KR101825049B1 - GLP 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

GLP 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 GLP(glucagon like peptide) 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 GLP 또는 이의 유사체에 적합한 면역글로불린 하이브리드 Fc의 발견에 기초한, 기존의 융합 폴리펩타이드에 비해 반감기가 증가되고 효능이 우수한 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 당뇨병, 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 기존의 GLP-1 또는 GLP-2에 비하여 증가된 반감기를 가지면서, 우수한 DPP-4 효소에 대한 저항성을 가짐으로써, 당뇨병, 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군 치료에 있어 기존 약제에 비하여 우수한 약물 효능을 보여, 의약품에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

GLP 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드 및 이의 용도{Fusion Polypeptide Comprising GLP and Immunoglobulin Hybrid Fc and use thereof}
본 발명은 GLP(glucagon like peptide) 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 GLP 또는 이의 유사체에 적합한 면역글로불린 하이브리드 Fc의 발견에 기초한, 기존의 융합 폴리펩타이드에 비해 반감기가 증가되고 효능이 우수한 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 당뇨병, 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본 발명의 범위에 포함된다.
당뇨병은 유전적, 환경적 원인에 의해 인슐린 분비에 문제 또는 인슐린 기능에 이상이 생겨 혈액 속의 포도당이 세포의 에너지원이 되지 못하고 혈중에 높게 남아 있는 고혈당증(hyperglycemia) 증상을 보이는 대사성 질환으로, 합병증을 동반하여 현대에 가장 심각한 만성 질병이다.
당뇨병은 크게 제1형 당뇨병(Type 1 diabetes)와 제2형 당뇨병(Type 2 diabetes)로 분류된다. 제1형 당뇨병은 전체 당뇨병 환자의 10% 미만을 차지하며 주로 소아에서 발병하며 자가면역질환 등에 의해 췌장 β 세포의 파괴에 의해 인슐린 합성 및 분비가 되지 않아 발병하는 것으로 보고되어 있어, 평생 동안 인슐린 주사를 필요로 한다. 반면, 제2형 당뇨병은 전체 당뇨병 환자의 90% 이상을 차지하며 주로 성인에서 발병하며 특히 과체중 및 비만인 성인에게서 발병률이 높고, 췌장으로부터의 인슐린 분비 장애 및 인슐린 저항성이 원인으로 보고되고 있다.
이러한 당뇨병의 치료를 위하여 기본적으로 운동 및 식이요법이 선행되나, 이를 통해 혈당의 조절이 어려울 경우 당뇨병 치료제의 단독 혹은 병용 투여를 진행하게 된다. 미국 당뇨병 학회(ADA)의 가이드라인을 참고하면 1차로 선택되는 약제는 메트포민(metformin)이고, 2차, 3차 약물은 설포닐 요소(sulfonylurea)계, 글리나이드(glinide)계, 티아졸(thiazolidinedione)계 및 DPP-4 저해제 등이며, 이후 GLP-1(glucagon like peptide-1) 아고니스트(agonist) 등의 주사제 또는 인슐린 주사제가 사용되고 있다.
그러나, 현재 임상에서 사용되고 있는 기존 경구용 당뇨 치료제의 경우, 지속적인 혈당의 정상화 유지라는 긍정적인 측면 이외에 장기 복용시 저혈당 유발, 설사, 체중 증가, 심혈관계 문제, 간 독성 등과 같은 다양한 부작용을 일으킬 뿐 아니라 결국에는 췌장의 β 세포가 파괴되고 최후에 인슐린을 주사하게 된다. 또한, 최후의 치료 방법인 인슐린 투여 역시 매일 2-3회 피하주사를 해야 하기 때문에 불편함이 있으며 가장 큰 부작용인 저혈당 유발 가능성이 있다.
이러한 문제점을 보완하기 위하여, 최근 차세대 당뇨병 치료제로 부각되는 것이 GLP-1 이다. GLP-1 및 그의 유사체와 유도체는 제2형 당뇨병 치료를 위한 임상 시험에서 좋은 가능성을 나타내며, 인슐린 분비 자극, 글루카곤 분비 저해, 위 공복화 저해, 위 운동성 또는 장 운동성 저해, 및 체중 감량 유도와 같은 수많은 생물학적 효과를 유도한다. 또한, 장기 복용시에도 췌장 보호 기능이 있으며, 저혈당의 위험이 없고 장기간 적정 혈당을 유지할 수 있다.
그러나, 생체 내에서는 DPP-4 라는 효소에 의하여 상기 GLP-1이 절단되어 불활성화되고, 그에 따라 매우 짧은 생체 내 반감기를 가져 치료제로써의 개발에 어려움이 있다. 이에, 생물학적 활성을 유지하면서 GLP-1의 반감기를 연장시키거나 신체로부터 펩타이드의 제거율을 감소시키기 위하여 다양한 접근법이 수행되어 왔다. 즉, 다양한 GLP-1 유사체의 개발이 활발하게 진행되고 있으며, 면역글로불린 Fc 부위에 GLP-1을 융합시키는 접근법도 시도되어 왔다(미국특허 US 7,452,966 B2 등).
그러나, 그럼에도 불구하고 아직까지 면역글로불린 Fc를 융합하고자 하는 기술의 적용은 반감기의 한계, ADCC 유발능, DPP-4 효소에 대한 안정성 등의 측면에서 상용화되기에는 충분하지 못한 실정이다.
한편, 염증성 장질환(IBD)은 유전적, 면역학적 요인에 의해 발병하는 것으로 생각되고 있으나 아직은 그 원인과 치료법이 명확하지 않은 난치성 질환이다. 소화관 내벽에 발생한 염증이 원인이 되어 나타나는 만성질환이며 크게 궤양성 대장염과 크론병으로 나눌 수 있다.
궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC)은 소화관 중 대장의 점막에 발생하는 만성 염증성 질환으로 염증은 직장에서부터 시작하여 연속적으로 위쪽 대장으로 이어져 있다. 환자들은 설사, 혈변, 복통 등을 호소하는데 식욕 감퇴, 체중 감소, 피로감 등도 비교적 흔히 나타나는 증상이다. 대부분의 경우에 증상이 악화와 호전을 반복하며 때로는 상당히 오랜 기간 동안 증상이 없는 시기가 있기도 한다.
크론병 (Crohn's disease, CD)은 궤양성 대장염과 달리 염증이 장의 전층을 침범하여 병변의 분포도 연속적이지 않고 드문드문 있는 경우가 많다. 증상은 설사, 복통, 식욕 감퇴 등이 흔한 증상이며 증상의 종류와 정도는 환자마다 매우 다양하며 궤양성 대장염에 비하여 환자가 느끼는 괴로움이 더 심한 예가 많으며 장기적인 경과와 치료에 대한 반응도 더 나빠서 수술에 이르게 되는 경우가 많다.
상기 염증성 장질환은 아직까지 원인이 밝혀지지 않았으므로 완치에 이르는 방법은 알려져 있지 않지만, 병의 경과에 미치는 인자에 대해서는 상당한 연구가 이루어져 있으며, 염증을 가라앉히기 위한 여러 가지 약이 개발되어 사용되고 있다. 현재 널리 이용되고 있는 염증성 장질환 치료제는 증상의 경중에 따라 항염증제(5-ASA; 5-AminoSalicylic Acid), 스테로이드 제제, 6-MP(6-mercaptopyrine)과 같은 면역억제제, TNFα억제제(anti-TNFα antibody, Infliximab)와 같은 생물학제제 순으로 단계적으로 사용된다. 그러나, 현재 이용되고 있는 치료제들은 여러 가지 부작용이 나타나고 있으며, 그에 따라 1) 기존 약물을 보완 또는 대체할 수 있는 효능을 가진 생물학적 제제, 또는 2) 기존 약물이 가지는 기전과는 다른 새로운 기전을 이용하는 생물학적 제제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이러한 문제점을 보완하기 위하여, 최근 염증성 장질환 치료제로서 부각되고 있는 것이 GLP-2이다. 장내 L 세포로부터 분비되는 GLP-2는 장내 세포에 발현되는 GLP-2 수용체 신호를 통해 IGF-1과 nitric oxide(NO), Vasoactive Intestinal Peptide(VIP) 등의 생성을 유도하게 된다. 생성된 IGF-1은 PI-3K, AKT 신호전달을 통해 장세포의 성장을 유도하며, NO는 장내 혈류의 개선에 도움을 준다. 또한, GLP-2는 VIP의 생성을 유도함으로써 항염증 작용이 있음이 알려져 있어, 염증성 장질환 뿐만 아니라 단장 증후군(Short bowel syndrome) 등에 효과적인 것이 여러 연구팀에서 실험적으로 입증되고 있다.
실제로, GLP-2 유사체인 Gattex(teduglutide)가 2012년 말에 미국의 NPS pharmaceuticals, Inc.에서 개발되어 단장증후군(short bowel syndrome, SBS) 치료제로 희귀의약품 지정을 받았으며, 적응증을 확대하여 염증성 장질환 환자들에서 임상 2상을 진행 중에 있다.
그러나, 상기 Gattex 역시 천연 GLP-2에 비해서는 혈중 반감기가 크게 증가하였지만, 1일 1회 주사를 맞아야 한다는 면에서 여전히 환자 편의성 면에서의 unmet needs를 충족시키지 못하고 있다. 더구나 염증성 장질환에 적용할 경우 염증성 장질환이 평생을 치료해야 하는 자가 면역질환이라는 것을 고려하면, 최소 주 1회에서 월 1회 투여할 수 있는 장기 지속형 치료제의 형태로 개발되어야 하는 실정이다. 즉, GLP-2는 펩타이드 호르몬이어서 그 지속성이 단백질 치료제에 비해서도 현저히 떨어지므로, 장기 지속력이 문제가 되므로 이를 해결할 방안이 필요하다.
한편, 암세포는 빠르게 증식하고 분열하는 특징이 있으므로 대부분의 항암제는 빠른 성장을 하는 세포를 죽이도록 만들어져 있다. 그러나 일부 정상세포 또한 암세포와 같이 빠르게 증식하기 때문에 항암 화학요법시 정상 세포도 손상을 받게 된다. 정상세포 중에서도 빨리 분열증식하는 세포, 즉 골수에서 형성된 혈액세포, 구강을 포함한 위장관의 상피세포, 머리카락세포, 그리고 정자, 난자를 만들어내는 생식세포 등이 영향을 많이 받는다. 특히 항암제에 의해 위장관의 점막염이 생기는 경우가 흔히 발생하는데 이런 경우에는 설사를 일으키며, 설사가 심한 경우 탈수를 막기 위해 정맥주사로 수액과 영양분을 공급해야 한다. 이로 인하여 예정된 항암 화학요법 일정을 변경하여야 하는 경우 암치료에 막대한 영향을 준다. 따라서 항암화학요법에 의한 장 점막염과 설사를 미연에 방지하는 것은 환자의 고통을 줄이고 항암 효과를 극대화 할 수 있으므로 그 필요성이 크다고 할 수 있다. GLP-2의 경우 소장세포의 융모를 형성하는 장샘세포(crypts cell)의 증식을 유도하여 항암 화학요법에 의한 부작용을 빠르게 치유할 수 있으며, 장기 지속형 GLP-2 유사체의 개발은 항암화학요법 1 사이클(cycle)당 1회의 주사로 항암화학요법에 의한 장 점막염과 설사를 미연에 방지할 수 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 GLP-1 또는 GLP-2와 같은 GLP를 포함하는 짧은 길이의 펩타이드의 체내 반감기를 증가시켜 장기 지속형 치료제로 개발하기 위하여, 기존의 본 발명자들의 선행특허인 국제공개특허 WO2008-147143 에서 제조한 면역글로불린 하이브리드 Fc 기술을 접목하고, 이 중 GLP(glucagon like peptide)에 특이적으로 최적화된 면역글로불린 Fc를 선택하여, 증가된 반감기를 가지면서도 DPP-4 효소에 대해 우수한 저항성을 가지는 융합 폴리펩타이드를 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) GLP(glucagon like peptide) 또는 이의 유사체; 및 (b) 제한된 수의 IgD 힌지 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병, 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 (a) GLP 또는 이의 유사체; 및 (b) 제한된 수의 IgD 힌지 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
구체적으로, 상기 융합 폴리펩타이드는 (a) GLP 또는 이의 유사체; (b) 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 상기 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드는 (i) 서열번호 25의 C-말단으로부터 35 내지 49개의 연속된 아미노산 서열로 이루어진, 분리된 IgD 힌지 영역; 및 (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어진 CH2 및 CH3 영역을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 GLP 또는 이의 유사체의 C-말단이 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드의 N-말단과 결합된 것일 수 있으며, 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드 내에서는 IgD 힌지 영역의 C-말단이 CH2 및 CH3 영역의 N-말단과 결합된 것일 수 있다. 그에 따라, N-말단으로부터 C-말단 방향으로 GLP 또는 이의 유사체; IgD 힌지 영역; 및 CH2 및 CH3 영역이 차례로 결합되어 포함되는 것일 수 있다. 본 발명에서 "융합 폴리펩타이드"는 상기 GLP와 같은 생물학적 활성 분자와 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드가 융합된 형태를 의미하며, "Fc 융합 폴리펩타이드", "융합 단백질"과 같은 용어와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 상기 GLP(glucagon like peptide, 글루카곤 유사 펩타이드)는 GLP-1 또는 GLP-2를 모두 포함하는 개념이다.
GLP-1과 GLP-2 peptide는 생체 내에서의 작용 기전 및 역할은 상이하나, proglucagon gene에서 하나의 mRNA 전구체로부터 생성되는 peptide로 아미노산 서열의 상동성이 높고 DPP-4 효소에 의해 절단되는 부위가 동일하며 분자적 특성이 유사한 호르몬이기 때문에, GLP-1 또는 GLP-2를 포함하는 GLP(glucagon like peptide)는 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드 융합시 유사한 형태가 적용될 수 있다. 구체적으로는, 상기 GLP는 본 발명자들에 의해 개발된 하이브리드 Fc(hybrid Fc, hyFc) 폴리펩타이드와의 융합시, 유사한 형태의 hyFc가 적용될 수 있다.
본 발명의 용어 "GLP-1(glucagon like peptide-1)"은, 소화기관에서 분비되는 호르몬인 인크레틴의 일종으로, 섭취에 의존적으로 장관 내의 L 세포에서 분비되어 췌장의 인슐린 분비를 증가시키는 역할과 글루카곤의 분비를 억제하여 이로 인해 식후 혈당의 상승을 억제하는 역할을 하는 것으로 알려진 단백질이다. 이렇듯, GLP-1은 기존에 당뇨병 치료 용도가 널리 알려져 있었으며, 식욕의 생리적 조절에도 관여하여 체중 감소 효과도 보고되어 있다.
한편, 상기 천연 GLP-1은 처음 6개의 아미노산이 분자로부터 절단되도록 생체 내에서 가공된다. 따라서, 당업계에서의 관행에 의해, GLP-1의 아미노 말단은 7번으로, 카르복시-말단은 37번으로 지정된다. 상기 가공에 따라 인슐린 분비 기능이 없는 형태인 GLP-1(1-37)에서 GLP-1(7-37) 형태로 프로세싱되어 활성형 GLP-1(7-37)(서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 33의 핵산 서열)이 될 수 있으며, C-말단 글리신 잔기가 제거되고 아미드 기로 대체되도록 생체 내에서 추가로 변형되어 GLP-1(7-36)아미드(서열번호 13의 아미노산 서열 및 서열번호 35의 핵산 서열)의 형태가 될 수 있다. 따라서, GLP-1(7-37)OH와 GLP-1(7-36)아미드는 두 가지 천연형 GLP-1에 해당된다.
그러나, 생체 내에서 DPP-4 효소에 의해 매우 빠른 속도로 절단되어 불활성화되는 등 약물로 개발하는 데에 많은 어려움이 있어, 생체 내 반감기를 증가시키기 위하여 다양한 시도들이 있어왔다. 이에 상기 GLP-1에 변이를 일으켜 DPP-4 효소에 의한 절단을 줄여 GLP-1 유사체를 제조하고자 하는 시도가 있어왔으며, 그에 따라 상기 GLP-1 유사체는 상기 목적을 달성하기 위하여 당업계에 공지된 유사체를 제한없이 사용할 수 있다.
구체적으로, 8번 위치의 아미노산의 치환은 DPP-4 효소가 GLP-1을 불활성화시키는 속도를 감소시킬 수 있으며, 22번 위치의 아미노산의 치환은 분자가 응집할 가능성을 감소시키고 분자의 효능을 증가시킬 수 있으며, 36번 위치의 아미노산의 치환은 융합 단백질이 인간에서 반복되고 지속된 투여 후에 중화 면역 반응을 유도할 위험을 감소시킬 수 있다. 따라서, 이에 제한되지는 않으나, 상기 8번, 22번 및 36번 위치의 아미노산이 치환된 형태의 유사체를 사용할 수 있으며, 그 밖에도 미국특허 US 7,452,966 B2 등에 개시된 바와 같이 33번, 34번 및 37번 위치의 아미노산이 치환된 형태의 유사체를 사용할 수도 있다.
보다 구체적인 한 가지 예로, 상기 GLP-1의 유사체는 바람직하게는 DDP-4 효소에 의한 절단 부위가 변이된 것일 수 있다. DPP-4 효소는 상기 GLP-1의 8번 및 9번 아미노산 사이에서 GLP-1을 절단하는데, 그에 따라 8번 아미노산인 알라닌(A)이 글라이신(G) 또는 발린(V)으로 치환된 GLP-1 유사체는 DPP-4 효소에 의한 절단을 줄일 수 있다.
또한, 상기 22번 아미노산인 글라이신(G)은 글루탐산(E)으로 치환된 것일 수 있으며, 36번 아미노산인 아르기닌(R)은 글라이신(G)으로 치환된 것일 수 있다.
그에 따라, 바람직하게는 상기 GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)으로부터 8번, 22번 및/또는 36번 아미노산이 치환된 형태인 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 유사체일 수 있으며, GLP-1(7-36)으로부터 8번, 22번 및/또는 36번 아미노산이 치환된 형태인 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 유사체일 수 있다. 또한, 보다 바람직하게는 DPP-4 효소에 의한 절단 부위인 8번 아미노산이 변이된 서열번호 2, 3, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23 또는 24의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 유사체일 수 있으며, 가장 바람직하게는 8번 아미노산인 알라닌(A)이 글라이신(G)으로 치환된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 유사체일 수 있다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 유사체는 서열번호 34의 핵산 서열로 코딩될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 유사체를 이용하여 그 효능을 확인하였다. 상기 GLP-1 유사체의 변이 위치를 하기 표에 정리하였다.
GLP-1(7-37) GLP-1(7-36)
서열번호 변이 위치 서열번호 변이 위치
2 A8G 14 A8G
3 A8V 15 A8V
4 G22E 16 G22E
5 R36G 17 R36G
6 A8G G22E 18 A8G G22E
7 A8V G22E 19 A8V G22E
8 A8G R36G 20 A8G R36G
9 A8V R36G 21 A8V R36G
10 G22E R36G 22 G22E R36G
11 A8G G22E R36G 23 A8G G22E R36G
12 A8V G22E R36G 24 A8V G22E R36G
본 발명의 용어 "GLP-2(glucagon like peptide-2)"는, 장의 장내분비 L 세포 및 뇌의 특정 영역에서 프로글루카곤 전구체 형태로 생성되어, 장내 효소에 의한 효소 절단을 통해 생성되는 33개의 짧은 아미노산(서열번호 44)을 갖는 펩타이드 호르몬으로서, 음식의 섭취와 함께 영양분 소화에 반응하여, 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 옥신토모듈린 및 글리센틴과 함께 동시 분비된다.
상기 GLP-2는 염증성 장질환 뿐만 아니라, 단장 증후군(Short bowel syndrome, SBS) 등에 효과적인 것이 널리 알려져 있었다. 실제로 GLP-2 유사체인 Gattex(teduglutide)가 2012년 말에 미국의 NPS pharmaceuticals, Inc.에서 개발되어 단장증후군 치료제로 희귀의약품 지정을 받았으며, 현재 적응증을 확대하여 염증성 장질환 환자들에서 임상 2상을 진행 중에 있다.
상기 GLP-2는 33개 아미노산 펩타이드로서 분비되는데, 상기 GLP-1과 마찬가지로 DPP-4 효소에 의해 절단될 수 있다. 구체적으로 DPP-4 효소에 의해 2번 아미노산인 알라닌(A)에서 매우 빠르게 절단되어 불활성 인간 GLP-2를 생성함으로써, 생체 내 반감기가 짧아져 약물로 개발하는 데에 어려움이 있었다. 이에, 상기 GLP-2에도 변이를 일으켜 DPP-4 효소에 의한 절단을 줄여 GLP-2 유사체를 제조하고자 하는 시도가 있어왔으며, 그에 따라 상기 GLP-2 유사체는 상기 목적을 달성하기 위하여 당업계에 공지된 유사체를 제한없이 사용할 수 있다.
구체적으로, 2번 위치의 아미노산의 치환은 DPP-4 효소가 GLP-2를 불활성화시키는 속도를 감소시킬 수 있다. 즉, 2번 아미노산인 알라닌(A)이 글라이신(G), 세린(S) 또는 발린(V)으로 치환된 GLP-2 유사체는 DPP-4 효소에 의한 절단을 줄일 수 있다. 또한, 다른 한가지 예로, 미국특허 US 2007/0117752 A1에 개시된 GLP-2 유사체를 사용할 수 있다. 구체적으로, 2번 위치, 및 3, 5, 7, 10 및 11 위치의 아미노산의 추가 치환, 및/또는 31 내지 33 위치의 아미노산의 결실, 및/또는 N-말단 또는 C-말단에 안정화 펩타이드 서열의 부가와 함께, 8, 16, 24 및 28 위치의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 2번 위치의 아미노산인 알라닌(A)은 글라이신(G), 세린(S) 또는 발린(V)으로, 3번 위치의 아미노산인 아스파르트산(D)은 글루탐산(E)으로, 5번 위치의 아미노산인 세린(S)은 트레오닌(T)으로, 6번 위치의 아미노산인 페닐알라닌(F)은 프롤린(P)으로, 7번 위치의 아미노산인 세린(S)은 트레오닌(T)으로, 8번 위치의 아미노산인 아스파르트산(D)은 세린(S)으로, 9번 위치의 아미노산인 글루탐산(E)은 아스파르트산(D)으로, 10번 위치의 아미노산인 메티오닌(M)은 류신(L), 노르류신(Nle), 또는 산화적으로 안정한 Met-대체 아미노산으로, 11번 위치의 아미노산인 아스파라진(N)은 알라닌(A), 라이신(K) 또는 세린(S)으로, 12번 위치의 아미노산인 트레오닌(T)은 라이신(K)으로, 13번 위치의 아미노산인 이소류신(I)은 글루탐산(E) 또는 글루타민(Q)으로, 14번 위치의 아미노산인 류신(L)은 메티오닌(M) 또는 노르류신(Nle)으로, 15번 위치의 아미노산인 아스파르트산(D)은 글루탐산(E)으로, 16번 위치의 아미노산인 아스파라진(N)은 알라닌(A)으로, 17번 위치의 아미노산인 류신(L)은 글루탐산(E)으로, 19번 위치의 아미노산인 알라닌(A)은 트레오닌(T)으로, 20번 위치의 아미노산인 아르기닌(R)은 라이신(K)으로, 21번 위치의 아미노산인 아스파르트산(D)은 이소류신(I)으로, 24번 위치의 아미노산인 아스파라진(N)은 알라닌(A) 또는 글루탐산(E)으로, 28번 위치의 아미노산인 글루타민(Q)은 알라닌(A) 또는 아스파라진(N)으로 치환될 수 있으며, 31번 위치의 아미노산인 이소류신(I)은 프롤린(P)으로 치환되거나 결실될 수 있고, 32번 위치의 아미노산인 트레오닌(T)은 결실될 수 있으며, 33번 위치의 아미노산인 아스파르트산(D)은 아스파라진(N)으로 치환되거나 결실될 수 있다.
상기 다양한 변이가 GLP-2에 가해질 수 있으며, 이로 제한되지는 않으나, 가장 바람직하게는 2번 아미노산인 알라닌(A)이 글라이신(G)으로 치환된 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 GLP-2 유사체, 또는 발린(V)으로 치환된 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 GLP-2 유사체일 수 있다. 상기 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 GLP-2 유사체는 서열번호 51의 핵산 서열로 코딩될 수 있다.
본 발명은 상기와 같이 생체 내에서 DPP-4 효소에 의해 빠르게 절단되어 불활성화되는 GLP(GLP-1 또는 GLP-2), 또는 이의 유사체가 치료 약물로 적절하게 사용되기 어렵다는 문제점을 인식하고, 그를 해결하기 위하여 GLP-1 또는 GLP-2에 적합한 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 개발하여 이를 융합한 융합 폴리펩타이드를 제조한 데에 기술적 특징이 있다. 구체적으로는, GLP-1 또는 GLP-2의 생체 내 반감기를 현저하게 증가시킴으로써 GLP-1 또는 GLP-2가 생체 내에서 지속적으로 약물 효능을 발휘할 수 있게 하고자 하였다. 추가적으로, 혈청 내 안정성, DPP-4 저항성, 및 약력학적 프로파일 등의 측면에서도 우수한 융합 폴리펩타이드를 제조하였다.
이를 위하여, 본 발명에서는 먼저 선행특허인 국제공개특허 WO2008-147143 에서 제조한 면역글로불린 하이브리드 Fc 기술에 따른 hyFc5를 상기 GLP-1 또는 GLP-2에 융합하여 융합 폴리펩타이드를 제조하고자 하였다. 본 발명에서 용어 "하이브리드(hybrid)"는 서로 다른 기원의 둘 또는 그 이상의 면역글로불린 Fc 단편을 코딩하는 서열이 단일-사슬 면역글로불린 Fc 단편에 존재함을 의미한다. 상기 hyFc5는 30개 아미노산 길이의 IgD 힌지 영역을 포함하는 hyFc로, 크기가 큰 단백질(Large protein)에 적용시에는 매우 큰 반감기 증가 효과를 나타내었으나, 상대적으로 짧은 길이의 펩타이드(Short peptide), 예컨대 본 발명의 GLP-1 또는 GLP-2에 적용 시에는 상기와 같이 크기가 큰 단백질에 적용한 것에 비해 그 효과가 크지 않아, 이보다 더 개량된 효과를 나타내는 융합 폴리펩타이드를 제조하게 된 것이다.
본 발명에서 용어, "면역글로불린 Fc 단편" 또는 "면역글로불린 Fc"는 면역글로불린의 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역(CL)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 Fc는 힌지 영역을 더 포함할 수 있으며, 본 발명의 목적상 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)은 포함하나, 중쇄 불변 영역(CH1)은 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, CH2 도메인 영역 및 CH3 도메인 영역을 포함할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 하이브리드 면역글로불린 Fc 단편일 수 있으며, 그에 따라 상기 힌지 영역은 인간 Ig 힌지 영역을 포함할 수 있고, 상기 CH2 도메인 영역은 인간 IgD와 IgG4 CH2 도메인의 아미노산 잔기 부분을 포함할 수 있으며, 상기 CH3 도메인 영역은 인간 IgG4 CH3 도메인의 아미노산 잔기 부분을 포함할 수 있다.
본 발명의 GLP 또는 이의 유사체에 융합될 수 있는 적합한 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드는 35 내지 49개 아미노산 길이의 IgD 힌지 영역을 포함하는 데에 특징이 있다. 상기 힌지 영역은 기본적으로는 GLP-1 또는 GLP-2와 같은 생물학적 활성 분자와 결합 시에 유연성(flexibility)을 유지하여 그 구조를 유지시킬 수 있는 역할을 하는 것이다. 구체적으로는, IgD 힌지 영역인 서열번호 25의 아미노산 서열(서열번호 36의 핵산 서열로 코딩됨) 중에서 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 35 내지 49개의 연속된 아미노산 서열을 가지는 분리된 IgD 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 서열번호 25의 아미노산 서열 중에서 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 35 내지 40개의 연속된 아미노산 서열을 가지는 IgD 힌지 영역일 수 있으며, 보다 바람직하게는 35개 또는 40개의 연속된 아미노산 서열을 가지는 IgD 힌지 영역, 보다 더 바람직하게는 40개의 연속된 아미노산 서열을 가지는 IgD 힌지 영역일 수 있다. 상기 서열번호 25의 아미노산 서열 중 35개의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 IgD 힌지 영역을 서열번호 26, 40개의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 IgD 힌지 영역을 서열번호 27, 49개의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 IgD 힌지 영역을 서열번호 28으로 표시하였으며, 서열번호 26의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 서열번호 37, 서열번호 27의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 서열번호 38, 서열번호 28의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 서열번호 39로 각각 표시하였다.
본 발명에서 상기와 같은 IgD 힌지 영역에 결합되는 면역글로불린 Fc CH2 및 CH3 영역은 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 약동학적 및 약물 효능을 변화시키지 않거나, ADCC 및/또는 CDC와 같은 세포 독성을 일으키지 않는 한 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 본 발명자들에 의해 개발된 IgD 및 IgG4의 하이브리드 Fc CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 서열번호 29의 아미노산 서열 또는 서열번호 40의 핵산 서열로 코딩되는 아미노산 서열로 이루어진 CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있다.
상기와 같은 GLP 또는 이의 유사체; IgD 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드가 결합되어, 최종적으로 본 발명의 융합 폴리펩타이드가 구성될 수 있다.
이에 제한되지는 않으나, 그 예로 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 GLP-1이 포함되는 경우, 상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 30 내지 32으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 30 또는 31의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 또는 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 서열번호 30의 아미노산 서열은 본 발명의 서열번호 2의 GLP-1 유사체, 서열번호 26의 IgD 힌지 영역, 및 서열번호 29의 CH2 및 CH3 영역이 결합된 형태로 'GLP-1-hyFc8'로 표시되며, 서열번호 31의 아미노산 서열은 본 발명의 서열번호 2의 GLP-1 유사체, 서열번호 27의 IgD 힌지 영역, 및 서열번호 29의 CH2 및 CH3 영역이 결합된 형태로 'GLP-1-hyFc9'로 표시되며, 서열번호 32의 아미노산 서열은 본 발명의 서열번호 2의 GLP-1 유사체, 서열번호 28의 IgD 힌지 영역, 및 서열번호 29의 CH2 및 CH3 영역이 결합된 형태로 'GLP-1-hyFc11'로 표시된다.
또한, 다른 예로 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 GLP-2가 포함되는 경우, 상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 47 내지 49으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 48 또는 49의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 또는 서열번호 49의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 서열번호 47의 아미노산 서열은 본 발명의 서열번호 45의 GLP-2 유사체, 서열번호 26의 IgD 힌지 영역, 및 서열번호 29의 CH2 및 CH3 영역이 결합된 형태로 'GLP-2-hyFc8'로 표시되며, 서열번호 48의 아미노산 서열은 본 발명의 서열번호 45의 GLP-2 유사체, 서열번호 27의 IgD 힌지 영역, 및 서열번호 29의 CH2 및 CH3 영역이 결합된 형태로 'GLP-2-hyFc9'로 표시되며, 서열번호 49의 아미노산 서열은 본 발명의 서열번호 45의 GLP-2 유사체, 서열번호 28의 IgD 힌지 영역, 및 서열번호 29의 CH2 및 CH3 영역이 결합된 형태로 'GLP-2-hyFc11'로 표시된다.
본 발명의 일 실시예에서는 먼저 본 발명자들이 기존에 개발하였던 30개의 아미노산 서열로 구성된 IgD 힌지 영역을 포함하는 hyFc5를 GLP-1에 결합하여 GLP-1-hyFc5를 제조하였으며(도 1), 이의 반감기를 기존의 GLP-1 단독의 펩타이드와 비교한 결과 반감기가 증가하였다. 하지만, hyFc5를 짧은 길이의 펩타이드(Short peptide)인 GLP-1에 적용시 나타나는 반감기 증가 효과는, hyFc5를 크기가 큰 단백질(Large protein)에 적용했을 때 나타나는 효과만큼 높지는 않음을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명자들은 GLP-1에 적용 시 hyFc5 보다 더 우수한 효능을 나타내는 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 찾고자 하였으며, 그 결과, GLP-1 또는 GLP-2와 같은 짧은 길이의 펩타이드의 경우에는 힌지 영역의 길이를 증가시키는 경우 우수한 반감기와 함께 우수한 활성을 갖는 융합 폴리펩타이드의 제조가 가능함을 발견하였다. 즉, 상기 IgD 힌지 영역에는 단백질 분해 효소(protease)에 의해 분해되기 쉬운, 상기 효소에 민감한 절단 부위가 있는데, 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드에 결합되는 생리활성 단백질의 크기가 클 경우에는 상기 절단 부위가 노출되지 않아 문제가 없었으나, GLP-1 또는 GLP-2와 같은 짧은 길이의 펩타이드의 경우에는 절단 부위가 노출됨으로 인해, Fc 폴리펩타이드 융합을 통해 예상한 만큼의 반감기 증가 효과가 나타나지 않는 문제점이 있었다. 그러나, 힌지 영역의 길이를 증가시키게 되면 이러한 문제점이 해소될 수 있다는 가능성을 확인한 것이다.
이에, 본 발명의 일 실시예에서는 40개의 아미노산 서열로 구성된 IgD 힌지 영역을 가지는 hyFc9을 제조하였으며(도 2), 이를 기반으로 35개의 아미노산 서열로 구성된 IgD 힌지 영역을 가지는 hyFc8 및 49개의 아미노산 서열로 구성된 IgD 힌지 영역을 가지는 hyFc11을 제조하여, 최종적으로 GLP-1-hyFc9, GLP-1-hyFc8 및 GLP-1-hyFc11 융합 폴리펩타이드를 제조하였다. 또한, 상기 제조된 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 PK 프로파일을 측정한 결과, GLP-1 단독의 펩타이드보다는 물론, GLP-1-hyFc5보다도 훨씬 더 증가된 반감기를 가져(도 5 및 6), 보다 효과적인 약물 효능을 보일 수 있을 것임을 확인하였다.
또한, 상기 융합 폴리펩타이드 중 대표적인 융합 폴리펩타이드로서 GLP-1-hyFc9을 대상으로 기존의 GLP-1-hyFc5과 다양한 효능을 비교한 결과, 혈청 내 안정성(도 7), DPP-4 저항성(도 8), 및 PD 프로파일(도 9)의 모든 측면에 있어서 월등히 우수한 것을 확인하였다. 또한, 체중감소효능도 우수한 것을 확인하였다(도 10).
아울러, 본 발명의 다른 일 실시예에서는 상기 GLP-1-hyFc9에 대하여, GLP-1-linker-IgG4-mut (미국특허 US 7,452,966 B2)와 ADCC 저해능을 비교한 결과, GLP-1-hyFc9이 ADCC 저해능이 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 11). 실질적으로 상기 GLP-1-linker-IgG4-mut 는 ADCC를 막기 위하여 면역글로불린 Fc의 일부 아미노산 부위에 변이를 가한 것임에도 불구하고, 본 발명의 GLP-1-hyFc9는 이보다 더 우수한 ADCC 저해능을 갖는 것이다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 GLP-1과 마찬가지로, GLP-2에 대해서도 융합 폴리펩타이드를 제조하였다. 구체적으로, 40개의 아미노산 서열로 구성된 IgD 힌지 영역을 가지는 GLP-2-hyFc9을 제조하였으며(도 3), 이를 기반으로 35개의 아미노산 서열로 구성된 IgD 힌지 영역을 가지는 GLP-2-hyFc8 및 49개의 아미노산 서열로 구성된 IgD 힌지 영역을 가지는 GLP-2-hyFc11을 제조하였다. 상기 제조된 융합 폴리펩타이드 중 GLP-2-hyFc9은 GLP-2-hyFc5에 비해서도 증가된 반감기를 가짐을 확인하였다(실시예 2-4).
더불어, 본 발명의 다른 일 실시예에서는 상기 GLP-2-hyFc9의 다양한 생물학적 활성을 확인한 결과, 염증을 감소시킬 수 있는 cAMP 활성이 감소되지 않으며(도 12), 염증성 장질환 치료효과(도 13), 장상피세포 증식 유도 효과(도 14), 소장 성장 촉진효과(도 15), 설사 및 치사율 감소효과(도 16 및 17) 등이 모두 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 비교군에 비해 적은 처리에도 불구하고 우수한 효능이 유지됨을 확인하였다.
이러한 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 기존의 GLP-1 또는 GLP-2에 비하여 증가된 반감기를 가지는 것이며, 특히 GLP-1을 포함하는 융합 폴리펩타이드는 우수한 혈당 강하 효능, 체중 감소 효능 및 DPP-4 효소에 대한 저항성을 가짐으로써 당뇨병 치료 등에 유용하게 사용될 수 있고, GLP-2를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 소장 성장 촉진 효능을 가짐으로써 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 것이다.
이에, 본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 융합 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 치료용 약학적 조성물, 및 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 당뇨병, 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군 치료를 위한 약제를 제조하기 위한, 상기 융합 폴리펩타이드의 용도를 제공한다.
또한, 또 다른 하나의 양태로서, 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병, 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군 치료 방법을 제공한다.
이때, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병일 수 있으며, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염 또는 크론병일 수 있다.
또한, 상기 장 점막염 및 설사는 항암화학요법에 의해 유발된 것일 수 있으며, 이때 상기 항암화학요법은 장 점막염 및 설사를 유발할 수 있는 모든 화학요법이라면 제한되지 않으며, 예컨대 5-플루오로우라실(5-FU), 이리노테칸(irinotecan), 류코보린(leucovorin) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin) 등일 수 있다.
하나의 예로서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 기존에 당뇨병 치료제로 널리 알려진 GLP-1 또는 이의 유사체를 포함함으로써 당뇨병 치료에 유용하게 사용할 수 있으며, 기존의 약제에 비하여 증가된 반감기와 함께, 우수한 혈당 강하 효능을 가지며, DPP-4 효소에 대한 저항성이 증가됨으로써, 기존 약물보다 우수한 프로파일을 가지고 의약품에 적용될 수 있다.
또한, 다른 예로서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 기존에 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군 치료제로 널리 알려진 GLP-2 또는 이의 유사체를 포함함으로써 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군의 치료에 유용하게 사용할 수 있으며, 기존의 약제에 비하여 증가된 반감기를 가져 기존 약물보다 우수한 프로파일을 가지고 의약품에 적용될 수 있다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 광범위하게 다양한 질환 및 증상을 치료하는데 사용될 수 있다.
하나의 예로서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 포함된 GLP가 GLP-1일 때, 일차적으로 "GLP-1 수용체"로 언급되는 수용체에 작용함으로써 그들의 생물학적 효과를 발휘한다. 따라서 GLP-1 수용체 자극 또는 GLP-1 화합물의 투여에 우호적으로 반응하는 질환 및/또는 증상을 갖는 대상체는 본 발명의 융합 폴리펩타이드로 치료될 수 있다. 이들 대상체는 "GLP-1 화합물로의 치료를 필요로 한다" 또는 "GLP-1 수용체 자극을 필요로 한다"라고 말해진다. 비-인슐린 의존성 당뇨병, 인슐린 의존성 당뇨병, 졸중(WO 00/16797 참조), 심근경색(WO 98/08531 참조), 비만(WO 98/19698 참조), 수술 후 이화 변화(미국특허 제6,006,753호 참조), 기능성 소화불량 및 과민성 대장 증후군(WO 99/64060 참조)을 갖는 대상체가 포함된다. GLP-1 화합물로의 예방적 치료를 요구하는 대상체, 예를 들어 비-인슐린 의존성 당뇨병이 발병할 위험이 있는 대상체(WO 00/07617 참조)도 포함된다. 손상된 글루코스 내성 또는 손상된 절식 글루코스를 갖는 대상체, 체중이 대상체의 신장과 체격에 대한 정상 체중의 약 25％를 상회하는 대상체, 부분적 췌장절제술을 시술받은 대상체, 한 사람 이상의 부모가 비-인슐린 의존성 당뇨병에 걸린 대상체, 임신성 당뇨에 걸렸던 대상체, 및 급성 또는 만성 췌장염에 걸렸던 대상체는 비-인슐린 의존성 당뇨병이 발병할 위험이 있다.
또한, 다른 예로서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 포함된 GLP가 GLP-2일 때, 위 및 장 관련 장애의 치료 및 예방, 예컨대 골다공증 및 DPP-4 매개 증상, 손상된 장 기능을 가진 신생아의 치료 등을 위하여 사용될 수 있다. 위 및 장 관련 장애의 예로는 궤양, 위염, 소화 장애, 흡수장애 증후군, 짧은 창자 증후군, 맹관(cul-de-sac) 증후군, 염증성 장 질환, 글루텐에 의해 유도된 장병증 또는 만성소화장애증으로부터 발병된 비열대성 스프루우(celiac sprue), 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증성 스프루우, 장염, 국소성 장염(크론병), 궤양성 결장염, 설사와 관련된 자극성 장 증후군, 소장 손상, 단장 증후군, 및 항암 화학요법에 의한 장점막염, 항암 화학요법에 의한 설사 등이 포함될 수 있다. 또한, 다른 증상으로서 방사선 장염, 감염성 또는 감염 후 장염, 및 독성 물질 또는 다른 화합요법제로 인한 소장 손상이 포함될 수 있다.
본 발명에 기재된 융합 폴리펩타이드의 유효량은 GLP-1 또는 GLP-2 수용체 자극을 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 허용될 수 없는 부작용을 유발하지 않으면서 목적하는 치료 및/또는 예방 효과를 가져오는 양이다. "목적하는 치료 효과"는 하기 중 하나 이상을 포함한다. 1) 질환이나 증상과 관련된 징후(들)의 경감; 2) 질환이나 증상과 관련된 징후 개시의 지연; 3) 치료하지 않은 경우와 비교하여 증가된 수명; 및 4) 치료하지 않은 경우와 비교하여 더 높은 질의 삶. 예를 들어, 당뇨병을 치료하기 위한 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 "유효량"은 치료하지 않은 경우에 비해 혈당 농도의 더 큰 제어를 일으킴으로써, 망막증, 신경장해 또는 신장 질환과 같은 당뇨합병증 발병의 지연을 일으키는 양이다. 당뇨병을 예방하기 위한 융합 폴리펩타이드의 "유효량"은 치료하지 않은 경우와 비교하여, 설포닐 우레아, 티아졸리딘디온, 인슐린 및(또는) 비스구아니딘과 같은 항-저혈당 약물로의 치료를 요구하는 상승된 혈당 수준의 발병을 지연시키는 양이다.
본 발명의 일 실시예에서는 반감기 확인을 통한 PK 프로파일을 확인한 실험 이외에도, 본 발명의 융합 폴리펩타이드가 당뇨병 치료를 위한 약물 효능에 있어서도 우수함을 확인하였다. 구체적으로, in vivo 실험에서 GLP-1-hyFc9 융합 폴리펩타이드의 약력학적 프로파일(PD profile)을 확인한 결과, GLP-1-hyFc5에 비하여 월등히 우수한 혈당 강하 효능을 가짐을 확인하였으며(도 9), in vitro 상에서도 DPP-4 효소에 대한 저항성이 월등히 우수하여 DPP-4 효소에 대한 안정성 측면에서도 우수한 효능을 가짐을 확인하였다(도 8). 당뇨병 치료에 있어서, 혈중 글루코스 함량의 유지가 중요하며, DPP-4 저해제가 일반적으로 당뇨병 치료제로 사용됨을 고려할 때, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 당뇨병 치료에 있어서 우수한 약물로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 투여로 당뇨병, 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 당뇨병, 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군의 치료 효과를 나타낼 수 있다면, 유효 성분인 융합 폴리펩타이드를 다양한 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 또는 당뇨병, 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군 치료 효과를 나타내는 기타 약물과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 상기 투여는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 제한되지 않는다. 예를 들어 관절내 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 4주에 1회, 2주에 1회 또는 1주에 1회 투여되는 것이 바람직하다. 치료되는 질환에 따라, 융합 폴리펩타이드는 1주에 2 내지 3회와 같이 더 빈번하게 투여하는 것이 필요할 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 상기에서 설명한 융합 폴리펩타이드에 기술적 특징이 있으며, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터, 및 이를 포함하는 숙주 세포 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있으며, 상기 융합 폴리펩타이드의 발현이 가능한 한 그 종류에는 제한이 없다.
상기 폴리뉴클레오티드는 이에 제한되지는 않으나, 그 예로 'GLP-1-hyFc8'를 코딩하는 서열번호 41의 핵산 서열, 'GLP-1-hyFc9'을 코딩하는 서열번호 42의 핵산 서열, 또는 'GLP-1-hyFc11'을 코딩하는 서열번호 43의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 41 또는 42의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 또는 서열번호 42의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 다른 예로 'GLP-2-hyFc8'를 코딩하는 서열번호 52의 핵산 서열, 'GLP-2-hyFc9'을 코딩하는 서열번호 53의 핵산 서열, 또는 'GLP-2-hyFc11'을 코딩하는 서열번호 54의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 53 또는 54의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 또는 서열번호 54의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 발현되는 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 기존의 GLP-1 또는 GLP-2에 비하여 증가된 반감기를 가지면서, 우수한 DPP-4 효소에 대한 저항성을 가짐으로써, 당뇨병, 염증성 장질환, 항암화학요법에 의한 장 점막염 및 설사, 또는 단장 증후군 치료에 있어 기존 약제에 비하여 우수한 약물 효능을 보여, 의약품에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 GLP-1-hyFc5의 제조에 관한 그림으로서, GLP-1-hyFc5의 개략도 및 GLP-1-hyFc5의 서열을 나타낸다.
도 2는 GLP-1-hyFc9의 제조에 관한 그림으로서, GLP-1-hyFc5 및 GLP-1-hyFc9의 서열 및 개략도를 나타낸다.
도 3은 GLP-2-hyFc9의 제조에 관한 그림으로서, GLP-2-hyFc5 및 GLP-2-hyFc9의 개략도를 나타낸다.
도 4는 GLP-1 펩타이드와 GLP-1-hyFc5의 PK 프로파일을 확인한 그래프이다.
도 5는 GLP-1-hyFc5 및 GLP-1-hyFc9의 PK 프로파일에 관한 그림으로서, 각 시간별 혈액 내에 잔존하는 단백질량 및 약물농도 곡선 하 면적(AUC) 값으로 나타내었다.
도 6은 GLP-1-hyFc5, GLP-1-hyFc8 및 GLP-1-hyFc9의 PK 프로파일에 관한 그림으로서, 각 시간별 혈액 내에 잔존하는 단백질량으로 나타내었다.
도 7은 GLP-1-hyFc5 및 GLP-1-hyFc9의 혈청 내 안정성을 확인한 그림으로서, 각 반응시간별 잔존하는 단백질량 및 시간 그래프의 곡선 하 면적(AUC) 값으로 나타내었다.
도 8은 GLP-1-hyFc5 및 GLP-1-hyFc9의 DPP-4 저항성을 확인한 그림으로서, 각 반응시간별 잔존하는 단백질량 및 시간 그래프의 곡선 하 면적(AUC) 값으로 나타내었다.
도 9는 GLP-1-hyFc5 및 GLP-1-hyFc9의 PD 프로파일에 관한 그림으로서, 혈중 글루코스의 농도 변화를 측정하여 AUC 값을 구하여 음성 대조군 대비 AUC 함량 %로 나타내었다.
도 10은 GLP-1-hyFc9의 체중감소 효능을 확인한 그림으로서, 체중 변화량 및 누적 식이 섭취량을 나타내었다.
도 11은 GLP-1-hyFc9 및 GLP-1-linker-IgG4-mut의 ADCC 저해능을 비교한 그림으로서, Fcγ 수용체에 대한 결합능을 확인하였다.
도 12는 GLP-2, GLP-2-hyFc5 및 GLP-2-hyFc9의 in vitro 생물학적 활성을 확인한 그림으로서, cAMP에 의해 유도되는 막탈분극을 측정한 결과를 나타내었다.
도 13은 GLP-2-2G 및 GLP-2-hyFc9의 염증성 장질환 치료 효과에 관한 그림으로서, 인도메타신을 투여하여 유도한 염증성 장질환 모델에서 체중 변화, TNF-a 발현량 변화 및 소장 길이 변화를 나타내었다.
도 14는 GLP-2-2G 및 GLP-2-hyFc9의 장상피세포 증식 유도 효과를 확인한 그림이다.
도 15는 GLP-2-hyFc9의 소장 성장 촉진효과를 확인한 그림으로서, 소장의 무게를 나타내었다.
도 16은 GLP-2-hyFc9의 설사 감소 효과를 확인한 그림으로서, 5-FU에 의해 유도된 설사의 감소 효과를 나타내었다.
도 17은 GLP-2-hyFc9의 치사율 감소 효과를 확인한 그림으로서, 5-FU에 의해 설사가 유도되어 발생한 치사율의 감소 효과를 나타내었다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: GLP-hyFc 융합단백질의 제조
1-1: GLP-1-hyFc5, GLP-1-hyFc9, GLP-1-hyFc8 및 GLP-1-hyFc11의 제조
GLP-1 (Glucagon like peptide-1) 의 경우 당뇨병 치료에 효과적인 단백질이지만, 생체 내 DPP-4 효소에 의해 매우 빠른 속도로 절단(cleavage)되고, 반감기(half-life)가 약 3 내지 5분으로 매우 짧기 때문에 약물로서 개발하는 데에 많은 어려움이 있어 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 많은 시도들이 있어왔다.
이에, 먼저 상기 DPP-4 효소에 의한 절단을 줄이기 위하여, GLP-1(7-37)을 기반으로, DPP-4 효소에 의한 절단 부위(cleavage site)인 8번 아미노산을 알라닌(Alanine)에서 글라이신(Glycine)으로 치환하여 GLP-1 유사체(analogue)를 제조하였다(서열번호 2). 그리고 나서, 본 발명자들의 선행특허인 국제공개특허 WO2008-147143 에서 제조한 hyFc5(hybrid Fc 5) 폴리펩타이드를 상기 GLP-1 유사체 펩타이드에 융합시켜 GLP-1-hyFc5 융합 폴리펩타이드를 제조하였다(도 1). 상기 GLP-1-hyFc5 융합 폴리펩타이드의 전체서열은 도 1에 나타낸 바와 같다.
추가로, GLP-1-hyFc5보다 반감기를 더욱 증가시키면서 다른 활성 측면에서도 우수한 융합 폴리펩타이드를 제조하고자 하였다.
구체적으로, hyFc5에서 IgD 힌지 부위(hinge region)를 다양하게 조절함으로써 보다 우수한 반감기를 가지면서 우수한 활성을 갖는 융합 폴리펩타이드를 제조하고자 하였으며, IgD 힌지 부위의 아미노산을 증가시키는 경우 이러한 조건을 만족시킬 수 있는 가능성이 있음을 확인하였다.
그에 따라, 30개의 아미노산으로 구성된 힌지를 가지는 hyFc5의 힌지 부위의 아미노산을 증가시켜, 먼저 40개의 아미노산으로 구성된 힌지(서열번호 27)를 가지는 hyFc9를 제조하였으며(도 2), 이후 각각 35개의 아미노산으로 구성된 힌지(서열번호 26)를 가지는 hyFc8 및 49개의 아미노산으로 구성된 힌지(서열번호 28)를 가지는 hyFc11을 제조하였다. 아울러, 상기 hyFc9, hyFc8 및 hyFc11에 각각 GLP-1 유사체 펩타이드를 융합하여 각각 GLP-1-hyFc9(서열번호 31), GLP-1-hyFc8(서열번호 30) 및 GLP-1-hyFc11(서열번호 32) 융합 폴리펩타이드를 제조하였다.
1-2: GLP-2-hyFc5, GLP-2-hyFc9, GLP-2-hyFc8 및 GLP-2-hyFc11의 제조
GLP-2 (Glucagon like peptide-2) 의 경우 GLP-1과 마찬가지로 생체 내 DPP-4 효소에 의해 매우 빠른 속도로 절단(cleavage)되고, 반감기(half-life)가 약 7분으로 매우 짧기 때문에, 약물로서 개발하는 데에 많은 어려움이 있다. GLP-2의 생체 내 반감기를 증가시키기 위해 DPP-4 효소에 의한 절단 부위(cleavage site)인 2번 아미노산을 알라닌(Alanine)에서 글라이신(Glycine)으로 치환하였다(GLP-2-2G 펩타이드, 서열번호 45). 상기 치환된 GLP-2-2G 펩타이드는 1일 제형으로 성인 단장증후군 치료제로 사용되고 있으나, 단장증후군의 치료가 계속적으로 이루어져야 하는 것을 고려하자면 이보다 더 길어진 반감기를 가지는 GLP-2 유사체의 개발이 필요하다. 이를 위해 본 발명자들의 선행특허인 국제공개특허 WO2008-147143 에서 제조한 hyFc5 폴리펩타이드를 상기 GLP-2-2G 유사체 펩타이드에 융합시켜 GLP-2-hyFc5 융합 폴리펩타이드를 제조하였다(도 3). 또한, IgD 힌지 부위는 전체 64개의 아미노산 길이를 다양하게 조절함으로써, GLP-2-2G 펩타이드의 반감기를 늘리면서 우수한 활성을 갖는 융합 폴리펩타이드를 제조하고자 하였다. 구체적으로는, 30개의 아미노산으로 구성된 힌지를 가지는 hyFc5에서 힌지 부위의 아미노산을 증가시켜 40개의 아미노산으로 구성된 힌지를 가지는 hyFc9를 제조하여, GLP-2-2G 펩타이드를 결합시켜 GLP-2-hyFc9 융합 폴리펩타이드를 제조하였다(도 3, 서열번호 48). 추가로, 35개의 아미노산으로 구성된 힌지를 가지는 hyFc8 및 49개의 아미노산으로 구성된 힌지를 가지는 hyFc11을 제조하여, 각각 GLP-2-2G 펩타이드를 결합시켜 GLP-2-hyFc8(서열번호 47) 및 GLP-2-hyFc11(서열번호 49) 융합 폴리펩타이드를 제조하였다.
실시예 2: GLP-hyFc 융합 단백질의 PK 프로파일 확인
2-1: GLP-1-hyFc5의 PK 프로파일 확인
상기 제조한 GLP-1-hyFc5 융합 폴리펩타이드의 약동학적 프로파일(pharmacokinetic profile, PK profile)을 확인하기 위하여, 합성한 GLP-1을 대조군으로 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
그룹당 4마리의 수컷 Sprague Dawley Rats에 각각의 단백질(GLP-1 및 GLP-1-hyFc5)을 정맥(IV) 경로로 투여하였다. 주입 전 및 주입 후 0.08, 0.16, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72 및 96시간에 혈액을 수득하였다. 혈액 샘플은 응집을 위해 30분 동안 실온 보관하였다. 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 각 샘플의 혈청을 수득하였고, 초저온 냉동고(deep freezer)에 저장하였다. 샘플은 GLP-1 키트(ALPCO, cat#43-GP1HU-E01)를 사용하여 표준곡선의 직선상의 위치에서 분석되도록 희석하여 정량하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, hyFc 폴리펩타이드를 융합하지 않은 GLP-1 단독 펩타이드의 경우에는 반감기가 4분으로 짧았으나, 이에 비해 GLP-1 및 hyFc5를 융합한 GLP-1-hyFc5 폴리펩타이드의 경우에는 반감기가 8시간 이상으로 약 116배 증가하였음을 확인할 수 있었다.
2-2: GLP-1-hyFc9의 PK 프로파일 확인
상기 실시예 1에서 제조한 GLP-1-hyFc9 융합 폴리펩타이드와 GLP-1-hyFc5 융합 폴리펩타이드의 반감기를 비교함으로써, PK 프로파일을 확인하고자 하였다.
그룹당 4마리의 수컷 Sprague Dawley Rats에 각각의 단백질을 피하(SC) 경로로 투여하였다. 주입 전 및 주입 후 2, 6, 12, 26, 48, 72, 96, 120, 144 및 168시간에 혈액을 수득하였다. 혈액 샘플은 응집을 위해 30분 동안 실온 보관하였다. 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 각 샘플의 혈청을 수득하였고, 초저온 냉동고(deep freezer)에 저장하였다. 샘플은 GLP-1 키트(IBL, Cat#27784A)를 사용하여 표준곡선의 직선상의 위치에서 분석되도록 희석하여 정량하였다.
그 결과는 각 시간별 혈액 내에 잔존하는 단백질량 및 약물농도 곡선 하 면적(AUC, Area Under the Curve) 값으로 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, GLP-1-hyFc5와 비교하여 GLP-1-hyFc9에서 약 12배의 AUC 값을 보임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 GLP-1-hyFc9가 GLP-1-hyFc5에 비해 반감기가 더욱 증가함으로써 보다 효과적인 약물 효능을 보일 수 있을 것임을 알 수 있었다.
2-3: GLP-1-hyFc8의 PK 프로파일 확인
GLP-1-hyFc8 융합 폴리펩타이드의 반감기를 GLP-1-hyFc9 융합 폴리펩타이드와 비교함으로써, GLP-1-hyFc8의 PK 프로파일을 확인하고자 하였다. GLP-1-hyFc5, GLP-1-hyFc9 및 GLP-1-hyFc8을 대상으로, 상기 실시예 2-2와 동일한 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, GLP-1-hyFc9 및 GLP-1-hyFc8은 유사한 수준의 PK 프로파일을 보임을 확인할 수 있었으며, GLP-1-hyFc8이 오히려 약간 더 우수한 수준을 나타내었다. 이는 대조군인 GLP-1-hyFc5에 비하여 훨씬 우수한 수준이었다. 이러한 결과를 토대로 GLP-1-hyFc8 역시 반감기가 증가함으로써 보다 효과적인 약물 효능을 보일 수 있을 것임을 알 수 있었다.
2-4: GLP-2-hyFc5 및 GLP-2-hyFc9의 PK 프로파일 확인
상기 제조한 GLP-2-hyFc5 및 GLP-2-hyFc9 융합 폴리펩타이드의 약동학적 프로파일(pharmacokinetic profile, PK profile)을 확인하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
그룹당 3마리의 수컷 Sprague Dawley Rats에 각각의 단백질(GLP-2-2G 펩타이드, GLP-2-hyFc5 및 GLP-2-hyFc9)을 S.C(피하) 경로로 투여하였다. 주입 전 및 주입 후 0.08, 0.16, 0.5, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 120 및 168 시간에 혈액을 수득하였다. 혈액 샘플은 응집을 위해 30분 동안 실온 보관하였다. 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 각 샘플의 혈청을 수득하였고, 초저온 냉동고(deep freezer)에 저장하였다. 샘플은 GLP-2 키트(Millipore, Cat#EZGLP2-37K)를 사용하여 표준곡선의 직선상의 위치에서 분석되도록 희석하여 정량하였다. 그 결과, Fc 단백질을 융합하지 않은 GLP-2-2G 펩타이드 단독의 경우에는 그 반감기가 1.2시간이었으나, 이에 비해 GLP-2-hyFc5, GLP-2-hyFc9 융합 단백질들은 반감기가 각각 44시간, 65시간이었으며 GLP-2-2G 대비 약 36배, 54배 증가하였음을 확인할 수 있었다. 특히, GLP-2-hyFc9은 GLP-2-hyFc5 보다도 약 1.5배 증가된 반감기를 가짐을 알 수 있었다.
실시예 3: GLP-hyFc 융합 단백질의 생물학적 활성 시험
3-1: GLP-1-hyFc9의 혈청 내 안정성 확인
우수한 PK 프로파일을 보이는 융합 폴리펩타이드들 중에서 GLP-1-hyFc9을 대상으로 추가적인 다양한 효능들에 관하여 확인하고자 하였다. 비교군으로서 GLP-1-hyFc5를 사용하였다. GLP-1-hyFc5 및 GLP-1-hyFc9에 대하여 혈청 내 분해인자들에 대한 안정성을 확인하기 위하여, 랫드 혈청 내 안정성 시험을 수행하였다.
먼저, 두 가지 시험물질을 랫드 혈청으로 희석하고, 준비한 각 샘플을 37℃ 항온기에 넣어 0, 6, 10, 24, 48시간 동안 반응시킨 후 각각의 물질을 ELISA 방법으로 정량하였다.
그 결과는 각 반응시간별 잔존하는 단백질량 및 시간 그래프의 곡선 하 면적(AUC, Area Under the Curve) 값으로 나타내었다. 도 7에서 보는 바와 같이, GLP-1-hyFc5와 비교하여 GLP-1-hyFc9에서 약 1.2배의 AUC 값을 보임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 GLP-1-hyFc9가 혈청 내 안정성 역시 GLP-1-hyFc5에 비해 우수함을 확인할 수 있었다.
3-2: GLP-1-hyFc9의 DPP-4 저항성 확인
GLP-1-hyFc5 및 GLP-1-hyFc9에 대하여 주요 대사 효소인 DPP-4(Sigma, #D4943-1VL)에 대한 저항성 및 그에 따른 안정성을 확인하기 위하여, DPP-4 저항성 시험을 수행하였다.
두 가지 시험물질과 DPP-4를 반응시키고자 하는 시간(0, 2, 8, 24, 48시간)에 맞도록 37℃ 항온기에 넣어 반응시킨 다음, 각각의 물질을 정량하였다.
그 결과는 각 반응시간별 잔존하는 단백질량 및 시간 그래프의 곡선 하 면적(AUC, Area Under the Curve) 값으로 나타내었다. 도 8에서 보는 바와 같이, GLP-1-hyFc5와 비교하여 GLP-1-hyFc9에서 DPP-4 저항성이 약 7배 이상 향상되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 GLP-1을 절단할 수 있는 DPP-4 효소에 대한 안정성 측면에서도 GLP-1-hyFc9가 훨씬 우수함을 알 수 있었다.
3-3: GLP-1-hyFc9의 PD 프로파일 확인
GLP-1-hyFc5 및 GLP-1-hyFc9에 대하여 약력학적 프로파일(pharmacodynamic profile, PD profile)을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
그룹당 10마리의 CD-1 마우스에 각각의 단백질을 피하(SC) 경로로 투여한 후, 0, 1, 2, 4 및 8일마다 글루코스(glucose)를 투여하여 혈중 글루코스의 변화를 측정하여 혈당 감소능을 확인하고자 하였다.
결과는 측정일마다 글루코스 투여 직후 1분부터 180분까지 혈중 글루코스의 농도 변화를 측정하여 각 실험일마다 AUC 값을 구하였으며, 음성 대조군(vehicle) 대비 GLP-1-hyFc5 및 GLP-1-hyFc9의 AUC 함량 %로 나타내었다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, GLP-1-hyFc5의 경우 2일째부터 혈당 감소능이 없어져 정상화(normalization)되는 반면, GLP-1-hyFc9의 경우에는 8일째까지 혈중 글루코스 함량이 낮은 상태로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 GLP-1-hyFc9의 경우 8일째까지도 혈당 감소능이 유지된다는 것을 의미한다.
3-4: GLP-1-hyFc9의 체중감소효과 확인
GLP-1-hyFc9에 대한 ob/ob 질병모델에서의 음성대조군 대비 약력학적 특성(PD, cumulative food intake & weight loss effect)을 확인하였다.
그룹 당 10마리의 ob/ob 마우스에 각각의 단백질을 SC(피하) 경로로 주1회 반복투여 후 매주 체중 및 누적식이섭취량의 변화를 측정하였다. 체중의 경우 각 그룹별 체중변화 값에서 음성대조군의 체중변화 값을 뺀 차이를 표시하였고, 누적식이섭취량의 경우도 마찬가지로 음성대조군의 누적식이섭취량 대비 차이로 나타내었다(도 10). 결과적으로 GLP-1-hyFc9은 체중변화량과 누적식이섭취량에 있어서 음성대조군 대비 유의한 체중 감소와 식이 감소 효력을 보였으며 그 효력은 용량의존적인 경향을 보였다.
종합하면, 표 2에 나타낸 바와 같이 GLP-1-hyFc9이 GLP-1-hyFc5에 비하여 우수한 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112017086210414-pat00001
3-5: GLP-1-linker-IgG4-mut 와의 ADCC 저해능 비교
다음으로, 상기 실시예들을 통하여 다방면에서 우수한 효능을 보이는 GLP-1-hyFc9 융합 폴리펩타이드에 대하여, 기존에 알려져 있는 융합 폴리펩타이드와의 ADCC 저해능 비교를 통하여 그 우수성을 입증하고자 하였다.
미국특허 US 7,452,966 B2 에 개시된 GLP-1-linker-IgG4-mut 를 비교군으로 하였으며, 이는 IgG4 부위 3곳이 돌연변이되어 항체 의존성 세포독성(ADCC, Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)을 저해하고자 한 폴리펩타이드이다.
상기 GLP-1-linker-IgG4-mut 및 본 발명의 GLP-1-hyFc9은 모두 구조적으로 IgG4의 CH2-CH3 부위를 포함하고 있어 CDC(Complement Dependent Cytotoxicity)에 의한 안전성 문제는 없으나, ADCC에 대한 안전성 문제가 있기 때문에, 이를 확인하고자 ADCC를 유발하는데 중요한 역할을 하는 Fcγ 수용체에 대한 결합능을 측정하고자 하였으며, 이를 위해 Surface Plasmon Resonance(SPR, Bio-rad, #Proteon XPR36)을 이용한 결합력 시험을 수행하였다.
먼저 NHS/EDC 반응을 통해 아민 커플링된 bio-rad chip의 각 채널에 Fcγ 수용체를 아세테이트 버퍼를 이용하여 흘려 리간드를 고정화시켰다. 음성 대조군의 개념으로는 tween 20이 첨가된 PBS(Phosphate Buffered Saline)을 흘렸다. 각 Fcγ 수용체가 결합된 칩에 각 시험물질을 흘려 결합력을 측정하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, GLP-1-linker-IgG4-mut는 면역글로불린 Fc 부위의 잔여 이펙터 기능을 제거하기 위하여 여러 아미노산 부위를 변형시켰음에도 불구하고 ADCC를 유발하는 주요 Fcγ 수용체에서 GLP-1-hyFc9에 비해 높은 결합능을 보였으며, 이로 인해 잠재적으로 세포독성을 일으킬 가능성이 있을 것으로 확인되었다. 반면, GLP-1-hyFc9의 경우 GLP-1-linker-IgG4-mut에 비하여 모든 Fcγ 수용체와의 결합능이 낮은 것을 확인하였으며, 이를 통해 장기간 약물 투여시 보다 안전할 수 있음을 알 수 있었다.
3-6: GLP-2-hyFc9의 염증 관련 생물학적 활성 시험
상기 GLP-1-hyFc9과 함께, GLP-2-hyFc9에 대해서도 생물학적 활성 시험을 수행하였다. GLP-2-hyFc9은 현저하게 증가된 반감기를 가지지만 hyFc9의 융합으로 GLP-2-2G 펩타이드 자체의 생물학적 활성을 감소시킬 수 있기 때문에, 먼저 생물학적 활성의 감소여부를 시험하였다.
GLP-2-hyFc9의 생물학적 활성을 조사하기 위하여, GLP-2-hyFc9의 자극에 의해 증가하는 세포내 cAMP를 측정하였다. GLP-2R 를 발현하는 293 세포를 6 × 104 cells씩 96 well에 배양하고 24시간 후 융합 단백질을 0, 0.1, 1, 3, 10, 100, 300 nM 농도별로 처리하여 증가한 세포내 cAMP에 의해 유도되는 막탈분극(membrane depolarization)을 fluorescent Membrane Potential Dye를 통해 측정하였다. 그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이, GLP-2-2G 펩타이드의 활성을 100%로 하였을 때, GLP-2-hyFc5 융합 단백질은 27%의 활성을 나타내어 생물학적 활성이 매우 감소한 것을 확인할 수 있었으나, GLP-2-hyFc9 융합 단백질은 98%의 활성을 나타내어 hyFc9의 융합에도 불구하고 염증 관련 생물학적 활성이 감소하지 않는 것을 확인하였다.
3-7: GLP-2-hyFc9의 염증성 장질환 치료 효과 확인
GLP-2-hyFc9을 피하투여하여 인도메타신(Indomethachin)에 의해 유도된 염증성 장질환 모델에서의 개선효과를 비교하였다. 그룹당 6마리의 수컷 Sprague Dawley Rats에 인도메타신 9mg/kg을 1일과 2일에 처리하여 염증성 장질환을 유도하였다. 비교군으로서 GLP-2-2G는 50 nmol/kg씩 하루 2회씩 3일부터 8일까지 총 12회 처리하였고, GLP-2-hyFc9는 50 nmol/kg씩 이틀에 1회씩 총 3회 처리한 후 9일에 부검하였다. 각 군들의 체중의 변화, 소장의 길이변화, 소장 조직에서의 염증성 사이토카인(TNF-a)의 발현양을 비교함으로서 염증성 장질환 증상의 치료효과를 비교하였다.
그 결과, 도 13에서 나타낸 바와 같이, 인도메타신 처리에 의해 체중과 소장길이가 현저히 감소하고 염증성 사이토카인인 TNF-a 발현량이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나, GLP-2-hyFc9을 처리한 군에서는 체중 감소량이 적고 TNF-a 발현량도 감소하였으며, 소장의 길이 역시 증가하여, GLP-2-hyFc9의 염증성 장질환 치료효과를 확인할 수 있었다. 특히, GLP-2-2G에 비하여 4분의 1 수준의 처리에도 불구하고, 오히려 더욱 우수한 효과를 가짐을 확인하였다.
3-8: GLP-2-hyFc의 장 상피세포 증식 유도효과 확인
GLP-2-hyFc9을 대상으로 장 상피세포의 증식 유도 효능을 확인하고자 하였다. 비교군으로서 GLP-2-2G 펩타이드를 사용하였다. GLP-2는 섬유아세포(fibroblast, effector cell)에 작용하여 성장인자 (growth factors, IGF-1, VEGF, EGF등)의 생성을 증가시키며, 증가된 성장인자는 장 상피세포의 증식을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 GLP-2-hyFc9의 장 상피세포 증식 유도능을 확인하는 시험을 수행하였다. CCD-18co 세포를 무혈청 배지에서 24시간 배양한 후, GLP-2-2G 및 GLP-2-hyFc9을 50, 100, 250 nM 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 세포를 배양한 배지(Conditioned media(CM))를 Caco-2 세포에 처리하여 3일간 배양한 후, Caco-2 세포가 증식한 정도를 EZ Cytox (Dogen, Cat.No.EZ-1000)로 측정하였다. 그 결과, 도 14에서 보는 바와 같이 GLP-2-hyFc9 의 Caco-2 세포 증식 촉진 능력이 GLP-2-2G 펩타이드와 유사한 것을 확인할 수 있었다. 요컨대, hyFc9을 융합하더라도, GLP-2의 생물학적 활성은 자연 상태의 GLP-2와 유사한 수준을 유지함을 알 수 있었다.
3-9: GLP-2-hyFc9의 소장 성장 촉진효과 확인
GLP-1-hyFc9의 약력학적 특성인 소장 성장 촉진 효능(intestinotrophic effect)를 확인하기 위하여 아래와 같은 실험을 수행하였다. 그룹당 8마리의 수컷 Sprague Dawley Rats에 GLP-2-hyFc9을 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 nmol/kg 씩 1일 1회 5일간 처리한 후 부검하여 소장의 중량을 측정함으로써 GLP-1-hyFc9의 소장 성장 촉진 효능을 확인 하였다. 도 15에서 알 수 있듯이, GLP-2-hyFc9를 처리한 군에서 농도 의존적으로 소장의 무게가 증가함을 확인할 수 있었고, ED50은 14.2 nmol/kg/day 임을 확인하였다.
3-10: GLP-2-hyFc9의 설사 및 치사율의 감소효과 확인
암세포를 죽이기 위해 사용되는 항암 화학치료제들 중 5-FU나 Irinotecan 등은 소장세포의 융모를 형성하는 장샘세포(crypts cell)를 파괴하여 융모위축을 유도하고, 이는 치명적인 설사를 유발할 수 있다. 항암 화학치료제에 유도되는 융모위축과 설사는 나아가 치사율에 영향을 줄 수 있으므로, GLP-2-hyFc9를 처리하여 항암 화학치료제에 의한 설사 및 치사 예방 효과를 확인하는 시험을 수행하였다. 그룹당 15마리의 수컷 Sprague Dawley Rats에 5-FU를 75mg/kg씩 1일 1회 총 4회를 처리하여 설사를 유도하였다. GLP-2-hyFc9은 80nmol/kg/day씩 총4회 또는 320nmol/kg/day 1회 처리한 후 10일간 설사 스코어를 확인하고 치사율을 확인 하였다. 그 결과, 도 16에서 보는 바와 같이, GLP-2-hyFc9을 80nmol/kg/day씩 총4회 처리한 군은 처리하지 않은 군에 비해 설사 스코어가 감소하였으며, 320nmol/kg/day를 1회 처리한 군은 저용량을 4회 처리한 군보다 설사 스코어가 현저히 감소하였다. 또한 5-FU에 의해 유도된 치사율(27%)도 GLP-2-hyFc9 처리한 군에서 6.7%로 20% 감소하였음을 확인하였다(도 17). 즉, GLP-2-hyFc9이 항암 화학요법에 의해 유도되는 설사를 예방하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
<110> Genexine, Inc. <120> Fusion Polypeptide Comprising GLP and Immunoglobulin Hybrid Fc and use thereof <130> KPA141389-KR-P1-D1 <150> KR 10-2014-0195793 <151> 2014-12-31 <160> 54 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1(7-37) analogue (A8G) <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1(7-37) analogue (A8V) <400> 3 His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1(7-37) analogue (G22E) <400> 4 His Ala Glu 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Val Lys Gly Gly 20 25 30 <210> 21 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1(7-36) analogue (A8V/R36G) <400> 21 His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly 20 25 30 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1(7-36) analogue (G22E/R36G) <400> 22 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly 20 25 30 <210> 23 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1(7-36) analogue (A8G/G22E/R36G) <400> 23 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly 20 25 30 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1(7-36) analogue (A8V/G22E/R36G) <400> 24 His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val 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ccgtgctgga tagcgatggc agcttctttc tgtacagcag actgaccgtg 780 gacaagagca gatggcagga aggcaacgtg ttcagctgca gcgtgatgca cgaagccctg 840 cacaaccact acacccagaa gagcctgtcc ctgagcctgg gcaag 885 <210> 44 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 45 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 analogue (A2G) <400> 45 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 46 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 analogue (A2V) <400> 46 His Val Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 47 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2-hyFc8 <400> 47 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser 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Asp Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala 35 40 45 Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys 50 55 60 Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu 65 70 75 80 Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 85 90 95 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 100 105 110 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 115 120 125 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 130 135 140 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 145 150 155 160 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 165 170 175 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 180 185 190 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 195 200 205 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 210 215 220 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 225 230 235 240 Tyr Lys Thr 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cctgttcccc 240 cccaagccca aggacaccct gatgatcagc cgcacccccg aggtgacctg cgtggtcgtg 300 gatgtgagcc aggaagatcc cgaagtgcag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaagtg 360 cacaacgcca agaccaagcc cagagaagag cagttcaact ccacctacag agtggtgagc 420 gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc 480 aacaaaggcc tgcccagctc catcgagaag accatcagca aagccaaagg ccagcccaga 540 gaaccccagg tgtacaccct gcctcccagc caggaagaga tgaccaagaa ccaggtgtcc 600 ctgacctgcc tggtgaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggaaagcaac 660 ggccagcccg agaacaatta caagacaacc cctcccgtgc tggatagcga tggcagcttc 720 tttctgtaca gcagactgac cgtggacaag agcagatggc aggaaggcaa cgtgttcagc 780 tgcagcgtga tgcacgaagc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gtccctgagc 840 ctgggcaag 849 <210> 53 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2-hyFc9 <400> 53 cacggcgacg gcagcttcag cgacgagatg aacaccatcc tggacaacct ggccgctaga 60 gacttcatca actggctgat ccagaccaag atcaccgatg ccaaggcaac gactgcgccg 120 gccactacgc gcaacaccgg ccgcggcggc gaggagaaga agaaggagaa ggagaaggag 180 gagcaggagg agcgcgagac caagaccccc gagtgcccca gccacaccca gcccctgggc 240 gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagccgcac ccccgaggtg 300 acctgcgtgg tcgtggatgt gagccaggaa gatcccgaag tgcagttcaa ctggtacgtg 360 gatggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcccagag aagagcagtt caactccacc 420 tacagagtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 480 aagtgcaagg tgtccaacaa aggcctgccc agctccatcg agaagaccat cagcaaagcc 540 aaaggccagc ccagagaacc ccaggtgtac accctgcctc ccagccagga agagatgacc 600 aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtg aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 660 gagtgggaaa gcaacggcca gcccgagaac aattacaaga caacccctcc cgtgctggat 720 agcgatggca gcttctttct gtacagcaga ctgaccgtgg acaagagcag atggcaggaa 780 ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaagccctgc acaaccacta cacccagaag 840 agcctgtccc tgagcctggg caag 864 <210> 54 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2-hyFc11 <400> 54 cacggcgacg gcagcttcag cgacgagatg aacaccatcc tggacaacct ggccgctaga 60 gacttcatca actggctgat ccagaccaag atcaccgatg ctcagccaca ggctgaggga 120 agcctcgcca aggcaacgac tgcgccggcc actacgcgca acaccggccg cggcggcgag 180 gagaagaaga aggagaagga gaaggaggag caggaggagc gcgagaccaa gacccccgag 240 tgccccagcc acacccagcc cctgggcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 300 ctgatgatca gccgcacccc cgaggtgacc tgcgtggtcg tggatgtgag ccaggaagat 360 cccgaagtgc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 420 cccagagaag agcagttcaa ctccacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac 480 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaagg cctgcccagc 540 tccatcgaga agaccatcag caaagccaaa ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc 600 ctgcctccca gccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaaa 660 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggaaagca acggccagcc cgagaacaat 720 tacaagacaa cccctcccgt gctggatagc gatggcagct tctttctgta cagcagactg 780 accgtggaca agagcagatg gcaggaaggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgaa 840 gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgtccctga gcctgggcaa g 891

Claims (12)

  1. (a) GLP(glucagon like peptide)-1, 또는 GLP-1의 유사체; 및 (b) 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 폴리펩타이드로서,
    상기 GLP-1의 유사체는 DPP-4 효소에 의한 절단 부위(cleavage site)가 변이된 것이며,
    상기 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드는 (i) 서열번호 25의 C-말단으로부터 35 내지 49개의 연속된 아미노산 서열로 이루어진, 분리된 IgD 힌지(hinge) 영역; 및 (ii) 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드의 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 GLP-1은 서열번호 1 또는 13의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 GLP-1의 유사체는 서열번호 2 내지 12 및 14 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 IgD 힌지 영역은 서열번호 26 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 CH2 및 CH3 영역은 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는, 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드가 융합되지 않은 폴리펩타이드에 비해 증가된 반감기를 나타내는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 30 내지 32으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 폴리펩타이드.
  8. 제1항의 융합 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 41 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열로 이루어진 것인, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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