JP4541699B2 - カルボキシレート−ゲート−ニトロキシド（ｃｇｎ）化合物および組成物ならびにその使用方法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

相互参照
本出願は、米国特許出願０９／９４８,５０５の部分継続出願であり、その出願を出典明示により本明細書の一部とし、米国法による優先権を持つ。

発明の分野
本発明は、酸化的ストレスから生じる慢性および急性の疾患および障害の治療および予防に関する。新規な化合物、組成物およびその使用法は、治療薬および診断薬の分野に関する。

発明の背景
多くの急性および慢性の疾患および障害は、内因的および外因的に生じた活性酸素種（ＲＯＳ）からの損傷に原因がある。ＲＯＳ損傷が起きるのは、抗酸化酵素およびビタミンの正常な解毒能が破壊されたときである。ＲＯＳを処置するための組換え抗酸化酵素およびビタミンを含有する補助剤はいくつかの利点と限界を有する。一酸化窒素（ＮＯ・）およびスーパーオキシド（Ｏ_２・⁻）はいずれも、単独または協力してＲＯＳカスケードおよび損傷を開始し得る生理的ガス状の遊離ラジカルである。進行中の薬剤開発プログラムは、ＮＯ・の補充または除去を標的としている。モデルとしてスーパーオキシドディムスターゼ（ＳＯＤ）を用いて、代替薬剤を開発する戦略は、Ｏ_２・⁻の除去および後に続くＲＯＳカスケードの弱化を目的としている。後者のプログラムは、「金属中心」または「金属フリー」合成分子における、例えば、それぞれキレート遷移金属またはニトロキシドにおけるＳＯＤの触媒活性を模倣することを含む。ポリニトロキシル化「金属中心」（すなわち、ポリニトロキシルヘモグロビン）および「金属フリー」（すなわち、ポリニトロキシルアルブミン）血液タンパク質を脈管ＲＯＳ損傷の保護剤および造影剤として使用することは、米国特許 5,725,839; 5,741,893; 5,767,089; 5,804,561; 5,807,831; 5,817,632; 5,824,781; 5840,701; 5,591,710; 5,789,376; 5,811,005; 6,048,967 などの特許に記載されている。しかし、一般的に認識されているように、ひとつの方法がすべてのＲＯＳ損傷を処置できるわけでない。事実、継続的な研究努力が前に予想できないような新しい挑戦に取り組むのに必要である。本発明は、活性中心である「カルボキシレート−ゲート−ニトロキシド（ＣＧＮ）」の新しい合成類似体の存在を示す。

本発明は、ＣＧＮの合成、そのエステル化および非エステル化形態における「金属中心」および「金属フリー」の新規化合物、それらの所望の治療部位への標的送達における利用も示す。さらに、共有結合による共役および存在薬物または標的分子との共役使用がこれらの医療上の適用を増加する。

発明の要約
カルボキシレート−ゲート−ニトロキシド（ＣＧＮ）化合物、そのエステル化誘導体組成物、ＲＯＳ損傷に由来の疾患および障害の治療および予防のための使用法を開示する。本発明の組成物は、ＣＧＮを含み、望ましくない高レベルの活性酸素種（ＲＯＳ）に暴露された組織を処置するのに有用である。ＣＧＮに加えて、その有用な誘導体を適当な医薬製剤、化粧品製剤、診断製剤において、静脈内、腹腔内、筋肉内、経口、局所的、経鼻、経肺、直腸内投与のために使用できる。ＣＧＮおよびその誘導体の例には、エステル化ＣＧＮ、エステル化ジカルボキシルアミノ酸ＣＧＮ、エステル化カルボキシルジアミノ酸ＣＧＮ、その誘導体、例えば、ジニトロキシド、トリニトロキシド誘導体または共役体があり、単独で、または存在する薬物または標的分子と組み合わせて使用する。ニトロキシドの医薬製剤および投与経路を記載する。特に、本発明の組成物の局所適用によると、細胞内へのＣＧＮの標的化送達が、プロドラッグとしての疎水性エステル化ＣＧＮの、遊離酸形の親水性ＣＧＮへの細胞エステラーゼ解裂を介して達成される様式を示す。

本発明のニトロキシド化合物は、発明的特徴を提供する３つの分子特性を含む。第１に、本発明の化合物は、一緒に直接的に結合する窒素原子と酸素原子を含み、そして不対電子（・ＮＯ）を含む。第２に、本発明の化合物は、少なくとも２酸素原子を含む分子の第２部分を含み、第２部分は負電荷、例えば、１、２、３またはそれ以上のカルボン酸基を提供する。第２部分は、所定の反応後、例えば、エステル基のアルキル部分を除去した後にカルボン酸基をつくるように構成され得る。第３に、本発明の化合物は、第１部分と第２部分との間に位置する結合基を含み、この結合基が、第２部分が第１部分の方に曲がる負電荷効果を可能にし、それによって人体の環境領域における（・ＮＯ）部分の安定の保持を助ける。

ＣＧＮの組成および投与経路を局所適用で記載し、細胞内でＣＧＮの標的送達が、プロドラッグとしての疎水性エステル化ＣＧＮの遊離酸形における親水性ＣＧＮへの細胞エステラーゼ解裂を介して、どのように達成されるかを示す。先行技術の化合物である４−ヒドロキシル−２,２,６,６−テトラメチル−ピペリジン−１−オキシルに対する生物半減期および細胞内送達の改善を、２ニトロキシドの窒素安定同位体、およびその共投与（エアゾール、経直腸、経口）分布、代謝、消失の試験を用いて、電子常磁性共鳴分光法で調べ明らかにする。本発明は、エステラーゼ水解エステル化ＣＧＮが、分子のインビボ安定性を触媒活性に影響することなく保護する「ゲート」として、そのカルボン酸部分を提供することを示す。局所、静脈内、経口、経肺の投与の例には、ＣＧＮの選択された誘導体がある。ＵＶＢにより誘発された急性および慢性の皮膚病変の予防におけるＣＧＮの効力の例を、照射の前および後で、提示する。

（図面の説明）
図１は、エステル化カルボキシレート−ゲート−ニトロキシド（ＣＧＮ）およびその誘導体の一般的構造式を示す。
図２は、エステル化ジカルボキシルアミノ酸ＣＧＮの一般的構造式を示す。
図３は、エステル化カルボキシルジアミノ酸およびその誘導体の一般的構造式を示す。
図４は、選択された化合物の一般的構造を示す。これは、実施例で例示する。
図５は、一般化合物、２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−ピペリジリデン−４−スクシネートを示す。

図６は、ひとつのヒドロキシル（−Ｈ）基で置換されたＲ_２を有する図５の半一般的構造式を示す。
図７は、水素で置換されたＲ_２およびＲ_３を有する図５の構造式を示す。これを、化合物２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−ピペリジリデン−４−スクシネート（ＴＯＰＳ）と称する。
図８は、水素およびエチルでそれぞれ置換されたＲ_２およびＲ_３を有する図５の構造式を示す。これを、化合物モノエチル−２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジリデン−スクシネート（Ｅ−ＴＯＰＳ）と称する。
図９は、両Ｒ_２およびＲ_３ともエチルである図５の構造式を示す。これを、化合物ジエチル−２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジリデン−スクシネート（ＤＥ−ＴＯＰＳ）と称する。
図１０は、両Ｒ_２およびＲ_３ともtert−ブタノールである図５の構造式、すなわちジ−tert−ブチル−２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジリデン−スクシネート（ＤＢ−ＴＯＰＳ）を示す。

図１１は、Ｒ_２がTempolである図５の一般的構造式，すなわちＴＥ−ＴＯＰＳを示す。
図１２は、両Ｒ_２およびＲ_３ともTempolである図５の構造式、すなわちＴＴ−ＴＯＰＳを示す。
図１３は、一般環が５員環である図４の構造式を示す。
図１４は、ＴＯＰＳならびにそのカルボン酸エステル誘導体、Ｅ−ＴＯＰＳおよびＤＥ−ＴＯＰＳを同定する液体クロマトグラフィー・スペクトルを示す。
図１５は、水環境における水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）によるＤＥ−ＴＯＰＳからＴＯＰＳへの加水分解を示す。ＥＰＲシグナルから明白なように、加水分解の前後にＤＥ−ＴＯＰＳからＴＯＰＳへの完全な転換が起きる。

図１６は、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳおよび^１５Ｎ−TempolからＴＥ−ＴＯＰＳの合成における構造変化を表示する液体クロマトグラフィーＨＰＬＣおよびＥＰＲスペクトルを示す。
図１７（ＡおよびＢ）は、^１４Ｎ−^１５Ｎ−ＴＥ−ＴＯＰＳの２モノラジカルへのインビトロおよびインビボでの加水分解を示す。
図１８は、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳのインビボ血漿半減期が^１５Ｎ−Tempolに比して、両者のマウス腹腔への共投与時に、伸長することを示す。
図１９は、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳのインビボ血漿半減期が^１５Ｎ−Tempolに比して、両者のマウス静脈への共投与時に、伸長することを示す。
図２０は、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳのインビボ血漿半減期が^１５Ｎ−Tempolに比して、両者のマウス筋肉内への共投与時に、伸長することを示す。

図２１は、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳのインビボ血漿半減期が^１５Ｎ−Tempolに比して、両者のマウスへ経口共投与時に、伸長することを示す。
図２２Ａ−Ｃは、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳおよび^１５Ｎ−Tempolを毛無しマウス皮膚に適用するときに、フランツ型拡散セルにおけるＤＥ−ＴＯＰＳの皮膚透過および区分化（compartmentalization）を示す。２２Ａは適用前；２２Ｂはレセプターセルにおいて；２２Ｃは皮膚において２０時間である。
図２３は、ＥＰＲＩによるＤＥ−ＴＯＰＳの皮膚透過および区分化を示す。
図２４は、マウスＬＤ_５０試験におけるＥ−ＴＯＰＳについて生存率と用量の関係をTempolに比して示す。
図２５は、毎日の適用１０日後の尿中への排泄および血漿での減少を介するＤＥ−ＴＯＰＳの代謝を示す。

図２６は、ＥＰＲにより測定されたＥ−ＴＯＰＳのスーパーオキシドディムスターゼ活性を示す。
図２７は、ＤＥ−ＴＯＰＳ、Ｅ−ＴＯＰＳ、ＴＯＰＳの、皮質ニューロンに対するヘモグロビン誘導毒性の用量依存的阻害を示す。
図２８は、ＤＥ−ＴＯＰＳ、Ｅ−ＴＯＰＳ、ＴＯＰＳの、皮質ニューロンに対するペルオキシ亜硝酸塩誘導毒性の用量依存的阻害を示す。
図２９は、ＤＥ−ＴＯＰＳ、Ｅ−ＴＯＰＳ、ＴＯＰＳが、ペルオキシ亜硝酸によるヒドロキシフェノール酢酸（ＨＰＡ）のニトロ化を用量依存的に阻害することを示す。
図３０は、Ｅ−ＴＯＰＳが、種々のインキュベーション時間でＹ−７９細胞系に対する腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）により起こされたアポトーシスを減少することを示す。

図３１は、ＤＥ−ＴＯＰＳの照射前局所適用が毛無しマウスでのＵＶＢ誘導の皮膚障害を急性的に防止することを示す。
図３２は、１１日間のＵＶＢ照射後での毛無しマウスの組織病理学的変化を、対照または照射前適用のＤＥ−ＴＯＰＳで示す。
図３３は、ＤＥ−ＴＯＰＳの照射前局所適用が毛無しマウスでのＵＶＢ誘導の皮膚障害を４か月の慢性的に防止することを示す。
図３４は、ＤＥ−ＴＯＰＳの照射後局所適用が毛無しマウスでのＵＶＢ誘導の皮膚障害を急性的に防止することを示す。
図３５は、１１日間のＵＶＢ照射後での毛無しマウスの組織病理学的変化を、対照または照射後適用のＤＥ−ＴＯＰＳで示す。

図３６（Ａ、Ｂ、Ｃ）は、ＵＶＢ誘導の急性障害に対するＤＥ−ＴＯＰＳの作用をTempolと比較して、照射前１０分または２時間での適用で示す。
図３７は、ＤＥ−ＴＯＰＳ、プラセボおよびレチン−Ａを比較し、ＤＥ−ＴＯＰＳ処置および紫外線照射１５日後で示す。

発明の詳細な説明
本化合物、製剤および使用を記述する前に、本発明が特定の構造に限定されず、説明の処方および使用はもちろん変化の多いものであると理解されるべきである。また、使用された用語が特定の実施態様のみを説明する目的のためにであって、限定の意図は存するものでないことが理解されるべきである。本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

値の範囲が提供されている場合、下限と上限との間の各介在値が、内容が明らかに他の事項を記述していない限り下限の単位の十番まで、具体的に開示されていると理解されるべきである。記述値または記述範囲の介在値と記述範囲の他の記述または介在値との間の各小さい範囲が本発明中に包含される。これらの小さい範囲の上限および下限は、その範囲中で独立的に包まれまたは排除され得、いずれかまたは両者が小さい範囲中に含まれるか、いずれも含まれない各範囲も本発明に包含され、ただし記述限界における具体的に除外された限界に従う。記述限界が１または両方の限界を含むときに、これらの除外限界のいずれかまたは両者を除外する限界も本発明に含まれる。

他に定義されない限り、本発明で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野での当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似または等価のものを本発明の実施および試験に使用できるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書に記載のすべての公表文献は出典明示により本明細書の一部とし、引用の公表文献と合わせて方法および／または材料を開示し記載する。

本明細書および請求項に使用のように、単数の「ａ」、「ａｎｄ」、「ｔｈｅ」は、内容が明らかに異なるものを記述していない限り、複数形を含む。例えば、「ニトロキシド」についての言及は複数の該化合物および官能基細胞を含み、「製剤」についての言及は、１またはそれ以上の製剤および当業者に知られているそれと等価のものを含む。

本明細書で述べる公表文献は本発明の出願時以前の開示についてのみ提供する。ここではなにものも、本発明が以前の発明による該公表を先行していたことを認めるものとして構成されていない。さらに、公表の日付は、個々に確認される必要があるかも知れない実際の日付と異なることがある。

さらに、本発明の化合物は、それが生物体と反応して、化合物の構造に変化をもたらして、所望の場所に化合物の直接的送達を高めるように構成され得る。

本発明の化合物は、細胞内の停留が重要でありそして皮膚、角質層などの疎水性バリアーまたは他の同様の膜が選択的に浸透性である生物学的意味で用いられるときに診断的および治療的な有用性が増加するように具体的に設計されるものである。この組成物は、エステラーゼ含有の細胞に送達するときに、特に有用である。この組成物は、化学物質やトキシン、さらに太陽、ＵＶなどのイオン化照射に生体が暴露されることから生じる遊離ラジカルの毒性作用を軽減するために使用できる。特定化された方法および製剤も、様々な生理状態を診断および処置し、またニトロキシドおよびその反応性を測定する造影法でインビボ反応を解析するのに、本発明の化合物を用い得る。本発明はまた、局在的な場所でニトロキシドの医療量の標的化および分画化を可能にし、特に皮膚内境界面での浸透および停留を可能にするような新規のニトロキシド組成物に関する。

本発明の化合物は、図１−１３に示される構造式により定義できる。これらの化合物は、所望の方法、例えば、所望の医薬として有効な製剤をつくるような方法で、製剤し得る。化合物を薬学的に許容される担体に混合し、溶解および／または懸濁せしめる。例えば、クリーム、ゲル、ローションを皮膚への局所適用のために使用し得る。塩類溶液を注射用に使用し得る。

本発明の化合物および組成物は、所望の方法で適用できる。一般的に、化合物を投与の特定の形態に適した組成物に製剤する。例えば、ヒトの皮膚に適用されるローション、口腔および上部咽頭のうがい用の水/エタノール製剤、注射用の塩類水溶液に製剤する。

発明についての総説
本発明に多くの態様があり、その態様は、化合物、適当な担体中に化合物を含む製剤、処置方法を含む。構成される化合物は、生物（例えばヒト）に対してＣＧＮの抗酸化作用を提供し、およびこの作用を所望の治療結果が得られるような十分に長い期間で提供する。本発明のＣＧＮは、ＮＯ基が同じ分子内でカルボキシレートにより「ゲート」されるように構成することで、そのレドックス変調機能がインビボで長時間維持される。ＣＧＮのＮＯ基を２カルボキシレート基に対して対称的にまたは非対称的に位置せしめ得る。

本発明の化合物（参照、図１−１３）を、ある範囲の異なる処置のための広範な製剤に組合せ得る。処置は、一般的に生化学反応の変調であり、あるいはより具体的に後述するような酸化反応の低減である。得られる変調作用は、ビタミンＣなどのビタミンの抗酸化作用よりも一般的に大きく、そして内因性触媒の作用よりも一般的に小さい。酸化反応の変調の必要は、一般的に下記するような感染に対する人体の過剰反応によりしばしば生じる。

血液は、血漿、赤血細胞、白血細胞からなる。赤血細胞は酸素の輸送を担い、白血細胞は感染に対する防御を提供する。白血細胞は２つの型−リンパ球と単球を含む白血球を含む。白血細胞はまた、３つの型−好塩基球、好酸球、好中球を含む果粒球を含む。

好中球は最も豊富な白血細胞であり、本発明で特に関心がある。好中球は、毛管壁を通って絞り出て、感染された組織を発見するか、または外傷の対象となっている感染組織と誤認され得るものを発見する。好中球は、骨髄から放出され、循環し、問題の化学物質の方に細胞を動かす化学走性により感染および炎症に向かう。好中球が異物または細菌を発見すると、好中球はそれを飲み込み、顆粒から酵素および過酸化水素などの化学物質を放出し、それを酸化し、例えば、細菌を殺す。感染部位のうみは死んだ好中球などの細胞の残骸である。この過程は感染と戦う健康的なものであるが、生体は一般的に過剰反応し、過剰の酸化による追加の炎症を起こす（参照、米国特許５,２１１,９３７および特にその図５）。

本発明の化合物は、酸化の比率および／または全体量を低下し、それによって炎症を減少する。本発明のＣＧＮ化合物は、通常のニトロキシド、例えば、４−ヒドロキシル−２,２,６,６−テトラメチル−ピペリジン−１−オキシル（Tempol１）に優れる利点を、下記のように提供する。

１）標的送達：ＣＧＮエステルは角質層を貫通し、局所適用後に生存皮膚細胞により優先的に取り込まれる。細胞に入る際に、プロドラッグのエステル結合が細胞内エステラーゼにより解裂され、ＣＧＮをその遊離酸形に転換し、膜貫通を非常に少なくする。このインビボ酵素転換がエステラーゼ含有皮膚細胞の内部でＣＧＮを効果的に区画化する。

２）インビボゲート機能：加水分解された遊離酸の状態で、「ゲート」として働くカルボキシレートはニトロキシドの細胞内活性を保護し護衛する。

３）インビボ安全性：ＣＧＮの急性毒性（ＬＤ_５０）は２ｇ／ｋｇでも検出されない。Tempolのそれは３７５ｍｇ／ｋｇである。
簡単にいうと、本発明は細胞内カルボキシレート部分を持つＣＧＮを開示する。このカルボキシレートがニトロキシド部分のインビボ還元を、その触媒活性に影響を与えないで「防衛」する。

本発明は、反応性酸素種（ＲＯＳ）から生じる疾患または損傷の予防および治療のための、カルボキシレート−ゲート−ニトロキシド（ＣＧＮ）の化合物、製剤、使用法を開示する。本発明の化合物、製剤、方法は、単独でまたは下記特許に開示される化合物と併せて用い得る：米国特許 5,725,839; 5,741,893; 5,767,089; 5,804,561; 5,807,831; 5,817,632; 5,824,781; 5840,701; 5,591,710; 5,789,376; 5,811,005; 6,048,967。

本発明は、モノ機能ＣＧＮおよびビ機能ＣＧＮを含む一般的クラスのＣＧＮを包含する。モノ機能ＣＧＮは、その抗ＲＯＳ損傷活性のみを意味する。ビ機能ＣＧＮは、コンジュゲート存在薬物部分ＣＧＮからの第二医療活性を意味する。これは、「カルボキシレート−ゲート」を提供するだけでなく、その成立形態において細胞内抗ＲＯＳ活性の送達を標的にする。ＣＧＮのインビボ標的化送達および安定性は治療指標および診断有用性を高める。

ＣＧＮエステル化誘導体およびその前駆物質を含む安定なモノおよびビ機能ＣＧＮ、その製剤、その使用を開示する。モノ機能ＣＧＮとしての酸化／還元活性および分画化は、カルボン酸基のエステル化により調節され得る。１以上のカルボキシレートを含む本発明の化合物が「ゲート」機能をもたらす。この機能は、「プロドラッグ」（例えば、エステル）の形態で細胞膜を通るＣＧＮの貫通性を増加し、またインビボ半減期を高める。ＣＧＮは既存の薬物でエステルまたはアミドを介して修飾でき、ビ機能ＣＧＮを作る。

ＲＯＳ損傷からの組織障害を処置する組成物は、ＣＧＮ、そのエステルまたは活性薬物誘導体を、適当な医薬、化粧品、診断製剤中に、静脈内、腹腔内、筋肉内、経口、局所、経鼻、経肺、経膣、皮膚透過、経直腸の投与のために含有する。

化合物の合成
ＣＧＮの３一般構造式を図１、２、３に示す。構造Ｉは図１に記載のＣＧＮである。これは、ケトンまたはアルデヒドニトロキシドとエステル化ジカルボン酸との反応から合成する。構造IIは図２に記載のモノアミノＣＧＮである。これは、カルボキシルまたはアセトアミドニトロキシドとジエステル化ジカルボキシルα−アミノ酸との反応から合成する。構造IIIは図３に記載のジアミノＣＧＮである。これは、カルボキシルまたはアセトアミドニトロキシドとジエステル化およびアミジオジアミノ酸（エステル化基は既存の薬物を含むＯＨ官能基を持ついかなる化合物でもある）との反応から合成する。構造IIIにおいて、２アミノ基はニトロキシドおよび任意的に他の部分とカルボキシル基を結合するのに役立つ。このように、ＣＧＮの例には、エステル化ジカルボキシレートＣＧＮ、エステル化モノアミノ酸ＣＧＮ、およびジニトロキシドやトリニトロキシドの誘導体、または単独あるいは既存の薬物や標的分子と併せて使用されるコンジュゲートがある。

ＣＧＮの組成物および投与経路を記載する。多くの例において、本発明の組成物の局所適用は、どのように、ＣＧＮの標的化送達が、細胞内でプロドラッグとしての疎水性エステル化ＣＧＮの遊離酸形態における親水性ＣＧＮへの細胞エステラーゼ解裂によって達成されるかを示す。Ｅ−ＴＯＰＳなどのＣＧＮの第２例で、血漿半減期を共投与で先行技術のニトロキシド、Tempolと比較して試験した。Ｅ−ＴＯＰＳのTempolを越える長い半減期を、Ｅ−ＴＯＰＳおよびTempolを投与したときに（腹腔内、静脈内、筋肉内、経口）認めた。ＤＥ−ＴＯＰＳなどのＣＧＮの第３例をＵＶＢ誘発皮膚障害の無毛マウスモデルで試験した。

定義
用語「ニトロキシド」を、互いに結合している酸素および窒素を含む分子を記述するために、本明細書で用いる。ニトロキシドは電子の供与体または受容体であり得る。ニトロキシドは、前駆物質（Ｎ−Ｈ形など）を含む安定なニトロキシル遊離ラジカルおよびその対応のヒドロキシルアミン誘導体（Ｎ−ＯＨ）を含む誘導体を含み得る。その場合、酸素がヒドロキシル基で置換され、ハロゲン化水素の形態で存在する。本発明のニトロキシドをヒトなどの生体に投与できる。ニトロキシドは電子の供与または受容により酸化および還元反応を変調する。ニトロキシドの不対電子は、窒素核において、強力な電子供与基で置換された２つの隣接炭素原子により安定となる。Ｎ−Ｏ結合の酸素上の部分的負電荷と、２つの隣接炭素原子が一緒になって窒素核上に不対電子を局在化させる。ニトロキシドは一般的に複素環または直鎖構造のいずれかを有し得る。

本発明のニトロキシドは、１、２またはそれ以上のカルボキシル基またはエステル基などの基を有し得る。これらの基は、ニトロキシドが電子供与体として作用するのを可能にする遊離電子の維持を助けるカルボキシル基に容易に変化し得る。インビボ環境において、ニトロキシドは、第１スーパーオキシドと反応して、オキソアンモニウム（電子供与体として）を形成でき、ついで第２スーパーオキシドと反応して、ニトロキシド（電子受容体として）を形成できる。ニトロキシドは、ヒドロキシルアミンに還元されると、反応を変調する能力を失う。ニトロキシドが２カルボン酸基の間に位置すると、「ゲート」作用を得る。すなわち、ニトロキシドが保護されて、その反応を変調する能力が、カルボン酸基を欠く分子に比して長い期間、広範なインビボ環境において維持される。

用語「処置する」および「処置」などは、所望の薬理学的および／または生理学的作用を得る手段を一般的に意味するものとして用いる。処置は有益なまたは所望の臨床結果を得るための方法である。この結果は、限定でないが、反応性酸素種（ＲＯＳ）の望ましくない作用を減少せしめることを含む。この作用は、疾患および／またはその症候を完全的または部分的に防ぐ観点から予防的であり、疾患および／またはそれに関与する害作用を完全的または部分的に治癒する観点から治療的であり得る。一般的に、本発明の方法は、炎症応答に一般的に関与する疾患の処置を含み、種々の異なる領域、特に膜表面に使用できる。膜表面には、皮膚、ＧＩ管、鼻腔、口腔、膣、眼などの粘膜、さらに肺表面および脈管系表面がある。本明細書で用いる「処置」は、哺乳動物特にヒトにおける症候や疾患のすべての処置を包含し、下記を含む。

（ａ）疾患および／または症候に罹患し得るが、罹患していると未だ診断されていない対象における疾患および／または症候を予防または診断すること、
（ｂ）疾患を阻止すること、すなわち、その進展を阻止すること、および／または、
（ｃ）疾患および／またはその症候を除くこと、すなわち、疾患および／またはそれにより起こされる症候の低減を図ること。

本発明は、炎症応答を変調すること、特に過剰な酸化を変調することに関する。炎症応答およびそれに関連する付属の過剰な酸化は、紫外線照射や核照射を含むすべての型の照射を細胞に与えることを含む様々な物理的障害および鈍感障害により起こり得る。抗炎症剤や抗生物質を用いるなどの他の共処置と組み合わせて処置して、炎症を変調し、感染を防ぎ得る。

本発明の化合物および組成物を用いて実施し得る処置の形態は、日焼けによる炎症が起きる前に日焼けを処置するために、および／または日焼けによる炎症が起きた後に日焼け関連する炎症応答を処置するために、皮膚に化合物および／または組成物を適用することを含む。さらに、癌の処置や透視検査で照射を用いる前後に、患者の皮膚を処置し得る。同様に、口や咽喉の内部表面に対する照射の害作用を処置するために、本発明の化合物を含有する口腔洗浄剤で患者はうがいできる。骨髄における過剰な酸化を防止するために、本発明の化合物を骨髄に直接適用できる。脈管系における炎症応答および過剰な酸化を調節するために、本発明の化合物を患者に注射し得る。皮膚に適用する化粧品に処置を含めるときに、本発明の化合物を使用し得る。皮膚に形成外科および／またはレーザー再サーフェーシングを行ったときに、本発明の化合物および製剤をレーザー再サーフェーシングの前および／または後に、炎症応答を変調するために、適用できる。当業者は、本開示を読んで、これらおよび他の型の処置を行い得る。

用語「有効量」は、臨床結果を含む有益または所望の結果をもたらすのに十分な量であり、このような「有効量」はそれが適用される内容に依存する。有効量を１回以上の用量で投与し得る。有効量は、処置を得るのに、例えば、反応性酸素種の望ましくない高レベルを変調するのに十分な量であり得る。
「含む」およびその同義語は「含んでいること」を意味する。

分子の特性
本発明によるＣＧＮの生理的区画化すなわち部位指向送達は、いくつかの個々の化学構造または分子の修飾により達成できる。本明細書に開示された基準に従って分子を設計し、選択された透過および反応についての特性を得る。修飾ＣＧＮ化合物を局所的に適用し、特殊な細胞、例えば、表皮の生存細胞に標的化する。ニトロキシドの膜溶解性を、本明細書に記載のようにＣＧＮを修飾形に転換して変える。例えば、エステル基を加えて、よりリピド溶解性の分子をつくる。この基を細胞エステラーゼにより触媒される反応で除去すると、より水溶性が高く脂溶性が低い分子を得る（例えば、１log、２logs、３logs またはそれ以上までヒトリピドに溶性が低い)。一旦、修飾ＣＧＮが細胞に入ると、内因性エステラーゼの通常の細胞内加水分解メカニズムがＣＧＮの誘導体をつくる。このものは膜透過性が低下している。このように、これらの化合物は細胞に容易に入るが（脂溶性のとき)、細胞から去りにくく（より水溶性が高く、より脂溶性が低いとき)、結果として、生存細胞に膜貫通で入るための透過性が増加する。脂溶性の減少および水溶性の増加はまた、通常の生理的クリアランス過程により生存の細胞あるいは組織からニトロキシドがにじみ出るのを減少させやすい。この特性がインビボでの選択可能な優先的区画化および持続的な治療または診断の能力を生み出す。

本明細書に記載のように、ＣＧＮの蓄積および分離すなわち分画化をエステル化で高め得る。局所適用にジエステルが好ましい。このものは非対称性であり得、ひとつのエステル基を他のエステル基よりも反応活性とする。例えば、ＢＥ−ＴＯＰＳのｔ−ブチルエステルは、エチルエステルよりも反応活性であり、エチルエステルよりも容易に加水分解される。これらの２エステルを含む非対称のニトロキシドの加水分解は、膜透過性の低いモノカルボキシルＥ−ＴＯＰＳを最初に作る。特定のジカルボン酸エステル誘導体、例えばスクシネートの選択でもって、分画化および細胞内蓄積の性質を決定し、具体的な診断または治療の適応のために、この性質を高くまたは低くなし得る。同様に、天然のジカルボキシルアミノ酸のジエステル（例えば、アスパルテート、グルタメート）を調製して、細胞内の蓄積および分離を増大でき、投与、配送、代謝、排泄（ＡＤＭＥ）試験でよく知られている天然のアミノ酸に利点を加え得る。

本発明で使用し得るＣＧＮは、その必要要件がエステル化される能力であるので、構造的に様々である。すなわち、ＣＧＮを、そのモノカルボキシル、ジカルボキシルあるいはポリカルボキシルの状態で使用できる。本発明の選択的実施態様は下記の構造を有する。しかし、本発明は、誘導体、異性体、置換体、ポリマー、および官能性を保持する他の通常の化学的修飾を包含する。

本発明の化合物は、下記の一般的構造式Ｉで表される化合物を含む：
図１

式中、Ｒ_１は、あらゆるニトロキシド、またはより具体的には窒素原子の周りに局在する１不対電子を有する基を含有するニトロキシルラジカル(ＮＯ）、またはより具体的には炭素および水素原子をさらに含む線状(直鎖または分枝鎖）もしくは環状のニトロキシルラジカルである。Ｒ_１の例は２,２,６,６−テトラメチル−4−ピペリデン−１−オキシルである。

Ｒ_２およびＲ_３は各々独立的に水素、アルキル、アルケイニル、アリール、アラルキル、アルカリールまたはニトロキシドであり、特に独立的に水素またはエチルであり得る。注目すべきは、Ｒ_２および／またはＲ_３がＨのとき、カルボン酸基が形成され、この酸は人体などの適当な環境において塩に転換され得る。いかなる塩も形成され、特にＮａおよびＫ塩が形成され得る。
ｎは０から１８の整数（例えば、１−６または１−４）であり、特に、１，２または３であり得る。

構造式Ｉにおいて、Ｒ_１基は−ＮＨ−を介して結合し、下記式IIの本発明の化合物を提供する：
図２

式中、変換可能なＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびｎは上記定義と同じであり、特にｎは１，２または３であり得る。Ｒ_１が窒素原子の周りに局在する１不対電子を有するＮＯ基を含有する単一環部分であるとき、ｎは１であり得る。例えば、Ｒ_１は２,２,６,６−テトラメチル−4−コボキシルピペリデン−１−オキシルであり得る。

上記の構造ＩおよびIIにおいてＲ_２またはＲ_３のいずれかは、Ｏに結合しないで、ＮＨ結合部分に結合し得る。Ｒ_２またはＲ_３の各々がＮＨに結合しているとき、下記の構造IIIを得る：
式３

本発明の化合物には構造IIIが含まれ、ここで変換可能なＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびｎは上記ＩおよびIIでの定義と同じである。
構造Ｉ、II、IIIの各々においてＲ_１は、１不対電子を有するニトロキシルラジカルであり得、ニトロキシラジカルは下記の構造IVに示される環状ニトロキシルであり得る。

本発明の化合物は、例えば、一般構造式IVで示される。
図４

式中、Ｒ_２およびＲ_３は、構造Ｉ、II、IIIについて定義される部分であり、特にＲ_２およびＲ_３は、メチル、エチルまたはｔ−ブチルを含み得るブチルであり得る。

本明細書で用いるように、環は、少なくとも１つの部位でＮＯ基の−Ｎ−を有する環状部分であり得る。環は、図５におけるような６員環、図１３におけるような５員環または他の環および／または融合環構造であり得る。

図７においてＲ_２＝Ｒ_３＝Ｈである１構造において、エステラーゼ解裂後の生存細胞内で構造物は、ニトロキシドの細胞内効力をもたらす。ひとつの実施態様においてＲ_２および／またはＲ_３は、図１１および図１２に示される構造である。図６は、Ｒ_２＝Ｈであり、Ｒ_３が構造Ｉ、II、IIIについて上記されたような各部分である非対称の構造を示す。図８は、Ｒ_３は＝エタノールである図６の例（Ｅ−ＴＯＰＳ）を示す。図９および図１０は、Ｒ_２＝Ｒ_３＝エタノール（ＤＥ−ＴＯＰＳ）またはＲ_２＝Ｒ_３＝ｔ−ブタノール（ＤＴ−ＴＯＰＳ）である図５の対称構造の例を示す。図１１は、Ｒ_２＝Tempol（ＴＥ−ＴＯＰＳ）であるジラジカル構造の例を示す。

本発明の化合物のいずれの構造においても、Ｒ_２およびＲ_３を用いて、その分子を他の原子、分子または生物材料に結合せしめ得る。例えば、構造IIIにおいて、Ｒ_２を用いて、その分子を下記のいずれの米国特許に記載されるような他の活性部位に結合せしめ得る：米国特許 5,725,839; 5,741,893; 5,767,089; 5,804,561; 5,807,831; 5,817,632; 5,824,781; 5840,701; 5,591,710; 5,789,376; 5,811,005; 6,048,967。さらに、ＯＲ_２基に結合するＮＨを用いて、銅トリペプチドなどの他の分子に結合せしめ得る。

本発明の化合物は、抗酸化ニトロキシドの標的化された治療用量を提供するので、酸化ストレスの作用を阻害または軽減するのに非常に有効である。Ｅ−ＴＯＰＳがTempolに比して、２００ｍｇ／ｋｇの静脈内、筋肉内、経口、腹腔内投与でインビボ半減期を増加することがわかった。参照、図１８、１９、２０、２１。Ｅ−ＴＯＰＳはまた、Tempolに比してマウスのＬＤ_５０モデルで急性毒性が非常に低かった（参照、図２４)。

膜貫通的適用において、ＤＥ−ＴＯＰＳ(図３２，３５）製剤は、ＵＶＢ光誘発の皮膚肥厚、出血、炎症を、照射の前および後の適用で減少せしめる。ＤＥ−ＴＯＰＳはまた、ＵＶＢ照射による慢性損傷に対する作用を示す（図３３)。これらの製剤は、winkling を低下するのにレチンＡよりも優れる（参照、図３７)。さらに詳細に下記するように、本発明のＣＧＮ化合物の主な利点は、様々な経路で生理的適合性溶液を投与し得る能力である。また、標的細胞および診断的もしくは治療的目標に従って、これらの化合物の活性をポリニトロキシドの同時的な皮下投与により高め得る。

本発明の組成物は、軟膏、ローションまたはゲルなどの皮膚科的／化粧品的に許容されるビヒクルおよび希釈剤または分散剤などとして働く他の溶媒や担体において使用できる。ビヒクルは、水、液体または固体の皮膚軟化剤、シリコン油、乳化剤、溶媒、湿潤剤、増粘剤、粉末、プロペラントなどの皮膚ケア用品に通常使用される材料を含む。

上記のように、不対ニトロキシル電子は、抗酸化活性に加えてニトロキシドに他の有用な性質を付与する。特に、このような遊離ラジカル形態におけるニトロキシドは、常磁性プローブであり、そのＥＰＲシグナルが生物システム、例えば、酸化テンションや組織レドックス状態における代謝情報を反映できる。自然に生じる不対電子はインビボで基本的に存在しないので、ＥＰＲ造影は背景ノイズが基本的にないという利点をさらに有する。ニトロキシドはまた、水素核の緩和時間を低下し、プロトンまたは核磁気共鳴造影（ＭＲＩ）におけるコントラスト剤として有用である。ニトロキシドはまた、ＭＲＩですてに得られた形態学的データに代謝情報を加えるためのコントラスト剤として作用し得る。例えば、ニトロキシド上の種々の官能基を置換することにより、弛緩性、溶解性、生体分布、インビボ安定性、耐容性を含む性質を処理できる。ニトロキシムから得られるコントラストの向上は、似かよっているが組織学的に異なる組織を区別することにより、および血液脳関門障害、膿瘍、腫瘍などの損傷の局在性および特徴の解明を容易にすることによりＭＲＩの性能を改善できる。

製剤
ニトロキシドの安定な化学的性質からして、本明細書に開示の組成物は、種々の経路で投与できる。本発明の目的のために、「医薬」組成物または「薬学的に許容される」組成物は、非毒性に既知の技術で製剤でき、所望により、ヒトに投与するのが許容されている担体または補助剤とともに使用できる。実施例に下記するように、投与経路には、筋肉内、皮下、静脈内を含むすべての形の注射；眼、眼内、経口投与；口腔、鼻、肛門、膣を含むすべての形の粘膜貫通送達；皮膚または皮膚貫通の投与；胸内投与がある。このような組成物は、ワクチンに活性を溶液に保存するのに、当業者に既知の緩衝液、塩または他の溶媒を含み得る。

本発明の組成物および製剤は、本発明のニトロキシドの有効量を薬学的に許容される賦形剤または担体中に含み得る。担体は一般的に、医薬的に有効な物質を対象、例えば患者に送達するのに適した用量形態で投与するのを容易にする比較的無活性の物質である。適当な賦形剤には、限定でないが、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変えるための塩、カプセル化剤、緩衝剤、皮膚透過向上剤、皮膚クリームおよびゲルがある。薬学的に許容される賦形剤の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Alfonso R. Gennaro, ed., 19th edition, 1995）に記載されている。これを担体および製剤の開示および記載のために本明細書に合体する。

皮膚への適用のための製剤は、ニトロキシド、担体、日光遮断剤すなわちＵＶ吸収剤を含み得る。数多くのＵＶ吸収剤が既知であり、米国特許 6,235,271; 6,224,854; 6,071,501; 5,976,513; 5,972,316; 5,968,485 およびこれらの特許に引用される特許および文献に開示されている。ＵＶ吸収剤は、すべての油溶性有機ＵＶ吸収剤、特に化粧品的使用がすでに承認され市販されている吸収剤であり得る。この油溶性有機ＵＶ吸収剤は、例えば、"Sunscreens", Development, Evaluation and Regulatory Aspects, Eds.: N.J. Lowe and N.A. Shaath, M. Dekker Inc., New York and Basel, 1990; Ken Klein, Encyclopedia of UV absorbers for sunscreen products, Cosmetics & Toiletries 107 45-64 (1992) に記載されている。

油溶性の非微粒化吸収剤は、例えば、ｐ−アミノ安息香酸のエステルや塩などの誘導体またはｐ−アミノ安息香酸のアミン修飾誘導体；サリチル酸のエステルや塩などの誘導体；ベンゾフェノン誘導体；ジベンゾイルメタン誘導体；ジフェニルアクリレート誘導体；ベンゾフラン誘導体；１以上のケイ素有機残基を含有するポリマーＵＶ吸収剤；シナメートエステル；ショウノウ誘導体；トリアニリノ−ｓ−トリアジン誘導体；フェニルベンツイミダゾールスルホン酸およびその塩；ウロカン酸（３−イミダゾル−４−イル−アクリル酸）またはそのエチルエステル；メンチルアントラニレート；ベンゾトリアゾール；ヒドロキシフェニルトリアジン誘導体；ビスレゾルシノール−ジアルキルアミノトリアジンであり得る。

ベンゾフェノンの具体例には、ベンゾフェノン−３−(２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン)、ベンゾフェノン−４−(２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸)、ベンゾフェノン−８−(２,２'−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン）がある。

ジベンゾイルメタン誘導体の具体例は、ブチルメトキシジベンゾイルメタン[１−(４−tert−ブチル)−３−(４−メトキシフェニル)プロパン−１,３−ジオン］である。

ジフェニルアクリレート誘導体の具体例には、オクトクリレン(２−エチルヘキシル−２−シアノ−３,３'−ジフェニルアクリレート）およびエトクリレン(２−エチル−２−シアノ−３,３'−ジフェニルアクリレート）がある。

ベンゾフラン誘導体の具体例には、米国特許 5,338,539 またはヨーロッパ特許 582 189 に記載の３−(ベンゾフラニル)−２−シアノアクリレート、米国特許 5,518,713 に記載の２−(２−ベンゾフラニル)−５−tert−ブチルベンゾキサゾール、米国特許 5,362,481 に記載の２−(ｐ−アミノフェニル)ベンゾフランがある。

１以上のケイ素有機残基を含有するポリマーＵＶ吸収剤の具体例は、ヨーロッパ特許 709 080 に記載のベンジリデンマロネートシリコーン誘導体（R.sub.15 がＨまたはＯＭｅであり、ｒが約７である）；WO 94/06404 に記載のベンゾトリアゾールシリコーン型のポリマーである。

シンナメートエステルの具体的な例には、オクチルメトキシシンナメート(４−メトキシケイ皮酸 ２−エチルヘキシルエステル)、ジエタノールアミンメトキシシンナメート(４−メトキシケイ皮酸のジエタノールアミン塩)、イソアミル ｐ−メトキシシンナメート(４−メトキシケイ皮酸 ２−イソアミルエステル)、２,５−ジイソプロピルメチルシンナメート、米国特許 5,601,811 に開示されているシンナミド誘導体、WO 97/00851 に記載されている誘導体がある。

カンファー誘導体の具体例は、４−メチルベンジリデンカンファー［３−(４'−メチル)ベンジリデン−ボルナン−２−オン］、３−ベンジリデンカンファー［３−ベンジリデン−ボルナン−２−オン］、ポリアクリルアミドメチルベンジリデンカンファー｛Ｎ−［２(および４)−２−オキシボルン−３−イリデンメチル）ベンジル］アクリルアミドポリマー｝、トリモニウム ベンジリデンカンファー スルフェート［３−(４'−トリメチルアンモニウム)−ベンジリデン−ボルナン−２−オン メチルスルフェート］、テレフタリデン ジカンファー スルホン酸｛３,３'−（１,４−フェニレンジメチン）−ビス−（７,７−ジメチル−２−オキソ−ビシクロ[２．２．１]ヘプタン−１−メタンスルホン酸｝およびその塩ならびにベンジリデンカンファー スルホン酸［３−(４'−スルホ)ベンジリデン−ボルナン−２−オン］およびその塩である。

トリアニリノ−ｓ−トリアジン誘導体の具体例には、オクチルトリアジン［２，４，６−トリアニリノ−（ｐ−カルボ−２'−エチル−１−オキシ）−１，３，５−トリアジン、米国特許 5,332,568 に開示のトリアニリノ−ｓ−トリアジン誘導体、ヨーロッパ特許 517 104 に開示のトリアニリノ−ｓ−トリアジン誘導体、ヨーロッパ特許 570 838 に開示のトリアニリノ−ｓ−トリアジン誘導体、米国特許 5,252,323 に開示のトリアニリノ−ｓ−トリアジン誘導体、WO 93/17002-A1 に開示のトリアニリノ−ｓ−トリアジン誘導体、WO 97/03642-A1 に開示のトリアニリノ−ｓ−トリアジン誘導体がある。

ベンゾトリアゾールの具体例は、２−(２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル)ベンゾトリアゾールである。
ヒドロキシフェニルトリアゾール誘導体の具体例は、例えば、２,４−ビス−｛［４−(２−エチル‐ヘキシルオキシ)−２−ヒドロキシ］−フェニル｝−６−(４−メトキシフェニル)−１,３,５−トリアジンなどのヨーロッパ特許-A1-775,698 に記載のものである。
ビス−レゾルシノール−ジアルキルアミノトリアジンの具体例は、例えば、ヨーロッパ特許-A1-780,382 に記載のものである。

無機の微色素ＵＶ吸収剤、新しい日光保護剤の選択的成分ｂ）は、例えば、アルミニウムオキシドまたはケイ素ジオキシドで被覆されたチタニウムオキシド、アルミニウムオキシドまたはケイ素ジオキシドで被覆された亜鉛オキシド、雲母であり得る。
ポリマー空洞球成分、本発明の新しい日光保護剤の成分ｃ）は、例えば、ヨーロッパ特許-A-761,201 に記載のものである。

方法
ニトロキシド化合物を医療的に有効な量で患者に投与する処置方法を開示する。ニトロキシド化合物は、直接一緒に結合する窒素原子と酸素原子および不対電子（・ＮＯ）を含む第１部分ならびに負電荷を提供する第２部分からなる。第１部分と第２部分は、両者の間に位置し両者と結合する連結基により結合され、ニトロキシドが患者中に存在するときに、第２部分の負電荷が第１部分の・ＮＯを安定にする。分子の・ＮＯ部分を安定にすることにより、ニトロキシドが反応性酸素種と、患者中で長い時間相互作用し、これらの反応性酸素種の有害作用を変調する。

患者などの皮膚に製剤を適用する方法を開示する。製剤は、担体ならびに第１脂溶性および第１水溶性を有する化合物を含む。この化合物は、患者の皮膚を透過でき、生存細胞に到達し、細胞の酵素の存在で反応する。この反応によって、第１脂溶性よりも実質的に小さい第２脂溶性および第１水溶性よりも実質的に大きい水溶性を有する化合物となり、このことにより化合物が生存細胞に浸透し、それらの細胞と接触を保つ。この化合物は、反応性酸素種の有害作用を変調するのに役立つニトロキシドであり得る。

下記の実施例は、当業者に本発明をつくり利用するのに完全な開示および説明を提供するためのものであって、発明者が本発明と認めるものの範囲を制限するものではなく、また下記の試験がすべてまたは唯一の試験であるというものでもない。使用された数値（例えば、量、温度など）について正確を期しているが、いくらかのエラーや誤差は考慮されるべきである。特に別記しない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏、圧は大気圧またはその近似である。

モノおよびジカルボン酸およびエステル化ニトロキシド種の合成および調製
下記の化学合成プロトコールにより安定なニトロキシド遊離ラジカルを得る。その生理区画化は、インビボ膜透過性およびクレアランスの機能で、モノまたはジカルボン酸などの負電荷アニオンにより調整される。エステル誘導体の皮膚適用が特に利点を有する。このエステル誘導体は、増加した細胞内停留を有する第２ニトロキシド種に比して増加した膜透過性を有する第１ニトロキシド種でもって疎水性バリアーを通過する種々の透過性を提供し、細胞内エステラーゼによる加水分解後の抗酸化の医療上の有用性を提供する。

（ａ）モノエチルおよびジエチル−２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジリデンスクシネート（Ｅ−ＴＯＰＳおよびＤＥ−ＴＯＰＳ）の合成
還流冷却器および磁気攪拌器を設置した乾燥の２首フラスコに４５ｍｌの無水tert−ブタノールおよび６.７２ｇのカリウムtert−ブトキシドを窒素気の下に入れる。混合物を沸騰せしめ、すべての固体が溶解するまで加熱還流する。ついで、フラスコを冷やし、６.８ｇの４−オキソ−［ＴＰＯ］、１２ｍｌのジエチルスクシネート、１５ｍｌの第３級ブタノールを加える。反応混合物を１０分間加熱する。氷で冷やし、稀ＨＣＬで中和した後、アルコール分を減圧で留去する。残渣を３５０ｍｌの氷水に注ぎ、稀塩酸でｐＨ３の酸性とし、メチレンクロリドで抽出する。合わせた抽出物を１％アンモニアで数回洗う。溶液を氷で冷やし、酸性にし、メチレンクロリドで再度抽出する。得られた抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥する。メチレンクロリドを蒸発せしめた後、残りの油状赤色液体をヘキサンで粉砕する。モノエステルの結晶を多孔磁器プレート上で押しつぶし、エーテルとヘキサンの混合物から再結晶する。産物は黄色角柱であり、融点が１０３℃、収率が６０−７０％である。
図１４は、液体クロマトグラフィーによるＴＯＰＳ、Ｅ−ＴＯＰＳ、ＤＥ−ＴＯＰＳの分離を示す。

ＤＥ−ＴＯＰＳからＴＯＰＳへの加水分解
図１５に示されるＤＥ−ＴＯＰＳから非エステル化ＴＯＰＳ形への加水分解という機構によって、選択的細胞膜透過性と、ニトロキシド化合物がエステラーゼなどの細胞内酵素またはエステル基を解裂する他の生化学的反応に暴露されたときの細胞内停留の増大とが得られる。疎水性プロドラッグとしてのＤＥ−ＴＯＰＳの適用により、角質層（死細胞）を通り、代謝的に活性の基底−膜層に浸透する。ＤＥ−ＴＯＰＳの酵素性加水分解によって、産物ＴＯＰＳが水層に、望ましくはそして主に細胞内物に停留できる。この反応を明らかにするために、ＤＥ−ＴＯＰＳの化学的加水分解がオクタノールに対し水中に優先的に分散する化合物をつくることを示す。

２０ｍｌサンプルのＤＥ−ＴＯＰＳを水１ｍｌとオクタノール１ｍｌの混合物に加え、分散するままにした。１５分後、４０μｌサンプルの水または油をＥＰＲスペクトル分析にかけた。ついで、２０ｍｇのＤＥ−ＴＯＰＳを１ｍｌの１０ｍＭ ＮａＯＨに混合し、一夜室温でインキュベートした。溶液を塩酸で中性とし、１ｍｌの水および２ｍｌのオクタノールに加えた。混合物を分散するままにし、１５分後に４０μｌサンプルの水または油をＥＰＲスペクトル分析にかけた。Varian E9 分光器でＥＰＲスペクトルを取った。掃引幅は１００Ｇ、周波数は９.５３５ＧＨｚ、マイクロ波は２ｍＶ、変調周波数は１００Ｈｚであった。

加水分解の前は、ＤＥ−ＴＯＰＳはオクタノールに優先的に分散した。ＤＥ−ＴＯＰＳの分散係数（LogP）は１.７であった。加水分解後は、予測の産物ＴＯＰＳが水層に分散した。ＴＯＰＳの分散係数（LogP）は−０.９であった。このことは、加水分解後に、形成された産物が有意に親水性であり、より容易に細胞内で区画化されることを示す。

ＴＥ−ＴＯＰＳの合成
このパイロット試験は、Tempolの証明としてのＴＥ−ＴＯＰＳの合成に関し、切除化合物をＴＯＰＳ−エステルプロドラッグ構造中に組み込み得る。ＴＥ−ＴＯＰＳを^１４Ｎ−Ｅ−ＴＯＰＳおよび^１５Ｎ−Tempolから合成した。合成は複数工程であり、オキソ−Tempo（４−オキソ−２,２,６,６−テトラメチル−ピペリジン−１−オキシル）とジエチル−スクシネートとの縮合、続く^１４Ｎ−Ｅ−ＴＯＰＳの^１５Ｎ−Tempolまたはエタノールによるエステル化を含み、それぞれ^１４Ｎ−ＤＥ−ＴＯＰＳまたは^１４Ｎ−、^１５Ｎ−ＴＥ−ＴＯＰＳを得る。ビラジカル^１４Ｎ−、^１５Ｎ−ＴＥ−ＴＯＰＳを形成する反応は、ＨＰＬＣおよびＥＰＲでモニターした。^１４Ｎ−Ｅ−ＴＯＰＳは、図１６Ａ左パネルに示すように、三重項ＥＰＲスペクトルを与える。そのＨＰＬＣ溶出時間は、図１６Ａ右パネルに示すように、６.３分である。^１５Ｎ−Tempolは、図１６Ｂ左パネルに示すように、二重項ＥＰＲスペクトルを与える。そのＨＰＬＣ溶出時間は、図１６Ｂ右パネルに示すように、５.３分である。反応３時間後に、５.３分および６.３分でのＨＰＬＣピークの高さが低下し、一方、１３.９分で新たなピークが現れた（参照、図１６Ｃ右パネル)。反応６時間後、^１５Ｎ−Tempolおよび^１４Ｎ−Ｅ−ＴＯＰＳのピークがほとんど消失した（図１６Ｄ右パネル)。１３.９分のＨＰＬＣピークが^１４Ｎ−、^１５Ｎ−ＴＥ−ＴＯＰＳからなることを確認するために、ピークを集めてＥＰＲで分析した。ＥＰＲスペクトルを図１６Ｄ左パネルに示す。新ピークの拡大および出現は、ビラジカル間のスピン−スピンおよびスピン−スピン二極相互反応による。

ＴＥ−ＴＯＰＳのＴＯＰＳおよびTempolへの加水分解
２０ｍｇの^１４Ｎ−、^１５Ｎ−ＴＥ−ＴＯＰＳを１ｍｌの１０ｍＭ ＫＯＨに混合し、室温で一夜インキュベートした。溶液を塩酸で中和し、ＥＰＲスペクトルを Varian E9 分光器で測定した。掃引幅は１００Ｇ、周波数は９.５３５ＧＨｚ、マイクロ波は２ｍＶ、変調周波数は１００Ｈｚであった。図１７Ａにおける鋭いＥＰＲスペクトルが、図１６Ｄ左パネル中の幅広いスペクトルに比して、ＴＥ−ＴＯＰＳが完全に加水分解されたことを示す。^１４Ｎ−、^１５Ｎ−ＴＥ−ＴＯＰＳの皮膚用クリームをマウスの皮膚に用いた。尿サンプルがインビボでのエステラーゼ解裂を示した（参照、図１７Ｂ)。

ＤＥ−ＴＯＰＳおよびTempolのインビボ血漿半減期
上記のように、インビボ治療的または診断的使用での既存ニトロキシド組成物の主な欠点は、これらの分子の半減期が限定されることおよびそのインビボ減少およびクリアランスが速いことである。Tempolの比較的短い半減期のために完全な治療または診断の効果を得るために、用量を多くして投与する必要が生じる。下記の図２４に示すように、ニトロキシドの用量増加は、急性および慢性の毒性をもたらしかねない。しかし、化合物の血漿半減期が増加すると、急性または慢性期での全用量を減じ得る。

血漿半減期の測定のため、６０から９０分において各分でのスペクトルを収集した。^１５Ｎ−Tempolまたは^１４Ｎ−Ｅ−ＴＯＰＳのＥＰＲシグナルのピークの高さを時間に対し、図１８−２１に示すように、腹腔内、静脈内、筋肉内、経口について、それぞれプロットする。図１８は、Ｅ−ＴＯＰＳおよびTempolの１２５ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与のインビボ血漿半減期の測定結果を示す。^１４Ｎ−Ｅ−ＴＯＰＳ（上側）は化合物の全体の半減期を実質的に高める。^１５Ｎ−Tempolは４０分を越える測定可能な半減期を有するが、Ｅ−ＴＯＰＳは少なくとも８０分間、実質的により高い活性を有する。用量は、Ｅ−ＴＯＰＳが１２０ｍｇ／ｋｇ、Tempolが８０ｍｇ／ｋｇであり、モル比が１：１である。

図１９は、Ｅ−ＴＯＰＳおよびTempolの１２５ｍｇ／ｋｇ静脈内投与のインビボ血漿半減期の測定結果を示す。静脈注入例において、Tempol（下側）は急速にインビボで減少し、注入５分間後までに、非常に少量のTempolが静脈内に残存するのみである。

図２０に示すように、筋肉内の共投与で、最初の５分間を越えてＥ−ＴＯＰＳのインビボ半減期は少なくとも６０分間でTempolを劇的に凌駕する。
図２１に示すように、両化合物を経口投与すると、Ｅ−ＴＯＰＳのインビボ半減期はTempolよりも大きい。図１８−２１に示すように、用量は、Ｅ−ＴＯＰＳが１２０ｍｇ／ｋｇ、Tempolが８０ｍｇ／ｋｇであり、モル比が１：１である。

ヒトの皮膚における浸透および区画化
図２２に示すように、フランツ型拡散セルを用いて、ＤＥ−ＴＯＰＳ（１００ｍＭ）の石油基剤を新鮮なヒト皮膚に適用した。レセプター緩衝液は０.０１％ナトリウムアジドを有するＰＢＳである。緩衝液を常に攪拌した。セルを３７℃に循環湯浴で維持した。図２２は皮膚浸透の程度を示す。レセプターセルの上部を覆うようにマウス皮膚（または供与体ヒト皮膚）を設置し、ＤＥ−ＴＯＰＳを皮膚の上部に適用する。皮膚の下に、皮膚の生存を保つためにＰＢＳ緩衝液を適用する。２４時間後に緩衝液をＥＰＲアッセイのために収集する。皮膚の表面を清潔にし、皮膚サンプルをＥＰＲシグナルについて試験する。TempolとＤＥ−ＴＯＰＳは適用前に同じシグナル強度を有するが、適用から２４時間後には緩衝液中にTempolがＤＥ−ＴＯＰＳよりも大きく存在する。しかし、皮膚においてＤＥ−ＴＯＰＳシグナルはTempolよりも強い。すなわち、ＤＥ−ＴＯＰＳは、皮膚においてTempolよりも局在する。ＤＥ−ＴＯＰＳは、表皮および真皮の細胞に浸透し、そこで酵素的に加水分解されて、区画化される。遊離で溶性のTempol に比べると、これらの皮膚層においてＤＥ−ＴＯＰＳの均一の分散がある。

ＤＥ−ＴＯＰＳを用いて準備的なＳバンドＥＰＲ分光法および造影試験をヒト被験者で行った。ヒト被験者の腕の皮膚、典型的には手首の月状面の直径６ｍｍ円状点をアルコールで完全に洗い、３μＬの１００ｍＭ ＤＥ−ＴＯＰＳ溶液（約２ｘ１０^１７スピン）を、印をつけた皮膚の箇所に適用した。５分後に析出溶液を乾燥し、この皮膚領域を表面共鳴器に固定するために、共鳴器キャップにおけるウエル中に閉じ込められた直径７ｍｍのウエルおよび底面ディスクをもつ特別に設計された位置ホルダーを、皮膚に接着した（参照、"In vivo EPR Imaging of a Distribution and Metabolism of Nitroxide Radicals in Human Skin," He et al., J. of Magnetic Resonance 148, 155-164, 2001)。ついでＥＰＲおよびＥＰＲＩ測定を開始した。被験者についての測定を、１５−２０分間行い、その後に、共鳴器および磁石から腕を離す３０分間の休止時間を入れた。このホルダーは皮膚の位置を固定し、設置の共鳴器の一定の充填因子を確保した。位置ホルダーを腕に８時間かかった全測定の間、接着したままとした。

図２３は、ヒト皮膚におけるＣＮＯ浸透および区画化のカラーコード造影を示す。１−Ｄ空間造影を、同じヒト被験者の腕の皮膚から、３μＬのＤＥ−ＴＯＰＳ（１００ｍＭ、ＤＭＳＯ中）の局所適用後１時間および８時間に得た。測定を、空間的に設計された表面共鳴器を有するＳバンド（２.２ＧＨｚ）ＥＰＲ造影システムを用いて、He et al., J. of Magnetic Resonance 148, 155-164 (2001) に記載のように行った。点線は皮膚表面を表す。推定の皮膚深度を、表皮、真皮、皮下層として表示する。区分化により、皮膚層を通してさらに広がった分布を生じる。１−Ｄ ＥＰＲ空間造影でＤＥ−ＴＯＰＳは tempone に比して、８時間まで真皮および表皮を通しての増大した可視分布を示している。

TempolおよびＥ−ＴＯＰＳの急性毒性ＬＤ_５０ならびにＥ−ＴＯＰＳの代謝
上記したように、非結合の小分子ニトロキシドの実際的臨床適用は、インビボでの活性の低下および比較的短いインビボ半減期により限定されている。インビボ半減期の低下の結果、同じ治療的または診断的効果を得るのに大きい用量を投与する必要がある。Tempolの毒性は、ＬＤ_５０モデルで測定でき、種々の用量でのマウスの生存率を調べる。図２４は、用量増加を伴う生存率の関数としてのTempolについての急性毒性曲線を示す。Ｅ−ＴＯＰＳ製剤は用量３.５ｍｍｏｌ／ｋｇまで生存率に基本的に低下を示さないが、Tempolは低い用量２.０ｍｍｏｌ／ｋｇで生存率が０である。生存率における有意の差異は用量２.０−２.５ｍｍｏｌ／ｋｇで現れる。図２５は、６時間後での血漿に対する尿化合物におけるＥ−ＴＯＰＳからの強いＥＰＲシグナル（濃度に対する比率で）を示す。正常な代謝による排泄およびクリアランスである。

Ｅ−ＴＯＰＳのスーパーオキシドディムスターゼ活性の阻害
図２６は、Ｅ−ＴＯＰＳのスーパーオキシドディムスターゼ活性をTempolと比較して示す。Ｅ−ＴＯＰＳおよびTempolのＳＯＤ様活性を電子常磁共鳴により測定した。高ファイルＥＰＲピークを時間とともにモニターした。ＮＡＤＨのない（−ＮＡＤＨ）Ｅ−ＴＯＰＳおよびTempol曲線はニトロキシドとスーパーオキシドの酵素的反応を示した。ＮＡＤＨのある（＋ＮＡＤＨ）Ｅ−ＴＯＰＳおよびTempol曲線はオキソアンモニウムからヒドロキシルアミンへの２電子の減少を示した。結果からすると、Ｅ−ＴＯＰＳはTempolに類似のＳＯＤ活性を有する。

培養ラット皮質ニューロンにおけるヘモグロビン毒性
Ｅ−ＴＯＰＳは卒中での出血性形質転換のモデルにおいてニューロン保護性である。最初のニューロン培養基をラット胚（胚形成１５日）の前脳からつくった。機械的粉砕を繰り返して、細胞をニューロン培養基（MEM Eagle (Sigma, M4526)) に分散した。この培養基には、グルタミン(2mM)、ペニシリン−ストレプトマイシン(50 units/ml-0.05mg/ml)、熱不活化ウマ血清(10%)、ウシ胎児血清(10%)、グルコース(0.5%, 28mM)を補充してあった。遠心分離（９００ｇ；５分間）後、細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆９６ウエルプレート上に密度５ｘ１０^６細胞／ウエルで入れた。ヘモグロビン塩類溶液を１０μＭの最終濃度で加え、Ｅ−ＴＯＰＳを１０μＭ、１μＭ、０.１μＭの最終濃度で加えた。インキュベーション２４時間後にニューロン生存能を、比色ＭＴＴアッセイで定量測定した。ＭＴＴを各ウエルに加え、染料の最終濃度を０.１５ｍｇ／ｍｌとした。プレートをインキュベーターに１時間もどし、取り込まれていないＭＴＴを除去し、プレートを空気乾燥した。生存細胞に存在する紫色のホルマザン産物を（０.１Ｎ ＨＣｌによる）酸性イソプロパノールの添加で溶解し、吸収強度（５４０ｎｍ）を９６ウエルプレートリーダーで測定した。％対照＝（試験Ａ_５４０／平均対照）ｘ１００％。図２７は、Ｅ−ＴＯＰＳサンプルでのニューロン生存能の増加を示す。

ペルオキシニトリート・ジェネライターＳＩＮ−１に暴露された皮質ニューロンのＴＯＰＳまたはＴＯＰＳエステルによるニューロン保護
ＳＩＮ−１毒性を、ペルオキシニトリートの生成に基づく培養ラット皮質ニューロンで調べる。このモデルでＴＯＰＳまたはＴＯＰＳエステルがニューロン保護性であることは、ＳＩＮ−１によるＥＧＦＲ活性のニトロキシド依存性遮断に翻訳できる。

最初のニューロン培養基をラット胎児（胚形成１５日）の前脳からつくった。機械的粉砕を繰り返して、細胞をニューロン培養基（MEM Eagle (Sigma, M4526)) に分散した。この培養基には、グルタミン(2mM)、ペニシリン−ストレプトマイシン(50 units/ml-0.05mg/ml)、熱不活化ウマ血清(10%)、ウシ胎児血清(10%)、グルコース(0.5%, 28mM)を補充してあった。遠心分離（９００ｇ；５分間）後、細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆９６ウエルプレート上に密度５ｘ１０^６細胞／ウエルで入れた。細胞毒性を公表の方法（Carroll et all, 2000）に従って細胞中に誘導した。ＳＩＮ−１（３−モルホリノシドノニミン、Shigma)、ＰＮジェネレーターを使用直前に５０ｍＭホスフェート（ｐＨ５.０）に溶解し、各ウエルに加えて、最終濃度１ｍＭを得た。ＴＯＰＳ、Ｅ−ＴＯＰＳまたはＤＥ−ＴＯＰＳを表示の濃度で各培養基にＳＩＮ−１の１５分前に加えた。ニューロン生存能を、比色ＭＴＴアッセイで定量測定した。ＭＴＴを各ウエルに加え、染料の最終濃度を０.１５ｍｇ／ｍｌとした。プレートをインキュベーターに１時間もどし、取り込まれていないＭＴＴを除去し、プレートを空気乾燥した。生存細胞に存在する紫色のホルマザン産物を（０.１Ｎ ＨＣｌによる）酸性イソプロパノールの添加で溶解し、吸収強度（５４０ｎｍ）を９６ウエルプレートリーダーで測定した。％対照＝（試験Ａ_５４０／平均対照）ｘ１００％。

図２８は、ＴＯＰＳまたはＴＯＰＳエステルがＳＩＮ−１の毒性を用量依存的に防止することを示す。これらの化合物のニューロン保護濃度は、ペルオキシニトリート依存性ＥＧＦＲ活性を、受容体の共有的二量化およびそれに続く自動リン酸化を防ぐことにより、防止する。

ニトロ化の阻害による抗酸化活性
ＤＥ−ＴＯＰＳ、Ｅ−ＴＯＰＳ、ＴＯＰＳのインビトロ抗酸化活性を明らかにするために、ゴールド標準としてのTempolと比較した。Tempolはインビトロでペルオキシニトリートによる４−ヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡ）のニトロ化を防止した。この予備的試験において、ＨＰＡのペルオキシニトリート依存性ニトロ化のTempol、ＤＥ−ＴＯＰＳ、Ｅ−ＴＯＰＳまたはＴＯＰＳによる阻害％を測定した。

ペルオキシニトリートを前記の方法でつくった。１ｍＭ４−ヒドロキシフェニル酢酸溶液（ＨＰＡ、Sigma）を１００ｍＭナトリウムホスフェート中にｐＨ６.５でつくった。一定量のＴＯＰＳ、Ｅ−ＴＯＰＳまたはＤＥ−ＴＯＰＳを上記にＨＰＡ溶液１ｍｌに加え、最終濃度のニトロキシドを０.９８、３.９１、１５.５、６２.５、２５０Ｍで得た。ペルオキシニトリートを最終濃度１ｍＭで加え、ニトロ化を開始した。反応を、不活性ペルオキシニトリートをブランクとして、および０ニトロキシドを正対照として用い、実施した。ニトロ化を４０５ｎｍで分光測定した。４−ヒドロキシフェニル酢酸溶液の濃度を、反応混合物のｐＨをＮａＯＨで１０−１１に増加した後、分光測定（_４３０＝４４００Ｍ^−１ｃｍ^−１）した。

図２９に示すように、１ｍＭペルオキシニトリートによるＨＰＡニトロ化の４０％−６０％が本発明のニトロキシドにより３μＭで阻害される。ニトロキシドによる阻害のメカニズムは触媒的である。ペルオキシニトリートが照射誘導細胞障害における重要な役割を演じることが示唆されるので、ＴＯＰＳエステルは、ペルオキシニトリートなどの反応性酸素種に暴露された皮膚の治療に有用性を有する。

ＴＮＦ-αへの暴露により測定される細胞アポトーシス
ＵＶ光誘発アポトーシスを、アポトーシスが腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ-α）への暴露により誘発されるモデルで測定できる。図３０に示すように、ＴＮＦ-αプラスＥ−ＴＯＰＳに暴露された細胞について、時間経過でのアポトーシス強度を対照とともに測定する。培養されたヒトＹ−７９細胞をｐＨ７.４で培養フラスコに保持し、アンホテリシン／ペニシリン／ストレプトマイシン処理（１％ｖ／ｖ）ＲＰＭＩ１６４０倍地とＬ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清の混合物中、インキュベーターにおいて１０％ＣＯ_２／９０％空気条件で、３７℃、湿度２０％で保持した。Ｅ−ＴＯＰＳを１０ｍｇ／ｍｌ製剤として調製した。この保存溶液から、１０μｌを１ｍｌの細胞懸濁液に加え、Ｅ−ＴＯＰＳの最終濃度を１００μｇ／ｍｌとした。連続的培地希釈を調製するためにヒトＴＮＦ-α（１０μｇ／１ｍｌ）を用い、ＴＮＦ-α濃度５.０ｎｇ／ｍｌを得た。細胞の密度および生存能を、Zeiss 逆送顕微鏡のトリパンブルー排除アッセイで調べ、サイトメトリー・アッセイの前の細胞濃度を確認した。ＴＮＦ-αを緩やかに混合した後、バイアルを所定の濃度で６、２４、４８時間セットし、サイトカイン処理細胞をＰＢＳに再懸濁した。細胞をアネキシンＶ−ＦＩＴＣコンジュゲート溶液に再懸濁し、室温で暗所で１５分間インキュベートした。結合緩衝液を各サンプルに加え、細胞密度を約１.０ｘ１０^６細胞／ｍｌまでとした。結合緩衝液は下記のものを混合して調製した：１０ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７.４、３０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ_２、１.８ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ_２、５２.２ｍｌのＤＤＷ。

フローサイトメトリー法を用い、アネキシンＶリバーシブルおよび負電荷ホスファチジルセリン（ＰＳ）残基にカルシウム依存性結合の利点を１：５０のアネキシン：ＰＳで得た。次いで Becton-Dickinson FACStar フローサイトメトリーで４８８ｎｍでのアッセイを培養バイアルからの細胞に行い、非生存の細胞に対する比率を調べた。２次元ｘ−ｙ輪郭プロットを用い、後期アポトーシス事象から分離の初期アポトーシス事象の集団を示す。補償をサイトメトリー試験の前に、アネキシンのみ着色集団、プロピジウムのみ着色集団、非着色集団を用いて行い、各ＦＬ−１／ＦＬ−２カドラントでの検出を限界ずけた。全サンプリングは、CellQuest ソフトウエアーを用いるサンプルカドラントの各セットについて所定の統計および回帰分析で１.０ｘ１０^６細胞／ｍｌを越えるサンプル集団平均ウエルから算出の５０００細胞事象平均であった。フルオレセン着色集団のみがアポトーシス検出の境界を表し、一方、プロピジウムヨーダイドでのジュアルカウンター着色が壊死集団を表した。

紫外線誘発皮膚障害に対する保護、照射前にＤＥ−ＴＯＰＳを適用したとき
図３２に示すように、ＵＶＢに１１日間暴露すると、ＵＶＢ暴露のない正常なマウス皮膚に比して顕著な皮膚肥厚が生じる。組織病理学的検査によると、ＤＥ−ＴＯＰＳの皮膚適用がＵＶＢ誘発の皮膚肥厚を劇的に低下する。皮膚適用はＵＶＢ照射の１０分前に毎日行った。ＵＶＢ量は２００ｍＪ／ｃｍ^２、１５分間である。ＵＶＢランプは、スペクトル分散が８０％で２９０−３１０ｎｍ、２０％で３１０以下である。ＤＥ−ＴＯＰＳ製剤は石油基剤中１００ｍＭである。図３１に示すように、類似のプロトコールで、皮膚焼けはＤＥ−ＴＯＰＳにより急性的に阻止される。図３３に示すように、同じマウスで４か月間、皮膚損傷がＤＥ−ＴＯＰＳにより慢性的に阻止された。このサンプルでＤＥ−ＴＯＰＳをＵＶＢ照射の２時間前に適用した。

紫外線誘発皮膚障害に対する保護、照射後にＤＥ−ＴＯＰＳを適用したとき
ＤＥ−ＴＯＰＳを照射１５分後に適用した以外は、実施例１３と同じプロトコールを用いた。ＤＥ−ＴＯＰＳの保護効果を図３４に、組織病理学的変化を図３５に示す。

紫外線誘発皮膚障害に対する保護、Tempolとの比較
本試験では、実施例１３と同じプロトコールを用いた。ＵＶＢ誘発皮膚障害に対する保護についてのＤＥ−ＴＯＰＳの作用を、照射１０分前または２時間前の適用で、Tempolと比較して試験した。図３６の結果は、ＤＥ−ＴＯＰＳがTempolよりも長い治療作用を提供することを示す（参照、図３６ＢおよびＣ)。

Rhino マウスにおけるＢＥ−ＴＯＰＳの抗しわ作用
市販の皮膚治療薬に比してのＣＧＮの利点を調べるために、ＢＥ−ＴＯＰＳ、レチン−Ａおよびプラセボを、交互の日のＵＶＢ照射に暴露されたマウスの皮膚に投与した。レチン−Ａでの処置で、対照マウスに比して皮膚のしわが減少した（参照、図３７)。レチン−Ａの光感受性は背面皮膚の脱色および剥離を起こすが、背面皮膚の組織的検査によると、レチン−Ａ処置は開および深シスト（cysts）の密度を減少せしめた。
ＢＥ−ＴＯＰＳもレチン−Ａに勝る利点を有し、ＤＥ−ＴＯＰＳ処置マウスはＵＶＢ感受性である。

本発明について、具体的な実施態様を参照して記述したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなしに、種々の変更をなし、均等物で置換し得ることを当業者は理解すべきである。さらに、多くの改変をなして、本発明の対象、精神および範囲に特定の状態、材料、事物の組合せ、方法、方法工程を適合せしめ得る。すべてのかかる改変は添付の特許請求の範囲にあることを意図する。

図１は、エステル化カルボキシレート−ゲート−ニトロキシド（ＣＧＮ）およびその誘導体の一般的構造式を示す。 図２は、エステル化ジカルボキシルアミノ酸ＣＧＮの一般的構造式を示す。 図３は、エステル化カルボキシルジアミノ酸およびその誘導体の一般的構造式を示す。 図４は、選択された化合物の一般的構造を示す。これは、実施例で例示する。 図５は、一般化合物、２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−ピペリジリデン−４−スクシネートを示す。 図６は、ひとつのヒドロキシル（−Ｈ）基で置換されたＲ_２を有する図５の半一般的構造式を示す。 図７は、水素で置換されたＲ_２およびＲ_３を有する図５の構造式を示す。これを、化合物２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−ピペリジリデン−４−スクシネート（ＴＯＰＳ）と称する。 図８は、水素およびエチルでそれぞれ置換されたＲ_２およびＲ_３を有する図５の構造式を示す。これを、化合物モノエチル−２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジリデン−スクシネート（Ｅ−ＴＯＰＳ）と称する。 図９は、両Ｒ_２およびＲ_３ともエチルである図５の構造式を示す。これを、化合物ジエチル−２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジリデン−スクシネート（ＤＥ−ＴＯＰＳ）と称する。 図１０は、両Ｒ_２およびＲ_３ともtert−ブタノールである図５の構造式、すなわちジ−tert−ブチル−２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジリデン−スクシネート（ＤＢ−ＴＯＰＳ）を示す。 図１１は、Ｒ_２がTempolである図５の一般的構造式，すなわちＴＥ−ＴＯＰＳを示す。 図１２は、両Ｒ_２およびＲ_３ともTempolである図５の構造式、すなわちＴＴ−ＴＯＰＳを示す。 図１３は、一般環が５員環である図４の構造式を示す。 図１４は、ＴＯＰＳならびにそのカルボン酸エステル誘導体、Ｅ−ＴＯＰＳおよびＤＥ−ＴＯＰＳを同定する液体クロマトグラフィー・スペクトルを示す。 図１５は、水環境における水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）によるＤＥ−ＴＯＰＳからＴＯＰＳへの加水分解を示す。ＥＰＲシグナルから明白なように、加水分解の前後にＤＥ−ＴＯＰＳからＴＯＰＳへの完全な転換が起きる。 図１６は、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳおよび^１５Ｎ−TempolからＴＥ−ＴＯＰＳの合成における構造変化を表示する液体クロマトグラフィーＨＰＬＣおよびＥＰＲスペクトルを示す。 図１７（ＡおよびＢ）は、^１４Ｎ−^１５Ｎ−ＴＥ−ＴＯＰＳの２モノラジカルへのインビトロおよびインビボでの加水分解を示す。 図１８は、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳのインビボ血漿半減期が^１５Ｎ−Tempolに比して、両者のマウス腹腔への共投与時に、伸長することを示す。 図１９は、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳのインビボ血漿半減期が^１５Ｎ−Tempolに比して、両者のマウス静脈への共投与時に、伸長することを示す。 図２０は、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳのインビボ血漿半減期が^１５Ｎ−Tempolに比して、両者のマウス筋肉内への共投与時に、伸長することを示す。 図２１は、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳのインビボ血漿半減期が^１５Ｎ−Tempolに比して、両者のマウスへ経口共投与時に、伸長することを示す。 図２２Ａ−Ｃは、^１４ＮＥ−ＴＯＰＳおよび^１５Ｎ−Tempolを毛無しマウス皮膚に適用するときに、フランツ型拡散セルにおけるＤＥ−ＴＯＰＳの皮膚透過および区分化（compartmentalization）を示す。２２Ａは適用前；２２Ｂはレセプターセルにおいて；２２Ｃは皮膚において２０時間である。 図２３は、ＥＰＲＩによるＤＥ−ＴＯＰＳの皮膚透過および区分化を示す。 図２４は、マウスＬＤ_５０試験におけるＥ−ＴＯＰＳについて生存率と用量の関係をTempolに比して示す。 図２５は、毎日の適用１０日後の尿中への排泄および血漿での減少を介するＤＥ−ＴＯＰＳの代謝を示す。 図２６は、ＥＰＲにより測定されたＥ−ＴＯＰＳのスーパーオキシドディムスターゼ活性を示す。 図２７は、ＤＥ−ＴＯＰＳ、Ｅ−ＴＯＰＳ、ＴＯＰＳの、皮質ニューロンに対するヘモグロビン誘導毒性の用量依存的阻害を示す。 図２８は、ＤＥ−ＴＯＰＳ、Ｅ−ＴＯＰＳ、ＴＯＰＳの、皮質ニューロンに対するペルオキシ亜硝酸塩誘導毒性の用量依存的阻害を示す。 図２９は、ＤＥ−ＴＯＰＳ、Ｅ−ＴＯＰＳ、ＴＯＰＳが、ペルオキシ亜硝酸によるヒドロキシフェノール酢酸（ＨＰＡ）のニトロ化を用量依存的に阻害することを示す。 図３０は、Ｅ−ＴＯＰＳが、種々のインキュベーション時間でＹ−７９細胞系に対する腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）により起こされたアポトーシスを減少することを示す。 図３１は、ＤＥ−ＴＯＰＳの照射前局所適用が毛無しマウスでのＵＶＢ誘導の皮膚障害を急性的に防止することを示す。 図３２は、１１日間のＵＶＢ照射後での毛無しマウスの組織病理学的変化を、対照または照射前適用のＤＥ−ＴＯＰＳで示す。 図３３は、ＤＥ−ＴＯＰＳの照射前局所適用が毛無しマウスでのＵＶＢ誘導の皮膚障害を４か月の慢性的に防止することを示す。 図３４は、ＤＥ−ＴＯＰＳの照射後局所適用が毛無しマウスでのＵＶＢ誘導の皮膚障害を急性的に防止することを示す。 図３５は、１１日間のＵＶＢ照射後での毛無しマウスの組織病理学的変化を、対照または照射後適用のＤＥ−ＴＯＰＳで示す。 図３６（Ａ、Ｂ、Ｃ）は、ＵＶＢ誘導の急性障害に対するＤＥ−ＴＯＰＳの作用をTempolと比較して、照射前１０分または２時間での適用で示す。 図３７は、ＤＥ−ＴＯＰＳ、プラセボおよびレチン−Ａの比較を、ＤＥ−ＴＯＰＳ処置および紫外線照射１５日後で示す。

Claims (18)

1. 下記の構造式ＡまたはＢの化合物：
   

   

   Ａ：ジエチル-2,2,6,6,-テトラメチル-1-オキシル-4-ピペリジリデン-スクシネート；
   Ｂ：Tempol・エチル-2,2,6,6,-テトラメチル-1-オキシル-4-ピペリジリデン-スクシネート。
2. 薬学的に許容される担体および請求項１の化合物を含む医薬組成物。
3. 薬学的に許容される担体が、ゲル、クリーム、軟膏、エマルション、固体不活性粉末および塩類溶液から選択される、請求項２の医薬組成物。
4. ポリニトロキシルアルブミンをさらに含む、活性酸素種損傷に由来の疾患または障害の治療または予防用途の組成物である、請求項２の医薬組成物。
5. 非ステロイド性抗炎症剤をさらに含む、抗炎症用途の組成物である、請求項２の医薬組成物。
6. 抗生物質をさらに含む、抗菌用途の組成物である、請求項２の医薬組成物。
7. 哺乳類の細胞に投与して酸化反応を変調するための、請求項１の化合物を含む医薬組成物。
8. 局所適用のために製剤されている、請求項２〜７のいずれかの組成物。
9. ヒトへの注射用に製剤されている、請求項２〜７のいずれかの組成物。
10. 経口投与のために製剤されている、請求項２〜７のいずれかの組成物。
11. 眼投与のために製剤されている、請求項２〜７のいずれかの組成物。
12. エアロゾル投与のために製剤されている、請求項２〜７のいずれかの組成物。
13. 直腸投与のために製剤されている、請求項２〜７のいずれかの組成物。
14. 化粧品的に許容される担体および請求項１の化合物を含む化粧料組成物。
15. 化粧品的に許容される担体が、ゲル、クリーム、軟膏、エマルション、固体不活性粉末および塩類溶液から選択される、請求項１４の化粧料組成物。
16. ポリニトロキシルアルブミンをさらに含む、請求項１４の化粧料組成物。
17. 非ステロイド性抗炎症剤をさらに含む、請求項１４の化粧料組成物。
18. 抗生物質をさらに含む、請求項１４の化粧料組成物。

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