KR101911484B1 - 대환식 화합물 및 그의 제조방법 - Google Patents

대환식 화합물 및 그의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101911484B1
KR101911484B1 KR1020137028095A KR20137028095A KR101911484B1 KR 101911484 B1 KR101911484 B1 KR 101911484B1 KR 1020137028095 A KR1020137028095 A KR 1020137028095A KR 20137028095 A KR20137028095 A KR 20137028095A KR 101911484 B1 KR101911484 B1 KR 101911484B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
alkyl
compound according
mmol
rti
Prior art date
Application number
KR1020137028095A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140071958A (ko
Inventor
스티븐 제임스 모스
매튜 앨런 그레고리
배리 윌킨슨
Original Assignee
뉴로바이브 파마슈티컬 에이비
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1105293.3A external-priority patent/GB201105293D0/en
Priority claimed from GBGB1113629.8A external-priority patent/GB201113629D0/en
Priority claimed from GBGB1202060.8A external-priority patent/GB201202060D0/en
Application filed by 뉴로바이브 파마슈티컬 에이비 filed Critical 뉴로바이브 파마슈티컬 에이비
Publication of KR20140071958A publication Critical patent/KR20140071958A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101911484B1 publication Critical patent/KR101911484B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/04—1,3-Oxazines; Hydrogenated 1,3-oxazines
    • C07D265/06—1,3-Oxazines; Hydrogenated 1,3-oxazines not condensed with other rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5355—Non-condensed oxazines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/54—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D237/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings
    • C07D237/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings not condensed with other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D498/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D498/06—Peri-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06191—Dipeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

바이러스 감염의 치료용으로서 또는 면역억제제로서 식 (I)의 화합물들이 제공된다:
[화학식 1]
Figure 112013096342271-pct00080

Description

대환식 화합물 및 그의 제조방법 {MACROCYCLIC COMPOUNDS AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION}
본 발명은, 예를 들어, 간염 C 바이러스 (HCV), 간염 B 바이러스 (HBV) 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)와 같은 바이러스에 의한 바이러스성 감염의 치료에 사이클로필린 저해체로서 및/또는 예를 들어, 이식 거부 반응을 예방하는 데 사용하는 면역억제제로서, 및 예를 들어, 염증성 질환에 사용되는 항염증제로서 유용한, 상글리페린 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 의약 용도, 특히 HCV 또는 HIV 감염의 치료에의 용도 및 근이영양증과 같은, 미토콘드리아성 투과성 전이 기공 (Mitochondrial Permeability Transition Pore (mPTP))이 유용한 질병에서 면역억제제로서의 용도, 또는 다른 의학적으로 유용한 화합물의 제조에서 중간체로서의 용도로 사용하는 방법을 제공한다.
간염 C
간염 C 바이러스 (HCV)는 양성 가닥 (positive strand) RNA 바이러스이고, 그 감염은 수혈후 간염의 주된 원인이다. HCV는 가장 공통적인 만성 혈액 매개 감염이고, 미국에서 간질환으로부터 사망의 주된 원인이다. 세계보건기구의 추산에 따르면 1억7천만명 이상의 HCV 감염 만성 보균자가 있고, 이는 세계인구의 약 3%에 해당한다. HCV-감염되었지만, 비치료된 환자 중, 약 70-85%는 만성 HCV 감염으로 발전하고, 따라서, 간경화 및 간세포암으로 발전될 위험이 크다. 선진국의 경우, 간암의 모든 환자의 50-76% 및 모든 간이식자의 2/3가 만성 HCV 감염 때문이다 (Manns 등, 2007).
간질환외에, 만성적으로 감염된 환자들은 또한 다른 만성적인 것에 더하여, HCV-관련 질환을 발전시키고, 타인에 대하여 전염원으로 작용한다. HCV 감염은 관절통 (관절통증), 피부발진, 및 주로 신장에 대한 내부기관 손상과 같은 간외 (non-liver) 합병증을 야기한다. HCV 감염은 주요한 세계적 건강 서비스 부담으로 나타나며, 현재 간염 C에 이용할 만한 백신이 없다 (Strader 등, 2004; Jacobson 등 2007; Manns 등, 2007; Pawlotsky, 2005; Zeuzem & Hermann, 2002).
HCV의 치료
현재 치료 기준 (standard of care (SoC))은 PEG화된 인터페론-α (pIFNα)의 피하 주사 및 항바이러스 약물인 리바비린의 24-48 주간 경구 투여이다. 치료적 성공은 지속된 바이러스 반응 (sustainedvirologicresponse(SVR))에 의해 정의되는 데, 이는 치료 기간 말에 그리고 6 개월 후에, 혈액에서 HCV RNA가 존재하지 않음으로서 정의된다. SoC에 대한 전체적인 반응율은 주로 유전자형과 치료전 HCV RNA 수준에 의존한다. 유전자형 2와 3을 가진 환자는 유전자형 1로 감염된 환자보다 SoC에 더 용이하게 반응한다 (Melnikova, 2008; Jacobson 등, 2007).
상당한 수의 HCV 환자들은 SoC 처리에 적절히 반응하지 않거나, 부작용 때문에 치료를 견딜 수 없어서, 전 과정을 끝마치는 것이 종종 이슈로 등장하였다. SoC의 전체적인 임상 SVR 율은 약 50%일 뿐이다 (Melnikova, 2008). 내성 발달은 치료 실패의 다른 잠재된 요인이다 (Jacobson 등 2007). SoC는 또한 과거 우울증이나 심작 질환의 심각한 발현을 가진 환자와 같이, 치료 대상 후보로서 고려치 않는 특정 환자에서는 금기된다. SoC의 부작용은, 종종 치료의 중단을 결과하는 것으로, 유사 독감 질환, 발열, 피로, 혈액학적 질병, 빈혈증, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 탈모증, 및 우울증을 포함한다 (Manns 등, 2007).
SoC를 사용하는 오래된 치료와 연관된 부작용들인, 내성 발달 및 최적에 못미치는 전체적인 성공율을 고려하면, 더욱 효율적이고 더 안전한 새로운 치료가 HCV 감염의 치료에 시급히 필요하다. 새로운 치료의 목적은 향상된 효능, 향상된 독성 프로필, 향상된 내성 프로필, 향상된 삶의 질, 및 환자 순응도에서의 결과된 향상을 포함한다. HCV는 짧은 수명 주기를 가지며 따라서 약물 치료동안 약물 내성의 발달이 공통적이다.
바이러스성 RNA 폴리머라제 NS5B 또는 바이러스성 프로테아제 NS3과 같은 바이러스 단백질을 표적하는, 직접적인 작용 항바이러스성 (direct acting antiviral (DAA)) 약물로도 또한 알려진, 신규한 간염 C에 대한 특별히 표적된 항바이러스 요법 (specifically targeted antiviral therapy for hepatitis C (STAT-C))이 개발되고 있다 (Jacobson 등, 2007; Parfieniuk 등, 2007). 또한, 바이러스 단백질보다는 인간 단백질 (예, 사이클로필린)을 표적하는 신규한 화합물이 개발 중인데, 이는 약물 치료 중에 내성 발생을 감소시킬 것으로 예상되고 있다 (Manns 등, 2007; Pockros, 2008; Pawlotsky J-M, 2005).
사이클로필린 저해체
사이클로필린류 (CyP)는 단백질 형태 변화와 폴딩을 용이하게 하는 펩티딜-프로필 시스-트란스 이소머라제 활성을 보이는 세포 단백질 군이다. CyP들은 전사성 조절, 면역 반응, 단백질 분비 및 미토콘드리아 기능과 같은 세포 작용에 참가한다. HCV 바이러스는 인간 감염 중에 그 수명주기 중에 CyP을 채용한다. CyP PPIase 활성에 대한 요구를 위시한 몇 가지 대안적인 가정들이 제시되어 있지만, 원래는, CyP들은, RNA 복제를 촉진하는 HCV 비구조성 단백질 NS5B RNA 폴리머라제의 RNA 결합 활성을 자극한다고 생각되었다. A 및 B를 위시한 CyP들의 다양한 이소폼들은 HCV 수명 주기에 관계하는 것으로 믿어지고 있다 (Yang 등, 2008; Appel 등, 2006; Chatterji 등, 2009; Gaither 등, 2010). 마우스 (Colgan 등, 2000) 및 인간 T 세포(Braaten and Luban, 2001)에서 녹아웃물을 생성할 수 있기 때문에, CyPA가 세포 성장과 생존에 조건적이라는 것으로 나타난다. 유사한 결과가, 세균 (Herrler 등, 1994), 뉴스포라 (Tropschug 등, 1989) 및 사카로마이세스 세레비지아 (Dolinski 등 1997)에서 CyPA 유사체 파괴로 관찰되었다. 따라서, CyP들을 저해하는 것은 HCV 감염을 치료하기 위한 새롭고 매력적인 숙주 타겟을 나타내며, SVR을 증가시키고, 내성 출현을 방지하고, 치료 부작용을 저하시키는 목적으로, 현재의 SoC 또는 STAT-C/DAA 약물에 새로운 가능성을 추가하는 것이다.
Figure 112013096342271-pct00001

사이클로스포린 A (Inoue 등 2003) ("CsA") 및 이와 구조적으로 유사하게 관련된 비-면역억제성, 임상 유사체 DEBIO-025 (Paeshuyse 등 2006; Flisiak 등 2008), NIM811 (Mathy 등 2008) 및 SCY-635 (Hopkins 등, 2009)은 사이클로필린에 결합하는 것으로 알려져 있고, 그리고 사이클로필린 저해체로서, HCV 감염의 치료에 시험관 내 및 임상적 효능을 나타낸다 (Crabbe 등, 2009; Flisiak 등 2008; Mathy 등 2008; Inoue 등, 2007; Ishii 등, 2006; Paeshuyse 등, 2006). 비록 CsA에 대한 선행의 내성 연구가 HCV NS5B RNA 폴리머라제에서의 변이가 있음을 보였고, 사이클로필린 B 만이, HCV 복제 과정에 연루되었을 것이라고 제시하였지만 (Robida 등, 2007), 최근의 연구는 HCV 복제에서 사이클로필린 A에 대한 본질적인 역할을 제시하였다 (Chatterji 등 2009; Yang 등, 2008). NS5A 바이러스 단백질에서의 변이들이 또한 CsA 내성과 연관이 있다는 것과 NS5A가 CyPA 및 CypB 양쪽과 상호작용하여 그들의 특이적인 펩티딜-프로필 시스/트란스 이소머라제 (PPIase) 활성을 나타낸다는 것을 고려하면, 바이러스 수명 주기에서 양쪽 사이클로필린들에 대한 역할이 또한 제시되고 있다 (Hanoulle 등, 2009).
사이클로스포린 유사체들의 항-HCV 효과는 면역억제 특성과 무관하며, 칼시뉴린에 의존한다. 이것은 HCV 활성에 대한 필수적인 요구사항이 CyP 결합이며, 칼시뉴린 결합은 필요치 않다는 것을 의미한다. HCV의 치료에 임상적으로 가장 발전된 사이클로필린 저해체인 DEBIO-025 네 가지의 가장 유력한 HCV 유전자유형들 (유전자유형 1, 2, 3, 및 4)에 대하여 시험관 내 및 생체 내 효능을 나타냈다. 내성 연구에 따르면, DEBIO-025에 내성을 부여하는 변이들은 폴리머라제 및 프로데타제 저해체에 대하여 보고된 것과 다르다는 것과 및 STAT-C/DAA 내성 바이러스 리플리콘들과는 교차 저항이 없다는 것을 보였다. 더 중요하게는, DEBIO-025는 또한, 프로테아제 및 폴리머라제 저해체 둘 다에 내성을 주는 탈출 변이의 발달을 방지하였다 (Crabbe 등, 2009).
그러나, 임상적 개발 중인 CsA-기반 사이클로필린 저해체들은 많은 논란 거리를 가지고 있는 데 이것들은 그들의 공유된 구조적 위상과 관련된 것으로 생각되며, 이들은 치료를 걷어들이게 할 수 있으며 임상적 투약 수준을 제한하게 하는 특정 역 작용들; 다양한 효능으로 이끌어 질 수 있는 다양한 약동력 특성들; 및 투약 문제로 이끌어 질 수 있는 약물-약물 상호작용의 증가된 위험을 포함한다.
DEBIO-025가 투약된 환자에서 가장 빈번하게 일어나는 역작용들 (adverse events (AEs))은 황달, 비정상적인 통증, 구토, 피로 및 발열을 포함한다. 임상적으로 가장 중요한 AEs는 고빌리루빈혈증 및 혈소판 감소 (저혈소판증)이다. Peg-IFN 심한 저혈소판증을 야기할 수 있고 DEBIO-025과의 조합은 심각한 임상적 문제를 나타낸다. 빌리루빈에서의 증가 및 혈소판에서의 감소 둘 다는 또한 NIM-811을 사용한 초기 임상 연구에서 설명되고 있다 (Ke 등, 2009). DEBIO-025 임상 연구 중에 관찰된 고빌리루빈혈증이, 치료 중단 후에 해소된다고 하더라도, 이것은 16 명 환자 중 4 명의 치료 중단 및 향후 치료에서 투약 수준을 감소시키는 원인이었다. 사이클로필린 저해체들의 HCV에서의 항바이러스 효과가 투약 용량과 관계있음에 따라, 투약용량에서의 감소는 항바이러스 효과의 감소로 이어지고 및 나중에 CsA-기반 사이클로필린 저해체을 사용한 많은 시도에서, 단일요법으로서 투여될 때, HCV 바이러스 부하에 대하여 감소를 나타내지 않거나 조금 감소시킬 뿐이었다 (Lawitz 등, 2009; Hopkins 등, 2009; Nelson 등, 2009). DEBIO-025 및 사이클로스포린 A는 담즙염 배출 펌프 및 다른 간장 수송체들 (특히 OAT1B1/OAT1B3/MRP2/MRP3/cMOAT/ABCC2)과 같은 담즙 수송체들의 저해체로서 알려져 있다 (Crabbe 등, 2009). 담즙 수송체들의, 특히 MRP2의 상호작용은, DEBIO-025의 고 용량 수준에서 나타나는 고빌리루빈혈증의 원인이 될 수 있다는 것이 제시되었다 (Nelson 등, 2009, Wring 등, 2010). P-당단백질 (Pgp/MDR1), BSEP, OAT1B1 및 OAT1B3 (Konig 등, 2010)과 같은 다른 약물 수송체의 저해를 통한 CsA 등급-연관 약물-약물 상호작용들(DDIs)은 또한 관심거리가 될 수 있고, HIV와 같이, 공감염에 대한 치료차 있는 특정 환자에서 특정 조합과 사용을 잠재적으로 제한한다 (Seden 등, 2010).
또한, DEBIO-025 및 사이클로스포린 A는 시토크롬 P450 (특히 CYP3A4)에 의한 대사에 대한 기질이고, 인간 P-당단백질 (MDR1)의 기질 및 저해체이라고 알려져 있다 (Crabbe 등, 2009). 사이클로스포린 A는 또한 시험관 내에서 CYP3A4의 저해체인 것으로 나타난다 (Niwa 등, 2007). 이것은 예를 들어, 케토코나졸, 시메티딘 및 리팜피신과 같은 CYP3A4 기질, 유발체, 또는 저해체인 다른 약물과의 약물-약물 상호작용이 커질 위험이 있다는 것을 나타낸다. 또한, P-당단백질 (예, 디곡신)에 의한 수송에 속하는 약물과의 상호작용이 예상되며, 이는 다른 동시적 질환에 대한 의료적 처리를 받는 HCV 환자에서 심각한 약물-약물 상호작용을 야기할 수 있다 (Crabbe 등 2009). CsA는 또한 매우 가변적인 약동력 특성을 가지는 것으로 나타나며, 초기 제제들은 1-89%의 경구 생체이용성을 보인다 (Kapurtzak 등, 2004). 값비싼 환자 혈액 수준을 감시하기 않으면, 이러한 것은 증가된 혈장 수준에 의한 부작용이 만연할 위험이 증가하고 또는 저하된 혈장 수준으로 인해 임상 반응이 감소되는 것으로 나타날 수 있다.
사이클로필린들의 저해가 CV의 치료에 대한 새로운 확실한 방법을 나타내는 것을 고려하면, HCV 감염에 대한 조합 요법에 사용하기 위해서, 더욱 강력하고 안전한 CyP 저해체들의 발견과 개발이 필요하다.
상글리페린류
상글리페린 A (SfA) 및 이의 자연적인 동속물질 (congener)들은 혼합된 비-리보좀성 펩타이드/폴리케타이드류의 군에 속하는 것으로, 스트렙토마이세스 종 A92-308110 (또한 DSM 9954으로도 알려짐)에 의해 생산되는 데 (참조 WO 97/02285), 이들은 원래 사이클로필린 A (CyPA)에 대한 높은 친화성에 기반하여 발견되었다. SfA는 발효액에서 가장 많은 성분이고, CyPA에 대하여, CsA보다 약 20 배 더 높은 친화도를 나타낸다. 이것은 상글리페린류들이 HCV의 치료에 유용할 수 있는 제안으로 연결되었다 (WO2006/138507). 상글리페린류들은 또한, 시험관 내 시험때, CsA보다 더 낮은 면역억제 활성을 보이는 것으로 나타났다 (Sanglier 등, 1999; Fehr 등, 1999). SfA는 CyPA의 CsA 결합 부위에 높은 친화도를 가지고 결합한다 (Kallen 등, 2005).
Figure 112013096342271-pct00002

상글리페린류의 생합성
상글리페린류는 혼성된 폴리케타이드 신타제 (PKS)/비-리보좀성 펩타이드 신세타제 (NRPS)에 의해 생합성된다 (참조 WO2010/034243). 22 개 원소의 마크로리드 구조물은 폴리케타이드 탄소 사슬 및 트리펩타이드 사슬로 구성된다. 상기 펩타이드 사슬은 하나의 천연 아미노산, 발린, 및, 아미드 결합으로 연결된 두 개의 비천연 아미노산: (S)-메타-타이로신 및 (S)-피테라즈 산으로 구성된다. 페닐알라닌의 하이드록실화 (NRPS 상에서 인사이추로, 또는 생합성 전에)하여 (S)-메타-타이로신을 생성하는 것은 sfaA의 유전자 생성물을 통하여 일어나는 것으로 판단된다.
상글리페린류의 면역억제 작용
SfA의 작용의 면역억제 기작은 CsA, FK506 및 라파미신과 같은 알려진 다른 이뮤노필린-결합 면역억제 약물의 것과 상이하다. SfA는 CsA의 표적인 칼시뉴린의 포스파타제 활성을 저해하지 않지만 (Zenke 등 2001), 대신에, 그의 면역억제 활성은 인터루킨-6 (Hartel 등, 2005), 인터루킨-12 (Steinschulte 등, 2003)의 저해 및 인터루킨-2-의존 T 세포 증식의 저해에 기인한다 (Zhang & Liu, 2001). 그러나, SfA가 그의 면역억제 효과를 발휘하는 분자 표적 및 기작은 여태 알려져 있지 않다.
SfA의 분자 구조는 복합적이고 CyPA과의 그의 상호작용은 분자의 마크로시클릭 부분에 크게 매개된다고 판단된다. 사실, SfA의 산화성 절단에 의해 유도된 마크로시클릭 화합물 (하이드록시마크로사이클)은 CyPA에 대하여 강력한 친화성을 나타냈다 (Sedrani 등, 2003). X-선 결정구조 데이터는 상기 하이드록시마크로사이클이 CsA와 동일한 CyPA의 활성 위치에 결합하는 것을 나타내고 있다. SfA의 마크로사이틀 분체에 기반한 유사체들은 또한 이전에 면역억제 특성이 없는 것으로 나타났고 (Sedrani 등, 2003), HCV 요법에서의 잠재적으로 사용하기 위한, 비면역억제성 CyP 저해체를 설계하는 기회를 제공한다.
이와는 반대로, 크론병, 베체트 증후군, 포도막염, 건선, 아토피성 피부염, 류마티스성 관절염, 신증후군, 무력성 빈혈, 담즙성 간경변증, 천식, 폐섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD) 및 셀리악 병을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 이식거부, 자가변역, 염증성 및 호흡기 질환의 예방과 같은 분야에서 사용하기 위한, 저독성을 가지는 면역억제제를 개발할 기회가 있는 것이다. 상글리페린류는 면역억제 활성(Zenke 등, 2001)을, 잠재적으로 수지상 세포 케모카인류를 통해 작용하는 것으로 (Immecke 등, 2011) 나타나는 신규한 기작을 가지며, 따라서, 사이클로스포린 A, 라파미신 및 FK506과 같은 현재의 임상 제제와 상이한 작용 기작을 가지는 제제를 개발할 기회가 있다. 상글리페린 A는 사이클로스포린 A보타 10배 약한 것으로 나타나며, 따라서 이상적인 신규 제제는 향상된 효능 및/또는 치료적 창구를 가지게 될 수 있다.
사이클로필린 저해체류의 다른 치료적 용도
인간 면역결핍 바이러스 (HIV)
CsA 및 DEBIO-025와 같은 사이클로필린 저해체류는 또한 HIV 복제의 저해에서 잠재적인 유용성을 또한 나타냈다. 상기 사이클로필린 저해체류들은 HIV 역전사의 진행/완결 동안 CyPA의 기능을 저해하는 것으로 판단된다 (Ptak 등, 2008). 그러나, 임상적으로 시험시, DEBIO-025는 9 명 및 2 명의 환자에게서 HIV-1 RNA 수준 ≥0.5 및 >1 log10 개/mL로 각각 감소시켰을 뿐이고, 반면 치료된 환자 중 27 명은 HIV-1 RNA 수준에서 감소를 나타내지 않았다 (Steyn 등, 2006). 이 후, DEBIO-025가 HCV/HIV 동시감염된 환자에게 시도되었고, HCV에 대해서는 더 나은 효능을 보였고, HIV 임상 시험은 중단되었다 (참고 Watashi 등, 2010).
HIV의 치료
전세계적으로 3천만명이 넘는 사람들이 HIV-1에 감염되어 있고, 매년 3백만명이 새로이 감염된다. 치료 조건은 강력한 항레트로바이러스 요법 (highly active antiretroviral therapy (HAART))의 도입으로 극적으로 향상되었다 (Schopman 등, 2010), 2008년까지, 거의 25 개 항레트로바이러스 약물이 HIV-1의 치료에 인가되었고, 이중에는 9 개 뉴클레오시드 역전사효소 저해체, (NRTI), 4 개 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해체 (NNRTI), 9 개 프로테아제 저해체 (PI), 1 개 융합 저해체, 1 개 CCR5 저해체 및 1 개 인테그라제 저해체 (Shafer and Schapiro, 2008)를 포함한다. 그러나, 이러한 현재의 요법의 어느 것도 완벽하게 바이러스 청소를 하지 못하고, 심각한 부작용을 낳게되고, 및 항바이러스 내성이 여전히 주요 문제점으로 남는다. 따라서, 새로운 항바이러스 요법, 특히 사이클로필린 저해체들의 경우에서와 같이, 승인된 약물이 없는 경우, 작용 기작에서, 새로운 요법이 여전히 필요한 것으로 남아있다.
간염 B 바이러스
간염 B 바이러스는 헤파드나바이러스과의 DNA 바이러스이고, 간염 B의 원인 병원체이다. HCV 및 HIV의 경우와는 달리, 간염 B 바이러스에 대한 사이클로필린 저해체들의 활성에 대한 오직 몇 개의 공개된 내용들이 있다. Ptak 등 2008에 따르면, HBV에 대하여 Debio-025의 약한 활성이 기술되어 있고 (IC50 4.1μM), Xie 등, 2007은 HBV에 대하여 CsA의 활성을 기술하였다 (IC50 >1.3μg/mL). 이것은 HIV 및 HCV와 대조되는 것이고, 여기서, 사이클로필린 저해체들의 나노몰 수준의 항바이러스 활성에 대하여 많은 보고가 있다.
HBV의 치료
HBV는 전세계적으로 최대 4억명의 사람을 감염시키며, 만성 바이러스성 간염 및 간세포암의 주요 원인이다. 2008년 현재, 6 개의 약물이 HBV의 치료에 허가되어 있다; 인터페론 알파와 PEG화된 인터페론 알파, 세 개의 뉴클레오시드 유사체 (라미부딘, 엔테카비르 및 텔비부딘) 및 한 개의 뉴클레오타이드 유사체 (아데포비르 디피복실). 그러나, 높은 내성율, 열악한 인내 (tolerability) 및 부작용으로 인하여, 새로운 치료 옵션이 필요하다 (Ferir 등, 2008).
미토콘드리아성 투과성 전이 기공 (mPTP)의 저해
미토콘드리아에서 높은 전도 투과성 전이 기공을 개방하는 것은 미토콘드리아 투과성 전이(MPT)를 개시한다. 이것은 원인적 사건으로, 산화성 스트레스, Ca2+ 독성 및 허혈/재관류 후에, 간세포에서의 괴사와 어팝토시스로 이어진다. 사이클로필린 저해체들에 의한 사이클로필린 D (사이클로필린 F으로도 알려진)을 저해하면, 투과성 전이 기공들의 개방을 차단하는 것으로 나타나고, 이러한 스트레스 후에 세포 사멸을 방지한다. 사이클로필린 D 저해체들은 따라서 mPTP 개방이 연루되는, 근이영양증, 특히, 울리히 선천성 근이영양증 및 베들레헴 근육증 (Millay 등, 2008, WO2008/084368, Palma 등, 2009), 다발성 경화증 (Forte 등, 2009), 당뇨병 (Fujimoto 등, 2010), 근위축성 측색 경화증 (Martin 2009), 양극성 장애 (Kubota 등, 2010), 알츠하이머병 (Du and Yan, 2010), 헌팅턴 병 (Perry 등, 2010), 심근 경색후 회복 (Gomez 등, 2007) 및 만성 알코올 소비 (King 등, 2010)와 같은 처방에 유용할 수 있다.
추가의 치료 용도
사이클로필린 저해체들은 대상포진 바이러스 (Ptak 등, 2008), 인플루엔자 A 바이러스 (Liu 등, 2009), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 및 다른 인간 및 고양이 코로나 바이러스 (Chen 등, 2005, Ptak 등, 2008), 뎅기 바이러스 (Kaul 등, 2009), 황열 바이러스 (Qing 등, 2009), 웨스트 나일 바이러스 (Qing 등, 2009), 서부형 마뇌염 바이러스 (Qing 등, 2009), 사이토메갈로바이러스 (Kawasaki 등, 2007) 및 백시니아 바이러스 (Castro 등, 2003)와 같은 다른 바이러스들의 감염에 대하여 및 따라서 이를 치료하는 대 잠재적인 활성을 가진다.
또한, 암에서와 같이, 다른 치료적 분야에서의 사이클로필린 저해체들과 사이클로필린 저해의 유용성에 대하여 보고하고 있다 (Han 등, 2009).
상글리페린에 대한 일반적인 의견
상글리페린류와 같은 화합물의 약물 개발에서의 논의점 중의 하나는 낮은 경구 생체이용성으로 이어지는 빠른 대사와 글루큐로닌 결합(glucuronidation)이다. 이것은 음식물 효과, 투여 형태로부터의 더 빈번한 불완전한 방출, 및 더 높은 환자간 다양성이 증가되는 기회로 이어질 수 있다.
그러므로, 특히, HCV 감염의 치료에서 및 HIV 감염, 근이영양증 또는 심근 경색 후 회복 촉진과 같이, 사이클로필린의 저해가 유용한 또는 면역억제나 항염증 효과가 유용한 다른 질병 분야의 치료에 유용성을 가질 수 있는 신규한 사이클로필린 저해체들을 동정할 필요가 남아있다. 바람직하게는, 그러한 사이클로필린 저해체들은 현재 이용가능한 사이클로필린 저해체들보다 향상된 특성을 가지는 데, 하기 특성들 중 하나 이상을 포함한다: 가능하게는 감소된 P450 대사 및/또는 감소된 글루큐로닌 결합(glucuronidation)을 통해서, 더 긴 또는 증가된 경구 생체이용성, 향상된 수용해성, HCV에 대한 향상된 효능, 감소된 독성 (간독성을 포함), 표적 기관 (예, HCV의 경우 간)에 대한 높은 노출 및/또는 긴 반감기 (더 낮은 빈도로 투약이 가능)와 같은, 향상된 약학적 프로필, CYP3A4 대사와 저해의 감소된 수준, 및 감소된 (Pgp) 저해 (더 이른 다중 약물 조합을 가능하게 하는)를 통한, 감소된 약물-약물 상호작용, 고빌리루빈혈증의 낮은 기회로 이어지는 MRP2와의 낮은 결합과 같은 향상된 부작용 프로필, 더 낮은 면역억제 효과, 내성 바이러스 종, 특히, CsA와 CsA 유사체 (예, DEBIO-025) 내성 바이러스 종에 대한 향상된 활성 및 더 높은 치료적 (및/또는 선택성) 지표. 본 발명은 하나 이상의 상기 특성을 가질 수 있는 신규한 상글리페린 유사체들을 개시한다. 특히, 본 발명은 신규한 변이합성적 (mutasynthetic) 상글리페린 유사체들을 개시하며, 이들은, 예를 들어, 증가된 마이크로좀 반감기에 의해 나타난 바와 같이, P450 또는 글루큐로닌 결합을 통한 감소된 대사 및/또는, 예를 들어, 낮은 리플리콘 EC50에 의해 나타난 바와 같이, HCV에 대한 감소된, 개선된 효능을 가지는 것으로 예상된다.
또한, 이식 거부의 예방에 또는 자가 면역, 염증성 및 호흡기 장애의 치료에서 유용성을 가질 수 있는 신규한 면역억제제를 개발할 필요가 있다. 바람직하게는, 그러한 면역억제제들은 공지된 천연 상글리페린류보다 개선된 특성을 지니며, 하기 특성들 중 하나 이상을 포함한다: 가능하게는 감소된 P450 대사 및/또는 감소된 글루큐로닌 결합을 통해서, 더 긴 또는 증가된 경구 생체이용성, 향상된 수용해성, T-세포 증식 시험에서 나타날 수 있는 바와 같이, 면역억제 활성에서의 향상된 효능, 감소된 독성 (간독성을 포함), 표적 기관 (예, HCV의 경우 간)에 대한 높은 노출 및/또는 긴 반감기 (더 낮은 빈도로 투약이 가능)와 같은, 향상된 약학적 프로필, CYP3A4 대사와 저해의 감소된 수준, 및 감소된 (Pgp) 저해 (더 이른 다중 약물 조합을 가능하게 하는)를 통한, 감소된 약물-약물 상호작용, 및 향상된 부작용 프로필. 본 발명은 상기 특성들 중 하나 이상을 가질 수 있는 신규한 상글리페린 유사체들을 개시한다. 특히, 본 발명은, 예를 들어, 감소된 마이크로좀 반감기에 의해 나타난 바와 같은, P450 또는 글루큐로닌 결합을 통한 감소된 대사 및/또는, 예를 들어, 낮은 T-세포 증식 IC50에 의해 나타난 바와 같이, 향상된 면역억제 효능을 가질 수 있는 신규한 유도체를 개시한다. 따라서, 실시예로부터 보여지는 바와 같이, 본 발명의 화합물들은 하기 유리한 치료적으로 연관된 특성을 가진다:
- 선행 기술 사이클로필린 저해체들 사이클로스포린 A, DEBIO-025 (알리스포리비르) 및 상글리페린 A와 비교하여, HCV 및 HIV에 대한 향상된 항바이러스성 효능;
- 선행기술 화합물 상글리페린 A에 비교하여, 감소된 체내 제거 및 증가된 경구 노출;
- 선행기술 사이클로필린 저해체류인 사이클로스포린 A, DEBIO-025 (알리스포리비르) 및 상글리페린 A와 비교하여 CypA PPIase 활성의 더 강력한 저해;
- 빌리루빈 수송체(OATP-1B1, OATP-1B3, MRP2 and MRP3)의 감소된 저해 및 생체이물(xenobiotic) 수송체 (Pgp and BSEP)의 감소된 저해에 의해 증명되는 바와 같이 향상된 부작용 프로필 및 감소된 약물-약물 상호작용.
본 발명은 변이합성적 상글리페린류의 반합성적 변경에 의해 발생된 신규한 마크로시클릭 상글리페린 유사체들을 제공한다. 이러한 유사체들은 식 IIA 및 식 IIB에서 설명되는 바와 같이, 변이합성적 상글리페린을 디하이드록실화 한 후 절단하여 알데하이드성 마크로사이클을 생성하고, 그 후 추가의 화학, 즉, 호너-엠몬스 반응 (Horner-Emmons type reactions) 및 알데하이드를 위시한 다른 커플링 반응에 의해 알데하이드를 대체하는 다양한 치환체를 가진 분자를 생성한다. 그 결과, 본 발명은 마크로시클릭 상글리페린 유사체류, 이들 화합물의 제조 방법, 및 이들 화합물의 의학에서의 용도와 다른 화합물을 생성하는 데 있어서 중간체로서의 용도를 제공한다.
그러므로, 첫 관점에 있어서, 본 발명은 하기 식 (I)에 따른 마크로시클릭 상글리페린 유사체류 및 이의 유도체, 또는 이의 약학적 허용염을 제공한다:
Figure 112013096342271-pct00003
식 (I)
상기식에서:
분체 X1는 -OR1,-NR1R2또는 R3를 나타내고;
R1,R2및 R3는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬시클로알킬, 알킬시클로알케닐, 알케닐시클로알킬, 알케닐시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐아릴 또는 알케닐헤테로아릴을 나타내며 이들 중 임의의 기는 모노시클릭 아릴 또는 모노시클릭 헤테로아릴에 의해 선택적으로 치환될 수 있고;
및 아릴 또는 헤테로아릴 기의 부분이 아닌 R1,R2및 R3의 하나 이상의 탄소원자는 O, N 및 S(O)p로부터 선택된 이종원자에 의해 선택적으로 치환되며 여기서 p는 0, 1 또는 2를 표시하고, 및 R1,R2및 R3의 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 카르보닐에 의해 치환되고;
또는 R1및 R2는 연결되어 특정된 질소 원자를 포함하는 포화된 또는 불포화된 헤테로시클릭 고리를 표시하게 되고, 상기 고리의 하나 이상의 탄소원자는 O, N 및 S(O)p로부터 선택되는 추가의 이종원자에 의해 선택적으로 치환되며 여기서 p는 0, 1 또는 2를 나타내며, 및 상기 고리의 하나 이상의 탄소원자는 선택적으로 카르보닐에 의해 치환되고 및 그러한 헤테로시클릭 고리는 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 선택적으로 융합될 수 있고;
및 R1,R2및 R3기의 하나 이상의 탄소원자는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 선택적으로 치환될 수 있고;
또는 R1및/또는 R2는 수소를 나타내고;
R9는 H 또는 OH를 나타내고;
n은 단일 또는 이중 결합을 나타내며, 단 n이 이중결합을 나타낼 때, R9이 H를 표시하고;
R4,R5,R6,R7및 R8은 독립적으로 알케닐 또는 알킬을 표시하고 여기서 상기 알킬기의 하나 이상의 탄소 원자는 O, N 및 S(O)p으로부터 선택된 이종원자에 의해 선택적으로 치환되며, 여기서 p는 0, 1 또는 2를 나타내며, 및 상기 알킬기의 하나 이상의 탄소원자는 카르보닐에 의해 선택적으로 치환되고 그러한 알킬기는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 선택적으로 치환될 수 있고;
X2,X3,X4,X5및 X6는 독립적으로 C 또는 N을 나타내며, 이러한 기들의 임의의 기가 N을 나타내는 경우, 부착된 치환체가 없고;
단 R4,R6,R7및 R8모두가 H를 나타내고 및 X2,X3,X4,X5및 X6모두가 C를 나타낼 때, R5는 OH, -O알킬 또는 O(CO)알킬을 나타낼 수 없다는 조건이며;
이의 임의의 호변이성질체를 포함하고; 및 C-53 케토 및 C-15 하이드록실 기와 메탄올의 조합에 의해 케탈이 형성되는 메탄올 부가생성물을 포함한다.
상기 구조는 대표적인 호변이성질체를 나타내며, 및 본 발명은 식 (I)의 화합물을 모든 호변이성질체, 예를 들어, 에놀 화합물이 예시되는 케토 화합물 및 그 역의 상황도 마찬가지인 것을 포함한다.
식 (I)의 정의 내에 포함된 특이적 호변이성질체들은 (i) 상기 C-53 케토기가 상기 C-15 하이드록실과 헤미케탈을 형성하고, 또는 (ii) 상기 C-15 및 C-17 하이드록실이 상기 C-53 케토와 조합하여 케탈을 형성할 수 있는 것이다. 모든 숫자 매김은 모체 상글리페린 A 구조에 대한 시스템을 사용하고 있다.
식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적 허용염들은 선택적으로, 수화물과 같이, 약학적 허용 용매화물의 형태로 존재할 수 있다.
정의
관사로 나타나는 "하나" 및 "일"은 그 관사의 문법적 목적물의 하나 또는 그 이상을 지칭하는 것으로 사용된다. 예를 들어, "일 유사체"는 하나의 유사체 또는 하나 이상의 유사체를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유사체(류)"는 구조적으로 다른 것과 유사하지만 조성에서 약간 다른 화학 화합물을 지칭한다 (일 원자가 다른 것에 의해 치환된 것과 같이 또는 특정 관능기의 존재 또는 부존재에서와 같이).
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상글리페린(류)"는 상글리페린 A와 구조적으로 유사하나, 조성에서 약간 다른 화학 화합물 (일 원자가 다른 것에 의해 치환된 것과 같이 또는 특정 관능기의 존재 또는 부존재에서와 같이), 특히, 스트렙토마이세스 종. A92-308110의 발효에 의해 발생된 것들을 지칭한다. 이의 예는 WO97/02285와 WO98/07743에서 논의된, 상글리페린 B과 같은, 상글리페린-유사 화합물을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이합성적 상글리페린(류)" 또는 "변이합성적 상글리페린 유사체(류)"는 상글리페린 A, B, C 또는 D와 구조적으로 유사하나 조성에서 약간 다른 화학 화합물 (일 원자가 다른 것에 의해 치환된 것과 같이 또는 특정 관능기의 존재 또는 부존재에서와 같이), 특히, 배양물에 메타-타이로신 유사체가 공급되는 스트렙토마이세스 종 A92-308110 또는 이의 변이에 의해 생성된 것들을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "메타-타이로신 유사체(류)"는 메타-타이로신과 구조적으로 유사하나 조성에서 약간 차이가 있는 화학 화합물 (일 원자가 다른 것에 의해 치환된 것과 같이 또는 특정 관능기의 존재 또는 부존재에서와 같이), 특히, 식 (III)에서 나타난 것들을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "마크로시클릭 유사체", "마크로시클릭 상글리페린 유사체" 또는 "마크로시클릭 상글리페린"은 상기에서 가장 넓은 관점에서 본 발명을 대표하는 것으로 나타나는 화합물, 예를 들어, 식 (I)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적 허용염을 지칭한다. 이러한 화합물들은 "본 발명의 화합물" 또는 "상글리페린의 유도체" 또는 "상글리페린 유사체"로 또한 지칭되며 이러한 용어들은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "HCV"는 플라비비리데과의 단일 본쇄 RNA, 피막형 바이러스인 간염 C 바이러스를 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "HIV"는 인간 후천성 면역 결핍 증후군의 원인 병원체인 인간 면역결핍 바이러스를 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체이용성"은 약물 또는 다른 물질이 투여 후 생물학적 활성의 부위에서 흡수되거나 이용가능하게 되는 정도 또는 비율을 지칭한다. 이러한 특성은 화합물의 용해도, 장관내 흡수율, 단백질 결합과 대사의 정도 등을 위시한 많은 인자에 의존한다. 당해 분야의 숙련자에게 친숙할 수 있는 생체이용성에 대한 다양한 시험들이 본 명세서에 설명되어 있다 (또한 참조 Egorin 등 2002).
용어 "수용해성"은 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 수성 매체, 예를 들어, pH 7.4의 인산염 완충액에서, 또는 5% 글루코스 용액에서의 용해도를 지칭한다. 수용해성에 대한 시험은 하기 실시예에서 "수용해성 분석"으로 제시되어 있다.
식 (I)의 화합물과 같은 본 발명의 화합물의 약학적 허용염은 약학적 허용 무기 또는 유기산류 또는 염기류로부터 형성된 통상적인 염은 물론 4급 암모늄 산부가염을 포함한다. 적합한 산 염류의 더 상세한 예는 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산, 과염소산, 퓨마르산, 초산, 프로피온산, 석신산, 글리콜산, 포름산, 젖산, 말레산, 타르타르산, 구연산, 팔모산, 말론산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 퓨마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산, 하이드록시나프토산, 하이드로아이오드산, 말산, 스테로산, 탄닌산 등을 포함한다. 염화수소산 염이 특히 바람직하다. 그 자체로는 약학적 허용되지 않지만, 옥살산 같은 다른 산들은 본 발명의 화합물 및 이들의 약학적 허용염들을 얻는 데 중간체로서 유용한 염의 제조에 유용할 수 있다. 적절한 염기 염의 더 상세한 에는, 소듐염, 리튬염, 포타슘염, 마그네슘염, 알루미늄염, 칼슘염, 아연염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 콜린염, 디에탄올아민염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 및 프로카인염을 포함한다. 이하, 본 발명에 따른 화합물에 지칭은 식 (I)의 화합물 및 이들의 약학적 허용염들 둘 다를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알킬"은 통상 1-10 개 탄소원자를 포함하는 직쇄 또는 분지 알킬기, 예를 들어, C1-6알킬기를 나타낸다. "알케닐"은 둘 이상의 탄소들을 포함하는 (예를 들어 2-10 탄소, 예, C2-6알케닐기), 하나 이상의 이중결합으로 불포화된 알킬을 지칭한다.
알킬기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, 및 n-부틸과 같은 C1-4알킬기를 포함한다. 알케닐기의 예는 CH=CH2및 CH2CH=CH2와 같은 C2-4알케닐기를 포함한다.
당해분야에 사용되는 바와 같이, 용어 "시클로알킬"은 통상 3-10 개 탄소원자를 포함하는, 선택적으로 분지된, 환형 알킬을 나타내는 것으로서, 예를 들어, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 또는 시클로헵틸이다. 분지된 예는 2-메틸시클로펜틸이다. "시클로알케닐"은 은 통상 5-10 개 탄소원자를 포함하는 환형 알케닐기를 나타내는 것으로, 예를 들어 시클로펜틸, 시클로헥세닐 또는 시클로헵테닐이다. 시클로알킬 및 시클로알케닐기들은 예를 들어 모노시클릭 또는 바이시클릭 (스피로시클릭을 위시한)일 수 있지만, 모노시클릭이 적합하다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시클로알킬"은 통상 3-10 개 탄소원자를 포함하는 환형 알킬기를 나타내는 것으로서, 선택적으로는 분지되어 있고, 예를 들어 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 또는 시클로헵틸이다. 분지된 예는 2-메틸시클로펜틸이다. "시클로알케닐"은 통상 5-10 개 탄소원자를 포함하는 환형 알케닐기를 나타내는 것으로서, 시클로펜틸, 시클로헥세닐 또는 시클로헵테닐이다. 시클로알킬 및 시클로알케닐기들은, 예를 들어, 모노시클릭 또는 바이시클릭 (스피로시클릭)이나, 적합하게는 모노시클릭이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로시클릴"은 하나 이상의 고리 탄소 원자들 (예, 1, 2 또는 3개 고리 탄소원자, 1 또는 2개, 예를 들어, 1 개)이 O, N 및 S로부터 선택된 이종원자에 의해 치환된 시클로알킬기를 나타낸다. 예를 들어, 모노폴리닐, 피페라디닐, 피롤리디닐, 피페라지닐 및 N-메틸 피페라지닐을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로시클레닐"은 하나 이상의 고리 탄소 원자 (예, 1, 2 또는 3 개 고리 탄소 원자, 1 또는 2개, 예를 들어, 1개)가 O, N 및 S로부터 선택된 이종원자에 의해 치환된 시클로알케닐기를 나타낸다.
아릴기의 예는 (지정된 경우를 제외하고) 모노시클릭 기, 예, 페닐 및 바이시클릭 고리 (예, 9 및 10 개 원소 고리들)를 포함하며 이들은 방향족이거나 또는 (바이시클릭 고리의 경우) 적어도 하나의 방향족 고리를 포함한다. 예를 들어, 바이시클릭 고리는, 나프틸과 같이, 전체가 방향족일 수 있거나, 테트랄린, 인덴 또는 인단과 같이, 부분적으로 방향족일 수 있다 (예, 하나의 방향족 고리를 포함). 바람직한 아릴은 페닐이다. 아릴기들은 선택적으로, 예를 들어, 하나 이상 (예, 1, 2 또는 3) 치환체, 예, 알킬 (예, C1-4알킬), 하이드록실, CF3,할로겐, 알콕시 (예, C1-4알콕시), 니트로, -SO2Me,시아노 및 CONH2로부터 선택된 것으로 치환될 수 있다.
헤테로아릴기의 예는 (지정된 경우를 제외하고), 모노시클릭 기 (예, 5 및 6 개 원소 고리) 및 바이시클릭 고리 (예, 9 및 10 개 원소 고리)를 포함하고 이들은 방향족이거나 (바이시클릭 고리의 경우, 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하고) 및 하나 이상의 헤테로원자 (예, 1, 2, 3 또는 4 개), N, O 및 S로부터 선택된 이종원자를 포함한다. 5개 원소 헤테로아릴 고리의 예는 피롤, 퓨란, 티오펜, 옥사졸, 오사디아졸, 티아졸 및 트리아졸을 포함한다. 6 개 원소 헤테로아릴 고리의 예는 피리딘, 피리미딘 및 피라진을 포함한다. 바이시클릭 고리의 예는 퀴놀린, 퀴나졸린, 이소퀴놀린, 인돌, 신놀린, 벤즈티아졸, 벤즈이미다졸, 푸린 및 퀴녹살린과 같은 완전 방향족 고리, 및 크로멘, 크로만, 테트라하이드로퀴놀린, 디하이드로퀴놀린, 이소인돌린 및 인돌린과 같은 부분적 방향족 고리를 포함한다. 모노시클릭 헤테로아릴기가 바람직하다. 전술한 헤테로아릴기들은 상기 기술된 바와 같이 선택적으로 아릴기에 대하여 치환될 수 있다.
바이시클릭 아릴 및 헤테로아릴기가 부분적 방향족일때, 상기 분자의 나머지로의 연결은 방향족 부분을 통해서 또는 비방향족 부분을 통해서 이뤄질 수 있다.
용어 "치료"는 예방적은 물론 요법성 치료를 포함한다.
용어 "식 II"는 식 IIA 및 식 IIB를 통틀어 지칭한다.
도 1: 화합물 23의 1H NMR.
도 2: 화합물 24의 1H NMR.
도 3: 화합물 25의 1H NMR.
도 4: 화합물 26의 1H NMR.
도 5: 화합물 27의 1H NMR.
도 6: 화합물 28의 1H NMR.
도 7: 화합물 29의 1H NMR.
도 8: 화합물 30의 1H NMR.
본 발명은, 상기 설정된 바와 같은 마크로시클릭 상글리페린 유사체류, 이들 화합물의 제조방법, 및 이들 화합물의 의약 용도로 사용하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 화합물은 헤미-케탈이 C-53 케토 및 C-15 하이드록실 기와 메탄올의 조합에 의해 형성되는 메탄올 부가생성물이다. 다른 구체예에서는, 이것은 그렇지 않다.
변수 n, X 2 -X 6 및 R 4 -R 9
적절하게는 n은 단일결합을 나타낸다.
적절하게는 R9는 OH를 나타낸다.
적절하게는, R4,R5,R6,R7및 R8는 독립적으로 H, F, Cl, Br, C2-6알케닐 또는 C1-10알킬을 표시하고, 상기 알킬기의 하나 이상의 탄소원자가 선택적으로 O, N 및 S(O)p로부터 선택된 이종원자에 의해 치환되고, 여기서 p는 0, 1 또는 2를 나타내고, 및 상기 알킬기의 하나 이상의 원자는 선택적으로 카보닐에 의해 치환되고 및 그러한 알킬기는 선택적으로는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 치환될 수 있다.
특정 구체예에서, R4,R5,R6,R7및 R8의 하나 이상이 나타내는 C1-10알킬기 (예, C1-6알킬기)의 탄소원자는 이종원자에 의해 치환된다.
-CH3가 N으로 치환된다면, 형성되는 기는 NH2. -CH2-가 N으로 치환된다면, 형성되는 기는 NH-이다. CHR-이 N으로 치환된다면, 형성되는 기는 NR-이다. 따라서, R4,R5,R6,R7또는 R8 기 내의 질소 원자들은 일차, 이차 또는 삼차 질소 원자일 수 있다.
-CH3이 O로 치환된다면, 형성되는 기는 OH이다.
R4,R5,R6,R7및 R8중 하나 이상이 나타낼 수 있는 C1-10알킬기 (예, C1-6알킬기)의 탄소원자가 이종원자에 의해 치환될 때, 그것은 O, S 또는 N, 특히, N 또는 O, 더 특별히 O에 의해 치환된다.
R4,R5,R6,R7및 R8 중 임의의 하나가 S(O)p기를 포함할 때, 변수 p는 적절하게는 0 또는 1을 나타낸다. 일 구체예에서 p는 0을 나타낸다. 다른 구체예에서, p는 1을 나타낸다. 다른 구체예에서, p는 2 를 나타낸다.
R4,R5,R6,R7및 R8중 하나 이상이 나타낼 수 있는 C1-10알킬기 (예, C1-6알킬기)가 하나보다 많은 헤테로원자를 포함할 때, 이러한 것들은 통상 둘 이상의 탄소원자들에 의해 분리될 수 있다.
적절하게는, R4,R5,R6,R7및 R8중 하나 이상이 나타낼 수 있는 C1-10알킬기 (예, C1-6알킬기)의 탄소원자들이 임의의 이종원자에 의해 치환되지 않는 것이다.
R4,R5,R6,R7및 R8중 하나 이상이 나타낼 수 있는 C1-10알킬기 (예, C1-6알킬기)의 탄소원자가 카르보닐에 의해 치환될 때, 상기 카르보닐은 적절하게는 다른 탄소원자 또는 질소 원자에 인접되게 위치된다. 적절하게는, 카르보닐기들은 황 또는 산소 원자에 인접하게 위치되지 않는다.
예를 들어, R4,R5,R6,R7및 R8 중 하나 이상은COC1-3알킬, 예, -COMe을 나타낸다.
적절하게는, R4,R5,R6,R7및 R8중 하나 이상이 나타낼 수 있는 C1-10알킬기 (예, C1-6알킬기)의 탄소원자들은 카르보닐로 치환되지 않는다.
R4,R5,R6,R7및 R8중 하나 이상이 나타낼 수 있는 C1-10알킬기 (예, C1-6알킬기)는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 치환될 수 있다. 예를 들어, R1,R2,R3,R4및 R5중 하나 이상은 CF3를 나타낼 수 있다. 대안적으로, R4,R5,R6,R7및 R8중 하나 이상은 하나 이상 (예, 하나의) Cl 또는 F 원자에 의해 치환된 C1-10알킬 (예, C1-6알킬)을 나타낼 수 있다 (예, CH2CH2Cl).
적절하게는, R4,R5,R6,R7및 R8이 나타낼 수 있는 C1-10알킬기들 (예, C1-6알킬기들)은 할로겐에 의해 치환되지 않은 것들이다.
R4,R5,R6,R7및 R8 기(들) 중 하나 이상이 C1-10알킬기 (예, C1-6알킬기)를 나타낼 때, 상기 기(들)는 적절하게는 C1-4알킬 (예, C 1-2알킬, 메틸과 같은)을 나타낸다.
일 구체예에서, R4,R5,R6,R7및 R8 중 하나 이상은 C1-6알킬 (C 1-2알킬과 같은) 또는 C2-3알케닐을 나타내며, 예를 들어, R4,R5,R6,R7및 R8 중 하나 이상은 메틸을 나타낸다.
적절하게는, R4는 H, F, Cl, CF3,OH또는 C1-6알킬 (예, 메틸)을 나타낸다. 가장 적절하게는, R4는 H 또는 F, 특히 H를 나타낸다.
적절하게는, R5는 H, F, Cl, CF3,OH,NH2또는 C1-6알킬 (예, 메틸)을 나타낸다. 더욱 적절하게는, R5는 H, F, OH 또는 NH2,특히 OH를 나타낸다.
적절하게는, R6는 H, F, Cl, CF3,OH또는 C1-6알킬 (예, 메틸)을 나타낸다. 더욱 적절하게는, R6는 H, Me 또는 F를 나타낸다.
적절하게는 R7는 H, F, Cl, CF3,OH또는 C1-6알킬 (예, 메틸)을 나타낸다. 더욱 적절하게는, R7는 H 또는 F를 나타낸다.
적절하게는 R8은 H, F, Cl, CF3,OH또는 C1-6알킬 (예, 메틸) 을 나타낸다. 더욱 적절하게는, R8은 H 또는 F, 특히 H를 나타낸다.
적절하게는 R4,R5,R6,R7및 R8중 하나 이상, 더 적절하게는 두 개 이상 (예를 들어, 세 개 이상)은 H를 나타내지 않는다.
적절하게는, R4,R5,R6,R7및 R8중 하나 이상, 예를 들어 두 개 이상은 F를 나타낸다.
적절하게는, R6및/또는 R7은 F를 나타낸다.
적절하게는, X2,X3,X4,X5및 X6중 적어도 두 개는 C를 나타낸다; 더욱 적절하게는, 적어도 세 개, 더욱 적절하게는 적어도 네 개 및 가장 적절하게는 다섯개 모두 C를 나타낸다.
일 구체예에서, X2는 N을 나타낸다 (따라서, R4는 부재이다). 다른 바람직한 구체예에서, X2는 C 을 나타낸다.
적절하게는 X3은 C를 나타낸다.
적절하게는 X4는 C를 나타낸다.
적절하게는 X5는 C를 나타낸다.
적절하게는 X6은 C를 나타낸다.
일 구체예에서, X2,X3,X4,X5및 X6각각은 C를 나타내고, R4는 H를 나타내고, R5는 OH를 나타내고, R6는 H를 나타내고, R7은 F를 나타내고, 및 R8은 H를 나타낸다.
일 구체예에서, X2,X3,X4,X5및 X6각각은 C를 나타내고, R4는 H를 나타내고, R5는 OH를 나타내고, R6은 Me를 나타내고, R7은 H를 나타내고, 및 R8은 H를 나타낸다.
일 구체예에서, X2,X3,X4,X5및 X6각각은 C를 나타내고, R4는 H를 나타내고, R5는 OH를 나타내고, R6은 F를 나타내고, R7은 F를 나타내고, 및 R8은 H를 나타낸다.
변수 X 1
일 구체예에서 X1은 -R3을 나타낸다. 일 구체예에서 X1은 -NR1R2를 나타낸다. 일 구체예에서 X1은 -OR1을 나타낸다.
특정 구체예에서, R1및/또는 R2및/또는 R3의 탄소 원자는 이종원자에 의해 치환된다.
-CH3이 N으로 치환되면, 생성되는 기는NH2이다. -CH2-가 N으로 치환되면, 형성되는 기는 NH-이다. CHR-이 N으로 치환되면, 형성되는 기는 NR-이다. 따라서, R1,R2,R3 개 내의 질소원자들은 일차, 이차 또는 삼차 질소원자들 일 수 있다.
-CH3이 O로 치환되면, 형성되는 기는 OH이다.
R1및/또는 R2및/또는 R3의 탄소 원자가 이종원자로 치환될 때, 적절하게는 O 또는 N, 특히 O로 치환된다.
R1및/또는 R2및/또는 R3의 탄소 원자가 S(O)p기로 치환될 때, 변수 p는 적절하게는 0 또는 1을 나타낸다. 일 구체예에서 p는 0을 나타내고, 다른 구체예에서, p는 1을 나타낸다. 다른 구체예에서, p는 2를 나타낸다.
R1및/또는 R2및/또는 R3가 하나보다 많은 이종원자를 포함할 때, 이러한 것들은, 예를 들어, 둘 이상의 탄소원자들에 의해 분리될 수 있다.
적절하게는, R1,R2및 R3의 어떠한 탄소원자도 이종원자로 치환되지 않는 것이다.
R1및/또는 R2및/또는 R3의 탄소원자가 카르보닐로 치환될 때, 상기 카르보닐은 적절하게는 다른 탄소 원자 또는 질소 원자 인근에 위치한다. 적절하게는, 카르보닐 기들이 황 또는 산소 원자 인근에 위치하지 않는 것이다.
예를 들어, R1및/또는 R2및/또는 R3은 COC1-4알킬, 예, -COMe 을 나타낼 수 있다.
적절하게는, R1의 탄소 원자는 카르보닐로 치환되지 않는 것이다.
적절하게는, R2의 탄소 원자는 카르보닐에 의해 치환되지 않는 것이다.
적절하게는, R3의 탄소 원자는 카르보닐에 의해 치환되지 않는 것이다.
R1및/또는 R2및/또는 R3기의 하나 이상의 탄소 원자들이 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 치환될 때, 예증적 할로겐 원자들은 F, Cl 및 Br, 특히, F 및 Cl, 특별히 F이다. 예증적인 할로겐화된 R1및/또는 R2및/또는 R3분체는 CF3이다.
예를 들어, R1,R2및 R3중 하나 이상은 C1-10알킬 (예, C1-6알킬)을 표시하고, 이는 하나 이상의 (예, 하나의) Cl 또는 F 원자로 치환될 수 있다 (예, CH2CH2Cl).
적절하게는, R1,R2및 R3탄소 원자가 할로겐으로 치환되지 않는 것이다.
하나 이상의 R1,R2및 R3 기들이 C1-10알킬기 (예, C1-6알킬기)를 나타내고, 적절하게는, 상기 기들은 C1-4알킬 (예, C 1-2알킬, 즉 메틸과 같은)를 나타낸다.
R1및/또는 R2및/또는 R3이 알킬아릴을 나타낼 때, 이의 예는 C1-2알킬아릴, 예를 들어, 벤질을 포함한다.
R1및/또는 R2및/또는 R3가 알케닐아릴을 나타낼 때, 이의 예는 C2-3알케닐아릴 예를 들어, 에테닐페닐을 포함한다.
R1및/또는 R2및/또는 R3가 알킬헤테로아릴을 나타낼 때, 이의 예는 C1-2알킬헤테르아릴, 예를 들어, 메틸피리딜을 포함한다.
R1및/또는 R2및/또는 R3가 알케닐헤테로아릴을 나타낼 때, 이의 예는 C2-3알케닐헤테로아릴 예를 들어, 에테닐피리딜을 포함한다.
적절하게는, R1은 수소를 나타내지 않는다.
적절하게는, R1및 R2둘 다는 수소를 나타내지 않는다.
적절하게는, R2의 탄소원자는 임의의 이종원자로 대체되지 않는다.
X 1 이 NR 1 R 2 을 나타낼 때
X1이 NR1R2을 나타낼 때, R1은, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬시클로알킬, 알킬시클로알케닐, 알케닐시클로알킬, 알케닐시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐아릴 또는 알케닐헤테로아릴을 나타낼 수 있다.
R2는, 예를 들어 H, 알킬 (예, C1-4알킬), 알케닐 (예, C2-4알케닐), 또는 O알킬 (예,-OC1-4알킬), 특히, H 또는 알킬을 나타낸다.
예증적 R1기들은 모노시클릭 아릴 또는 모노시클릭 헤테로아릴, C1-4알킬, OC1-4알킬, COC1-4알킬 또는 C2-4알케닐로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴을 포함하거나, R1은 알킬 또는 O알킬을 나타낼 수 있다. 전술한 예증적 기들은, 예를 들어, H 또는 알킬을 나타내는 R2와 함께 사용된다.
다른 예증적 R1기들은 메틸, -CF3,에틸, 이소프로필, -CH2CH=CH,이소부틸, 시클로헥실을 포함한다. 전술한 예증적 기들은, 예를 들어, H 또는 Me를 나타내는 R2과 함께 사용될 수 있다.
다른 예증적 R1기들은 선택적으로 치환된 피리딜 또는 페닐, 예를 들어 페닐로 치환된 페닐을 포함한다. 전술한 예증적 기들은, 예를 들어, H, Me 또는 Ome을 나타내는 R2와 같이 사용될 수 있다.
다른 예증적 R1기들은 OMe, -OCF3,O에틸, O-이소프로필, -SMe, O-n-프로필, -O-n-부틸, -O-t-부틸, O-이소부틸, O-CH2C(Me)3을 포함한다. 전술한 예증적 기들은, 예를 들어, H, Me. 에틸, 이소프로필 또는 터트-부틸을 타나내는 R2와 같이 사용될 수 있다.
다른 예증적 R1기들은 O- (선택적으로 치환된 페닐)을 포함한다. 전술한 예증적 기들은, 예를 들어, H, 또는 Me를 나타내는 R2와 함께 사용될 수 있다.
대안적으로, R1및 R2는 연결되어서 NR1R2가 제시된 특정 질소 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 헤테로시클릭 고리를 나타낼 수 있다.
NR1R2가 나타낼 수 있는 헤테로시클릭 고리는 통상 4-8 개 고리 원자, 예, 5-7개 고리 원자, 특히 5 또는 6 개 고리 원자들을 포함한다.
NR1R2가, 예를 들어, 나타낼 수 있는 헤테로시클릭 고리는 상기 특정된 질소 원자만을 (예, 이는 피롤리딘이나 피페리딘을 나타낸다) 또는 하나 또는 두 개 (예, 하나)의 추가적인 이종원자, 특히, 질소나 산소 원자를 포함한다.
예를 들어, 상기 NR1R2가 나타낼 수 있는 헤테로시클릭 고리는 모르폴리닐 또는 1,2-옥사지난 (N에 인접한 O를 포함하는 6원 포화 고리)일 수 있다.
NR1R2가 상기 특정된 질소원자를 함유하는 포화 또는 불포화 헤테로시클릭 고리를 나타내며, 상기 고리의 하나 이상의 탄소 원자가 선택적으로 O, N 및 S(O)p로부터 선택된 이종원자에 의해 대체되고, 여기서 p는 0, 1 또는 2를 나타내며, 및 상기 고리의 하나 이상의 탄소 원자들이 선택적으로 카르보닐에 의해 대체되고 및 그 헤테로시클릭 고리가 아릴 또는 헤테로아릴 고리와 융합되는 경우, 그 예는 테트라하이드로퀴놀리닐이다.
대안적으로, 적절하게는, NR1R2가 5-7개 원소 헤테로시클릭 고리를 나타내는 것으로, 예를 들어, 피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린 또는 피페라진이고, 피페라진의 4번 질소는 선택적으로 C1-4알킬에 의해 치환되어 있다.
다른 구체예에 있어서, 적절하게는, NR1R2은 5-7 개 원소 헤테로시클릭 고리를 나타내고, 예를 들어, 피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린 또는 피페라진 고리이며 피페라진의 4 번 질소는 선택적으로 C1-4알킬에 의해 치환되어 있고, 및 상기 고리 내의 질소 원자에 인접한 탄소 원자는 카르보닐에 의해 대체되어 있다. 따라서, 예를 들어, R1및 R2는 이들에 부착된 질소와 함께 피페리디논을 나타낸다.
다른 구체예에서, 산소 원자가 R1및 R2가 부착된 질소원자에 인접한다. 예를 들어, R1은 R1이 부착된 질소원자에 인접한 메틸렌이 O로 대체된 알킬 또는 알케닐을 나타낸다. 예를 들어, R1은 OC1-4알킬, 예, OMe를 나타낼 수 있다. 대안적으로, R1및 R2는 연결되어 있고, 및 R1이 부착된 질소 원자에 인접한 탄소원자는 O로 대체되어, 예를 들어, 1,2-옥사지난 고리 또는 1,2-이속사졸리딘을 형성한다.
다른 구체예에서, R1및 R2는 연결되어서 NR1R2가 상기 특정된 질소 원자를 함유하는 포화 또는 불포화 헤테로시클릭 고리를 나타내게 되고, 상기 고리의 하나 이상의 탄소 원자들은 선택적으로 O, N 및 S(O)p로부터 선택된 이종원자에 의해 추가로 대체되며, 여기서 p는 0, 1 또는 2를 나타내고, 및 상기 고리의 하나 이상의 탄소 원자들은 선택적으로 카르보닐에 의해 대체되고 그 헤테로시클릭 고리는 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 융합된다 (예, 페닐 또는 피리딜 고리에 융합된다).
NR1R2이 더불어 형성할 수 있는 분체의 예는 모르폴리닐, 옥사지난 (예, 1,2-옥사지난) 및 하기 표에 개시된 것을 포함한다:
Figure 112013096342271-pct00004
Figure 112013096342271-pct00005
아릴 또는 헤테로아릴 기를 포함하는 전술한 -NR1R2분체들은 또한, 상기 기에서, 하나 이상의 (예, 하나 또는 둘, 특히, 하나) 고리 치환체, 즉, C1-4알킬 (예, 메틸), 할로겐 (예, Cl 또는 F), C1-4알콕시 (예, 메톡시), 하이드록실, CF3,시아노, 니트로, SO2Me및 CONH2로부터 선택된 기를 선택적으로 포함할 수 있다
전술한 -NR1R2분체들은 하나 이상의 (예, 하나 또는 둘) 할로겐 (예, F 또는 Cl) 원자에 의해 선택적으로 치환될 수 있다.
X 1 이 OR 1 를 나타낼 때
X1이 OR1을 나타낼 때, R1은, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬시클로알킬, 알킬시클로알케닐, 알케닐시클로알킬, 알케닐시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐아릴 또는 알케닐헤테로아릴을 나타낼 수 있다.
일 구체예에서 R1은 모노시클릭 아릴 또는 모노시클릭 헤테로아릴으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴을 나타낸다. R1은, 예를 들어, 4-비페닐일을 표시하고, 여기서 상기 페닐 고리들 중 어느 하나는 선택적으로 치환되어 있다.
일 구체예에서, R1은 모노시클릭 아릴 또는 모노시클릭 헤테로아릴, C1-4알킬, OC1-4알킬, COC1-4알킬 또는 C2-4알케닐로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴을 나타낼 수 있다.
일 구체예에서, R1은 C1-6알킬 (C4-6알킬과 같은), C2-6알케닐, C1-4알킬C4-7시클로알킬 또는 C1-4알킬C5-7시클로알케닐을 나타낸다.
적절하게는, R1은 C2-10알킬 (예, C2-6알킬, 즉 C4-6알킬과 같은), C2-10알케닐 (예, C2-6알케닐, 즉 C4-6알케닐과 같은), 헤테로아릴 및 아릴로부터 선택된다.
따라서, 일 구체예에서, R1은 C4-6알킬, C 2-6알케닐, 헤테로아릴 및 아릴로부터 선택된다.
일 구체예에서, R1은 C4-7시클로알킬, C1-2알킬아릴 및 C1-2알킬헤테로아릴로부터 선택된다.
R1기의 예는 시클로헥실, -메틸시클로펜틸, CH2CH=CH2,에틸, n-프로필, n-부틸, t-부틸, i-부틸, -CH2C(Me)3,n-펜틸, -CH2CH2C(Me)3,n-헥실, n-헵틸, -시클로펜틸, -메틸시클로헥실, 페닐, -메틸페닐, -메틸피리딜, 티아졸, 트리아졸, 이미다졸, 옥사졸, 퓨란, 티오펜, 및 테트라졸을 포함하고, 예를 들어, CH2CH=CH2,n-부틸, t-부틸, i-부틸, -CH2C(Me)3,n-펜틸, -CH2CH2C(Me)3,n-헥실, n-헵틸, -시클로펜틸, -메틸시클로헥실, 페닐, -메틸페닐, -메틸피리딜, 티아졸, 트리아졸, 이미다졸, 옥사졸, 퓨란, 티오펜, 및 테트라졸로부터 선택된다.
다른 예증적 R1기는 상기 언급된 아릴 또는 헤테로아릴 기로서, 아릴 또는 헤테로아릴 기가 치환된 것을 포함한다.
X 1 이 R 3 을 나타낼 때
X1이 R3를 나타낼 때, R3는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬시클로알킬, 알킬시클로알케닐, 알케닐시클로알킬, 알케닐시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐아릴 또는 알케닐헤테로아릴을 나타낼 수 있고, 이들의 임의의 기는 모노시클릭 아릴 또는 모노시클릭 헤테로아릴로 선택적으로 치환될 수 있고; 및 아릴 또는 헤테로아릴 기의 부분이 아닌 R3의 하나 이상의 탄소 원자들은 O, N 및 S(O)p로부터 선택된 이종원자에 의해 선택적으로 대체되어 있고, 여기서 p는 0, 1 또는 2 을 표시하고, 단 R3이 부착된 카르보닐 기에 인접한 원자가 O 또는 N이 아닌 조건이며, 및 R3의 하나 이상의 탄소 원자들이 선택적으로 카르보닐에 의해 대체된다.
적절하게는, R3는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬시클로알킬, 알킬시클로알케닐, 알케닐시클로알킬, 알케닐시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐아릴 또는 알케닐헤테로아릴을 나타낸다.
적절하게는, R3는 C1-6알킬, C2-6알케닐, C1-4알킬C4-7시클로알킬 또는 C1-4알킬C5-7시클로알케닐을 나타낸다.
R3기의 예는메틸시클로펜틸, 에틸시클로펜틸, n-프로필, -CH(Me)(에틸), t-부틸,-CH(에틸)2,-CH(에틸)(i-프로필), -CH(Me)(i-부틸), CH(Me)(n-프로필), -CH(Me)(n-부틸), -CH(메틸)(n-펜틸), -CH(에틸)(n-프로필), 시클로펜틸, 테트라하이드로퓨란, 시클로헥실, 시클로헵틸, 헥사하이드로옥세핀, -메틸시클로헥실, -에틸시클로헥실, -CH(Me)(O에틸), -CH(Me)(O-이소프로필), -CH(OMe)(에틸), -CH(Me)(O에틸), -CH(OMe)(i-프로필), -CH(Me)(OMe), -CH(Me)(O-n-프로필), -CH(Me)(O-n-부틸), -CH(에틸)(O에틸), -CH2C(Me)3,-CH2CH2C(Me)3,티아졸, 이미다졸, 트리아졸, 트리아졸, 옥사졸, 퓨란, 피리딘 및 페닐을 포함한다.
추가의 예증적 R1기는 상기 아릴 또는 헤테로아릴기에서 아릴 또는 헤테로아릴 기가 치환된 것을 포함한다.
추가의 적절한 구체예
본 발명의 적절한 구체예에서, 하기 구조식에서 나타난 바와 같이, X1는 NMe(OMe)을 나타내고, R4는 H를 나타내고, R5는 OH를 나타내고, R6은 H를 나타내고, R7은 F를 나타내고, R8은 H를 나타내고, X2는 C를 나타내고, X3은 C를 나타내고, X4는 C를 나타내고, X5는 C를 나타내고, X6은 C를 나타내고, n은 단일 결합을 나타내고, 및 R9는 OH를 나타낸다:
Figure 112013096342271-pct00006
본 발명의 다른 적절한 구체예에서, 하기 구조식에서 나타난 바와 같이, X1은 NMe(OMe)을 나타내고, R4는 H를 나타내고, R5는 OH를 나타내고, R6은 H를 나타내고, R7은 F를 나타내고, R8은 H를 나타내고, X2는 C를 나타내고, X3은 C를 나타내고, X4는 C를 나타내고, X5는 C를 나타내고, X6은 C를 나타내고, n은 이중 결합을 나타내고, 및 R9는 H를 나타낸다:
Figure 112013096342271-pct00007
다른 적절한 구체예에서, 하기 구조식에서 나타난 바와 같이, X1은 NR1R2를 표시하고 여기서 R1및 R2는 더불어서 CH2CH2CH2CH2O를 나타내며 이는 결합되어 헤테로사이클을 형성하며, R4는 H를 나타내고, R5는 OH를 나타내고, R6는 H를 나타내고, R7는 F를 나타내고, R8는 H를 나타내고, X2는 C를 나타내고, X3는 C를 나타내고, X4는 C를 나타내고, X5는 C를 나타내고, X6는 C를 나타내고, n은 이중 결합을 나타내고, 및 R9는 OH를 나타낸다:
Figure 112013096342271-pct00008
다른 적절한 구체예에서, 하기 구조식에서 나타난 바와 같이, X1은 NR1R2를 표시하고 여기서 R1및 R2는 더불어서 CH2CH2CH2CH2O를 나타내며 이는 결합되어 헤테로사이클을 형성하며, R4는 H를 나타내고, R5는 OH를 나타내고, R6는 Me를 나타내고, R7는 H를 나타내고, R8는 H를 나타내고, X2는 C를 나타내고, X3는 C를 나타내고, X4는 C를 나타내고, X5는 C를 나타내고, X6는 C를 나타내고, n은 이중 결합을 나타내고, 및 R9는 OH를 나타낸다:
Figure 112013096342271-pct00009
본 발명의 다른 적절한 구체예에서, 하기 구조식에서 나타난 바와 같이, X1는 NMe(OMe)를 나타내고, R4는 H를 나타내고, R5는 OH를 나타내고, R6는 F를 나타내고, R7은 F를 나타내고, R8은 H를 나타내고, X2는 C를 나타내고, X3는 C를 나타내고, X4는 C를 나타내고, X5는 C를 나타내고, X6는 C를 나타내고, n은 이중 결합을 나타내고, 및 R9는 OH를 나타낸다:
Figure 112013096342271-pct00010
다른 적절한 구체예에서, 하기 구조식에서 나타난 바와 같이, X1은 NR1R2를 표시하고 여기서 R1및 R2는 더불어서 CH2CH2CH2CH2O를 나타내며 이는 결합되어 헤테로사이클을 형성하며, R4는 H를 나타내고, R5는 OH를 나타내고, R6는 F를 나타내고, R7는 F를 나타내고, R8는 H를 나타내고, X2는 C를 나타내고, X3는 C를 나타내고, X4는 C를 나타내고, X5는 C를 나타내고, X6는 C를 나타내고, n은 이중 결합을 나타내고, 및 R9는 OH를 나타낸다:
Figure 112013096342271-pct00011
본 발명의 다른 적절한 구체예에서, 하기 구조식에서 나타난 바와 같이, X1은 NH(2-피리딜)을 나타내고, R4는 H를 나타내고, R5는 OH를 나타내고, R6는 F를 나타내고, R7는 F를 나타내고, R8는 H를 나타내고, X2는 C를 나타내고, X3는 C를 나타내고, X4는 C를 나타내고, X5는 C를 나타내고, X6는 C를 나타내고, n은 이중 결합을 나타내고, 및 R9는 OH를 나타낸다:
Figure 112013096342271-pct00012
본 발명의 다른 적절한 구체예에서, 하기 구조식에서 나타난 바와 같이, X1은 NH(2-피리딜)을 나타내고, R4는 H를 나타내고, R5는 OH를 나타내고, R6는 F를 나타내고, R7는 H를 나타내고, R8는 H를 나타내고, X2는 C를 나타내고, X3는 C를 나타내고, X4는 C를 나타내고, X5는 C를 나타내고, X6는 C를 나타내고, n은 이중 결합을 나타내고, 및 R9는 OH를 나타낸다:
Figure 112013096342271-pct00013
특정 구체예에서, C26, 27 위치에서의 이중 결합 (상글리페린 A의 구조식을 참조하면)은 트란스 형태 대신에 시스 형태일 수 있다.
본 발명의 적절한 구체예에서, 하기 식에서 나타난 바와 같이, C26, 27 위치에서의 이중 결합은, 하기 식에서 나타난 바와 같이, 시스 형태이다:
Figure 112013096342271-pct00014
그러한 화합물들은 화학 합성을 통해 생성될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 화합물들은 변이합성으로 제조되어 식 (II)의 화합물을 생성한 후, 반합성을 수행한다.
Figure 112013096342271-pct00015
식 (IIA)
Figure 112013096342271-pct00016
식 (IIB)
식 (II)에서 적절한 X2,X3,X4,X5,X6,R4,R5,R6,R7및 R8기들은 식 (I)의 화합물에 대하여 정의한 바와 같다.
일반적으로, 식 (I)의 화합물들의 전구체 또는 이의 약학적 허용염을 제조하는 방법은:
- 발효액에 상글리페린 생산체 (스트렙토마이세스 종. A92-308110, 또한 DSM 9954로 알려진 것과 같은) 또는 더욱 바람직하게는, sfaA 유전자 또는 sfaA 유전자 동족체가 불활성화되거나 제거된 상글리페린 생산체의 배양물로 접종하고;
- 상기 발효액에 메타-타이로신 유사체 (식 (III)에 도시된 바와 같은)을 공급하고;
- 식 IIA 및 식 IIB의 화합물이 생성될 때까지 발효를 지속시키고;
- 식 IIA 및 식 IIB의 화합물을 추출 및 분리하고;
- 식 IIA 및 식 IIB의 화합물의 반합성적 유도화를 수행하여 식 I의 화합물을 생성하는 것을 포함한다.
식 (III)의 화합물들은 하기 정의한 바와 같다:
Figure 112013096342271-pct00017
식 (III)
상기식에서, R10은 H 또는 알킬기, 즉, Me와 같은 C1-6알킬와 같이, 에스테르를 형성할 수 있는 기를 나타낸다.
식 (III)에서 적절한 X2,X3,X4,X5,X6,R4,R5,R6,R7및 R8기들은 식 (I)의 화합물에 대하여 정의된 바와 같다.
상기 공급물은 식 (III)의 화합물의 라세미체 또는 L 형태일 수 있다.
식 (III)의 화합물들은 상업적으로 이용가능 하거나, 표준 유기 합성 화학 기법으로 제조될 수 있다. 식 (III)의 화합물에 대한 일반적인 경로는 하기 반응식 1에 도시된 바와 같다.
Figure 112013096342271-pct00018
반응식 1: a) 식 (IV)의 알데히드와 적절한 단편물, 예, (R11O)2P(O)CH(NHPG)CO2R10과의 커플링 및 b) 수소화 및 필요시 탈보호. PG = 보호기.
식 (IV)의 알데히드류는 상업적으로 이용가능하거나 당해분야의 숙련자에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 보호 및 탈보호 화학은 식 (III)의 화합물을 식 (IV)의 화합물로부터 생성하는 데 필요할 수 있다. 이러한 기법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있고, 적절한 보호기들은 Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis (Wuts and Greene, 4thEdition,2007)에 설명되어 있다
식 (IIA) 및 식 (IIB)의 화합물을 생성한 후, 본 발명의 화합물은 반-합성 유도체화하여 제조된다. 상글리페린 마크로시클릭 알데히드를 생성하는 반합성 방법은 미국 특허 제6,124,453호, Metternich 등, 1999, Banteli 등, 2001 및 Sedrani 등, 2003에 기술되어 있다.
일반적으로, 식 (I)의 특정 화합물 또는 이의 약학적 허용염을 상글리페린 변이합성적 유사체로부터 제조하는 반합성 방법은:
(a)상글리페린 유사체의 디하이드록실화;
(b)1,2-디올을 산화성 절단하여 알데히드를 생성; 및
(c)식 V의 화합물을 사용하여 상기 알데히드와, 포스페이트 카르보음이온과 같은, 안정화된 카르보음이온 (또는 이의 원형)과 커플링하는 것을 포함한다.
이것은 역합성적으로 하기에 나타나 있다:
Figure 112013096342271-pct00019
상기식에서 상글리페린 A 변이합성적 유사체들에 대하여, R12=
Figure 112013096342271-pct00020
R11기들은 동일하거나 상이할 수 있고, 독립적으로 알킬 (예, C1-4알킬) 또는 벤질을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 화합물을 제조하는 방법은 식 (V)의 화합물을 알데히드성 마크로사이클 (식 (VI)의 화합물)과 반응시키는 것을 포함한다.
식 (VI)의 화합물의 제조는 상글리페린 A를 이의 상응하는 알데히드성 마크로사이클로 전환하는 것에 대하여 이전에 설명된 것 (Metternich 등 1999)과 유사한 방법으로 수행될 수 있다. 상세하게, 식 (II)의 화합물을 개질된 사플리스 조건 (촉매성 오스뮴 테트록사이드)를 사용하여 디하이드록실화시킨다. 키랄 리간드를 사용하면 선택성을 증진시키는 데 도움이 된다. 다음, 결과된 디올을, 예를 들어, 과요드산 나트륨을 사용하여 산화적으로 절단할 수 있다. 다음, 식 VI의 화합물을 상동적 아미드, 에스테르 또는 케톤으로의 유도화용 기질로서 사용할 수 있다. 통상적으로, 식 (V)의 화합물을 비양자성 용매에 용해하고, 냉각하고, 및 염, 예를 들어 수산화 나트륨으로 처리한다. 다음, 식 (VI)의 화합물을 첨가하고, 및 가온 반응 시킨다. 적절한 시간 후, 반응을 종결시키고, 식 I의 화합물을 표준 조건 (예, 예비성 (preparative) HPLC, 예비성 TLC 등, 표준 상 플래쉬 크로마토그래피)으로 정제한다.
R9기들 및 n에 변화를 도입하는 유도화는 식 VI의 화합물의 생성 전에 또는 상동적 아미드를 형성하는 반응 후에 수행될 수 있다. 상세하게, R9에서의 하이드록실은 산성 조건에서 적절한 기질의 처리에 의해 제거되어 공역된 트리엔을 생성할 수 있다.
식 (V)의 화합물은 공지되어 있고 또는 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
예를 들어, X1이 NR1R2을 나타내는 식 (V)의 화합물은 이용가능한 아미류 (예, R1R2NH)로부터 용이하게 합성될 수 있다. 반응식 1 (하기)에 나타난 바와 같이, 상기 아민을 사용하여 염화 클로로아세틸을 처리하거나 또는 유사하게 알파-클로로아미드를 형성할 수 있다. 다음, 상기 알파-클로로아미드를 아르부조프 (Arbuzov) 반응으로 처리하여 식 V의 화합물을 생성한다. 식 V의 화합물에 대한 다른 경로는 당해 분야의 숙련자에게 명백할 것이다.
Figure 112013096342271-pct00021
반응식 1
X1이 R3을 나타내는 식 (V)의 다른 화합물은 공지되어 있거나, 이용가능한 카르복실 산 유도체 (예, R3COX)로부터 용이하게 합성될 수 있다. 반응식 2(하기)에서 나타난 바와 같이, 상기 카르복실산 유도체는 포스포네이트가 염기로 처리된 후 메틸 포스포네이트 상에 커플될 수 있다. 이것은, 식 (V)의 화합물에 대한 다른 경로가 당해분야에 명백하지만, 식 V의 화합물을 생성한다.
Figure 112013096342271-pct00022
반응식 2
X1이 OR1을 나타내는 식 (V)의 다른 화합물은 공지되어 있거나 이용가능한 알코올류(예, R1OH)로부터 용이하게 합성될 수 있다. 반응식 3(하기)에 나타난 바와 같이, 상기 알코올을 사용하여 염화 클로로아세틸을 처리하거나 유사하게 알파-클로로에스테르를 형성할 수 있다. 다음, 상기 알파-클로로에스테르를 아르부조프 반응으로 처리하여 식 II의 화합물을 생성한다. 식 II의 화합물에 대한 다른 경로가 본 발명의 숙련자에게 명백할 것이다.
Figure 112013096342271-pct00023
반응식 3
원하거나 필요시, 보호기들을 사용하여 상기 알데히드성 마크로사이클, 마크로사이클, 알코올 (R1OH),카르복실산 유도체 (R1R2R3COX)또는 아민 (R1R2NH)에서의 관능성, 또는 식 V의 화합물에서의 관능성을, T. W. Green, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience,NewYork,1999에서 설명된 바와 같이 보호할 수 있다.
본 발명에서 제시된 특정 방법과 참조문헌에 더하여, 당해분야의 숙련자들은 또한 Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry (Furniss 등, 1989) 및 March's Advanced Organic Chemistry (Smith and March, 2001)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 합성 방법에 대한 표준 교과서 참조문헌을 참조할 수도 있다.
본 발명에 따른 상글리페린 유사체를 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 투여할 수 있다. 둘 (또는 그 이상) 제제의 공동 투여는 사용될 각각의 용량을 줄여주고, 그럼으로써 부작용을 감소하며, 이는 향상된 효능과 그에 따른 더 높은 SVR로 그리고, 내성 감소로 이어질 수 있다.
그러므고, 일 구체예에서, 상기변이합성적 상글리페린 유사체는, 치료 기준으로부터 취해진, HCV 감염 치료용의 하나 이상의 치료제/들과 공동투여된다. 이것은 인터페론 (예, pIFNα 및/또는 리바비린)일 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 상글리페린 마크로사이클은 STAT-C (HCV 치료에 특이적으로 표적된 제제) 또는 DAA (직접 작용 항바이러스제)와 같은 하나 이상의 다른 항-바이러스 제제와 공동 투여되며, 이들을 하기 중 하나 일 수 있다: 비-뉴클레오시드 폴리머라제 저해체류 (예, ABT-333, ABT-072, BMS 791325, IDX375, VCH-222, BI 207127, ANA598, VCH-916, GS 9190, PF-00868554 (Filibuvir) 또는 VX-759), 뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드 폴리머라제 저해체류 (예, 2'-C-메틸시티딘, 2'-C-메틸아데노신, R1479, PSI-6130, R7128, R1626, PSI 7977 또는 IDX 184), 프로테아제 저해체류 (예, ABT-450, ACH-1625, BI 201355, BILN-2061, BMS-650032, CTS 1027, Danoprevir, GS 9256, GS 9451, MK 5172, IDX 320, VX-950(Telaprevir), SCH503034(Boceprevir), TMC435350, MK-7009 (Vaneprivir), R7227/ITMN-191, EA-058, EA-063 또는 VX 985), NS5A 저해체 (예, A-831, BMS 790052, BMS 824393, CY-102 또는 PPI-461), 실리마린, NS4b 저해체류, 세린 C-팔미토일트란스퍼라제 저해체류, 니타족사니드 또는 바이러스 침입 저해체류 (예, PRO 206).
다른 구체예에서 본 발명의 상글리페린 마크로사이클 HIV 치료용의 하나 이상의 다른 항바이러스 제제(강력한 항레트로바이러스 요법 (HAART)과 같은)와 공투여되며, 이들은 하기 중 하나일 수 있다: 뉴클레오시드 역전사효소 저해체류(NRTI)(예, 엠트리시타빈 또는 테노포비르), 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해체류(NNRTI) (예, 릴리피비린 또는 에파비렌즈), 프로테아제 저해체류(PI)(예, 리토나비르 또는 로피나비르), 융합 저해체류(예, 마라비록 또는 엔퓨비르티드), CCR5 저해체류(예, 아플라비록 또는 비크리비록), 성숙 저해체류(예, 베비리맷), CD4 단일클론 항체류(예, 이발리주맙) 및 인테그라제 저해체류 (예, 엘티에그라비르).
다른 구체예에서, 본 발명의 상글리페린 마크로사이클 HBV 치료용의 하나 이상의 다른 항바이러스 제제와 공동투여되며, 이들은 하기 중 하나 이상일 수 있다: 인터페론류 (예, 인터페론 알파 또는 PEG화된 인터페론 알파), 뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드 유사체류 (예, 라미부딘, 엔테카비르, 아데포비르 이피복실 또는 텔비부딘), 다른 면역조절제류 (예, 티모신 알파, CYT107 또는 DV-601) 또는 HMG CoA 리덕타제 저해체류 (예, 심바스타틴).
상기 제형들은 편리하게 단일 투약 형태로 제공될 수 있고 약학 분야에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 그러한 방법들은 상기 활성 성분 (본 발명의 화합물)을 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 연합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 제형들은 상기 활성성분을 액체 담체 또는 세밀히 분쇄된 고형 담체, 또는 둘 다와 균일하고 연합한 다음, 필요시 생성물을 조형함으로써 제조된다.
본 발명의 화합물은 선택적으로는 비-독성 유기 또는 무기 산 또는 염기, 부가염의 형태로, 약학적 허용 투약 형태로 있는 상기 활성 성분을 포함하는 약학 제형의 형태로, 경구적으로 투여될 것이다. 처리될 질병과 환자는 물론 투여 경로에 의존하여, 상기 조성물을 다양한 투약량으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은, 향미 또는 착색제를 포함할 수 있는, 속방성, 지연방출성 또는 서방성 적용 용도의 정제, 캡슐, 오뷸, 엘릭서, 용액 또는 현탁액의 형태로 경구, 볼 또는 설하로 투여될 수 있다.
그러한 정제들은 미세결정성 셀룰로즈, 락토즈, 구연산 나트륨, 탄산 칼슘, 이염기성 인산 칼슘 및 글리세린과 같은 부형제, 전분 (바람직하게는 옥수수, 감자나 타피오카 전분), 소듐 전분 글리콜레이트, 크로스카멜로즈 소듐 및 특정 복합 실리케이트와 같은 붕해제, 및 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 (HPMC), 하이드록시-프로필셀룰로즈 (HPC), 수크로즈, 젤라틴 및 아카시아과 같은 과립화 결합제를 포함할 수 있다. 또한, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르 산, 글리세릴 베헤네이트 및 탈크와 같은 윤활제가 포함될 수 있다.
유사한 유형의 고형 조성물을 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 부형제는 락토즈, 전분, 셀룰로즈, 유당 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜류를 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭서의 경우, 본 발명의 화합물은 다양한 감미 또는 향미제, 착색물질 또는 염료와, 에멀젼화 및/또는 현탁제와, 및 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 같은 희석제와, 및 이들의 조합물과 조합될 수 있다.
정제는 하나 이상의 보조 성분과 타정 또는 성형함으로 만들 수 있다. 타정된 정제는, 적절한 기기에서 분말이나 과립과 같은 자유 유동 형태로 있는 활성성분을, 선택적으로는 결합제 (예, 포비돈, 젤라틴, 하이드록시 프로필메틸 셀룰로즈), 윤할제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제 (예, 소듐 전분 글리콜레이트, 가교된 포비돈, 가교된 소듐 카르복시 메틸 셀룰로즈), 계면제, 또는 분산제와 혼합하여, 타정함으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제는, 분말화된 화합물을 불활성 액체 희석제로 습윤한 혼합물을 적절한 기기에서 성형함으로써 만들어질 수 있다. 상기 정제들은 선택적으로 코팅되거나 새겨넣을 수 있고, 및 제형화되어 예를 들어, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈를 원하는 방출 경과를 제공하는 다양한 비율로 사용하여 활성 성분의 지연방출 또는 서방 특성을 제공할 수 있다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제형들은, 각각 소정량의 상기 활성 성분을 함유하는 캡슐, 케세이, 또는 정제와 같은 구별된 단위체로서; 분말 또는 과립으로서; 수성액 또는 비수성액의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 상기 활성 성분은 또한 볼러스, 연약 또는 연고로서 제공될 수 있다.
특히 상기 언급한 성분외에, 본 발명의 제형은 문제의 제형 유형에 관하여 당해 분야에 통상적인 다른 제제들을 포함할 수 있고, 예를 들어, 경구 투여에 적합한 것들은 향미제를 포함할 수 있다.
유리하게는, 보존제와 완충제와 같은 제제들을 담체에 용해할 수 있다. 안정성을 향상시키기 위해, 상기 조성물을 바이알에 채우고 물을 진공에서 제거한 후 동결할 수 있다. 다음, 상기 동결건조된 분말을 바이알에 밀봉하고 사용전에 주사용 물을 담은 바이얼을 제공하여 액체를 사용전에 재구성할 수 있다. 본 발명의 화합물의 투약량은 특정 화합물, 연루된 질병, 대상체, 질병의 특성과 심한 정도, 대상체의 신체 상태, 및 투여 경로에 따라 변할 수 있다. 적절한 투여는 당해분야의 숙련자에 의해 용이히 결정될 수 있다.
상기 조성물들은 투여 방법에 의존하여, 본 발명의 화합물을 0.1중량 % 이상, 바람직하게는 5-60%, 더욱 바람직하게는 10-30중량 % 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물의 적절한 양과 개별 투약의 간격은 처리될 상태의 특성과 정도, 투여의 형태, 경로 및 위치, 및 처리될 대상체의 나이와 상태에 결정되며, 및 의사가 사용될 적절한 투여량을 최종 결정한다는 것이 당해분야의 숙련자에게 인지될 것이다. 이러한 투약은 적절한 빈도로 반복될 수 있다. 부작용이 나타나면, 표준 임상 시행에 따라 투약의 양 및/또는 빈도를 변경 또는 감소시킬 수 있다.
본 발명의 추가 관점:
- 본 발명에 따른 화합물의 약학물로서의 용도;
- 본 발명에 따른 화합물의, HCV 또는 HIV 감염과 같은 바이러스 감염 (특히 RNA 바이러스 감염)을 치료하기 위한 약학물로서의 용도, 항-염증제로서의 용도 또는 기관 이식 거부의 예방하기 위한 용도;
- 본 발명에 따른 화합물을 약학적 허용 희석제 또는 담체와 같이 포함하는 약학적 조성물;
- 본 발명에 따른 화합물과 약학적 허용 희석제 또는 담체를 같이 포함하고, 추가로 제2 또는 후속적인 활성 성분, 특히, HCV 또는 HIV 감염과 같은 바이러스 감염의 치료에 처방된, 항염증제로서의 용도 또는 기관 이식 거부의 예방용도의 활성 성분을 포함하는 약학 조성물;
- 본 발명에 따른 화합물의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, HCV 또는 HIV 감염과 같은 바이러스 감염 (특히 RNA 바이러스 감염)의 치료, 항염증제로서의 사용 또는 기관 이식 거부를 예방하는 방법;
- HCV 또는 HIV 감염과 같은 바이러스 감염 치료용, 항염증제로서의 용도용, 또는 기관 이식 거부 예방용 의약물의 제조에 본 발명의 화합물을 사용하는 용도.
일반적 방법
재료 및 방법
세균 균주 및 성장 조건
상글리페린 생산균 스트렙토마이세스 종. A92-308110 (DSM no 9954, DSMZ, 브라운슈바이크, 독일로부터 구입), BIOT-4253 및 BIOT-4370로도 불리우고, 또는 BIOT-4585과 같은, 유도체를 배지 오트밀 아가, MAM, ISP4 또는 ISP2 (하기 참조) 상에서, 28℃에서 유지한다.
BIOT-4585 (제작 방법론 용, 실시예 1 참조)를 오트밀 아가 상에서 28℃에서 7-10 일간 성장시켰다. 상기 아가 플레이트의 표면으로부터 포자를 수집하여 20% w/v 멸균 글리세롤를 함유한 증류수 용액에 넣고, 0.5-ml 분획물로 -80℃에서 보관하였다. 동결된 포자 스탁을 사용하여 종균 배지 SGS 또는 SM25-3에 접종하였다. 접종된 종균 배지를 200 내지 300 rpm 사이에서, 5.0 또는 2.5 cm 길이로 진탕하면서 27℃에서 24 시간 배양하였다. 발효 배지 SGP-2 또는 BT6에 종균 배양액 2.5%-10%를 접종하고, 200 내지 300 rpm 속도로 5 또는 2.5 cm 거리로 진탕하면서 24ㅊC에서 4-5 일간 배양하였다. 추출하기 위해 배양액을 수거하였다.
메타- 타이로신 유사체
메틸 (2S)-2-아미노-3-(6-하이드록시(2-피리딜))프로파노에이트, L-3-아미노페닐알라닌 메틸 에스테르, L-4-메틸-메타-타이로신 메틸 에스테르, L-4-플루오로-메타-타이로신 메틸 에스테르 및 L-4,5-디플루오로-메타-타이로신 메틸 에스테르를 Netchem (USA)으로부터 구입하였다.
DL-3-플루오로페닐알라닌 및 L-페닐알라닌을 Sigma (UK)로부터 구입하였다.
DL-메타-타이로신을 Fluorochem (UK)으로부터 구입하였다.
L-메타-타이로신을 Alfa Aesar (UK)로부터 구입하였다.
(S)-메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트를 NetChem (USA)로부터 구입하였다. (3-브로모-5-플루오로아니솔 (9-1)을 Accela ChemBio Co., Ltd., (상해, 중국)으로부터 구입하였고, 또한 Amfinecom Inc (USA) 또는 Apollo Scientific Ltd. (UK))로부터 구입할 수 있다.
DL-5-플루오로-메타-타이로신 (8),DL-5-플루오로-메타-타이로신 (9),메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트 (10),메틸 2-아미노-3-(2-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트 (11),메틸 2-아미노-3-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)프로파노에이트 (12)및 메틸 2-아미노-3-(2,6-디플루오로-3-하이드록시페닐)프로파노에이트 (13)을 하기와 같이 합성하였다:
DL-4-플루오로-메타-타이로신(8)
Figure 112013096342271-pct00024
8-1 (3 g, 19.5 mmol)이 함유된 무수 DCM (150 mL) 용액에 BBr3(4M함유 DCM, 14.6 ml, 58.5 mmol)를 -70℃에서 점적하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 -20℃에서 3 시간 교반하고, 빙수를 조심스럽게 첨가하고, DCM로 추출하였다. 유기층들을 물과 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과 및 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 크로마토그래피하여 소정의 화합물 8-2를 얻었다.
8-2 (0.9 g, 6.4 mmol)가 함유된 아세톤 (40 mL)에 K2CO3(2.2g,16mmol)을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물을 첨가하고 아세톤을 진공에서 제거한 다음, EtOAc로 추출하고, 유기층을 물과 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 정제 및 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 크로마토그래피하여 소정의 화합물 8-3을 얻었다.
8-3 (1 g, 4.34 mmol), 히푸르산 (860 mg, 4.80 mmol), NaOAc (400 mg) 및 Ac2O(2.2mL)의 혼합물을 80℃에서 2 시간 교반하였다. 노란 반응 혼합물을 냉각하고 냉각된 EtOH (10 mL)를 첨가하고, 혼합물을 냉각조에서 15분간 냉각시킨 후 빙수 30 mL에 붓고, 냉각하고, 생성물을 여과하여 수집하였다. 고형물을 진공 건조하여 8-4를 생성하였다.
8-4 (300 mg, 0.8 mmol) 및 NaOAc (71 mg, 0.87 mmol)을 함유한 MeOH (50 mL)용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 회전 증발시켜 제거하고, 잔류물을 EtOAc 50 mL에 용해하고, 상기 EtOAc 용액을 물로 두번 세척하고 농축하여 8-5를 생성하였다.
8-5 (360 mg, 0.89 mmol)를 함유한 MeOH (50 mL)용액을 10% Pd/C (77 mg) 상에서 정상 압력에서 20 시간 동안 수소화시켰다. 촉매를 여과로 제거한 후, 용배를 증발시켜 생성물 8-6을 얻었다.
8-6 (210 mg)을 함유한 3 N HCl (10 mL) 용매를 24 시간 재환류하였다. 이 용액을 농축 건조하고 잔류물을 역-콤비플래쉬로써 정제하여 목표 생성물 8을 얻었다.
DL-5-플루오로-메타-타이로신 (9) 및 메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하드록시페닐)프로파노에이트 (10)
Figure 112013096342271-pct00025
9-1 (20 g, 97.55 mmol)을 함유한 테트라하이드로퓨란 (100 mL) 용액에 n-부틸 리튬 (43 mL, 2.5M, 107.3 mmol)을 -78℃에서 적가하였다. 30 분간 교반하고, N,N-디메틸포름아미드 (15.1 mL, 195.1 mmol)를 그 온도에서 첨가하였다. 다시 30 분간 교반 하고, 냉각조를 제거하였다. 1 시간 후, 반응물을 포화된 수성 염화 암모늄으로 냉각하였다. 유기층을 물과 포화된 수성 염화 나트륨으로 세척하고, 건조시키고 (황산 나트륨), 여과 및 농축하였다. 잔류물을 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 9-2를 얻었다.
9-2 (6 g, 38.9 mmol)를 함유한 무수 DCM (200 mL)에 BBr3(4M함유 DCM, 30 ml, 116.8 mmol)를 -70℃에서 적가하였다. 첨가후, 반응 혼합물을 -20℃에서 3 시간 교반하고, 빙수를 조심스럽게 첨가하고, DCM로 추출하였다. 유기층들을 물과 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과 및 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 크로마토그래피하여 소정의 화합물 9-3를 수득하였다.
메틸 2-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-(디메톡시포스포릴)아세테이트 (4.64 g, 14 mmol)을 함유한 DCM (150 mL) 용액에 DBU(4.26 g, 28 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 10 분 후, 9-3(1.95g,14mmol)을 첨가하고, 결과된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이 용액을 EtOAc (150 mL)로 희석시키고, 분리하고, 및 유기층을 1 N HCl로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과 및 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 9-4을 얻었다.
9-4 (1 g)을 함유한 MeOH (20 mL) 용액을 정상 압력하 10% Pd/C 200 mg 상에서 밤새 수소화시켰다. 여과하여 촉매를 제거한 후, 용매를 증발시켜 10을 수득하였다.
10 (300 mg, 1.4 mmol)을 함유한 EtOH (30 mL) 용액에 수성 NaOH (2 N, 4 mL)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 30 분간 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 pH=6으로, 2 N HCl를 사용하여 중성화시키고, 생성된 흰색 결정을 여과로써 수집하여 표적 화합물 9를 얻었다.
메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트 (10)에 대한 다른 경로
(3,5-디플루오로브로모벤젠 (9a-1)을 Darui Fine Chemicals Co., Ltd., (상해, 중국)으로부터 구입하였고, 또한 Alfa Aesar 또는 Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다.)
Figure 112013096342271-pct00026
9a-2의 제조
BnOH (1.61 mL, 15.54 mmol)을 함유한 DMF (30 mL) 용액에 NaH (622 mg, 미네랄 오일 내의 60% 분산액, 15.54 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 실온에서 0.5 시간 연속 교반하여 맑은 용액을 얻었다. 9a-1(1.79mL,15.54mmol)를 그러한 속도로 첨가하여 40℃ 미만의 온도를 유지하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하여 노란 용액을 얻었다. 반응물을 물로 식히고, 석유 에테르로 추출하였다 (35 mL x 4). 혼합된 유기층을 농축하였다. 잔류물을 석유 에테르로 용출하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 9a-2 (2.544 g)을 무색 오일로 얻었다.
9a-3의 제조
건조된 삼구 플라스크에 Mg (170.1 mg, 7.10 mmol), 무수 THF (10 mL), 및 적은 양의 요오드를 질소하에서 첨가하였다. 9a-2(1.664g,5.9192mmol)을 함유한 THF (2 mL)의 1/3을 첨가하였다. 이 혼합물을 가열 환류시켰다. 이 사이에, 노란색 혼합물이 점차 밝은 노란색이 되었다. 다음, 남은 9a-2의 2/3를 적가하고, 반응 혼합물을 다른 0.5 시간 동안 재환류시켰다.
상기 혼합물에 DMF (0.504 mL, 6.51 mmol)를 0℃에서 서서히 첨가하였다. 실온에서 0.5 시간동안 교반을 계속하였다. HCl (2 M, 10 mL)을 첨가하고, THF를 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (25 mL x 3)로 추출하였다. 혼합된 유기층들을 염수로 세척하고 진공에서 농축하였다. 잔류물을 잔류물을 석유 에테르 대 석유에테르/에틸 아세테이트 = 20/1로 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 9a-3 (694 mg)을 무색 오일로 생성하였다.
9a-5의 제조
메틸 2-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-(디메톡시포스포릴) 아세테이트, 9a-4(993mg,3.00mmol)를 함유한 DCM (30 mL)에 (832uL, 5.57 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 10 분 후, 9a-3(694mg,3.01mmol)을 첨가하고, 결과의 혼합물을 실온에서 1 시간 교반하였다. 용액을 HCl (1 M, 10 mL)로 세척하고, 혼합된 유기층을 건조하고 진공 농축하였다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 (디클로로메탄/에틸 아세테이트 = 10/1으로 용출) 9a-5(1.11g)을 수득하였다.
10의 제조
9a-5 (100 mg)을 함유한 MeOH (50 mL) 용액을 10% Pd/C의 20 mg 상에서 2 시간 동안 정상 압력에서 수소화시켰다. 촉매를 여과하여 제거한 후, 용매를 증발시켜 10 (33 mg)을 얻었다.
메틸 2-아미노-3-(2-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트 (11)
Figure 112013096342271-pct00027
화합물 11-1 (1.4 g, 9 mmol)을 함유한 50 mL DCM에 BBr3(4M함유 DCM, 3.6 mL, 13.5 mmol)를 -78℃에서 적가하였다. 첨가 후, 반응물을 -20 ℃에서 4 시간 동안 교반하였다. 다음, 얼음/물을 서서히 첨가하고, 층들을 분리하고, 유기층을 물과 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다.
메틸 2-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-(디메톡시포스포릴)아세테이트 (3 g, 9 mmol)을 함유한 100 mL DCM 용액에 DBU (2.8 g, 18 mmol)을 실온에서 첨가하고, 10 분 후, 화합물 11-2 (마지막 단계로부터 얻은 미정제 화합물)을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 다음, 그 용액을 DCM (50 mL)로 희석하고, 1N HCl (20 mL)으로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 건조할 때까지 증발시켰다. 잔류물을 실리카 젤 크로마토그래피로 정제하여 (석유 에테르/에틸 아세테이트=5/1) 11-3을 얻었다.
화합물 11-3 (500 mg, 1.5 mmol)이 내포된 MeOH (20 mL) 혼합물을 10% Pd/C 50 mg 상에서 정상 압력하 밤새 수소화시켰다. 여과하여 상기 촉매를 제거한 후, 용매를 증발시켜 미정제 생성물을 얻고, 이를 역-콤비플래쉬하여 흰색 고형물로서 11을 얻었다.
메틸 2-아미노-3-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)프로파노에이드 (12)
Figure 112013096342271-pct00028
화합물 12-1 (1.4 g, 9 mmol)을 함유한 50 mL DCM 용액에 BBr3(4MinDCM,3.6mL,13.5mmol)를 -78 ℃에서 적가하였다. 첨가 후, 반응물을 -20 ℃에서 4 시간 교반하였다. 얼음/물을 서서히 첨가한 후, 층들을 분리하고, 유기층을 물과 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 증발 건조하였다. 잔류물을 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다.
메틸 2-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-(디메톡시포스포릴)아세테이트 (3 g, 9 mmol)를 함유한 100 mL DCM 용액에 DBU (2.7 mL, 18 mmol)를 실온에서 첨가하고, 10 분 후, 화합물 12-2 (마지막 단계에서 얻은 미정제 화합물)을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 다음, 이 용액을 DCM (100 mL)로 희석시키고, 1N HCl (30 mL)으로 세척하고, Na2SO4상에서 건조하고, 및 증발 건조하였다. 잔류물을 실리카 젤 크로마토그래피 (석유 에테르/에틸 아세테이트 = 5/1)로 정제하여 12-3을 생성하였다.
화합물 12-3 (500 mg, 1.44 mmol)을 함유한 MeOH (10 mL) 혼합물을 10% Pd/C 50 mg 상에서 정상 압력하 밤새 수소화시켰다. 여과하여 상기 촉매를 제거한 후, 용매를 증발시켜 미정제 생성물을 얻고, 이를 역-콤비플래쉬하여 소정의 화합물 12 를 흰색 고체로 얻었다.
메틸 2-아미노-3-(2,6-디플루오로-3-하이드록시페닐)프로파노에이드 (13)
Figure 112013096342271-pct00029
2,4-디플루오로페놀 (2 g, 15.4 mmol)을 함유한 50 mL DMF 용액에 K2CO3(3.2g,23.1mmol)및 BnBr (2.2 mL, 18.5 mmol)를 0 ℃에서 첨가하였다. 이 반응물을 실온에서 2 시간 교반하였다. 물(100 mL)과 EA(200 mL)를 첨가하고, 유기 상들을 물(50 mL)과 염수(50 mL)로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 실리카 젤 크로마토그래피 (석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1)로 정제하여 미정제 화합물 13-1을 얻었다.
화합물 13-1 (2 g, 9 mmol)을 함유한 10 mL THF 용액에 n-BuLi (4 mL, 2.5 M)을 -78 ℃에서 적가하고 30분간 교반하였다. DMF (1.3 g, 0.018 mmol)를 첨가하고 30분간 다시 교반하였다. 다음, 냉각조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 교반한 후 물로 식혔다. 이를 에틸 아세테이트로 추출하고 (20 mL x3), Na2SO4상에서 건조시키고 및 증발 건조시켰다. 잔류물을 실리카 젤 크로마토그래피 (석유 에테르/에틸 아세테이트 =10/1)로 정제하여 13-2 를 노란 고체로서 얻었다.
메틸 2-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-(디메톡시포스포릴)아세테이트 (728 mg, 2.2 mmol)를 함유한 20 mL DCM 용액에 DBU (319 mg, 2.1 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 10 분 후, 화합물 13-2 (500 mg, 2 mmol)을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 다음, 용액을 DCM (50 mL)로 희석하고, 1N HCl (20 mL)로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 및 증발 건조시켰다. 잔류물을 실리카 젤 크로마토그래피 (석유 에테르/에틸 아세테이트 =5/1)로 정제하여 13-3을 노란 오일로서 얻었다.
화합물 13-3 (600 mg, 1.32 mmol)을 함유한 MeOH (20mL)을 10% Pd/C 60 mg 에서 정상 압력하 밤새 수소화시켰다. 여과하여 상기 촉매를 제거한 후, 용매를 증발시켜 미정제 생성물을 얻고, 이를 역-콤비플래쉬하여 소정의 화합물 13을 흰색 고체로서 수득하였다.
배지 레시피
배지를 만드는 데 사용된 물은 Millipore Elix 분석 등급 물 정제 시스템을 사용하여 제조하였다
Figure 112013096342271-pct00030
Figure 112013096342271-pct00031
Figure 112013096342271-pct00032
Figure 112013096342271-pct00033
Figure 112013096342271-pct00034
Figure 112013096342271-pct00035

일반적 발효 방법
BIOT-4585의 냉동보존된 포자 스탁 (제작 방법용, 참조 실시예 1)을 실온에서 해동하였다. 포자 스탁 4.0 mL을 배지 SM25 400 mL을 함유한 2L들이 삼각 플라스크로 옮기고 스폰지 (foam) 마개하여 생장력 있는 배양물 (종균 배양물)을 만들었다. 48 시간 27℃에서 250 rpm (5.0 cm 거리)으로 배양하였다. 이러한 종균 배양물로부터, 25 mL를 생성 배지 SGP2+5%HP20 250mL을 함유한 2L들이 삼각 플라스크에 옮기고 스폰지 마개로 막았다. 24℃ 및 250 rpm (2.5cm 거리)에서 24 시간 배양 후, 1M 염화수소 산에 함유된 소망의 전구체의 250 mM 라세믹 또는 125mM 거울상이성질체적으로 순수한 용액 2 mL 및 DL-피페라즈 산의 250mM 메탄올 용액 2 mL을 각 생성 플라스크에 첨가하여 최종 1mM 농도의 상기 전구체들의 개별 거울상 이성질체들을 만들었다. 선택적으로, DMSO를 1M 염화수소 산 대신에 사용할 수 있다. 상기 DL-피페라즈산은 선택적으로 생략할 수 있다. 24℃ 및 250rpm (2.5cm 거리)에서 추가로 4 일간 배양을 실시하였다.
LC-UV 및 LC-UV-MS에 의한 배양액 분석
배양액 (1 mL) 및 에틸 아세테이트 (1 mL)를 첨가하고 15-30 분간 혼합한 후, 10 분간 원심분리하였다. 유기층 0.4 mL을 수집하고, 증발 건조시킨 후, 아세토니트릴 0.20 mL에 재용해하였다.
HPLC 조건:
C18 Hyperclone BDS C18 컬럼 3u, 4.6 mm x 150 mm
Phenomenex Analytical C18 Security Guard Cartridge (KJ0-4282) 장착
컬럼 온도 50 ℃
유동 속도 1 mL/min
모니터 UV 240 nm
주입량 20 uL 분획물
용매 구배:
0 분: 55% B
1.0 분: 55% B
6.5 분: 100% B
10.0 분: 100% B
10.05 분: 55% B
13.0 분: 55% B
용매 A는 물 + 0.1% 포름산
용매 B는 아세토니트릴 + 0.1% 포름산
이러한 조건하에서, SfA는 5.5 분에서 용출된다.
이러한 조건하에서, SfB는 6.5 분에서 용출된다.
상기 설명된 크로마토그래피와 용매를 사용하여 양이온 모드로 작동하는 Bruker Daltonics Esquire 3000+ 전기분무 질량분광분석기와 조합된 통합된 Agilent HP1100 HPLC 시스템상에서 LCMS를 수행하였다.
QC LC-MS 방법
HPLC 조건:
C18 Hyperclone BDS C18 컬럼 3u, 4.6 mm x 150 mm
Phenomenex Analytical C18 Security Guard Cartridge (KJ0-4282) 장착
컬럼 온도 at 50 ℃
유동 속도 1 mL/min
모니터 UV 210, 240 및 254 nm
용매 구배:
0 분: 10% B
2.0 분: 10% B
15 분: 100% B
17 분: 100% B
17.05 분: 10% B
20 분: 10% B
용매 A는 물 + 0.1% 포름산이다.
용매 B는 아세토니트릴 + 0.1% 포름산이다
MS 조건:
MS는, 150에서 1500 amu까지 스캔하면서, 스위칭 모드 (양과 음 사이를 스위칭)로 작동한다.
HCV 항바이러스 활성 평가용 시험관내 리플리콘 분석
유전자형 1 HCV에 대한 항바이러스 효능을 하기와 같이 시험하였다: 시험 물질 첨가 하루 전에, HCV 유전자형 1b I389luc-ubi-neo/NS3-3/5.1 리플리콘 (Vrolijk 등, 2003)을 가지며, 및 세포 성장 배지 [DMEM (Cat No. 41965039), 10% FCS, 1% 비필수 아미노산 (11140035), 1% 페닐실린/스트렙토마이신 (15140148) 및 2% 제네티신 (10131027); Invitrogen 이 보충된]에서 1.3-1.4의 비율로 계대배양되고 3-4 일간 75cm2 조직 배양 플라스크 (Techno Plastic Products)에서 배양된, Huh5.2 세포를 수확하고, 및 분석 배지 (DMEM, 10% FCS, 1% 비필수 아미노산, 1% 페닐실린/스트렙토마이신)가 들어있는 96-웰 조직 배양 마이크로타이터 플레이터 (Falcon, Beckton Dickinson 항대사성 효과의 평가용, 및 CulturPlate, Perkin Elmer, 항바이러스 효과 평가용)에 6 500 세포/웰 (100μL/웰) 밀도로 종균접종하였다. 상기 마이크로타이터 플레이트를 밤새 배양하여 (37℃, 5% CO2,95-99%상대습도), 미-합류성 (non-confluent) 세포 단층을 형성하였다.
연속 희석물을 제조한다; 각 연속 희석물은 적어도 두 본으로 시행된다. 분석 설정후, 상기 마이크로타이터 플레이트들을 72 시간 항온처리한다 (37℃, 5% CO2,95-99%상대습도).
항-대사성 효과를 평가하기 위해, 상기 분석 배지를 흡인하고, 5% MTS (Promega)을 함유한 무페놀 레드 배지 용액 75 μL로 대체하고, 1.5 시간 (37℃, 5% CO2,95-99%상대 습도) 배양하였다. 흡광도를 498nm 파장에서 측정하고 (Safire2 Tecan) 광학밀도 (OD 값)을 미처리 대조군의 백분율로 전환하였다.
항바이러스 효과의 평가를 위해, 분석 배지를 흡인하고, 상기 세포 단층을 PBS로 세척하였다. 세척 완충액을 흡인하고, Glo Lysis Buffer (Cat. N°E2661, Promega) 25μL를 첨가한 후, 세포를 실온에서 5 분간 파괴하였다. 다음, 루시페라제 분석 시스템 (Cat. N°E1501, Promega) 50μL를 첨가하고 루시페라제 발광 신호를 즉시 정량한다 (1000ms 적분시간/웰, Safire2 Tecan). 상대 발광 단위를 미처리된 대조군의 백분율로 전환한다.
EC50 및 EC90 (용량-반응 곡선으로부터 유도된 값)은 각각 바이러스 복제의 50% 및 90% 저해율이 관찰되는 농도를 나타낸다. CC50 (용량-반응 곡선으로부터 유도된 값)은 세포의 대사 활성이 미처리된 세포의 대사 활성의 50 %로 감소되는 농도를 나타낸다. 선택성 지표는, 상기 화합물의 치료 창을 나타내는 것으로, CC50/EC50로서 계산된다.
화합물의 농도는, 그 특정 농도에서, 항-리플리콘 효과가 70% 역치를 넘고 및 대사 활성에서 30 % 감소만이 관찰될 때, 상기 HCV 리플리콘 시스템에서 진짜 항바이러스 효과를 이끌어 내는 것으로 생각되어진다.
유전자형 1a 및 2a에서 HCV 항바이러스 활성 평가용 시험관 내 리플리콘 분석
리플리콘 세포 (유전자형 1a (H77) 및 2a (JFH-1)의 하위유전체성 (subgenomic) 리플리콘)을 5% CO2배양기 내, 10% 우태아혈청 (FBS), 1% 페닐실린-스트렙토마이신 (pen-strep), 1% 글루타민, 1% 비필수 아미노산, 250 μg/ml G418을 함유한 둘베코의 변형된 필수 배지 (DMEM)에서, 37℃로 성장시킨다. 모든 세포 배양 시약은 Mediatech (Herndon, VA)로부터 구입할 수 있다.
리플리콘 세포를 트립신 처리하고, 96-웰 플레이트에, 웰당5 x 103세포로 G418 없는 상기 배지에 접종한다. 다음날, 배양 배지를 5% FBS 존재하에서, 연속적으로 희석된 화합물들을 함유하는 DMEM으로 대체한다. 상기 HCV 리플리콘 항바이러스 분석은 연속 희석된 화합물의 효과를 검사한다. 상세하게, 상기 HCV 리플리콘을 함유하는 세포를 96-웰 플레이트에 종균접종한다. 시험물을 5% FBS가 함유된 DMEM으로 연속 희석한다. 희석된 화합물을 상기 플레이트의 적절한 웰에 적용한다. 37℃에서 72 시간 배양후, 상기 세포를 가공한다. 각 웰로부터 얻은 세포내 RNA를 RNeasy 96 키트 (Qiagen)를 사용하여 추출한다. HCV RNA의 수준을, TaqMan　 One-Step RT-PCR 마스터 믹스 시약 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 ABI Prism 7900 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems)을 전술한 바와 같이 (Vrolijk 등, 2003) 사용하여 역전사효소-실시간 PCR 분석으로 결정한다. 세포독성 효과는 TaqMan　 Ribosomal RNA Control Reagents (Applied Biosystems)를 사용하여 세포수를 나타냄으로써 측정된다. 다음 HCV RNA 및 리보좀 RNA의 양을 사용하여 적용가능한 IC50값 (리플리콘 복제 상에서 50 % 저해하는 농도)를 유도한다.
마이크로좀 대사의 평가 (마이크로좀 안정성 분석)
마이크로좀에서의 대사율을 하기와 같이 시험할 수 있다:
마우스 또는 인간 간 마이크로좀을 완충액 C (0.1 M 인산칼륨 완충액, 1.0 mM EDTA, pH 7.4)로 2.5 mg/mL의 농도로 희석한다. 다음, 5 μM 화합물 스파이킹 용액 (9.5 μL ACN에 함유된 0.5 10 mM DMSO 스탁 용액, 990 μL 완충액 C에 첨가) 50 μL를 마이크로좀 용액 (2.5 mg/mL) 50 μL, 완충액 C 110 μL에 첨가하고, 잘 섞는다. 모든 샘플을 약 15 분간 37℃에서 예비 처리하였다. 이후, NADPH 용액 (12.5 mM) 40 μL 첨가하여, 부드럽게 혼합하면서 반응을 개시하였다. 분획물 (40 μL)을 0, 15, 30, 45 및 60 분에 얻고, 내부 표준물을 함유한 ACN (120 μL)로 냉각시킨다. 원심분리 (4000 rpm, 15 min)하여 단백질을 제거하고, 샘플 플레이트를 화합물 농도에 대하여 LC-MS/MS로써 분석하였다. 다음, 표준 방법으로 수명을 계산하고, 원래 존재한 양과 분석물의 농도를 비교한다.
간세포 안정성의 평가
액체 질소에 미리 보관된 냉동 간세포들을 37±1℃ 진탕 수조에 2분±15초 간 놓았다. 다음, 간세포를 미리가온된 크렙스-한셀라이트 중탄산염 (KHB) 완충액 (2000mg/L 글루코스, 탄산칼슘 및 중탄산 나트륨 부재, Sigma)의 10X 부피에 첨가하고, 가볍게 혼합하고, 500 rpm에서 3 분간 원심분리하였다. 원심분리후, 상등액을 조심스럽게 제거하고, 미리 가온된 KHB 완충액의 10x 부피를 첨가하여 세포 펠렛을 재현탁하였다. 이를 부드럽게 혼합하고, 500 rpm에서 3 분간 원심분리하였다. 다음 상등액을 제거하고 버렸다. 다음, 세포를 계수하여 세포 생존성 및 효율을 결정하고, 이러한 값을 사용하여 인간 간세포 현탁액을 적절한 접종 밀도로 생성한다 (생세포밀도 = 2x106세포/mL). 2X 용량 (dosing) 용액을 미리 가온된 KHB (1% DMSO)에서 제조한다 (200 μM 스파이킹 용액: DMSO 980 μL에 함유된 기질 스탁 20 μL 용액 (10 mM), 2X 용량 용액: KHB 990 μL (희석후 2μM)에 200 μM 스파이킹 용액 10 μL 첨가).
미리 가온된 2X 용량 용액50 μL를 웰에 첨가하고, 미리 가온된 간세포 용액 (2x106세포/mL) 50 μL를 첨가하고, 시간 측정한다. 다음, 플레이트를 37℃에서 처리한다. 항온처리 시간 완료 후 (0, 15, 30, 60 및 120 분), 내부 표준물을 함유하는 아세토니트릴 100 μL을 각 웰이 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 및 미리 가온된 간세포 용액 50 μL를 첨가한다 (2x106세포/mL). 배양 끝에, 세포 생존능을 결정한다. 샘플들을 4000 rpm에서 15분간 4℃에서 원심분리하고, 상등액을 초순수 물로 2 배 희석하고, 및 화합물 수준을 LC-MS/MS로 분석한다.
수용해성의 평가
수용해성을 하기와 같이 시험할 수 있다: 상기 상글리페린 유사체의 10 mM 스탁 용액을 100% DMSO 내에서, 실온에서 제조한다. 삼중 0.01 mL 분획물을 0.1 M PBS, pH 7.3 용액 또는 100% DMSO을 사용하여 황갈색 바이알 내에서 0.5 mL로 만든다. 결과된 0.2 mM 용액을 실온에서 IKA　 vibrax VXR 진탕기 상에서 6 시간 진탕한 후, 결과의 용액 또는 현탁액을 2 mL 에펜도르프 튜브로 옮기고, 30 분간 13200 rpm에서 원심분리한다. 다음 상등액의 분획물들을 전술한 바와 같이 LCMS 방법으로 분석한다.
대안적으로, PBS pH7.4에서의 안정성을 하기와 같이 시험할 수 있다: 시험 화합물들 및 대조군 화합물들을 H2O내 50% MeOH로 40μM, 16μM, 4μM, 1.6μM, 0.4μM, 0.16μM, 0.04μM 및 0.002 μM로 희석시킴으로서 검정선을 만든다. 다음, 표준점들을 MeOH:PBS 1:1에서 1:20로 더 희석시킨다. 1:20 희석후 최종 농도는 2000nM, 800nM, 200nM, 80nM, 20nM, 8nM, 2nM 및 1nM이다. 다음, 표준물을 내부 표준물(하이드록시마크로사이클, 6)함유 ACN의 동부피 (1:1)와 혼합한다. 샘플을 원심분리 (5 분, 12000rpm)하고, LC/MS로 분석한다.
Figure 112013096342271-pct00036
시험 화합물들을 DMSO내에서 10mM 농도의 스탁 용액으로 제조한다. 이러한 스탁 용액들을 PBS, pH7.4로 1.5mL 에펜도르프 튜브에서 1 %의 최종 DMSO 농도를 가진 100의 표적 농도로 이중으로 희석한다 (예, 10mM DMSO 스탁 용액 4를 396μL 100mM 인산염 완충액에 첨가). 다음, 샘플 튜브를 4 시간 동안 실온에서 가볍게 진탕한다. 샘플을 원심분리하여 (10 분, 15000rpm) 미용해된 입자를 침전시킨다. 상등액을 새 튜브에 옮기고, PBS로 희석한다 (개별 시험 물에 대한 희석 인자는 적용된 분석 기기 상에서 화합물의 신호 수준에 의해 확인된다). 다음, 희석된 샘플을 MeOH의 동일 부피(1:1)와 혼합한다. 샘플을 LC-MS/MS 분석용 내부 표준 물(하이드록시마크로사이클, 6)함유 ACN의 동일 부피 (1:1)와 최종적으로 혼합한다.
세포 투과성의 평가
세포 투과성을 하기와 같이 시험할 수 있다: 시험 화합물을 DMSO에서 10mM로 용해한 후, 완충액에서 추가로 희석하여 최종 10μM 투약 농도를 생성한다. 형광 표식자 루시퍼 옐로우를 또한 포함하여 멤브레인 온전성을 조사하였다. 다음 시험 화합물을 Caco-2 세포 단층의 정점 표면에 적용하고, 측저 (basolateral) 구획실로의 화합물 투과를 측정한다. 이것을 반대 방향으로 (측저에서 정부까지) 수행하여 활성적 수송을 조사한다. LC-MS/MS를 사용하여 시험 및 표준 대조군 화합물 (프로판올 및 아세부톨올과 같은) 둘 다의 수준을 정량화한다.
생체내 약동력학 평가
생체내 분석을 또한 사용하여 화합물의 생체이용성을 측정할 수 있다. 일반적으로, 화합물을 시험 동물(예, 마우스나 래트)에 정맥내 (i.v.) 및 경구 (p.o.)적으로 투여하고, 혈액 샘플을 정기적으로 취하여 약물의 혈중 농도가 시간에 따라 어떻게 변하는 지를 살핀다. 시간에 따른 혈중 농도의 시간 과정을 사용하여 화합물의 절대적 생체이용성을 표준 모델을 이용한 백분율로서 계산할 수 있다. 전형적인 방법의 예는 하기에 설명된다.
마우스에 본 발명의 화합물 또는 그 전구 화합물을 1, 10, 또는 100 mg/kg 양으로 i.v. 또는 p.o.적으로 투여한다. 혈액 샘플을 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 420 및 2880 분에서 취하고, 샘플에서 본 발명의 화합물 또는 전구 화합물의 농도를 HPLC로 정하였다. 다음, 혈중 농도의 시간 과정을 사용하여 혈중 농도-시간 곡선하 면저 (AUC 이는 전신적 순환에 도달하는 변하지 않는 약물의 총량에 직접적으로 비례한다), 최대 (피크) 혈중 약물 농도, 최대 혈중 약물 농도가 생성되는 시간 (피크 시간)과 같은 주요 매개변수를 유도할 수 있고, 생체이용성의 정확한 결정에 사용되는 추가의 인자는: 화합물의 말단 반감기, 총신체 제거율, 분배의 항상상태 부피, 및 F%을 포함한다. 다음, 이러한 매개변수들을 비분획적 또는 분획적 방법으로 분석하여 이러한 유형의 방법의 예에 대하여, 계산된 백분율 생체이용성을 나타낸다. 참조 Egorin 등 2002, 및 참조문헌.
경구 및 정맥내 약동력학의 생체내 평가 (특이적 방법)
상글리페린 유사체들의 경우, 전혈을 분석한다. 화합물들을 5% 에탄올 / 5% 크레모포어 EL / 90% 염수에서 p.o. 및 i.v. 양쪽 투여용으로 제형화하였다. 3 마리 수컷 CD1 마우스들의 군들에 1 mg/kg i.v. 또는 5 또는 10mg/kg p.o.로 투여하였다. 혈액 샘플 (40 μL)을 복재정맥을 통해 투여전, 및 0.25, 0.5, 2, 8, 및 24 시간에 얻고, 동일양의 dH20로 희석시키고, 즉시 드라이 아이스 상에 놓았다. 샘플들을 분석시까지 -70℃에 보관하였다. 본 발명의 화합물 또는 전구 화합물의 샘플 내 농도를 LCMS을 통해 하기와 같이 결정한다: 혈액 : H2O(1:1,v/v)/PK샘플 20 μL에 20 μL 내부 표준물 (하이드록실 마크로사이클, 6)을 100 ng/mL에서, 20 μL 작용 용액 /MeOH 및 150 μL ACN를 첨가하고, 1분간 1500 rpm에서 볼텍스하고, 12000 rpm에 5 분간 원심분리한다. 다음, 상등액을 LC-MS/MS로 주입한다. 혈중 농도의 시간-과정을 도시하고 전혈중 농도-시간 곡선하의 면적을 유도한다 (AUC 이는 전신적 순환에 도달하는 변화되지 않은 약물의 총량에 직접적으로 비례한다). 이러한 값들을 사용하여 필요시 PK 매개변수를 생성한다.
세포독성의 생체내 평가
ATCC로부터 얻는 Huh-7 및 HepG2 세포를 10% 우태아혈청 (FBS), 1% 페닐실린-스트렙토마이신 (pen-strep) 및 1% 글루타민을 함유하는 둘베코 변형 필수 배지 (DMEM)에서 배양한다; 반면 CEM 세포 (ATCC로부터 얻은 인간 T-세포 백혈병 세포)를 10% FBS, 1% pen-strep 및 1% 글루타민를 함유한 RPMI 1640 배지에서 성장시킨다. 적어도 두명의 정상 조사된 공여자로부터 얻은 전혈로부터 신선한 인간 PBMC를 분리한다. 상세하게는, 말초혈액 세포를 저속 원심분리 및 PBS 내에서 재현탁하여 2-3 번 펠렛화하고 세척하여 오염 혈소판을 제거한다. 다음, 세척된 혈액 세포를 둘베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)에 1:1 희석시키고, 50 mL 원심분리 튜브에 들어있는 임파구 분리 배지 (LSM; 세포성장 Mediatech, Inc.; 밀도 1.078+/-0.002 g/ml; Cat.# 85-072-CL) 14 mL 상에 층을 만들고, 이 들어 있는 30 분간 600 x g에서 원심분리한다. 띠를 이룬 PBMC들을 결과된 계면으로부터 부드럽게 흡인하고 PBS로 2번 저속 원심분리로 세척한다. 최종 세척후, 세포를 트립판 블루 배제에 의해 계수하고, 15 % 우태아혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 4 μg/mL PHA-P이 보충된 RPMI 1640에서 1x107세포/mL로 재현탁한다. 세포를 48-72 시간 37℃에서 배양한다. 배양후, PBMC들을 원심분리하고 15% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페닐실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 10 μg/mL 젠타마이신, 및 20 U/mL 재조합 인간 IL-2을 가진 RPMI 1640에서 재현탁한다.
전술한 세포에 대하여 각 화합물의 절반-로그 농도를 삼중으로 시험하여 화합물 세포독성을 평가한다. 세포함유 배지 단독은 세포 대조군 (CC)으로 사용하였다. Huh-7 및 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 5x103세포 농도로 접종한다. 다음날, 배지를 흡인하고, 5% FBS를 포함하는 상응하는 배지 100μL를 첨가한다. 시험 약물 희석물을 마이크로타이터 튜브에서 2X 농도로 제조하고, 각 농도의 100 μL를 표준 포맷내의 적절한 웰에 둔다. 72 시간 후, 세포를 세포독성 평가를 위해 가공한다.
PBMC를 새로운 배지에 희석하고 및 96 웰 둥근 바닥 마이크로플레이트의 내부 웰에 5x104세포/웰 농도로 100 L의 부피로 둔다. 유사하게, CEM 세포를 1x104세포/웰로 둔다. 다음, 시험 약물의 2X 제조물100μL를 표준 포맷의 적절한 웰에 첨가한다. 배양물을 6 내지 7일간 유지한 후 세포독성 결정을 위해 가공한다.
CytoTox-ONE™ 동질성 막 온전성 분석 키트 (Promega)를 사용하여 세포독성을 결정한다. 이러한 분석은 손상된 막을 가진 세포로부터 락테이트 디하이드로게나제 (LDH)의 방출을 플루오로기준의, 균질성 형식으로 측정한다. 배양 배지로 방출된 LDH은 레자주린을 형광 레조루핀 생성물로 전환하게하는 연계된 효소법으로 측정된다. 생성된 형광의 양은 용혈된 세포의 수와 비례한다. 각 화합물의 여섯개 연속적으로 희석된 농도들을 세포에 적용하여 적용가능한 TC50 (세포 생존능을 50% 감소시키는 약물의 독성 농도) 및 TC90 (세포 생존능을 90% 감소시키는 약물의 독성 농도) 값을 유도한다.
MDR1 및 MRP2 수송체의 저해에 대한 시험관 내 평가
MDR1 (P-당단백질 1) 및 MRP2 수송체의 저해와 활성을 평가하기 위해, Solvo Biotechnology Inc.로부터 얻은 시험관 내 ATPase 분석법을 사용할 수 있다 (Glavinas 등, 2003). 상기 화합물들 (0.1, 1, 10 및 100 μM 에서)을 MDR1 또는 MRP2 막소포와 바나듐산염의 부재 및 존재 양쪽에서 항온처리하여 잠재적인 ATPase 활성화를 연구한다. 또한, 유사한 항온처리를 베라파밀/설파살라진의 존재하에서 수행하여 수송체 ATPase 활성의 가능한 저해를 검출한다. ATPase 활성은 무기 인산염을 분광분석적으로 정량화하여 측정된다. 활성화는 ATPase 활성의 바나듐산 염 민감성 증가로부터 계산된다. 저해는 베라파밀/설파살라진 매개 ATPase 활성에서의 감소로 결정된다.
MDCK 세포를 사용한 Pgp 수송체의 저해에 대한 시험관내 평가
P-당단백질 (Pgp/MDR1) 수송체의 저해를 평가하기 위해, Cyprotex로부터 얻은 시험관내 ATPase 분석법을 사용하였다. NIH (Rockville, MD, USA)로부터 얻는 MDR1-MDCK 세포를 사용하였다. 배양 후, 측저 및 정부 표면을 완충액으로 두번 pH 7.4 및 37℃에서 세척함으로써 단층을 얻었다. 다음 세포를 7.4 완충액과 정부 및 측저 구획부에서 37℃ 및 95 %의 상대 습도를 가진 5% CO2하에서 배양하여 생리적 변수들을 안정화시켰다. 정부 내지 측저부 연구 (A-B)를 위해, pH 7.4의 완충액을 정부 구획부로부터 제거하고, 로페라미드 투약 용액으로 대체한 후, '동료' 플레이트에 두었다. 이 용액들은 로페라미드를 함유한 DMSO를 완충액으로 로페라미드의 최종 농도가 5 μM가 되도록 희석하여 제조되었다 (최종 DMSO 농도는 1%로 조절). 형광성의 온전성 마커 루시퍼 옐로우를 또한 투약 용액에 포함될 수 있다. 상기 실험은 상기 시험 화합물 (정부 및 측저 구획부 둘 다에 적용)의 존재 및 부재하에서 수행되었다. 측저 내지 정부 (B-A) 연구의 경우, P-당단백질 기질인 로페라미드 (최종 농도 = 5 μM)를 측저 구회부에 두었다. 실험은 상기 시험 화합물(정부 및 측저 구획부에 적용된)의 존재 및 부재하에서 수행되었다. 상대 습도 95%의 5% CO2분위기하, 37℃에서 60 분간 배양하였다. 배양 기간 후, 상기 동료 플레이트를 제거하고, 정부 및 측저 샘플을 희석하여 LC-MS/MS로 분석하였다. 각 시험 화합물 농도를 단일 결정하였다. 각 플레이트 상에서, 양성 대조군 저해체를 또한 검사하였다. 상기 시험 화합물을 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 및 50 μM에서 평가하였다. 실험을 통틀어 단일층의 온전성을, 형광측정 분석법을 사용하여 루시퍼 옐로우를 검사함으로 확인하였다. 분석 후, IC50을 계산하였다 (즉, 최대 절반 저해 효과를 달성하는 저해체 농도 (시험 약물)).
흡수 수송체의 저해에 대한 시험관내 평가
OAT1B1 및 OAT1B3 흡수 수송체의 저해를 평가하기 위해, Solvo Biotechnology Inc.로부터 수득한 시험관내 흡수 수송체 분석법을 사용하였다. 0.068, 0.2, 0.62, 1.8, 5.5, 16.7 및 50 μM의 시험 물질 (TA)을 사용한 흡수 시험은 인간 SLC 수송체 OATP1B1 및 OATP1B3을 안정적으로 발현하는 CHO 세포상에서 수행되었다. 모 세포주 CHO-K을 음성 대조군으로서 허용하였다. 세포 (1×105 세포가 둘베코 변형 이글 배지 및 Ham's F-12 DMEM (F-12, Lonza, New Jersey, US)이 1:1 혼합되고 5 mM 소듐 부티레이트가 보충된 것 200 μl에 함유됨)를 표준 96-웰 조직 배양 플레이트 상에 분주하고 24 시간 배양한 후 5% CO2 및 95% 공기의 분위기하 37℃에서 상기 실험을 수행하였다. 실험 전에, 상기 배지를 진공 흡인하였고, 세포를 크렙스-헨셀라이트 완충액 pH 7.3 (시그마 화학물로부터 제조, Sigma-Aldrich, St Louis, MO)의 100 μl로 2번 세척하였다. 흡수 실험은 탐침 기질 및 TA 또는 용매를 각각 포함하는 크렙스-헨셀라이트 완충액 (pH 7.3) 50 μl로 37 ℃에서 수행되었다. 유기 용매 농도는 각 웰에서 동일하며, 1% v/v를 넘지않았다. OATP1B1 분석용 탐침자 기질은 E3S (0.1μM)였고, OATP1B3 분석용은 Fluo-3 (10μM)였다. 탐침자 기질이 이동된 양은 각 웰에서 cpm로 결정되었다. 상대적 활성은 하기 식으로부터 계산되었다:
활성%=(A-B)/(C-D)×100
상기식에서 A= 형질전환된 세포 상에서 TA의 존재하 기질이 이동된 양, B= 모세포 상에서 TA의 존재하 기질이 이동된 양, C= 형질전환된 세포 상에서 용매 존재하 기질이 이동된 양 및 D= 모세포 상에서 용매 존재하 기질이 이동된 양. IC50는 탐침자 기질의 수송을 50 % 감소시키는 데 필요한 TA 농도의 양으로서 정의된다. IC50은 삼-변수 로지스틱 방정식으로부터 유도되었다; 상대적 활성 대 TA 농도 플롯에 맞춰 비선형 회귀에 의해 곡선 작성.
유출 수송체의 저해에 대한 시험관내 평가
MRP2, MRP3 및 BSEP 유출 수송체의 저해를 평가하기 위해, Solvo Biotechnology Inc.로부터 얻은 시험과내 소포성 수송체 분석법을 사용하였다. 시험물 (TA) (0.068, 0.2, 0.62, 1.8, 5.5, 16.7 및 50 μM)을 유출 수송체 막소포 (Solvo Biotechnology Inc.)와 4 mM ATP의 존재 및 부재 양쪽에서 항온처리하여 TA의 수송체 매개 흡수 및 소포레로의 수동적 확산 사이를 구별하였다. MRP2 및 MRP3 수송체의 경우, 반응을 2 mM 글루타치온 존재하에서 수행하였다. 반응 혼합물을 10분간 37 ℃에서 예비항온처리하였다. 12 mM MgATP (분석에서 4 mM 최종 농도) 또는 배경 대조군용으로서 분석 완충액 25 μl을 첨가하여 반응을 개시하였다. 빙냉 세척 완충액200 μl을 첨가하여 반응을 종결한 후, 바로 96-웰 포맷의 유리섬유 필터 (필터 플레이트) 상에서 여과하였다. 신틸레이션 완충액을 상기 세척되고 건조된 필터 플레이트에 첨가하고 신틸레이션을 계수하였다. 프로브 기질은 BSEP 소포용으로 토로콜레이트 (2 μM)이고 MRP2 및 MRP3 소포용으로 E217βG (1μM)이다. 모든 웰에 대하여, 상기 탐침 기질의 이동량을 cpm 단위로 결정하였다. 상대적 활성을 하기 방정식으로 계산하였다:
활성 %=(A-B)/(C-D)x100 상기식에서 A= TA 및 ATP 존재하에서의 기질의 이동량, B= TA의 존재하에서의 기질의 이동량, C= 용매와 ATP의 존재하에서의 기질의 이동량, 및 D= 용매 존재하에서의 기질의 이동량. IC50는 탐침 기질의 수송을 50% 저해하는 데 필요한 TA 농도로서 정의된다. IC50는 삼-변수 로지스틱 방정식으로부터 유도되었다; 상대 활성 대 TA 농도 플룻에 ??춰 비선형 회귀에 의해 곡선 작성.
HIV 항바이러스 활성 평가용 시험관내 분석
HIV에 대한 항바이러스 효능을 하기와 같이 시험하였다: 혈액 유래 CD4+ T-임파구 및 마크로파지를 이전에 기술된 바와 같이 분리하였다 (Bobardt 등, 2008). 상세하게, 인간 PBMC를 신선한 혈액으로부터 FicollHypaque 상에 층을 만듦으로써 (30 분, 800 g, 25℃) 정제하였다. 일차 인간 CD4+ T 세포를, PBMC로부터 항-CD4 Dynabead들을 사용하여 양성 선택하고 그 다음 Detachabead를 사용하여 방출함으로써 정제하였다. 세포를 10% FCS, MEM 아미노산류, L-글루타민, MEM 비타민류, 소듐 파이루베이트 및 페닐실린과 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지 1640 (Invitrogen)에서 배양하고, 세균성 초항원 구균성 장내독소 B (SEB; 100 ng/ml) 및 다른 공여자로부터 얻은 미토마이신 C-사멸된 PBMC (10:1 PBMC:CD4 세포 비율)로 활성화시켰다. 자극 삼일 후에, 세포를 IL-2 (200 유닛/ml 최종농도)를 포함하는 배지에 1:2로 분리하였다. 다음, 세포를 IL-2 배지에서, 이틀마다 1:2로 분리하고 자극 후 7일에 HIV로 감염시켰다. 일차 인간 마크로파지를 생성하기 위해, 단핵세포를 인간 PBMC로부터 음성 선택으로써 정제하고, 활성화시키고, 및 10% FCS, MEM 아미노산류, L-글루타민, MEM 비타민류, 소듐 파이루베이트, 및 페닐실린 (100 유닛/ml), 스트렙토마이신 (100 mg/ml), 및 50 ng/ml 재조합 인간 과립구마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)가 보충된 DMEM에서 106/ml의 세포 농도로 배양하고, 5% CO2의 습윤된 분위기하 37℃에서 유지하였다. 단핵세포-유도 마크로파지를 얻기 위해, 세포를 플라스틱에 부착하고 6 일간 배양하여 분화시켰다.
CD4+ HeLa 세포, Jurkat 세포, 활성화된 CD4+ 말초혈액 T-임파구 및 마크로파지 (500,000 cells/100 μL)를 시험 물질의 증가되는 농도하에서 pNL4.3-GFP (X4 바이러스) 또는 pNL4.3-BaL-GFP (R5 바이러스) (p24의 100 ng)와 배양하였다. 48시간 후, FACS로 GFP-양성 세포의 백분율을 분석함으로써 감염을 평가하고, EC50를 계산하였다.
HBV 항바이러스 활성 평가용 시험관내 분석
HBV에 대한 항바이러스 효능을 하기와 같이 시험할 수 있다: HepG2 2.2.15 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 분주한다. 16-24 시간후, 콘플루언트 단일층 HepG2 2.2.15 세포를 세척하고 배지를 다양한 농도의 시험 화합물을 삼중으로 포함하는 완전 배지로 교체한다 (예, 6 개의 절반-로그 농도). 삼일 후, 배양 배지를 적절히 희석된 시험 화합물을 포함하는 신선한 배지로 교체한다. 시험화합물의 최초 투여 6일 후, 세포 배양 상등액을 수집하고, 프로나제로 처리한 후 실시간 정량 TaqMan qPCR 분석에 사용하였다. PCR-증폭 HBV DNA를 증폭된 HBV DNA와 하이브리드화하는 켄치된(quenched) 형광 탐침자의 핵산말단가수분해로 결과된 형광 신호의 증가를 조사함으로써 실시간 검출한다. 각 PCR 증폭의 경우, 표준 곡선을 정제된 HBV DNA의 희석물을 사용하여 동시에 만든다. 항바이러스 활성은 HBV DNA 수준(IC50)에서의 감소로부터 계산된다. 다음, 염료 흡수 분석을 사용하여 세포 생존능을 측정하고, 이를 사용하여 독성(TC50)을 계산한다. 치료지표(TI)는 TC50/IC50로 계산된다.
면역억제 활성 평가를 위한 시험관내 혼합 임파구 반응 (MLR) 분석
면역억제 활성을 하기와 같이 시험하였다: 말초혈액 단핵 세포 (PBMC) 군을 두 명의 정상, 비연관 자원자 (A & B)로부터, Histopaque 상에서 원심분리하여 정제하였다. 세포를 계수하고, 96 웰 플레이트의, 보충물과 2% 인간 AB 혈청을 가진 RPMI 배지에 웰당 1 x 105세포로 분주하였다.
배양 조건은: 세포군 A & B 단독 및 세포 A&B의 혼합군에 각각 6 개 다른 농도로 있는 시험 화합물들이 적용 또는 부적용된 상태를 포함한다. 화합물들을 10μM에서 0.0001 μM까지 1-log 증분으로 증가하는 투약량에서 시험하였다. 대조군 웰은 시험 화합물 웰에 존재하는 것과 비견될 만한 농도의 담체(0.5% DMSO)를 함유하였다. 배양물을 96 웰 플레이트에서 삼중으로 만들고 습윤 5% CO2분위기 하 37℃에서 배양하였다. 3H-티미딘을 분석이 설정된 후 6일째에 첨가하고 24 시간 후에 수확하였다. 다음, 상이한 배양 조건 간의 증식 수준을 비교하였다.
시험 화합물의 각 희석물이 MLR에서 증식을 억제하는 능력은 저해 백분율로 계산되었다. 이것은 IC50(분당 세포수를 50% 감소시키는 결과를 나타내는 시험 화합물의 농도)를 추정케 한다. IC50를 계산하기 위해, X 축을 로그 단위로 변형하였다. 비선형 회귀를 사용하여 평균 데이터 포인트에 맞췄다. S-자형 변수 기울기가 선택되었다.
Cyp-NS5A 상호작용의 ELISA 분석.
이러한 분석을 사용하여 Cyp-NS5A 복합체의 붕괴를 측정하였고, 이는 사이클로필린 D와의 상호작용능을 나타내는 데 사용될 수 있다. 상세하게, 재조합 GST, GST-CypD 및 Con1 NS5A-His 단백질들을 이전 기술된 바와 같이 생성하고 정제하였다 (Chatterji 등, 2010). Nunc MaxiSorb 8-웰 스트립 플레이트를 GST 또는 GST-CypD로 16 시간 4 ℃에서 코팅하고 차단하였다. 재조합 NS5A-His (1 ng/mL)를 결합 완충액 (20 mM 트리스 pH 7.9, 0.5 M NaCl, 10% 글리세롤, 10 mM DTT 및 1% NP-40) 50 μL 함유한 웰에 첨가하고 16 시간동안 4 ℃로 처리하였다. 다음, 포획된 NS5A-His를 마우스 항-His 항체 (1 μg/mL) (anti-6xHis, Clontech) 및 토끼 항-마우스-겨자무 페록시다제 포스파타제 (HRP) 항체 (1:1000 희석)을 사용하여 검출하였다. 모든 실험은 두 가지 CypD 및 NS5A 단백질의 두 가지 다른 배치를 사용하여 두번 수행되었다.
사이클로필린 저해의 항-PPIAse 분석
사이클로필린과의 상호작용을 분석하기 위한 다른 방법은 하기 설명된다: GST-CypA 또는 D의 트롬빈 절단에 의해 생성된, 재조합 CypA 또는 D의 PPIase 활성은 키모트립신에 의한 N-석시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐라이드의 가수분해 속도를 추적함으로 결정되었다. 키모트립신은 펩타이드의 트란스 형태만을 가수분해하고, 그 농도가, 470 mM LiCl를 함유하는 트리플루오로에탄올에 용해된 스탁을 사용하여 최대화되는 시스 형태의 가수분해는 시스-트란스 이성화율에 의해 제한된다. CypA 또는 D를 선택된 시험 물질과, 0.1 내지 20 nM 범위의 약물 농도 범위를 사용하여, 1 시간동안 5℃에서 평형화하였다. 상기 펩타이드를 첨가하여 반응을 개시하고, 흡광도의 변화를 초당 10 개 데이터 지점에서 분광분석적으로 조사하였다. 가수분해의 블랭크 속도 (CypA 또는 D 부재시)를 CypA 또는 D 존재하에서의 속도에서 감하였다. 이러한 효소 반응의 개시 속도를 흡광도에서의 변화에 대한 시간 경과를 일차 회귀 분석으로 분석하였다.
실시예
실시예 1 - 스트렙토마이세스 종 A92-308110 (DSM9954)의 sfaA 삭제 변이체의 제작
1.1 sfaA 삭제 작제물의 제작
sfaA (뉴클레오타이드 위치 14396-21362, NCBI 서열 수탁 번호 FJ809786)를 포함하는 코스미드 TL3006 (SEQ ID NO. 3)의 ~7kb EcoRV-StuI절편을 EcoRV 및 StuI로 절단하여 얻었고, 결과의 분리된 절편을, EcoRV로 미리 절단하고 새우 알카라인 포스파타제 (Roche)로 처리한 pKC1139로 직접 결찰하였다. 이러한 플라스미드를 pSGK268로 지칭하였다.
이러한 클론 내에 포함된 sfaA 유전자의 인-플레임 삭제는 Gene Bridges (catalog number K006)에서 공급된 Red/ET 재조합 키트 를 사용하여 수행되었다.
(서열번호 1) SfaA17161f 5’-CGCTCTGTGGCGCCTGGTTTCCAAGCGGCTCGCGGACCGGCACCGGCACATGCATAATTAACCCTCACTAAAGGGCG-3’
(서열번호 2) SfaA17825r 5’-TGGATGTATCGTCGCAGGACGCCCAGAATTCACCTGCGACGTCCTCCAGATGCATTAATACGACTCACTATAGGGCTC-3’
두 개 올리고뉴클레오타이드, SfaA17161f 및 SfaA17825r를 사용하여 KOD DNA 폴리머라제 존재하에서, 상기 키트에서 공급된 FRT-PGK-gb2-neo-FRT 주형 DNA로부터 네오마이신 마커를 증폭하였다. 결과된 ~1.7kb 증폭 생성물을 젤 전기영동으로 분리하고, QiaEX 수지를 사용하여 젤로부터 정제하였다.
표준 기법으로 플라스미드 pSGK268을 E. coli DH10B로 형질전환 시키고, 아프라마이신 (50 mg/ml)을 함유하는 플레이트에서 선택하였다. 삭제 제조물의 도입은 기본적으로 Gene Bridges 키트 방식을 따라서 수행되었다. 단일 콜로니가 2TY 아프라마이신 (50 mg/ml)에서 밤새 성장하였고 pRedET (tet) 플라스미드로 형질전환하고, 아프라마이신 (50 mg/ml) 및 테트라사이클린 (3 mg/ml) 상에서 30 ℃에서 선택하였다. 단일 콜로니를 사용하여 3ml 2TY 아프라마이신 (50 mg/ml) 및 테트라사이클린 (3 mg/ml) 존재하 30 C에서 이러한 균주를 밤새 키웠다. 이러한 배양물의 0.5 ml를 사용하여 10 ml 2TY 아프라마이신 (50 mg/ml) 및 테트라사이클린 (3 mg/ml)에 30 ℃에서 접종하고 OD600nm~0.5까지 성장시켰다. 이러한 배양물의 1.4 ml를 2 개 에펜도르프 튜브 각각에 옮기고 50 ml 10 % 아라비노즈를 하나의 튜브에 첨가하여 Red/ET 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 튜브를 ~1 시간동안 37 ℃에서 진탕하였다. 유도된 및 미유도된 세포를 벤치 탑 원심분리에서 펠렛화시키고 냉각 멸균수로 두 번 세척하였다; 매번 세포를 재현탁하고 펠렛으로 원심분리하였다. 결과된 펠렛을 약 30-40 ml의 물에 현탁시키고 얼음에 보관하였다. 이전에 분리된 1.7kb 붕괴 절편을 도입 및 미도입 튜브에 첨가하고, 얼음 상의 1mm Biorad 전기큐벳에 옮겼다. 샘플을 전기천공하고 (Biorad Micropulser, 1.8kV, 결과된 시간 상수 ~4ms), 1 ml 2TY (무 항생제)를 첨가하고 혼합하여 큐벳으로부터 세포를 제거하였다. 세포를 ~3 시간동안 at 37 ℃에서 진탕하면서 (1100rpm, eppendorf thermomixer compact) 배양한 후, 아프라마이신 50 mg/ml 및 카나마이산 25 mg/ml을 함유하는 2TY 플레이트 상에 플레이트하고 밤새 37 ℃에서 배양하였다. 도입된 샘플 플레이트로부터 얻은 콜로니들을 카나마이신 50 mg/ml를 함유하는 2TY 플레이트 상에 획선 접종 (streak)하여 카나마이신 내성 카세트를 정제하고 그 도입을 확인하였다. 개별 세균 콜로니에 대하여 PCR을 사용하여 상기 카세트의 도입을 확인하였다. 이러한 배양물로부터 플라스미드를 제조하고 절단하여 예상된 플라스미드 pSGK270를 확인하였다. 다음 플라스미드들을 NsiI로 절단하여 마커 절편을 제거하고, 나머지를 재결찰하여 sfaA 인-플레임 삭제 작제물 pSGK271을 생성한다.
1.2 스트렙토마이세스 종 A92-308110 (DSM9954)의 접합 및 sfaA 삭제의 도입
플라스미드 pSGK271를 표준 기법을 사용하여 E. coli ET12567 pUZ8002로 형질전환시키고, 아프라마이신 (50 mg/ml), 카나마이신 (25 mg/ml) 및 클로람페니콜 (10 mg/ml)을 함유한 2TY 플레이트 상에서 선택하였다. 결과된 균주를 아프라마이신 (50 mg/ml), 카나마이신 (25 mg/ml) 및 클로람페니콜 (10 mg/ml)을 함유한 3ml 액체 2TY로 접종하고 밤새 37C, 250rpm에서 배양하였다. 이러한 배양물 0.8 ml를 사용하여 아프라마이신 (50 mg/ml), 카나마이신 (25 mg/ml) 및 클로람페니콜 (10 mg/ml)을 함유한 10 ml 액체 2TY가 들어있는 50 ml Falcon 튜브에 접종하고 37C, 250 rpm에서 OD600nm~0.5도달 시까지 배양하였다. 결과된 배양물을 3500 rpm로 10 분간 4C에서 원심분리하고, 10 ml 2TY 배지로 두 번 세척하고, 매 세척시 원심분리로 세포를 펠렛시켰다. 결과된 펠렛을 0.5ml 2TY에 재현탁시키고, 사용전에 얼음에서 보관하였다. 이 과정은 하기 설명된 스트렙토마이세스 포자의 완전한 제조와 시간상으로 일치시켰다.
스트렙토마이세스 종 A92-308110 (DSM9954) (Biot-4370)의 포자를 1-2 주령 콘플루언트 플레이트로부터 ~3 ml 20 % 글리세롤에 재현탁시킴으로써 수확하였다. 포자들을 원심분리 (5000rpm, 10 분 실온)하고 50 mM TES 완충액으로 두 번 세척한 후 1ml 50 mM TES 완충액에 재현탁시키고 2 개 에펜도르프 튜브에 분할하였다. 이러한 튜브를 50C에서 10 분간 수조에서 열충격을 가한 후 0.5 ml 2TY를 첨가하고 37 ℃에서 4-5 시간동안 Eppendorf Thermomixer 콤팩트에서 배양하였다.
제조된 E. coli ET12567 pUZ8002 pSGK271 및 Biot-4370를 1:1 (250 mL 각 균주) 및 1:3 (100 mL E. coli)의 비율로 혼합하고 즉시 R6 플레이트 상에 펼치고, 37 ℃ 배양기로 옮겼다. 약 2 시간 배양후, 상기 플레이트들에 날리딕스 산을 함유하는 멸균수 2ml을 첨가하여 25 mg/L의 최종 인-플레이트 농도를 생성하였다. 플레이트들을 아프라마이신 함유 멸균수 2 ml를 첨가하여 20-25 mg/L의 최종 인-플레이트 농도를 만들었다. ~4-7 일 후 나타나는 이전의 접합성 콜로니들을 아프라마이신 (25 mg/L) 및 날리딕스산 (25 mg/L)을 함유하는 ISP4 배지에 접종하고 37 ℃에서 배양하였다. 일단 적절한 균사 성장이 관찰되면, 균주를 아프라마이신 (25 mg/L) 함유 ISP4 배지로 37C에서 다시 접종하여 포자를 형성하게 한다. 다음, 균주를 ISP4 (무항생제)에 접종 및 37℃에서 3-4 일간 배양함으로써 세 번 계대배양하였다 (온도 감음성 플라스미드의 제거를 촉진하기 위해). 최종적으로 균주를 ISP4에 접종하고 28 ℃에서 배양하여 완전한 포자 형성을 수행하였다 (5-7 일). 포자를 수집하고 ISP4 플레이트 상에 28 ℃에서 연속 희석히켜 단일 콜로니를 선택하였다. 포자형성된 단일 콜로니들을 아프라마이신 (25 mg/L)이 함유되었거나 함유되지 않은 ISP4 플레이트에 이중으로 접종하여 플라스미드의 손실을 확인하고 ~ 7 일간 성장시킨 후 상글리페린류 생성을 시험하였다.
1.3 팔콘 튜브에서 상글리페린 생성용 균주 검사
포자형성이 잘된 균주의 단일 ~7mm 아가 플러그를 사용하여 멸균 SM25-3 배지 7 ml에 접종하고, 27℃ 200rpm로 2" 행정거리 진탕기에서 배양하였다. 48 시간 성장 시킨후, 이 배양물 0.7 ml을 7 ml의 SGP2 배지와 5 % HP20 수지를 가지고 있는 멸균된 팔콘 튜브에 옮겼다. 배양물을 24℃ 300rpm로 1 인치 행정거리 진탕 배양기상에서 5 일간 배양한 후 수확하였다. 0.8 ml 세균 배양물을 제거하고 2ml 에펜도르프 튜브에 분획하기 전에, 배양물 전체에 걸쳐 상기 수지를 적절히 분산하고, 분획하였다. 0.8 ml 아세토니트릴 및 15 ml의 포름산을 첨가하고 상기 튜브를 약 30분간 혼합하였다. 원심분리함으로써 혼합물을 맑게하고 추출물 170 ml를 HPLC 바이알에 옮긴 후 HPLC로 분석하였다.
1.4 야생형 또는 sfaA 표현형으로 복귀하기 위한 균주의 분석
균주의 추출물을 HPLC로 분석하였다. 상글리페린 A 및 B를 생성하는 균주는 이들이 야생형으로 복귀하였기 때문에 더 이상 분석하지 않았다. 상글리페린 A 및 B 생성이 결여된 균주는 상글리페린 유사 발색단을 나타내는, 적은 수준(~1-2 mg/L)의 피크 유지 시간 6.5 분을 나타냈다. LCMS에 의한 분석 결과, 이러한 피크는 상글리페린의 예상된 m/z로부터 -16 유닛인, m/z 1073을 가지는 것을 보여준다. 이러한 피크는 메타-하이드록시타이로신의 부재에서 페닐알라닌이 합체된 것으로 인한 것으로 추정된다.
다음, 상글리페린 생성의 결여를 보이는 8 개 균주를 다시 배양하여 잠재적인 sfaA 변이가 보완되어 신규한 상글리페린으로의 변이합성적 과정을 화학적으로 가능하게 할 것인가를 평가하였다. 균주들을 SM25-3 종균 배지에서 48 시간 배양한 후 5 % 수지를 가진 SGP2 생성 배지로 옮겼다. 24 시간 더 배양 후, 균주에 2mM DL 메타-하이드록시타이로신 (1M HCl에 함유된 0.16M 용액 100 ul 첨가) 또는 2mM L-페닐알라닌를 삼중으로 공급하고, 미공급 균주를 대조군으로 사용하였다. 균주에 피페콜산 (2mM, 메탄올에 함유)을 공급하여 생산 수율을 향상시켰다. 추가 4 일간 배양 후, 균주를 수확하고, 추출하고, HPLC로 분석하였다. 메타-하이드록시 타이로신은 sfaA 변이를 완전히 보완하는 것으로 나타나고, L-페닐알라닌의 첨가는 -16 amu 화합물의 수준을 높였다. 균주 Biot-4585를 sfaA 삭제 변이로서 추가 연구를 위해 선택하였다.
실시예 2 - sfaA 삭제 작제물의 다른 제조 방법
다른 방법으로 sfaA 삭제 변이를 생성할 수 있다. 이의 예는 sfaA 삽입 불활성화 변이 (WO2010/034243에서 실시예 12와 같은)가 있다. 이러한 균주는 WO2010/034243에 설명된 바와 같이 생성되었고, 균주명 BIOT-4452으로 지칭되었다.
sfaA의 삭제를 수행하는 대안적 과정에서, 두 개의 올리고뉴클레오타이드 15209F 5’-CAGAGAATTCGCGGTACGGGGCGGACGACAAGGTGTC-3’ (서열번호 4) 및 17219R 5’-GCGCATGCATGTGCCGGTGCCGGTCCGCGAGCCGCTTGG-3’ (서열번호 5)을 사용하여 주형으로서 코스미드 TL3006 (서열번호 3) 및 KOD DNA 폴리머라제 존재하, 상동성의 상류 부위를 증폭하였다. 증폭된 생성물을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 (NEB)로 처리하고, 새우 알카라인 포스파타제 (Roche)로 처리함으로써 탈포스포릴화된 pUC18에 클론하였다. 생성된 작제물을 제한 절단으로 검사하고 완전히 시퀀싱하여 소정의 서열이 생성된 것과 오류가 폴리머라제 증폭동안 도입되지 않은 것을 확인하였다. 이러한 작제물은 EcoRI 및 NsiI으로 절단하고, 생성물을 젤 전기영동으로 분석하였다. 상기 소정의 서열-함유 밴드 (즉 상동부위 상류 ~2 kb)를 젤로부터 절제하고 표준 방식으로 (QiaEX 수지) 정제하였다. 올리고뉴클레오타이드의 제2 시리즈: 17766F 5’-CCTCATGCATCTGGAGGACGTCGCAGGTGAATTCTGGGCG-3’ (서열번호 6) 및 19763R 5’-GGGCAAGCTTCTCCTGGCTGAGCTTGAACATCG-3’ (서열번호 7)를 사용하여 주형으로서 코스미드 TL3006 (서열번호 3) 및 KOD DNA 폴리머라제 존재하, 상동물의 하류 부위를 증폭하였다. 증폭된 생성물을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 (NEB)로 처리하고, 새우 알카라인 포스파타제 (Roche)로 처리하여 탈포스포릴화 시킨 pUC18로 클론시켰다. 결과된 작제물을 제한 절단으로 분석하고 완전히 시퀀싱하여 소정의 서열이 생성된 것과 오류가 폴리머라제 증폭동안 도입되지 않은 것을 확인하였다. 이러한 작제물은 HindIII 및 NsiI으로 절단하고, 생성물을 젤 전기영동으로 분석하였다. 상기 소정의 서열-함유 밴드 (즉 상동부위 하류 ~2 kb)를 젤로부터 절제하고 표준 방식으로 (QiaEX 수지) 정제하였다. 벡터 pKC1139을 EcoRI 및 HindIII로 절단하고 및 큰 벡터 절편을 젤 전기영동으로 분리하고, 표준 방법으로 (QiaEX resin) 정제하였다. 분리된 상류 및 하류 상동부 절편을 pKC1139의 이러한 절편에 세가지 방식 (three-way) 결찰로 클론하여 소망의 sfaA 삭제 작제물을 생성한다.
sfaA 삭제 작제물의 생성에 대한 다른 방법에서, 상업적인 유전자 합성법 (예, Genscript 또는 다른 벤더)를 사용하여 소망의 서열 (서열번호 8)을 포함하는 작제물을 생성한다. 이러한 구입된 작제물을 BamHI 및 XbaI을 사용하여 절단하여 소정의 서열을 잘라내고, 생성물을 젤 전기영동으로 분석한다. 바람직한 서열-함유 밴드 (~4kb)를 젤로부터 잘라내고 표준 기법으로 정제한다. 벡터 pKC1139를 BamHI 및 XbaI으로 절단하고, 큰 절편을 젤 전기영동으로 분리하고 표준 방법으로 정제한다. 다음, 두 개 분리된 절편을 서로 결찰하여 소망의 sfaA 삭제 작제물을 생성한다.
이러한 대안적 sfaA 삭제 작제물들을 스트렙토마이세스 종 A92-308110 (DSM9954)로 접합함으로써 도입하고, 실시예 1.2에 설명된 방법을 사용하여 이차 검정하기 위해 선택한다. 이러한 방식으로 작제된 균주의 성장과 분석은 또한 실시예 1.2에 설명된 방식을 따른다.
실시예 3 - sfaA 삭제 변이체의 어레이 공급
sfaA가 붕괴된 변이체 (BIOT-4452 또는 BIOT-4585)의 포자 스탁을 MAM, ISP4, ISP3 또는 ISP2 배지에서 배양 후 제조하고, 20% w/v 글리세롤을 함유한 증류수에 보존하고, -80 ℃에서 보관하였다. 포자 스탁 (1% v/v)을 7 mL 종 배지 (SM25 배지)가 들어있는 50 mL 원심분리 튜브에 접종하고 스폰지 마개로 막아 생장성 배양물 (종 배양물)을 제조하였다. 상기 배양 튜브를 27 ℃, 250 rpm (5 cm 행정거리)에서 48 시간 배양하였다. 상기 종 배양물로부터, 10 % (v/v)를 7 mL 생성 배지 SGP-2이 들어있는 50 mL 원심분리 튜브에 옮기고 스폰지 마개로 막았다. 24℃ 및 300 rpm (2.5cm 행정거리)에서 배양하였다. 상글리페린 변이합성적 유사체들을 생성하기 위해, 상기 공급 화합물 (뮤타신톤 (mutasynthon))의 0.32 M 용액 (1N HCl 내)의 0.05 mL를 접종 24 시간 후에 각 튜브에 첨가하여 최종 농도 2 mM를 만든다. 또한, 피페라즈 산의 0.32 M 용액 (메탄올 내)의 0.05 ml를 24 시간에 각 튜브에 첨가하여 최종 농도 2 mM로 만든다. 공급 후 추가로 4일간 배양하였다.
전체 배양액 0.8 ml을 샘플을 2 ml 뚜껑있는 에펜도르프 튜브에 옮겨 샘플을 추출하였다. 아세토니트릴 0.8 ml을 포름산 0.015 ml과 함께 첨가하였다. 다음, 혼합물을 vibrax에서 30분간 진탕하였다. 다음, 튜브를 13000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 상등액 0.15 ml를 분석용으로 얻었다. 추출물을 일반 방법에서 설명한 대로 분석하였다.
표 1은 이러한 방식으로, LCMS H+ 및 Na+ 부가생성물과 함께 공급된 뮤타신톤을 나타내며, 관찰된 상글리페린 변이합성적 생성물의 예상 분자량과 지속 시간을 나타낸다. 상글리페린 A 유사체들에 대한 주요 피크가 나타나 있다. 모든 경우, LCMS 피크는 상글리페린 B 유사체에 대하여 또한 나타나 있다 (질량 18).
공급된 뮤타신톤 뮤타신톤 명 관측된 [M-H]-(m/z) 관측된 [M+Na]+(m/z) 분자량 (amu) 지속시간 (분)
Figure 112013096342271-pct00037
 2-아미노-3-(4-플루오로-3-하이드록시페닐)프로파노산 1106.4 1130.4 1107.4 5.5
Figure 112013096342271-pct00038
 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노산 1106.4 1130.4 1107.4 5.7
Figure 112013096342271-pct00039
 메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐) proprionate 1106.4 1130.4 1107.4 5.7
Figure 112013096342271-pct00040
 메틸 (S)-2-아미노-3-(3-하이드록시-4-메틸페닐)프로파노에이트 1102.5 1126.7 1103.5 6.0
Figure 112013096342271-pct00041
 2-아미노-3-(3-플루오로페닐)프로파노산 1090.4 1114.5 1091 6.1
Figure 112013096342271-pct00042
 메틸 (2S)-2-아미노-3-(3-하이드록시(2-피리딜))프로파노에이트 1089.5 1113.7 1090.5 4.4
Figure 112013096342271-pct00043
 메틸 2-아미노-3-(2-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트 1106.5 1130.6 1107.5 5.5
Figure 112013096342271-pct00044
 메틸 2-아미노-3-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)프로파노에이트 1106.5 1130.6 1107.5 5.1
Figure 112013096342271-pct00045
 메틸 2-아미노-3-(2,6-디플루오로-3-하이드록시페닐)프로파노에이트 1124.4 1148.5 1125.5 5.1
실시예 4 - 63-플루오로 상글리페린 A, 중간체 화합물 14의 분리
메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트 및 DL-피페라즈 산을 전구체로서 사용하여 일반 방법에서 설명한 대로 발효를 수행하고, 상기 둘 다를 26 시간에 첨가하였다.
수집후, 상기 배양액을 모으고 포름산으로 약 pH 3으로 조절하고, 25분간 원심분리하여 (3300g) 상기 맑게진 배양액으로부터 세포와 수지를 분리하였다. 표적 화합물의 5% 미만이 존재한다는 것을 분석 확인한 후, 맑게진 배양액을 버렸다. 자석 교반기를 사용하여 세포와 수지를 아세토니트릴 2 배 부피와 같이 1 시간 교반하였다. 상기 아세토니트릴 추출물을 원심분리 또는 중력하에서 침전시킴으로써 회수하였다. 다음, 세포와 수지의 제2 아세토니트릴 추출을 동일한 조건에서 수행하였다. 혼합된 아세토니트릴 추출물을 감압하에서 농축하여 잔류부피를 만들고 이를 pH 6으로 조정하였다. 이를 에틸 아세테이트로 두 번 추출하고, 혼합된 유기물을 감압하에서 건조시켜 최종 미정제물을 생성하였다 (1.3g).
상기 미정제 추출물 (1.3 g)을 에틸 아세테이트 (2 ml)에 용해하고 에틸 아세테이트 (500 ml)로 조건화된 실리카 젤 컬럼(10 x 2 cm)에 적재하였다. 상기 컬럼을 에틸 아세테이트로 용출시킨 후 단계적으로 아세톤을 증가시켰다 (10%, 20%, 30%, 등, 에틸 아세테이트 내에서). 약 250 mL 분획물을 수집하고 및 표적 화합물을 분석적 LC로써 동정하고, 혼합하고 및 건조 시켰다. 이러한 물질(278 mg)을 메탄올(1.8 ml)에 용해하고 및 예비성 HPLC로 정제하였다. Waters Xterra MSC18 컬럼 (10 미크론, 19 cm x 250 mm)을 사용하고 용매를 21 mL/min로 펌프하였다. 용매 A는 물이고 용매 B는 아세토니트릴이었다. 주입후 컬럼을 50 % B에서 6 분간 등용매적으로 용리한 후, 30분에서 100 % B로 구배하였다. HPLC-UV로 순수한 분획물을 동정하고 및 혼합하였다. 이러한 분획물을 감압하에서 건조시켜 표적 화합물을 회백색 무정형 고체로서 얻었다 (20 mg).
실시예 5 - 62,63-플루오로 상글리페린 A, 중간체 화합물 15의 분리
메틸 (S)-2-아미노-3-(3,4-디플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트 및 DL-피페라즈 산을 전구체로서 사용하여 일반 방법에서 설명한 대로 발효를 수행하고, 상기 둘 다를 26 시간에서 첨가하였다.
수집후, 상기 배양액을 모으고 포름산으로 약 pH 3으로 조절하고, 25분간 원심분리하여 (3300g) 맑게진 배양액으로부터 세포와 수지를 분리하였다. 표적 화합물의 5% 미만이 존재한다는 것을 분석 확인한 후, 맑게진 배양액을 버렸다. 자석 교반기를 사용하여 세포와 수지를 아세토니트릴 2 배 부피와 같이 1 시간 교반하였다. 상기 아세토니트릴 추출물을 원심분리 또는 중력하에서 침전시킴으로써 회수하였다. 다음, 세포와 수지의 제2 아세토니트릴 추출을 동일한 조건에서 수행하였다. 혼합된 아세토니트릴 추출물을 감압하에서 농축하여 잔류부피를 만들고 이를 pH 6으로 조정하였다. 이를 에틸 아세테이트로 두 번 추출하고, 혼합된 유기물을 감압하에서 건조시켜 최종 미정제물을 생성하였다 (1.6g).
상기 미정제 추출물 (1.6 g)을 에틸 아세테이트 (2 ml)에 용해하고, 에틸 아세테이트 500 ml로 조건화된 실리카 젤 컬럼(10 x 2 cm)에 적재하였다. 상기 컬럼을 에틸 아세테이트로 용출시킨 후 단계적으로 아세톤을 증가시켰다 (10%, 20%, 30%, 등, 에틸 아세테이트 내에서). 약 250 mL 분획물을 수집하고 및 표적 화합물을 분석적 LC로써 동정하고, 혼합하고 및 건조 시켰다. 이러한 물질(188 mg)을 메탄올 1.8 ml에 용해하고 및 예비성 HPLC로 정제하였다. Waters Xterra MSC18 컬럼 (10 미크론, 19 cm x 250 mm)을 사용하고 용매를 21 mL/min로 펌프하였다. 용매 A는 물이고 용매 B는 아세토니트릴이었다. 주입후 컬럼을 50 % B에서 6 분간 등용매적으로 용리한 후, 30분에서 100 % B로 구배하였다. 이러한 분획물을 감압하에서 건조시켜 표적 화합물을 회백색 무정형 고체로서 얻었다 (15 mg).
실시예 6 - 62-플루오로 상글리페린 A, 중간체 화합물 16의 분리
메틸 (S)-2-아미노-3-(4-플루오로-3-하이드록시페닐)프로파노에이트 및 DL-피페라즈산 전구체를 사용하였다. 전구체를 27 시간에서 첨가한 것을 제외하고, 발효를 일반 방법에 따라 수행하였다.
수집후, 상기 배양액을 모으고 포름산으로 약 pH 3으로 조절하고, 25분간 원심분리하여 (3300g) 맑게진 배양액으로부터 세포와 수지를 분리하였다. 표적 화합물의 5% 미만이 존재한다는 것을 분석 확인한 후, 맑게진 배양액을 버렸다. 자석 교반기를 사용하여 세포와 수지를 아세토니트릴 2 배 부피와 같이 1 시간 교반하였다. 상기 아세토니트릴 추출물을 원심분리 또는 중력하에서 침전시킴으로써 회수하였다. 다음, 세포와 수지의 제2 아세토니트릴 추출을 동일한 조건에서 수행하였다.
혼합된 아세토니트릴 추출물을 감압하에서 농축하여 잔류부피를 만들고 이를 pH 6으로 조정하였다. 이를 에틸 아세테이트로 두 번 추출하고, 혼합된 유기물을 감압하에서 건조시켜 최종 오일성 미정제물을 생성하였다 (4.2g).
상기 미정제 추출물 (4.2 g)을 에틸 아세테이트 4 ml에 용해하고, 에틸 아세테이트 500 ml로 조건화된 실리카 젤 컬럼(15 x 2 cm)에 적재하였다. 상기 컬럼을 에틸 아세테이트로 용출시킨 후 단계적으로 아세톤을 증가시켰다 (10%, 20%, 30%, 등, 에틸 아세테이트 내에서). 약 250 mL 분획물을 수집하고 및 표적 화합물을 분석적 LC로써 동정하고, 혼합하고 및 건조 시켰다. 이러한 물질(390 mg)을 메탄올 2.4 ml에 용해하고 및 예비성 HPLC로 정제하였다. Waters Xterra MSC18 컬럼 (10 미크론, 19 cm x 250 mm)을 사용하고 용매를 21 mL/min로 펌프하였다. 용매 A는 물이고 용매 B는 아세토니트릴이었다. 주입후 컬럼을 50 % B에서 6 분간 등용매적으로 용리한 후, 30분에서 100 % B로 구배하였다. 순수한 분획물들을 HPLC-UV로 동정하고, 혼합하였다. 이러한 분획물을 감압하에서 건조시켜 표적 화합물을 회백색 무정형 고체로서 얻었다 (38 mg).
실시예 7 - 62-메틸 상글리페린 A, 중간체 화합물 17의 분리
BIOT-4585의 냉동보존된 포자 스탁들을 실온에서 해동하였다. 포자 스탁 0.4 mL을 배지 SM25 400 mL을 함유한 2L들이 삼가 플라스크로 옮기고 스폰지 (foam) 마개하여 생장력 있는 배양물 (종 배양물)을 만들었다. 48 시간 27℃에서 250 rpm (5.0 cm 행정거리)으로 배양하였다. 이러한 종 배양물로부터, 25 mL를 생성 배지 SGP2+5%HP20 250mL을 함유한 2L들이 삼각 플라스크에 옮기고 스폰지 마개로 막았다. 24℃ 및 250 rpm (2.5cm 행정거리)에서 24 시간 배양 후, 1M 염화수소 산에 함유된 메틸 (S)-2-아미노-3-(3-하이드록시-4-메틸페닐)프로파노에이트의 200 mM 용액의 2 mL 및 DL-피페라즈 산의 400 mM 메탄올성 용액 2 mL를 각 생성 플라스크에 첨가하여 전구체들의 개별 거울상 이성질체들의 최종 1 mM 농도를 만든다. 24℃ 및 250rpm (2.5cm 행정거리)에서 추가로 4 일간 배양을 실시하였다.
상기 배양액을 모으고 포름산으로 약 pH 3으로 조절하고, 25분간 원심분리하여 (3300g) 맑게진 배양액으로부터 세포와 수지를 분리하였다. 표적 화합물의 5% 미만이 존재한다는 것을 분석 확인한 후, 맑게진 배양액을 버렸다. 오버헤드 패들 교반기를 사용하여 세포와 수지를 아세토니트릴 2 배 부피와 같이 1 시간 교반하였다. 상기 아세토니트릴 추출물을 중력하에서 침전시킴으로써 회수하였다. 다음, 세포와 수지의 제2 아세토니트릴 추출을 동일한 조건에서 수행하였다. 혼합된 아세토니트릴 추출물을 감압하에서 농축하여 잔류 수성 부피를 만들고 이를 pH 6으로 조정하였다. 이를 에틸 아세테이트로 두 번 추출하고, 혼합된 유기물을 감압하에서 건조시켜 최종 오일성 미정제물을 생성하였다 (7.6g).
상기 미정제 추출물 (7.6 g)을 에틸 아세테이트 5 ml에 용해하고, 에틸 아세테이트 500 ml로 조건화된 실리카 젤 컬럼(15 x 2 cm)에 적재하였다. 상기 컬럼을 에틸 아세테이트로 용출시킨 후 단계적으로 아세톤을 증가시켰다 (10%, 20%, 30%, 등, 에틸 아세테이트 내에서). 약 250 mL 분획물을 수집하고 및 표적 화합물을 분석적 LC로써 동정하고, 혼합하고 및 건조 시켰다. 이러한 물질(319 mg)을 메탄올 2.4 ml에 용해하고 및 예비성 HPLC로 정제하였다. Waters Xterra MSC18 컬럼 (10 미크론, 19 cm x 250 mm)을 사용하고 용매를 21 mL/min로 펌프하였다. 용매 A는 물이고 용매 B는 아세토니트릴이었다. 주입후 컬럼을 50 % B에서 6 분간 등용매적으로 용리한 후, 30분에서 100 % B로 구배하였다. 순수한 분획물들을 HPLC-UV로 동정하고, 혼합하였다. 이러한 분획물을 감압하에서 건조시켜 표적 화합물을 회백색 무정형 고체로서 얻었다 (14.9 mg).
실시예 8 - 61-데스하이드록시 상글리페린 A, 중간체 화합물 18의 분리
BIOT-4585의 냉동보존된 포자 스탁들을 실온에서 해동하였다. 포자 스탁 0.4 mL을 배지 SM25 400 mL을 함유한 2L들이 삼가 플라스크로 옮기고 스폰지 (foam) 마개하여 생장력 있는 배양물 (종 배양물)을 만들었다. 48 시간 27℃에서 250 rpm (2.5 cm 행정거리)으로 배양하였다. 이러한 종 배양물로부터, 500 mL를 생성 배지 SGP2+5%HP20 4.5 L를 함유한 7L들이 Applikon 발효기에 옮기고 24℃, 400rpm (케스케이드 DOT 조절), 2.5L/min 공기 유동 및 30% DOT (케스케이드 진탕조절)에서 배양하였다. 24 시간 배양 후, 1M 염화수소 산에 함유된 (S)-2-아미노-3-페닐프로파노산의 667 mM 용액 7.5 mL을 상기 발효기에 첨가하여 상기 전구체의 최종 1 mM 농도를 생성하였다. 24℃, 400rpm (케스케이드 DOT 조절), 2.5L/min 공기 유동 및 30% DOT (케스케이드 진탕 조절) 에서 추가로 4 일간 배양을 실시하였다.
상기 배양액을 모으고 포름산으로 약 pH 3으로 조절하고, 25분간 원심분리하여 (3300g) 맑게진 배양액으로부터 세포와 수지를 분리하였다. 표적 화합물의 5% 미만이 존재한다는 것을 분석 확인한 후, 맑게진 배양액을 버렸다. 오버헤드 패들 교반기를 사용하여 세포와 수지를 아세토니트릴 2 배 부피와 같이 1 시간 교반하였다. 상기 아세토니트릴 추출물을 중력하에서 침전시킴으로써 회수하였다. 다음, 세포와 수지의 제2 아세토니트릴 추출을 동일한 조건에서 수행하였지만, 제2 추출물은 원심분리로 회수하였다. 혼합된 아세토니트릴 추출물을 감압하에서 농축하여 잔류 수성 부피를 만들고 이를 pH 6으로 조정하였다. 이를 에틸 아세테이트로 두 번 추출하고, 혼합된 유기물을 감압하에서 건조시켜 최종 미정제물을 생성하였다 (55g).
상기 미정제 추출물 (55 g)을 물에 포함된 80% 메탄올에 현탁하고 헥산 300 ml로 두번 추출하였다. 상기 표적 화합물을 메탄올/물 부분에서 발견하고 이를 건조시켰다. 이러한 건조된 추출물 (48 g)을 30 ml 에틸 아세테이트에 용해하고 및 1 L 에틸 아세테이트로 조건화된 실리카 젤 컬럼 (20 x 5 cm)에 적재하였다. 상기 컬럼을 에틸 아세테이트로 용출시킨 후 단계적으로 아세톤을 증가시켰다 (10%, 20%, 30%, 등, 에틸 아세테이트 내에서). 약 250 mL 분획물을 수집하고 및 표적 화합물을 분석적 LC로써 동정하고, 혼합하고 및 건조 시켰다. 이러한 물질(813 mg)을 메탄올에 용해하고 및 예비성 HPLC로 정제하였다. Waters Xterra MSC18 컬럼 (10 미크론, 19 cm x 250 mm)을 사용하고 용매를 21 mL/min로 펌프하였다. 용매 A는 물이고 용매 B는 아세토니트릴이었다. 주입후 컬럼을 50 % B에서 6 분간 등용매적으로 용리한 후, 30분에서 100 % B로 구배하였다. 순수한 분획물들을 HPLC-UV로 동정하고, 혼합하였다. 이러한 분획물을 감압하에서 건조시켜 표적 화합물을 회백색 무정형 고체로서 얻었다 (34 mg).
실시예 9 - 58-데스(3-하이드록시페닐)-58-(3-하이드록시(2-피리딜)-상글리페린 A, 중간체 화합물 19의 분리
메틸 (2S)-2-아미노-3-(3-하이드록시(2-피리딜))프로파노에이트 및 DL-피페라즈산 전구체를 사용하였다. 생장성 (종) 배양동안 배양기 행정거리가 2.5 cm인 것을 제외하고, 발효를 일반 방법에 따라 수행하였다.
상기 배양액을 모으고 포름산으로 약 pH 3으로 조절하고, 25분간 원심분리하여 (3300g) 맑게진 배양액으로부터 세포와 수지를 분리하였다. 표적 화합물의 5% 미만이 존재한다는 것을 분석 확인한 후, 맑게진 배양액을 버렸다. 오버헤드 패들 교반기를 사용하여 세포와 수지를 아세토니트릴 2 배 부피와 같이 1 시간 교반하였다. 상기 아세토니트릴 추출물을 중력하에서 침전시킴으로써 회수하였다. 다음, 세포와 수지의 제2 아세토니트릴 추출을 동일한 조건에서 수행하였다. 혼합된 아세토니트릴 추출물을 감압하에서 농축하여 잔류부피를 만들고 이를 pH 6으로 조정하였다. 이를 에틸 아세테이트로 두 번 추출하고, 혼합된 유기물을 감압하에서 건조시켜 최종 오일성 미정제물을 생성하였다 (7g).
상기 미정제 추출물 (7 g)을 에틸 아세테이트 4 ml에 용해하고, 에틸 아세테이트 500 ml로 조건화된 실리카 젤 컬럼(15 x 2 cm)에 적재하였다. 상기 컬럼을 에틸 아세테이트로 용출시킨 후 단계적으로 아세톤을 증가시켰다 (10%, 20%, 30%, 등, 에틸 아세테이트 내에서 100% 아세톤까지, 다음, 아세톤 내의 1% 메탄올에서 단계적 5% 메탄올까지). 약 250 mL 분획물을 수집하고 및 표적 화합물을 분석적 LC로써 동정하고, 혼합하고 및 건조 시켰다. 이러한 물질(204 mg)을 메탄올에 용해하고 및 예비성 HPLC로 정제하였다. Waters Xterra MSC18 컬럼 (10 미크론, 19 cm x 250 mm)을 사용하고 용매를 21 mL/min로 펌프하였다. 용매 A는 물이고 용매 B는 아세토니트릴이었다. 주입후 컬럼을 50 % B에서 6 분간 등용매적으로 용리한 후, 30분에서 100 % B로 구배하였다. 순수한 분획물들을 HPLC-UV로 동정하고, 혼합하였다. 이러한 분획물을 감압하에서 건조시켜 표적 화합물을 회백색 무정형 고체로서 얻었다 (4 mg).
실시예 10 - 61-데스하이드록시-61-플루오로 상글리페린 A, 중간체 화합물 20의 분리
BIOT-4585의 냉동보존된 포자 스탁들을 실온에서 해동하였다. 포자 스탁 0.4 mL을 배지 SM25 400 mL을 함유한 2L들이 삼가 플라스크로 옮기고 스폰지 (foam) 마개하여 생장력 있는 배양물 (종 배양물)을 만들었다. 48 시간 27℃에서 250 rpm (2.5 cm 행정거리)으로 배양하였다. 이러한 종 배양물로부터, 20 mL를 생성 배지 SGP2+5%HP20 400 mL를 함유한 2L들이 삼각플라스크에 옮기고 스폰지 마개를 막았다. 24℃ 및 250rpm (2.5cm 행정거리)에서, 24 시간 배양 후, 1M 염화수소 산에 함유된 2-아미노-3-(3-플루오로페닐)프로파노산의 400 mM 용액의 2 mL 및 DL-피페라즈 산의 400 mM 메탄올성 용액 2 mL를 각 생성 플라스크에 첨가하여 전구체들의 개별 거울상 이성질체들의 최종 1 mM 농도를 만든다. 24℃ 및 250rpm (2.5cm 행정거리)에서 추가로 4 일간 배양을 실시하였다.
상기 배양액을 모으고 포름산으로 약 pH 3으로 조절하고, 25분간 원심분리하여 (3300g) 맑게진 배양액으로부터 세포와 수지를 분리하였다. 표적 화합물의 5% 미만이 존재한다는 것을 분석 확인한 후, 맑게진 배양액을 버렸다. 오버헤드 패들 교반기를 사용하여 세포와 수지를 아세토니트릴 2 배 부피와 같이 1 시간 교반하였다. 상기 아세토니트릴 추출물을 중력하에서 침전시킴으로써 회수하였다. 다음, 세포와 수지의 제2 아세토니트릴 추출을 동일한 조건에서 수행하였다. 잔류 세포와 수지 혼합물을 원심분리하여 제3 추출물을 얻었다. 혼합된 아세토니트릴 추출물을 감압하에서 농축하여 잔류 수성 부피를 만들고 이를 pH 6으로 조정하였다. 이를 에틸 아세테이트로 두 번 추출하고, 혼합된 유기물을 감압하에서 건조시켜 최종 미정제물을 생성하였다 (10.5g).
상기 미정제 추출물 (10.5 g)을 에틸 아세테이트 7 ml에 용해하고, 에틸 아세테이트 500 ml로 조건화된 실리카 젤 컬럼(15 x 2 cm)에 적재하였다. 상기 컬럼을 에틸 아세테이트로 용출시킨 후 단계적으로 아세톤을 증가시켰다 (10%, 20%, 30%, 등, 에틸 아세테이트 내에서). 약 250 mL 분획물을 수집하고 및 표적 화합물을 분석적 LC로써 동정하고, 혼합하고 및 건조 시켰다. 이러한 물질(342 mg)을 메탄올에 용해하고 및 예비성 HPLC로 정제하였다. Waters Xterra MSC18 컬럼 (10 미크론, 19 cm x 250 mm)을 사용하고 용매를 21 mL/min로 펌프하였다. 용매 A는 물이고 용매 B는 아세토니트릴이었다. 주입후 컬럼을 53 % B에서 등용매적으로 용리하였다. 순수한 분획물들을 HPLC-UV로 동정하고, 혼합하였다. 이러한 분획물을 감압하에서 건조시켜 표적 화합물을 회백색 무정형 고체로서 얻었다 (6 mg).
실시예 11 -디에틸 (2-(1,2-옥사지난-2-일)-2-옥소에틸)포스포네이트의 합성
Figure 112013096342271-pct00046
21-1 (ChemCollect, Germany)(100 mg, 0.81 mmol), Et3N(246mg,2.43mmol)을 함유한 무수 DCM (5 mL) 용액에 염화 클로로아세틸 (138 mg, 1.22 mmol)을 적가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 교반하고, 빙수에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축하였다. 잔류물 (21-2)을 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다. (123 mg, 90% 수율).
21-2 (123 mg, 0.75 mmol) 및 트리에틸 포스파이트 (250 mg, 1.50 mmol)의 혼합물을 140 ℃에서 6 시간 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 21을 얻었다.
디에틸 (2-(1,2-옥사지난-2-일)-2-옥소에틸)포스포네이트, 21 합성의 다른 합성
Figure 112013096342271-pct00047
21a-2 제조의 일반적 방법
Figure 112013096342271-pct00048
t-BuOK (84.0g,0.75mol)이 함유된 테트라하이드로퓨란 (2.0L)용액에 21a-1(50.0g,0.38mol)을 실온에서 부분적으로 첨가하였다. 이 혼합울을 실온에서 1 시간 교반하였다. 1,4-디브로모부탄(81.2g,0.38mol)을 실온에서 적가하였다. 다음, 상기 혼합물을 80 ℃에서 16 시간 교반하였다. 냉각 후, 물(2000 mL)을 첨가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 1000 mL)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4상에서 16 시간 건조시키고, 여과 및 농축후, 잔류물을 실리카-젤 컬럼 크로마토그래피 (용리액: 석유 에테르:에틸 아세테이트=100:1 내지 10:1)로 여과하여 무색 오일로서 21a-2(57g)를 얻었다.
21a-3 제조의 일반적 방법
Figure 112013096342271-pct00049
21a-2(55g,0.29mol)이 함유된 터트-부틸 메틸 에테르, TBME (80 mL) 용액에 4N HCl 용액 (600 ml, TBME 내)을 실온에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3 시간 교반하였다. 침전된 고체를 여과하고 TBME (50 mL)로 세척하여 백색고체로서 21a-3 (30g)을 수득하였다.
21 제조의 일반적 방법
Figure 112013096342271-pct00050
21a-4 (35g,0.18mol),하이드록시벤조트리아졸 (HOBT) (29g,0.21mol)및 Et3N(71mL,0.51mol)을 함유한 무수 디클로로메탄 (550 mL)의 교반된 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDCI) (41g,0.21mol)를 0℃에서 부분적으로 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 0℃에서 0.5 시간 교반한 후, 21a-3(24g,0.20mol)을 0℃에서 첨가하고 16 시간 교반하였다. 다음, TLC (석유 에테르/에틸 아세테이트: 3/1)로 반응이 완수됨을 검사하였다. 이 때, 반응 혼합물을 격렬히 교반하면서 서서히 물(500 mL)에 부었다. 혼합물을 디클로로메탄 (2 x 200 mL)으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 염수 (2×100 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 및 농축하여 미정게 생성물을 수득하였다. 크로마토그래피 (석유 에테르/에틸 아세테이트, 100:1 내지 10:1)로 황색 오일로서 21 (38g)을 생성하였다.
실시예 12 -디에틸 (2-옥소-2-(피리딘-2-일아미노)에틸)포스포네이트의 합성
Figure 112013096342271-pct00051
22-1 (1 g, 10.6 mmol), Et3N(1.075g,10.6mmol)을 함유한 무수 염화 메틸렌 (50 mL)의 용액에 염화 클로로아세틸 (1.2 g, 10.6 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 교반하고, 빙수에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 및 진공에서 농축하였다. 잔류물을 역상-콤비플래쉬로 정제하여 22-2을 생성하였다.
22-2 (170 mg, 1.00 mmol) 및 트리에틸포스파이트 (332 mg, 2.00 mmol)의 혼합물을 140 ℃에서 6 시간 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 22를 생성하였다.
실시예 13 - 화합물 23의 제조
Figure 112013096342271-pct00052
14 (430 mg, 0.38 mmol), (DHQ)2PHAL(18.6mg,0.024mmol),오스뮴 테트라옥사이드 (0.156 mL, 0.012 mmol) 함유 터트-부틸 알코올 (2.5 wt%, 0.079 mmol/ml), 및 메탄설폰아미드 (74 mg, 0.77 mmol) 함유 20 mL 터트-부틸 알코올의 교반된 용액에 포타슘 페리시아나이드 (382 mg, 1.16 mmol) 및 탄산 칼륨 (160 mg, 1.16 mmol)을 함유한 20 mL 물을 실온에서 첨가하여 갈색 에멀젼을 생성하였다. 2 시간 후, 아황산 나트륨 용액을 첨가하고, 20분간 교반하였다. 결과된 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 x 50 ml). 혼합된 유기층들을 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 감압 하 농축하고, 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 흰색 고체로서 23-2을 생성하였다.
THF 및 물의 2:1 혼합물24 mL에 23-2 (240 mg, 0.21 mmol)이 함유된 교반된 용액에 과요오드산 나트륨 (91 mg, 0.42 mmol)을 첨가하였다. 결과된 혼합물을 실온에서 3 시간 교반한 후, 포화된 수성 중탄산 나트륨을 첨가하였다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트를 세부분으로 하여 추출하였다. 혼합된 유기층을 물로 한번 및 포화 염수로 두번 세척하고, 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 및 감압하 농축하였다. 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 23-3을 생성하였다.
디에틸 (2-(메톡시(메틸)아미노)-2-옥소에틸)포스포네이트 (91 mg, 0.368 mmol)을 함유한 THF (5.0 mL) 용액에 NaH (2.8 mg, 0.1104 mmol)을 함유한 무수 THF (0.2 mL)를 0 ℃에서 교반하면서 첨가하였다. 다음, 용액을 20℃에서 맑게될 때까지 교반하였다. 다음, 23-3(70mg,0.092mmol)을 상기 맑은 용액에 첨가하고 혼합물을 20 ℃에서 2 시간 교반하였다. 이 혼합물을 물(10 mL)로 식히고, 에틸 아세테이트 (3 x 30 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고 및 진공 농축하였다. 잔류물을 예비성 HPLC로 정제하여 흰색 고체로서 23을 수득하였다.
실시예 14 - 화합물 24의 제조
Figure 112013096342271-pct00053
21 (42 mg, 0.168 mmol)을 함유한 THF (2.0 mL) 용액에 NaH (1.2 mg, 0.05 mmol)을 함유한 무수 THF (0.2 mL)를 0 ℃에서 교반하면서 첨가하였다. 다음, 상기 용액을 20 ℃에서 맑게될 때까지 교반하였다. 다음, 23-3(30mg,0.042mmol)을 상기 맑은 용액에 첨가하고 혼합물을 20 ℃에서 2 시간 교반하였다. 이 혼합물을 물 (10 mL)로 식히고 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 x 20 mL). 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 및 진공에서 농축하였다. 잔류물을 예비성 HPLC로 정제하여 흰색 고체로서 24을 생성하였다.
실시예 15 - 화합물 25의 제조
Figure 112013096342271-pct00054
22 (48 mg, 0.168 mmol)을 함유한 THF (2.0 mL) 용액에 NaH (1.2 mg, 0.05 mmol)을 함유한 무수 THF (0.2 mL)를 0 ℃에서 교반하면서 첨가하였다. 이 용액을 20 ℃에서 맑게될 때까지 교반하였다. 다음 23-3 (30 mg, 0.042 mmol)을 맑은 용액에 첨가하고 혼합물을 20 ℃에서 2 시간 교반하였다. 혼합물을 물(10 mL)로 식히고, 에틸 아세테이트 (3 x 20 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 및 진공 농축하였다. 잔류물을 예비성 HPLC로 정제하여 흰색 고체로서 25 를 수득하였다.
실시예 16 - 화합물 26의 제조
Figure 112013096342271-pct00055
23 (13 mg, 0.015 mmol)이 용해된 디옥산 (1 mL) 용액에 수성 HCl 용액 (2 M, 0.080 ml, 0.16 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 20 ℃에서 24 시간 교반한 후, 물로 식히고, 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 x 10 mL). 유기상을 황산 나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 예비성 HPLC로 정제하여 흰색 고체로서 26을 수득하였다.
실시예 17 - 화합물 27의 제조
Figure 112013096342271-pct00056
17 (99 mg, 0.09 mmol), (DHQ)2PHAL(4.2mg,0.0054mmol),오스뮴 테트라옥사이드 (0.034 mL, 0.0027 mmol) 함유 터트-부틸 알코올 (2.5 wt%, 0.079 mmol/ml), 및 메탄설폰아미드 (18 mg, 0.18 mmol) 함유 5 mL 터트-부틸 알코올의 교반된 용액에 포타슘 페리시아나이드 (90 mg, 0.27 mmol) 및 탄산 칼륨 (37 mg, 0.27 mmol) 함유 5 mL 물을 실온에서 첨가하여 갈색 에멀젼을 생성하였다. 2 시간 후, 아황산 나트륨을 첨가하고, 20분간 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 x 20 ml). 혼합된 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하 농축하고, 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 흰색 고체로서 27-2을 생성하였다.
THF 및 물의 2:1 혼합물 3 mL에 27-2 (40 mg, 0.035 mmol)이 함유된 교반된 용액에 과요오드산 나트륨 (15 mg, 0.07 mmol)을 첨가하였다. 결과된 혼합물을 실온에서 3 시간 교반한 후, 포화된 수성 중탄산 나트륨을 첨가하였다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트를 세부분으로 하여 추출하였다. 혼합된 유기층을 물로 한번 및 포화 염수로 두번 세척하고, 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 및 감압하 농축하였다. 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 27-3을 생성하였다.
21 (28 mg, 0.104 mmol)을 함유한 THF (2.0 mL)의 용액에 NaH (0.75 mg, 0.0312 mmol)를 함유한 무수 THF (0.2 mL)를 0 ℃에서 교반하면서 첨가하였다. 다음, 상기 용액을 맑게될 때까지 20 ℃에서 교반하였다. 다음, 27-3(19.6mg,0.026mmol)을 상기 맑은 용액에 첨가하고, 그 혼합물을 20 ℃에서 2 시간 교반하였다. 혼합물을 물(10 mL)로 식히고, 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 x 10 mL). 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 및 감압하 농축하였다. 잔류물을 예비성 HPLC로 정제하여 흰색고체로서 27을 수득하였다.
실시예 18 - 화합물 28의 제조
Figure 112013096342271-pct00057
15 (349 mg, 0.31 mmol), (DHQ)2PHAL(14mg,0.0186mmol),오스뮴 테트라옥사이드(0.117 mL, 0.0093 mmol) 함유 터트-부틸 알코올 (2.5 wt%, 0.079 mmol/ml), 및 메탄설폰아미드 (59 mg, 0.62 mmol) 함유 15 mL 터트-부틸 알코올의 교반된 용액에 포타슘 페리시아나이드 (128 mg, 0.93 mmol) 및 탄산 칼륨 (306 mg, 0.93 mmol) 함유 15 mL 물을 실온에서 첨가하여 갈색 에멀젼을 생성하였다. 2 시간 후, 아황산 나트륨을 첨가하고, 20분간 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 x 50 ml). 혼합된 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하 농축하고, 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 흰색 고체로서 28-2을 생성하였다.
THF 및 물의 2:1 혼합물 15 mL에 28-2 (170 mg, 0.1466 mmol)이 함유된 교반된 용액에 과요오드산 나트륨 (62 mg, 0.2931 mmol)을 첨가하였다. 결과된 혼합물을 실온에서 3 시간 교반한 후, 포화된 수성 중탄산 나트륨을 첨가하였다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트를 세부분으로 하여 추출하였다. 혼합된 유기층을 물로 한번 및 포화 염수로 두번 세척하고, 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 및 감압하 농축하였다. 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 28-3을 생성하였다.
21 (41 mg, 0.155 mmol)을 함유한 THF (1.0 mL)의 용액에 NaH (2.3 mg, 0.0575 mmol)를 함유한 무수 THF (0.2 mL)를 0 ℃에서 교반하면서 첨가하였다. 다음, 상기 용액을 맑게될 때까지 20 ℃에서 교반하였다. 다음, 28-3(30mg,0.0387mmol)을 상기 맑은 용액에 첨가하고, 그 혼합물을 20 ℃에서 2 시간 교반하였다. 혼합물을 물(10 mL)로 식히고, 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 x 20 mL). 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 및 증발시켰다. 잔류물을 예비성 HPLC로 정제하여 흰색고체로서 28을 수득하였다.
실시예 19 - 화합물 29의 제조
Figure 112013096342271-pct00058
22 (42 mg, 0.155 mmol)을 함유한 THF (1.0 mL)의 용액에 NaH (2.3 mg, 0.0575 mmol)를 함유한 무수 THF (0.2 mL)를 0 ℃에서 교반하면서 첨가하였다. 다음, 상기 용액을 맑게될 때까지 20 ℃에서 교반하였다. 다음, 28-3(30mg,0.0387mmol)을 상기 맑은 용액에 첨가하고, 그 혼합물을 20 ℃에서 2 시간 교반하였다. 혼합물을 물(10 mL)로 식히고, 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 x 20 mL). 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 및 증발시켰다. 잔류물을 예비성 HPLC로 정제하여 흰색고체로서 29를 수득하였다.
실시예 20 - 화합물 30의 제조
Figure 112013096342271-pct00059
디에틸 (2-(메톡시(메틸)아미노)-2-옥소에틸)포스포네이트 (37 mg, 0.155 mmol)을 함유한 THF (1.0 mL)의 용액에 NaH (2.3 mg, 0.0575 mmol)를 함유한 무수 THF (0.2 mL)를 0 ℃에서 교반하면서 첨가하였다. 다음, 상기 용액을 맑게될 때까지 20 ℃에서 교반하였다. 다음, 28-3(30mg,0.0387mmol)을 상기 맑은 용액에 첨가하고, 그 혼합물을 20 ℃에서 2 시간 교반하였다. 혼합물을 물(10 mL)로 식히고, 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 x 20 mL). 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 및 증발시켰다. 잔류물을 예비성 HPLC로 정제하여 흰색고체로서 30을 수득하였다.
실시예 21 -생물학적 데이터 -HCV 리플리콘 및 분석
화합물들을 일반적 방법에서 설명된 바와 같이, Huh5.2 세포를 사용하는 유전자형 1b 리플리콘 분석법으로 분석하였다. 사이클로스포린 A, 1, DEBIO-025, 2, 상글리페린 A, 5, 및 하이드록시마크로사이클, 6을 비교물로 사용하였다.
Figure 112013096342271-pct00060
나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물 23, 24, 25, 26 및 27 모두 CsA, Debio-025, SfA 및 상기 하이드록시마크로사이클에 비하여, Huh5.2 리플리콘 분석법에서 유의하게 더 강력하며 (낮은 EC50에 의해 나타나듯이), 상기 세포주에 대하여 유의하게 더 나은 선택성을 보인다 (높은 선택성 지표로 나타나듯이).
실시예 22 -생물학적 데이터 -HIV 대항 활성
화합물들을, 일반 방법에서 설명한 바와 같이, HeLa 세포를 사용하여 HIV 항바이러스 분석법으로 분석하였다. 사이클로스포린 A, 1, DEBIO-025, 2, 및 HIV 항바이러스 제제 엠트리시타빈과 테노포비르를 비교물로 사용하였다.
Figure 112013096342271-pct00061
나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물 24는, 본 분석법 상, HIV 감염을 저해하는 것에서, CsA, DEBIO-025, 엠트리시타빈 및 테노포비르보다 유의하게 더 강력하다.
실시예 23 -생물학적 데이터 -마우스 생체 내 경구 및 iv PK
화합물들의 생체내 준비물에서의 약동력학적 특성을 평가하기 위해, 화합물들을 CD1 마우스 군에 10 또는 5mg/kg 양으로 po 투여 및 1mg/kg 양으로 iv 투여하였다. 약동력학적 분석을 일반 방법에서 설명한 대로 수행하였다. PK 변수들을 하기에 나타낸다.
Figure 112013096342271-pct00062
나타난 바와 같이, 화합물 23 및 24는, 상글리페린 A에 비하여, 제거율을 감소시키고 경구 노출을 증가시킨다 (높은 po AUClast로 나타난 바와 같이).
실시예 24 -생물학적 데이터 -CypA PPIase 활성의 저해
CypA 펩티딜 프로필 시스-트란스 이소머라제 (PPIase) 활성의 직접적인 저해를 평가하기 위해, 일반 방법에서 설명한 대로의 방법을 사용하였다. 사이클로스포린 A, 1, DEBIO-025, 2 및 상글리페린 A, 5를 대조군으로 사용하였다.
Figure 112013096342271-pct00063
나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물 23, 24, 25 및 27 모두는 상글리페린 A, DEBIO-025 및 사이클로스포린 A보다 더 강력하게 CypA PPIase 활성을 저해한다.
실시예 25 -생물학적 데이터 -빌리루빈 수송체의 저해
DEBIO-025 사용시 나타나는 투약을 제한하는 고빌리루빈 혈증의 원인이 된다고 생각되는, 빌리루빈 수송체의 표적외 저해의 가능성을 평가하기 위해, 수송체 저해의 시험관 내 분석을 일반 방법에서 설명한 대로 수행하였다.
Figure 112013096342271-pct00064
나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물 24는 DEBIO-025 및 사이클로스포린 A와 비교하여, 접합된 및 미접합된 빌리루빈 수송체를 훨씬 덜 저해한다.
실시예 26 -생물학적 데이터 -생체이물 수송체의 저해
생체 이물 수송체의 저해를 통한 약 약 상호작용 (DDIs)의 가능성을 평가하기 위해, P-당단백질 (Pgp/MDR1) 및 담즙염 배출 펌프 (BSEP) 저해에 대한 시험관 내 분석을 일반 방법에서 설명한 바와 같이 수행하였다.
Figure 112013096342271-pct00065
나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물 24는 DEBIO-025 및 사이클로스포린 A에 비하여, 약-약 상호작용에 잠재적으로 연루된 생체 이물 수송체를 훨씬 덜 저해하는 것으로 나타난다.
참조문헌
Appel, N., T. Schaller, et al. (2006). "From structure to function: new insights into hepatitis C virus RNA replication." JBiolChem 281(15): 9833-6.
Banteli, R., J. Wagner, et al. (2001). "Synthesis of derivatives of the novel cyclophilin-binding immunosuppressant sanglifehrin A with reduced numbers of polar functions." BioorgMedChemLett 11(12): 1609-12.
Chatterji, U., M. Bobardt, et al. (2009). "The isomerase active site of cyclophilin a is critical for HCV replication." JBiolChem.
Colgan, J., M. Asmal, et al. (2000). "Isolation, characterization and targeted disruption of mouse ppia: cyclophilin A is not essential for mammalian cell viability." Genomics 68(2): 167-78.
Crabbe, R., G. Vuagniaux, et al. (2009). "An evaluation of the cyclophilin inhibitor Debio 025 and its potential as a treatment for chronic hepatitis C." ExpertOpinInvestigDrugs 18(2): 211-20.
Dolinski, K., S. Muir, et al. (1997). "All cyclophilins and FK506 binding proteins are, individually and collectively, dispensable for viability in Saccharomyces cerevisiae." ProcNatlAcadSciUSA 94(24): 13093-8.
E. Lawitz, R. R., T. Nguyen, M. Huang, J. Ke, J. Praestgaard, D. Serra, M. Koziel, T. Evans (2009). "Safety And Antiviral Efficacy Of 14 Days Of The Cycophilin Inhibitor Nim811 In Combination With Pegylated Interferon .2a In Relapsed Genotype 1 Hcv Infected Patients." JournalofHepatology 50(S1): S379.
Egorin, M. J., T. F. Lagattuta, et al. (2002). "Pharmacokinetics, tissue distribution, and metabolism of 17-(dimethylaminoethylamino)-17-demethoxygeldanamycin (NSC 707545) in CD2F1 mice and Fischer 344 rats." CancerChemotherPharmacol 49(1): 7-19.
Fehr, T., J. Kallen, et al. (1999). "Sanglifehrins A, B, C and D, novel cyclophilin-binding compounds isolated from Streptomyces sp. A92-308110. II. Structure elucidation, stereochemistry and physico-chemical properties." JAntibiot(Tokyo) 52(5): 474-9.
Flisiak, R., A. Horban, et al. (2008). "The cyclophilin inhibitor Debio-025 shows potent anti-hepatitis C effect in patients coinfected with hepatitis C and human immunodeficiency virus." Hepatology 47(3): 817-26.
Furniss, B. S., Furniss, A.I., Vogel, A.I., Ed. (1989). Vogel'sTextbookofPracticalOrganicChemistry,PrenticeHall.
Gaither, L. A., Borawski, J., Anderson, L. J., Balabanis, K. A. et al., (2010). cyclophilins involved in different cellular pathways mediate HCV replicationVirology397:43-55
Glavinas, H., Krajcsi, P., Cserepes, J., Sarkadi, B. (2004). "The role of ABC transporters in drug resistance, metabolism and toxicity." Curr.Drug.Deliv. 1(1): 27-42.
Gomez, L., H. Thibault, et al. (2007). "Inhibition of mitochondrial permeability transition improves functional recovery and reduces mortality following acute myocardial infarction in mice." AmJPhysiolHeartCircPhysiol 293(3): H1654-61.
Goto, K., Watashi, K., Inoue, D., Hijikata, M., Shimotohno, K. (2009) of cellular and viral factors related to anti-hepatitis C virus activity of cyclophilin inhibitorCancerScience100(10):1943-1950
Hanoulle, X., Badillo A, Wieruszeski JM, Verdegem D, Landrieu I, Bartenschlager R, Penin F, Lippens G (2009). "Hepatitis C virus NS5A protein is a substrate for the Peptidyl-Prolyl cis/trans isomerase activity of Cyclophilins A and B." JBiolChem.
Hartel, C., P. Iblher, et al. (2006). "Immunosuppressive activity of the immunophilin-binding drug Sanglifehrin A in human whole blood: potent inhibition of interleukin-6 produced by lymphocytes and monocytes." ScandJImmunol 63(1): 26-34.
Herrler, M., H. Bang, et al. (1994). "Cloning and characterization of ppiB, a Bacillus subtilis gene which encodes a cyclosporin A-sensitive peptidyl-prolyl cis-trans isomerase." MolMicrobiol 11(6): 1073-83.
Hite, M., Turner, S., Federici, C. (2003). 1: Oral delivery of poorly soluble drugsPharmaceuticalManufacturingandPackingSourcer.Summer2003issue.
Immecke, S.N., Baal., N, et al. (2011). Cyclophilin-Binding Agent Sanglifehrin A Is a Dendritic Cell Chemokine and Migration Inhibitor. PLOS one 6(3):e18406
Inoue, K., K. Sekiyama, et al. (2003). "Combined interferon alpha2b and cyclosporin A in the treatment of chronic hepatitis C: controlled trial." JGastroenterol 38(6): 567-72.
Inoue, K., T. Umehara, et al. (2007). "Evaluation of a cyclophilin inhibitor in hepatitis C virus-infected chimeric mice in vivo." Hepatology 45(4): 921-8.
Ishii, N., K. Watashi, et al. (2006). "Diverse effects of cyclosporine on hepatitis C virus strain replication." JVirol 80(9): 4510-20.
Ke, J., E. L., R. Rozier, T. Marbury, N. Nguyen, D. Serra, K. Dole, J. Praestgaard, M. Huang, T. Evans (2009). "Safety, And Tolerability Of Nim811, A Novel Cyclophilin Inhibitor For Hcv, Following Single And Multiple Ascending Doses In Healthy Volunteers And Hcv-Infected Patients." JournalofHepatology 50(S1): S229.
Jacobson, I., McHutchison, JG, Sulkowski, M. (2007). Gastroenterol & Hepatol 3(S34): 1-10.
Kallen, J., R. Sedrani, et al. (2005). "Structure of human cyclophilin A in complex with the novel immunosuppressant sanglifehrin A at 1.6 A resolution." J Biol Chem 280(23): 21965-71.
Kawasaki, H., E. S. Mocarski, et al. (2007). "Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells." J Virol 81(17): 9013-23.
Konig, J. H., Glaeser, M. Keiser, K. Mandery, U. Klotz and M. F. Fromm (2010), DrugMetabDispos,39,1097-1102.
Manns, M. P., G. R. Foster, et al. (2007). "The way forward in HCV treatment--finding the right path." NatRevDrugDiscov 6(12): 991-1000.
Martin Cabrejas, L. M., S. Rohrbach, et al. (1999). "Macrolide Analogues of the Novel Immunosuppressant Sanglifehrin: New Application of the Ring-Closing Metathesis Reaction." AngewChemIntEdEngl 38(16): 2443-2446.
Mathy, J. E., S. Ma, et al. (2008). "Combinations of cyclophilin inhibitor NIM811 with hepatitis C Virus NS3-4A Protease or NS5B polymerase inhibitors enhance antiviral activity and suppress the emergence of resistance." AntimicrobAgentsChemother 52(9): 3267-75.
Melnikova, I. (2008). "Hepatitis C therapies." NatureRevDrugDisc 7: 799-800.
Metternich, R., Denni, D., Thai, B, Sedrani, R. (1999). "Toward a Total Synthesis of the Immunosuppressant Sanglifehrin A. Preparation of Two Relay Compounds by Degradation and Their Use in the Reassembly of the Natural Product." J. Org. Chem. 64: 9632-9639.
Millay, D. P., M. A. Sargent, et al. (2008). "Genetic and pharmacologic inhibition of mitochondrial-dependent necrosis attenuates muscular dystrophy." NatMed 14(4): 442-7.
Nelson, D. R., Ghalib, R.H., Sulkowski, M., Schiff, E., Rustgi, V., Pockros, P.J., Wang, C., Decosterd Kerhuel, D., and P. Grosgurin, Porchet, H., Crabbe, R. (2009). "Efficacy And Safety Of The Cyclophilin Inhibitor Debio 025 In Combination With Pegylated Interferon Alpha-2a And Ribavirin In Previously Null-Responder Genotype 1 Hcv Patients." JournalofHepatology 50(S1): S40.
Niwa, T., Yamamoto, S, Saito, M, Shiraga, T, Takagi, A. (2007). "Effect of Cyclosporine and Tacrolimus on Cytochrome P450 Activities in Human Liver Microsomes." YakugakuZasshi 127(1): 209--216.
Paeshuyse, J., A. Kaul, et al. (2006). "The non-immunosuppressive cyclosporin DEBIO-025 is a potent inhibitor of hepatitis C virus replication in vitro." Hepatology 43(4): 761-70.
Parfieniuk, A., J. Jaroszewicz, et al. (2007). "Specifically targeted antiviral therapy for hepatitis C virus." WorldJGastroenterol 13(43): 5673-81.
Pawlotsky, J. M. (2000). "Hepatitis C virus resistance to antiviral therapy." Hepatology 32(5): 889-96.
Pawlotsky, J. M. (2005). "Current and future concepts in hepatitis C therapy." SeminLiverDis 25(1): 72-83.
Pawlotsky, J. M. (2006). "Virology of hepatitis B and C viruses and antiviral targets." JHepatol 44(1 Suppl): S10-3.
Pemberton, T. J. and J. E. Kay (2003). "Cyclophilin sensitivity to sanglifehrin A can be correlated to the same specific tryptophan residue as cyclosporin A." FEBSLett 555(2): 335-40.
Pockros, P. (2008). "Emerging Therapies for Chronic Hepatitis C Virus." GastroenterolandHepatology 4(10): 729-734.
Ptak, R. G., P. A. Gallay, et al. (2008). "Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in human cells by Debio-025, a novel cyclophilin binding agent." Antimicrob Agents Chemother 52(4): 1302-17.
Qu, X., Jiang, N. et al., (2011). "Cloning, sequencing and characterization of the biosynthetic gene cluster of sanglifehrin A, a potent cyclophilin inhibitor." Mol.Biosyst.7:852-861
Robida, J. M., H. B. Nelson, et al. (2007). "Characterization of hepatitis C virus subgenomic replicon resistance to cyclosporine in vitro." JVirol 81(11): 5829-40.
Hopkins, S. D. H., E. Gavis, J. Lalezari, E. Glutzer, B. DiMassimo, P. Rusnak, S. Wring, C. Smitley, Y. and Ribeill (2009). "Safety, plasma pharmacokinetics, and anti-viral activity of SCY-635 in adult patients with chronic hepatitis C virus infection." JournalofHepatology 50(S1): S36.
Sanglier, J. J., V. Quesniaux, et al. (1999). "Sanglifehrins A, B, C and D, novel cyclophilin-binding compounds isolated from Streptomyces sp. A92-308110. I. Taxonomy, fermentation, isolation and biological activity." JAntibiot(Tokyo) 52(5): 466-73.
Schneider, M. D. (2005). "Cyclophilin D: knocking on death's door." SciSTKE 2005(287): pe26.
Sedrani, R., J. Kallen, et al. (2003). "Sanglifehrin-cyclophilin interaction: degradation work, synthetic macrocyclic analogues, X-ray crystal structure, and binding data." JAmChemSoc 125(13): 3849-59.
Seden,K. D. Back and S. Khoo (2010), JAntimicrobChemother,65, 1079-1085.
Smith, M. B. a. M., J. , Ed. (2001). March,JohnWileyandSonsInc.,UK.
Steinschulte, C., T. Taner, et al. (2003). "Cutting edge: sanglifehrin A, a novel cyclophilin-binding immunosuppressant blocks bioactive IL-12 production by human dendritic cells." JImmunol 171(2): 542-6.
Strader, D. B., T. Wright, et al. (2004). "Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C." Hepatology 39(4): 1147-71.
Tropschug, M., I. B. Barthelmess, et al. (1989). "Sensitivity to cyclosporin A is mediated by cyclophilin in Neurospora crassa and Saccharomyces cerevisiae." Nature 342(6252): 953-5.
Vrolijk, J. M., A. Kaul, et al. (2003). "A replicon-based bioassay for the measurement of interferons in patients with chronic hepatitis C." JVirolMethods 110(2): 201-9.
Wring, S. ,C. Wille, C. Rewerts, R. Randolph, A. Scribner and S. Hopkins (2010), JournalofHepatology,52, S263
Yang, F., J. M. Robotham, et al. (2008). "Cyclophilin A is an essential cofactor for hepatitis C virus infection and the principal mediator of cyclosporine resistance in vitro." JVirol 82(11): 5269-78.
Zenke, G., U. Strittmatter, et al. (2001). "Sanglifehrin A, a novel cyclophilin-binding compound showing immunosuppressive activity with a new mechanism of action." JImmunol 166(12): 7165-71.
Zeuzem, S. and E. Herrmann (2002). "Dynamics of hepatitis C virus infection." AnnHepatol 1(2): 56-63.
Zhang, L. H. and J. O. Liu (2001). "Sanglifehrin A, a novel cyclophilin-binding immunosuppressant, inhibits IL-2-dependent T cell proliferation at the G1 phase of the cell cycle." JImmunol 166(9): 5611-8.
본 출원에 인용된 특허 및 특허 출원서를 포함한 모든 참조 문헌은 참조함으로써 가능한 최대로 본 발명에 내포된다.
명세서 및 하기 청구범위를 통틀어, 문맥이 달리 요구하지 않으며, "포함하다" 및 "포함" 및 "포함하는"과 같이 이의 변형어는 진술된 정수 또는 정수의 단계나 군을 내포하지만, 임의의 다른 정수나 정수의 단계나 군 또는 단계들을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
<110> NEUROVIVE PHARMACEUTICAL AB <120> MACROCYCLIC COMPOUNDS AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION <130> IP13-018/SE/NVP <150> GB 1105293.3 <151> 2011-03-29 <150> GB 1113629.8 <151> 2011-08-08 <150> GB 1202060.8 <151> 2012-02-07 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 cgctctgtgg cgcctggttt ccaagcggct cgcggaccgg caccggcaca tgcataatta 60 accctcacta aagggcg 77 <210> 2 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 tggatgtatc gtcgcaggac gcccagaatt cacctgcgac gtcctccaga tgcattaata 60 cgactcacta tagggctc 78 <210> 3 <211> 46596 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cosmid <400> 3 acaccggcca caccggcggc ggcctgcgtg tgcccgatgt tggacttcac cgaaccgagc 60 cacagcggct cgtcccgctc ctgcccgtag gtggcgagca gcgcctgcgc ctcgatcggg 120 tcgcccagcc gcgtgcccgt accgtgcgcc tccaccgcgt ccacgtccgc gggcgtgagc 180 ccggcaccgg agagcgcctg acggatcacc cgctgctgcg aaggaccgtt cggggccgtc 240 agaccgttcg acgcgccgtc ctggttgatc gcggtgccgc gtacgacggc cagtacctgg 300 tggccgtggc ggcgggcgtc ggagagccgt tccacgagga gcatgccggc gccctcggac 360 cagccggtgc cgtcggccgc ggcggcgaag gacttgcagc ggccgtccac ggccaggccg 420 cgctggcggg agaagtcgac gaagacgtcg ggggcggaca tgacggtgac accgccggcc 480 agcgccatcg agcactcgcc gctgcgcagc gcctggatcg cccagtgcag ggcgaccagc 540 gacgccgagc acgcggtgtc cacggtgacc gcagggcctt ccaggccgag gacgtaggcg 600 atgcggcccg acagcacgct ggcggagttg ccgatgccga cgtagccctc cgcgctctcg 660 acggtcctgc gcacgagctg ggcatagtcc tggccgttgg tgccgaggta gacgccgacg 720 tccgcgccgc gcagggactt cgggtcgatg ccggcgcgtt cgacggcctc ccaggcggtc 780 tccagggcca gccgctgctg cgggtccatc gccagcgcct cgcgcggcga gatcccgaag 840 aagtccgcgt cgaacccggc gacgtccgcg aggaagccgc cctcccgcac gtacgacgtg 900 cccgcgtgct ccggatccgg gtggaagagg cccgcgaggt cccagccccg gtcgtcgggg 960 aacggggtga gcgcgtcgcg ctcgtcggcg agcagccgcc acaggtcctc gggcgaggtc 1020 acgccgccgg ggtaccggca cgccatgccg acgatcgcga tgggatcgtc gtcggcgggg 1080 cgggcgacgg cgggcaccgg cgccgtctcc tcggcgcgtt cgccgaggag ttcggccagc 1140 aggtggccgg ccagggagcg cgggttgggg tggtcgaaca cgagggtcgc gggcaggcgc 1200 agcccggtgg cggcggacag ccggttgcgg agttcgacgg cggtcagcga gtcgaagccc 1260 agttccttga acgcccggcc gggggtcacg gcggtgtcgt cggtgtggcc gaggaccacg 1320 gcggcgtgcg agcggacgag cgtgagcagg gtccgttcgc gttccgcggc ggtgagtccg 1380 gtgagctttc cggccagggt gtccggtccg gcgcccgcgg tggcggcgcg ccggacgggg 1440 ccacggacca gccggcgcat cagcgcgggt acggcggtga cgccggtggc gaacgaggtg 1500 aggtccagcc aggcggggac gacgacgggg gcggagccgg cggtggcgcg gtcgaacagg 1560 gcgagcgcgt cgggcgtcgg cagcggcacc acgccgtcgc gggccgcgcg ccgcaggtcg 1620 gcgccgccca ggtggccggt catgccgctg gcgtgcgccc acaggcccca cacctgggag 1680 gtggcgggca ggccctgggc gcggcggtgt gccgcgagcg cgtccacgaa ggcgttgccc 1740 gccgcgtagt tgccctgtcc gggcgccccg aagaggccgg aggtggagga gaacagcacg 1800 aagacggccg gccggtgcgg ggcggtgagt tcgtgcaggt tccaggcggc gtcgaccttg 1860 gggcggagca ccttggcgag ccgctcgggg gtctgggagg cgatgacgcc gtcgtccagg 1920 acgccggcgg cgtggacgac tccggtcagg gggtgctcgg cggtgatccg gtcgagcagg 1980 gcggccagtt cggtgcggtc ggcggcgtcg caggcggcga cggtcacctc ggcgccgagg 2040 gcgcgcagtt cgccggcgag ggtcacggcg tcgggggccg cgtcgccgcg ccgtccggcc 2100 aggaccagcc ggcgtacgcc gtgctcggtg accaggtggc gggcgcagag ggcgccgagc 2160 gtgccggtgc cgccggtgac gaggacgacg ccgtcggacg gccacagggc cgcctggctc 2220 gtgggctcgt cggtgcgcgg ggcgcggacc agccggggtg cgaggacccg gccggagcgc 2280 acggcgatct cgggttcgcc ggtggcgagg acagcgggca gctgttgcag tgcgtcgggg 2340 ccgtcgatgt cgaccagcac cagcctgccg gggtgttcgg cgcgggcgga gcggatcagg 2400 ccccacacgg gcgcgtgggc gaggtcggtg acgtcctcgt gctcgaccgg gaccgcgccg 2460 tgggtgagga cggccagacg ggtgccggcc agtcgctcgt cggcgagcca ctcctgaaga 2520 gcggtcagca cgcgccgggc gccggcgtgg gccgcgccgg cggtgtcgtc ggccgactgc 2580 tgccgacacg gcagcacgag ggtgccgggc acggtgtcca gggcggcgac ggcggcgagg 2640 tcggggcagg aggggtatcc gggcagcgga aggccgccga gcacggcgat gccgtcgacg 2700 tcggccgcgg gcagcggcac gggcgtccac tcgacccggt acagctcgtg gtcgcggccg 2760 gggccggccg tggccggcgg gcgcagggtc accgcgtcga cggtgagcac ggcggctccg 2820 ctgtcgtcgg tggcgtgcag ggtgaccgtg tgctcgcccg cggggtgcag gcgtacccgc 2880 agccgggtgg cgcccacggc gtgcagggtg acgccgtgcc aggcgccggg gaccaggccg 2940 gggtgtacgg ccgcgagggc gtcggtgagc agggcggggt gtacgcccca gccgccggcg 3000 gtctcgtcgg tcagctcaac ggtcacgtcg gtcagctcga cggtcacgtc ggtgtccggg 3060 tcccctggcg cggcggccgg ggcggtgccg gtgtgcggga ggaggacgcc ggtcgcgtgc 3120 cgggtccagg gctggtcgtc gtcggcgtcg gcggggcggg agtggacggc gaccgggcgg 3180 gcgccgtcct cgttctccgc gcccagggtg acctggaggc ggcgggcttc gccgacggtg 3240 tcgagcggtg cctcctcggt cagttcgccg agcgtcctgc cgtcggccgc gtgcagggcc 3300 aggtcgagta cggcgccggc cggcagctcg gtgccggccg gcacgcgccc ggtgaacacc 3360 tgtccgccgg atccggcgag cggggtgacg gcgccgagca gcgggtgccc ggcgccggtc 3420 aggcccaggc cggcggcgtc ggaggcgacc gggccgctgg gccagaagcg gcggcgctgg 3480 aaggcgtagg tgggcaggtc gacgtggcgt ccgtcggggc agcccaccgt ccagtcgacg 3540 gacacgccgt ggacggcggc ctcggcgagc gaggtgagga ggcggcgcgg gccgtcctcg 3600 tcgcggcgga gggtgccgac gacgacggcg gtccgctcgg tggcctccgc cgtctcctgc 3660 acggcggccg tcagcaccgg gtgcgggctg atctccacga acacggcgtg gccggagtcg 3720 agcaggccgc gcaccacggg ctcgaaccgt acgggctccc gcaggttgcg gtaccagtag 3780 ccggcgtcga gccgtgtctc gccgaggggg ccgcccagca gggtggagtg gaaggcgatg 3840 ccggcctcac cgggccgcag ttcggcgagc gcggcgcgca actcggcttc gagggactcg 3900 acatgggccg agtgggaggc gtagtcgacc gcgatgcggc gcagtcgtac cccgtcggcc 3960 gaccaggcgg ccatcacctc gtccagcgca tcggggtcgc cgctgaggac caccgacgac 4020 gggccgttga gggcggcgac gcaaacgcgt ccggaccacg gtgcgagccg ccgtgtgacg 4080 gtggcctcgg gcagggcgac ggagaccatg ccgccgcgcc cggccagccg ctcggcgatg 4140 agccgcgacc gcagggcgac gatccgggcg ccgtccgcca gcgacagcac acccgccaca 4200 caagcagccg cgatctcccc ctgcgaatga ccgaccacag ccgacggcac gacaccgtac 4260 gaacgccaca cctccgccaa cgacaccatc accgcccaca acaccggctg aacgacatcc 4320 acccgctcca acgccaccgg atcacccagc acaccacgca acgaccagcc cacgaacggc 4380 tccaacgcca ccgcacactc agccatccgc cccgcgaaca ccggcgacga atccagcaga 4440 tccaccgcca tccccaccca ctgcgccccc tgacccggga acacgaacac cacccggccc 4500 tcacccggca acccggcaac acccgacacc acaccctcca ccggctcccc cgcggccaac 4560 gccgccagag aagcccgcgc accggccaca tcagcggcca ccaccaccgc acgatgcggc 4620 aacaacgccc gcgacgcggc aagggaccag gagaggtcca ccgggtccag gccggggtgg 4680 gtgtcgaggt gggcggcgag ccgggtggcc tgctcggcga gggcggcctg ggagcgggcg 4740 gagagcagcc acggcaccca gcgcggcgcg gcgccgcgcg cgggcgcggc cggttccgcc 4800 ggggcctcct ccaggatgag gtgggcgttg gtgccgctgg cgccgaacga cgacacgccc 4860 gcgcggcgcg gccggtcggt cgggggccag acggcggcgc cggtgacgag ttcgacggag 4920 ccggaggccc agtcgatgtg cggtgagggg gcgtccacgt gcagggtgcg gggcacttcg 4980 ccggcgcgca gcgcgagcac cgtcttgatc acgccggcca cgcccgccgc ggggccggtg 5040 tggccgatgt tggacttcag cgagcccagc cgcagcggct gtgcgcggtc ctggccgtag 5100 gtggccagca gggcgttggc ctcgatgggg tcgccgaggg tggtgccggt gccgtgtgcc 5160 tccacgacgt cgacgtcggc ggcggtgagg ccggcggcgg ccagcgcgga gcggatgacc 5220 cgctgctggg cggagccgtt gggggcggtg agcccggagg aggcgccgtc ctggttgatc 5280 gccgagccgc ggaccacggc cagcacgggg tggccgttgc ggcgggcgtc ggacagccgc 5340 tccagcacga ccacgcccgc gccctcggac cagccgatgc cgtccgcggc ggcggcgaac 5400 gccttgcagc ggccgtcggg ggcgaggccg cgctgccggg agaactccac gaaggcacgc 5460 ggggtcgaca tgaccatcac gccgccggcg agggccagcg agcattcgcc gctgcgcagg 5520 gactggccgg ccaggtgcag ggcgacgagc gaggacgagc aggcggtgtc cacgctgacg 5580 gccgggcctt ccaggccgag ggtgtaggcc acccggccgg agagcacgct ggcgtagttc 5640 ccggtgccga gcagcccctc gtccacgccg gcgaccgcgc cgtgccgtga gtcgtagcgc 5700 tggtcggtga cgcccgcgaa gacgccggtg gcgctgccgc gcaggccgtg cggatcgacg 5760 ccggcgtgct cgaacgcctc ccaggcgact tcgaggaaca gccgctgctg cgggtccatc 5820 gccagcgcct cgcgcgggct gatgccgaag aagtcggcgt cgaagccggc ggcgtcgttc 5880 aggaagccgc cctggcgcag gtaggtgtgt ccggcccggt ccgggtcggg gtcgtagagg 5940 ccgtcgaggt cccagccgcg gtcggcgggg aagtcgccga tgacgtcacg gccttcggcg 6000 aggagctgcc acaggtcgtc gggcgaggcc actccgccgg ggaagcggca ggccatgccg 6060 accacggcca gcggctcgtc ggccggggtg gcgcggacgg cggggcgggc cgggacgggc 6120 gcgccgtcga gccgggtgag cagatggtcg gtgagggcgg ccgggttcgg gtggtcgaag 6180 acgacgctgc tggccagcgt caggccggtc gcctcggtca gcgcggtgcg cagccgcagg 6240 gaggcgaggg agtcgaagcc gagggcggcg aaaccgcggt gcggttcgat cgcggcgggg 6300 tcggcgtggc cgagcacggc ggcggtccgc agccgtacca ggtccatgac gcggtgccgg 6360 cgttcggcgg gggtcagccc ggccagctcg tcgcgccagg gcgtgccctc gtcggcggtc 6420 cgctgcgcgg ggagcgcgac gggggtggcg gccgggggca gcgggcgggc cgctgcgtcc 6480 acgggcggcc agtaccggtc gcgctggaag gcgtacgtcg gcaggtcggc cgggtgggct 6540 ccggtgcccc ggaagaaggc ggtccagtcg atgcgcacgc cgtgcgtgtg cgcctcggcc 6600 aggttggtca gcagggtcgg caggccggcc cggtcgcgct ggagggtgcc gacgaccgcg 6660 gctccggtct ccgtgcgctc gacggtctcc tgggtgccga cggtcagtac ggggtgcgga 6720 ctgacctcga tgaagccccg gtggccctgg gcgagcaggg cggcgacggc gtcggcgtag 6780 cggacgggtt cgcgcaggtt gcggtaccag tagccggcgt ccagcgccgt gccgtccgcc 6840 cactcccccg tcacggtgga gaacagcgga accgtgccct cacccggccg cacgccctcc 6900 agatcagcca gcagagcctc acgcaccggc tccaccagca ccgaatgcga ggcatagtcg 6960 acagcgatac gccgggcccg caccccccga cccccgcaat gagccaggaa ctcctccagc 7020 gccaccccct cacccgcgac gacgaccgac tcaggaccgt tgaccgcagc caccgccaac 7080 cggcccgccc agcccaccaa cagctcctcg acaccggacg gcccggcagc gaccgacacc 7140 atccccccac tgcccgccag cgccgtcaaa gccctgctgc gcagggcgac gacccgggcg 7200 ccgtccgcca gcgacaacac acccgccaca caagcagccg cgatctcccc ctgcgaatga 7260 ccgaccacag ccgacggcac gacaccgtac gaacgccaca cctccgccaa cgacaccatc 7320 accgcccaca acaccggctg aacgacatcc acccgctcca acgccaccgg atcacccagc 7380 acaccacgca acgaccagcc cacgaacggc tccaacgcca ccgcacactc agccatccgc 7440 cccgcgaaca ccggcgacga atccagcaga tccaccgcca tccccaccca ctgcgccccc 7500 tgacccggga acacgaagac ggcgcggccg tcgccgacgg cgcggccgcg caccacgtcg 7560 gccgactcgg cgccttccgc cacggcggtc aggccggcga gcagggtgtc gtggtccgcg 7620 ccgaggacga ccacgcggtg ttcgaaggcc gtacgggtgg tggcgagggc gagggccacg 7680 tcgtgggggg cggcgtcgtg cgcgggccgg tgggcgagga ggcgttcggc ctgggcgcgc 7740 agtccggccg ccgtccggga ggacagcgtc cacgggacga ccggcagggt gcggtccgtg 7800 gcctcgtcgg tgggctcggg ccgggcgggt gcctgctcca ggatggcgtg ggcgttggtg 7860 ccggacacgc cgaacgacga cacgcccgcg cggcgcggct gctccccgcc cggccagtcc 7920 cgctcctcgg tgagcagttc cacggcgccg gcggtccagt cgacgtgcgg tgacgcctcg 7980 tccacgtgga gcgtgcgcgg cagcgtgccg tggcgcatgg cctgcaccat cttgatcaca 8040 ccggccacac cggcggcggc ctgcgtgtgc ccgatgttgg acttcaccga accgagccac 8100 agcggctcgt cccgctcctg gccgtaggtg gcgaggaggg cctgcgcctc gatcgggtcg 8160 cccagccggg tgcccgtacc gtgcgcctcc acggcgtcga cctggctcgc ggccaggcgg 8220 gcgtcggcca gcgcctggcg gatcacgcgc tgctgggcga gtccgttggg ggcggtgagt 8280 ccgctgctcg cgccgtcctg gttgatggcg gtgccgcgga ccacggccag cacggggtgg 8340 ccgttgcggc gggcgtccga gagccgttcc aggacgagca tgcccgcgcc ctcggcgaag 8400 ccgaacccgt cggccgccgc ggcgaacgcc ttgcagcggc cgtcggccgc gagggcccgc 8460 tgccggctgt actcggtgaa cacgccgggc gtggacagca cggtcgcccc gccggtgagc 8520 gccagcgtgc actccccggc gcgcagcgag cggaccgcga ggtgcagggc gaccagggac 8580 gaggagcagg cggtgtccac ggagagggcg gggccctcca ggccgagggt gtaggcgacc 8640 cggccggaga gcacgctggg cgaggtgccg gtgacgacgt acccctccag ctcggtggcc 8700 accgggccgg tgatgtcgga gtagtcctcg ctgctgaagc cgacgaacac gccggtggcg 8760 gtggagcgca ggccggccgg gtcgatgcca gcccgctcca gggcctccca tgaggtctcc 8820 agcaccagcc gctgctgcgg gtccatggcc agcgcctcgc gcgggctgat gccgaagaag 8880 ccggcgtcga agtccgcggc gccgtcgagg aatccgcctt cgcgggcgta ggaggttccg 8940 ggccggtcgg ggtccgggtc gtagaccgag gccatgtccc agccgcggtc ggcggggaac 9000 gccgagaccg cgtcggtccc atcggtcacc agccgccaca ggtcctcggg cgaggtcacg 9060 ccgccggggt agcggcaggc catgcccacg atcgcgatcg gttcgcggtc gcgggcctcg 9120 gcctcgcgca gccggcgccg ggcgacctgg agatcgcccg tgacctgctt gaggtagtcg 9180 agcagtttgg cctcgtcagc catcggtgca cccccgtgcg gttcgttcgg cgcgggtcac 9240 gagacgcccc ggtcgatcag gtcgaagagt tcgtcggcgg tgacgccgtc cagagcggcc 9300 cgctcgggtg tgccgtcggt cgtgccggcg tcccagcggg ccgcgaggtc ccgcaggtgc 9360 gccgccaccc gggcgcggtc ggtgccgtcg gccggcagtg cgccgagcgc gctctccacg 9420 cgggccagtt cggcgatgat ccggtcggcg ctcgcctcgc cggactcgct cggcaggagc 9480 gcgtcgagga ggtggtcggc gagcgcggcc gggttcgggt ggtcgaacac gatggtggtg 9540 ggcagtcgca ggccggtggc ggtgccgagg cggttgcgca gttccacggc ggtcagcgag 9600 tcgaagccca gttccttgaa gccgcggtcg ggtgccaccg cgtcgcgtcc ccggtgtccc 9660 aggacgtcgg cgacctggcc gcggacgacg tcgagcaggg cgggggcgcg ctcgggcgcg 9720 ggcagcccgg tgatccgcgc caccagggcc gccgcaccgg gcaccgggcg ggcggcggcc 9780 gggccggccg gggtggcgac caggccgcgc agcagcggcg gggtgggcgc ggcggaggcg 9840 gtggcgaggt ccaggcgcgc ggtgacggtc acggcgtcgc cggtggcggt ggccgtgtcg 9900 aacagggcca gtccttcggc ggcggccatc ggcacgatgc ggttgcggcc ggcgcgggcg 9960 acgtcggcgg cgtccaggtg ccgggtgagg ccggtggcgt cggcccacag gccccaggcc 10020 gcggcggtgc cgggcaggcc ggcggcgcgg cgccgttcgg cgagcgcgtc gaggaaggcg 10080 ttggcggcgg cgtagttggc ctgcgcgggg gtgccgaggg tggccgccgc ggaggagaac 10140 agcacgaagg cggacaggtc cttgtcctcg gtgagttcgt gcaggtgcca ggcggcgtcg 10200 gccttcgggc gcagtacgcc cggcagccgg ccggcgccga gttcggtcag cacgccgtcg 10260 tcgagggcgc ccgcggtgtg caccaccgcg gtcagcgggg cctcggcggt cagcttggcg 10320 agcagcgcgt cgagggcggc gcggtcggtg acgtcgcagg tctcgaagcg gacggtggcg 10380 cccgccgcgg ccagttcggc gaccaggtcc gcgctgccgg gggcggcggc gccgcgccgg 10440 ctggccagca ccaggtcacg ggcgccgtgt tcggacacca gatgccgggc gagcatgccg 10500 ccgagcacgc cggcgccggt gatcaggacg gtgccgtcgg cgtacggggc gacggtgagc 10560 acgatcttgc cggtgtgccg ggcctgggcc atgaaccgga acgcggtgcg cgcgtcggcg 10620 aggggccagg tccgggtggg cagcccggtc agctcgcccg cctcggcgtg ggcgacgacc 10680 tcggtcagca ggctctggac gcggtcgggg ccggcgtcca gcagcaggtc gaacgggagg 10740 tagtcgacac cgggcaggcc ggcggggtcg cggcggtcgg tcttgccgag ttccacgaac 10800 cgtccgccgg gacggagcag tcgcagcgac gcgtccacga actcacccgt gagggagttc 10860 agcacgacgt ccatctccgg gaaccgctgc gcgaactccg tatcccgcga cgacgccaca 10920 cgcgcctcgt ccagaccggc cgcccgcagc acctcgtgct tgccgggact cgccgtcgca 10980 tacacctcgg cgcccagcag ccgcgccacc cgcaccgcgg ccatgcccac accaccggcc 11040 gccgcgtgca ccagcacccg ctcccccgcc cgcaccccgg ccacatcgcg cagcgcgaac 11100 caggcggtgg cgaacacgga cggcagggcc gcggcgcgga cccaggacca gccggcggga 11160 acgggcacca cgagccgccg gtccaccacg gcgagggtgc cgaagccgcc cggcaccatg 11220 ccgaggactc ggtcgccgac ggcgaggtcg gtgacgtccg gggcgaccgc gaccacggtg 11280 cccgcggcct cggagccgat cgcgtcgacc tcgtccgggt acatgtcgag cgcgcacagc 11340 acgtcgcgga agttcaggcc cgccgcgcgg acggcgatgc ggacctggcc gggtgccagg 11400 ggggcggtgg cgtcgggagc ggcgacggcg tcgacgccgt cgatgctgcc gggccggacc 11460 acgtcgacgc gccaggcgtc ggcgccgacg ggcgggcgca gcgcggtctc agcggcccgg 11520 gtgagccggg cgacgaggcg ttcgccgtcg cggagcgcgg tctgcggctc gtcgccgacg 11580 gccggcacag cgtccaggga ggcgggtgtg ccgtcggtgt cgacgagcag gaaccggtcg 11640 gggtgctcgg tctgcgcgga gcgcaccagg ccccagaccg cggcggcggc cgggtcgggt 11700 tcctcgccgg gccgggcggc gacggcgtgc cgggtgacga tcgcgagccg ggcctgcccg 11760 aaccggtcgt cggcgagcca ctcgtgcagc agttccagca cctgggcggt ggcccggtgg 11820 gcggcggcga ccacatcggc tcctgtgctg acgggagcga ggacgaggtc caccgcgccg 11880 gcgtcgatgt cggcgagggc ggtgctcagg ggcgcggcga ggccttccgg tccgtcgccc 11940 aggacggcgc agcgcgcggc ggcgggtgtc tcggcgtcgg gggtctgcca ggtcacgcgg 12000 aacagcgcgt cgcgcgtgcc ggcggcggcc acggcgcgga gctgcccggc cgacgcgggc 12060 cgcagccgca gcgcggccag ctccacgacg ggccggccct cgcggtcggt cgcggtgagg 12120 ctcagcgtgt cggcgctctc ccgggcggcg cgcacccgca ggacccgggc cgggccgggg 12180 tgcacggtca cgccggtcca ggtgaacggc agcagcagcg gcgcgtcctc gggctcggcg 12240 gcgggcacgg cctgggtgac ggcgtcgagc agcgccgggt gcacgagatg gccggcggtg 12300 tcgacggtgt cggggagttc gacctcggcg tagacctcgg tgtcccggcg ccacagggcg 12360 cgcaggccct ggaaggcggg cccgtagccg tagccgcggg cggcgaaacg gtcgtacacg 12420 ccgtccaccg ggaccggctc agcgcccgcc gggggccacg cgccggtctc gggctccgcc 12480 ggctcggccg gctcggccgg tgccaggacg cccgtggcgt gccgggtcca gccgtcgccg 12540 gagtgggagt ggacggcgac cgtgcggcgg ccggacccgt cggcgccgtg cacggtgacg 12600 cgcagggtca ggccgtcggc ggggacgccg atgggcgcgg ccagggtcag ctcctcgatc 12660 tgggcgcggt cgagccggtg gccggcgtgg gccaccatct ccaggacggc ggtgccgggc 12720 agcagggcgg tgcccagcac ggtgtgctcg gtcagccagg ggtgcgtctc ggggctgatc 12780 cggccggtga ggagcaggcc gtcctcgtcg gggagttcgg cctcggcggc gagcagcgga 12840 tgccctccgg cggtgaggcc gacggcggtc aggtcgccgg cggcggcctg gggggtgagc 12900 cagtagcgct cgcgctggaa ggggtaggcg ggcagttcga ccgggcgggc gccggtggcg 12960 tcgaacaggg ggcgccagtc gaccggcacg ccgtcggcgg ccacctcggc cagtgcggtg 13020 gtcaggcgca gccggtcgct ctcgtcgcgg cgcagggtgg cggcgacccg cagttcggtg 13080 cccgccgcct cggcggtctg ctgcatggcg accgtgagca cggggtgcgg gctgatctcc 13140 acgaagccgt ggtggccggc ggcgagcaga tcgctgatcg cgttctggaa gagcacgggc 13200 tcgcgcaggt tgcggtacca gtagcgggcg cccagttcgc tgccgtcgat ccagtcggcg 13260 gtgacggtgg agtagagggg cacgtcgccg tcccgggggc ggatgccctt gaggtcggcg 13320 agcagccgct gccgtacggc ctccacctgc ggggagtgcg aggcgtagtc ggcggcgacg 13380 cggccggcgc gcagcccctc gtcgtcgcag aggtcgagca gctcctccag ggcatcgcgg 13440 tcgcccgcga cgaccagcga gcgggggctg ttggcagcgg cgatgccgag ccggccgggc 13500 cagcgctcca gcatccgctc gacgttcgcc gcgggggcgg cgacgaaggc catgccgcag 13560 cggccgggca ggtcggcgac ggccttggcg cgcagcgcga cggtcttcgc ggcgtcgtcc 13620 agggtgaggg cgccggcgac gcaggcggcg gcgatctcgc cctgggagtg gccgaccacg 13680 gccgccggca cgacgccgtg ggagcgccac accgcggcca gcgagaccat gagcgcgaac 13740 agcaccggct gcaccacgtc gacgcggctg agcggcggcg cgtcctcggc tccgcgcagc 13800 acgtccacga ccgaccagtc caggtagggg gcgagggcgc gctcgcactc ggccatgcgc 13860 gcggcgaaca ccgggtgggt gtcgagcagt tccacgccca tgccgagcca ctgtccgccc 13920 tggccggcga agacgaagac gacgctgccg tcggctccgg cggtgccgcg gacgacggcc 13980 gggtcggcgc cgcccgcggc gagcacgtcg agcgcggcga gcagttcggc gcggtcccgg 14040 cccacgacgg cggcgcggtg ctcgaacgcg gtgcggcggg tggccagggt gaacccgacg 14100 gaggcgggct cgaggccggg gtcggcggcg acgaactcgc gcagccgggc ggcctgttcg 14160 agcagcgcgg cctcggtgcg cgcggacagc tgccagggca cggggagcgc accggccggc 14220 ggcgccgtcg cttcctcggg ttcgggcgcc tccgccacga tcacatgggc gttggtgccg 14280 ctgacgccga acgaggacac gccggcccgg cggggacgct cgccccgggg ccacgggcgg 14340 gcctcggtca gcagccgtac gtcgccggac acccagtcca cgtgcggggt gggctcgtcg 14400 acgtgcagcg tcttcgggag cagtccgtgc cggagcgcga gcaccgtctt gatcactccg 14460 ccgacgccgg cggcggcctg ggcgtggccg aggttggact tcagcgagcc cagccacagc 14520 ggccggtcgc ggtcctggcc gtaggaggag aggagtgcct gggcctcgat ggggtcgccc 14580 agggcggtgc cggtgccgtg gccctccacg gcgtccacgt cggcgggacg cagtccggcg 14640 tcggccagtg cctgccggac cacgcgctgc tgggcggcgc cgctcggcgc ggtgaggccg 14700 ttggaggcgc cgtcctggtt gacggcggtg ccgggcagca gggcgagcac cgggtggccg 14760 tttcgccggg cgtcggagag ccgctccagc aggagcatgc cgacgccctc ggaccagccg 14820 agtccgtcgg cggccttggc gtacgagcgg cagcgaccgt cctcggacag gccgccctgc 14880 ttggtgaagt cgacgaacag ctccggcgtc ggcatgacgg tcacaccgcc ggccagcgcg 14940 agggtgctct cgcccgagcg cagcgaccgc accgcctggt gcagggcgac gagggaggac 15000 gagcaggcgg tgtccaccgt gaaggcgggg ccttccaggc cgaggacgta ggagatgcgg 15060 ccggccacca cgctggccag gcggccggtc agggcgtgcc cgtcgccgcc ttccgggatg 15120 ccggcgagca gcgaggagta ggactgggcg ttggcgccga cgaacacgcc gacgcgtccg 15180 ccccgccacg agccgggtgc gacgccggcc cgctccagcg cctcccagct ggtctccagc 15240 agcagccgct gctgggggtc catcagctgg gcctcgcgcg ggctgatgcc gaagaagccg 15300 gcgtcgaaca gggcgacgtc gtcgaggaat ccgccgtgcc gggtgcggct ggccgagggg 15360 ccgtccgggt cggcgagggc ggcgaggtcc cagccgcggt cggcggggaa cggcgtgatg 15420 gcgtcgcgct cctccagcac gagccgccac agctcgtcgg gggtggtcac accgcccggg 15480 aagcggcagg ccatgccgac cacggcgacc gggtcgtcgt cggccgcgcg ctgtacgggc 15540 tcgtcgtcct cggcgagccg gacgtgccgg ccggaggcgg cgtcgaccag gacgtccgcc 15600 agggcgcggg cggtggggtg gtcgtagatg gcggtggtgg gcagcttcac gccggtgccg 15660 cggctgagcc gcagcagcag ttgtacggcg gtcagcgagc gcagtccgag ttcccggatc 15720 gcccggtccg gcggtacgtc ggcggcggtg ccgaggtcga gcacctccgc gacctgtgtc 15780 cggaccaggt ccaggacgac gcgccggcgc tcgggttcgg gcagaccggc gagccggtgc 15840 gcgagcgcgg gcggctgagc agccttcggg tcggtcagcg gctcagtcat gggtggtccc 15900 ctccagcggg tccggtgcgt gcagtgcgga gacgggcagg ccgggttcgg cgagtgcggc 15960 ctgtagcagc gcggcggtgc cggccagcag gccgtccacg acgcgtcggc cgagggcggc 16020 ggcgcggtgt acgacgtgtc cggtgaggcc gccgtcgggg tcctcgacca ggtgcacctc 16080 gaggtgccag cgggcgtacg cctgttggcc cgtgaactgc tcgacgcggg cgccaggcag 16140 gccgagttcg ccgagttcga cgttgacgag ctggaacacg acgtcgacca gcggctgttc 16200 ggggtccagg ccgaggcctt cgacgacgcg ttcccagggc agggcctggt gggcgtaggc 16260 gtcgagggcg gtgtcccgga cccgctccag caggccggcg aaggacgggt cgccgctgag 16320 gtcgacgcgc aggggcacga agttggcgaa gaagccgatc agcccctcga cctcggcccg 16380 ggtgcggccc gccaccgggg agccgacggc gaggtcgtcc gtgcccgccc agcgggcgag 16440 cgtggccgtg aacgcggcca gcagggtcat gtagagggtg gcgtcgtgct cggcgccgac 16500 ccggcgggcg gtggcgacca ggccggcggg cagccgccac tcggtcagca cgccggtggc 16560 gtcgtgggcc gcgtcggccg ggacgcccgg cagggcgagg ggccgcaggc cgtccagccg 16620 gcggcgccag tggccgagct gggcgtcgag cgcggctccg gtcagccagg accgctgcca 16680 gaaggcgaag tcgccgtact ggacgggcag ttcgggcagc tcggccggac ggttctctcg 16740 tagtgccgcg taggcgccgg acagttcggt ccagagcacg ccctgggacc agccgtcggt 16800 ggcgatgtgg tgcaccgtca gcagcaggac gtggtcgtcg ggggcgatcc gcagcagtgc 16860 gggccgcagc accggtcccc ggacgaggtc gaacggccgg gccgctgcct cgtcggccag 16920 ggcgcgggcg gcggtctcgt cggccacgtc caccgggtcc agcacgatgt ccgtggcggg 16980 caggatcacc gacgccggct cgtcgccggg cacgaagacc gtgcgcagcg cctcgtgccg 17040 gcgcacgacc tcggtcaggg cgcggcccag caggtccgcg tccagttcgc cggtgatccg 17100 cacggccagc gggatcgtcc agaccgggtc gccggggtcg gcctcgtgca gccgccacag 17160 ccgcagctgg cccagcgaca gcggcagggg ctcctgccgg gacaccggca ccaggggcgg 17220 tacggccgtg cgcggggcca cggcgacgac ctcggcgagg gcgcgcgggg tgcggtgctg 17280 gaacagctcc cgcagggaca cctcggcgcc cagcgcctcg cggatccggg cgaccgtgcg 17340 ggccgcgacc agcgagtgcc cgccgagcgc gaagaagtcg tcgtcgatgc cgaccccgcc 17400 ggtctccagc acctcggcga acacctcgca cagcgtctgc tccgcaccgg tacggggtgc 17460 ggtgaagccg gtgtcgagcg tggtgcgcag gtccggggcg ggcagcgcgg cccggtcgat 17520 cttgccggtg gtggtcagcg ggaacgcgtc cagcgcgacg agcgccgacg gcaccatgta 17580 gtccggtacg gcgtcggcca ggtgggcgcg cagccgggcc ggcagccctc cgtcggtacc 17640 ggggacgggc acgacgtagc cgacgagccg cttgacgccg ggggcgtcct cgcgggcgac 17700 gatgacggcg cgggtgacct cggggtggcg cagcaggacg gcctcgacct cgcccagctc 17760 cacccggaag ccccggatct tgacctggtg gtcgagccgg cccaggtatt ccaggctgcc 17820 gtcgggccgc cagcggccca ggtccccggt gcggtagagg cgggagccgg gcgggccgaa 17880 cgggtcgggc acgaacttct gcgccgtcag ttccggcttg ccgacgtagc cgcgggcgag 17940 tccggggccg gcgaagcaga gttcgccggc cacgcccacg gggaccggcc gcagccggtc 18000 gtccaggacg taggcgcggg agttgtcgac cggctcgccc aggtgtgcgg tccggggcca 18060 gtcggcgacg tcagcgggca gggtgaagga ggtgacgacc tggatctcgg tggagccgta 18120 gtggttgtgc agacgcagac ggggccgggc ggcgcagaac tcgcgcagca cggtgtccag 18180 cgacagcggc tcgcccgcct gggagatgtg ccgcagcgag gtgagccggg cccggccggc 18240 gccggcctcc tcggcgagcg cgcggatcat caggttgggc acgaatatct gctcgacggc 18300 ccgttcgtcg agccagcggg cgaagcgggc cgggtcgcgg cgggtctcct cggtggggat 18360 gaccagcgtc tcgccgtaca ggagcgcgga gagcacctcc tgcacatgca cgtcgaaggt 18420 gagggcggtg aactgggcgg tgcgcgtgcc gggtccgccc ggtaccgtct tcttctgcca 18480 ggcgagcatg ttgaccacac accgggcggg catggcgatg cccttgggca cgccggtgga 18540 gccggaggtg tagacgacgt aggcgaggga gtcggggccg ggtcgtccgg cggccgttgc 18600 cgcgggcggc tcctgcccgg ccggggcgtc cacgaggacg agggcggtgc cctcggcgaa 18660 gacgtccgcg tgagcccggt cggtgacggc gacggtcatc cgggcgtcgt cgacgatgag 18720 ccggatccgg tcccgggggt ggctcgggtc gatcggcaca taggcggcgc cggccttgag 18780 gatgccgatc agagcggcca tctgcacggt gccgcgctcc aggcagaggc cgacgaggtc 18840 gtccggcccc acgccctggg cccgcagccc ggcggcgatc cgctcggcct cgtggtccag 18900 cgcggcgtag gtgaggacgt cgtcctcgca ctccacggcg cgggcgccgg gggtgcgggc 18960 gacctgctcg gcgaacagct ccacgagcgg gacgtcccgg tacgggaggg cggtgtcgtt 19020 ccaccgctcc agcagcaggc gccggtcgtc gtcgtccagc agcgagagcg cggacagcgg 19080 cgcgtccggg tcggcgaggg cggcgcgcag cagcaccgtg tggtgatgca gcaggcggcg 19140 gaccgtgtcc gcctcgaaca gcgcggtgga gtgcagcacg gtgccgcgca cccggtcgcc 19200 gtcctcggtg aggtgcactt cgaggtcgac gcgggtgaag gcgtgctcgt ccagcagcgg 19260 ttccaggcgg gcggcgccga ggcggtcgcc cttgtccccg ggcgcccgca tcagctggaa 19320 gaccacctgg accagcgggt tgcgggacag gtcccgctcg ggtgccaggg tctccaccag 19380 gtgctcgaag ggcaggtcct ggtggtccat ggcgcccacc accgtctcgc gcacccggcc 19440 cagcaggtcg cggaaggtcg ggtcgccgga gacgtcggtg cgcagcacca gcatgttgac 19500 gaagaagccg atcagccgct ccacctcggg gcgggtacgg cctgccacgg gggcgccgac 19560 ggcgacgtcc tcggtgccgg cgaaccgtgc caggaccacg gtgaaggcgg tcagcagcgt 19620 catgtagagg gtggcgccct cggtgtcgcc gaacgcgcgc gcggcccgga ccaggtcctc 19680 gggcagttcc cacggctggg aggcgcccgc cgagccggcg accgcggggc ggggccggtc 19740 caggggaagt tccagggggc gcagcccggc gagccgcgcc cgccagtagg tgaggtaccg 19800 ctccagttcg gcgccggtga gccggccctg ctgccagacg gcgaagtcgc cgtactggac 19860 aggcagttcg ggcagttcgg cggggtcgcc ggacagttcg gcgcggtagg cctcggccag 19920 ctcgccccag aacacggcgt gcgaccagcc gtccgtgacc gcgtggtgcg cggtgatcag 19980 gacggcgtgg tcctcggccg cgaggcgcag cacgcgggcg cgcagcagcg gtccccgggc 20040 caggtcgaag gggcgcgcgg cgtccgcctc ggccagggcg cgtacctcgg cctcgtcggc 20100 gacgtccgtg acctccaggc ggagcggggt cgcgggccgt acgacggcca taggctcgcc 20160 ggcgtcggcg gcgaagacgg tgcgcagcgc ctcgtggcgg gagaccacca gggacagtgc 20220 ccggccgagg gcgtcgacgt cgagcgggcc gtgggcgcgt acgcccatcg ccacgttcca 20280 gaagccgctg tccggggtga gccggtccag gaaccacagg cgccgctggg aggacgacag 20340 cggaagcgcg gcgccgtccc ggcgggccgg ccggatgacg tccgtggccg tgccgggctc 20400 gccgagggtc tcggccagcc ggcgcgggga gcgccgttcg aacaccgcct ggagcggcac 20460 gtcgggcccg aagcgggcgc ggatccgggc gatggcgcgg gtggccagca gcgagtgccc 20520 gcccagggcg aagaagtcgt cgtcggcgcc caccgggtgg acgtccagca cctcggcgaa 20580 gatctcgcac agcacccgct ccgcctcggt cgcgggcggg acgtacccgc tctcggcgac 20640 cgagcgggtg tcgggcgcgg gcagggcccg gcggtcgatc ttgccggtgg tggacagcgg 20700 gaacgcgtcg agcgcgacga acgccgacgg caccatgtag tcgggtacgg agcccgcggc 20760 gtgggcgcgc agggcgggca gcacgctcgc gccggcctcc ggctccagca ccacataggc 20820 gaccaggcgc ttgtcgcccg ggatgtcctc gcgcacggcg acggtgacct gcgagaccgc 20880 cgggtgccgc agcagcgcgg cctcgacctc gccgggctcc acccggaagc cgcggatctt 20940 gacctggacg tcggcgcggc cgaggaactc cagcgcgccg ccgggcagcc accgtacgac 21000 gtcgcccgta cggtacatcc gctcgcccgg cccgccccac gggtccggca cgaacttctc 21060 ggcggtcagg tcgggccggc ccaggtagcc gcgcgccacc cggggcccgc cgatgaccag 21120 ttcgcccgcc acgcccagcg gcgccgggcg gagggtgtcg tcgaggacgt acacccgggt 21180 gttgtcgatc ggcgcgccga tgggcacccg ggagccggcg agccggaagc cgggttccat 21240 cgggaacagc gtggtgaacg cggtcgcctc ggtcgggccg taggcgtcgg ccacggtcag 21300 gtgcgggtgg gcggccatca cctgggcgac ggtctcgccg gacacggcct cgccgccggt 21360 gagcacctcg cgcagcccgc cgaagcactc catgcactcc tcggccagga ggctgaacag 21420 gggtgcgggc aggcacatcg cggtgacgcc gtgctcgcgg atgagccggt cgaaggtgtg 21480 cggttcgacg tgctcgtcgg tggcgacgac gatctgcttg ccggtcagca ggaacggcca 21540 cagctcgtag gtggagatgt cggtggccag cggatagtgc agcagcaccc gttcgtggtt 21600 gccgttgctc cagcggcggt cggcggccag cacgacgacg ttgcggtggg tcacggccac 21660 gcccttgggc tcgccgctgg acccggaggt gtagatgacg tacgccgtgg tgtcggggtg 21720 cgggtcgata ccggggtcgg tgtcgggccc ggggcccggg tcggtgacgt cgaggacggt 21780 gatgccgtcg gtgccgggca ccgggcggtc ggcgatgacg acgcgcagcc ccgaggtggc 21840 cacgatgcgc tcggtgcggc ccggggggtt gcgcgggtcg agcggcacgt aggcggcgcc 21900 cgccttgagc acgccgagca cggcggccac catgccggtg gagcgtccgg tggcgacgcc 21960 gaccggttcg tcggcgccga cgccgtgggc cagcaggagg tgggcgaagc ggttggcccg 22020 ccggtccagt tcggcgtagg tgacccgctc gtcgccgcag atcagggcga cggcgtcggg 22080 ggtgcgggcg gcctgctcgg cgtagagccg gggcacgcag ccgtccggca gcggtgcggc 22140 cgtgtcgttc caggcgacca gggtgcggtg ccggtcggtc tcgtcgagca tggtcgccgc 22200 ggagaccggc cggtcggggt cggcgagcac ctcgccgagg accaccgaca cgtggtgcat 22260 cagctggcgg acggtgtcgg cgtcgaacag gtcggccgcg tacaggacgg tcgcgccgac 22320 ctcgtcgccg gtctcgacgg cgtgcacctc caggtccatc cgggtgtacg cgtggtcgat 22380 gtcgaacggc tcggcccggg cgccctgcca ccagggccgc cggggcgcgt cggcgagcag 22440 ctggaacgcc acctgcacga gcgggttgcg ggacaggtcg cgctcggggc gcagccgttc 22500 caccaggtgc tcgaagggga cgtcctggtg ctcgacggcg ccgaccaccg actcccgtac 22560 ccggcccagg agttcccgga aggtcgggtc gccggacagg tcggtgcgga cggcgacgac 22620 gttgacgaag aagccgatca gcgcctcggt ctcggcgcgg gtccggccgg ccgtcggcga 22680 gcccacggcg atgtcctcgg tgcgggcgta ccgggacagg acgagggtga acgcggccag 22740 gagcaccatg tagagcgtgg ctccctcgcg ggcggcgacg gcccgggcgt cccggatcag 22800 ctcggcgggc agctgccagg gcagggtgcc cgcccgcccg gtggcgacgg cgggccgggc 22860 cttgtccagc ggcagttcca gcggggcgag gccggccagc cggccggtcc agtagccggc 22920 ccggcgctcc agcacctcgc cggtcagcca ggaccgctgc catacggcgt ggtcgccgta 22980 ctggacgggc agttcgggca gcggggcgcc gtcgtacgcg gcggcgatct cggcccacag 23040 cagggcctgg gaccagccgt cggtcgcgat gtggtgcacg gcgacgacga ggacgtggtc 23100 gtcgggggcg agccggagca gcgtggcgcg cagcagcggg ccccgcgtca ggtcgaaccc 23160 ggtggacagc tcggcggagg ccgcggcgcg tgccgcgtcg gcgtcgggta cgtcgacgat 23220 ccgcggggcg accggggcgg cggcgccgat gaccgcggcg ggcacgccgt cggcgaccgt 23280 gaaggtggtg cgcagggtct cgtgccgggc gacgaccgcc gacagggcgc cggccagccg 23340 ctcggggtcc agcggtccgc gcacgcgcag ggctccgccg gaggtgtacg aggcgctgcc 23400 gggggcgagc tggtccagga accacatccg ctgctgggcg aaggacagcg gcagcagccg 23460 gtcgcggtcc gcgggcacca gcggcggcgc cgggtcggcc gggagcgcgg cgccggcgac 23520 caccgaggcc agggctcgcg gggtgcggtg ctcgaacacc tcgcgcagcg ggacctcggt 23580 gccgaaggcg cgggcgattc gggcgacgag gcgggtggcg agcagcgagt ggccgccgcg 23640 tacgaagaag tcgtcctcgg cgccgaacgc gtcggcgtcg agcagctcgg cgaagatctc 23700 gcacagcgcc cgctcggcgt cggtgcgcgg ggcggccagg ccggcgtccg ccgtctccgc 23760 cggggcgggc agcgcggcgc ggtcgacctt gccggtggcg gtcagcggca gcgcgtcggc 23820 gaggacgaag gccgagggca ccaggtagtc gggcagggcc gccgcggcgt gggcgcgcag 23880 ggcggcggtg tcggtggtgc ggccggcgcg cgggacgacg tgggcgacga gccgcttgcc 23940 ggccgggccg tcaccgcgca ccacgacggc ggcgtgcgcg acggcggggt gggcggccag 24000 gacggcctcg acctcgccgg gctcgacccg gaggccgcgc agcttcgcct ggtcgtcggc 24060 gcggccgagg aactccagga cgccgtcggg gcggcggcgc accacgtcgc cggtgcggta 24120 catgcggctg cccgccggtc cggacgggtc gggcaggaag cgctcggcgg tggccgccgg 24180 ccggccggcg tagccgcggg ccaggcgcgg gccgccgacg tacagttcgc cgggcacgcc 24240 gaacgggacg ggccgcagcc ggtcgtcgag gacgtgggcg cgggtgttgt ccagggggct 24300 gccgatgggc acccggccgc cgggggccgg gtcggccggc gcgatcgggt ggagggtggc 24360 gaaggtggtg gtctcggtgg ggccgtagcc gttgacgacc gtcaggtccg ggtgggcgcc 24420 gcgcacgcgg gccacggtcg ccggggacac ggtgtcgccg ccgacgacga gttcgcggac 24480 gccggccagg caggtgacgt cctcctcgac cacgaggtcg aagaggccgg aggtcagcca 24540 cagcgcggtg acgccctggt cggcgacgac acgggcgagg gcggcgggtc cgagggcgcc 24600 gggcggggcc accacgacgc ggcggccgga cagcagcggg gaccacagtt cgtaggtgga 24660 ggcgtcgaac gcctgcgggg agtgcagcag gacccgttcg tgggcgccgc cggaccagcg 24720 ccggtggagg gcgagggcgg ccacggcgcg gtgggtcgtg gcgacggcct tgggcgtgcc 24780 ggtggaaccg gaggtggaca tcacgtacgc gaggccgtcc gggccgacgg tgttcggcaa 24840 agccgtgtcg ggggctgtgc cggggacggc gcgcaggtct acggccggca ggtgctcggt 24900 gccggcgggt gcgggaccgc cgtcggtcag cagcagcgcg gcaccggtgt cggcgaggac 24960 ggcgcgggtc cgggcggccg ggttgcgggc gtcgagcggc aggtaggcgc cgccggcctt 25020 gaggaccgcg agcacggcga cgaccaggtg ggcggaacgt tccgtcgcca gcgcgacgac 25080 gctctcgggt ccggctccgt ggccggccag gacatgggcg agccggttgg cggcgcggtc 25140 cagctgggcg taggtgaggt gttccgtccc gtcggccacg gcgacggcgt ccggggtgcg 25200 ggcggcctgg gcggcgaaca gctcgggcag cgaggcctcg ggcagcggta cgccggtgcc 25260 ccgggcggcc cggtccaggg ccgcgtcctc gcccgcgtcg gtcatcgtca gccgggacag 25320 cggccggtcg ggctcggcgc aggcggcgcg cagcagggcc gtcaggtggc gggccagccg 25380 ctcgacggtc tcccggtcga acagggcgcg gctgtagttg atcagtccct cgacgccgcc 25440 ctcggcgtcc tcgccgaggt agacctccag gtccatgcgg gtgaaggcgc ggtcgcccgc 25500 gaagggttcg gcggtggtgc cggggaacgg cgcggggcgc gcggcgggcc ggggcacgta 25560 ctggaagacg acctgggcga gcgggttgcg ggacaggtcg cgctcgggga ccagccgctc 25620 caccaggtac tcgaacggca cgtcctggtg cgccatctcg tccaccgagg cggcgcggac 25680 gcgttcgacg agttccgcga aggtggggtc gccgccgagg tcggtgcggg tgacgacggt 25740 gttgacgaag aatccgatga gttgctcgac ctcggccagg ggccggccgg cgaccggctg 25800 ggcgacggcg acgtcctcgg tgcgggcgtg ccgcccgagg accgcgctga acgcggccag 25860 cagggtcatg tgcagggtcg cgccctgccg tgcggcgacg gcccgggcgg cggcgacggc 25920 gtccgccggc agccgccagg tgacgacgcc gccctcggcg gaggcgacgg ccgggcgggg 25980 ccggtcgagc ggcaggtcca gcgggggcag gccggccagc cggtcctgcc agtacgccag 26040 ccgccgctcc agcacggcgg gcgacagggt acggcgctgc caggcggcga agtcggcgta 26100 ctgcaccggc agttccggca gcgcgggctg ccggccgtcg gccagggcgg tgtaggccgc 26160 ggtcagctcg gcccacagca ggccgtgcga ccagccgtcg gtggcgatgt gatgcaccgt 26220 cagcagcagg acgtggtcgt cgtcggcgag ccgcagcagg cgggcgcgga gcagggggcc 26280 cttggtgagg tcgaaggggc gcgcggcctc ctcgccggcc agccgctcgg cgtcggcctc 26340 gtccacggcg tcggtcacgg gaacgggcac cggctccggc ggcaggacga cggcgccggc 26400 cacgccctcg tggtcggcga agacggtgcg cagggtctcg tgccgggcga cgacacagct 26460 cagcgcccgg gccagcaggc cggcgccgag cgggccgcgg acgcgcacgg cggtgccgaa 26520 gttgtagaag gcgctgtccg gcatcagccg gtcgaggaac cacagccgct gctgggcgaa 26580 cgacagctcc agcggccggt cgcgggggac ccggctgatg cccgcgggtg tcgtgccggt 26640 cctcgccgtg cgctcccgga gccggttgag tgccgagtcc agtcccggcc gtcgcgagct 26700 cccctgcgtc atccggctgt ctcccgctcc tcgtcggctt cggtgagtcc gcggtcgcgc 26760 atcacgctgg ccagggcgcg gtgggtgccg gactcgcttg cttcgaactg ctcgaccacg 26820 cgccgccgca tcggggcggg cttctcctgg ctgagcttga acatcgtctg cacggaatcg 26880 acccgcaggg tgaaggcgcc cacgccgggc gcgatctggc ggaagtagtc gagggaggac 26940 tcctggtccc agccgcgccc gaagccggac tccagccgcc gggcggtgtc ggagacgatg 27000 tccagcacgg cggcggggtc ggcggtgggc tccactgtgc cgttcacgtg gacggcgatg 27060 aagtcccagg tgggggccgc gggcgtgacc ccgtagaccg tcggcgagac atagccgtgc 27120 gggccctgga agacgatgag cgcccggtcg ccggagcgca tccggcgcca ctgcgggttc 27180 tcgacgttca tgtggccgat cagggtggag ccggcgagcg ggacggtgcc cgcggcgacg 27240 gcctcggcgt cggcgccgtc gggtccgtgc cggaacagca ccggcgcgtg ggtggccacc 27300 gggacgtcgt cgtgcgaggt gacgaccatt gccagtgggt tgtgtcgcag aaacgccagg 27360 acgacgccgt cgcaatcctc ccggtacagc ggacgttcgt acacttcagc ccctgttccc 27420 cgctgctgcc ttgcttccgg tggagcggtc cgggtcgcac cggccgccgg tgatcgaccg 27480 ggcgatctcg cccgcgcgga ccgccaccat ggacagcagg gtggaggcga tgccgtgggt 27540 cgcctcggtg gcgccctgga cgtagatgcc gcaccggaaa tccccggtgg tgccgagccg 27600 gtagtcgcgg ccgatcagca actcccccgc ctcgtcccgg cggagggcgc cggagacgcc 27660 gccgagcagt tcggccgggt cggtggagtc gtacccggtg gcgtacacga ccaggtcggc 27720 gtccaggtcg gtgtgttcgc ccgtgggcag gaactccacg cgtacggcgg cggattcctg 27780 gcgcggttcg acggacacca ggcgggaggc gttcatcacc cgcagccgcg gggcgccgga 27840 caccttctgc tcgtactggc ggcggtagag gccctggagg acgtcctcgt cgacgacggc 27900 gtagttggtg ccgccgtggt agcgcatgat ggcctgcttg acctcgggcg gggcgaagta 27960 gaagtcgtcc acggcggccg ggtcgaagac gcggttggcg aacgggctgg agtcggcgac 28020 gctgtagccg tagcgggcga acaccgcgca cacctcggcc tgcgggtagc ggtccatgag 28080 gtgcgcggcg acctcggccg cgctctggcc ggcgccgacc acgacggccc ggcggggcgg 28140 gcgttcgtcg aacgcgggca gccggtgcag caactgggag ctgtgccaga cgcgttcgcc 28200 ggtctccgcg ccctcgggca gccgggggcg caggccggag gcgaggacga ggtttctggt 28260 ccgggcgacc acccggtccc cggcgagcac gtcgagcgcg acgacctcac cggcttcggt 28320 caccggccgc acaccggtgg cctccacgcc gtactcgacc aggtggttca gccggtcggc 28380 ggcccactgg aggtagtcgt ggtactcgat ccgggagggc agcagggtgt gctggttgat 28440 gaagtcgacc agccggtcct tctcctggag ataggacagg aatccgaaat cactggtggg 28500 attgcgcatc gtggcgatgt ccttgagaaa ggacacctgg agcgaggagc cccccaggag 28560 catcccccga tgccagccga attccttctg cttctccagg aaaagggcct tcccggcggc 28620 ttcggattca tggagcgcca ccgccagggc gagattcgcg gcaccgaatc cgattccggt 28680 gacgtccagt acttctgatt ccgggctctg ctgcgcagtg gatgattgct ctgcgagccg 28740 ggtcatatat caaccgccat tagtttttca atggatgtat cgtcgcagga cgcccagaat 28800 tcacctgcga cgtcctccag atgcgtgagg gaacgcgcgc tgtaaaaggt ggtctggtac 28860 tgggttatgt cgtagtcgac gtgggccatg tcggcgatgt ccagcggccg gatctccgcg 28920 gaacggaagt gctccagctc gccgtaggag gagacgacgc tggcgccgta ggcccggggc 28980 ccgtcggcgg cgtccagcag gccgcattcg agcgtgaacc agaaggtctt ggcgacgaac 29040 tggacggcgt cctcggactc caccctgcgc acggcctcgc cggccaggcg gtacaggttg 29100 gcgaaccggt cgtcggccag ggcgctgccg tgcccgatga cctcgtgcag gatgtccggt 29160 tccgtcgagt agaagggtgt cgcgctgtcg cggaggtact gggtggagtg gaagtacccg 29220 tcggccagag agccgcagaa cagggcgaag ggaaccacgc cggacgcggg gcgtaggcgg 29280 aatccggtca gctggtcgag ccggtcggac acttcacgca actgcgggac gccgtcgccg 29340 cccacctcga gccgctccgc cgcctcgacg aactccggcg ccgccatgtg ccggtgccgg 29400 tccgcgagcc gcttggaaac caggcgccac agagcgtgct cggcgtccgt gtactcgacc 29460 tctggaatgg gctcgccggg cacataggcg gcagcgcttg cggcgatttg gtcacgccgc 29520 tgctgataca ccgacgacgc ggttaattcg ggcgcgcccg agccgatttc cacgaacttc 29580 cccctacttc catcgacaga aggcagcagt tgctgtccga agctattttg gttcggacgc 29640 ccgcatcaac cttcccttgt ccagccgatt cattaggacc ctacaagcca cccgcagcac 29700 tcgcaagagt tttctatgcg cccgctatgt acccttttgg gcagactcac cggaaattat 29760 cgtcatccgc accgccggaa ccggagtcaa gcgttggctc ggcagggcgg cttcaagttc 29820 ccgataggag cgggccctag gcgattcctc agatccggcc ggcgcgttcg ggtgtgtccc 29880 aaatcactgg cctaaatcct tcatgaggac ccgtcagctt gccgacggac gctctttcgc 29940 ttgtggtgcc gggcgtttcg gtgtccgggc aggccgcgcg ggagcgcccc aactgccgcg 30000 tcgggctgtc gcgtcgggtg ggcgccgggt tccacggctc cgggagtcct tcgacagggc 30060 ccggcgaata tctccaggac caagccgtgg gcggtgaggt ggtcggcgag ggcggtgagt 30120 tcggcggcgt tgcgaccgag ccgcttccgc tcgtacaccg tgaagatgac acggcagtgt 30180 ggggcgtgcg ccttgacctc ccgcgccgcc ctcagcgcct cctcccggaa cttcgggctg 30240 ccccgcgccc gggtgctgat cttctcgccg aagatgtagt cgcgcgagat gccgtgtttg 30300 gcgagcgcgt cgagctggga gtcacttcgc ctgcatccgc ccgcgcgcgg agtggtgcgg 30360 catcgtggca gcgcgcgtca gatgcgcggc gtcgccccca ggtgaactcc gtccgccctg 30420 gggcagggtg ggcggagttc accgcgtcgt gcggttcaac gggtccaatg gaggtcgcga 30480 tacggtccgc ccggcgcgcg ggccgcgatc atcattccgg cggggcggag ccgtcagtgc 30540 ttgacggtga acgtggcgcc ttggggcgcg aaggtcgtgt cgtggtcctt ggcggtggcc 30600 agcacggata cgtgccagac gcccttgggc aacgcggcgg cttccttggc cgagctcttc 30660 acggtgtagg tgcacaccga ggccgtcgcg gaagtcgcct tgcacgtggc ttcctcgaca 30720 tcccgcatct cgcccgccgt gggcgcaagg cccgaactcg ccggccaggc gagcacccgc 30780 aggctcttga ttccggagtt gtcggccacg gtggcgctga aggtgagcga ggcgctccca 30840 ccggccgtac tggtgtagtg ggcggtggcc tttgagatct ccggcttggc cggcacagcg 30900 gcgtcggccg aggagacgaa caccacggtg ccggcaacga cggctgcggc cacggcgagc 30960 gacgagacga caaggcgctt ggacatgaag tatcccctca tagatgaccg ctactggtct 31020 cttcgccgag cgctctgcgc accgcggcgt tgtgtacaca gcctgtctcg acggccctgc 31080 ccctcacatg ggcagaacta ctcaaccgaa gtactcagac gccctgagct tgtcgttcaa 31140 cctcgtctcc gttgggggcg ggtattgagc aggcgctttt cgaatgtggc gtccagcacc 31200 gccgtccagg atgtgcagcc ggtctgcaag cttcgtcgcg atcaggacct tcagcagatc 31260 cagcgcgtcg tccaccgccc gcgacgtgag gtacaccgcc gcggccagca gcgttgtgag 31320 gctgcgagag tccgagtgcc ggcgcggcaa cgacaccttg tcgtccgccc cgtaccgcga 31380 ccactctgcg ccgccccgtc acccgtaccg gtccgcggcg cagccggtcc agctccacca 31440 ggcggcccga cgagcagaga atccagcacc gcccgctgca cgacgcgcgg catcccgcac 31500 aaggcgtccc aaaacgccga ttcgccgcct cccacaccga tcccacagga caggccggac 31560 agctcgcccc cagcagcagc ggctactgtc acccgttcgg cggcgggcgc gacagagccc 31620 gtgacaacca gattgtgacg ttcggtgatc gtgacaccaa ttcggagctg gcccgctgac 31680 ctgtgacagc ggactggcct cgaaggtgga ccgaatgcag ttcttgacag caaagacgga 31740 ccgccgcagc tcaggggcgc agtgcccgcc cgcagcacag tcggttcagg gctcgacgcc 31800 ggctacggac agacgtggat cgccggtcgc ggtcagcgcg aacgctgtcc ggtgaagagg 31860 cggtacagca ggagcacgat caccgagccg acgaccgcgg cgatccatgt cgagaggtgg 31920 aagaagccgt tgatggagtg cacgccgaag atcaccttgc cgagccagcc gccgagcaga 31980 ccgccgacga tgccgatgag catcgtgacg aggcagccgc ccgggtcctt gccgggcatg 32040 agtgccttgg cgatggcgcc cgcgatgagg ccgatgagaa tccaggcgat gatgcccacg 32100 gtgtgcgtcc tttgctgtag gtggtgccga ggaaggcccg acgaggctcc gccggggctg 32160 cccgccggtc gctccgcgcg gacgaccggc gacatacgga tatccgctcc ggaacactcc 32220 acacgggtca aaggtcccgt ttcctccgac cgacccaccc ggcatccgat ccgtcggccg 32280 atccggtcga cggcggattc ggtgactggt caaccttcga tggcgctcga tcaaggttcg 32340 ctgtcacagg tcatccgccc tcagtccctc aggtcgcccc tcggaaggcg tccaccagag 32400 gtcaggcggg tccattcctc cggatcccca gctgcctcac agggtgctgg ggacccgggg 32460 acggccctcg gtgttatgga taagccgaag ctcaggacgt tctcacggcg acgccggatg 32520 agctggcgag gagggcgtgc cgaggcagtt cggttgtcac cgaggaggca tcccacttct 32580 cacgcgtgct cattcggcgg acttcctgtc accggcgccg acgagccgga gttcccgggc 32640 tccccggctg ggcccggctg agggctgagc ccttccacgg cgaggcggaa gaggcggtcg 32700 gcctgggtgt cggggtctgt gtggtgctcg gtggccaggg cgatgccgac ggcgagggtc 32760 agcaggtcgt gaaaggtgac gtgcggtgca accgccttgt cgcggatggc ccgctggagc 32820 aagggagttg cggctgcttc gattacgccc ccgcagctct tcggggaggg ttcttcggtg 32880 ggcggctcgt agctgaggat atgggcgaat ccgcgggctg agacggcgta gcggacgaag 32940 gcgtggaacc actccagcag tgcggtgcgg ccgtcctcgg acgcactcag ccgatgggcg 33000 cgctcgcaca ggcccgcaat gcgctcctgg aagacggctt cgaggagcgc ccggcgggtg 33060 gggaagtgac ggcgcacggt cgccgaaccg acgcctgcga tgcgggcgat ctgctcctgg 33120 gatgcctcgg cgccgtgcgc ggcgacttcg gcttcggcga cggcgaggat gcgctgatag 33180 ttgcgtcggg cgtccgagcg ctggccagtc atggtctcct cgttgctaag tggcgggccc 33240 cgccatatct tagcggcaca cgaaacggcg ggccccgccg ttttgtctct ccggcccttg 33300 aggagcagca ccatgcccag cagcagcgat accgtcctgg tcaccggcgc caccggccag 33360 caaggcgggg ccacggctcg cgcgcttttg gccgccaagg tgcccgtacg tgcgctcgta 33420 cgcgatccct cgtcgaagtc cgcccgggcg atcgaggcgc tgggcgcgga actggtacgc 33480 gcggatcttt ccgaccgggc ctccctcgac ccggcggtcg agggggtccg cgcggtgttc 33540 tcggtgcaga tgccgcccat gaccgagacc agcgtggact tcgcgagcga actcgcccag 33600 gccaccaacc tggtggacgc ggcgaagata gggggagtac ggcagttcgt acagtcctcg 33660 accagtggag tcggtgaaca cacccgggtc gccggctggg ccgagggccg ctgggcggcg 33720 atggcggagt acttccacac caagcaggcg atcatggagg cggtgcgtgg tgcgggtttc 33780 gcccgctgga cggtgatcaa gcccgccttc ttcatggaga acctgcccct gctggcaccc 33840 aaggggcccc gcggcggact gctgacggta ctgaagccgg acaccgaact ggccttggtg 33900 gccgtgcggg acatcggcac ggccgcggca cacgccctcc gagaccccga ccggttccac 33960 caggtggaac tggaactggc tggtgacctt cgcacgatgg agcagatcgc gcagaccttg 34020 tccgccgcct ggggcgtgcc cgtgaccgcg ccctccctga gcgtggaaga ggcccttgcc 34080 gcgggcatgc cgaagtgggg agccggacac gagtggaaca acgtggtcct ccagcccgcc 34140 cggcccacat tcgcccggaa gttgggcatc ccgctcacca ccttcgccga gtgggcggat 34200 gagcagttga cacatgtgtc tgattagggg tgtggcggca agggcgcgcc attgacccct 34260 acggggagcg cggcggttgc ccgcagaggg cattgcggtc ggggggcatc ggtgccggtc 34320 ccctggacgg gctgcaatga gcaggacagc gcagaggggt ggacacgaga tccctggagt 34380 gcacgacgtg gccatcaggg ggtcgggcgg tacgggatgg ggatgatgta gcgcgggtgt 34440 ggaggcatcg gcccagtgcg ctgcttccgc tgttcgcgcg ggtgccggca gcctgttcgt 34500 tggagtcgtc gtggcttcgg agcccgtccg ggaagtacac gccgtgggcg ctggcccatg 34560 ctgcccgggt gtcgctcgcg tgggggaacg agtaccgcaa ggacgcgggc gatgcggctt 34620 cggcggcctc cctcgggtcc tcgccctctt cctcgtcgct ctcgttccag tcgagagcgc 34680 ggccgggtcc cgcccatccg cacgagcaca ccgcgcgcaa cgctgccgcc cgcggtccgc 34740 catgaggccg gccgtcgtag acgctccgct ccgatagcca cctggcctcc gctccggaag 34800 agctgaggaa gagcacagga tccgggacgg tgccatcggc cagcaacacc ccgaccgcac 34860 ccacgtggga cgacccgaac tcctccgtcg tccacgtctc cctctcacct tcacccatcg 34920 tctcgcccct ctcctcatcg ccgcatccgc acccggccga acgcacggat acagacgatt 34980 ccggagtcca aggttccgca cagcgagatc ctcgaaaagg tgacctcgca cctccaccgt 35040 gcaccaggcc tcaaagccca cgacgagccg accgagcgca gaccaccgaa gacgaagcgc 35100 atcgccgctt cccagtgcgc tggttgatga ggttcaggaa agcggggtca cttctctaca 35160 tcggacagct accgcagctt gccgcgcccg ccgcccggag cggcggttgc tcggcgcccg 35220 cgtgcgggtc ggaagcggag gctcggccgg cgaggttcgc cgtcgatgcc ggcggcacga 35280 cgggccagct ctccgatctt ctcctcgggc agtccggaca tcctgacggc ctggcgcact 35340 gcggcccggc agtcgggccg tgagcagtgc gccgacgata ccggccgtcc gaccgtcgga 35400 tgctcgggcg gcaggtagat cgctgcgcag ccgacgcaca gatagattga tcgcaaggcg 35460 cttccccttc gtcagctgag gccgctgccg tggcaggtat tgcaggagcc ggtccagcta 35520 cgggcgacgg gcttctggtt cccgtcctta tcgacttcga cagagtgctc ggtgtgctca 35580 gtgactccgg atccgctgca agcggagcaa ggcacgtcag acattttccc aggatgcccg 35640 attctgtggg gccgtgtcag tcgtcccgcg acactcgcgc gctaccggac cgggcgggcc 35700 catcccgaga atctcccgcc tgcatcacgg cggcgccaac ggcgagcccg aacctctggg 35760 ccacgcggtc gctcgccggc ccggtgggcg acctcgtgcc gccacgttcc cactgcgcgc 35820 tgttccgcca ctcccccgcc ccccagggcg agtcctcgct gcgctcgcag tactgccgca 35880 cgagcaggtc gcccgctccc ggagaggccc cagcatcacg gcccgtcaag gtgctccgga 35940 tcggtggtgg ccgttgtgaa ccgccacgcg ccgcccggct cgtcggcctg gccatcgccc 36000 ggcctggtcc cgctcaggat gccggggcgg tcaggacggc cttggcagcc agccggaaat 36060 tcctgatcat cggattcggg tcgcccttgc ggctgaccag gacgacccgg ctggggggag 36120 cgccctcgac cgggacggtg acgaggtcgg gacgcagtga gctgcgccga tcgccgaccg 36180 gtagcacggc gatggccctg ccgctcgcga cgagttcgag cttgtcctcg tagctctcga 36240 tcggcggcac gccggtcccg aggaactggt aggaagccca gcctgcggtc tcgaacgcac 36300 acggcgccgc ctcttcgccg gccagttctt ccgcggtcac cgacgcgcgg tcggccagag 36360 gatggccgcg cgggaccacg agcatccggg gctcctcgta cagcggggtg gtgaacacgt 36420 cgtcggcgac gagcggcagc ggggcccgcg cgatcagggc gtcgacgcgc ctgtcggaca 36480 gtgccccgac gtcgcggcag tgcagatgcc gggtggcgat ctcggcgtcg gggtaacggc 36540 ggcgcagttc ccgcacggcg gcagtgatca ccaggtcttc gacgtagccg atggcgattc 36600 gttcggtccg ggcttgttca cgcacggcca gctcggcctg gcgggcggcc cgcagcaggg 36660 cctgggcccg ggggaggaac gtccggccgg ccggagtgag ccgggtgccc tggggggtgc 36720 ggtccagcag tcgtgtgccg agatatttct cgagccgttg gatctgacgg ctcagcgccg 36780 gctgggctac gtgcaggtcg gcggcggccc ggccgaagtg ctggtgcgcc gccaccacgg 36840 tgaagtagcg caccagccgc agttccaggt cctgcccgag atcgttcacc ctcgcagggt 36900 acgcgtcatg ccgtttcgga atggtcagat tgccgaaccg gtcttggacg gccatgccgt 36960 cccgggcttt gactgaagga gcaacgtttc cccgagaaag cgacaggcgc gatgaaggcg 37020 atccagatcc acgaagcggg tgggccggaa gttctgcggt acgacgaggt gccggctccc 37080 gagatcggcc cgggcgaggt gctcgtccgg gtgcacgcgg cgggcatcaa cccgccggac 37140 tggtacctgc gtgaagggat gaaggtcatg ccggccggga tgaggccggc gctggagttc 37200 cctctgatcc ccggaacgga catgtcgggc gtggtccagg cggtcgctcc ggacgtgccg 37260 gggttcggcg tcggcgacga ggtcttcggc atgctgcggt tccccggatt cgacggccgg 37320 acgtacgccc agtacgtggc cgcgccggct tctgacctgg ctcacaagcc ggccggtatc 37380 gaccacgtgc aggcggccgg ggcgccgatg gccgtgctca cggcctggca gtacctggtc 37440 gacctcggcc acgaggtgcc gtctcctttc accggccagg tgcaccagcc ggtgccgatc 37500 acgccgggga tgaccgtgct ggtcaacggg gccgccggtg gagtgggcca tttcgcggtg 37560 caattggcga aatggaaggg ggcacacgtc atcgcggtgg cctcaagtcg gcacgagcgg 37620 ttcctgcgcg agctcggtgc cgatgagttc atcgactaca ccacgacgca ggccgcggac 37680 gtggtcagcg gtgtcgacct ggtgatcgac accgtcggcg gcccggacgg ctcacgcttc 37740 ctgaccgtac tcaagcgcgg cggcaccctg ctcccggtgt tcttcgccga gtacgacccg 37800 gaagagacgg cgagtctgga catcaccgtc tcgaacattc aggtacgttc ccacggcccc 37860 cagctcgccg agatcgggcg cctgttcgac gagggcacac tccgggtcgg ggtggacagc 37920 acctacccgc tgtccgaagc ggtcagcgca cacacgcgag ccgcgcaggg ccacatccaa 37980 ggcaagatcg tgctgacggt ggcctcgtga tcgccgaaac tccagcaggc ggtggcgaac 38040 tacgcccacg ccttggacga gttgcatata cccgagctgg aaacggtcct ggccgaagac 38100 accacctgga ccgtcacgat gcccggacag gggatgctcg gccccgtcgc cggacgcgcg 38160 gccgcggcgg tgctcgactt catcttcatc ccccgtgtca gctcggtgag cggtgtccca 38220 gaccggcccg ggacctcagc agttgcccag ccgacccgat gagcgcgggc gccgagttgc 38280 ccgcgagcag ccgcggcgcc atcttgacgg gcaggcccag tcgcgctgcc gcgtcggatt 38340 cacgccggtt tcctcgggtc gctgtcggcc aagtcagcgg tcattgtgcc acccgtccca 38400 cttcggaaga cgctgaccgc cgctcccccg atcctggatg cggcggcttt cacggcacgc 38460 tgctccgctg ccgtgccgac gaggtctccg gacggctgag ccgtgctgcg catgccgcgc 38520 cgcctcggcg accgatcgcc gcgcagcgtc agatgcgccg gactttcgcc acggcaaggg 38580 cgtccgcgac ctcccggacg acacgcttcg cgtcgtcggg gctgttcacc acgtcggtgc 38640 ggttcatgtc gatcacgagg acatcgctgg cggaatagtg ctcgtgcacc cagtcgtcgt 38700 acccggccca aagcgtccgg tagtactcga cgagactttg gtcctgctcg aagtcacgcc 38760 cccgcagtcc gatgcggcgc agcaccgtct cgaagtccgc tctgagatac accatgagat 38820 cgggtgcctt gcgatagggc aggccgtcga tctcacgcat catctccgcg agcaacccct 38880 cgtacacctg catctccagg gaactgatcc tgccgaggtc gtgattgact ttggcgaagt 38940 accagtcctc gtagatcgac cggtcgagga cgttgtcgtc ctgtttgtac gcctccttga 39000 tcgcggcgaa tcgcgtctgc aagaagtaga gctggagaag gaagggatag cgcttcgccg 39060 ctatctcctc aggaccggcg gtgtagaaga gcggcaggat cgggttgtcc tccacgctct 39120 cgtagaagac catgctcccc agctctttgg cgatcagctc ggccacgctt gtcttcccga 39180 tcccgatcat gccgccgacg cagatcactg ccatacctcg cttctttccc gggacaccgt 39240 ccgcgggcgc gattcccgcg caccggctct tccacggcac acgcaccgcc gcggagcgca 39300 gtcgtggaag cgccccaggc gcaggtgacg agcctggcct ccgtcggacg accgaagcgg 39360 catcatatcg gcacggaggg gtgttcgaat ctacgtgctc gtgccctgga tggaagacgc 39420 tggtgcaccg ggtagcggga tcatcggagg tgatcatgta gcgggtgggc ggaacgacgc 39480 ggaacgacgg agtggtggga caggggccac tgacgcacgt atccgcagcc gcgctggagt 39540 cgccgacctc cacaggttca ctctcaccgg tgaccaagga aagatcgccc gcatgccagg 39600 ctcgcccgct cctccccgga acagcgcgta caccgatcag gagaacgacg ccgcgacccc 39660 gagcgagcag ccgagcctgt gtggacgccg aacgtgtcgg ttaccactcg acgaccagcc 39720 ttgacacacc gcgcgtcgcg aggccctccc gccatacgag ggcctcgtcc cccggtgcga 39780 gtcgcaggcc ggggaagcgc tgccacaagc gggtcagcgc gatcttcatc tggagaagaa 39840 ccagtggcgc gcccatgcac cggtgggcgc cgtgtccgaa tgtgaggtgt gcaggccggc 39900 gggcgctgct cttcgcaccc gatgtgcaaa atacttcggc gtcatgattg ccgtgcagca 39960 acgagacgat gacggcctct ccttggcgca ccgtcgtccc gcccaggaca aggtcctcga 40020 tggccactcg gggaaaactg ataggtgtgg acggcgtctt gcggagcagc tcctcaacca 40080 gatcctccac ggattgcccg tcgagcgcgt caccggtgag cagttcgagt atggcaaggc 40140 tcaattgatg ggcggtggtc tcgtaaccgg ccatgagaag tgccagtccg aggttgatca 40200 actcgatgcg ggatatctca cccgactgct caacccgcac cagcgcgctc aggagatcct 40260 gcccgggcgc atccctcttt ctttcgatca gtgaggacat gtacttgata agagtcagga 40320 tatggcggcc tcttctgcgg gttccctgag gcgtcatgtc gaacagcgca gtcacggcgg 40380 cgtcgaaaac gggccgctcc gccgccggca cgccgagcag tgagctcaac gcgaccatgg 40440 gaaggggcga agcataaccg ctgaccaggt cggcgcctgg ccccgcaacc tgtagccgat 40500 ccagcagtgc gtcggcggcc tcctcgatca ccgctgcctg tgcggtgact cgggcgctgg 40560 tgaacgctgc tccggcgacc cggcgcagcc gggcgtggtc cgcaccgtcc agactcatga 40620 tcgagttggg tgagaggtcg acggatcccc atttcggagc atcggggtgg gtggccgcag 40680 ctctgctgag acgtgtgtcg gcgagcgcgg cgcgccccac ggcgtagtcg gtgaccagcc 40740 acatgtgatc accagtgggc atccgcaccc gtttgacggc ctcacttgat ggcgctgcca 40800 ggaagggcgg cagggggccg accctgtggt gatcgaaagt gccggacatg gtcgattact 40860 cctgttcggt cggaaacgcc gcggggtgtc tgtctcccct gccgccgacg gccgtgggag 40920 acgacccatc gggtggcggc cgggtcgggc gagcgggctt tttccaccgc ccggaaggcg 40980 gcccgctgtt cggtctgcac gctgttcggg ctgcccggct tcggcggaca gaccggcttt 41040 ggcggacaga ccggctgccg gatgttcgtc acgtagcgcg cacggtgtgt tccctgcctc 41100 tcagcgcatc ccgccgtcgc ggcctgacgc gttggacgcc tgtggtctca gccgagcgtg 41160 ggcaccgaac tgcgtcggcc cgtcgacctg cgctctgcgg gacaggacga ggtcccggag 41220 tcgctgtggc agggcgtcgt caaagcggag gtggtccggc accgtgacgc cggcgttgcg 41280 cagcggcgtc gcgatctcgc ggcaggtggt gctgagccag ttgaggaccg cgggatctcc 41340 cgagcggccc gcgaccggcg tccaggtggc cacttccggc tgccggaggc cggcgtcgag 41400 gaacgtccgg gtgaggcggg ggccgaagtc ggggacggcg ccggccgcca ggaaggggcc 41460 gggccacagc gcgtagtact cgtcccactc cggcagcggc ggacgtgacg gcgacgtgtt 41520 ggtgaagtcc atctcgtgca tgacgacgat cccgtccggt ttcagcaggg acgtcagacg 41580 gcgcagtgcg gatgcgggat cgggcaggta catcaggatg tacctgccga ccaggacgtc 41640 gaacttcatc ggccaggtga agtcggccag gtccgcggct tcgtaccgca ccgagtccgc 41700 gagccccgcc tcctgtgcca ggatccgcgc cttgtggacg gttccggggt cgcgctcgat 41760 tcccacgacg tgtccgccgg gcccgaccag ttgggcggcc agcagagaga cgtatcccag 41820 tccggcaccg atgtcgagga cgctcatccc cggacgtact ccggccgacc gcagggtgcg 41880 ttcggtgaac ggcgagatcg cctcgttctg aagggtcagc ctttggtgct cgctatcgga 41940 gtaaccgagc aggtatgcgt cgtgcgccat gcgaggcctc cagggccggt cgtgcgggga 42000 gttccccacg gcaggtggcc agggggctcc gcggtgtctg gagcactgag tgccctgtag 42060 cggccgtgcg gtgtggtccg gtgttccggg tatgtcacgc accggagcgg gacatgtacg 42120 tgtccgaagg cggcgggcgg cgcagagcct tgccgctgga ggtgcgtgcg atcccgccgc 42180 gccgcacgaa ctcgatcgtg tcgggtgtga tgcccagctc ggccaccaca cgtgcgcgga 42240 tgtgttgcgt cgtggcacga cggctcgcct cgtcgtgccg cgtcgtctcg acgacgagcc 42300 cgaggcggcc tccctcgtcg ctccagatct gctcggccag gacgccgtgg acgaggaggc 42360 cgggtgtgtc ccgcacgacc gcctcgatgt cgctcgccca gtggttcgcg ccgaagacga 42420 tgatcacctc tttcgtgcgg cccacgatgt acagctcgcc gtcgtgccac aggcccaggt 42480 caccggtcgc caaccagccg cccggaagga ggacgcgacg gctctcttcg gggtggcggt 42540 cgtacccggt gctcgtgacg gacgcccccc ggacctcgac ggcgccgacc gtgccgggca 42600 cggccggtgc gccgctcgcg gtggtgagcc ggacctcggt acgccgcacc ggcgttccca 42660 cactgaccag ttcgcgacac ggcccggcgc cggacggcac cggtacgtaa cggccccggt 42720 tcagttcgtc ccggtcggca cgcagcacct tggccgggcg gccgagggga gggaaggcga 42780 ccgccagggt cgcctccgcc agtccgtagg ccggcaggaa gacgttctcg gacagtccgg 42840 cgggcgcgaa acgctcggcg aaggcgtcct gaagccgccg gtcgaccggc tcggcgccgt 42900 tcaccgcgat gcgccagcgg gagagatcga ggccggccgg cggcgccgcg tcgcgcctca 42960 ggacgtagcg gtagccggag tcaggagcca tggtgaaggt cgcccccagc cgccccatgg 43020 cccggatcca gtcacccgga ctgcgcaggt agtcctccgg tgtcagcaga tggatgtcga 43080 cgtcgtgcag cagcggtgtc aagaaggaac cgatcaggcc catgtcgtgg aagaggggca 43140 gccaggtgca gccgacgtcg gtcctggcga gccgtgtgcc atgggcgatg gccgccaccc 43200 cggccgccac gttgccgtgg ctgagcacga cgccccgcgg ttcgctgctc gtgcccgacg 43260 tgtactgaac gacggccggg tccgacgccg cccgcgcgac gtgggccgcg gacggctcgg 43320 ccacctccgg caccaggagt acgtcgaccg ggcgggcgcc gtcggacagt ccaggaccga 43380 gcagcgggcg catggccgga gccgtcagca cggtccgtac ccgagagcgg cgcagggccg 43440 cggaggtgcg ccggagatag gcgtcggacg acccgaaggg cgcgggaccg ggcagcggca 43500 ccgcgaccgc gcccgccgcc agcacgccga agaaggcgcg cgcgaagtcc accgacgtcg 43560 gcaggacgag ggcgacccgc tcgccgggtc gcaccccgcg cgacagcagc cccgcggcca 43620 cccgcccggc ctcggcgaag aggtcgctgt aggacagcgc gtcgccgtcc tggccccggc 43680 gcagcacgtg catgccccgt ccggagcctt gtgcggcgac gcggccgagc gcggcgaaca 43740 gggtcacgac agcggttccg tgccggcctc cgcgatcacc ttggtgatcg cggccgcgaa 43800 ctcccgcacg gtgctcgtct cgaagacgat gcggtcctcc acctcgatgt cgtagtgctg 43860 ctcgatctcc agcacgatct ggagcgcgtg gatcgagtcg aagcgcggca aggagcgcag 43920 atcggtgtcc acgcccacct cctcgacacc gatgcgcagt tgctcggcga cggatcggcg 43980 gacggtctgt tcgatgtcgg tgacactcgc ctgtgacatg gcgtggtgtt gtcctgttct 44040 gtgaggccgg cgcgtcgggg cgcggcggga ggcggacgcc gggactgacg gtcagcgagc 44100 gccgggccgg cgggccaggg cgcgcagctt ggctttgatg tcccgcgggg tctccaacga 44160 gtcgtcgtcc gccaggagcc ggacgatcga catcaccttg gcgtccgcgg cgtccaccga 44220 gtcgtgctgg atggtctcga tacggcggat gccggccgtg gatgtggaat gcgggtagaa 44280 catgcccgcc gggtgcttga cgccgttgct acggtccgcg agccagatgt aggccatgcg 44340 cagcgcggcg gcctgatggg ccggatcgct gtcgcacagt tcccgcatga agacggagaa 44400 cgcacggcag tgccgggcct cgtcgcgggc caggagccgc cagattctgc ggatcaccgg 44460 ctccgacaca tgggcggcga gcgccttgta gagggcggac gcgcgtgact ccgagatcac 44520 gttcatcatg agggtggcgg agcgcacgtc gccctgcgga tacggctctc gtttgtagag 44580 cgcgtgcttc gaacggagtg agaccccgat ccggtccagg tagcgggcct ggaccagtga 44640 gtgccgggat tcctccgcac cccattgcag tgcccaggag gagaagctga cctcgtcctg 44700 ccattcccgc aggaagttgt gagcgccggg tagggtgccg aactcgatga cggccgcctc 44760 ggtgaggaag tccacggtcc gttcgtcgag catgccgtgc tcgatgcggt ccaggtccac 44820 ctcggtccag tcccagcgcg tcgtctcgaa ccagtcgaag atcttgttga aggtcatgtc 44880 gaggtagtag tcggtgtaga ggtcgtccgt catcagcgcg cggtgcgccc gcagggccag 44940 ttcgaccgag gtggtgaacc cttcgggcgc caccgcggcg ggccggacga tgtcctcgac 45000 gtccagtgct tccgcccagc cgggaaccgg gcccgccgta tcgggcccga cgacgtacac 45060 ccgggtccgg ttgaacttcg agtgcgaccg cagcgcccgg acggcgggca gcggctcggc 45120 gtccgccccg atccacaccg ccgcgagctc ggatgacggt tcgaactcgt gcaggtagcg 45180 gtgccagtcg gcgtgtgccg gccggtccac ggtgacgtcg ccgaaggcgg ggacggtgag 45240 cctttcggcg ggggagactg cggtggtggg tgccagcagg gcgatggtgt gcgggggcac 45300 ggagggcgtc ctctctgtcg gtctgcgcag gccgtcggcg agcaccttgc cgcgcgttgt 45360 gtggggctcg gctccgtaac acgtgcgtgc cgcgacgtca gagccgcccg tactccgcgg 45420 cagggccgag gagtacgggc agcgcctcga tgctgttgct gacgaacgag ggcacgggcc 45480 gcacggtcca cgtgtcggac ggggccagcc gcacgtcggg gaaccgggtg aagaatccgg 45540 ccagtgccgt ctccagctgg agacgggcca ggtgtgtccc gatacagaag tgcgggccgt 45600 gcccgaagcc gaggtggccg gcctgccgcc ggcggacgtc gaagaggtcc gcgtccggcc 45660 cgtggtgcgc cgggtcccgg cccgccgagc cgaaggacgc gaggatggct tctccccggt 45720 ggatcgtctg gccggcgatg acgacgtcct cggtcgggta gcgcatcggg aactggttca 45780 ccgcgccgtt ccagcgcatc gtctcctcga ccaccgcact ccacgggacc tccccggcgc 45840 gggcggaggc cagttgctcg gggtgggtga gcagcgcgtg gcaggcgttg acgagtacgt 45900 tgatgacgct ctggtggccg gcgaagaaca tcagcaggat catgccgtgc agttcgctgt 45960 cggtgagccg gtcgtctccg tcctggcgtg ccgtgagcag gacgctgatg aggtcgtccc 46020 gggggacgtc gcgacgttcg gcgacgatct cccggagcag cgcttcgatc cgtccgtcga 46080 tctcctggac ctgttcgggg gagttgttcg tacgggtctg catgccggtg agcacgtgca 46140 gcagacgccg cttgcgctgc gggatcccca gcaggtccga gatgacggtg gtggggatgg 46200 ggtaggcgaa agccttgcgg agatccaccg gccggtcttc cggccgtgtg gcgagctggt 46260 cgaggagccc gtcgacgagg cgttccaccc ccgggcgcat ggcctccacc cgttccgggg 46320 tcagtgcctg gtcgaccagt ccgcgcagcc gccggtgatc cgcgccgtgc gaattgatga 46380 cgctgtcggt cgcgacgaag cccatcaacg gccacccgtc cggcacttcg ccgcgggccg 46440 ctgcctccca gtgcgtgatt cccttggcga ccctgggatc cgtcagcact cggcgcaggt 46500 cctcgtggtg cggaatcgcc cacgcccgca caccgccggg gagttggacc ggaacggctc 46560 tccccgccgc ccgcaggcgg gcgttctccg cgtgct 46596 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cagagaattc gcggtacggg gcggacgaca aggtgtc 37 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gcgcatgcat gtgccggtgc cggtccgcga gccgcttgg 39 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cctcatgcat ctggaggacg tcgcaggtga attctgggcg 40 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gggcaagctt ctcctggctg agcttgaaca tcg 33 <210> 8 <211> 3994 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment <400> 8 cagaggatcc gcggtacggg gcggacgaca aggtgtcgtt gccgcgccgg cactcggact 60 ctcgcagcct cacaacgctg ctggccgcgg cggtgtacct cacgtcgcgg gcggtggacg 120 acgcgctgga tctgctgaag gtcctgatcg cgacgaagct tgcagaccgg ctgcacatcc 180 tggacggcgg tgctggacgc cacattcgaa aagcgcctgc tcaatacccg cccccaacgg 240 agacgaggtt gaacgacaag ctcagggcgt ctgagtactt cggttgagta gttctgccca 300 tgtgaggggc agggccgtcg agacaggctg tgtacacaac gccgcggtgc gcagagcgct 360 cggcgaagag accagtagcg gtcatctatg aggggatact tcatgtccaa gcgccttgtc 420 gtctcgtcgc tcgccgtggc cgcagccgtc gttgccggca ccgtggtgtt cgtctcctcg 480 gccgacgccg ctgtgccggc caagccggag atctcaaagg ccaccgccca ctacaccagt 540 acggccggtg ggagcgcctc gctcaccttc agcgccaccg tggccgacaa ctccggaatc 600 aagagcctgc gggtgctcgc ctggccggcg agttcgggcc ttgcgcccac ggcgggcgag 660 atgcgggatg tcgaggaagc cacgtgcaag gcgacttccg cgacggcctc ggtgtgcacc 720 tacaccgtga agagctcggc caaggaagcc gccgcgttgc ccaagggcgt ctggcacgta 780 tccgtgctgg ccaccgccaa ggaccacgac acgaccttcg cgccccaagg cgccacgttc 840 accgtcaagc actgacggct ccgccccgcc ggaatgatga tcgcggcccg cgcgccgggc 900 ggaccgtatc gcgacctcca ttggacccgt tgaaccgcac gacgcggtga actccgccca 960 ccctgcccca gggcggacgg agttcacctg ggggcgacgc cgcgcatctg acgcgcgctg 1020 ccacgatgcc gcaccactcc gcgcgcgggc ggatgcaggc gaagtgactc ccagctcgac 1080 gcgctcgcca aacacggcat ctcgcgcgac tacatcttcg gcgagaagat cagcacccgg 1140 gcgcggggca gcccgaagtt ccgggaggag gcgctgaggg cggcgcggga ggtcaaggcg 1200 cacgccccac actgccgtgt catcttcacg gtgtacgagc ggaagcggct cggtcgcaac 1260 gccgccgaac tcaccgccct cgccgaccac ctcaccgccc acggcttggt cctggagata 1320 ttcgccgggc cctgtcgaag gactcccgga gccgtggaac ccggcgccca cccgacgcga 1380 cagcccgacg cggcagttgg ggcgctcccg cgcggcctgc ccggacaccg aaacgcccgg 1440 caccacaagc gaaagagcgt ccgtcggcaa gctgacgggt cctcatgaag gatttaggcc 1500 agtgatttgg gacacacccg aacgcgccgg ccggatctga ggaatcgcct agggcccgct 1560 cctatcggga acttgaagcc gccctgccga gccaacgctt gactccggtt ccggcggtgc 1620 ggatgacgat aatttccggt gagtctgccc aaaagggtac atagcgggcg catagaaaac 1680 tcttgcgagt gctgcgggtg gcttgtaggg tcctaatgaa tcggctggac aagggaaggt 1740 tgatgcgggc gtccgaacca aaatagcttc ggacagcaac tgctgccttc tgtcgatgga 1800 agtaggggga agttcgtgga aatcggctcg ggcgcgcccg aattaaccgc gtcgtcggtg 1860 tatcagcagc ggcgtgacca aatcgccgca agcgctgccg cctatgtgcc cggcgagccc 1920 attccagagg tcgagtacac ggacgccgag cacgctctgt ggcgcctggt ttccaagcgg 1980 ctcgcggacc ggcaccggca catgcatctg gaggacgtcg caggtgaatt ctgggcgtcc 2040 tgcgacgata catccattga aaaactaatg gcggttgata tatgacccgg ctcgcagagc 2100 aatcatccac tgcgcagcag agcccggaat cagaagtact ggacgtcacc ggaatcggat 2160 tcggtgccgc gaatctcgcc ctggcggtgg cgctccatga atccgaagcc gccgggaagg 2220 cccttttcct ggagaagcag aaggaattcg gctggcatcg ggggatgctc ctggggggct 2280 cctcgctcca ggtgtccttt ctcaaggaca tcgccacgat gcgcaatccc accagtgatt 2340 tcggattcct gtcctatctc caggagaagg accggctggt cgacttcatc aaccagcaca 2400 ccctgctgcc ctcccggatc gagtaccacg actacctcca gtgggccgcc gaccggctga 2460 accacctggt cgagtacggc gtggaggcca ccggtgtgcg gccggtgacc gaagccggtg 2520 aggtcgtcgc gctcgacgtg ctcgccgggg accgggtggt cgcccggacc agaaacctcg 2580 tcctcgcctc cggcctgcgc ccccggctgc ccgagggcgc ggagaccggc gaacgcgtct 2640 ggcacagctc ccagttgctg caccggctgc ccgcgttcga cgaacgcccg ccccgccggg 2700 ccgtcgtggt cggcgccggc cagagcgcgg ccgaggtcgc cgcgcacctc atggaccgct 2760 acccgcaggc cgaggtgtgc gcggtgttcg cccgctacgg ctacagcgtc gccgactcca 2820 gcccgttcgc caaccgcgtc ttcgacccgg ccgccgtgga cgacttctac ttcgccccgc 2880 ccgaggtcaa gcaggccatc atgcgctacc acggcggcac caactacgcc gtcgtcgacg 2940 aggacgtcct ccagggcctc taccgccgcc agtacgagca gaaggtgtcc ggcgccccgc 3000 ggctgcgggt gatgaacgcc tcccgcctgg tgtccgtcga accgcgccag gaatccgccg 3060 ccgtacgcgt ggagttcctg cccacgggcg aacacaccga cctggacgcc gacctggtcg 3120 tgtacgccac cgggtacgac tccaccgacc cggccgaact gctcggcggc gtctccggcg 3180 ccctccgccg ggacgaggcg ggggagttgc tgatcggccg cgactaccgg ctcggcacca 3240 ccggggattt ccggtgcggc atctacgtcc agggcgccac cgaggcgacc cacggcatcg 3300 cctccaccct gctgtccatg gtggcggtcc gcgcgggcga gatcgcccgg tcgatcaccg 3360 gcggccggtg cgacccggac cgctccaccg gaagcaaggc agcagcgggg aacaggggct 3420 gaagtgtacg aacgtccgct gtaccgggag gattgcgacg gcgtcgtcct ggcgtttctg 3480 cgacacaacc cactggcaat ggtcgtcacc tcgcacgacg acgtcccggt ggccacccac 3540 gcgccggtgc tgttccggca cggacccgac ggcgccgacg ccgaggccgt cgccgcgggc 3600 accgtcccgc tcgccggctc caccctgatc ggccacatga acgtcgagaa cccgcagtgg 3660 cgccggatgc gctccggcga ccgggcgctc atcgtcttcc agggcccgca cggctatgtc 3720 tcgccgacgg tctacggggt cacgcccgcg gcccccacct gggacttcat cgccgtccac 3780 gtgaacggca cagtggagcc caccgccgac cccgccgccg tgctggacat cgtctccgac 3840 accgcccggc ggctggagtc cggcttcggg cgcggctggg accaggagtc ctccctcgac 3900 tacttccgcc agatcgcgcc cggcgtgggc gccttcaccc tgcgggtcga ttccgtgcag 3960 acgatgttca agctcagcca ggagtctaga gccc 3994

Claims (25)

  1. 하기 화학식 I의 화합물로서,
    그의 호변이성질체를 포함하고; 및 C-53 케토 및 C-15 하이드록실 기와 메탄올의 조합에 의해 케탈이 형성된 메탄올 부가생성물을 포함하는 화합물,
    또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
    [화학식 I]
    Figure 112018052101877-pct00066

    상기 식에서:
    부분 X1는 -OR1,-NR1R2 또는 R3를 나타내고;
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬시클로알킬, 알킬시클로알케닐, 알케닐시클로알킬, 알케닐시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐아릴 또는 알케닐헤테로아릴을 나타내며 이들 중 어느 하나의 기는 모노시클릭 아릴 또는 모노시클릭 헤테로아릴에 의해 선택적으로 치환될 수 있고;
    및 아릴 또는 헤테로아릴 기의 부분이 아닌 R1, R2 및 R3의 하나 이상의 탄소원자는 O, N 및 S(O)p로부터 선택된 이종원자에 의해 선택적으로 치환되며 여기서 p는 0, 1 또는 2를 표시하고, 및 R1,R2 및 R3의 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 카르보닐에 의해 치환되고;
    또는 R1 및 R2는 연결되어 NR1R2가 특정된 질소 원자를 포함하는 포화된 또는 불포화된 헤테로시클릭 고리를 표시하게 되고, 상기 고리의 하나 이상의 탄소원자는 O, N 및 S(O)p로부터 선택되는 추가의 이종원자에 의해 선택적으로 치환되며 여기서 p는 0, 1 또는 2를 나타내며, 및 상기 고리의 하나 이상의 탄소원자는 선택적으로 카르보닐에 의해 치환되고 및 그러한 헤테로시클릭 고리는 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 선택적으로 융합될 수 있고;
    및 R1,R2 및 R3기의 하나 이상의 탄소원자는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 선택적으로 치환될 수 있고;
    또는 R1 또는 R2는 수소를 나타내고;
    R9는 H 또는 OH를 나타내고;
    n은 단일 또는 이중 결합을 나타내며, 단 n이 이중결합을 나타낼 때, R9이 H를 표시하고;
    R4,R5,R6,R7 및 R8은 독립적으로 H, F, Cl, Br, 알케닐 또는 알킬을 표시하고 여기서 상기 알킬기의 하나 이상의 탄소 원자는 O, N 및 S(O)p으로부터 선택된 이종원자에 의해 선택적으로 치환되며, 여기서 p는 0, 1 또는 2를 나타내며, 및 상기 알킬기의 하나 이상의 탄소원자는 카르보닐에 의해 선택적으로 치환되고 그러한 알킬기는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 선택적으로 치환될 수 있고;
    X2,X3,X4,X5 및 X6는 독립적으로 C 또는 N을 나타내며, 이러한 기들 중 어느 하나의 기가 N을 나타내는 경우, 부착된 치환체가 없고;
    단 R4,R6,R7 및 R8 모두가 H를 나타내고 및 X2,X3,X4,X5 및 X6 모두가 C를 나타낼 때, R5는 OH, -O알킬 또는 O(CO)알킬을 나타낼 수 없다는 조건임.
  2. 제1항에 있어서,
    n은 하나의 단일 결합을 나타내는, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, R9는 OH를 나타내는, 화합물.
  4. 제1항에 있어서, X2는 C를 나타내는, 화합물.
  5. 제1항에 있어서, X3는 C를 나타내는, 화합물.
  6. 제1항에 있어서, X4는 C를 나타내는, 화합물.
  7. 제1항에 있어서, X5는 C를 나타내는, 화합물.
  8. 제1항에 있어서, X6은 C를 나타내는, 화합물.
  9. 제1항에 있어서, R4는 H를 나타내는, 화합물.
  10. 제1항에 있어서, R8은 H를 나타내는, 화합물.
  11. 제1항에 있어서, R5는 OH를 나타내는, 화합물.
  12. 제1항에 있어서, R6는 H, Me 또는 F를 나타내는, 화합물.
  13. 제1항에 있어서, R7은 H 또는 F를 나타내는, 화합물.
  14. 제1항에 있어서, R6 또는 R7은 F를 나타내는, 화합물.
  15. 제1항에 있어서, X1은 NR1R2를 나타내는, 화합물.
  16. 제15항에 있어서,
    R1은 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬시클로알킬, 알킬시클로알케닐, 알케닐시클로알킬, 알케닐시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐아릴 또는 알케닐헤테로아릴을 나타내고, R2는 H, 알킬, 알케닐 또는 -O알킬을 나타내는, 화합물.
  17. 제15항에 있어서, NR1R2는 모르폴리닐, 옥사지난 또는 하기 표에 개시된 기 중 하나를 나타내는, 화합물.
    Figure 112017005481437-pct00067

    Figure 112017005481437-pct00068
  18. 제1항에 따른 화합물로서, 상기 화합물은,
    Figure 112018052101877-pct00069
    ;
    Figure 112018052101877-pct00070
    ;
    Figure 112018052101877-pct00071
    ;
    Figure 112018052101877-pct00072
    ;
    Figure 112018052101877-pct00073
    ;
    Figure 112018052101877-pct00074
    ;
    Figure 112018052101877-pct00075
    ; 및
    Figure 112018052101877-pct00076
    로부터 선택되며,
    그의 호변이성질체; 또는 트랜스로 나타낸 C26,27 C=C 결합이 시스인 그의 이성질체를 포함하고; 메탄올과 C-53 케토(존재한다면)와 C-15 하이드록실기의 조합에 의하여 케탈이 형성된, 그의 메탄올 부가물을 포함하는, 화합물,
    또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 약품으로서 사용되는 화합물.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, C형 간염 바이러스(HCV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에서 선택되는 바이러스 감염의 치료용 약품 또는 면역억제제나 항염증제로 사용되는 화합물.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 화합물을, 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 C형 간염 바이러스(HCV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에서 선택되는 바이러스 감염의 치료용 약제 또는 면역억제제 또는 항염증제로 사용되는 약학 조성물.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 화합물을, 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하고, 제2 또는 후속적인 활성 성분을 더 포함하는 C형 간염 바이러스(HCV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에서 선택되는 바이러스 감염의 치료용 약제 또는 면역억제제 또는 항염증제로 사용되는 약학 조성물.
  23. 삭제
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 제조하는 방법으로서,
    하기 화학식 V의 화합물을, 하기 화학식 VI의 알데히드성 매크로사이클과 반응시키는 것을 포함하는 방법.
    [화학식 V]
    Figure 112018052101877-pct00077

    상기 식에서 X1은 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같고, 및 각 R11은 독립적으로 C1-4알킬 또는 벤질이고;
    [화학식 VI]
    Figure 112018052101877-pct00078

    상기 식에서, X2,X3,X4,X5,X6,R4,R5,R6,R7,R8,R9, 및 n은 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같다.
  25. 하기 화학식 VI의 화합물.
    [화학식 VI]
    Figure 112017005481437-pct00079

    상기 식에서 X2,X3,X4,X5,X6,R4,R5,R6,R7,R8,R9, 및 n은 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같다.
KR1020137028095A 2011-03-29 2012-03-29 대환식 화합물 및 그의 제조방법 KR101911484B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1105293.3A GB201105293D0 (en) 2011-03-29 2011-03-29 Novel compounds and methods for their production
GB1105293.3 2011-03-29
GBGB1113629.8A GB201113629D0 (en) 2011-08-08 2011-08-08 Novel compounds and methods for their production
GB1113629.8 2011-08-08
GBGB1202060.8A GB201202060D0 (en) 2012-02-07 2012-02-07 Novel compounds and methods for their production
GB1202060.8 2012-02-07
PCT/GB2012/050707 WO2012131377A1 (en) 2011-03-29 2012-03-29 Macrocyclic compounds and methods for their production

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140071958A KR20140071958A (ko) 2014-06-12
KR101911484B1 true KR101911484B1 (ko) 2018-10-24

Family

ID=46001313

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137028095A KR101911484B1 (ko) 2011-03-29 2012-03-29 대환식 화합물 및 그의 제조방법
KR1020137027773A KR101868084B1 (ko) 2011-03-29 2012-03-29 대환식 화합물 및 그의 제조방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137027773A KR101868084B1 (ko) 2011-03-29 2012-03-29 대환식 화합물 및 그의 제조방법

Country Status (29)

Country Link
US (2) US9090657B2 (ko)
EP (2) EP2691413B1 (ko)
JP (2) JP6118793B2 (ko)
KR (2) KR101911484B1 (ko)
CN (3) CN103619869B (ko)
AR (1) AR085724A1 (ko)
AU (2) AU2012235880B2 (ko)
BR (2) BR112013024974A2 (ko)
CA (2) CA2830831C (ko)
CL (2) CL2013002739A1 (ko)
CY (2) CY1116318T1 (ko)
DK (2) DK2691412T3 (ko)
EA (2) EA023848B1 (ko)
ES (2) ES2533437T3 (ko)
HK (2) HK1189236A1 (ko)
HR (2) HRP20150184T1 (ko)
IL (2) IL228509B (ko)
JO (1) JO3063B1 (ko)
MX (2) MX345351B (ko)
MY (2) MY170637A (ko)
PL (2) PL2691413T3 (ko)
PT (2) PT2691412E (ko)
RS (2) RS53964B1 (ko)
SG (2) SG193568A1 (ko)
SI (2) SI2691413T1 (ko)
TW (1) TWI525098B (ko)
UY (1) UY33993A (ko)
WO (2) WO2012131371A1 (ko)
ZA (2) ZA201307149B (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112012019866A8 (pt) 2010-02-09 2017-12-26 Biotica Tech Limited Composto, uso do mesmo, composição farmacêutica, e, processo para preparar um composto
JO3063B1 (ar) * 2011-03-29 2017-03-15 Neurovive Pharmaceutical Ab مركب مبتكر وطرق لانتاجه
CN103130734A (zh) * 2011-12-01 2013-06-05 上海药明康德新药开发有限公司 一种合成1,2-吗啉盐酸盐的方法
CN105695541B (zh) * 2016-03-10 2019-03-15 苏州华赛生物工程技术有限公司 一种抗生素nvp018中间体的分离纯化方法
KR20180036522A (ko) * 2016-09-30 2018-04-09 (주)나노믹스 스틸벤 유도체 및 그 제조 방법
BR112019009903A2 (pt) 2016-11-18 2019-08-13 Neurovive Pharmaceutical Ab análogo de sangliferina, combinação, composição farmacêutica, e, método para tratamento de um sujeito sofrendo de câncer ou de malignidade de célula-b
CN112410353B (zh) * 2019-08-23 2023-01-24 上海医药工业研究院 一种fkbS基因、含其的基因工程菌及其制备方法和用途
CN115028681B (zh) * 2022-08-11 2022-11-15 中国科学院微生物研究所 一种降解亲环素a的嵌合体化合物及其制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008546708A (ja) 2005-06-17 2008-12-25 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト Ｈｃｖにおけるサングリフェリンの使用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR006514A1 (es) 1995-07-04 1999-09-08 Sandoz Ag Un macrolido, sus usos, un proceso para producirlo, un aislado biologicamente puro capaz de producirlo, y una composicion farmaceutica quelo comprende
US6124453A (en) 1995-07-04 2000-09-26 Novartis Ag Macrolides
WO2008084368A2 (en) 2007-01-04 2008-07-17 Debiopharm Sa Non-immunosuppressive cyclosporin for treatment of ullrich congenital muscular dystrophy
ES2556211T3 (es) 2008-09-24 2016-01-14 Shanghai Institute Of Organic Chemistry, Chinese Academy Of Sciences Agrupación de genes novedosa
CN101691575B (zh) * 2008-09-24 2013-06-05 中国科学院上海有机化学研究所 一种萨菲菌素的生物合成基因簇
WO2011098808A1 (en) * 2010-02-09 2011-08-18 Biotica Technology Limited Sanglifehrin based compounds
WO2011098805A1 (en) * 2010-02-09 2011-08-18 Biotica Technology Limited Sanglifehrin based compounds
BR112012019866A8 (pt) * 2010-02-09 2017-12-26 Biotica Tech Limited Composto, uso do mesmo, composição farmacêutica, e, processo para preparar um composto
JP6086869B2 (ja) * 2010-12-20 2017-03-08 ネウロビベ プハルマセウトイカル エービー サングリフェリン誘導体及びそれらの製造方法
JO3063B1 (ar) * 2011-03-29 2017-03-15 Neurovive Pharmaceutical Ab مركب مبتكر وطرق لانتاجه

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008546708A (ja) 2005-06-17 2008-12-25 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト Ｈｃｖにおけるサングリフェリンの使用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) Vol.11, p.1609-1612 J. Am. Chem. Soc. (2003) Vol.125, No.13, p.3849-3859

Also Published As

Publication number Publication date
PL2691413T3 (pl) 2015-05-29
BR112013024965A2 (pt) 2017-04-18
US9139613B2 (en) 2015-09-22
AR085724A1 (es) 2013-10-23
IL228509A0 (en) 2013-12-31
CN103635484A (zh) 2014-03-12
AU2012235961B2 (en) 2016-09-01
CY1116186T1 (el) 2017-02-08
CN103635484B (zh) 2017-05-10
KR20140057481A (ko) 2014-05-13
MY170618A (en) 2019-08-21
PT2691412E (pt) 2015-03-25
JO3063B1 (ar) 2017-03-15
WO2012131371A1 (en) 2012-10-04
EA023907B1 (ru) 2016-07-29
EA201391399A1 (ru) 2014-02-28
CA2830827C (en) 2020-03-10
MX345352B (es) 2017-01-26
IL228509B (en) 2018-02-28
SG193568A1 (en) 2013-11-29
AU2012235880B2 (en) 2016-11-17
DK2691412T3 (en) 2015-04-07
ES2533437T3 (es) 2015-04-10
TW201300398A (zh) 2013-01-01
KR20140071958A (ko) 2014-06-12
AU2012235880A1 (en) 2013-10-17
HK1189237A1 (en) 2014-05-30
SI2691412T1 (sl) 2015-05-29
BR112013024974A2 (pt) 2016-09-06
IL228508A0 (en) 2013-12-31
KR101868084B1 (ko) 2018-06-18
EP2691413A1 (en) 2014-02-05
EP2691412B1 (en) 2014-12-24
AU2012235961A1 (en) 2013-10-10
UY33993A (es) 2012-10-31
CL2013002739A1 (es) 2014-07-11
PT2691413E (pt) 2015-03-25
CN103619869A (zh) 2014-03-05
CN103619869B (zh) 2015-11-25
HRP20150187T1 (en) 2015-06-05
CA2830827A1 (en) 2012-10-04
MX2013011043A (es) 2014-04-25
CN107417766A (zh) 2017-12-01
US9090657B2 (en) 2015-07-28
CY1116318T1 (el) 2017-02-08
RS53963B1 (en) 2015-08-31
JP2014514290A (ja) 2014-06-19
MX2013011051A (es) 2014-03-13
PL2691412T3 (pl) 2015-08-31
JP2014510746A (ja) 2014-05-01
EP2691413B1 (en) 2014-12-24
MX345351B (es) 2017-01-26
TWI525098B (zh) 2016-03-11
US20140038885A1 (en) 2014-02-06
JP6118792B2 (ja) 2017-04-26
CA2830831A1 (en) 2012-10-04
HK1189236A1 (en) 2014-05-30
ZA201307149B (en) 2015-04-29
US20120251581A1 (en) 2012-10-04
RS53964B1 (en) 2015-08-31
SG193569A1 (en) 2013-11-29
JP6118793B2 (ja) 2017-04-26
ES2533438T3 (es) 2015-04-10
CA2830831C (en) 2020-03-10
HRP20150184T1 (hr) 2015-05-08
ZA201307231B (en) 2015-05-27
EA201391396A1 (ru) 2014-02-28
CL2013002740A1 (es) 2014-07-11
IL228508B (en) 2018-01-31
MY170637A (en) 2019-08-21
DK2691413T3 (en) 2015-04-07
SI2691413T1 (sl) 2015-05-29
WO2012131377A1 (en) 2012-10-04
EA023848B1 (ru) 2016-07-29
EP2691412A1 (en) 2014-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101911484B1 (ko) 대환식 화합물 및 그의 제조방법
WO2011098808A1 (en) Sanglifehrin based compounds
CN107090476B (zh) Sanglifehrin衍生物及其制备方法
EP2533784B1 (en) Sanglifehrin based compounds
WO2011098805A1 (en) Sanglifehrin based compounds
Class et al. Patent application title: Macrocyclic Compounds and Methods for Their Production Inventors: Steven James Moss (Cambridge, GB) Matthew Alan Gregory (Cambridge, GB) Matthew Alan Gregory (Cambridge, GB) Barrie Wilkinson (Cambridge, GB) Assignees: NeuroVive Pharmaceutical AB
AU2011346823B8 (en) Sanglifehrin derivatives and methods for their production

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant