KR101795495B1 - 피부 질환, 손상 또는 상처의 예방 및/또는 치료에 유용한 프테로스틸벤 - Google Patents

피부 질환, 손상 또는 상처의 예방 및/또는 치료에 유용한 프테로스틸벤 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부 질환, 손상 또는 상처를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용되는 PTER, 또는 이의 임의의 허용성 염, 경우에 따라 QUER 또는 이의 임의의 허용성 염과 배합된 PTER의 용도에 관한 것이다. 예방 및/또는 치료 방법은 활성 화합물로서 PTER 또는 이의 임의의 허용성 염과 경우에 따라 QUER 또는 이의 임의의 허용성 염과 함께 함유하는 조성물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 활성 화합물로서 PTER, 또는 이의 임의의 허용성 염을, 경우에 따라 QUER 또는 이의 임의의 허용성 염과 함께 함유하고 리포좀 형태로 조제된 것을 특징으로 하는 조성물 자체에 관한 것이며, 또한 이러한 리포좀 제형을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

피부 질환, 손상 또는 상처의 예방 및/또는 치료에 유용한 프테로스틸벤{PTEROSTILBENE(PTER) FOR USE IN THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF SKIN DISEASES, DAMAGES OR INJURIES}
본 발명은 약제 기술 분야에 포함될 수 있다.
과일과 야채의 많은 섭취는 건강한 생활 양식과 관련이 있다. 이러한 관련성은 천연 항산화제, 주로 폴리페놀계 화합물이 식품에 존재하기 때문이다. 과학 협회에서 많은 관심을 받고 있는 폴리페놀 중 하나는 여러 만성 질환(특히, 암, 심혈관 질환, 제II형 당뇨병 및 신경변성 질환)에서 잠재적 유익 효과를 초래했던 와인에 유의적인 양으로 존재하는 소형 폴리페놀인 레스베라트롤(3,4',5-트리하이드록시-트란스-스틸벤; RESV)이다. RESV의 항암성은 처음 장(Jang) 등에 의해 암 발달의 3 단계(개시, 촉진 및 진행)에 효과가 있는 것으로 제안되었다(Jang M, Cai L, Udeani GO , Slowing KV , Thomas CF , Beecher CW , Fong HH , Farnsworth NR , Kinghorn AD , Mehta RG , Moon RC , Pezzuto JM . (1997) Science 275(5297):218-20). RESV의 항암 효과는 낮은 생체이용률로 인해 매우 제한적이다(Asensi M, Medina I, Ortega A, Carretero J, Bano MC , Obrador E, Estrela JM . (2002) Free adic Biol Med. 33(3):387-98). 이러한 단점으로 인해, 생체이용률이 개선된 다른 일부 폴리페놀이 암 치료용으로 분석되었다. 하기 화학식으로 표시되는 2가지 소형 천연 폴리페놀인 PTER(3,5-디메톡시-4'-하이드록시-트란스-레스베라트롤, PTER, RESV의 유도체)과 QUER(3,3',4',5,6-펜타하이드록시플라보나; QUER)의 배합물은 매우 공격성인 쥐 악성 흑색종의 전이성 성장을 억제하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다(Ferrer P, Asensi M, Segarra R, Ortega A, Benlloch M, Obrador E, Varea MT , Asensio G, Jorda L, Estrela JM . (2005) Neoplasia . 7(1):37-47).
PTER
Figure 112012041116415-pct00001
QUER
Figure 112012041116415-pct00002
더욱이, PTER과 QUER의 연합은 화학요법과 방사선요법의 항종양 효과를 증대시켜 면역결핍 마우스에 이종이식된 저항성 사람 결장직장암의 제거를 촉진한다(Priego S, Feddi F, Ferrer P, Mena S, Benlloch M, Ortega A, Carretero J, Obrador E, Asensi M, Estrela JM . (2008) Mol Cancer Ther . 7(10):3330-42). PTER과 QUER은 정맥내 및/또는 경구 투여되었다.
최근 역학 조사는 모든 피부암의 90% 이상이 태양, 특히 자외선 B(UVB)에 과도한 노출에 의해 유발되는 것을 밝혀냈다. 이 암의 빈도는 흑색종 타입 및 비흑색종 타입 모두 대단하게 증가하고 있다(지난 20년 동안 피부암으로 인한 사망은 2배로 증가했다).
따라서, 방사선, 특히 UVB(자외선 B)에 장기간 노출 시 유발되는 피부 질환(피부암 포함), 상처 또는 손상을 예방 및/또는 치료할 수 있는 조성물은 당업계의 오랜 염원이다.
하지만, 피부 질환, 상처 또는 손상은 방사선 노출뿐만 아니라 다른 요인, 예컨대 면역 인자에 의해서도 유발될 수 있다. 대부분의 피부 질환, 상처 또는 손상은 피부 병리상태와 관련된 염증 과정들이 함께 존재한다. 더욱이, 방사선에 대한 피부 노출 또는 상기 방사선 노출 또는 다른 원인, 예컨대 면역 피부 질환 또는 알러지성 피부 질환, 예컨대 건선, 알러지성 접촉 피부염 또는 아토피성 피부염과 관련된 피부 염증 과정은 또한 산소 라디칼 및 다른 산화적 종, 예컨대 한 예로서 퍼옥시니트라이트의 질소 산화물(NO)의 생산에 의해 피부의 산화적 스트레스의 증가를 공유한다.
염증과 관련된 이상으로는 매우 다양한 사람 질환의 근거가 되는 장애의 거대한 무관련 그룹을 포함한다. 하지만, 본 발명의 목적은 구체적으로 염증을 예방/치료하는데 초점을 맞춘 것이 아니라, 모두 피부와 관련이 있고 국소 제제를 적용함으로써 치료되는 특정 선택 그룹의 징후들, 더 구체적으로 방사선 노출에 의해 유발된 피부 질환에 초점을 맞추고 있다. 더욱이, 현재 당업계에는 염증 장애의 치료에 유용할 수 있는 경구 투여된 약물을 개시했으나, 이러한 경구 투여 약물은 피부처럼 멀리 떨어진 표적 조직에 잠재적인 치료적 효과를 결코 발휘하지 않을 것이다.
QUER은 피부에 미치는 UV 방사선의 유해 효과를 예방하는데 효과적인 것으로 개시되어 있다(Rubia Casagrande , Sandra R. Georgetti , Waldiceu A. Verri Jr ., Daniel J. Dorta , Antonio C. dos Santos , Maria J.V. Fonseca [2006]; J. Photochem Photobiol B: Biology 84: 21-27 and Alena Svobodova Jitka Psotova Daniela Walterova [2003]; Biomed . Papers 147(2): 137-145). 하지만, QUER의 흡수 스펙트럼은 정확하게 PTER의 흡수 스펙트럼이 최대 면적을 나타내는 UVB 범위(290-320nm)가 아닌 UVA 범위(320-400nm)의 파장에서 대부분의 최대 피크를 나타낸다.
당업계의 현 상태(WO01/43705 A2)에서는 구체적으로 PTER이 아닌 스틸벤의 화학적 패밀리의 일부 구성원들과 레티노이드의 배합물이 피부 케어에 사용되고 있다.
본 발명은 상기 문제점들을 해결하기 위해 피부 질환, 상처 또는 손상을 예방 및/또는 치료하는데 초점을 맞춘, 주 활성 화합물로서 PTER을 기반으로 한, 더욱 특히 PTER과 QUER의 배합물을 사용한 조성물의 개발에 한 단계 진보를 제공한다. 더욱이, 본 발명은 어떤 피부 질환, 손상 또는 상처가 발생하기 전에 제제, 특히 선스크린제, 애프터선(after-sun)제, 노화방지제, 주름방지제, 광보호 목적의 제제 중에서 포유동물(사람) 피부에 적용될 수도 있다.
본 발명은 주로 PTER 또는 이의 임의의 허용가능한 염을, 경우에 따라 QUER 또는 이의 임의의 허용가능한 염과 함께, 피부 질환, 손상 또는 상처를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용하는 용도에 관한 것이다. 피부 질환, 손상 또는 상처를 예방 및/또는 치료하기 위한 치료 방법은 활성 화합물로서 PTER, 또는 이의 임의의 허용성 염을, 경우에 따라 QUER, 또는 이의 임의의 허용성 염과 함께 함유하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에게 투여하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 활성 화합물로서 PTER 또는 이의 임의의 허용성 염을 포함하고, 경우에 따라 QUER을 함께 함유하며, 바람직하게는 국소 제제 형태이고 더욱 바람직하게는 리포좀 형태인 약제학적 조성물 그 자체에 관한 것이며; 또한, 본 발명은 상기 리포좀 제제를 제조하는 방법도 포함한다.
QUER은 PTER과의 배합이 상승효과를 나타낸다면 다른 임의의 폴리페놀로 대체될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 폴리페놀은 식물에서 발견될 수 있지만, 절대적이지는 않고, 분자당 하나보다 많은 페놀 단위 또는 빌딩 블록의 존재를 특징으로 하는 화학 물질의 그룹이다. 폴리페놀은 일반적으로 가수분해성 탄닌(글루코오스 및 다른 당의 갈산 에스테르) 및 페닐프로파노이드, 예컨대 리그닌, 플라보노이드 및 축합 탄닌으로 분류된다.
PTER의 작용, 및 경우에 따라 PTER과 QUER 배합물의 작용은 다양한 방식으로 발휘될 수 있다:
a) UV 필터로서(상기 두 폴리페놀은 모두 방사선을 흡수하는 화학적 구조를 갖고 있다).
b) 광조사 및/또는 염증 과정 동안 생성된 반응성 산소종(ROS)의 산소 유리 라디칼 스캐빈저로서.
c) 소염제 및 면역조절제로서.
바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 두 활성 화합물 PTER과 QUER, 또는 이의 임의의 허용성 염의 배합물을 포함한다. 따라서, 예방 및/또는 치료 방법은 PTER 및 QUER, 또는 이의 임의의 허용성 염을 함유하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에 정의된 "피검체"는 포유동물, 예컨대 사람이다.
본 발명에 정의된 염증 과정은 모든 조직, 주로 상주 대식세포, 수지상 세포, 조직구, 쿠퍼(Kuppfer) 세포 및 비만세포에 이미 존재하는 세포에 의해 개시된 급성 또는 만성 염증 과정을 포함한다. 감염, 화상 또는 다른 상처의 개시 시에, 상기 세포들은 활성화하여 염증의 임상 표시에 책임이 있는 염증 매개인자를 방출한다. 혈관확장과 이로 인한 혈류량 증가는 발적 및 열 증가를 유발한다. 혈관 투과성 증가는 조직 내로 혈장 단백질 및 유체의 삼출(유출)을 초래하며, 이는 종창으로 나타난다. 브래디키닌과 같은 방출된 일부 매개인자는 통증 민감성을 증가시킨다(통각과민). 또한, 매개인자 분자는 혈관을 변경시켜 백혈구, 주로 호중구가 혈관 외부로 나가(혈관외유출) 조직 내로 이동시킨다. 호중구는 국소 세포에 의해 형성된 화학주성적 구배를 따라 이동하여 손상 부위에 도달한다. 기능 상실은 아마도 통증에 반응한 신경학적 반사의 결과일 것이다.
세포-유래의 매개인자 외에도, 기성 혈장 단백질로 이루어진 여러 세포 생화학적 캐스캐이드 시스템이 염증 반응의 개시 및 전파에 나란히 작용한다. 이 시스템으로는 세균에 의해 활성화된 보체 시스템 및 화상 또는 외상과 같은 괴사에 의해 활성화된 응고 섬유소용해 시스템을 포함한다. 급성 염증 반응은 일정한 자극이 유지될 필요가 있다. 염증 매개인자는 반감기가 짧고 조직에서 빠르게 분해된다. 따라서, 염증은 자극이 제거된 즉시 중단된다.
본 발명의 조성물은 본원에 포함된 활성 화합물의 임의의 "허용성 염"을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 표현은 포유동물에 약제로서 사용하기에 효과적이고 안전하며 원하는 생물학적 활성을 보유하는 본 발명의 화합물의 염을 의미한다. 염의 예로는 황산염, 구연산염, 아세트산염, 옥살산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 질산염, 중황산염, 인산염, 산 인산염, 이소니코틴산염, 젖산염, 살리실산염, 산 구연산염, 주석산염, 올레산염, 탄닌산염, 판토텐산염, 중주석산염, 아스코르브산염, 석신산염, 말레산염, 젠티신산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 글루카론산염, 사카린산염, 포름산염, 벤조산염, 글루탐산염, 메탄설폰산염, 에탄설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염 및 파모산염을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 "허용성 염"은 산성 작용기, 예컨대 카르복시산 작용기를 가진 폴리페놀 화합물과 허용성 무기 또는 유기 염기로 제조하는 것이 바람직하다. 적당한 염기로는 나트륨, 칼륨 및 리튬과 같은 알칼리 금속의 수산화물; 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속의 수산화물; 알루미늄 및 아연과 같은 다른 금속의 수산화물; 암모니아, 및 유기 아민, 예컨대 비치환 또는 하이드록시-치환된 모노-, 디- 또는 트리-알킬아민, 디사이클로헥실아민; 트리부틸 아민; 피리딘; N-메틸, N-에틸아민; 디에틸아민; 트리에틸아민; 모노-, 비스- 또는 트리스-(2-하이드록시 치환된 저급 알킬아민), 예컨대 모노-, 비스- 또는 트리스-(2-하이드록시에틸)아민, 2-하이드록시-tert-부틸아민 또는 트리스-(하이드록시메틸)메틸아민, N,N-디저급 알킬-N-(하이드록시 저급 알킬)-아민, 예컨대 N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)아민 또는 트리-(2-하이드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 및 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신 및 이의 유사물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, "허용성 염"이란 용어는 폴리페놀 화합물의 수화물을 포함한다.
본 명세서에 정의된 부형제는 조성물에 포함된 활성 화합물(PTER 및/또는 QUER)에 대한 운반체 또는 매개체로서 사용되는 불활성 물질이다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 국소 조성물에 포함되기에 적합한, 임의의 부형제를 포함할 수 있다(즉, 피부학적 허용성 부형제). 이하에 언급된 다음 보조제는 서로 독립적으로 본 발명의 조성물에 존재할 수 있다: 겔화제, 오일, 왁스, 점증제, 친수성 또는 소수성 중합체, 유화제, 연화제, 지방산, 유기 용매, 항산화제, 안정제, 격절형성제, 산성화제 또는 염기성화제, 유화제, 연화제, 계면활성제, 막형성제, 성능 및/또는 소비자 기호도를 향상시키는 생물학적 첨가제, 예컨대 아미노산, 단백질, 바닐라, 알로에 추출물 또는 생플라비노이드, 완충제, 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 옥살산, 착색제, 염료, 분사제, 소포제, 습윤제, 비타민, 유탁액 안정제, pH 조정제, 점증제, 향료, 보존제, 불투명화제, 물 및/또는 알코올. 전술한 본 발명의 조성물용 보조제는 당업자에게 공지된 통상적인 양으로 사용된다.
본 발명의 조성물에 적당한 오일은 동물 오일 또는 식물 오일 또는 합성 오일 중에서 선택된다. 특히 바람직한 오일은 액체 바셀린, 액체 파라핀, 휘발성 및 비휘발성 실리콘 오일, 이소파라핀, 폴리알파올레핀, 플루오르화된 오일 및 과플루오르화된 오일을 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 조성물에 적당한 안정제는 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성일 수 있다. 바람직한 안정제는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 이의 유도체, 트윈, 트리톤, 스판, 폴리글리세린, 폴리알킬 글리세라이드, 알킬 설폰산염, 아릴 설폰산염, 알킬 인산염, 알킬-베타인 및 포스파티딜글리세로의 유도체를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
유화제는 상기 조성물의 성분들을 균일하게 배합하기에 효과적인 양으로 본 발명의 조성물에 사용되는 것이 바람직하다. 적당한 유화제로는 음이온성 물질, 예컨대 지방산 비누, 예컨대 스테아르산칼륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산암모늄 및 트리에탄올아민 스테아르산염; 지방산 비누를 함유하는 폴리올 지방산 모노에스테르, 예컨대 칼륨 염 또는 나트륨 염을 함유하는 글리세롤 모노스테아레이트; 황산 에스테르(나트륨 염), 예컨대 소듐 라우릴 5 설페이트 및 소듐 아세틸 설페이트; 및 황산 에스테르를 함유하는 폴리올 지방산 모노에스테르, 예컨대 소듐 라우릴 설페이트를 함유하는 글리세릴 모노스테아레이트; (ii) 양이온성 물질, 예컨대 N(스테아로일 콜아미노 포밀메틸)피리듐; N-소야-N-에틸 모르폴리늄 에토설페이트; 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 디이소부틸페녹시테옥시에틸 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 및 아세틸 피리듐 클로라이드; 및 (iii) 비이온성 물질, 예컨대 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르, 예컨대 모노스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 라우릴 알코올; 폴리옥시프로필렌 지방 알코올 에테르, 예컨대 프로폭시화된 올레일 알코올; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 예컨대 폴리옥시에틸렌 스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트; 소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대 소르비탄; 폴리옥시에틸렌 글리콜 지방산 에스테르, 예컨대 폴리옥시에틸렌 글리콜 모노스테아레이트; 및 폴리올 지방산 에스테르, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 및 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트; 및 에톡시화된 라놀린 유도체, 예컨대 에톡시화된 라놀린, 에톡시화된 라놀린 알코올 및/또는 에톡시화된 콜레스테롤을 포함한다.
연화제는 또한 건조함을 방지하거나 경감시키는 양으로 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 적당한 연화제로는 탄화수소 오일 및 왁스; 실리콘 오일; 트리글리세라이드 에스테르; 아세토글리세라이드 에스테르; 에톡시화된 글리세라이드; 알킬 에스테르; 알케닐 에스테르; 지방산; 지방 알코올; 지방 알코올 에테르; 에테르에스테르; 라놀린 및 유도체; 다가 알코올(폴리올) 및 폴리에테르 유도체; 다가 알코올(폴리올) 에스테르; 왁스 에스테르; 벌꿀 유도체; 식물 왁스; 인지질; 스테롤; 및/또는 아미드를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
계면활성제도 역시 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 적당한 게면활성제는 예컨대 일반적으로 클렌징제, 유화제, 발포 촉진제, 하이드로트로프(hydrotrope), 가용화제, 현탁제로 분류되는 계면활성제 및 액체에 고체의 분산을 촉진하는 비-계면활성제이다.
본 발명의 조성물에 바람직하게 사용될 수 있는 막 형성제는 조성물을 부드럽고 균일하게 유지해야 하지만, 제한이 없는 것이 바람직하다. 적당한 막 형성제는 아크릴아미드/소듐 아크릴레이트 공중합체; 암모늄 아크릴레이트 공중합체; 발삼 페루(Balsam Peru); 셀룰로스 검; 에틸렌/말레산 무수물 공중합체; 하이드록시에틸셀룰로스; 하이드록시프로필셀룰로스; 폴리아크릴아미드; 폴리에틸렌; 폴리비닐알코올; pvm/MA 공중합체(비닐 메틸에테르/말레산 무수물 공중합체); PVP(폴리비닐피롤리돈); 말레산 무수물 공중합체, 비닐피롤리돈/헥사데센 공중합체; 아크릴릭아크릴레이트 공중합체 및 이의 유사물을 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
또한, pH 조정제도 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 pH 조정제는 수산화암모늄, 트리에탄올아민 또는 구연산 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 사용된 점증제는 칸델릴라, 카나우바 및 미세결정형 왁스, 가교된 아크릴산 중합체, 카보머, 메틸하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 또는 하이드록시에틸셀룰로스 및 폴리에틸렌 점증제 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 바람직한 유기 용매의 예로는 저급 지방족 알코올 및 폴리올을 포함한다.
본 발명에 사용된 조성물에 적합한 산화방지제는 아스코르브산(비타민 C), 소듐-L-아스코르베이트, 칼슘-L-아스코르베이트, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸하이드록시아니솔, 부틸하이드록시톨루엔, 칼슘-디소듐-EDTA, 이소아스코르브산, 레시틴, 젖산, 폴리포스페이트, 토코페롤(비타민 E), 예컨대 [알파]-토코페롤, [감마]-토코페롤, [델타]-토코페롤, 프로필갈레이트, 옥틸갈레이트, 도데실갈레이트, 소듐-이소아스코르베이트, 구연산, 구연산나트륨, 구연산칼륨 및 주석-II-클로라이드를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 바람직하게 사용되는 겔화제는 천연 중합체 또는 합성 중합체일 수 있다. 천연 중합체는 아가-아가, 알기네이트, 펙틴, 카보머, 카라기난, 카제인, 덱스트린, 젤라틴, 아라빅 검, 케라틴, 로커스트빈 검, 잔탄 검 및 이의 유사물 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 합성 중합체는 아크릴산 중합체, 폴리아크릴 아미드 및 알킬렌 옥사이드 중합체 중에서 선택된다.
본 발명의 조성물을 피검체에게 투여하기 위한 투여 경로는 임의의 투여 경로일 수 있고, 바람직한 투여 경로는 정맥내, 경구 및 국소 경로이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 액체형, 또는 반고체형으로 조제될 수 있는 국소 제형이고, 바람직하게는 액체, 유체, 포말, 크림, 젤, 페이스트, 발삼, 스프레이, 연고, 로션, 콘디셔너, 토닉, 밀크, 무스, 에멀젼, 세럼, 오일, 스틱, 샴푸, 젤리, 현탁액, 분산액, 래커, 페인트, 엘릭서제, 점적제 또는 에어로졸로 조제될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 활성 화합물은 리포좀 제제로 국소 투여했다. 본 발명에 사용된, "리포좀"은 하나 이상의 동심원 층으로 구성되고 특히 물질(즉, PTER 및/또는 QUER)을 체세포로 전달하는데 사용되는 인공 소포이다.
본 발명의 조성물의 국소 투여는 활성 화합물 PTER 및/또는 QUER의 생체이용률을 높여, 이 화합물들이 투여된 피검체의 50%에서 치료 반응을 나타내는 본 발명의 조성물의 양을 감소시키며, 즉 유효 투여량(ED50)을 감소시킨다. 약리학에서, 생체이용률은 약물의 중 약동학적 성질 중 하나인 전신 순환을 달성하는 미변화 약물의 투여 용량의 비율을 나타내는데 사용된다. 따라서, 생체이용률은 약동학의 필수 도구 중 하나이며, 비-정맥내 투여 경로의 투약량을 계산할 때 검토되어야 한다.
피부암을 비롯한 모든 피부 질환, 손상 또는 상처는 본 발명의 조성물로 예방 및/또는 치료될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 피부 질환, 손상 또는 상처는 염증 과정과 관련이 있다. 따라서, 본 발명은 바람직한 양태로서 질환을 앓고 있는 피부 영역(입술, 얼굴, 또는 전반적으로 피부)에 본 발명의 조성물을 투여하고/또는 다른 임의의 대체 투여 방식으로 투여하는 것을 포함하여, 염증성 피부염을 앓고 있거나 걸리기 쉬운 피검체를 예방 및/또는 치료하는데 초점을 두고 있다. "염증성 피부염"이란 용어는 광범한 피부 장애, 예컨대 비제한적으로 피지선 장애, 구진비닐 피부병, 알러지 피부병, 소양성 피부병, 혈관 피부병, 세균 피부병, 바이러스 피부병, 소양성 피부병, 혈관 피부병, 세균 피부병, 바이러스 피부병, 미콜 피부 감염, 육아종성 피부병, 기생충성 피부 피부병, 박탈 피부염, 수포 피부병, 색소침착 피부병, 감광성 피부병, 콜라겐 질환으로 인한 피부병 및 내부 질환으로 인한 피부병을 포함한다. 또한, 염증성 피부병은 자가면역 상태와도 관련이 있을 수 있고, 이 경우에 본원에는 "자가면역 피부병"이라 지칭된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 염증성 피부병은 피지선 장애, 예컨대 여드름모양 장애, 예컨대 보통여드름, 응괴성 여드름, 화농 땀샘염, 장미 여드름, 지루, 지루성 피부염, 그램음성 모낭염, 안면화농피부증, 다발성 피지낭종, 피지선 증식 또는 딸기코종이다. 본 발명의 더욱 바람직한 양태에서, PTER 또는 이의 임의의 허용성 염을, 경우에 따라 QUER 또는 이의 임의의 허용성 염과 함께 함유하는 조성물/제제는 보통여드름을 치료하는데 사용된다. 공지된 바와 같이, 보통여드름은 면포 및 구진을 특징으로 하는 만성 피부 상태이며, 꽤 중증일 수 있고;특히 중증 증례, 농포, 낭 및 영구 흉터가 일어날 수 있다.
또 다른 본 발명의 바람직한 양태에서, 예방 및/또는 치료된 염증성 피부병은 구진비닐 피부병, 예컨대 건선, 장미색 잔비늘증, 어우러기 또는 편평태선이다. 본 발명의 방법 및 제제는 특히 종래의 제제로 치료하기가 어려운 것으로 입증된 바 있는 자가면역 염증성 장애인 건선을 치료하는데 유용하다.
또 다른 본 발명의 바람직한 양태에서, 치료된 염증성 피부염은 예시적으로 아토피성 피부염, 비만 세포 질환, 수포성 유천포창, 보통천포창, 괴사성 혈관염, 원반모양홍반루푸스, 전신홍반루푸스 또는 포진피부염일 수 있는 자가면역 피부염이다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법과 제제가 유효한 염증성 피부병의 다양한 종류의 예는 다음과 같다:
ㆍ 알러지성 피부병: 접촉 피부염; 광알러지성 피부염; 접촉 자극물질인 산업에서 사용되는 다양한 화합물에 노출 시 유발되는 산업 피부병; 아토피성 발진(소아 및 성인); 및 약물에 의해 유발된 피부병 및 동전 습진.
ㆍ 소양성 피부병: 겨울, 노인성 및 본태 소양증; 항문 소양증; 영구 이염; 동계 소양증; 음문 소양증; 및 음낭 소양증.
ㆍ 혈관 피부병: 다형홍반; 결절홍반; 정체피부염; 자반성 피부병, 예컨대 혈소판감소 자색반, 비혈소판감소 자색반, 이상단백혈자색반, 광선 자색반, 괴혈병 자색반 및 헤노흐 자색반과 관련이 있는 피부병; 반상출혈; 정체자색반; 원발성 및 속발성 모세혈관확장증.
ㆍ 세균 피부병: 화농피부증, 예컨대 고름딱지증, 농창, 모낭염, 종기 다래끼, 큰 종기, 땀샘 감염, 얇은연조직염, 홍색음선, 감염 궤양, 및 감염 습진양 피부염; 및 전신 세균 감염과 관련이 있는 세균 피부염, 예컨대 성홍열, 서혜부육아종, 무른 궤양, 결핵, 나병, 임질, 리케차 질환, 방선균증 및 매독.
ㆍ 바이러스 피부병: 예컨대 단순헤르페스바이러스에 의한 피부병, 카포시 수두모양 발진, 대상, 수두, 마마, 우두, 물사마귀, 성병림프육아종, 발진 질환, 예컨대 풍진, 장미진 및 감염홍반.
ㆍ미콜 피부 감염: 완선(다양한 신체 부위 피부의 표재성 진균 감염); 발백선증(모창 백선균 감염으로 유발된 발의 백선증); 손발톱 백선증(손발톱 진균증); 스포로트릭스증; 콕시디오이데스 진균증; 히스토플라스마증; 및 북미 분아균증.
ㆍ 육아종 피부병: 사르코이드증; 고리육아종; 망상조직세포종; 및 실리카-유도 육아종.
ㆍ 기생충 피부 감염: 옴, 샤레티엘라 피부염; 모낭충증; 이 기생증.
ㆍ 색소침착 피부병; 기미(기미) 및 백반증.
ㆍ 콜라겐 질환: 피부경화증 및 피부근육염.
ㆍ 내부 질환으로 인한 피부병: 궤양대장염과 관련이 있는 괴저농피증 및 당뇨병으로 인한 궤양.
ㆍ 광민감성 피부병: 약물 유도 광피부염 및 광알러지 성분에 의한 접촉 피부염과 같은 외인성 타입; 및 포르피린증 및 다형광발진과 관련이 있는 피부병과 같은 내인성 타입.
바람직한 양태에서, 피부 질환, 손상 또는 상처는 방사선 노출에 의해 유발되는, 급성 또는 만성이다. 이 질환은 다음 중에서 선택된다: 피부암, 흑색종, 다형광발진, 광선각화증, 햇빛 두드러기, 색소성 건피증, 광노화, 만성 광선피부염 또는 일광화상 중에서 선택된다. "방사선"이란 용어는 피부에 상처 또는 손상을 유발할 수 있는 임의의 종류의 방사선, 예컨대 암 치료에 사용되는 방사선요법, 자외선(UV), 바람직하게는 태양에 의해 방출된 UVB를 포함한다.
본 발명에 사용된 "예방"이란 용어는 산화 스트레스와 관련된 피부 병태생리학적 과정의 출현, 방사선에 대한 과한 노출, 특히 바디 태닝에 연계된 UV 방사선에 대한 과한 노출, 특히 선태닝의 원인인 UVB선에 대한 과한 노출, 알러지, 면역 반응 및 염증 과정을 완전히 또는 부분적으로 피하는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된, "광-보호"란 용어는 피검체가 방사선, 주로 UVB선에 노출되기 전에 본 발명의 조성물을 투여하여 손상을 입을 위험을 줄이거나 완화시키는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에서 "광-보호"란 용어는 "예방"이란 용어에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
한편, "치료"란 용어는 피검체가 피부 질환, 손상 또는 상처의 증상을 겪은 다음, 본 발명의 조성물을 투여하는 것과 연관이 있다. 한 예로서, "치료"란 용어는 본 발명에 개시된 임의의 조성물을 방사선, 주로 UVB선에 노출된 사람에게 투여하여 피부의 손상 부분을 복원시키고 그 원래의 기능과 완전성을 복구하는 것에 적용된다. 더욱이, "치료"란 용어는 염증 과정과 관련이 있는 임의의 피부 질환, 손상 또는 상처를 겪고 있는 피검체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것과 연관이 있다.
PTER, 경우에 따라 QUER 또는 이의 임의의 허용성 염은 다른 활성 화합물과 함께 조제될 수 있다. 다른 활성 화합물 중에서, 진통제, 소염제, 항알러지제, 면역조절제, 힐링제 및 방사선 필터가 바람직하다. PTER 및 경우에 따라 QUER 또는 이의 임의의 허용성 염들과 동반되는 본 발명의 약제학적 제제의 성분으로 적합한 UV 필터의 목록으로는 WO 2008067928에 개시된 UV 흡수 물질(A 및/또는)이 있다. 가장 바람직한 UV 필터는 다음 중에서 선택된다:
UV -필터 다른 명칭
p- 아미노벤조산 PABA
패디메이트 O OD-PABA, 옥틸디메틸-PABA, σ-PABA
페닐벤즈이미다졸 설폰산 엔술리졸, 유솔렉스 232, PBSA, 파솔 HS
시녹세이트 2-에톡시에틸 p-메톡시신나메이트
디옥시벤존 벤조페논-8
옥시벤존 벤조페논-3, Eusolex 4360, Escalol 567
호모살레이트 호모메틸 살리실레이트, HMS
멘틸 안트라닐레이트 메라디메이트
옥토크릴렌 유솔렉스 OCR, 2-시아노-3,3-디페닐 아크릴산, 2-에틸헥실에스테르
옥틸 메톡시신나메이트 옥티녹세이트, EMC, OMC, 에틸메톡시신나메이트, Escalol 557, 2-에틸헥실-파라메톡시신나메이트, 파솔 MCX
옥틸 살리실레이트 옥티살레이트, 2-에틸헥실 살리실레이트, 에스카롤 587
S 술리이소벤존 2-하이드록시-4-메톡시벤조페논-5-설폰산,
3-벤조일-4-하이드록시-6-메톡시벤젠설폰산, 벤조페논-4, 에스카롤 577
트롤아민 살리실레이트 트리에탄올아민 살리실레이트
아보벤존 1-(4-메톡시페닐)-3-(4-tert-부틸페닐)프로판-1,3-디온, 부틸 메톡시 디벤조일메탄, BMDBM, 파솔 1789, 유솔렉스 9020
이캠슐 Mexoryl SX, 테레프탈릴리덴 디캠퍼 설폰산
이산화티탄 CI77891
산화아연
4- 메틸벤질리덴 캠퍼 엔자카멘, 파솔 5000, 유솔렉스 6300, MBC
티노솔브 M 비스옥트리졸, 메틸렌 비스-벤조트리아졸릴 테트라메틸부틸페놀, MBBT
티노솔브 S 비스-에틸헥실옥시페놀 메톡시페놀 트리아진, 베모트리지놀, BEMT, 안이소트리아진
네오 헬리오판 AP 비스디설리졸 디소듐, 디소듐 페닐 디벤즈이미다졸 테트라설포네이트, 비스이미다질레이트, DPDT
멕소릴 XL 드로메트리졸 트리실록산
벤조페논 -9 유비널 DS 49, CAS 3121-60-6, 소듐 디하이드록시 디메톡시 디설포벤조페논
유비널 T 150 옥틸 트리아존, 에틸헥실 트리아존, ET
유비널 A Plus 디에틸아미노 하이드록시벤조일 헥실 벤조에이트
우바솔브 HEB 이소트리지놀, 디에틸헥실 부타미도 트리아존, DBT
파솔 SLX 디메티코-디에틸벤잘말로네이트, 폴리실리콘-15
이소펜테닐-4-메톡시신나메이트
방사선에 노출하기 전과 후에 모두, 피부 질환, 병변 또는 손상을 예방 및/또는 치료하는 본 발명의 조성물의 유효성 또는 효능을 밝혀내기 위해 피부주름 또는 표피 두께의 측정과 같은 여러 기술을 본 발명에 수행했다. 이 기술들은 모두 당업계에 공지되어 있고 통상적인 일반 지식에 속한다. 더욱이, 상기 기술 모두 피부 질환, 손상 또는 상처를 예방 또는 치료하는 여러 화합물의 능력을 검사하는데 통상적으로 사용된다. 표피의 두께 또는 주름이 적을수록 치료는 더 효과적이다. 실시예에서 확인될 수 있는 바와 같이, 활성 화합물 PTER 또는 이의 임의의 허용성 염은 피부 질환, 손상 또는 상처를 예방 및/또는 치료하는 국소 조성물의 제조에 사용할 수 있다. 더욱이, 활성 화합물 PTER 및 QUER 또는 이의 임의의 허용성 염의 배합물은 이하에 설명된 일부 분석에서 각각 사용된 각 활성 화합물을 기능을 향상시키는 상승작용적 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명과 관련하여 사용된 "상승작용적"이란 용어는 방사선에 대한 노출로 유발된 피부 질환, 손상 또는 상처를 예방 및/또는 치료하기 위해 배합 요법으로 투여했을 때 PTER 및 QUER, 또는 이의 임의의 허용성 염의 배합물의 총 치료 효과가 각각 독립적으로 투여된 상기 활성 화합물의 치료 효과보다 크다는 것을 의미한다.
실시예에 제시된 바와 같이, 피부주름 두께 측정을 수행했다. 도 1은 PTER + QUER의 배합물, 및 또한 PTER 단독물이 시판 크림: Vichy(VICHY Capital Soleil 50 +UVB+UVA), Heliocare(Heliocare ultra 90 UVB/UVA) 및 Isdin(ISDIN Extrem 40 고차단 UVA 및 UVB)보다 UVB에 노출되기 전에 적용되었을 때 광보호제로서 더욱 효과적이며, PTER+QUER의 배합물이 약간 더 우수한 결과를 나타낸다는 것을 보여준다. 상기 3가지 시판 크림은 본 출원 명세서 전반에 비교 효과용으로 사용되었다. 본 출원에 따라 RESV도 동일한 분석 조건으로 PTER 및 PTER+QUER과 비교했다. RESV는 피부암의 화학보호제로서 종래 개시된 것이다(Moammir Hasan Aziz, Shannon Reagan-Shaw, Jianquiang Wu, B. Jack Longley and Nihal Ahmad; FASEB J. express article 10.1096(2005): 1-18). 도 1에서 PTER 단독물 또는 PTER+QUER 배합물은 RESV보다 UVB 노출 전 또는 후에 피부 광보호에 더 효과적인 것을 보여준다.
따라서, PTER+QUER의 배합물, 또는 PTER 단독물은 태양 방사선에 노출 시 유도된 피부 질환의 예방에 효과적으로 사용될 수 있다. PTER은 특히 태양 방사선의 UVB 성분을 흡수할 뿐만 아니라, QUER(도 13 참조)도 역시 방사선(태양) 노출로 인한 발암에 또한 부분적인 책임이 있는 태양 방사선의 UVA 성분에 대응하는 파장에 흡수 스펙트럼을 추가로 나타낸다. 따라서, PTER+QUER 배합물은 본 명세서의 일부 분석에서 상승작용적 효과가 관찰되었다.
더욱이, 도 1은 UVB에 노출 후 적용했을 때 PTER+QUER의 배합물이 시판 크림(Vichy, Heliocare 및 Isdin) 및 PTER 단독물보다 방사선에 의해 유발된 피부 질환, 상처 또는 손상의 치료에 더욱 효과적이라는 것을 보여준다. 따라서, PTER+QUER의 배합물은 자외선 B 조사에 의해 유도된 피부 질환, 상처 또는 손상의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
실시예에 도시된 바와 같이, 조사(24시간) 전에 표피 두께를 측정했다. 도 2는 UVB 노출 전에 적용했을 때 PTER 단독물 또는 QUER과의 배합물로의 사용이 시판 크림(Vichy, Heliocare 및 Isdin)보다 광보호제로서 더욱 효과적임을 보여준다. 따라서, PTER 단독물 또는 PTER과 QUER의 배합물은 자외선 B에 의해 유도된 피부 질환의 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
더욱이, 도 2는 UVB에 노출 후 적용했을 때, PTER+QUER의 배합물 또는 PTER 단독물이 시판 크림(Vichy, Heliocare 및 Isdin)보다 광조사에 의해 유발된 피부 질환, 상처 또는 손상의 치료에 더욱 효과적이며, PTER+QUER의 배합물이 약간 더 우수한 결과를 나타낸다는 것을 보여준다. 따라서, PTER 단독물뿐 아니라 PTER+QUER의 배합물은 자외선 B 조사에 의해 유도된 피부 질환, 손상 또는 상처의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
실시예에 예시된 바와 같이, 광조사(1주) 전에 표피 두께를 측정했다. 도 3은 UVB 노출 전에 적용했을 때 PTER 단독물의 사용이 시판 크림(Vichy, Heliocare 및 Isdin)보다 광보호제로서 더욱 효과적임을 보여준다. 따라서, PTER 단독물은 자외선 B에 의해 유도된 피부 질환의 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
더욱이, 도 3은 UVB에 노출 후 적용했을 때, PTER+QUER의 배합물 및 PTER 단독물이 시판 크림(Vichy, Heliocare 및 Isdin)보다 광조사에 의해 유발된 피부 질환, 상처 또는 손상의 치료에 더욱 효과적이며, PTER+QUER의 배합물이 약간 더 우수한 결과를 나타낸다는 것을 보여준다. 따라서, PTER 단독물뿐 아니라 PTER+QUER의 배합물은 자외선 B에 의해 유도된 피부 질환, 손상 또는 상처의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 피부 질환, 손상 또는 상처의 예방 및/또는 치료에 사용되는 PTER, 경우에 따라 PTER과 QUER의 배합물 또는 이의 임의의 허용성 염에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 또한 피부암의 예방 및/또는 치료에 사용되는 PTER, 경우에 따라 PTER과 QUER의 배합물, 또는 이의 임의의 허용성 염을 의미한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 피부 질환, 손상 또는 상처의 예방 및/또는 치료에 사용되는 QUER과 배합된 PTER, 또는 이의 임의의 허용성 염에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 피부암의 예방 및/또는 치료에 사용되는 QUER과 배합된 PTER 또는 이의 임의의 허용성 염에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 방사선에 대한 노출에 의해 유발된 피부 질환의 치료에 사용되는 QUER과 배합된 PTER, 또는 이의 임의의 허용성 염에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 피부병 또는 건선의 예방 및/또는 치료에 사용되는 QUER과 배합된 PTER, 또는 이의 임의의 허용성 염에 관한 것이다. 상기 사용은 국소 투여에 의해 사용이 바람직하다.
본 발명의 제2 양태는 피부 질환, 손상 또는 상처의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용되는 PTER, 경우에 따라 PTER과 QUER의 배합물 또는 이의 임의의 허용성 염의 용도에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 피부암의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용되는 PTER, 경우에 따라 PTER과 QUER의 배합물 또는 이의 임의의 허용성 염의 용도에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 피부 질환, 손상 또는 상처의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용되는 QUER과 배합된 PTER 또는 이의 임의의 허용성 염의 용도에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 방사선 노출에 의해 유발된 피부 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용되는 QUER과 배합된 PTER 또는 이의 임의의 허용성 염의 용도에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 피부병 또는 건선의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물에 제조에 사용되는 QUER과 배합된 PTER 또는 이의 임의의 허용성 염의 용도에 관한 것이다. 바람직한 제조된 약제학적 조성물은 국소 투여되는 것이다.
본 발명의 제3 양태는 국소 투여용 PTER 및 더욱 바람직하게는 리포좀 형태로 조제된 PTER을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 이 약제학적 조성물은 QUER과 함께 조제된 PTER을 포함한다. 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 선스크린 또는 애프터선 제형으로 조제된다.
본 발명의 제4 양태는 활성 화합물 PTER 또는 이의 임의의 허용성 염 및 레시틴을 유기 용매에 용해하는 단계, 용매를 증발시키는 단계, PBS 완충액을 첨가하는 단계, 형성된 리포좀을 수집하여 초음파처리하는 단계, 에멀젼 안정제, 바람직하게는 카보머, 더욱 바람직하게는 카르보폴과 1:1로 희석하는 단계, 경우에 따라 보존제, 바람직하게는 페노닙(Phenonip)을 첨가하는 단계를 포함하여, 리포좀 제형을 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태로, 리포좀 제형을 제조하는 방법은 또한 QUER 또는 이의 임의의 허용성 염을 PTER과 함께 제1 단계에서 용해시키는 단계를 포함한다. 카르보폴은 카보머이다. 카보머는 또한 약제 및 화장용품에서 에멀젼 안정제 또는 점증제로서 사용되는 아크릴산의 합성 중합체에 대한 일반명이다. 이는 알릴 에테르 펜타에리트리톨, 수크로오스의 알릴 에테르 또는 프로필렌의 알릴 에테르에 의해 가교된, 아크릴산의 단독중합체일 수 있다.
페노닙은 다수의 이용분야에서 작용하는 보존적인 투명 액체이다. 이것은 오일에 용해하고 물에 분산성인 점에서 독특하다. 이 보존제는 특히 오일 기반 산물과 함께 사용할 때 특히 효과적이지만, 수용액에서도 매우 잘 작용한다. 이것은 이 보존제가 오일만을 함유하는 연고 및 밤(balm)과 같은 제품에서도 작용할 것이라는 것을 의미한다. 페노닙은 또한 광범한 온도 범위를 견딜 수도 있다. 검사 결과, 페노닙은 보존 효과가 손상됨이 없이 멸균 온도로 가열될 수 있는 것으로 나타난다. 또한, 3 내지 8의 넓은 pH 범위에서 작용한다. 사용률은 총 포뮬라의 1 내지 3중량%로 달라진다(이용분야에 따라). 페노닙은 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 부틸파라벤, 프로필파라벤으로 구성된 것으로, 표지에 기재되어야 한다.
본 발명의 제5 양태는 PTER, 경우에 따라 PTER과 QUER의 배합물 또는 이의 임의의 허용성 염을 투여하는 것을 포함하여, 피부 질환, 손상 또는 상처를 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 PTER, 경우에 따라 QUER과 배합된 PTER, 또는 이의 임의의 허용성 염을 투여하는 것을 포함하여, 피부암을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 QUER과 배합된 PTER, 또는 이의 임의의 허용성 염을 투여하는 것을 포함하여, 피부 질환, 손상 또는 상처를 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 QUER과 배합된 PTER 또는 이의 임의의 허용성 염을 투여하는 것을 포함하여, 피부암을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 QUER과 배합된 PTER 또는 이의 임의의 허용성 염을 투여하는 것을 포함하여, 방사선 노출에 의해 유발된 피부 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 QUER과 배합된 PTER 또는 이의 임의의 허용성 염을 투여하는 것을 포함하여, 피부염 또는 건선을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 국소 적용되는 것이 더욱 바람직하다.
도 1. UVB에 노출되기 전(왼쪽 컬럼) 또는 노출 후(오른쪽 컬럼)에 여러 조성물로 처리된 마우스의 피부주름 두께(%)를 도시한 것이다. 시판 크림(Vichy, Heliocare -Helio- 및 Isdin). C+UVB = 임의의 처리 없이 광조사된 대조군; C Lipo+UVB = 리포좀만 적용된(임의의 활성 화합물을 함유하지 않은 리포좀), 광조사된 대조군. RESV = 레스베라트롤; P+Q = PTER+QUER.
도 2. 광 조사(24시간)에 노출되기 전(왼쪽 컬럼) 또는 노출 후(오른쪽 컬럼)에 여러 조성물로 처리된 표피 두께(㎛)를 도시한 것이다. 시판 크림(Vichy, Heliocare -Helio- 및 Isdin). 대조군 = 광조사 없음, 무처리; C+UVB = 임의의 처리 없이 광조사된 대조군; C Lipo+UVB = 리포좀만 적용된(임의의 활성 화합물을 함유하지 않은 리포좀), 광조사된 대조군. RESV = 레스베라트롤; P+Q = PTER+QUER.
도 3. 광 조사(1주)에 노출되기 전(왼쪽 컬럼) 또는 노출 후(오른쪽 컬럼)에 여러 조성물로 처리된 표피 두께(㎛)를 도시한 것이다. 시판 크림(Vichy, Heliocare -Helio- 및 Isdin). C Lipo+UVB = 리포좀만 적용된(임의의 활성 화합물을 함유하지 않은 리포좀), 광조사된 대조군. RESV = 레스베라트롤; P+Q = PTER+QUER.
도 1 내지 3 모두에서, 막대 히스토그램에 표시된 *는 대조군 값과 비교 시의 통계적으로 유의적인 차이(P<0.05)를 나타낸다.
도 4. TNCB로 실험적 아토피성 피부염을 유도한 시험에서 0일 대비 피부주름의 증가를 도시한 것이다(TNCB에 사전노출 후 1주 후 및 격일로 연속 노출 개시)
도 5. TNCB로 실험적 아토피성 피부염을 유도한 시험에서 TNCB에 4°노출 후 24시간 후 경피 유체 손실을 도시한 것이다.
도 6. TNCB로 실험적 아토피성 피부염을 유도한 시험에서 TNCB에 4°노출 후 24시간 후 병변을 도시한 것이다.
도 7. TNCB로 실험적 아토피성 피부염을 유도한 시험에서 개발된 프로토콜을 예시한 것이다.
도 8. TPA로 실험적 건선을 유도한 시험에서 TPA 처리 0일 대비 피부주름의 증가를 도시한 것이다.
도 9. TPA로 실험적 건선을 유도한 시험에서 TPA에 7°노출 후 24시간 후에 경피 유체 손실(TEWL)을 도시한 것이다.
도 10. TPA로 실험적 건선을 유도한 시험에서 TPA 노출 시 병변의 발생을 도시한 것이다.
A. TPA 2nmol에 3일간 매일 노출 후 24시간 후 마우스의 이미지;
B. TPA 2nmol에 6일간 매일 노출 후 24시간 후 동일한 마우스의 이미지;
C. 환자 손가락에 형성된 실제 건선의 이미지(Dermatology Image Atlas의 이미지);
D. 환자 무릎에 형성된 실제 건선의 이미지(Dermatology Image Atlas의 이미지).
도 11. TPA로 실험적 건선을 유도한 시험에서 개발된 프로토콜을 도시한 것이다.
도 12. 옥사졸론 접촉에 의해 실험적 과민을 유도한 시험에서 개발된 프로토콜을 도시한 것이다.
도 13. 폴리페놀의 흡수, 구체적으로 폴리페놀의 기계적 필터능을 평가하는 시험에서, 순수 에탄올에 용해한 각 폴리페놀(PTER, 레스베라트롤 및 QUER)의 다른 1mM 용액의 흡수 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 14. 폴리페놀의 광보호제 역할을 평가하는 시험에서 UV-B에 만성 노출 후 마우스의 상태를 보여준다. 이것은 180 mJ/㎠에 25주간 장기간 노출 후(주당 3회) 여러 실험 그룹의 사진이다. 참조 화합물 및 본 연구의 표본(폴리페놀 10μmol/마우스 또는 각 광보호제 200㎕)은 UV-B에 노출하기 20분 전에 마우스의 등에 적용했다.
도 15. 폴리페놀의 광보호제 역할을 평가하는 시험에서 병변의 발달 진행을 보여준다. 180 mJ/㎠에 30주간 장기간 노출 후(주당 3회) 여러 실험 그룹에서 직경이 1mm 보다 큰 전암성 병변의 1차 징후. 참조 화합물 및 본 연구의 표본(폴리페놀 10μmol/마우스 또는 각 광보호제 200㎕)은 UV-B에 노출하기 20분 전에 마우스의 등에 적용했다.
도 16. UV-B에 장기간 노출 후 수행한 피부의 해부병리학적 연구를 보여준다. 180 mJ/㎠에 30주간 장기간 노출 후(주당 3회) 마우스의 조직 절편의 해부병리학적 평가. 참조 화합물 및 본 연구의 표본(폴리페놀 10μmol/마우스 또는 각 광보호제 200㎕)은 UV-B에 노출하기 20분 전에 마우스의 등에 적용했다.
도 17. 피부염에 대한 여러 폴리페놀의 효과를 평가하는 시험에서, 연속 치료 처치 후의 피부주름을 보여준다. 폴리페놀 10μmol/마우스 및 덱사메타손 5 μmol/마우스 치료의 적용은 6일 동안 연속해서 마우스 등의 1/3에 매일 수행했다. 피부주름은 버니어 캘리퍼스를 이용하여 측정했다. * p>0.001 (대조군 대비). ANOVA 후 터키 시험.
도 18. 방사선 UV-B에 대한 심각한 노출로부터 보호를 평가하는 시험에서 여러 실험 상태를 표시한 조직 절편을 보여준다. 치료 적용(폴리페놀 10μmol/마우스, 또는 각 광보호제 200㎕)은 UV-B 360 mJ/㎠ 조사 20분 전 또는 후에 수행했다. 마우스는 UV-B 조사 후 24시간 후에 죽였다. 본 도면은 표피 두께의 변화를 나타낸다.
도 19. TNCB에 의해 유도된 아토피성 피부염의 실험 모델의 보호에 관한 시험에서 TNCB의 1차 투여 24시간 후 피부주름의 증가를 보여준다. 치료 적용(폴리페놀 10μmol/마우스, 또는 덱사메타손 0.5μmol/마우스)은 1 TNCB에 이미 감작된 마우스에 대해 1% TNCB 100㎕를 적용하기 24시간 전(0일)에 수행했다. 피부주름은 버니어 캘리퍼스로 측정했고, 0일 대비 증가율을 계산했다. * p>0.05 (대조군 대비); + p>0.05 (TNCB로 처리된 대조군 대비). ANOVA 후 터키 시험.
도 20. 병변의 육안 평가 시험에서 아토피성 피부염 모델의 병변 평가 결과를 보여준다. 치료 적용(폴리페놀 10μmol/마우스, 또는 덱사메타손 0.5μmol/마우스)은 1 TNCB에 이미 감작된 마우스에 대해 1% TNCB 100㎕를 적용하기 24시간 전에 수행했다. 유행병 전염에 대한 물 손실 측정(TEWL)은 Tweameter 시스템 TM 210(CK electronics, Germany)으로 평가했다. * p>0.05(대조군 대비); + p>0.05 (빈 리포좀으로 처리된 대조군 대비). ANOVA 후 터키 시험.
도 21. 병변의 육안 평가 시험에서 아토피성 피부염 모델의 마우스 평가 결과를 보여준다. 치료 적용(폴리페놀 10μmol/마우스, 또는 덱사메타손 0.5μmol/마우스)은 1 TNCB에 이미 감작된 마우스에 대해 1% TNCB 100㎕를 2일 마다 적용하기 24시간 전에 수행하고 TNCB는 4회까지 적용했다.
도 22. 옥사졸론에 의해 유도된 접촉 과민 모델에 대한 보호에 관한 시험에서 옥사졸론 투여 24시간 후 피부주름의 증가를 보여준다. 치료 적용(폴리페놀 10μmol/마우스, 디프로손 20mg)은 옥사졸론으로 사전 감작된 마우스의 귀에 에탄올 중의 2.5% 옥사졸론 20㎕를 적용하기 24시간 전(0일)에 수행했다. 피부주름은 버니어 캘리퍼스로 측정하고 0일 대비 증가율을 계산했다. * p>0.05 (옥사졸론으로 처리된 대조군 대비); + p>0.05 (옥사졸론을 적용하기 전에 디프로손으로 처리된 대조군 대비). ANOVA 후 터키 시험.
도 23. TPA에 의해 유도된 건선 모델에 대한 보호 시험에서 절차를 통한 0일 대비 피부주름의 증가율 발달을 보여준다. 치료 적용(폴리페놀 10μmol/마우스, 또는 덱사메타손 0.5μmol/마우스)은 2 nmol/마우스 TPA를 적용하기 30분 전에 수행했다. 이 투여 가이드라인은 연속 6일 동안 반복했다. 피부주름은 버니어 캘리퍼스로 측정하고 0일 대비 증가율을 계산했다.
도 24. TPA에 의해 유도된 건선 모델에 대한 보호 시험에서 TPA의 1차 투여 후 24시간 후의 피부주름의 증가를 보여준다. 치료 적용(폴리페놀 10μmol/마우스, 덱사메타손 0.5μmol/마우스)은 2 nmol/마우스 TPA를 적용하기 30분 전에 수행했다. 피부주름은 버니어 캘리퍼스로 측정하고 0일 대비 증가율을 계산했다. * p>0.05 (대조군 대비). ANOVA 후 터키 시험.
도 25. TPA에 의해 유도된 건선 모델에 대한 보호 시험에서 TPA 3차 투여 후 24시간 후 피부주름을 보여준다. 치료 적용(폴리페놀 10μmol/마우스, 덱사메타손 0.5μmol/마우스)은 2 nmol/마우스 TPA를 적용하기 30분 전에 수행했다. 피부주름은 버니어 캘리퍼스로 측정하고 0일 대비 증가율을 계산했다. * p>0.05 (대조군 대비); + p>0.05 (TNCB 그룹 대비). ANOVA 후 터키 시험.
도 26. TPA에 의해 유도된 건선 모델에 대한 보호 시험에서 건선 모델 마우스의 육안 관찰을 보여준다. 이 사진들은 (A) TPA 투여 24시간 후 및 (B) 7a TPA 투여 24시간 후에 촬영한 것이다. 치료 적용(폴리페놀 10μmol/마우스, 덱사메타손 0.5μmol/마우스)은 2 nmol/마우스 TPA를 적용하기 30분 전에 수행했다.
도 27. TPA에 의해 유도된 건선 모델에 대한 보호 시험에서 TPA 7회 투여 후 24시간 후에 박피 평가를 도시한 것이다. 치료 적용(폴리페놀 10μmol/마우스, 덱사메타손 0.5μmol/마우스)은 2 nmol/마우스 TPA를 적용하기 30분 전에 수행했다. 피부의 박피 양상은 0 내지 3의 스케일로 정량분석했다; 0은 전혀 일어나지 않음; 1, 약간 일어남; 2, 보통 일어남; 3, 심각하게 일어남. 각 그룹의 중간은 염증 정도를 시사했다.
도 28. 건선 과정의 조직 분석을 보여준다. 치료 적용(폴리페놀 10μmol/마우스, 덱사메타손 0.5μmol/마우스)은 2 nmol/마우스 TPA를 적용하기 30분 전에 수행했다. 7일 동안 매일 TPA 2nmol로 처리한 후 24시간(A) 및 72시간(B)째에 헤마톡실린-에오신으로 염색한 마우스 5㎛ 절단물의 현미경 관찰 이미지.
자외선 B 방사선에 의해 유도된 피부 질환(예컨대, 피부암)을 예방하는 본 발명의 조성물의 능력을 평가하는 연구는 360 mJ/㎠의 조사량으로 급성 광조사 후에 수행했다.
UVB 방사선에 대한 노출 프로토콜
UVB에 노출시키기 위해 특수 업그레이드된 카메라(312 nm에서 최대 방출율을 나타내는, UVB 방사선의 80%를 방출하는 5개 튜브가 장착된 크로스링커)를 사용했다.
UVB 급성 노출 프로토콜을 사용했다: 마우스를 360 mJ/㎠에 1회 노출시켰다. 본 연구는 노출 24시간 후에 수행했다. 본 프로토콜은 연구된 화합물의 광보호 효과를 평가하는데 사용했다. 동일한 급성 프로토콜을 이용하여, 모든 그룹의 마우스에게 광조사했다. 이어서, 마우스를 1주 동안 동물 보관 구역에 두어 염증 반응 및 부종의 발생을 관찰했다.
연구 중인 화합물의 투여 및 투여량
UVB 노출 연구(만성 또는 급성)를 위해, 마우스의 등에 국소 투여를 수행했다. 시판 선스크린제를 마우스에 직접 적용했다. 연구 중인 폴리페놀은 리포좀의 매개제인 카보폴 중합체와 1:1로 희석한 리포좀 제제로 투여했다. 투여된 각 폴리페놀 용량은 유리 산으로서 10μmol/마우스였다.
피부 손상 파라미터 표시인자
1. 부종 형성: 피부주름 두께는 1차 노출 24시간 후에 캘리퍼스로 측정했다.
2. 급성 광조사(360mJ/㎠ 24h 및 광조사 후 7일)에 노출 후 표피 두께 연구.
3. 조직학적 연구: 조직학적 절편으로부터 수득한 사진에서 표피 두께 측정
조직학적 연구
급성 노출 연구를 위해, 피부 샘플을 마우스 등으로부터 취했다. 이 샘플들을 4% 파라포름알데하이드(24시간)로 고정시키고 파라핀으로 매립시켰다. 절단 후, 샘플은 헤마톡실린과 에오신으로 염색했다.
여러 화합물들의 흡수 스펙트럼 연구
각 폴리페놀 1mM 용액을 무수 에탄올(HPLS 품질; Quima)에 준비하고(PTER, 레스베라트롤 및 QUER), 흡수 스펙트럼은 Multiskan Spectrum(ThermoScientific)을 사용하여 200nm와 800nm 사이에서 연구했다.
광 발암 절차(방사선 UV -B에 만성 노출)
종양 형성에서 UV-B 방사선의 역할은 공지되어 있다. UV-B에 연속 노출은 산화/니트로소화 스트레스의 형성은 물론, 다양한 전사 인자(이들 중 NF-κB 및 AP-1)를 활성화시키는 DNA, 단백질 등의 변경을 촉진하고, 결과적으로 발암을 유도하는 텔로머라제 활성, 스트레스 등을 증가시킨다.
더욱이, UV-B에 대한 노출은 증식 및 특정 염증 마커의 증가와 상관성이 있는 항아폽토시스 단백질의 발현 및 수준을 증가시킨다.
본 연구를 위해 선택한 마우스는 SKH-1이다. 이 마우스는 낮은 조사량(사람이 매일 노출될 수 있는 노출량과 비슷한)의 UV 방사선에 장기간 노출 후에 종양을 발생할 위험성이 크다.
사용된 프로토콜은 표준 프로토콜로서, 여러 마우스에서 24주 동안 180 mJ/㎠의 조사량을 매주 3회씩 노출시켜 광조사했다; 하지만, 이 시험 동안 프로토콜은 사용된 여러 처리들에서 광보호제의 효과에 대한 더욱 분명한 증거를 수득하기 위해 노출 시간을 28주까지 연장시켰다.
노출 조사량은 180 mJ/㎠이었는데, 그 이유는 이 조사량이 종래 시험에서 이 설치류 타입의 최소 홍반 조사량(MED)인 것으로 측정되었기 때문이다.
본 연구에는 광범한 여러 시판 광보호제가 포함되었다:
ㆍ Vichy: Capital Solein SPF-50+(Vichy Laboratories).
ㆍ Isdin: 광보호제 Isdin Extrem(SPF-40(Isdin SA)).
ㆍ Heliocare: Heliocare 젤 Protection Ultra 90(Difa Cooper S.P.A.)
참조 화합물들과 본 연구의 표본은 UV-B에 노출되기 20분 전에 마우스 등에 적용했다.
본 평가를 위해 20마리 마우스로 이루어진 그룹은 다음과 같다:
ㆍ 무처리.
ㆍ 참조 화합물 Vichy prior : 광조사 20분 전에 Vichy 200㎕ 적용.
ㆍ 참조 화합물 Isdin prior : 광조사 20분 전에 Isdin 200㎕ 적용.
ㆍ 참조 화합물 Heliocare prior : 광조사 20분 전에 Heliocare 200㎕ 적용.
ㆍ 매질 prior : 광조사 20분 전에 진공처리된 리포좀 200㎕ 적용.
ㆍ 레스베라트롤 prior : 광조사 20분 전에 레스베라트롤 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
ㆍ PTER prior : 광조사 20분 전에 PTER 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
ㆍ QUER prior : 광조사 20분 전에 QUER 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
ㆍ PTER + QUER prior : 광조사 20분 전에 PTER+QUER 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
UV-B는 단기간 내에 부종과 홍반을 유도한다. 이 염증은 과잉증식 과정에 중요하다.
UV에 노출된 피부 세포는 더 높은 수준의 핵 전사 NF-κB 인자를 보유하며, 이 인자는 UV-B가 피부 염증의 분명한 원인이라는 이유인, 특히 COX-2 및 iNOS의 산출을 조절한다.
연구된 광보호 화합물의 효과를 평가하기 위한 목적으로, 6주 내지 8주된 암컷 마우스 SKH-1을 360 mJ/㎠로 1회 노출시켰다.
자외선 B(UVB) 광조사 노출을 위해, UVB 방사선의 80%를 산출하고 312nm의 최대 방출률을 나타내는 5개 튜브가 장착된, 당해 실험실에서 이용할 수 있는 특수 제조한 카메라를 사용했다.
사용된 UV-B 노출의 2가지 프로토콜은 다음과 같다:
ㆍ 360 mJ/㎠ 1회 노출 후 강한 노출. 본 연구는 노출 후 24시간 후에 수행했다. 이 프로토콜은 연구된 화합물의 광보호 효과를 평가하는데 사용했다.
ㆍ 360 mJ/㎠ 1회 노출 후 강한 노출. 본 연구는 노출 후 1주 후에 수행했다. 마우스는 염증 및 부종 반응의 발생을 관찰하기 위해 1주 동안 우리에 두었다.
참조용으로, 여러 시판 광보호 제품을 사용했다(Vichy, Isdin 및 Heliocare). 본 발명의 목적 산물뿐 아니라 참조 화합물은 UV-B 광조사하기 20분 전 또는 광조사 20분 후에 마우스의 등에 적용하여, 관찰되는 반응이 광필터 효과때문인지 아닌지를 측정했다.
본 평가를 위한 5마리의 마우스 그룹은 다음과 같다:
ㆍ 무처리.
ㆍ 참조 화합물 Vichy prior : 광조사 20분 전에 Vichy 200㎕ 적용.
ㆍ 참조 화합물 Vichy after : 광조사 20분 후에 Vichy 200㎕ 적용.
ㆍ 참조 화합물 Isdin prior : 광조사 20분 전에 Isdin 200㎕ 적용.
ㆍ 참조 화합물 Isdin after : 광조사 20분 후에 Vichy 200㎕ 적용.
ㆍ 참조 화합물 Heliocare prior : 광조사 20분 전에 Heliocare 200㎕ 적용.
ㆍ 참조 화합물 Heliocare after : 광조사 20분 후에 Heliocare 200㎕ 적용.
ㆍ 매질 prior : 광조사 20분 전에 진공처리된 리포좀 200㎕ 적용.
ㆍ 매질 after : 광조사 20분 후에 진공처리된 리포좀 200㎕ 적용.
ㆍ 레스베라트롤 prior : 광조사 20분 전에 레스베라트롤 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
ㆍ 레스베라트롤 after : 광조사 20분 후에 레스베라트롤 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
ㆍ PTER prior : 광조사 20분 전에 PTER 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
ㆍ PTER after : 광조사 20분 후에 QUER 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
ㆍ QUER prior : 광조사 20분 전에 QUER 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
ㆍ QUER after : 광조사 20분 후에 QUER 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
ㆍ PTER + QUER prior : 광조사 20분 전에 PTER+QUER 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
ㆍ PTER + QUER after : 광조사 20분 후에 PTER+QUER 리포좀 200㎕(총합 중에 10μmol) 적용.
여러 처방을 투여한 후 24시간 또는 1주째, 마우스를 죽이고 피부를 4% PFA로 고정시켰다.
귀 두께
부종은 반응의 결과 전에 귀에서 수득된 두께와 24시간 후 두께 간의 차이로서 계산했고, 버니어 캘리퍼스로 측정했다.
변화는 0일 대비 상대적 증가로서 나타냈다.
피부의 육안 평가
마우스는 피부 외관의 모든 변화 또는 전반적인 모든 변화를 검출하기 위해 매일 관찰했다.
또한, 마우스를 죽이기 전에 임의의 특정 일에 피부 병변을 분석한 수의사는 피부 병변을 다음과 같은 함수로서 정성분석했다:
ㆍ 홍반 : 혈관 확장에 의한 초과 혈액 관류로 인한 염증에 의해 상태조정된 피부의 발적.
ㆍ 박피: 또는 박편화 양상을 띤 피부의 자극, 과다각화증을 초래할 수 있는 피부의 박리 증가.
ㆍ소아(soar) 또는 궤양을 산출하는 진피까지 도달할 수 있는 병변의 깊이.
각 변수는 0 내지 4 등급으로 평가했다; 0은 아무것도 나타나지 않음; 1, 약간 나타남; 2, 보통 나타남; 3, 현저히 나타남; 4, 매우 현저하게 나타남. 각 마우스의 3가지 값의 합은 염증의 정도를 시사했다.
광발암 과정 동안 여러 종양의 존재가 초래되었고 과정 전반에 걸쳐서 정량분석했다. 직경이 1mm보다 큰 모든 병변은 병변으로 간주했다.
현미경 검사.
조직화학적 기술은 현미경 수준에서 여러 시술의 피부 조직을 연구하는데 사용했다. 조직은 PBS에서 4% 포름알데하이드에 22℃에서 24h 동안 고정시켰다. 조직을 고정시킨 후, 다량의 에탄올로 탈수시켜야 하며 소수성 자일렌 혼합물에 넣고 파라핀이 조직에 침투하여 조직을 마이크로톰으로 얇게 박편화하기에 충분한 견고성을 제공했다.
파라핀 중의 샘플은 마이크로톰으로 처리하여 약 5 내지 10 ㎛의 박편을 수득했다. 샘플을 37℃에서 젤라틴 1 방울 위에 도말하고 젤라틴화된 슬라이드를 수집했다.
다른 절차를 위해 파라핀은 60℃의 온도 상에서 제거하는 것이 필수적이며, 이 샘플은 자일렌으로 세척하고 에탄올로 재수화시킨다.
헤마톡실린은 양이온성 착색제인 반면, 에오신은 잔텐에 속하는 음이온성 착색제이다. 따라서, 핵은 청색으로 염색되고 세포질은 분홍색으로 염색된다.
샘플을 염색하는데 사용한 프로토콜은 다음과 같다:
1. 메이어의 헤마톡실린과 10 내지 15 분 동안 항온처리.
2. 청색 빛이 날 때까지 수돗물로 세척.
3. 에오신(1%)과 2 내지 4분 동안 항온처리.
4. 에탄올 70°에서 남은 에오신 제거.
5. 탈수.
6. 자일롤로 3분 동안 세정.
7. 트레이를 37℃ 스토브에서 건조.
통계 분석
결과는 평균 ± 표준편차로 나타냈다. 표준편차는 오차 막대 형태로 나타냈고, 몇몇 경우에는 도표를 간략화하기 위해 양성 반막대만을 표시했다.
데이터는 적당한 경우 하나 이상의 인자 또는 시험의 분산(ANOVA)에 기초하여 분석했다. 변형체의 동종성은 레벤(Levene) 검사로 분석했다. 귀무가설(null hypothesis)은 p값이 0.05 초과인 F 값이 유의적이지 않은 검사들의 모든 값에서 수용되었다. F값이 유의적인 데이터는 p 값이 0.05인 터키 검사로 분석했다.
계산과 그래픽을 위해 컴퓨터 프로그램은 엑셀을 사용했고, 통계 검사를 위해, 발렌시아 대학이 사용자 라이센스를 갖고 있는 윈도우용 SPSS 버전 14.0(SPSS Inc)을 사용했다.
실시예
실시예 1. 실험적 동물 모델
찰스 리버 컴패니에서 제공받은 SKH-1 마우스 종을 실험 동물로 사용했다. 이 동물은 탈모성 면역적격 마우스이다. 실험 그룹은 표 2에 제시한 바와 같이 3주 내지 4주된 암컷 마우스로 구성했다. 광보호의 각 실험 그룹은 5마리 내지 6마리 동물로 구성했다. 이 연구에서, 각 실험 그룹은 마우스 20마리로 구성했다.
그룹 명칭 처리 UVB 노출
I 음성 대조군 리포좀 매개제 무처리
IIt UVBa 리포좀 매개제 처리 20분 후
IIa UVBb 리포좀 매개제 처리 20분 전
IIIt RESa RES 리포좀 처리 20분 후
IIIa RESb RES 리포좀 처리 20분 전
IVt PTERa PTER 리포좀 처리 20분 후
IVa PTERb PTER 리포좀 처리 20분 전
Vt QUERa QUER 리포좀 처리 20분 후
Va QUERb QUER 리포좀 처리 20분 전
VIt (PTER+QUER)a PTER+QUER 리포좀 처리 20분 후
VIa (PTER+QUER)b PTER+QUER 리포좀 처리 20분 전
VIIt ISDINa 처리 20분 후
VIIa ISDINb 처리 20분 전
VIIIt HELIOCAREa 처리 20분 후
VIIIa HELIOCAREb 처리 20분 전
IXt VICHYa 처리 20분 후
IXa VICHYb 처리 20분 전
b는 "전"을 의미한다.
a는 "후"를 의미한다.
또한, 생체내 시험은 찰스 리버에서 제공한 4주된 탈모성 암컷 마우스 SKH1-E 또는 6 내지 8주된 BALB/c 마우스를 사용했다.
본 연구는 발렌시아 대학의 실험연구중앙지원소(CSSER)에 있는 동물 생산부의 동물 실험 구역에서 수행했고, 단 옥사졸린에 대한 과민 연구는 TNO Quality of Life(Leiden, 네덜란드)에서 수행했다.
동물이 2주 후 환경에 적응하면, 현재 국제 규정[European Community Council Directive(86/609, OJ L 358. 1, December 12, 1987), National Health Institute(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publ.No. 85-23, 1985, USA)]에 따라 조절된 조건, 즉 온도 22±2℃, 상대습도: 65 내지 80%, 공기의 12 변화/시간 및 12/12시간의 광주기 하에 보호 장벽이 장치된 방에서 수행했다.
동물은 경추 탈구로 죽였다. 샘플은 조직검사를 위해 후사반부로부터 취하고, 4% 포름알데하이드에서 밤새 고정시켰다. 샘플 일부는 강한 UV-B 노출 시술 및 이어서 염증 및 산화/니트로소화 스트레스에 대한 평가를 위해 액체 N2에서 유지시켰다.
이어서, 혈액 20 ㎕를 취하고, N-에틸말레이미드(NEM) 80㎕에 첨가했다.
약 10분 동안 항온처리 후에 100 ㎕ 과염소산(PCA) 4%를 첨가했다. 샘플은 강한 진탕 후 얼음에 보관했다. 마지막에, 모든 샘플은 4℃에서 15분 동안 13000 rpm으로 원심분리했다. 상청액을 수집하고, GSH(글루타치온의 환원 형태)/GSSG(글루타치온의 산화 형태) 비를 분석할 때까지 -20℃에서 보관했다. GSH/GSSG 비는 세포내 산화환원 상태, 특히 세포내 티올 산화환원 상태를 반영하는 파라미터이다. 따라서, 이 비의 변화는 산화적 스트레스를 평가하는데 사용된다.
4가지 샘플을 후사반부의 피부로부터 취했다. 하나는 조직검사를 위해(4% 포름알데하이드에서 밤새 고정시킴), 3가지는 생화학적 분석을 위해 액체 질소로 동결시켰다.
실시예 2. 리포좀 제조
폴리페놀(들)에 상관없이 리포좀 제조 방법은 동일하게 사용했다: 대두 레시틴; PTER 및/또는 QUER의 경우에 유기 용매로서 디클로로메탄, 레스베라트롤의 경우에는 유기 용매로서 에틸 에테르(레스베라트롤은 디클로로메탄에 용해되지 않기 때문에)를 사용했다. 유기 용매의 증발은 40℃ 온도와 진공 연결된 회전식 증발기를 사용하여 수행했다. 유기 용매의 제거 후, 리포좀은 PBS에 재현탁시켜 1mM로 희석했다. 카보폴을 첨가하기 전에 최종 리포좀 농도에서 각 폴리페놀의 농도는 HPLC/MS-MS로 측정 시, 20 μM 폴리페놀이었다.
리포좀을 제조하는 단계는 다음과 같이 정리할 수 있다:
1. 폴리페놀과 레시틴을 칭량한다.
Figure 112012041116415-pct00003
2. 폴리페놀과 레시틴을 디클로로메탄 40ml(PTER 및/또는 QUER의 경우), 또는 에틸 에테르 140ml(레스베라트롤의 경우)에 용해한다.
3. 용액을 회전식 증발기 플라스크에 넣고 장치에 부착한다. 모든 용매가 증발하면 예상 진공을 끊고 제거될 수 있는 모든 미량의 용매를 제거하기 위해 15분 동안 기다린다.
4. 회전식 증발기 플라스크에 희석 PBS(1mM) 20ml를 첨가하고 진공 없이 장치에 다시 부착한다.
5. 형성된 리포좀은 50ml 튜브에 수집한다.
6. 리포좀을 초음파처리한다(6초, 25 주기, 각 주기마다 3초 간격으로; 고강도).
7. 카보폴과 1:1로 희석(최종 농도 10μmol/200㎕).
8. 가능한 오염을 없애기 위해 페노닙(제제 1000ml당 페노닙 6ml)을 첨가한다.
대조용 리포좀은 PTER 및 QUER과 동일한 방식으로 제조하나, 단 레시틴만을 함유한다(2.376g).
리포좀을 수득하는 절차는 콜로이드스 리서치 유닛(화학 및 물리학 부; 발렌시아 대학)과 공동으로 당해 실험실에서 수행했다.
리포좀에는 폴리페놀과 같은 다양한 소인이 적재될 수 있다. 리포좀은 피부를 투과하는 능력으로 인해, 상기 활성 소인을 피부 내의 먼 거리까지 운반하고 지정된 지점에 정지할 수 있다. 이는 리포좀이 피부 요법에 사용될 수 있는 이유이다. 리포좀에는 녹차 유래의 폴리페놀을 함유하는 제품(Replenix; Kaplan cosmetic Surgery Centers), 및 포도 유래의 레스베라트롤을 함유하는 제품(Resveraderm; SesDERMA Laboratories) 등 여러 가지가 있다.
대두 레시틴의 혼합물은 리포좀을 수득하는데 사용했고; 이것은 약 90% 포스파티딜콜린과 다른 지방산의 천연 혼합물이다. 대두 레시틴(99% 순도)은 GUINAMA S.L.(Valencia, Spain)에서 제공했다.
극성 유기 용매는 용해성을 위해 사용했으며, 예컨대 PTER(CML Europe BV) 및 QUER(Sigma)를 위한 디클로로메탄(Sigma) 및 레스베라트롤(Sigma)을 위한 에테르(Sigma)가 있다.
리포좀을 수득하기 위한 이상적인 혼합물은 다음을 함유했다:
ㆍ 레시틴 5.9(w/v), PTER 1.28(w/v) 및 QUER 1.69(w/v), 디클로로메탄에 용해됨.
ㆍ 레시틴 1.69(w/v) 및 레스베라트롤 1.15(w/v), 에테르에 용해됨.
여러 폴리페놀의 미시적 포장은 진공 회전식 증발기에서 40℃ 하에 대두 레시틴을 탈수시켜 달성했고, 이것은 이후 최종 용액에 화합물당 0.1mM의 최종 농도를 위해 20℃에서 pH 7의 1mM 인산염 용액으로 수화시켰다.
리포좀은 현미경을 통한 형태 관찰을 통해 입자 크기를 표준화했다. 리포좀 현탁액 중에 폴리페놀의 농도는 HPLC-MS/MS로 정량분석했다.
용액은 1:1 희석율로 카보폴 940(Guinama)로 안정시키고 항미생물성 보존제 페노닙(Quinama) 0.6%(v/v)을 첨가했고, 이로 인해 각 폴리페놀 10 μmol/200㎕을 함유하는 리포좀 용액이 수득되었다.
리포좀의 투여는 자동 마이크로피펫기로 마우스 등에 균일한 크림 막을 적용하고 매끄럽게 해서 수행했다.
화합물은 각 절차에 기술된 투여 프로토콜에 따라 적용했다:
ㆍ 빈 리포좀: 주입되지 않은 리포좀.
ㆍ PTER 리포좀: 1μmol/20㎕ 크림.
ㆍ QUER 리포좀: 1μmol/20㎕ 크림.
ㆍ PTER+QUER 리포좀: 각 화합물 1μmol/20㎕ 크림.
ㆍ 레스베라트롤 리포좀: 1μmol/20㎕ 크림.
실시예 3. 광조사 24h 후 피부주름 측정
피부주름은 겨드랑이부터 엉덩이까지 마우스 등의 피부에 주름을 만들어 측정했고; 주름은 버니어 캘리퍼스로 측정했다.
주름 증가는 반응 효과 전에 초기 시점의 두께와 각 시점의 두께 간의 차이로 계산했다.
도 1은 마우스 후사반부(다양한 처리가 적용된 지점)의 피부 두께를 측정하여 수득한 결과를 도시한 것이다. 결과는 ANOVA로 통계 분석했고 터키 시험으로 대비 조사하여 유의적인 차이에 따라 그룹으로 나누었다. 표준 편차는 도 1에 포함시켰다. 도 1에 도시된 바와 같이, PTER+QUER의 배합물 및 PTER 단독물은 UVB에 노출 전에 적용했을 때, 시판 크림(Vichy, Heliocare 및 Isdin) 및 RESV보다 광보호제로서 더 효과적이었다. 따라서, PTER+QUER의 배합물 또는 PTER 단독물은 자외선 B 방사선에 의해 유도된 피부 질환을 예방하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 도 1은 UVB에 노출 후 적용한, PTER+QUER 배합물 또는 PTER 단독물이 시판 크림(Vichy, Heliocare 및 Isdin) 및 RESV보다 방사선에 의한 피부 질환, 손상 또는 상처의 치료에 더 효과적인 것도 보여준다. 따라서, PTER+QUER의 배합물은 자외선 B 방사선에 의해 유도된 피부 질환, 손상 또는 상처를 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
실시예 4. 광조사 후(24시간) 표피 두께 측정
가능한 과다증식을 평가하는 표피 두께를 측정하기 위해, 표피 측정을 가능하게 하는 Neubauer 카메라의 도움으로 조정된 Image J 컴퓨터 프로그램을 사용했다. 수득된 결과는 ANOVA로 통계 분석하고 터키 시험으로 대비 조사하고 유의적인 차이에 따라 그룹으로 나누었다. 도 2에 도시된 바와 같이, PTER 단독물의 사용은 UVB 노출 전에 적용 시, 광보호제로서 시판 크림(Vichy, Heliocare 및 Isdin)보다 더 효과적이다. 따라서, PTER 단독물은 자외선 B 방사선에 의해 유도된 피부 질환, 상처 또는 손상을 예방하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 도 2는 UVB에 노출 후 적용한, PTER+QUER 배합물이 시판 크림(Vichy, Heliocare 및 Isdin) 및 RESV보다 방사선에 의한 피부 질환, 손상 또는 상처의 치료에 더 효과적인 것도 보여준다. 따라서, PTER 단독물은 물론 PTER+QUER의 배합물은 자외선 B 방사선에 의해 유도된 피부 질환, 손상 또는 상처를 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 본 실험의 대조군은 방사선 비조사 및 무처리를 의미한다.
실시예 5. 광조사후 (1주) 표피 두께의 측정
피부 두께의 평가는 컴퓨터 소프트웨어(IMAGE J)를 사용하여 수행했다. ANOVA에 의해 수득된 결과는 터키 시험으로 대비 조사하고 유의적인 차이에 따라 그룹으로 나누었다. 도 3에 도시된 바와 같이, PTER 단독물의 사용은 UVB 노출 전에 적용 시, 시판 크림(Vichy, Heliocare 및 Isdin)보다 광보호제로서 더 효과적이다. 따라서, PTER 단독물은 자외선 B 방사선에 의해 유도된 피부 질환, 손상 또는 상처의 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 도 3은 UVB에 노출 후 적용한, PTER+QUER 배합물이 시판 크림(Vichy, Heliocare 및 Isdin) 및 RESV보다 방사선에 의한 피부 질환, 손상 또는 상처의 치료에 더 효과적인 것도 보여준다. 따라서, PTER+QUER의 배합물은 물론 PTER 단독물은 자외선 B 방사선에 의해 유도된 피부 질환을 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
실시예 6. TNCB 에 의한 실험적 아토피성 피부염의 유도
피크릴 클로라이드로 일반적으로 알려져 있는 제제 "2-클로로-1,3,5-트리니트로벤젠 또는 2,4,6-트리니트로클로로벤젠"(TNCB)는 마우스 피부의 염증과 함께 알러지 과정을 유도하는 화학 제제이다. 또한, TNCB 연고의 연속 투여는 아토피성 피부염이 있는 사람 환자에서 나타나는 것처럼 혈청 중에 T-림프구, 비만세포 및 IgE의 생산을 증가시켰다.
아토피성 피부염 병변을 만들기 위해, 마츠모토가 기술한 프로토콜을 사용하여, SKH-1 마우스의 등에 아세톤 중의 1% TNCB 용액 100㎕를 적용했다[부피가 분산되지 않고 병변 부위가 더욱 국소적으로 유지되도록 하기 위해 33㎕씩 3회 적용(자동 마이크로피펫기 디스펜서를 이용하여)].
TNCB 처리가 TNCB 사전 검사 기간 후 32일 동안 지속된 마츠모토가 제안한 프로토콜과 대조적으로, TNCB를 이용한 1차 검사 및 1주 후 4회 용량 다음 2일마다 TNCB 처리로 이루어진 프로토콜을 개발했다. 기간이 더 짧은 프로토콜은 도 5에 도시된 경피 유체 손실에서와 같이, 도 4에 도시된 피부주름을 증가시켰으며, 이 병변들은 도 6에 도시된 육안조사 수준에서 분명했다.
따라서, 본 절차에서 개발된 프로토콜은 도 7에 제시된 것이다. 기준 처리처럼 이후에는 덱사메타손(Sigma 제품, 아세톤 중에 25mM 용액)을 사용했다. 검사할 제품 및 기준 처리의 투여는 격일로 제공했고, 맨 먼저 TNCB를 연속 적용하기 24시간 전부터 시작해서, 마우스를 TNCB(1주 prior)에 노출시킨 후 제공했다.
본 평가에 사용된 5마리 마우스 그룹은 다음과 같다:
ㆍ 무처리.
ㆍ 참조 화합물: 덱사메타손 0.5μmol(아세톤 중에 25mM 용액 20㎕).
ㆍ 매질: 진공처리된 리포좀 200㎕.
ㆍ 레스베라트롤: 레스베라트롤 리포좀 200㎕(총합 중의 10 μmol).
ㆍ PTER: PTER 리포좀 200㎕(총합 중의 10 μmol).
ㆍ QUER: QUER 리포좀 200㎕(총합 중의 10 μmol).
ㆍ PTER+QUER: 200㎕의 PTER 리포좀+QUER (총합 중의 10 μmol).
여러 처리를 마지막으로 투여한 후 24시간째(9일) 마우스를 죽이고 피부를 4% PFA에 고정시켰다.
실시예 7. TPA 를 이용한 건선의 실험적 유도
건선을 유도하기 위해, "12-O-테트라데카노일포르볼-13 아세테이트"(TPA) 제제를 사용했다. "포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트"(PMA)로도 일반적으로 알려진 제제 "12-O-테트라데카노일포르볼-13 아세테이트"(TPA)는 단백질 C의 키나제 효소(PKC)를 통한 시그널의 전달을 활성화시키기 위해 생의학 연구에서 통용되는 종양의 강한 프로모토이며 포르볼의 디에스테르이다.
이 질환을 탈모성 마우스 SKH-1에서 발생시키는데 필요한 TPA 용량과 관련하여, 몇몇 저자들은 상승된 10 내지 17 nmol/마우스의 용량을 사용했고, 달성된 과다증식의 재생은 사전에 면도한 건선이 있는 Balb/C 마우스에서 나타나는 방식과 유사하고, 이 모델은 건선 연구에 널리 사용된다. 하지만, 이 모델은 TPA를 1회 투여한 후에만 생화학적 또는 분자 파라미터를 평가하는데 사용되었다. 우리의 목적은 폴리페놀의 사용과 함께 건선 병변의 진행을 평가하는 것이기 때문에, 연속 노출 모델 및 더 약한 농도의 TPA를 1주 동안 TPA 2nmol 1일 용량으로 사용했고, 이는 건선의 진행을 관찰할 수 있게 해주었다.
유도는 1㎠ 영역에 아세톤 중의 200μM 용액 10㎕를 적용하여 2nmol TPA/마우스로 수행했다. 이 적용 프로토콜은 이 모델에서 언급한 20㎕를 적용할 때 부피가 상당히 증가하고 그 농도가 희석되어 더 농축하기로 결정한 점을 감안하여 수행했다.
단기 프로토콜은 도 9에 도시된 바와 같은 경피 유체 손실(TEWL)에서와 같이 도 8에 도시된 피부주름의 증가를 초래했고, 이 병변들은 도 10에 도시된 육안조사 수준에서 분명하게 나타났다.
따라서, 본 절차에서 개발된 프로토콜은 도 11에 제시된 것이다. 기준 처리로서 덱사메타손(Sigma 제품, 아세톤 중에 25mM 용액)을 사용했다. 검사할 제품 및 기준 처리의 투여는 TPA 적용 30분 전에 제공했고, 둘 모두 동일한 날에 시작했다.
본 평가에 사용된 6마리 마우스 그룹은 다음과 같다:
ㆍ 무처리.
ㆍ 참조 화합물: 덱사메타손 0.5μmol(아세톤 중에 25mM 1가지 용액 20㎕).
ㆍ 매질: 진공처리된 리포좀 200㎕.
ㆍ 레스베라트롤: 레스베라트롤 리포좀 200㎕(총합 중의 10 μmol).
ㆍ PTER: PTER 리포좀 200㎕(총합 중의 10 μmol).
ㆍ QUER: QUER 리포좀 200㎕(총합 중의 10 μmol).
ㆍ PTER+QUER: 200㎕의 PTER 리포좀+QUER (총합 중의 10 μmol).
여러 처리를 마지막으로 투여한 후 24시간째(7일), 각 그룹의 마우스 3마리를 죽이고 피부를 4% PFA에 고정시켰다. 나머지 마우스는 TPA에 노출시킴이 없이 처리 하에 유지시켜, 피부가 자발적인 것보다 치료 시에 더 빠르게 회복되는지를 입증했다. 여러 처리로 마지막 투여한 후 24시간째(9일) 나머지 마우스를 죽이고 피부를 4% PFA에 고정시켰다.
실시예 8. 옥사졸론에 접촉에 의한 과민증의 실험적 유도
동일한 물질에 감작시킨 후 옥사졸론의 적용은, 림프구 및 대식세포의 침윤, 표피 부종과 함께 습진 반응으로 나타나는 접촉 과민 반응을 생산시킨다.
BALB/c 마우스는 면도한 복부에 아세톤 중의 1.5% 옥사졸론(w/v) 100㎕를적용하여 0일째 감작시켰다. 과민화를 유도하기 전에, 귀 두께를 버니어 캘리퍼스(Mitutoyo 마이크로미터)의 도움으로 측정했다. 반응은 에탄올 중의 2.5% 옥사졸론 20㎕을 적용하여(오른쪽 귀의 각 면에 10㎕) 7일째 유발시켰다.
따라서, 본 절차에서 개발된 프로토콜은 도 12에 제시된 것이다. 대조 측정으로서, 에탄올 20㎕를 적용한 왼쪽 귀를 사용했다. 기준 처리로서, 베타메타손 0.5mg/g을 함유하는 Diprosone® 크림(Schering Plough B.V., Utrecht, The Netherlands)을 사용했다.
본 평가에 사용된 8마리 마우스 그룹은 다음과 같다:
ㆍ 무처리.
ㆍ 참조 화합물: 7일째 옥사졸론을 적용하기 30분 전에 Diprosone® 크림 10mg을 귀의 각 측면에 적용했다.
ㆍ 매질: 7일째 옥사졸론을 적용하기 30분 전에 귀의 각 측면에 적용된 빈 리포좀 10㎕.
ㆍ 레스베라트롤 prior: 7일째 옥사졸론을 적용하기 30분 전에 귀의 각 측면에 적용된 레스베라트롤 리포좀 10㎕(총합 중의 1 μmol).
ㆍ 레스베라트롤 after: 7일째 옥사졸론을 적용한 후 3 내지 4시간째 귀의 각 측면에 적용된 레스베라트롤 리포좀 10㎕(총합 중의 1 μmol).
ㆍ PTER prior: 7일째 옥사졸론을 적용하기 30분 전에 귀의 각 측면에 적용된 PTER 리포좀 10㎕(총합 중의 1 μmol).
ㆍ PTER after: 7일째 옥사졸론을 적용한 후 3 내지 4시간째 귀의 각 측면에 적용된 PTER 리포좀 10㎕(총합 중의 1 μmol).
ㆍ QUER prior: 7일째 옥사졸론을 적용하기 30분 전에 귀의 각 측면에 적용된 QUER 리포좀 10㎕(총합 중의 1 μmol).
ㆍ QUER after: 7일째 옥사졸론을 적용한 후 3 내지 4시간째 귀의 각 측면에 적용된 QUER 리포좀 10㎕(총합 중의 1 μmol).
ㆍ PTER+QUER prior: 7일째 옥사졸론을 적용하기 30분 전에 귀의 각 측면에 적용된 PTER+QUER 리포좀 10㎕(총합 중의 1 μmol).
ㆍ PTER+QUER after: 7일째 옥사졸론을 적용한 후 3 내지 4시간째 귀의 각 측면에 적용된 PTER+QUER 리포좀 10㎕(총합 중의 1 μmol).
옥사졸론 투여 후 24시간째(1일), 마우스를 죽이고 피부를 4% PFA에 고정시켰다.
실시예 9. 경피 수분 손실.
일부 피부 조건은 공피증 및 건선에서와 같은 피부의 기계적 성질의 손상을 특징으로 한다.
그럼에도 불구하고, 이러한 특징들의 객관적인 평가는 복잡하고, Tweameter TM210 시스템(CK electrinics, Germany)을 통해 평가한 경피 수분 손실(PTEA 또는 TWEL)의 측정은 피부 "장벽" 기능의 지표인자로 생각된다(g/h/㎠).
이러한 측정 형태의 물리적 기초는 아돌프 픽(Adolf Fick, 1885)에 의해 확립된 확산 법칙에 기반을 둔다:
Figure 112012041116415-pct00004
여기서, A = 표면적 ㎡, m = 물의 수송량(g), t = 시간(h), D = 확산 상수(=0.0877 g/m.h.mmHg), p = 대기 증기 압력(mmHg), x = 피부로부터 측정 지점까지의 거리(m).
확산 법칙 dm/dt는 시간 간격 동안 수송된 ㎠당 질량을 나타내며, 이것은 거리 dc/dx에 의한 농도 변동 및 면적 A에 비례한다. D는 공기 중에서의 수증기의 확산 계수이다. 이 법칙은 빈 원통과 유사 형태인 균일한 확산 구역 내에서만 유효하다. 최종 구배 밀도는 마이크로프로세서에 의해 분석된 2 세트의 검출기(온도 및 상대습도)에 의해 간접적으로 기록된다.
Tweameter TM 210 시스템의 프로브에서, 온도 및 수화 검출기뿐 아니라 측정 회로 및 보정용 데이터는 센서 내부에 위치해 있다. 센서 헤드는 중공의 좁은 실린더로 제조되고(직경 = 10mm, 길이 = 20mm), 그 기능은 센서의 공기 난류를 감소시키는 것이다.
마우스를 고정시킨 후, 등 위에 여러 화학제로 처리된 동일 영역에 프로브를 배치했다. TEWL 판독은, 판독 30초 내지 60초 사이에 나타날 수 있는, 측정기준이 안정화될 때까지 연속해서 수행했다.
실시예 10. 광보호제 및 UV -B 광조사에 장기간 노출 동안 항발암 효과
폴리페놀의 기계적 필터능
본 연구에 사용한 폴리페놀의 능력을 연구하기 위한 목적으로, 도 13에 도시한 바와 같이 자외선 스펙트럼을 통한 광흡수를 평가하기로 했다.
PTER뿐 아니라 레스베라트롤은 자외선 B 범위에서 피크 또는 최대 흡수를 나타내는 반면, QUER은 UV-A 내의 파장에서 더 큰 비율로 흡수되는 것으로 확인되었다.
폴리페놀의 광보호제 역할
다음 연구 단계는 광발암에 대하여 가능한 폴리페놀의 수복능(UV-B에 노출 후 폴리페놀 첨가)에 대비하여 광보호제 성분을 평가하는 것이다.
이 목적을 위해, 광보호제 능력은 도 14에 도시된 바와 같이 UV-B에 장기간 노출 후 평가했다. 마우스는 28주 동안 주당 3회씩 노출 당 UV-B 180mJ/㎠의 조사량으로 노출시켰다. 이 프로토콜로, 12주째 나타나기 시작한 종양이 유도되었다. 이 절차를 통해 전암성 병변이 평가되었고 도 15에 도시된 바와 같이 정량분석되었다.
병변 징후에 대한 여러 치료 효과를 비교한다면, 대조군뿐 아니라 UV-B에연속 노출 12주째부터 빈 리포좀으로 처리한 대조군은 50% 이상의 마우스에서 종양이 존재한다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 이에 반해, 폴리페놀 처리는 Resv 및 QUER의 경우에 대략 20주까지 종양의 출현을 지연시켰다. 하지만, Pter 하에 UV-B 장기 노출 30주 후에는 Pter 단독물 또는 Quer과의 배합물인 경우, 마우스의 10%만이 병변을 나타냈다. 이러한 보호 효과는 시판 광보호제에서 관찰되는 것보다 우수했다.
마우스당 병변 수와 관련해서, Pter 및 Quer과 배합된 Pter은 어떤 다른 처리에 비해 마우스당 병변의 수가 0이므로, 최대 보호를 제공하는 것이었다. 이하 표 3은 마우스당 병변, 즉 180mJ/㎠에 30주 동안 장기간 노출시킨 후(주당 3회) 여러 실험 그룹에서 나타나는 직경이 1mm가 넘는 전암성 병변의 1차 징후를 나타낸다. 참조 화합물 및 본 연구의 주제 화합물(폴리페놀 10μmol/마우스 또는 각 광보호제 200㎕)은 UV-B에 노출하기 20분 전에 마우스 등에 적용했다. 20마리 마우스 그룹.
　 종양 수/마우스 x 그룹(평균)　　
주 20 24 30
대조군 4,4 9,2 13,8
유리 리포좀 5,7 8,2 12,9
PTER 리포좀 0,0 0,1 0,0
QUER 리포좀 0,3 2,2 4,6
레스베라트롤 리포좀 0,3 1,2 3,8
Pter + Quer 리포좀 0,0 0,1 0,1
Vichy : 0,0 0,3 0,7
Heliocare : 0,0 0,5 1,06
Isdin : 0,1 0,5 0,6
해부병리학적 연구
SKH1 마우스에서 UV에 장기간 조사에 의해 유도된 종양의 조직병리학적 실험과 관련해서, UV-B 처리가 주로 염증 과정으로 인한 강한 가시세포증을 초래한다는 것이 확인되었다; 이것은 주로 흑색종이 아닌 암종 형태인 종양의 1차 징후로 전환되었다.
두 비흑색종 피부암의 대부분은 기저세포 암종 및 박편상 세포 암종이다.
시판 광보호제의 사용은 주로 염증을 차단했지만, Vichy만은 종양의 발달 가능성을 감소시켰다.
폴리페놀의 사용은 소염 효과 및 항종양 형성 효과가 있다: PTER은 효과가 가장 큰 화합물이었다. 하지만, 이의 대응물인 레스베라트롤과 비교해보면 소염 효과와 항종양 형성 효과 수준에서 큰 차이가 관찰되었다. 또한, 다른 시판 광보호제와 비교했을 때에도 더 우수한 결과를 제공했다.
Pter과 Quer의 배합물에 대해서는, 광보호제 효과와 관련하여 Pter 단독물 또는 그 배합물의 사용 간에 차이가 전혀 없는 것으로 확인되었지만, 이하에 논의되는 것처럼 소염 효과와 관련해서는 차이가 있었다. 도 16에 제시된 바와 같이, 이하 표 4는 UV-B에 장기간 노출 후, 구체적으로 180mJ/㎠에 30주 동안 장기간 노출시킨 후(주당 3회), 피부의 해부병리학적 연구 결과를 나타낸다. 참조 화합물 및 본 연구의 주제 화합물(폴리페놀 10μmol/마우스 또는 각 광보호제 200㎕)은 UV-B에 노출하기 20분 전에 마우스 등에 적용했다. 20마리 마우스 그룹의 평균. 모든 파라미터는 중증도의 정도에 따라 측정했다: (+) 가벼움-(+++) 심각함.
UV PQ + UV Resv + UV Isdin + UV Heliocare + UV
종양 (수/마우스 x 그룹) 13.8 0.1 3.8 0.7 1.1
간질 형성이상 + ++ ++ ++
　 섬유증 반응성
　 가시세포증 /가시세포분리 + / +++ +++ / ++ ++ +++ / ++
　 이상각화증 +++ + +
염증 +++ ++ ++ ++
실시예 11. 피부염 효과
여러 피부염 모델에 대한 여러 치료의 결과를 평가하기 전에, 마우스 피부에 폴리페놀을 연속 투여 시 가능한 부작용을 평가해야만 했고, 도 17에 제시한 바와 같다. 이 목적을 위해, 매일 평가를 위한 용량을 연속 6일 동안 투여했다.
관찰할 수 있듯이, 이 처리만은 장기간 처리 후에서 피부주름에 영향을 미치지 않았으나, 코르티코이드(예컨대, 덱사메타손)의 장기간 사용은 피부 구조에 부작용을 나타냈다.
방사선 UV -B에 급성 노출로부터의 보호
폴리페놀의 소염 특징은 광발암에 대한 보호로서 관찰되고 있는 바, 소염 역할을 UV-B에 강하게 노출시킨 후 조사했다. 4마리 마우스 등 피부의 두께 측정에 의해 수득된 결과는 도 1에 제시했다.
폴리페놀 Pter 및 Resv 각각 및 Pter+Quer의 배합물은 부종 형성의 감소로 인해, UVB 조사에 노출 후 유익한 효과를 나타냈다.
이러한 피부 두께의 증가는 주로 일부 염증 과정으로 인해 유발된 부피 또는 표피 세포의 과잉증식때문일 수 있다. 따라서, 도 2에 도시한 바와 같이 표피 두께를 측정하는 것이 필요했다.
폴리페놀로 처리된 마우스 표피 두께의 유의적인 차이는 UV-B로 처리된 그룹에서만 확인되었다. 실제로, PTER 처리 또는 PTER과 QUER의 처리는 시판 광보호제와 레스베라트롤보다 우수한 결과를 제공했다.
처리가 적용된 시기와 관련하여, 복원제로서는 아니지만 양호한 광보호 역할에 대해 적용 시기와 관련해 다른 결과를 나타내는 레스베라트롤 외에는, UV-B 노출 전 적용이나 노출 후 적용 간에 중요한 차이는 없었다.
또한, 표피 두께를 UV-B 360 mJ/㎠의 광조사 1주 후에 분석했을 때, UV-B 노출 전에 폴리페놀을 처리한 마우스는 UV-B 손상으로부터 보호되고, 광조사 24시간 후 수득한 표피 두께는 동일한 결과를 유지했고, 통계적 차이가 없다는 것을 확인했다. 광조사 후 폴리페놀을 적용한 경우에도 동일한 결과가 수득되었고, 단 QUER은 UV-B에 노출 후 적용 시에 최악의 예후를 나타냈고, 이 결과는 도 3 및 도 18에 제시된 바와 같이 시판 광보호제에서 관찰되는 결과와 유사했다.
TNCB 에 의해 유도된 아토피성 피부염 실험 모델에서의 보호
TNCB를 1차 투여한 후 24시간째 피부주름의 증가는 도 19에 제시한 바와 같이 조사되었다.
이 모델에서는 피부 두께를 정확히 측정할 수 없도록 하는 과정을 통해 병변이 생성되었기 때문에 피부주름을 측정하는 것이 불가능했다. 하지만, TNCB에 1차 노출 후 24시간째, 및 TNCB로 사전 감작화한 후 1주째 피부주름은 증가한 것으로 확인되었다. 이 도면에서 관찰할 수 있듯이, PTER(단독물 또는 QUER과의 배합물)뿐 아니라 덱사메타손은 TNCB 제제로 인한 염증 효과를 감소시켰다.
또한, 빈 리포좀은 리포좀 자신이 이의 목표 지점에 TNCB가 도달할 수 없게 하는 기계적 필터로서 작용하지 않아서 예상 병변을 생성하는 것으로 확인되는 바, 피부주름에 효과가 없었음을 관찰할 수 있었다.
병변의 육안 평가
여러 치료들 간에 차이를 정량분석하기 위하여 병변을 평가했다(도 20 및 도 21).
먼저 TNCB을 연속 적용하는 것부터 시작할 때, 피부 양상은 변화했고 TNCB 1차 노출 시작부터 전 과정 동안 수화 수준이 변화된 것이 관찰되었다.
단기적으로, TEWL 값의 분석은 TNCBA로의 처리뿐 아니라 덱사메타손 또는 빈 리포좀으로의 사전처리 시, 표피의 수화가 기본값에 비해 상당한 통계적 증가를 나타낸다는 것을 보여주었다.
하지만, 이 결과들의 분석에 의해 확인되는 것은, 폴리페놀 처리 시, 특히 Pter-Quer 배합물 처리 시에는 미처리 피부(기본값)에 비해 큰 통계적 차이가 없다는 것이었다. 이것은 폴리페놀이 물 단독물보다 훨씬 더 표피에 대한 수화 효과가 있으며, 또는 TNCB에 의한 공격에 대해 보호 효과가 있다는 것을 보여준다.
이때, 차이는 TNCB에 의해 수득된 값에 비해 통계적 유의성이 있는 것은 아니었는데, 그 이유는 아마도 덱사메타손으로 처리된 그룹을 비롯해 모든 그룹에서 병변이 있었기 때문이다.
병변과 관련해서, 병변의 정도가 낮은 수준이었는데, 그 이유는 다른 모델과 달리 TNCB 투여 프로토콜이 저용량을 사용했고, 이것이 적은 병변을 생성했지만, 실제 병변과 더 유사하다는 것을 표시한다.
주목해야할 가장 중요한 사실은 아토피성 피부염의 가능한 예방이나 치료에 대한 것으로, 덱사메타손은 병변 지수와 관련해서 또는 피부주름의 증가와 관련해서 어떤 유익한 효과를 나타내지 않았다. PTER은 덱사메타손 사용 시보다 또는 무처리 시보다 덜 심한 병변을 초래했다.
옥사졸론에 의해 유도된 접촉 과민증 모델에 대한 보호
접촉 과민증, 아토피성 피부염 및 건선과 같은 피부 장애는 피부의 과잉증식 및 염증 장애를 특징으로 한다.
피부 장애를 치료하는 현행 요법은 글루코코르티코이드와 같은 소염제 및 항증식제의 사용을 포함한다. 본 연구에서 말하고자 하는 것은 천연 폴리페놀의 사용이 도 22에 도시한 바와 같이 피부염을 임상적으로 향상시킨다는 것이다.
피부 장애에 미치는 PTER의 효과는 귀 부종의 예방 시에 옥사졸론을 사용하여 측정한 진피 염증에 대해 유사한 접촉 과민증을 나타낸 동물로 수행한 절차에 따라 확립했다.
피부 면역-관련 염증 장애를 모방한 상기 생체내 약리학적 시험의 결과는 병변에 적용된(옥사졸론 투여 후 적용) 폴리페놀, 특히 PTER이 옥사졸론에 의해 유도된 염증 결과로서의 염증 변화를 방지할 수 있었다. 유사한 결과는 디프로손에 의해서도 관찰할 수 있다.
실시예 12. TPA 에 의해 유도된 건선에 미치는 효과
건선 중의 부종 연구
피부에 대한 TPA의 적용은 혈관확장, 백혈구 침윤 및 부종을 초래하는 바, 조직 중량으로서 피부주름의 변동뿐 아니라 피부 염증의 둘레를 측정하는 것이 바람직하다(도 23 참조).
이 절차 동안(6일 연속) 피부주름의 증가를 평가하는 동안, 3가지 다른 그룹이 관찰되었다. 제1 그룹은 대조군 및 덱사메타손 처리 그룹(TPA 투여 30분 전에 0.5μmol/마우스)에 해당하며, 처리를 통해 이들 간에 차이가 없었고, 이것은 덱사메타손이 건선 발생을 예방했음을 나타낸다. 제2 그룹은 TPA, 빈 리포좀 및 Resv에 의해 형성된 그룹으로, 이 절차의 중반까지는 부종 형성의 증가와 함께 유사한 진행을 나타냈다.
마지막으로, Pter, Quer 및 Pter+Quer에 의해 형성된 그룹으로, TPA 그룹 전반적으로 피부주름 증가의 중요한 감소가 관찰되었고, 적어도 1차 투여 24시간 후에 유의적인 차이를 나타냈다(도 24 참조).
피부주름의 증가로 관찰할 수 있듯이, 마우스 피부에 대한 TPA의 적용은 투여 24시간 후 유의적인 강한 염증인 부종을 생성한다. TPA를 국소 투여하기 30분 전에 참조 제품인 덱사메타손(0.5μmol/마우스)의 적용은 피부주름의 증가를 유의적으로 감소시켰다.
동시에, PTER, QUER 및 이 두 배합물의 처리는 또한 부종의 출현을 유의적으로 감소시켰다. 빈 리포좀(주입되지 않은)의 사용은 부종의 출현에 아무런 영향을 미치지 않았고, 이는 Pter, Quer 또는 Pter+Quer에 의해 관찰된 효과가 리포좀 조성물에 의한 것이 아니라 폴리페놀의 특별한 효과 때문이라는 것을 시사한다. 이 효과는 당해 폴리페놀, 레스베라트롤이 주입된 리포좀(이것은 TPA 그룹에 비해 피부주름 증가에 어떤 효과도 미치지 않았다)과 비교할 때 확실해졌다.
TPA 3회 투여 후 피부주름을 비교하면, 육안 수준의 병변이 분명한데, 이는 도 25에 제시했다.
이때, Pter, Quer 및 두 배합물의 사용이 TPA에 의한 염증에 감소 효과를 얼마나 나타내는지도 분명하게 알 수 있었다.
병변의 육안 평가
병변은 도 26에 제시된 바와 같이, 여러 처리들마다의 차이를 정량분석하기 위한 목적으로 평가했다.
TPA 7회 적용 후 24시간째 병변의 박리에 따라 병변에 수치 값을 매겼는데, 그 이유는 이것이 확인되는 유일한 변화였기 때문이며, 홍반이나 궤양은 표시가 나지 않았다.
피부의 박편 양상은 0 내지 3의 등급으로 정량분석했고, 0은 전혀 나타나지 않음; 1은 약간 나타남; 2는 보통 나타남; 3은 심각하게 나타남이다. 각 그룹의 중간은 도 2에 제시한 바와 같이 염증 정도를 시사했다.
PTER 단독물 또는 QUER과의 배합물로 처리된 그룹만이 박리 지수 또는 박피 지수가 낮은 그룹인 것을 관찰할 수 있다.
병변의 조직학적 분석
이 분석은 도 28에 예시했다.
조직학적으로, 내부 두께가 있는 표피 능선의 연장(건선형 과다형성), 유도 연장 및 부종, 해면상 각막내 농포(코고이 농포)가 있는 유두상위 표피 위축, 과립층 결여 또는 저과립구증, 이상각화증, 먼로 표피내 미세농양, 확장 및 사행 유두상 모세혈관, 혈관주위 림프조직구 침윤 및 소수의 호산구 및 형질세포가 존재한다.
건선은 만성 염증성 피부염으로, 임상적으로 구진 및 박피성 홍반 형태의 병변과 풍부한 진줏빛 백색의 박피를 특징으로 한다. 그 과정은 일반적으로 악화와 경감 기간으로 장기간 진행되지만, 까다롭다. 다른 임상적 설명이 있지만, 일반적으로 동일 환자 내에서도 변화가 있을 수 있어서 고정된 틀은 없다. 우리는 조사 도안 또는 병의 여러 진행 단계 동안 이러한 다양한 변화를 관찰할 수 있었다.
오랫동안, 건선에서 표피의 과다형성은 증식 단계에서 발아 세포의 수 및 표피내 증식 단편화수에 의해 특징지워지는 각질세포의 과잉증식에 부차적인 것이다. 임상 단계 동안 세포 수 및 유사분열 지수의 증가가 검출되었다.
안정한 건선 병변의 전형적인 조직병리학적 특징은 "표피 건선형 과다형성"이다(Lever's Histopathology of the Skin. 10th edition). 이것은 기저면이 넓고 상부가 좁은 표피 융기가 있는 규칙적인 표피 가시세포증을 특징으로 하고, 여기에는 보통 유두상위 표피의 박막화가 존재한다.
TPA로 그룹에 건선을 유도한 당해 모델에서, 이 유두종증이 관찰되었으나, 유두상위 표피의 좁아짐은 관찰되지 않았다. 또한, 과다각화증 이상각화증도 관찰되었다.
처리를 중단한 마우스로부터 절단물을 만들었을 때, 육안 수준의 분명한 병변을 확인되지 않았고, 따라서 오류가 있을 수 있어서 박리 수준은 분석하지 않았다. 하지만, 조직 분석 결과, 피부가 건강한 피부가 아닌 것으로 나타났다. 따라서, 집중 분석한 결과, 건선 병변이 퇴화기에 들어간 경우, 정상적인 각화가 회복되는 경향이 있고 이상각화증은 사라지기 시작하고 표피가 얇아지기 시작한다. 또한, 형태가 정상 피부 수준에 도달하지는 못해도 유두종증은 사라진다.
여러 처리 그룹을 비교할 때, 덱사메타손 처리 그룹은 유두종증 또는 과다각화증 없이 매우 얇은 표피를 제공하는 것으로 관찰되었다. 일부 시점에서는 피지선에 대한 병변의 증거도 있었다.
PTER로 처리된 그룹과 관련하여, 가장 큰 차이는 유두종증의 징후가 없지만, 집단 증식으로 인한 가시세포증이 있다는 것이다. TPA 또는 빈 리포좀만으로 처리한 그룹과 비교해보면, 가시세포증은 현저하지 않았고, 이상각화증도 마찬가지였다.
이것은 PTER과 구조가 유사한 레스베라트롤 처리 그룹에서는 나타나지 않았는데, 그 이유는 이 그룹의 증식과 가시세포증이 PTER 처리 그룹에서보다 덜 현저했기 때문이다. 이외에도, 여러 처리를 비교할 때, 레스베라트롤 처리된 그룹은 PTER 그룹보다 TPA 처리 그룹과 더 유사하다.
또한, PTER과 QUER의 배합물은 PTER 단독물에 의해 관찰되는 것과 유사한 표현형을 나타냈다.

Claims (29)

  1. 프테로스틸벤(PTER) 및 피부과학적으로 허용가능한 부형제를 포함하고, UV-B 방사선에 노출됨에 의하여 발생되는 피부암의 위험을 경감 또는 완화시키기 위한 국소 투여용 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 케르세틴(QUER) 또는 그것의 임의의 허용성 염을 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 선스크린 형태로 조제된 약제학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    리포좀 형태로 조제된 약제학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 UV-B 방사선은 태양에 의하여 방사된 것인 약제학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 방사선에 노출되기 전 20분까지 투여되는 것인 약제학적 조성물.
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