X 3). Y se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera y se concentraron a vacío. Se purificó el residuo mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con de éter de petróleo a éter de petróleo/acetato de etilo = 20/1 para dar 9a-3 (694 mg) como aceite incoloro.
Preparación de 9a-5
A una disolución de 2-(benciloxicarbonilamino)-2-(dimetoxifosforil)acetato de metilo, 9a-4 (993 mg, 3,00 mmol) en DCM (30 ml) se le añadió DBU (832 ul, 5,57 mmol) a temperatura ambiente. Tras 10 min, se añadió 9a-3 (694 mg, 3,01 mmol) y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 1 h. Se lavó la disolución con HCl (1 M, 30 10 ml), y se secaron las fases orgánicas combinadas y se concentraron a vacío. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en sílice (eluyendo con diclorometano/acetato de etilo = 10/1) para dar 9a-5 (1,11 g).
Preparación de 10
Se hidrogenó una disolución de 9a-5 (100 mg) en MeOH (50 ml) sobre 20 mg de Pd al 10%/C a presión normal durante 2 h. Tras la eliminación del catalizador mediante filtración, se evaporó el disolvente para dar 10 (33 mg).
2-Amino-3-(2-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo (11)
A una disolución del compuesto 11-1 (1,4 g, 9 mmol) en 50 ml de DCM se le añadió gota a gota BBr3 (4 M en DCM, 3,6 ml, 13,5 mmol) a -78ºC. Tras la adición, se agitó la reacción a -20ºC durante 4 horas. Tras la adición lenta de hielo/agua, se separaron las fases, se lavaron las fases orgánicas con agua y salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y 5 se evaporaron hasta la sequedad. Se usó el residuo para la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una disolución de 2-(benciloxicarbonilamino)-2-(dimetoxifosforil)acetato de metilo (3 g, 9 mmol) en 100 ml de DCM se le añadió DBU (2,8 g, 18 mmol) a temperatura ambiente, tras 10 min, se añadió el compuesto 11-2 (compuesto en bruto de la última etapa), se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Entonces se diluyó la disolución con 10 DCM (50 ml), se lavó con HCl 1 N (20 ml), se secó sobre Na2SO4 y se evaporó hasta la sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo = 5/1) para dar 11-3.
Se hidrogenó una mezcla del compuesto 11-3 (500 mg, 1,5 mmol) en MeOH (20 ml) sobre 50 mg de Pd al 10%/C a presión normal durante la noche. Tras la eliminación del catalizador mediante filtración, se evaporó el disolvente 15 para obtener el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía Combiflash inversa para obtener 11 como un sólido blanco.
2-Amino-3-(2-fluoro-3-hidroxifenil)propanoato de metilo (12)
A una disolución del compuesto 12-1 (1,4 g, 9 mmol) en 50 ml de DCM se le añadió gota a gota BBr3 (4 M en DCM, 3,6 ml, 13,5 mmol) a -78ºC. Tras la adición, se agitó la reacción a -20ºC durante 4 horas. Tras la adición lenta de hielo/agua, se separaron las fases, se lavó la fase orgánica con agua y salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se 25 evaporó hasta la sequedad. Se usó el residuo para la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una disolución de 2-(benciloxicarbonilamino)-2-(dimetoxifosforil)acetato de metilo (3 g, 9 mmol) en 100 ml de DCM se le añadió DBU (2,7 ml, 18 mmol) a temperatura ambiente, tras 10 min, se añadió el compuesto 12-2 (compuesto en bruto de la última etapa), se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Entonces se diluyó la disolución con 30 DCM (100 ml), se lavó con HCl 1 N (30 ml), se secó sobre Na2SO4 y se evaporó hasta la sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo = 5/1) para dar 12-3.
Se hidrogenó una mezcla del compuesto 12-3 (500 mg, 1,44 mmol) en MeOH (10 ml) sobre 100 mg de Pd al 10%/C a presión normal durante la noche. Tras la eliminación del catalizador mediante filtración, se evaporó el disolvente 35
para obtener el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía Combiflash inversa para obtener el compuesto deseado 12 como un sólido blanco.
2-Amino-3-(2,6-difluoro-3-hidroxifenil)propanoato de metilo (13)
A una disolución de 2,4-difluorofenol (2 g, 15,4 mmol) en 50 ml de DMF se le añadió K2CO3 (3,2 g, 23,1 mmol) y BnBr (2,2 ml, 18,5 mmol) a 0ºC. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron agua (100 ml) y EA (200 ml), se lavaron las fases orgánicas con agua (50 ml) y salmuera (50 ml), se secaron sobre 10 Na2SO4 y se evaporaron hasta la sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo = 10/1) para dar 13-1 en bruto.
A una disolución del compuesto 13-1 (2 g, 9 mmol) en 10 ml de THF se le añadió gota a gota n-BuLi (4 ml, 2,5 M) a -78ºC y se agitó durante 30 min. Se añadió DMF (1,3 g, 0,018 mmol) y se agitó de nuevo durante 30 min. Entonces 15 se retiró el baño frío y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 1 hora antes de extinguirse con agua. Se extrajo con acetato de etilo (20 ml x 3), se secó sobre Na2SO4 y se evaporó hasta la sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo = 10/1) para dar 13-2 como un sólido amarillo.
A una disolución de 2-(benciloxicarbonilamino)-2-(dimetoxifosforil)acetato de metilo (728 mg, 2,2 mmol) en 20 ml de DCM, se le añadió DBU (319 mg, 2,1 mmol) a temperatura ambiente. Tras 10 min, se añadió el compuesto 13-2 (500 mg, 2 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Entonces se diluyó la disolución con DCM (50 ml), se lavó con HCl 1 N (20 ml), se secó sobre Na2SO4 y se evaporó hasta la sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo = 5/1) para dar 13-3 como un aceite 25 amarillo.
Se hidrogenó el compuesto 13-3 (600 mg, 1,32 mmol) en MeOH (20 ml) sobre 60 mg de Pd al 10%/C a presión normal durante la noche. Tras la eliminación del catalizador mediante filtración, se evaporó el disolvente para obtener el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía Combiflash inversa para obtener el compuesto 30 deseado 13 como un sólido blanco.
Fórmulas de los medios
Se preparó el agua usada para preparar los medios usando el sistema de purificación de agua de calidad analítica 35 Elix de Millipore
Medio de siembra SGS
Componente (y proveedor)
Fórmula
Glucosa (Sigma, G7021)
7,50 g
Glicerol (Fisher scientific, G/0650/25)
7,50 g
extracto de levadura (Becton Dickinson, 212770)
1,35 g
extracto de malta (Becton Dickinson, 218630)
3,75 g
almidón de patata (soluble) (Sigma, S2004)
7,50 g
NZ-amina A (Sigma, C0626)
2,50 g
harina de soja tostada, Nutrisoy (ADM, 063-160)
2,50 g
L-asparagina (Sigma, A0884)
1,00 g
CaCO3 (Calcitec, V/40S)
0,05 g
NaCl (Fisher scientific, S/3160/65)
0,05 g
KH2PO4 (Sigma, P3786)
0,25 g
K2HPO4 (Sigma, P5379)
0,50 g
MgSO4.7H2O (Sigma, M7774)
0,10 g
disolución de oligoelementos B
1,00 ml
Agar
1,00 g
Antiespumante SAG471 (GE Silicones, SAG471)
* 0,20 ml
H2O OI hasta un vol. final de
** 1,00 l
se ajusta el pH antes de la esterilización a pH 7,0 con NaOH 10 M/H2SO4 10 M
se esteriliza calentando a 121ºC, 20-30 min (en autoclave)
Notas * el antiespumante se usa sólo en fermentadores de siembra, NO en matraces de siembra ** volumen final ajustado en consecuencia para tener en cuenta el volumen de siembra
Disolución de oligoelementos B
Componente
Fórmula
FeSO4.7H2O (Sigma, F8633)
5,00 g
ZnSO4.7H2O (Sigma, Z0251)
4,00 g
MnCl2.4H2O (Sigma, M8530)
2,00 g
CuSO4.5H2O (Aldrich, 20,919-8)
0,20 g
(NH4)6Mo7O24 (Fisher scientific, A/5720/48)
0,20 g
CoCl2,6H2O (Sigma, C2644)
0,10 g
H3BO3 (Sigma, B6768)
0,10 g
KI (Alfa Aesar, A12704)
0,05 g
H2SO4 (95%) (Fluka, 84720)
1,00 ml
H2O OI hasta un vol. final de
1,00 l
Medio de producción SGP2 5
Componente
Fórmula
harina de soja tostada (Nutrisoy) (ADM, 063-160)
20,00 g
Glicerol (Fisher scientific, G/0650/25)
40,00 g
tampón MES (Acros, 172595000)
19,52 g
Antiespumante SAG471 (GE Silicones, SAG471)
*0,20 ml
H2O OI hasta un vol. final de
**1,00 l
se ajusta el pH antes de la esterilización a pH 6,8 con NaOH 10 M
se esteriliza calentando a 121ºC, 20-30 min (en autoclave)
Notas * volumen final ajustado en consecuencia para tener en cuenta el volumen de siembra ** el antiespumante se usó sólo en fermentadores, no en matraces
Medio SM25-3 (también denominado SM25)
Componente
Glicerol (Fisher scientific, G/0650/25)
40 g
Peptona de soja A3 SC (Organotechnie)
10 g
Extracto de malta (Difco)
21 g
hasta un vol. final de
1 l
No se ajusta el pH antes de la esterilización (es decir, pH 7,0)
Medio ISP4
Componente
Almidón soluble (Difco)
10 g
K2HPO4
1 g
MgSO4.7H2O
1 g
NaCl
1 g
(NH4)2SO4
2 g
CaCO3
2 g
Disolución de sales de oligoelementos ISP
1 ml
Agar
20 g
hasta un volumen final de
1 l
Hacer una pasta con el almidón en un pequeño volumen de agua fría y llevar hasta un volumen de 500 ml
Añadir otros componentes a la disolución II en 500 ml de agua. El pH debe estar entre pH 7,0 y pH 7,4 (pH 7,3). Mezclar dos disoluciones juntas y añadir agar
Sales de oligoelementos ISP
Componente
FeSO4.7H2O
1 g
MnCl2.4H2O
1 g
ZnSO4.7H2O
1 g
hasta un volumen final de
1 l
Almacenar a 4 grados C
Agar de harina de avena (ISP3) 5
Componente
Fórmula
Harina de avena
20,00 g
Disolución de oligoelementos ISP
1,00 ml
Agar Bacto (Becton Dickinson)
18,00 g
H2O IO hasta un volumen final de
1,00 l
Se cuecen 20 g de harina de avena en 1 l de agua sobre una placa caliente (o microondas) durante 20 minutos. Se filtra la mezcla cocida a través de gasa rectilínea/muselina y se lleva a pH 7,2 y se vuelve a llevar a 1 l. Se añade 1 ml de disolución de oligoelementos ISP. Entonces se añaden 18 g por l de agar antes de esterilizar.
Agar MAM
Componente
Fórmula
Almidón de trigo (Sigma)
10,00 g
Polvo de maceración de maíz (Roquette)
2,50 g
Extracto de levadura (Becton Dickinson)
3,00 g
CaCO3 (Calcitec)
3,00 g
FeSO4 (Sigma)
0,300 g
Agar Bacto (Becton Dickinson)
20,00 g
H2O IO hasta un volumen final de
1,00 l
pH 5,8 antes de someter al autoclave
Medios de producción BT6
Componente
Fórmula
Glucosa (Sigma)
50,00 g
Nutrisoy (ADM)
30,00 g
NaCl (Fisher)
5,00 g
(NH4)2SO4 (Sigma)
3,00 g
CaCO3 (Calcitec)
6,00 g
H2O IO hasta un volumen final de
1,00 l
Ajustar el pH a 7,0, entonces añadir CaCO3
Agar ISP2
Componente
Fórmula
Extracto de levadura (Becton Dickinson)
4,00 g
Extracto de malta (Becton Dickinson)
10,00 g
Dextrosa (Sigma)
4,00 g
Agar Bacto (Becton Dickinson)
20,0 g
H2O IO hasta un volumen final de
1,00 l
Ajustar el pH a 7,3 antes de añadir agar y esterilizar
Método de fermentación general
Se descongelaron reservas de esporas crioconservadas de BIOT-4585 (para la metodología de construcción, véase el ejemplo 1) a temperatura ambiente. Se prepararon cultivos vegetativos (cultivos de siembra) transfiriendo 4,0 ml 20 de reserva de esporas a 400 ml de medio SM25 en matraces Erlenmeyer de 2 l con tapón de espuma. Se llevó a cabo el cultivo durante 48 horas a 27ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 5,0 cm). A partir del cultivo de
siembra, se transfirieron 25 ml a 250 ml de medio de producción SGP2 + HP20 al 5% en matraces Erlenmeyer de 2 l con tapón de espuma. Tras 24 horas de cultivo a 24ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm), se añadieron 2 ml de una disolución racémica 250 mM o enantioméricamente pura 125 mM del precursor deseado en ácido clorhídrico 1 M y 2 ml de una disolución metanólica 250 mM de ácido DL-piperázico a cada matraz de producción para dar una concentración final 1 mM de los enantiómeros individuales de los precursores. Puede usarse 5 opcionalmente DMSO en lugar de ácido clorhídrico 1 M. Puede omitirse opcionalmente el ácido DL-piperázico. Se continuó con el cultivo durante cuatro días adicionales a 24ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm).
Análisis de caldos de cultivo mediante CL-UV y CL-UV-EM
Se añaden caldo de cultivo (1 ml) y acetato de etilo (1 ml) y se mezclan durante 15-30 min seguido por centrifugación durante 10 min. Se recogen 0,4 ml de la fase orgánica, se evaporan hasta la sequedad y entonces se vuelven a disolver en 0,20 ml de acetonitrilo.
Condiciones de HPLC: 15
Columna C18 Hyperclone BDS C18, 3 u, 4,6 mm x 150 mm
Dotada de un cartucho de seguridad C18 analítico de Phenomenex (KJ0-4282)
Temperatura de la columna a 50ºC
Velocidad de flujo 1 ml/min
Monitorizar UV a 240 nm 25
Inyectar alícuota de 20 ul
Gradiente de disolventes:
0 min: 55% de B
1,0 min: 55% de B
6,5 min: 100% de B 35
10,0 min: 100% de B
10,05 min: 55% de B
13,0 min: 55% de B
El disolvente A es agua + ácido fórmico al 0,1%
El disolvente B es acetonitrilo + ácido fórmico al 0,1% 45
En estas condiciones SfA eluye a los 5,5 min
En estas condiciones SfB eluye a los 6,5 min
Se realiza CL-EM en un sistema de HPLC HP1100 de Agilent integrado en combinación con un espectrómetro de masas por electropulverización Esquire 3000+ de Bruker Daltonics que funciona en modo de ión positivo usando la cromatografía y los disolventes descritos anteriormente.
Método de CL-EM QC 55
Condiciones de HPLC:
Columna C18 Hyperclone BDS C18, 3 u, 4,6 mm x 150 mm
Dotada de un cartucho de seguridad C18 analítico de Phenomenex (KJ0-4282)
Temperatura de la columna a 50ºC
Velocidad de flujo 1 ml/min 65
Monitorizar UV a 210, 240 y 254 nm
Gradiente de disolventes:
0 min: 10% de B 5
2,0 min: 10% de B
15 min: 100% de B
17 min: 100% de B
17,05 min: 10% de B
20 min: 10% de B 15
El disolvente A es agua + ácido fórmico al 0,1%
El disolvente B es acetonitrilo + ácido fórmico al 0,1%
Condiciones de EM:
La EM funciona en modo de intercalación (intercalando entre positivo y negativo), explorando desde 150 hasta 1500 uma.
Ensayo de replicón in vitro para la evaluación de la actividad antiviral contra VHC
Puede someterse a prueba la eficacia antiviral contra el genotipo 1 de VHC tal como sigue: Un día antes de la adición del artículo de prueba, se recogieron células Huh5.2 que contenían el genotipo 1b, replicón 1389luc-ubi-neo/NS3-3’/5.1 de VHC (Vrolijk et al., 2003) y subcultivadas en medio de crecimiento de células [DMEM (n.º de 30 catálogo 41965039) complementado con FCS al 10%, aminoácidos no esenciales al 1% (11140035), penicilina/estreptomicina al 1% (15140148) y geneticina al 2% (10131027); Invitrogen] a una razón de 1,3-1,4 y crecidas durante 3-4 días en matraces de cultivo tisular de 75 cm2 (Techno Plastic Products), y se sembraron en medio de ensayo (DMEM, FCS al 10%, aminoácidos no esenciales al 1%, penicilina/estreptomicina al 1%) a una densidad de 6500 células/pocillo (100 l/pocillo) en placas de microtitulación de cultivo tisular de 96 pocillos (Falcon, 35 Becton Dickinson para la evaluación del efecto antimetabólico y CulturPlate, Perkin Elmer para la evaluación del efecto antiviral). Se incuban las placas de microtitulación durante la noche (37ºC, 5% de CO2, humedad relativa del 95-99%), produciendo una monocapa de células no confluente.
Se preparan series de dilución; cada serie de dilución se realiza al menos por duplicado. Tras configurar el ensayo, 40 se incuban las placas de microtitulación durante 72 horas (37ºC, 5% de CO2, humedad relativa del 95-99%).
Para la evaluación de los efectos antimetabólicos, se aspira el medio de ensayo, se sustituye por 75 l de una disolución al 5% de MTS (Promega) en medio libre de rojo fenol y se incuba durante 1,5 horas (37ºC, 5% de CO2, humedad relativa del 95-99%). Se mide la absorbancia a una longitud de onda de 498 nm (Safire2, Tecan) y las 45 densidades ópticas (valores de DO) se convierten en porcentajes de los controles no tratados.
Para la evaluación de los efectos antivirales, se aspira el medio de ensayo y se lavan las monocapas de células con PBS. Se aspira el tampón de lavado, se añaden 25 l de tampón de lisis Glo (n.º de catálogo E2661, Promega) tras lo cual se permite que continúe la lisis durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se añaden 50 l de 50 sistema de ensayo de luciferasa (n.º de catálogo E1501, Promega) y se cuantifica inmediatamente la señal de luminiscencia de luciferasa (tiempo de integración de 1000 ms/pocillo, Safire2, Tecan). Se convierten las unidades de luminiscencia relativa en porcentajes de los controles no tratados.
Las CE50 y CE90 (valores obtenidos a partir de la curva de dosis-respuesta) representan las concentraciones a las 55 que se observaría inhibición de replicación viral del 50% y el 90%, respectivamente. La CC50 (valor obtenido a partir de la curva de dosis-respuesta) representa la concentración a la que la actividad metabólica de las células se reduciría al 50% de la actividad metabólica de las células no tratadas. El índice de selectividad (IS), indicativo de la ventana terapéutica del compuesto, se calcula como CC50/CE50.
Se considera que una concentración de compuesto provoca un efecto antiviral genuino en el sistema de replicón de VHC cuando, a esa concentración particular, el efecto anti-replicón está por encima del 70% del umbral y no se observa una reducción de más del 30% en la actividad metabólica.
Ensayo de replicón in vitro para la evaluación de la actividad antiviral contra VHC en los genotipos 1a y 2a 65
Se hacen crecer células con replicón (replicones subgenómicos de genotipo 1a (H77) y 2a (JFH-1)) en medios esenciales modificados por Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina-estreptomicina (pen-estrep) al 1%, glutamina al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, G418 250 g/ml en un incubador con el 5% de CO2 a 37ºC. Todos los reactivos del cultivo celular pueden adquirirse de Mediatech (Herndon, VA).
Se someten las células con replicón a tripsinización y se siembran a 5 x 103 células por pocillo en placas de 96 pocillos con los medios anteriores sin G418. Al día siguiente, se sustituye el medio de cultivo con DMEM que contienen compuestos diluidos en serie en presencia de FBS al 5%. El ensayo antiviral de replicón de VHC examina los efectos de los compuestos en una serie de diluciones de compuestos. Brevemente, se siembran las células que contienen replicón de VHC en placas de 96 pocillos. Se diluye en serie el artículo de prueba con DMEM más FBS al 10 5%. Se aplica el compuesto diluido a los pocillos apropiados e la placa. Tras 72 h de incubación a 37ºC, se procesan las células. Se extrae el ARN intracelular de cada pocillo con un kit RNeasy 96 (Qiagen). Se determina el nivel de ARN de VHC mediante un ensayo de PCR en tiempo real con transcriptasa inversa usando los reactivos de mezcla maestra de RT-PCR de una etapa TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900 (Applied Biosystems) tal como se describió anteriormente (Vrolijk et al., 2003). Se miden 15 los efectos citotóxicos con los reactivos de control de ARN ribosómico TaqMan® (Applied Biosystems) como una indicación del número de células. Entonces se usa la cantidad de ARN de VHC y ARN ribosómico para obtener los valores de CI50 aplicables (concentración que inhibe la replicación del replicón en el 50%).
Evaluación del metabolismo de microsomas (ensayo de estabilidad de microsomas) 20
Puede someterse a prueba la tasa de metabolismo en microsomas tal como sigue:
Se diluyeron microsomas de hígado de ratón o ser humano con tampón C (tampón fosfato de potasio 0,1 M, EDTA 1,0 mM, pH 7,4) hasta una concentración de 2,5 mg/ml. Entonces se prepararon muestras para determinar la 25 estabilidad microsómica añadiendo 50 l de disolución con adiciones conocidas de compuesto 5 M (0,5 l de disolución madre de DMSO 10 mM en 9,5 l de ACN, añadidos a 990 l de tampón C) a 50 l de disolución microsómica (2,5 mg/ml), 110 l de tampón C y se mezclaron bien. Se preincubaron todas la muestras durante aproximadamente 15 minutos a 37ºC. Tras esto, se inició la reacción añadiendo 40 l de la disolución de NADPH (12,5 mM) con mezclado suave. Se retiraron alícuotas (40 l) a 0, 15, 30, 45 y 60 minutos y se extinguió con patrón 30 interno que contenía ACN (120 l). Se retiraron las proteínas mediante centrifugación (4000 rpm, 15 min) y se analizó la placa de muestra para determinar la concentración del compuesto mediante CL-EM/EM. Entonces se calcularon las semividas mediante métodos convencionales, comparando la concentración del analito con la cantidad originalmente presente.
Evaluación de la estabilidad de hepatocitos
Se colocan hepatocitos crioconservados, previamente almacenados en nitrógeno líquido en un baño de agua con agitación a 37  1ºC durante 2 min  15 s. Entonces se añaden los hepatocitos a volúmenes 10X de tampón bicarbonato de Krebs-Henseleit (KHB) precalentado (glucosa 2000 mg/l, sin carbonato de calcio ni bicarbonato de 40 sodio, Sigma), se mezclan suavemente y se centrifugan a 500 rpm durante 3 minutos. Tras la centrifugación, se retira cuidadosamente el sobrenadante y se añade un volumen 10X de tapón KHB precalentado para resuspender el sedimento de células. Esto se mezcla suavemente y se centrifuga a 500 rpm durante 3 minutos. Entonces se retira el sobrenadante y se desecha. Entonces se determinan la viabilidad y el rendimiento celulares mediante recuentos de células, y estos valores se usan para generar suspensiones de hepatocitos humanos a la densidad de siembra 45 apropiada (densidad de células viables = 2 x 106 células/ml). Se prepara una disolución de dosificación 2X en KHB precalentado (DMSO al 1%) (disolución con adiciones conocidas 200 M: 20 l de disolución madre de sustrato (10 mM) en 980 l de DMSO, disolución de dosificación 2X: 10 l de disolución con adiciones conocidas 200 M en 990 l de KHB (2 M tras la dilución).
Se añaden 50 l de disolución de dosificación 2X precalentada a los pocillos y se añaden 50 l de disolución de hepatocitos precalentada (2 X 106 células/ml) y se comienza la medición del tiempo. Entonces se incuba la placa a 37ºC. Se añaden 100 l de patrón interno que contiene acetonitrilo a cada uno de los pocillos tras la finalización del tiempo de incubación (0, 15, 30, 60 y 120 minutos), se mezcla suavemente y se añaden 50 l de disolución de hepatocitos precalentada (2 X 106 células/ml). Al final de la incubación, se determina la viabilidad celular. Se 55 centrifugan las muestras a 4000 rpm durante 15 minutos a 4ºC, se diluyen dos veces los sobrenadantes con agua ultrapura y se analizan los niveles de compuesto mediante CL-EM/EM.
Evaluación de la solubilidad en agua
Puede someterse a prueba la solubilidad en agua tal como sigue: Se prepara una disolución madre 10 mM del análogo de sangliferina en DMSO al 100% a temperatura ambiente. Se llevan alícuotas de 0,01 ml por triplicado a 0,5 ml con o bien disolución de PBS 0,1 M, pH 7,3 o bien DMSO al 100% en viales de color ámbar. Se agitan las disoluciones 0,2 mM resultantes, a temperatura ambiente en un agitador IKA® vibrax VXR durante 6 h, seguido por la transferencia de las disoluciones o suspensiones resultantes a tubos Eppendorf de 2 ml y centrifugación durante 65
30 min a 13200 rpm. Entonces se analizan alícuotas del fluido sobrenadante mediante el método de CL-EM tal como se describió anteriormente.
Alternativamente, puede someterse a prueba la solubilidad en PBS a pH 7,4 tal como sigue: Se genera una curva de calibración diluyendo los compuestos de prueba y los compuestos control hasta 40 M, 16 M, 4 M, 1,6 M, 5 0,4 M, 0,16 M, 0,04 M y 0,002 M, con MeOH al 50% en H2O. Entonces se diluyen adicionalmente los puntos patrón 1:20 en MeOH:PBS 1:1. Las concentraciones finales tras la dilución 1:20 son 2000 nM, 800 nM, 200 nM, 80 nM, 20 nM, 8 nM, 2 nM y 1 nM. Entonces se mezclan los patrones con el mismo volumen (1:1) de patrón interno que contiene ACN (hidroximacrociclo, 6). Se centrifugan las muestras (5 min, 12000 rpm), luego se analizan mediante CL/EM. 10
Disolución (l) MeOH/H2O (1:1) (l) Disolución de trabajo (M) Disolución (l) MeOH/ Tampón (1:1) (l) Disolución final (nM)
10 mM
→
400 M
→ →
→ →
40 M
→ →
16 M
→ 1,6 →
4 M
→ 0,4 →
1,6 M
→ 0,16 →
0,4 M
→ 0,04 →
0,04 M
→ 0,002 →
Se preparan los compuestos de prueba como disoluciones madre en DMSO a una concentración de 10 mM. Se diluyen las disoluciones madre por duplicado en PBS, pH 7,4 en tubos Eppendorf de 1,5 ml a una concentración objetivo de 100 M con una concentración de DMSO final del 1% (por ejemplo 4 L de disolución madre de DMSO 15 10 mM en 396 l de tampón fosfato 100 mM). Entonces se agitan suavemente los tubos de muestra durante 4 horas a temperatura ambiente. Se centrifugan las muestras (10 min, 15000 rpm) para precipitar las partículas no disueltas. Se transfieren los sobrenadantes a tubos nuevos y se diluyen (el factor de dilución para el artículo de prueba individual se confirma mediante el nivel de señal del compuesto en el instrumento analítico aplicado) con PBS. Entonces se mezclan las muestras diluidas con el mismo volumen (1:1) de MeOH. Se mezclan finalmente las 20 muestras con el mismo volumen (1:1) de patrón interno que contiene ACN (hidroximacrociclo, 6) para análisis de CL-EM/EM.
Evaluación de la permeabilidad celular
Puede someterse a prueba la permeabilidad celular tal como sigue: Se disuelve el compuesto de prueba hasta 10 mM en DMSO y entonces se diluye adicionalmente en tampón para producir una concentración de dosificación final de 10 M. También se incluye el marcador de fluorescencia amarillo Lucifer para monitorizar la integridad de la membrana. Entonces se aplica el compuesto de prueba a la superficie apical de monocapas de células Caco-2 y se mide la permeación del compuesto al interior del compartimento basolateral. Esto se realiza en el sentido inverso (de 30 basolateral a apical) para investigar el transporte activo. Se usa CL-EM/EM para cuantificar los niveles tanto de compuestos de prueba como control patrón (tal como propanolol y acebutolol).
Evaluación in vivo de la farmacocinética
También pueden usarse ensayos in vivo para medir la biodisponibilidad de un compuesto. Generalmente, un compuesto se administra a un animal de prueba (por ejemplo ratón o rata) tanto por vía intravenosa (i.v.) como por vía oral (v.o.) y se extraen muestras de sangre a intervalos regulares para examinar cómo varía la concentración plasmática del fármaco a lo largo del tiempo. Puede usarse la evolución en el tiempo de la concentración plasmática a lo largo del tiempo para calcular la biodisponibilidad absoluta del compuesto como porcentaje usando modelos 40 convencionales. A continuación se describe un ejemplo de un protocolo típico.
Se administró a ratones 1, 10 ó 100 mg/kg del compuesto de la invención o el compuesto original por vía i.v. o por v.o. Se extraen muestras de sangre a 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 420 y 2880 minutos y se determina la concentración del compuesto de la invención o el compuesto original en la muestra mediante HPLC. 45 Entonces pueden usarse la evolución en el tiempo de las concentraciones plasmáticas para obtener parámetros clave tales como el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo (AUC – que es directamente proporcional a la cantidad total de fármaco sin cambiar que alcanza la circulación sistémica), la concentración plasmática del fármaco máxima (pico), el tiempo en que se produce la concentración plasmática del fármaco máxima (tiempo de pico); los factores adicionales que se usan en la determinación precisa de la biodisponibilidad incluyen: la semivida 50 terminal del compuesto, el aclaramiento corporal total, el volumen de distribución en estado estacionario y % de F. Entonces se analizan estos parámetros mediante métodos compartimentales y no compartimentales para dar una
biodisponibilidad en porcentaje calculada, para un ejemplo de este tipo de método véase Egorin et al. 2002, y referencias en el mismo.
Evaluación in vivo de farmacocinética oral e intravenosa (método específico)
Para determinar análogos de sangliferina, se analiza sangre completa. Los compuestos se formulan en el 5% de etanol / el 5% de Cremophor EL / el 90% de solución salina para administración tanto por v.o. como por vía i.v. Se administra a grupos de 3 ratones CD1 macho o bien 1 mg/kg por vía i.v. o bien 5 ó 10 mg/kg por v.o. Se extraen muestras de sangre (40 l) a través de la vena safena, antes de la administración y a las 0,25, 0,5, 2, 8 y 24 horas, y se diluyen con una cantidad igual de dH2O y se colocan en hielo seco inmediatamente. Se almacenan las muestras 10 a -70ºC hasta el análisis. Se determina la concentración del compuesto de la invención o compuesto original en la muestra mediante CL-EM tal como sigue: se añaden 20 l de sangre:H2O (1:1, v/v)/muestra PK con 20 l de patrón interno (hidroximacrociclo, 6) a 20 l de disolución de trabajo 100 ng/ml/MeOH y 150 l de ACN, se agita con vórtex durante 1 minuto a 1500 rpm, y se centrifuga a 12000 rpm durante 5 min. Entonces se inyecta el sobrenadante en CL-EM/EM. Se representa gráficamente la evolución en el tiempo de las concentraciones en sangre y se usa para 15 obtener el área bajo la curva de concentración en sangre completa-tiempo (AUC – que es directamente proporcional a la cantidad total de fármaco sin cambiar que alcanza la circulación sistémica). Estos valores se usan para generar parámetros PK cuando sea posible.
Evaluación in vitro de la citotoxicidad 20
Se hacen crecer células Huh-7 y HepG2 obtenidas de la ATCC en medios esenciales modificados por Dulbecco (DMEM) que contienen suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina-estreptomicina (pen-estrep) al 1% y glutamina al 1%; mientras que se hacen crecer células CEM (células de leucemia de células T humanas obtenidas de la ATCC) en medio RPMI 1640 con FBS al 10%, pen-estrep al 1% y glutamina al 1%. Se aíslan CMSP humanas recientes de 25 sangre completa obtenida al menos de dos donantes examinados normales. Brevemente, las células de sangre periférica se sedimentan/lavan 2-3 veces mediante centrifugación a baja velocidad y resuspensión en PBS para eliminar las plaquetas contaminantes. Las células sanguíneas lavadas se diluyen entonces 1:1 con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) y se estratifican sobre 14 ml de medio de separación de linfocitos (LSM; crecimiento celular realizado por Mediatech, Inc.; densidad 1,078+/- 0,002 g/ml; N.º de catálogo 85-072-CL) 30 en un tubo de centrífuga de 50 ml y se centrifugan durante 30 minutos a 600 X g. Se aspiran suavemente las CMSP dispuestas en bandas de la superficie de contacto resultante y posteriormente se lavan 2X con PBS mediante centrifugación a baja velocidad. Tras el lavado final, se cuentan las células mediante exclusión con azul de tripano y se resuspenden a 1 x 107 células/ml en RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal (FBS) al 15%, L-glutamina 2 mM, PHA-P 4 g/ml. Se permite incubar las células durante 48-72 horas a 37ºC. Tras la incubación, se 35 centrifugan las CMSP y se resuspenden en RPMI 1640 con FBS al 15%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 g/ml, gentamicina 10 g/ml e IL-2 humana recombinante 20 U/ml.
Se evalúa la citotoxicidad del compuesto sometiendo a prueba concentraciones semilogarítmicas de cada compuesto por triplicado contra las células descritas anteriormente. El medio que contenía células solo sirve como 40 control celular (CC). Se siembran células Huh-7 y HepG2 en placas de 96 pocillos a una concentración de 5 x 103 células por pocillo. Al día siguiente, se aspiran los medios y se añaden 100 l de medios correspondientes que contienen FBS al 5%. Se preparan diluciones del fármaco de prueba a una concentración 2X en tubos de microtitulación y se colocan 100 l de cada concentración en los pocillos apropiados en un formato convencional. Tras 72 horas, se procesan las células para la evaluación de la citotoxicidad. 45
Se diluyen CMSP en medio reciente y se siembran en los pocillos interiores de una microplaca de 96 pocillos de fondo redondo a 5 x 104 células/pocillo en un volumen de 100 l. De manera similar, se siembran en placa células CEM a 1 x 104 células/pocillo. Entonces, se añaden 100 l de preparaciones 2X de los fármacos de prueba en los pocillos apropiados en un formato convencional. Se mantienen los cultivos durante de seis a siete días y entonces 50 se procesan para la determinación de la citotoxicidad.
La citotoxicidad se determina usando el kit de ensayo de integridad de membrana homogéneo CytoTox-ONE™ (Promega). El ensayo mide la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de células con membranas dañadas en un formato fluorométrico homogéneo. La LDH liberada al medio de cultivo se mide con un ensayo enzimático acoplado 55 que da como resultado la conversión de resazurina en un producto de resorufina fluorescente. La cantidad de fluorescencia producida es proporcional al número de células lisadas. Se aplican seis concentraciones diluidas en serie de cada compuesto a las células para obtener cuando sea aplicable los valores de CT50 (concentración tóxica del fármaco que disminuye la viabilidad celular en un 50%) y CT90 (concentración tóxica del fármaco que disminuye la viabilidad celular en un 90%). 60
Evaluación in vitro de la inhibición de transportadores MDR1 y MRP2
Para evaluar la inhibición y la activación de los transportadores MDR1 (glicoproteína P 1) y MRP2, puede usarse un ensayo de ATPasa in vitro de Solvo Biotechnology Inc. (Glavinas et al., 2003). Se incuban los compuestos (a 0,1, 1, 65
10 y 100 M) con vesículas de membrana MDR1 o MRP2 tanto en ausencia como en presencia de vanadato para estudiar la posible activación de ATPasa. Además, se realizan incubaciones similares en presencia de verapamilo/sulfasalazina con el fin de detectar la posible inhibición de la actividad ATPasa del transportador. La actividad ATPasa se mide cuantificando el fosfato inorgánico espectrofotométricamente. La activación se calcula a partir del aumento sensible a vanadato en la actividad ATPasa. La inhibición se determina mediante la disminución 5 en la actividad ATPasa mediada por verapamilo/sulfasalazina.
Evaluación in vitro de la inhibición de transportadores Pgp usando células MDCK
Para evaluar la inhibición del transportador glicoproteína P (Pgp/MDR1), se usó un ensayo de ATPasa in vitro de 10 Cyprotex. Se usaron células MDR1-MDCK obtenidas del NIH (Rockville, MD, EE.UU.). Tras el cultivo, se prepararon las monocapas aclarando las superficies tanto basolateral como apical dos veces con tampón a pH 7,4 y 37ºC. Entonces se incubaron las células con tampón a pH 7,4 en los compartimentos tanto apical como basolateral durante 40 min a 37ºC y el 5% de CO2 con una humedad relativa del 95% para estabilizar los parámetros fisiológicos. Para el estudio de apical a basolateral (A-B), se retiró el tampón a pH 7,4 del compartimento apical y se 15 sustituyó por disoluciones de dosificación de loperamida antes de colocarse en las placas “complementarias”. Se prepararon las disoluciones diluyendo loperamida en DMSO con tampón para dar una concentración final de loperamida de 5 M (la concentración final de DMSO se ajusta al 1%). También se incluyó el marcador de integridad fluorescente amarillo Lucifer en la disolución de dosificación. Se realizó el experimento en presencia y ausencia del compuesto de prueba (aplicado a los compartimentos tanto apical como basolateral). Para el estudio de basolateral 20 a apical (B-A), se colocó el sustrato de la glicoproteína P, loperamida (concentración final = 5 M) en el compartimento basolateral. Se realizó el experimento en presencia y ausencia del compuesto de prueba (aplicado a los compartimentos apical y basolateral). Se llevaron a cabo incubaciones en una atmósfera del 5% de CO2 con una humedad relativa del 95% a 37ºC durante 60 min. Tras el periodo de incubación, se retiró la placa complementaria y se diluyeron las muestras apical y basolateral para su análisis mediante CL-EM/EM. Se realizó una única 25 determinación de cada concentración de compuesto de prueba. En cada placa, también se examinó un inhibidor de control positivo. Se evaluó el compuesto de prueba a 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 y 50 M. Se comprobó la integridad de las monocapas a lo largo de todo el experimento monitorizando la permeación de amarillo Lucifer usando análisis fluorimétrico. Tras el análisis, se calculó una CI50 (es decir, concentración de inhibidor (fármaco de prueba) que logra la mitad del efecto de inhibición máxima). 30
Evaluación in vitro de inhibición de transportadores de captación
Para evaluar la inhibición de los transportadores de captación OAT1B1 y OAT1B3, se usó un ensayo de transportador de captación in vitro de Solvo Biotechnology Inc. Se realizaron experimentos de captación con artículo 35 de prueba (AP) a 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 y 50 M, en células CHO que expresan de manera estable los transportadores SLC humanos OATP1B1 y OATP1B3. Se usó la línea celular parental CHO-K como control negativo. Se sembraron en placa células (1 x 105 en 200 l de mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco y DMEM-F12 de Ham (F-12, Lonza, Nueva Jersey, EE.UU.) complementado con butirato de sodio 5 mM) en placas de cultivo tisular de 96 pocillos convencionales y se incubaron 24 horas antes del experimento a 37ºC en 40 una atmósfera del 5% de CO2 y el 95% de aire. Antes de los experimentos, se aspiró el medio mediante succión a vacío, se lavaron las células con 2 x 100 l de tampón de Krebs-Henseleit, pH 7,3 (preparado a partir de Sigma chemicals, Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Se llevaron a cabo los experimentos de captación a 37ºC en 50 l de tampón de Krebs-Henseleit (pH 7,3) que contenía el sustrato de sonda y el AP o disolvente, respectivamente. La concentración del disolvente orgánico fue igual en cada pocillo y no superó el 1% v/v. El sustrato de sonda para el 45 ensayo de OATP1B1 fue E3S (0,1 M) y para el ensayo de OATP1B3 fue Fluo-3 (10 M). Se determinó la cantidad translocada de sustrato de sonda para cada pocillo en cpm. Se calcularon las actividades relativas a partir de la ecuación:
% de actividad = (A-B)/(C-D)x100 50
En la que A= cantidad translocada de sustrato en presencia de AP en células transfectadas, B= cantidad translocada de sustrato en presencia de AP en células parentales, C= cantidad translocada de sustrato en presencia de disolvente en células transfectadas y D= cantidad translocada de sustrato en presencia de disolvente en células parentales. La CI50 se definió como la concentración de AP necesaria para inhibir el transporte del sustrato de sonda 55 en un 50%. La CI50 se obtuvo de la ecuación logística de tres parámetros; una curva ajustada en la representación gráfica de la actividad relativa frente a la concentración de AP mediante regresión no lineal.
Evaluación in vitro de inhibición de transportadores de flujo de salida
Para evaluar la inhibición de los transportadores de flujo de salida MRP2, MRP3 y BSEP, se usó un ensayo de transportador vesicular in vitro de Solvo Biotechnology Inc. Se incubaron los artículos de prueba (AP) (a 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 y 50 M) con vesículas de membrana de transportador de flujo de salida (Solvo Biotechnology Inc.) tanto en ausencia como en presencia de ATP 4 mM para distinguir entre captación mediada por transportador y difusión pasiva de AP al interior de las vesículas. En el caso de los transportadores MRP2 y MRP3, se llevaran a 65
cabo las reacciones en presencia de glutatión 2 mM. Se preincubaron las mezclas de reacción durante diez minutos a 37ºC. Se iniciaron las reacciones mediante la adición de 25 l de MgATP 12 mM (concentración final de 4 mM en el ensayo) o tampón de ensayo para los controles de fondo. Se detuvieron las reacciones añadiendo 200 l de tampón de lavado helado y seguido inmediatamente por filtración en filtros de fibra de vidrio en un formato de 96 pocillos (placa de filtro). Se añadió tampón de centelleo a la placa de filtro lavada y secada y posteriormente se 5 realizó el recuento de centelleo. Se sometieron los sustratos de sonda a taurocolato (2 M) para las vesículas de BSEP y a E217G (1 M) para las vesículas de MRP2 y MRP3. Para todos los pocillos, se determinó la cantidad translocada del sustrato de sonda en unidades de cpm. Se calcularon las actividades relativas con la siguiente ecuación:
% de actividad = (A-B)/(C-D)x100, en la que A= cantidad translocada de sustrato en presencia de AP y ATP, B= cantidad translocada de sustrato en presencia de AP, C= cantidad translocada de sustrato en presencia de disolvente y ATP y D= cantidad translocada de sustrato en presencia de disolvente. La CI50 se definió como la concentración de AP necesaria para inhibir el transporte del sustrato de sonda en un 50%. La CI50 se obtuvo de la ecuación logística de tres parámetros; una curva ajustada en la representación gráfica de la actividad relativa frente 15 a la concentración de AP mediante regresión no lineal.
Ensayo in vitro para evaluar la actividad antiviral contra VIH
Puede someterse a prueba la eficacia antiviral contra VIH tal como sigue: Se aíslan macrófagos y linfocitos T CD4+ 20 derivados de sangre tal como se describió anteriormente (Bobardt et al., 2008). Brevemente, se purificaron CMSP humanas de sangre reciente obteniendo bandas en Ficoll-Hypaque (30 min, 800 g, 25ºC). Se purificaron células T CD4+ humanas a partir de las CMSP mediante selección positiva con perlas Dynabead anti-CD4 y posterior liberación usando Detachabead. Se cultivaron las células en medio RPMI 1640 (Invitrogen) complementado con FCS al 10%, MEM-aminoácidos, L-glutamina, MEM-vitaminas, piruvato de sodio y penicilina más estreptomicina y se 25 activaron posteriormente con el superantígeno bacteriano enterotoxina B de Staphylococcus (SEB; 100 ng/ml) y células CMSP destruidas con mitomicina C de otro donante (razón de células CMSP:CD4 10:1). Tres días tras la estimulación, se repartieron las células 1:2 en medio que contenía IL-2 (concentración final 200 unidades/ml). Entonces se repartieron los cultivos 1:2 cada 2 días en medio de IL-2 y se infectaron con VIH a los 7 días tras la estimulación. Para generar macrófagos humanos primarios, se purificaron monocitos a partir de CMSP humanas 30 mediante selección negativa y se activaron y se cultivaron a una concentración celular de 106/ml en DMEM, complementado con FCS al 10%, MEM-aminoácidos, L-glutamina, MEM-vitaminas, piruvato de sodio y penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 mg/ml) y factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) humano recombinante 50 ng/ml y se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada complementada con el 5% de CO2. Para obtener macrófagos derivados de monocitos, se permitió que las células se adhirieran al plástico 35 y se cultivaron durante 6 días para permitir la diferenciación.
Se incubaron células HeLa CD4+, células de Jurkat, linfocitos T de sangre periférica CD4+ activados y macrófagos (500.000 células/100 l) con pNL4.3GFP (virus X4) o pNL4.3-BaL-GFP (virus R5) (100 ng de p24) en presencia de concentraciones crecientes del artículo de prueba. Cuarenta y ocho horas después, se puntuó la infección 40 analizando el porcentaje de células positivas para GFP mediante FACS y se calculó la CE50.
Ensayo in vitro para evaluar la actividad antiviral contra VHB
Puede someterse a prueba la eficacia antiviral contra VHB tal como sigue: Se siembran en placa células HepG2 45 2.2.15 en placas de microtitulación de 96 pocillos. Tras 16-24 horas, se lava la monocapa confluente de células HepG2 2.2.15 y se sustituye el medio por medio completo que contiene diversas concentraciones de un compuesto de prueba por triplicado (por ejemplo, seis concentraciones semilogarítmicas). Tres días después, se sustituye el medio de cultivo por medio reciente que contiene los compuestos de prueba diluidos de manera apropiada. Seis días tras la administración inicial del compuesto de prueba, se recoge el sobrenadante del cultivo celular, se trata con 50 pronasa y luego se usa en un ensayo de qPCR TaqMan cuantitativo en tiempo real. Se detecta el ADN de VHB amplificado por PCR en tiempo real monitorizando los aumentos en las señales de fluorescencia que resultan de la degradación exonucleotídica de una molécula de sonda fluorescente extinguida que se hibrida con el ADN de VHB amplificado. Para cada amplificación por PCR se genera simultáneamente una curva patrón usando diluciones de ADN de VHB purificado. Se calcula la actividad antiviral a partir de la reducción en los niveles de ADN de VHB (CI50). 55 Entonces se emplea un ensayo de captación de colorante para medir la viabilidad celular, que se usa para calcular la toxicidad (CT50). Se calcula el índice terapéutico (IT) como CT50/CI50.
Ensayo de reacción linfocitaria mixta (MLR) in vitro para la evaluación de la actividad inmunosupresora
Se sometió a prueba la actividad inmunosupresora tal como sigue: Se purificaron poblaciones de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de la sangre de dos donantes voluntarios no relacionados normales (A y B), usando centrifugación en Histopaque. Se contaron las células y se sembraron en placa a 1 x 105 células por pocillo en placas de 96 pocillos en medios RPMI, con complementos y suero de AB humano al 2%.
Las condiciones de cultivo incluyeron: poblaciones de células A y B solas y población de células A y B mixta en ausencia o presencia de compuestos de prueba, cada uno a 6 concentraciones diferentes. Se sometieron a prueba los compuestos a dosis que oscilaban entre 10 M y 0,0001 M en incrementos de 1 log. Los pocillos control contenían una concentración comparable de vehículo (DMSO al 0,5%) a la presente en los pocillos con compuesto de prueba. Se establecieron los cultivos por triplicado en una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC en el 5% de 5 CO2 en una atmósfera humidificada. Se añadió 3H-timidina en el día 6 tras establecer el ensayo y se recogieron 24 h después. Entonces se compararon los niveles de proliferación entre las diferentes condiciones de cultivo.
Se calculó la capacidad de cada dilución de compuesto de prueba para inhibir la proliferación en la MLR como inhibición en porcentaje. Esto permitió una estimación de la CI50 (concentración de compuesto de prueba que dio 10 como resultado una reducción del 50% de los recuentos por minuto). Con el fin de calcular la CI50, se transformó el eje X en una escala logarítmica. Se usó regresión no lineal para ajustar a los puntos de datos medios. Se seleccionó una pendiente variable sigmoidea.
Análisis de ELISA de la interacción Cyp-NS5A. 15
Se usó este ensayo para medir la alteración de complejos Cyp-NS5A, lo que puede usarse para mostrar la potencia de interacción con ciclofilina D. Brevemente, se llevó a cabo la producción y purificación de las proteínas recombinantes GST, GST-CypD y Con1 NS5A-His tal como se describió anteriormente (Chatterji et al., 2010). Se recubrieron placas en tiras de 8 pocillos Nunc MaxiSorb con GST o GST-CypD durante 16 h a 4ºC y se bloquearon. 20 Se añadió NS5A-His recombinante (1 ng/ml) a los pocillos en 50 l de tampón de unión (Tris 20 mM, pH 7,9, NaCl 0,5 M, glicerol al 10%, DTT 10 mM y NP-40 al 1%) durante 16 h a 4ºC. Se detectó posteriormente NS5A-His capturada usando anticuerpos de ratón anti-His (1 g/ml) (anti-6xHis, Clontech) y anticuerpos de conejo anti-fosfatasa-peroxidasa del rábano (HRP) de ratón (dilución 1:1000). Todos los experimentos se realizaron dos veces usando dos lotes diferentes de proteínas recombinantes CypD y NS5A. 25
Análisis anti-PPIasa de la inhibición de ciclofilina
Se describe una metodología alternativa para analizar la interacción con ciclofilinas tal como sigue: Se determinó la actividad PPIasa de CypA o D recombinante, producida por la escisión por trombina de GST-CypA o D, siguiendo la 30 tasa de hidrólisis de N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida mediante quimiotripsina. La quimiotripsina sólo hidroliza la forma trans del péptido, y la hidrólisis de la forma cis, cuya concentración se maximiza usando una disolución madre disuelta en trifluoroetanol que contiene LiCl 470 mM, está limitada por la tasa de isomerización cis-trans. Se equilibró CypA o D durante 1 h a 5ºC con el artículo de prueba seleccionado usando una concentración de fármaco que oscila entre 0,1 y 20 nM. La reacción comenzó mediante la adición del péptido, y se monitorizó 35 espectrofotométricamente el cambio en la absorbancia a 10 puntos de datos por segundo. Se restaron las tasas de hidrólisis del blanco (en ausencia de CypA o D) de las tasas en presencia de CypA o D. Se analizaron las tasas iniciales de la reacción enzimática mediante análisis de regresión de primer orden de la evolución en el tiempo del cambio en la absorbancia.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Construcción de un mutante de deleción de sfaA de Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954)
1.1 Construcción del constructo de deleción de sfaA 45
Se escindió el fragmento de EcoRV-StuI de 7 kb del cósmido TL3006 (SEQ ID NO. 3) que engloba sfaA (posición de nucleótido 14396-21362, número de registro de secuencia de NCBI, FJ809786) mediante digestión con EcoRV y StuI y se ligó el fragmento aislado resultante directamente en pKC1139 que se había digerido previamente con EcoRV y se trató con fosfatasa alcalina de gamba (Roche). Este plásmido se denominó pSGK268. 50
Se realizó una deleción en marco del gen sfaA contenido dentro de este clon usando el kit de recombinación Red/ET suministrado por Gene Bridges (número de catálogo K006).
55
Se usaron dos oligonucleótidos, SfaA17161f y SfaA17825r para amplificar el marcador de neomicina del ADN de molde FRTPGK-gb2-neo-FRT suministrado en el kit usando la ADN polimerasa de KOD. Se aisló el producto amplificado resultante de ∼1,7 kb mediante electroforesis en gel y se purificó del gel con resina QiaEX.
Se transformó el plásmido pSGK268 en E. coli DH10B usando técnicas convencionales y se seleccionó en placas que contenían apramicina (50 g/ml). La introducción del constructo de deleción se realizó esencialmente siguiendo el protocolo del kit de Gene Bridges. Se hizo crecer una única colonia durante la noche en 2TY-apramicina (50 g/ml) y se transformó con el plásmido pRedET (tet) y se seleccionó en apramicina (50 g/ml) y tetraciclina (3 g/ml) a 30ºC. Se usó una única colonia para preparar un cultivo durante la noche de esta cepa en 3 ml de 2TY-10 apramicina (50 g/ml) y tetraciclina (3 g/ml) a 30ºC. Se usaron 0,5 ml de este cultivo para inocular 10 ml de 2TY-apramicina (50 g/ml) y tetraciclina (3 g/ml) a 30ºC y se hicieron crecer hasta una DO600nm ∼0,5. Se transfirieron 1,4 ml de este cultivo a cada uno de 2 tubos Eppendorf y se añadieron 50 l de arabinosa al 10% a un tubo para inducir la expresión de las proteínas de recombinación Red/ET. Se agitaron los tubos durante ∼1 hora a 37ºC. Se sedimentaron las células inducidas y no inducidas en una centrífuga de sobremesa y se lavaron dos veces con agua 15 estéril fría, resuspendiendo y centrifugando para sedimentar las células cada vez. Se suspendieron los sedimentos resultantes en aproximadamente 30-40 l de agua y se mantuvieron en hielo. Se añadió el fragmento de alteración de 1,7 kb aislado previamente a los tubos inducidos y no inducidos y se transfirió a electrocubetas de 1 mm de Biorad en hielo. Se sometieron las muestras a electroporación (micropulsador de Biorad a 1,8 kV, constante de tiempo resultante ∼4 ms) y se añadió 1 ml de 2TY (sin antibióticos) y se mezcló para retirar las células de la cubeta. 20 Se incubaron las células durante ∼3 horas a 37ºC con agitación (1100 rpm, termomezclador compacto Eppendorf) antes de sembrar en placas con 2TY que contenía apramicina 50 g/ml y kanamicina 25 g/ml y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se dispusieron las colonias de las placas de muestra inducidas en franjas sobre placas con 2TY que contenía kanamicina a 50 g/ml para purificar y confirmar la introducción del casete de resistencia a kanamicina. Se usó PCR en colonias de bacterias individuales para confirmar la introducción del casete. Se 25 prepararon plásmidos a partir de estos cultivos y se digirieron para confirmar el plásmido esperado pSGK270. Entonces se digirieron los plásmidos con NsiI para eliminar el fragmento marcador, y se volvió la ligar el resto para producir el constructo de deleción en marco de sfaA pSGK271.
1.2 Conjugación de Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) e introducción de una deleción de sfaA 30
Se transformó el plásmido pSGK271 en E. coli ET12567 pUZ8002 usando técnicas convencionales y se seleccionó en placas con 2TY que contenía apramicina (50 g/ml), kanamicina (25 g/ml) y cloranfenicol (10 g/ml). Se inoculó la cepa resultante en 3 ml de 2TY líquido que contenía apramicina (50 g/ml), kanamicina (25 g/ml) y cloranfenicol (10 g/ml) y se incubó durante la noche a 37ºC, 250 rpm. Se usaron 0,8 ml de este cultivo para inocular 10 ml de 35 2TY líquido que contenía apramicina (50 g/ml), kanamicina (25 g/ml) y cloranfenicol (10 g/ml) en un tubo Falcon de 50 ml y se incubó a 37ºC, 250 rpm, hasta que se alcanzó una DO600nm ∼0,5. Se centrifugó el cultivo resultante a 3500 rpm durante 10 minutos a 4ºC, se lavó dos veces con 10 ml de medios 2TY usando centrifugación para sedimentar las células tras cada lavado. Se resuspendió el sedimento resultante en 0,5 ml de 2TY y se mantuvo en hielo antes de su uso. Se cronometró este procedimiento para que coincidiera con la preparación completa de 40 esporas de Streptomyces descrita a continuación.
Se recogieron esporas de Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) (Biot-4370) de una placa confluente de 1-2 semanas resuspendiendo en ∼3 ml de glicerol al 20%. Se centrifugaron las esporas (5000 rpm, 10 minutos a temperatura ambiente) y se lavaron dos veces con tampón TES 50 mM antes de resuspender en 1 ml de tampón 45 TES 50 mM y repartir entre 2 tubos Eppendorf. Se sometieron a choque térmico estos tubos a 50ºC durante 10 minutos en un baño de agua antes de añadir 0,5 ml de 2TY e incubar en un termomezclador compacto Eppendorf a 37ºC durante 4-5 horas.
Se mezclaron las E. coli ET12567 pUZ8002 pSGK271 y Biot-4370 preparadas a razones de 1:1 (250 l de cada 50 cepa) y 1:3 (100 l de E. coli) y se extendieron inmediatamente sobre placas R6 y se transfirieron a un incubador a 37ºC. Tras aproximadamente 2 horas de incubación se recubrieron estas placas con 2 ml de agua estéril que contenía ácido nalidíxico para dar una concentración final en placa de 25 g/l. Se devolvieron las placas al incubador a 37ºC durante la noche antes de recubrir con 2 ml de agua estéril que contenía apramicina para dar una concentración final en placa de 20-25 g/l. Se dispusieron en parches las colonias exconjugantes que aparecieron 55 tras ∼4-7 días en medios ISP4 que contenían apramicina (25 g/L) y ácido nalidíxico (25 g/L) y se incubaron a 37ºC. Una vez que se observó crecimiento micelial adecuado, se volvieron a disponer en parches las colonias en medios ISP4 que contenían apramicina (25 g/L) a 37ºC y se permitió que esporularan. Entonces se subcultivaron las cepas tres veces (para promover la eliminación del plásmido sensible a temperatura) disponiendo en parches en ISP4 (sin antibiótico) e incubando a 37ºC durante 3-4 días. Finalmente se dispusieron en parches las cepas en ISP4 60 y se incubaron a 28ºC para permitir la esporulación completa (5-7 días). Se recogieron las esporas y se realizaron diluciones en serie en placas con ISP4 a 28ºC para permitir la selección de colonias individuales. Se dispusieron en parches doblemente las colonias individuales esporuladas en placas con ISP4 con o sin apramicina (25 g/l) para confirmar la pérdida del plásmido y se permitió que crecieran ∼7 días antes de someter a prueba la producción de
sangliferinas.
1.3 Examen de cepas para la producción de sangliferinas en tubos Falcon
Se usó un único tapón de agar de ∼7 mm de una cepa bien esporulada para inocular 7 ml de medios SM25-3 5 estériles y se incubó a 27ºC, 200 rpm, en un agitador con un desplazamiento vertical de 2”. Tras 48 horas de crecimiento, se transfirieron 0,7 ml de este cultivo a un tubo Falcon esterilizado que contenía 7 ml de medios SGP2 con resina HP20 al 5%. Se hicieron crecer los cultivos a 24ºC, 300 rpm, en un incubador con agitación con desplazamiento vertical de 1 pulgada durante 5 días antes de la recogida. Se retiraron 0,8 ml de cultivo bacteriano y se añadieron alícuotas a un tubo Eppendorf de 2 ml, asegurándose de la dispersión adecuada de la resina por todo 10 el cultivo antes de añadir las alícuotas. Se añadieron 0,8 ml de acetonitrilo y 15 l de ácido fórmico y se mezcló el tubo durante aproximadamente 30 minutos. Se aclaró la mezcla mediante centrifugación y se retiraron 170 l del extracto en un vial de HPLC y se analizaron mediante HPLC.
1.4 Análisis de las cepas para determinar la reversión al tipo natural o fenotipo de sfaA. 15
Se analizaron extractos de cepas mediante HPLC. Las cepas que producían sangliferina A y B no se analizaron adicionalmente, ya que habían revertido al tipo natural. Las cepas que carecían de producción de sangliferina A y B mostraron pequeños niveles (∼1-2 mg/l) de un pico con un tiempo de retención de 6,5 minutos que presentó la sangliferina como un cromóforo. El análisis mediante CL-EM indicó que este pico tenía una m/z 1073, -16 unidades 20 de la m/z esperada de sangliferina. Se postuló que este pico se debía a la incorporación de fenilalanina en ausencia de meta-hidroxitirosina.
Posteriormente se hicieron crecer de nuevo ocho cepas que mostraron pérdida de producción de sangliferina para evaluar si la posible mutación de sfaA podía complementarse químicamente permitiendo un procedimiento 25 mutasintético para obtener sangliferinas novedosas. Se hicieron crecer las cepas en medios de siembra SM25-3 durante 48 horas antes de transferir a los medios de producción SGP2 con resina al 5%. Tras un crecimiento adicional de 24 horas se alimentaron las cepas por triplicado con DL-meta-hidroxitirosina 2 mM (adición de 100 ul de una disolución 0,16 M en HCl 1 M) o L-fenilalanina 2 mM con una cepa no alimentada usada como control. También se alimentó a las cepas con ácido pipecólico (2 mM) en metanol) para potenciar los rendimientos de producto. Se 30 recogieron las cepas tras un crecimiento adicional de 4 días y se extrajeron y analizaron mediante HPLC. Se mostró que la meta-hidroxitirosina complementaba completamente la mutación de sfaA y la adición de L-fenilalanina aumentaba los niveles del compuesto -16 uma. Se eligió la cepa Biot-4585 para estudiar adicionalmente como mutante de deleción de sfaA.
Ejemplo 2 – Otros métodos para la construcción del constructo de deleción de sfaA
Pueden usarse otros métodos para generar mutantes de deleción de sfaA. Los ejemplos incluyen mutantes de inactivación por inserción de sfaA (tal como ejemplo 12 del documento WO2010/034243). Esta cepa se generó tal como se describe en el documento WO2010/034243, y se le dio la designación de cepa BIOT-4452. 40
En un procedimiento alternativo para generar la deleción de sfaA, se usan dos oligonucleótidos
15209F 5’-CAGAGAATTCGCGGTACGGGGCGGACGACAAGGTGTC-3’ (SEQ ID NO. 4) y
17219R 5’-GCGCATGCATGTGCCGGTGCCGGTCCGCGAGCCGCTTGG-3’ (SEQ ID NO. 5)
para amplificar una región de homología en el sentido de 5’ usando el cósmido TL3006 (SEQ ID NO. 3) como molde y la ADN polimerasa de KOD. Se trata el producto amplificado con la polinucleótido cinasa de T4 (NEB) y se clona en pUC18 que se ha desfosforilado mediante tratamiento con fosfatasa alcalina de gamba (Roche). Se comprueba el 50 constructo resultante mediante digestión de restricción y se secuencia completamente para garantizar que se genera la secuencia deseada y que no se han introducido errores durante la amplificación con polimerasa. Se digiere este constructo con EcoRI y NsiI y se analizan los productos mediante electroforesis en gel. Se escinde la banda que contiene la secuencia deseada (es decir homología en el sentido de 5’ de ∼2 kb) del gel y se purifica usando procedimientos convencionales (resina QiaEX). Se usa una segunda serie de oligonucleótidos: 55
17766F 5’-CCTCATGCATCTGGAGGACGTCGCAGGTGAATTCTGGGCG-3’ (SEQ ID NO. 6) y
19763R 5’-GGGCAAGCTTCTCCTGGCTGAGCTTGAACATCG-3’ (SEQ ID NO. 7)
para amplificar una región de homología en el sentido de 3’ usando el cósmido TL3006 (SEQ ID NO. 3) como molde y la ADN polimerasa de KOD. Se trata el producto amplificado con la polinucleótido cinasa de T4 (NEB) y se clona en pUC18 que se ha desfosforilado mediante tratamiento con fosfatasa alcalina de gamba (Roche). Se analiza el constructo resultante mediante digestión de restricción y se secuencia completamente para garantizar que se genera la secuencia deseada y que no se han introducido errores durante la amplificación con polimerasa. Se digiere este 65 constructo con HindIII y NsiI y se analizan los productos mediante electroforesis en gel. Se escinde la banda que
contiene la secuencia deseada (es decir homología en el sentido de 3’ de ∼2 kb) del gel y se purifica usando procedimientos convencionales (resina QiaEX). Se digiere el vector pKC1139 con EcoRI y HindIII y se aísla el fragmento de vector grande mediante electroforesis en gel y se purifica mediante métodos convencionales (resina QiaEX). Entonces se clonan los fragmentos de homología en el sentido de 5’ y de 3’ aislados en este fragmento de pKC1139 en una ligación de tres vías para generar el constructo de deleción de sfaA deseado. 5
En un procedimiento alternativo adicional para la generación de un constructo de deleción de sfaA se usa síntesis génica comercial de constructo de deleción (es decir Genscript u otro proveedor) para generar un constructo que contiene la secuencia deseada (SEQ ID NO. 8). Se digiere este constructo adquirido usando BamHI y XbaI para escindir la secuencia de interés y se analizan los productos mediante electroforesis en gel. Se escinde la banda que 10 contiene la secuencia deseada (∼4 kb) del gel y se purifica usando procedimientos convencionales. Se digiere el vector pKC1139 con BamHI y XbaI y se aísla el fragmento grande mediante electroforesis en gel y se purifica mediante métodos convencionales. Entonces se ligan entre sí los dos fragmentos aislados para generar el constructo de deleción de sfaA deseado.
Estos constructos de deleción de sfaA alternativos se introducen en Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) mediante conjugación y selección para el cruzamiento secundario usando los métodos descritos en el ejemplo 1.2. El crecimiento y el análisis de las cepas construidas de esta forma también siguen los métodos descritos en el ejemplo 1.2.
Ejemplo 3 – Alimentación en serie de mutante de deleción de sfaA
Se prepararon reservas de esporas de un mutante con alteración en sfaA (BIOT-4452 o BIOT-4585) tras el crecimiento en medio MAM, ISP4, ISP3 o ISP2, y se conservaron en glicerol al 20% p/v en agua destilada y se almacenaron a -80ºC. Se prepararon cultivos vegetativos (cultivos de siembra) inoculando la reserva de esporas (1% 25 v/v) en 7 ml de medio de siembra (medio SM25) en tubos de centrífuga de 50 ml con tapones de espuma. Se incubaron los tubos de cultivo a 27ºC, 250 rpm (desplazamiento vertical de 5 cm) durante 48 h. A partir del cultivo de siembra se transfirió un 10% (v/v) a 7 ml de medio de producción SGP-2 en tubos de centrífuga de 50 ml con tapones de espuma. Se llevó a cabo el cultivo a 24ºC y 300 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm). Para la producción de análogos mutasintéticos de sangliferina, se añadieron 0,05 ml de una disolución 0,32 M (en HCl 1 N) 30 del compuesto alimentado (mutasintón) a cada tubo a las 24 horas tras la inoculación para dar una concentración final de 2 mM. Adicionalmente, se añadieron 0,05 ml de una disolución 0,32 M de ácido piperázico (en metanol) a cada tubo a las 24 horas para dar una concentración final de 2 mM. Se continuó con el cultivo durante cuatro días adicionales tras la alimentación.
Se extrajeron muestras transfiriendo 0,8 ml del caldo completo a un tubo Eppendorf tapado de 2 ml. Se añadieron 0,8 ml de acetonitrilo, junto con 0,015 ml de ácido fórmico. Entonces se agitó la mezcla durante 30 minutos en un dispositivo Vibrax. Entonces se centrifugó el tubo a 13000 rpm durante 10 minutos y se retiraron 0,15 ml del sobrenadante para su análisis. Se analizaron los extractos tal como se describe en los Métodos generales.
La tabla 1 muestra los mutasintones que se alimentaron de esta forma, junto con los aductos de H+ y Na+ mediante CL-EM, la masa molecular prevista y el tiempo de retención de los productos mutasintéticos de sangliferina observados. Se muestran los picos principales, relacionados con los análogos de sangliferina A. En todos los casos, también se observaron los picos de CL-EM para los análogos de sangliferina B (Masa - 18).
Tabla 1
mutasintón alimentado
nombre del mutasintón [M-H]- observada (m/z) [M+Na]+ observada (m/z) masa molecular (uma) tiempo de retención (minutos)
ácido 2-amino-3-(4-fluoro-3-hidroxifenil)propanoico 1106,4 1130,4 1107,4 5,5
ácido 2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoico 1106,4 1130,4 1107,4 5,7
2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propionato de metilo 1106,4 1130,4 1107,4 5,7
(S)-2-amino-3-(3-hidroxi-4-metilfenil)propanoato de metilo 1102,5 1126,7 1103,5 6,0
ácido 2-amino-3-(3-fluorofenil)propanoico 1090,4 1114,5 6,1
(2S)-2-amino-3-(3-hidroxi(2-piridil))propanoato de metilo 1089,5 1113,7 1090,5 4,4
2-amino-3-(2-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo 1106,5 1130,6 1107,5 5,5
2-amino-3-(2-fluoro-3-hidroxifenil)propanoato de metilo 1106,5 1130,6 1107,5 5,1
2-amino-3-(2,6-difluoro-3-hidroxifenil)propanoato de metilo 1124,4 1148,5 1125,5 5,1
Ejemplo 4 – Aislamiento de 63-fluoro-sangliferina A, compuesto intermedio 14
Se llevó a cabo la fermentación tal como se describió en los Métodos generales utilizando 2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo y ácido DL-piperázico como precursores, añadiéndose ambos a las 26 horas. 5
Tras la recogida, se reunieron los caldos de cultivo y se ajustaron a aproximadamente pH 3 con ácido fórmico y se centrifugaron (3300g) durante 25 min para separar las células y la resina del caldo clarificado. Se desechó el caldo clarificado tras haber confirmado el ensayo que estaba presente menos del 5% del compuesto objetivo. Se agitaron las células y la resina con 2 volúmenes de acetonitrilo durante 1 h usando un agitador magnético. Se recuperó el 10 extracto de acetonitrilo o bien mediante centrifugación o bien permitiendo que se sedimentara por gravedad. Entonces se realizó una segunda extracción con acetonitrilo de las células y la resina en las mismas condiciones. Se concentraron los extractos de acetonitrilo combinados hasta un volumen acuoso residual a presión reducida y luego se ajustaron a pH 6. Esto se extrajo dos veces con acetato de etilo y los extractos orgánicos combinados se llevaron hasta la sequedad a presión reducida para dar el producto en bruto final (1,3 g). 15
Se disolvió el extracto en bruto (1,3 g) en acetato de etilo (2 ml) y se cargó en una columna de gel de sílice (10 x 2 cm) acondicionada con acetato de etilo (500 ml). Se eluyó la columna con acetato de etilo y luego con incrementos graduales en acetona (10%, 20%, 30%, etc., en acetato de etilo). Se recogieron fracciones de aproximadamente 250 ml y se identificó el compuesto objetivo mediante CL analítica, se combinaron y se llevaron hasta la sequedad. 20 Se disolvió este material (278 mg) en metanol (1,8 ml) y se purificó mediante HPLC preparativa. Se usó una columna Xterra MSC18 de Waters (10 micrómetros, 19 cm x 250 mm) con disolvente bombeado a 21 ml/min. El disolvente A fue agua y el disolvente B fue acetonitrilo. Se ejecutó la columna isocráticamente al 50% de B durante 6 minutos tras la inyección seguido por un gradiente hasta el 100% de B a los 30 minutos. Se identificaron las fracciones puras mediante HPCL-UV y se combinaron. Se llevaron estas fracciones hasta la sequedad a presión reducida para 25 producir el compuesto objetivo como un sólido amorfo blanquecino (20 mg).
Ejemplo 5 - Aislamiento de 62,63-fluoro-sangliferina A, compuesto intermedio 15
Se llevó a cabo la fermentación tal como se describió en los Métodos generales utilizando (S)-2-amino-3-(3,4-30 difluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo y ácido DL-piperázico como precursores, añadiéndose ambos a las 26 horas.
Tras la recogida, se reunieron los caldos de cultivo y se ajustaron a aproximadamente pH 3 con ácido fórmico y se centrifugaron (3300g) durante 25 min para separar las células y la resina del caldo clarificado. Se desechó el caldo 35 clarificado tras haber confirmado el ensayo que estaba presente menos del 5% del compuesto objetivo. Se agitaron
las células y la resina con 2 volúmenes de acetonitrilo durante 1 h usando un agitador magnético. Se recuperó el extracto de acetonitrilo o bien mediante centrifugación o bien permitiendo que se sedimentara por gravedad. Entonces se realizó una segunda extracción con acetonitrilo de las células y la resina en las mismas condiciones. Se concentraron los extractos de acetonitrilo combinados hasta un volumen acuoso residual a presión reducida y luego se ajustaron a pH 6. Esto se extrajo dos veces con acetato de etilo y los extractos orgánicos combinados se llevaron 5 hasta la sequedad a presión reducida para dar el producto en bruto final (1,6 g).
Se disolvió el extracto en bruto (1,6 g) en 2 ml de acetato de etilo y se cargó en una columna de gel de sílice (10 x 2 cm) acondicionada con 500 ml de acetato de etilo. Se eluyó la columna con acetato de etilo y luego con incrementos graduales en acetona (10%, 20%, 30%, etc., en acetato de etilo). Se recogieron fracciones de 10 aproximadamente 250 ml y se identificó el compuesto objetivo mediante CL analítica, se combinaron y se llevaron hasta la sequedad. Se disolvió este material (188 mg) en 1,8 ml de metanol y se purificó mediante HPLC preparativa. Se usó una columna Xterra MSC18 de Waters (10 micrómetros, 19 cm x 250 mm) con disolvente bombeado a 21 ml/min. El disolvente A fue agua y el disolvente B fue acetonitrilo. Se ejecutó la columna isocráticamente al 50% de B durante 6 minutos tras la inyección seguido por un gradiente hasta el 100% de B a los 15 30 minutos. Se llevaron estas fracciones hasta la sequedad a presión reducida para producir el compuesto objetivo como un sólido amorfo blanquecino (15 mg).
Ejemplo 6 - Aislamiento de 62-fluoro-sangliferina A, compuesto intermedio 16
Se emplearon los precursores (S)-2-amino-3-(4-fluoro-3-hidroxifenil)propanoato de metilo y ácido DL-piperázico. Se llevó a cabo según el Método general con la excepción de que los precursores se añadieron a las 27 horas.
Tras la recogida, se reunieron los caldos de cultivo y se ajustaron a aproximadamente pH 3 con ácido fórmico y se centrifugaron (3300g) durante 25 min para separar las células y la resina del caldo clarificado. Se desechó el caldo 25 clarificado tras haber confirmado el ensayo que estaba presente menos del 5% del compuesto objetivo. Se agitaron las células y la resina con 2 volúmenes de acetonitrilo durante 1 h usando un agitador magnético. Se recuperó el extracto de acetonitrilo o bien mediante centrifugación o bien permitiendo que se sedimentara por gravedad. Entonces se realizó una segunda extracción con acetonitrilo de las células y la resina en las mismas condiciones.
Se concentraron los extractos de acetonitrilo combinados hasta un volumen acuoso residual a presión reducida y luego se ajustaron a pH 6. Esto se extrajo dos veces con acetato de etilo y los extractos orgánicos combinados se llevaron hasta la sequedad a presión reducida para dar el producto en bruto aceitoso final (4,2 g).
Se disolvió el extracto en bruto (4,2 g) en 4 ml de acetato de etilo y se cargó en una columna de gel de sílice (15 x 35 2 cm) acondicionada con 500 ml de acetato de etilo. Se eluyó la columna con acetato de etilo y luego con incrementos graduales en acetona (10%, 20%, 30%, etc., en acetato de etilo). Se recogieron fracciones de aproximadamente 250 ml y se identificó el compuesto objetivo mediante CL analítica, se combinaron y se llevaron hasta la sequedad. Se disolvió este material (390 mg) en 2,4 ml de metanol y se purificó mediante HPLC preparativa. Se usó una columna Xterra MSC18 de Waters (10 micrómetros, 19 cm x 250 mm) con disolvente 40 bombeado a 21 ml/min. El disolvente A fue agua y el disolvente B fue acetonitrilo. Se ejecutó la columna isocráticamente al 50% de B durante 6 minutos tras la inyección seguido por un gradiente hasta el 100% de B a los 30 minutos. Se identificaron las fracciones puras mediante HPLC-UV y se combinaron. Se llevaron estas fracciones hasta la sequedad a presión reducida para producir el compuesto objetivo como un sólido amorfo blanquecino (38 mg). 45
Ejemplo 7 - Aislamiento de 62-metil-sangliferina A, compuesto intermedio 17
Se descongelaron reservas de esporas crioconservadas de BIOT-4585 a temperatura ambiente. Se prepararon cultivos vegetativos (cultivos de siembra) transfiriendo 0,4 ml de reserva de esporas a 400 ml de medio SM25 en 50 matraces Erlenmeyer de 2 l con tapón de espuma. Se llevó a cabo el cultivo durante 48 horas a 27ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm). A partir del cultivo de siembra, se transfirieron 20 ml a 400 ml de medio de producción SGP2 + HP20 al 5% en matraces Erlenmeyer de 2 l con tapón de espuma. Tras 24 horas de cultivo a 24ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm), se añadieron 2 ml de una disolución 200 mM de (S)-2-amino-3-(3-hidroxi-4-metilfenil)propanoato de metilo en ácido clorhídrico 1 M y 2 ml de una disolución metanólica 400 mM de 55 ácido DL-piperázico a cada matraz de producción para dar una concentración final 1 mM de los enantiómeros individuales de los precursores. Se continuó con el cultivo durante cuatro días adicionales a 24ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm).
Se reunieron los caldos de cultivo y se ajustaron a aproximadamente pH 3 con ácido fórmico y se centrifugaron 60 (3300g) durante 25 min para separar las células y la resina del caldo clarificado. Se desechó el caldo clarificado tras haber confirmado el ensayo que estaba presente menos del 5% del compuesto objetivo. Se agitaron las células y la resina con 2 volúmenes de acetonitrilo durante 1 h usando un agitador de paletas superior. Se recuperó el extracto de acetonitrilo permitiendo que se sedimentara por gravedad. Entonces se realizó una segunda extracción con acetonitrilo de las células y la resina en las mismas condiciones. Se concentraron los extractos de acetonitrilo 65 combinados hasta un volumen acuoso residual a presión reducida y luego se ajustaron a pH 6. Esto se extrajo dos
veces con acetato de etilo y los extractos orgánicos combinados se llevaron hasta la sequedad a presión reducida para dar el producto en bruto final (7,6 g).
Se disolvió el extracto en bruto (7,6 g) en 5 ml de acetato de etilo y se cargó en una columna de gel de sílice (15 x 2 cm) acondicionada con 500 ml de acetato de etilo. Se eluyó la columna con acetato de etilo y luego con 5 incrementos graduales en acetona (10%, 20%, 30%, etc., en acetato de etilo). Se recogieron fracciones de aproximadamente 250 ml y se identificó el compuesto objetivo mediante CL analítica, se combinaron y se llevaron hasta la sequedad. Se disolvió este material (319 mg) en 2,4 ml de metanol y se purificó mediante HPLC preparativa. Se usó una columna Xterra MSC18 de Waters (10 micrómetros, 19 cm x 250 mm) con disolvente bombeado a 21 ml/min. El disolvente A fue agua y el disolvente B fue acetonitrilo. Se ejecutó la columna 10 isocráticamente al 50% de B durante 6 minutos tras la inyección seguido por un gradiente hasta el 100% de B a los 30 minutos. Se identificaron las fracciones puras mediante HPLC-UV y se combinaron. Se llevaron estas fracciones hasta la sequedad a presión reducida para producir el compuesto objetivo como un sólido amorfo blanquecino (14,9 mg).
Ejemplo 8 - Aislamiento de 61-deshidroxi-sangliferina A, compuesto intermedio 18
Se descongelaron reservas de esporas crioconservadas de BIOT-4585 a temperatura ambiente. Se prepararon cultivos vegetativos (cultivos de siembra) transfiriendo 0,4 ml de reserva de esporas a 400 ml de medio SM25 en matraces Erlenmeyer de 2 l con tapón de espuma. Se llevó a cabo el cultivo durante 48 horas a 27ºC y 250 rpm 20 (desplazamiento vertical de 2,5 cm). A partir del cultivo de siembra, se transfirieron 500 ml a 4,5 l de medio de producción SGP2 + HP20 al 5% en un fermentador Applikon de 7 l y se cultivó a 24ºC, 400 rpm (control DOT en cascada), flujo de aire de 2,5 l/min y el 30% de DOT (control de agitación en cascada). Tras 24 horas de cultivo, se añadieron 7,5 ml de una disolución 667 mM de ácido (S)-2-amino-3-fenilpropanoico en ácido clorhídrico 1 M al fermentador para dar una concentración final 1 mM del precursor. Se continuó con el cultivo durante cuatro días 25 adicionales a 24ºC, 400 rpm (control DOT en cascada), flujo de aire de 2,5 l/min y el 30% de DOT (control de agitación en cascada).
Se reunieron los caldos de cultivo y se ajustaron a aproximadamente pH 3 con ácido fórmico y se centrifugaron (3300g) durante 25 min para separar las células y la resina del caldo clarificado. Se desechó el caldo clarificado tras 30 haber confirmado el ensayo que estaba presente menos del 5% del compuesto objetivo. Se agitaron las células y la resina con 2 volúmenes de acetonitrilo durante 1 h usando un agitador de paletas superior. Se recuperó el extracto de acetonitrilo permitiendo que se sedimentara por gravedad. Entonces se realizó una segunda extracción con acetonitrilo de las células y la resina en las mismas condiciones, pero recuperándose el segundo extracto por centrifugación. Se concentraron los extractos de acetonitrilo combinados hasta un volumen acuoso residual a 35 presión reducida y luego se ajustaron a pH 6. Esto se extrajo dos veces con acetato de etilo y los extractos orgánicos combinados se llevaron hasta la sequedad a presión reducida para dar el producto en bruto final (55 g).
Se suspendió el extracto en bruto (55 g) en metanol al 80% en agua y se extrajo con 300 ml de hexano dos veces. Se encontró el compuesto objetivo en parte de metanol/agua y se llevó hasta la sequedad. Se disolvió este extracto 40 seco (48 g) en 30 ml de acetato de etilo y se cargó en una columna de gel de sílice (20 x 5 cm) acondicionada con 1 l de acetato de etilo. Se eluyó la columna con acetato de etilo y luego con incrementos graduales en acetona (10%, 20%, 30%, etc. en acetato de etilo). Se recogieron fracciones de aproximadamente 250 ml y se identificó el compuesto objetivo mediante CL analítica, se combinaron y se llevaron hasta la sequedad. Se disolvió este material (813 mg) en metanol y se purificó mediante HPLC preparativa. Se usó una columna Xterra MSC18 de Waters (10 45 micrómetros, 19 cm x 250 mm) con disolvente bombeado a 21 ml/min. El disolvente A fue agua y el disolvente B fue acetonitrilo. Se ejecutó la columna isocráticamente al 50% de B durante 6 minutos tras la inyección seguido por un gradiente hasta el 100% de B a los 30 minutos. Se identificaron las fracciones puras mediante HPLC-UV y se combinaron. Se llevaron estas fracciones hasta la sequedad a presión reducida para producir el compuesto objetivo como un sólido amorfo blanquecino (34 mg). 50
Ejemplo 9 – Aislamiento de 58-des(3-hidroxifenil)-58-(3-hidroxi (2-piridil)-sangliferina A, compuesto intermedio 19
Se emplearon los precursores (2S)-2-amino-3-(3-hidroxi(2-piridil))propanoato de metilo y ácido DL-piperázico. Se llevó a cabo según el Método general con la excepción de que el desplazamiento vertical del incubador durante el 55 cultivo vegetativo (siembra) fue de 2,5 cm.
Se reunieron los caldos de cultivo y se ajustaron a aproximadamente pH 3 con ácido fórmico y se centrifugaron (3300g) durante 25 min para separar las células y la resina del caldo clarificado. Se desechó el caldo clarificado tras haber confirmado el ensayo que estaba presente menos del 5% del compuesto objetivo. Se agitaron las células y la 60 resina con 2 volúmenes de acetonitrilo durante 1 h usando un agitador de paletas superior. Se recuperó el extracto de acetonitrilo permitiendo que se sedimentara por gravedad. Entonces se realizó una segunda extracción con acetonitrilo de las células y la resina en las mismas condiciones. Se concentraron los extractos de acetonitrilo combinados hasta un volumen acuoso residual a presión reducida y luego se ajustaron a pH 6. Esto se extrajo dos veces con acetato de etilo y los extractos orgánicos combinados se llevaron hasta la sequedad a presión reducida 65 para dar el producto en bruto final (7 g).
Se disolvió el extracto en bruto (7) en 4 ml de acetato de etilo y se cargó en una columna de gel de sílice (15 x 2 cm) acondicionada con 500 ml de acetato de etilo. Se eluyó la columna con acetato de etilo y luego con incrementos graduales en acetona (10%, 20%, 30%, etc., en acetato de etilo hasta el 100% de acetona, luego el 1% de metanol gradualmente hasta el 5% de metanol en acetona). Se recogieron fracciones de aproximadamente 250 ml y se 5 identificó el compuesto objetivo mediante CL analítica, se combinaron y se llevaron hasta la sequedad. Se disolvió este material (204 mg) en metanol y se purificó mediante HPLC preparativa. Se usó una columna Xterra MSC18 de Waters (10 micrómetros, 19 cm x 250 mm) con disolvente bombeado a 21 ml/min. El disolvente A fue agua y el disolvente B fue acetonitrilo. Se ejecutó la columna isocráticamente al 50% de B durante 6 minutos tras la inyección seguido por un gradiente hasta el 100% de B a los 30 minutos. Se identificaron las fracciones puras mediante HPLC-10 UV y se combinaron. Se llevaron estas fracciones hasta la sequedad a presión reducida para producir el compuesto objetivo como un sólido amorfo blanquecino (4 mg).
Ejemplo 10 - Aislamiento de 61-deshidroxi-61-fluoro-sangliferina A, compuesto intermedio 20
Se descongelaron reservas de esporas crioconservadas de BIOT-4585 a temperatura ambiente. Se prepararon cultivos vegetativos (cultivos de siembra) transfiriendo 0,4 ml de reserva de esporas a 400 ml de medio SM25 en matraces Erlenmeyer de 2 l con tapón de espuma. Se llevó a cabo el cultivo durante 48 horas a 27ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm). A partir del cultivo de siembra, se transfirieron 20 ml a 400 ml de medio de producción SGP2 + HP20 al 5% en matraces Erlenmeyer de 2 l con tapón de espuma. Tras 24 horas de cultivo a 20 24ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm), se añadieron 2 ml de una disolución 400 mM de ácido 2-amino-3-(3-fluorofenil)propanoico en ácido clorhídrico 1 M y 2 ml de una disolución metanólica 400 mM de ácido DL-piperázico a cada matraz de producción para dar una concentración final 1 mM de los enantiómeros individuales de los precursores. Se continuó con el cultivo durante cuatro días adicionales a 24ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm). 25
Se reunieron los caldos de cultivo y se ajustaron a aproximadamente pH 3 con ácido fórmico y se centrifugaron (3300g) durante 25 min para separar las células y la resina del caldo clarificado. Se desechó el caldo clarificado tras haber confirmado el ensayo que estaba presente menos del 5% del compuesto objetivo. Se agitaron las células y la resina con 2 volúmenes de acetonitrilo durante 1 h usando un agitador de paletas superior. Se recuperó el extracto 30 de acetonitrilo permitiendo que se sedimentara por gravedad. Entonces se realizó una segunda extracción con acetonitrilo de las células y la resina en las mismas condiciones. Se obtuvo un tercer extracto mediante centrifugación de la mezcla residual de células y resina. Se concentraron los extractos de acetonitrilo combinados hasta un volumen acuoso residual a presión reducida y luego se ajustaron a pH 6. Esto se extrajo dos veces con acetato de etilo y los extractos orgánicos combinados se llevaron hasta la sequedad a presión reducida para dar el 35 producto en bruto final (10,5 g).
Se disolvió el extracto en bruto (10,5 g) en 7 ml de acetato de etilo y se cargó en una columna de gel de sílice (15 x 2 cm) acondicionada con 500 ml de acetato de etilo. Se eluyó la columna con acetato de etilo y luego con incrementos graduales en acetona (10%, 20%, 30%, etc., en acetato de etilo). Se recogieron fracciones de 40 aproximadamente 250 ml y se identificó el compuesto objetivo mediante CL analítica, se combinaron y se llevaron hasta la sequedad. Se disolvió este material (342 mg) en metanol y se purificó mediante HPLC preparativa. Se usó una columna Xterra MSC18 de Waters (10 micrómetros, 19 cm x 250 mm) con disolvente bombeado a 21 ml/min. El disolvente A fue agua y el disolvente B fue acetonitrilo. Se ejecutó la columna isocráticamente al 53% de B durante 30 minutos tras la inyección. Se identificaron las fracciones puras mediante HPLC-UV y se combinaron. Se llevaron 45 estas fracciones hasta la sequedad a presión reducida para producir el compuesto objetivo como un sólido amorfo blanquecino (6 mg).
Ejemplo 11 – Síntesis de (2-(1,2-oxazinan-2-il)-2-oxoetil)fosfonato de dietilo
A una disolución de 21-1 (ChemCollect, Alemania) (100 mg, 0,81 mmol), Et3N (246 mg, 2,43 mmol) en DCM seco (5 ml) se le añadió gota a gota cloruro de cloracetilo (138 mg, 1,22 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 3 h, se vertió en agua helada y se extrajo con acetato de etilo. Se lavó la fase 55 orgánica con salmuera y se secó sobre Na2SO4, se filtró, se concentró a vacío. Se usó el residuo (21-2) para la siguiente etapa sin purificación adicional. (123 mg, rendimiento del 90%).
Se agitó una mezcla de 21-2 (123 mg, 0,75 mmol) y fosfito de trietilo (250 mg, 1,50 mmol) a 140ºC durante 6 h. Se
enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para producir 21.
Síntesis alternativa de (2-(1,2-oxazinan-2-il)-2-oxoetil)fosfonato de dietilo, 21
Procedimiento general para la preparación de 21a-2
10
A una disolución de t-BuOK (84,0 g, 0,75 mol) en tetrahidrofurano (2,0 l) se le añadió 21a-1 (50,0 g, 0,38 mol) en porciones a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadió 1,4-dibromobutano (81,2 g, 0,38 mol) gota a gota a temperatura ambiente. Entonces se agitó la mezcla a 80ºC durante 16 h. Tras enfriar, se añadió agua (2000 ml), se extrajo la mezcla con acetato de etilo (2 x 1000 ml). Se secó 15 la fase orgánica combinada sobre Na2SO4 anhidro durante 16 h, tras filtración y concentración, se purificó el residuo mediante cromatografía en columna en gel de sílice (eluyente: éter de petróleo:acetato de etilo = de 100:1 a 10:1) para dar 21a-2 (57 g) como un aceite incoloro.
Procedimiento general para la preparación de 21a-3 20
A una disolución de 21a-2 (55 g, 0,29 mol) en terc-butil metil éter, TBME (80 ml) se le añadió una disolución de HCl 4 N (600 ml, en TBME) a temperatura ambiente, se agitó la mezcla durante 3 h a temperatura ambiente. Se filtró el 25 sólido precipitado y se lavó con TBME (50 ml) para dar 21a-3 (30 g) como un sólido blanco.
Procedimiento general para la preparación de 21
30
A una disolución agitada de 21a-4 (35 g, 0,18 mol), hidroxibenzotriazol (HOBT) (29 g, 0,21 mol) y Et3N (71 ml, 0,51 mol) en diclorometano anhidro (550 ml) se le añadió 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCI) (41 g, 0,21 mol) en porciones a 0ºC. Se agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante 0,5 h, entonces se añadió 21a-3 (24 g, 0,20 mol) a 0ºC y se agitó durante 16 h. Entonces la CCF (éter de petróleo/acetato de etilo: 3/1) mostró que la 35 reacción estaba completa. En ese momento, se vertió lentamente la mezcla de reacción en agua (500 ml) con agitación vigorosa.
Se extrajo la mezcla con diclorometano (2x200 ml). Se lavó la fase orgánica combinada con salmuera (2x100 ml), se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró para proporcionar el producto en bruto. La cromatografía (éter de 40 petróleo/acetato de etilo, de 100:1 a 10:1) dio 21 (38 g) como un aceite amarillo.
Ejemplo 12 – Síntesis de (2-oxo-2-(piridin-2-ilamino)etil)fosfonato de dietilo
A una disolución de 22-1 (1 g, 10,6 mmol), Et3N (1,075 g, 10,6 mmol) en cloruro de metileno seco (50 ml) se le añadió gota a gota cloruro de cloroacetilo (1,2 g, 10,6 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 3 h, se vertió en agua helada y se extrajo con acetato de etilo. Se lavó la fase orgánica con salmuera y se 5 secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró a vacío .Se purificó el residuo mediante cromatografía Combiflash en fase inversa para producir 22-2.
Se agitó una mezcla de 22-2 (170 mg, 1,00 mmol) y fosfito de trietilo (332 mg, 2,00 mmol) a 140ºC durante 6 h. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para 10 producir 22.
Ejemplo 13 - Preparación del compuesto 23
15
A una disolución agitada de 14 (430 mg, 0,38 mmol), (DHQ)2PHAL (18,6 mg, 0,024 mmol), tetraóxido de osmio (0,156 ml, 0,012 mmol) en alcohol terc-butílico (2,5% en peso, 0,079 mmol/ml) y metanosulfonamida (74 mg, 0,77 mmol) en 20 ml de alcohol terc-butílico se le añadió a temperatura ambiente una disolución de ferricianuro de potasio (382 mg, 1,16 mmol) y carbonato de potasio (160 mg, 1,16 mmol) en 20 ml de agua, dando como resultado 20 una emulsión marrón. Tras 2 h, se añadió una disolución de sulfito de sodio, y se continuó con la agitación durante 20 min. Se extrajo la mezcla resultante con acetato de etilo (3 x 50 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida, se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida de fase inversa para producir 23-2 como un sólido blanco.
A una disolución agitada de 23-2 (240 mg, 0,21 mmol) en 24 ml de una mezcla 2:1 de THF y agua se le añadió peryodato de sodio (91 mg, 0,42 mmol). Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 3 h, y entonces se añadió bicarbonato de sodio saturado acuoso. Se extrajo esta mezcla con tres porciones de acetato de etilo. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con una porción de agua y dos porciones de salmuera saturada, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. Se purificó el residuo 30 mediante cromatografía ultrarrápida de fase inversa para producir 23-3.
A una disolución de (2-(metoxi(metil)amino)-2-oxoetil)fosfonato de dietilo (91 mg, 0,368 mmol) en THF (5,0 ml) se le
añadió NaH (2,8 mg, 0,1104 mmol) en THF anhidro (0,2 ml) a 0ºC con agitación. Entonces se agitó la disolución a 20ºC hasta que se volvió transparente. Entonces se añadió 23-3 (70 mg, 0,092 mmol) a la disolución transparente y se agitó la mezcla a 20ºC durante 2 h. Se extinguió la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 30 ml). Se lavó la fase orgánica con salmuera y se secó sobre Na2SO4, se filtró y se redujo a vacío. Se purificó el residuo mediante HPLC preparativa para obtener 23 como un sólido blanco. 5
Ejemplo 14 - Preparación del compuesto 24
A una disolución de 21 (42 mg, 0,168 mmol) en THF (2,0 ml) se le añadió NaH (1,2 mg, 0,05 mmol) en THF anhidro (0,2 ml) a 0ºC con agitación. Entonces se agitó la disolución a 20ºC hasta que se volvió transparente. Entonces se añadió 23-3 (30 mg, 0,042 mmol) a la disolución transparente y se agitó la mezcla a 20ºC durante 2 h. Se extinguió la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 ml). Se lavó la fase orgánica con salmuera y se secó sobre Na2SO4, se filtró y se redujo a vacío. Se purificó el residuo mediante HPLC preparativa para obtener 24 15 como un sólido blanco.
Ejemplo 15 - Preparación del compuesto 25
20
A una disolución de 22 (48 mg, 0,168 mmol) en THF (2,0 ml) se le añadió NaH (1,2 mg, 0,05 mmol) en THF anhidro (0,2 ml) a 0ºC con agitación. Entonces se agitó la disolución a 20ºC hasta que se volvió transparente. Entonces se añadió 23-3 (30 mg, 0,042 mmol) a la disolución transparente y se agitó la mezcla a 20ºC durante 2 h. Se extinguió la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 ml). Se lavó la fase orgánica con salmuera y se 25 secó sobre Na2SO4, se filtró y se redujo a vacío. Se purificó el residuo mediante HPLC preparativa para obtener 25 como un sólido blanco.
Ejemplo 16 – Preparación del compuesto 26
A una disolución de 23 (13 mg, 0,015 mmol) disuelta en dioxano (1 ml) se le añadió una disolución acuosa de HCl (2 M, 0,080 ml, 0,16 mmol). Se agitó la reacción a 20ºC durante 24 h y se extinguió la reacción con agua y se extrajo con acetato de etilo (3 x 10 ml).Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio y se evaporó. Se purificó el residuo mediante HPLC preparativa para obtener 26 como un sólido blanco.
Ejemplo 17 - Preparación del compuesto 27
A una disolución agitada de 17 (99 mg, 0,09 mmol), (DHQ)2PHAL (4,2 mg, 0,0054 mmol), tetraóxido de osmio 10 (0,034 ml, 0,0027 mmol) en alcohol terc-butílico (al 2,5% en peso, 0,079 mmol/ml) y metanosulfonamida (18 mg, 0,18 mmol) en 5 ml de alcohol terc-butílico se le añadió a temperatura ambiente una disolución de ferricianuro de potasio (90 mg, 0,27 mmol) y carbonato de potasio (37 mg, 0,27 mmol) en 5 ml de agua, dando como resultado una emulsión marrón. Tras 2 h, se añadió una disolución de sulfito de sodio, y se continuó con la agitación durante 20 min. Se extrajo la mezcla resultante con acetato de etilo (3 x 20 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas 15 con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida, se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida de fase inversa para producir 27-2 como un sólido blanco.
A una disolución agitada de 27-2 (40 mg, 0,035 mmol) en 3 ml de una mezcla 2:1 de THF y agua se le añadió peryodato de sodio (15 mg, 0,07 mmol). Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 3 h, y 20 entonces se añadió bicarbonato de sodio saturado acuoso. Se extrajo esta mezcla con tres porciones de acetato de etilo. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con una porción de agua y dos porciones de salmuera saturada, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida de fase inversa para producir 27-3 como un sólido blanco.
A una disolución de 21 (28 mg, 0,104 mmol) en THF (2,0 ml) se le añadió NaH (0,75 mg, 0,0312 mmol) en THF anhidro (0,2 ml) a 0ºC con agitación. Entonces se agitó la disolución a 20ºC hasta que se volvió transparente. Entonces se añadió 27-3 (19,6 mg, 0,026 mmol) a la disolución transparente y se agitó la mezcla a 20ºC durante 2 h. Se extinguió la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 10 ml). Se lavó la fase orgánica con salmuera y se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida. Se purificó el residuo mediante HPLC 30 preparativa para obtener 27 como un sólido blanco.
Ejemplo 18 - Preparación del compuesto 28
A una disolución agitada de 15 (349 mg, 0,31 mmol), (DHQ)2PHAL (14 mg, 0,0186 mmol), tetraóxido de osmio (0,117 ml, 0,0093 mmol) en alcohol terc-butílico (al 2,5% en peso, 0,079 mmol/ml) y metanosulfonamida (59 mg, 0,62 mmol) en 15 ml de alcohol terc-butílico se le añadió a temperatura ambiente una disolución de ferricianuro de 5 potasio (128 mg, 0,93 mmol) y carbonato de potasio (306 mg, 0,93 mmol) en 15 ml agua, dando como resultado una emulsión marrón. Tras 2 h, se añadió una disolución de sulfito de sodio, y se continuó con la agitación durante 20 min. Se extrajo la mezcla resultante con acetato de etilo (3 x 50 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida, se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida de fase inversa para producir 28-2 como un sólido blanco. 10
A una disolución agitada de 28-2 (170 mg, 0,1466 mmol) en 15 ml de una mezcla 2:1 de THF y agua se le añadió peryodato de sodio (62 mg, 0,2931 mmol). Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 3 h, y entonces se añadió bicarbonato de sodio saturado acuoso. Se extrajo esta mezcla con tres porciones de acetato de etilo. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con una porción de agua y dos porciones de salmuera saturada, se 15 secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida de fase inversa para producir 28-3 como un sólido blanco.
A una disolución de 21 (41 mg, 0,155 mmol) en THF (1,0 ml) se le añadió NaH (2,3 mg, 0,0575 mmol) en THF anhidro (0,2 ml) a 0ºC con agitación. Entonces se agitó la disolución a 20ºC hasta que se volvió transparente. 20 Entonces se añadió 28-3 (30 mg, 0,0387 mmol) a la disolución transparente y se agitó la mezcla a 20ºC durante 2 h. Se extinguió la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 ml). Se lavó la fase orgánica con salmuera y se secó sobre Na2SO4, se filtró, se evaporó. Se purificó el residuo mediante HPLC preparativa para obtener 28 como un sólido blanco.
Ejemplo 19 - Preparación del compuesto 29
A una disolución de 22 (42 mg, 0.155 mmol) en THF (1.0 ml) se le añadió NaH (2,3 mg, 0,0575 mmol) en THF anhidro (0,2 ml) a 0ºC con agitación. Entonces se agitó la disolución a 20ºC hasta que se volvió transparente. Entonces se añadió 28-3 (30 mg, 0,0387 mmol) a la disolución transparente y se agitó la mezcla a 20ºC durante 2 h. Se extinguió la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 ml). Se lavó la fase orgánica con 5 salmuera y se secó sobre Na2SO4, se filtró, se evaporó. Se purificó el residuo mediante HPLC preparativa para obtener 29 como un sólido blanco.
Ejemplo 20 - Preparación del compuesto 30
A una disolución de (2-(metoxi(metil)amino)-2-oxoetil)fosfonato de dietilo (37 mg, 0,155 mmol) en THF (1,0 ml) se le añadió NaH (2,3 mg, 0,0575 mmol) en THF anhidro (0,2 ml) a 0ºC con agitación. Entonces se agitó la disolución a 20ºC hasta que se volvió transparente. Entonces se añadió 28-3 (30 mg, 0,0387 mmol) a la disolución transparente y 15 se agitó la mezcla a 20ºC durante 2 h. Se extinguió la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 ml). Se lavó la fase orgánica con salmuera y se secó sobre Na2SO4, se filtró, se evaporó. Se purificó el residuo mediante HPLC preparativa para obtener 30 como un sólido blanco.
Ejemplo 21 – Datos biológicos – replicón de VHC y análisis 20
Se analizaron los compuestos en el ensayo de replicón de genotipo 1b usando células Huh5.2 tal como se describe en los Métodos generales. Se incluyeron ciclosporina A, 1, DEBIO-025, 2, sangliferina A, 5, y el hidroximacrociclo, 6 como comparación.
Compuesto
CE50 (M) CC50 (M) Índice de selectividad (CC50/CE50)
Ciclosporina A, 1
0,62
DEBIO-025, 2
0,096 11,2
Sangliferina A, 5
0,318 9,1 28,7
Hidroximacrociclo, 6
8,4 83,6 9,9
0,067 >100 >1493
0,033 >100 >3030
0,066 >100 >1515
0,1 >100 >1000
0,121 >100 >826
Tal como puede observarse, los compuestos de la invención, 23, 24, 25, 26 y 27 son todos ellos significativamente más potentes en el ensayo de replicón Huh5.2 (tal como se muestra por la baja CE50), con una selectividad significativamente mejor frente a la línea celular (tal como se muestra mediante un alto índice de selectividad) en comparación con CsA, Debio-025, SfA y el hidroximacrociclo. 30
Ejemplo 22 – Datos biológicos - actividad contra VIH
Se analizaron los compuestos en un ensayo antiviral contra VIH usando células HeLa tal como se describe en los Métodos generales. Se incluyeron ciclosporina A, 1, DEBIO-025, 2 y los antivirales contra VIH emtricitabina y 35 tenofovir como comparación.
Compuesto
Células HeLa CE50 (M)
Ciclosporina A, 1
5,3
DEBIO-025, 2
1,5
Emtricitabina
0,4
Tenofovir
1,05
0,13
Tal como puede observarse, el compuesto de la invención, 24, es significativamente más potente que CsA, DEBIO-025, emtricitabina y tenofovir en la inhibición de la infección por VIH en este ensayo.
Ejemplo 23 – Datos biológicos – PK oral e i.v. in vivo en ratón 5
Para evaluar la farmacocinética de los compuestos en un entorno in vivo, se administraron los compuestos por v.o. a 10 ó 5 mg/kg y por vía i.v. a 1 mg/kg a grupos de ratones CD1. Se llevaron a cabo análisis farmacocinéticos tal como se describe en los Métodos generales. Los parámetros PK se muestran a continuación.
Compuesto
Nivel de dosis (mg/kg) Aclaramiento (l/h/kg) AUCfinal por v.o. (ng*h/ml)
Sangliferina A, 5
0,054
0,039
0,017
Tal como puede observarse, los compuestos 23 y 24 tienen aclaramiento reducido y exposición oral aumentada (tal como se muestra mediante una alta AUCfinal por v.o.), en comparación con sangliferina A.
Ejemplo 24 – Datos biológicos - inhibición de actividad PPIasa de CypA 15
Para evaluar la inhibición directa de la peptidil-prolil cis-trans isomerasa (PPIasa) de CypA, se usó un método tal como se describe en los Métodos generales. Se incluyeron ciclosporina A, 1, DEBIO-025, 2 y sangliferina A, 5 como controles.
Compuesto
PPIasa de CypA CI50 (nM)
Ciclosporina A, 1
9,7
DEBIO-025, 2
0,8
Sangliferina A, 5
2,4
0,33
0,31
1,15
0,35
Tal como puede observarse, los compuestos de la invención, 23, 24, 25 y 27 inhiben todos ellos la actividad PPIasa de CypA de manera más potente que sangliferina A, DEBIO-025 y ciclosporina A.
Ejemplo 25 – Datos biológicos - inhibición de transportadores de bilirrubina 25
Para evaluar el potencial de inhibición inespecífica de los transportadores de bilirrubina, que se piensa que es el motivo de la hiperbilirrubinemia limitante de la dosis observada con DEBIO-025, se llevó a cabo un análisis in vitro de inhibición de transportador tal como se describe en los Métodos generales.
Compuesto
OATP1B1 CI50 (M) OATP1B3 CI50 (M) MRP2 CI50 (M) MRP3 CI50 (M)
Ciclosporina A, 1
0,85 0,13 4,1 3,1
DEBIO-025, 2
0,45 0,19 16,0 >50
4,3 1,8 >50 >50
Tal como puede observarse, el compuesto de la invención, 24, muestra mucho menos inhibición de transportadores de bilirrubina conjugados y no conjugados en comparación con DEBIO-025 y ciclosporina A.
Ejemplo 26 – Datos biológicos - inhibición de transportadores xenobióticos 35
Para evaluar el potencial de las interacciones fármaco-fármaco (DDI) a través de la inhibición de transportadores xenobióticos, se llevó a cabo un análisis in vitro de la inhibición de glicoproteína P (Pgp/MDR1) y bomba de exportación de sales biliares (BSEP) tal como se describe en los Métodos generales.
Compuesto
Pgp CI50 (M) BSEP CI50 (M)
Ciclosporina A, 1
0,73 0,46
DEBIO-025, 2
0,72 0,18
>50 12,3
Tal como puede observarse, el compuesto de la invención, 24, muestra mucho menos inhibición de transportadores xenobióticos, implicados potencialmente en las interacciones fármaco-fármaco, en comparación con DEBIO-025 y ciclosporina A.
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A lo largo de toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de número enteros establecido pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de número enteros o etapas. 65
Lista de secuencias
<110> Biotica Technology Limited
Moss, Steven James
Gregory, Matthew Alan 5
Wilkinson, Barrie
<120> COMPUESTOS NOVEDOSOS Y MÉTODOS PARA SU PRODUCCIÓN
<130> BOA-P1393PCT 10
<150> Documento GB1105293.3
<151>
<150> Documento GB1113629.8 15
<151>
<150> Documento GB1202060.8
<151>
<160> 8
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1 25
<211> 77
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 30
<223> Cebador
<400> 1
35
<210> 2
<211> 78
<212> ADN
<213> Artificial 40
<220>
<223> Cebador
<400> 2 45
<210> 3
<211> 46596 50
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cósmido 55
<400> 3
<210> 4
<211> 37
<212> ADN 5
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 4
<210> 5 15
<211> 39
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 20
<223> Cebador
<400> 5
<210> 6
<211> 40 5
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador 10
<400> 6
<210> 7
<211> 33
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 7
<210> 8
<211> 3994
<212> ADN 30
<213> Artificial
<220>
<223> Fragmento de ADN
<400> 8

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
  2. 1. Compuesto de fórmula (I):
    5
    Fórmula (I)
    en la que:
    el resto X1 representa -OR1, -NR1R2 o R3;
    R1, R2 y R3 representan independientemente alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquenilcicloalquenilo, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, alquenilarilo o alquenilheteroarilo, pudiendo estar cualquiera de estos grupos opcionalmente sustituido con 15 arilo monocíclico o heteroarilo monocíclico;
    y en la que uno o más átomos de carbono de R1, R2 y R3 que no forman parte de un grupo arilo o heteroarilo están opcionalmente reemplazados por un heteroátomo seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 y en el que uno o más átomos de carbono de R1, R2 y R3 están opcionalmente 20 reemplazados por carbonilo;
    o R1 y R2 están unidos de manera que NR1R2 representa un anillo heterocíclico saturado o insaturado que contiene el átomo de nitrógeno especificado y en el que uno o más átomos de carbono de dicho anillo están opcionalmente reemplazados por un heteroátomo adicional seleccionado de O, N y S(O)p en el que p 25 representa 0, 1 ó 2 y en el que uno o más átomos de carbono de dicho anillo están opcionalmente reemplazados por carbonilo y pudiendo estar el anillo heterocíclico opcionalmente condensado con un anillo de arilo o heteroarilo;
    y en la que uno o más átomos de carbono de un grupo R1, R2 y R3 pueden estar opcionalmente sustituidos 30 con uno o más átomos de halógeno;
    o R1 y/o R2 representa hidrógeno;
    R9 representa H u OH; 35
    n representa un enlace sencillo o doble, con la salvedad de que cuando n representa un doble enlace R9 representa H;
    R4, R5, R6, R7 y R8 representan independientemente H, F, Cl, Br, alquenilo o alquilo en los que uno o más 40 átomos de carbono de dicho grupo alquilo están opcionalmente reemplazados por un heteroátomo seleccionado de O, N y S(O)p en el que p representa 0, 1 ó 2 y en los que uno o más átomos de carbono de dicho grupo alquilo están opcionalmente reemplazados por carbonilo y pudiendo estar el grupo alquilo opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno;
    X2, X3, X4, X5 y X6 representan independientemente C o N, y en el caso de que cualquiera de estos grupos
    represente N, el sustituyente unido está ausente;
    con la condición de que cuando R4, R6, R7 y R8 representan todos H y X2, X3, X4, X5 y X6 representan todos C, entonces R5 no puede representar OH, -O-alquilo u –O(CO)-alquilo;
    incluyendo cualquier tautómero del mismo; e incluyendo un aducto de metanol del mismo en el que se forma un cetal mediante la combinación del grupo ceto en C-53 y el grupo hidroxilo en C-15 y metanol.
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  3. 2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que n representa un enlace senillo.
  4. 3. Compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que R9 representa OH.
  5. 4. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R5 representa OH. 15
  6. 5. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R6 representa H, Me o F.
  7. 6. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que R7 representa H o F.
  8. 7. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que R6 y/o R7 representan F.
  9. 8. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que X1 representa NR1R2.
  10. 9. Compuesto según la reivindicación 8, en el que R1 representa alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, 25 alquilcicloalquilo, alquilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquenilcicloalquenilo, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, alquenilarilo o alquenilheteroarilo, y R2 representa H, alquilo, alquenilo u -O-alquilo.
  11. 10. Compuesto según la reivindicación 8, en el que NR1R2 representa morfolinilo, oxazinano o uno de los grupos dados a conocer en la siguiente tabla: 30
    .
  12. 11. Compuesto según la reivindicación 1 seleccionado de:
    5
    y 5
    incluyendo cualquier tautómero del mismo; o un isómero del mismo en el que el enlace C=C en C26, 27
    mostrado como trans es cis; e incluyendo un aducto de metanol del mismo en el que se forma un cetal mediante la combinación del grupo ceto en C-53 (si está presente) y el grupo hidroxilo en C-15 y metanol;
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  13. 12. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso como producto farmacéutico.
  14. 13. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso como producto farmacéutico para el tratamiento de infecciones virales tales como infección por VHC o VIH o como agente inmunosupresor o antiinflamatorio. 10
  15. 14. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
  16. 15. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 11, junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable que comprende además un segundo principio activo o principio activo posterior.
  17. 16. Procedimiento para preparar un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula V 20
    Fórmula V
    en la que X1 es tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y cada R11 es independientemente alquilo C1-4 o bencilo;
    con un macrociclo aldehídico (compuesto de fórmula VI):
    en la que X2, X3, X4, X5, X6, R4, R5, R6, R7 ,R8, R9 y n son tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
  18. 17. Compuesto de fórmula (VI):
    en la que X2, X3, X4, X5, X6, R4, R5, R6, R7 ,R8, R9 y n son tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
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