KR101860555B1 - Mhy498을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 고형 지질 나노입자 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Mhy498을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 고형 지질 나노입자 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MHY498을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 고형 지질 나노입자 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 MHY498의 난용성, 피부 자극 및 독성을 해결하기 위해 MHY498을 고형 지질 나노입자로 봉인시킴으로써 피부에 적용시 밀봉막을 형성하고, 피부 각질층 성분과 상화작용하여 MHY498의 피부 침투를 증진시킬 수 있다. 또한, MHY498이 봉입된 고형 지질 나노입자는 비독성 및 생체 적합성을 가지며, 두 개의 상(bi-phasic)의 방출 패턴을 보이는데, 초기 신속한 방출은 충분한 농도 구배를 제공함으로써 MHY498 피부 침투를 용이하게 하며, 지속적인 방출은 국소 농도를 유지하여 MHY498의 장기적인 항-멜라닌 생성 효과를 나타낸다. 또한, 고형 지질 나노입자의 제조방법에 있어서 고압 및 고가의 장비를 필요로 하지 않기 때문에 제조 비용을 절감시키고 생산성을 증가시킬 수 있다.

Description

MHY498을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 고형 지질 나노입자 조성물 및 이의 제조방법{Solid lipid nanoparticles composition for skin-whitening effect comprising MHY498 and preparation method thereof}
본 발명은 MHY498을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 고형 지질 나노입자 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
멜라닌은 피부색의 결정요인으로 표피의 기저층 에있는 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성 경로에 의해 생산된다. 멜라닌은 UV에 의한 손상에 대해 피부를 보호하는데 중요한 역할을 한다. 그러나, 멜라닌의 과잉 생산은 주근깨, 기미 및 검버섯을 포함하는 과색소침착(hyperpigmentation)을 유발하며, 이것은 심각한 심미적 문제와 연관된 세 번째로 가장 흔한 피부 질환이다. UV 방사선, α-멜라닌 세포 자극 호르몬(α-melanocyte stimulating hormone, α-MSH), cAMP-활성제(포스콜린(forskolin)) 및 멜라닌 합성 효소(티로시나아제(tyrosinase), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1), 도파크롬 상호변이효소(dopachrome tautomerase))와 같은 다양한 원인은 멜라닌 생성과 피부 축적을 조절하는데 연구되고 있다. 그 중 티로시나아제는 티로신이 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환하고, 유멜라닌(eumelanin)과 페오멜라닌(pheomelanin)을 생성하는 멜라닌 생성(melanogenesis)의 속도-제한 단계(rate-limiting step)를 조절함으로써 티로시나아제의 억제는 과색소침착 치료에 효과적이다.
코직산(kojic acid)과 하이드로퀴논(hydroquinone)과 같은 상업적 티로시나아제 억제제는 자외선 차단제 및 화장품에서 피부 미백제로 사용되어 왔다. 그러나, in vivo 효능, 피부 침투 및 제제 안정성 평가가 부족하여 임상적 사용이 제한되고 있어, 새로운 티로시나아제 억제제의 개발이 필요한 실정이다. 최근, 새로운 티로시나아제 억제제인 (Z)-5-(2,4-dihydroxy benzylidene) thiazolidine-2,4-dione(MHY498)은 이미다졸(imidazole)과 2,4-디히드록시 페닐 잔기(2,4-dihydroxy phenyl moiety)를 포함하는 화합물로 티로시나아제 활성을 다른 유도체보다 더 강력하게 억제하였다. MHY498(mean IC50=3.55 μM)은 코직산보다 6.4배 강력한 효능을 보였고, B16F10 멜라닌 세포에 최대 32 μM의 농도까지 비독성을 보였으며 농도 의존적으로 티로시나아제를 억제하였다. 코직산은 같은 농도에서 세포 독성을 보였다. 따라서, MHY498은 과색소침착을 치료하기 위한 티로시나아제 억제제로 사용할 수 있다.
이러한 효능에도 불구하고, 피부 보호막인 각질층(stratum corneum) 때문에 피부를 통한 MHY498의 전달에 어려움이 있다. 낮은 전달 효율은 빈번한 투여 또는 침투 촉진제 사용을 필요로 할 수 있고, 피부의 독성을 야기할 수 있다. 또한, 각질층에 티로시나아제 억제제의 직접적인 접촉은 피부암을 유발할 수 있다. 그러므로, MHY498의 안전한 캡슐화와 같이 각질층에서 멜라닌 세포로의 효과적인 침투가 보장되는 전달 시스템이 필요하다.
고형 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles, SLN)는 피부를 통한 약물 전달 동안 발생하는 기존의 단점을 제거하기 때문에 국소 약물 전달 시스템(topical drug-delivery system)에서 종종 사용되어 왔다. 고형 지질 나노입자는 다른 나노 입자 시스템과는 다른 독특한 특징을 가진다. 고형 지질 나노 입자에 사용된 지질은 생체 적합성을 가지며 급성 및 만성 피부에 독성이 없어 안전한 부형제(excipient)로 사용된다. 또한, 지질은 세라마이드(ceramide), 유리 지방산(free fatty acids), 콜레스테롤(cholesterol) 및 트리글리세라이드(triglycerides)의 지질 매트릭스에 포함된 6각형의 각질세포(hexagonal corneocytes)로 구성되는 각질층과 유리한 상호작용 할 수 있다. 고형 지질 나노입자는 피부에 적용할 때, 폐색막을 형성하여 경피의 수분 손실을 막고 각질층을 수화시켜 약물 침투를 용이하게 한다.
현재까지, 몇몇 연구에서 티로시나아제 억제제를 포함하는 지질 나노입자의 제제에 대해 보고한 바 있다. 그러나, 대부분 in vitro에 한정되었고, 과색소침착 치료의 in vivo 평가는 수행되지 않았다. 또한, 피부 적용 고형 지질 나노입자의 제조에는 초고압 균질기(high pressure homogenizer) 등의 고가의 기기를 이용한 복잡한 제조방법이 주로 사용되고 있다. 본 발명의 목적은 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하는 운반자(carrier)로서 고형 지질 나노입자를 고가의 장비 사용 없이 간단하게 제조하고, 제조된 고형 지질 나노입자를 이용하여 피부 기저층으로 MHY498을 독성 없이 효과적으로 전달하는 것이다. 본 발명자들은 콤프리톨(compritol) 888 ATO에 기초한 지질 나노입자에 MHY498를 캡슐화하였다. MHY498을 포함하는 고형 지질 나노입자(MHY498-SLN)를 다른 매개 변수(parameter)를 이용하여 평가하였고, in vivo에서 멜라닌 생성 억제 효과를 C57BL/6 마우스 모델을 이용하여 평가하였다. MHY498-SLN의 독성 평가는 L929 피부 섬유아세포에서 평가하였다.
대한민국 등록특허 제 10-1334466호 (2016. 11. 22. 공개)
본 발명의 목적은 MHY498 및 지질 매트릭스로 이루어진 나노입자 형태의 코어층과, 상기 코어층 주위를 둘러싸며 폴록사머 188로 이루어진 쉘층을 포함하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 MHY498 및 지질 매트릭스로 이루어진 나노입자 형태의 코어층과, 상기 코어층 주위를 둘러싸며 폴록사머 188로 이루어진 쉘층을 포함하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 건강식품 조성물, 또는 과색소침착 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MHY498 및 지질 매트릭스로 이루어진 나노입자 형태의 코어층과, 상기 코어층 주위를 둘러싸며 폴록사머 188로 이루어진 쉘층을 포함하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 MHY498 및 지질 매트릭스로 이루어진 나노입자 형태의 코어층과, 상기 코어층 주위를 둘러싸며 폴록사머 188로 이루어진 쉘층을 포함하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 건강식품 조성물, 또는 과색소침착 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
MHY498은 티로시나아제 억제제로 피부에서 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 작용을 하는 물질이다. 그러나, MHY498의 낮은 용해도를 향상시키기 위해 사용되는 알코올, 프로필렌 글리콜 등과 같은 용매는 피부 자극 및 독성을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명은 난용성 MHY498의 피부 침투를 최대화하기 위하여 고형 지질 나노입자를 개발하였다. 고형 지질 나노입자에 사용된 지질 성분은 피부에 무해하고, 난용성 MHY498을 봉입시킴으로써 피부에 적용시 밀봉막을 형성하고, 피부 각질층 성분과 상화작용하여 MHY498의 피부 침투를 증진시킬 수 있다. 또한, MHY498이 봉입된 고형 지질 나노입자는 비독성 및 생체 적합성을 가지며, 두 개의 상(bi-phasic)의 방출 패턴을 보이는데, 초기 신속한 방출은 충분한 농도 구배를 제공함으로써 MHY498 피부 침투를 용이하게 하며, 지속적인 방출은 국소 농도를 유지하여 MHY498의 장기적인 항-멜라닌 생성 효과를 나타낸다. 또한, 고형 지질 나노입자의 제조방법에 있어서 고압 및 고가의 장비 없이 간단한 혼합을 통해 제조가 가능하므로 비용을 절감시키고 생산성을 증가시킬 수 있다.
또한, 발명의 MHY498 및 지질 매트릭스로 이루어진 나노입자 형태의 코어층과, 상기 코어층 주위를 둘러싸며 폴록사머 188로 이루어진 쉘층을 포함하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자는 피부 미백용 화장료 조성물 및 건강식품 조성물, 또는 과색소침착 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 MHY-SLN의 in vitro 특징에 관한 것으로, A는 MHY498, 콤프리톨 및 MHY-SLN의 투과 전자 현미경 이미지, B는 입자 크기 확산, C는 XRD 회절도, D는 DSC 온도 기록도를 나타낸 것이다.
도 2는 MHY498-SLN의 in vitro 방출 프로파일에 관한 것으로, 약물 방출 실험은 투석 백-확산 기법을 이용하여 수행하였다.
도 3은 MHY-용액과 MHY-SLN의 in vitro 피부 침투에 관한 것으로, 피부 침투는 C57BL/6 마우스의 등쪽 피부를 사용하여 평가하였다.
도 4는 MHY499-SLN의 in vivo 평가에 관한 것으로, A는 UV-정상군, MHY-용액군 및 MHY-SLN군에서 피부 밝기를 일 변화(daily change)에 기초하여 정성적으로 비교하여 나타낸 것이며, B는 피부 밝기를 피부 침착의 반사 비색법(reflective colorimetric measurement)에 기초하여 정량적로 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 멜라닌 세포와 멜라닌의 조직학적 평가를 위해, UV-정상군, MHY-용액군 및 MHY-SLN군의 섹션에서 폰타나-메이슨 염색을 수행하여 광학 현미경으로 관찰한 것이다.
도 6은 MHY-용액 및 MHY-SLN의 in vitro 세포독성을 나타낸 것으로, 마우스 섬유아세포인 L929 세포주를 이용하여 세포독성을 평가하였다.
도 7은 MHY-SLN 매트릭스를 통한 MHY498의 메커니즘을 보여주는 모식도이다.
본 발명에서 사용된 용어 “MHY498”은 (Z)-5-(2,4-디하이드록시벤질리덴)티아졸리딘-2,4-디온((Z)-5-(2,4-dihydroxybenzylidene)thiazolidine-2,4-dione)으로, 대한민국 특허 10-2013-0045887호(2013.05.06 공개)에 공개되어 있다. 상기 화합물은 티로시나아제를 억제하는 피부 미백 활성을 지니므로 피부 미백용 약학 조성물 또는 화장품에 유용하게 사용될 수 있고, 항산화 활성을 지니므로 피부 노화 등의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “콤프리톨 888 ATO”는 상용화된 화합물로 50 μm의 입자 크기를 가지며, 경구용 고형 제제(지질 매트릭스)에서 사용되는 지질이다. 정제 및 캡슐제의 윤활유이며, 민감한 활성 성분의 보호를 위한 지질막을 제공하는 코팅 공정에서 사용될 수 있다. 또한, 다른 성분들과 화학적 불활성하여 높은 배합 적합성을 가진다.
본 발명에서 사용된 용어 “포스포리폰 90 G”는 0.1% 아스코빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate)을 함유하는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)으로 상용화된 화합물이다. 포스포리폰 90 G는 비경구 투여 제제의 가용화제, 약제 또는 화장품의 유화제 및 약물에서 포스파티딜콜린의 원료로 사용된다.
본 발명에서 사용된 용어 “폴록사머 188”에서 폴록사머는 친수성 블록인 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 와 소수성 블록인 폴리프로필레옥사이드(PPO)가 PEO-PPO-PEO 형태의 삼중블록으로 에테르 결합으로 연결된 화합물로서, 고분자의 중량 평균 분자량이 1,000 내지 20,000 Da이고, 양 말단기가 히드록시기인 블록 공중합체를 의미하며, 특히 상용화된 화합물인 폴록사머 188을 그 예로 들 수 있다. 폴록사머는 계면활성제로 소수성 부분 및 친수성 부분을 모두 함유하는 표면 활성 분자이다.
본 발명에서 사용된 용어 “생체 적합성”은 체내에 투여된 후 가수분해 또는 효소에 의하여 분해되어, 체내로 흡수되거나 안전하게 배출되는 특성을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 “동결건조”는 일반적으로 다양한 물질을 물에 녹여 0℃ 이하에서 얼리고, 진공펌프를 이용하여 감압시킴으로써, 용매로 이용된 물의 승화를 일으켜서 건조하는 방식이다.
본 발명은 MHY498 및 지질 매트릭스로 이루어진 나노입자 형태의 코어층과, 상기 코어층 주위를 둘러싸며 폴록사머 188로 이루어진 쉘층을 포함하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자를 제공한다.
바람직하게는, 상기 코어층은 MHY498 2 내지 6 중량% 및 지질 매트릭스 94 내지 98 중량%로 이루어질 수 있다.
바람직하게는, 상기 지질 매트릭스는 콤프리톨 888 ATO, 포스포리폰 90 및 이의 혼합물에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 고형 지질 나노입자의 크기는 100 내지 400 nm일 수 있다.
본 발명은 i) MHY498, 콤프리톨 888 ATO 및 포스포리폰 90 G를 무수 에탄올에 용해하여 혼합 용액을 제조하는 단계, ii) 상기 i) 단계의 혼합 용액을 가열하여 유기상을 제조하는 단계, iii) 상기 ii) 단계의 유기상을 차가운 폴록사머 188 용액으로 주입한 후 교반시키는 단계 및 iv) 상기 iii) 단계 이후, 원심분리하여 고형 지질 나노입자를 획득하는 단계를 포함하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 ii) 단계에서의 가열은 70 내지 90℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. 가열 온도가 상기 범위를 벗어나는 경우, 고형 지질 나노입자의 제조 수율이 저하되는 문제점이 있을 수 있어 바람직하지 않을 수 있다.
바람직하게는, 상기 iii) 단계에서의 차가운 폴록사머 188 용액에서 폴록사머 188은 0.3 내지 0.7%(w/v)를 함유할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. 폴록사머 188의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우, 고형 지질 나노입자의 제조 수율이 저하되는 문제점이 있을 수 있어 바람직하지 않을 수 있다.
바람직하게는, 상기 iii) 단계에서의 차가운 폴록사머 188 용액의 온도는 1 내지 10℃일 수 있다. 실시예에서 ii) 단계에서 제조된 뜨거운 유기상을 뜨거운 폴록사머 188 용액으로 주입하였을 때, 고형 지질 나노입자의 수율이 매우 낮아지는 것을 확인하였다(~25%). 뜨거운 폴록사머 188은 MHY498를 가용화시켰고 이는 SLN 매트릭스에서 MHY498을 방출시키는 원인일 수 있다. 따라서, MHY498 방출을 방지하기 위해, 뜨거운 유기상을 차가운 폴록사머 188 용액으로 주입한 결과, 고수율의 고형 지질 나노입자를 제조할 수 있었다.
바람직하게는, 상기 iii) 단계에서의 교반은 800 내지 12000 rpm에서 3 내지 5시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. rpm 및 교반 시간이 상기 범위를 벗어나는 경우, 반응 속도가 현저하게 저하되어 고형 지질 나노입자의 제조 수율이 저하되는 문제점이 있을 수 있어 바람직하지 않을 수 있다.
바람직하게는, 상기 iv) 단계 이후에, 동결 보호제를 부가하고 동결 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 MHY498 및 지질 매트릭스로 이루어진 나노입자 형태의 코어층과, 상기 코어층 주위를 둘러싸며 폴록사머 188로 이루어진 쉘층을 포함하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물인 경우, 상기 화장료 조성물은 상기 유효성분 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위해 피부 흡수 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 화장료 조성물은 화장수, 유액, 스킨, 토너, 로션, 에센스, 선 스크린, 크림, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 팩, 젤, 샴푸, 린스, 스프레이, 메이크업 제거제 및 세정제 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아님을 명시한다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 MHY498 및 지질 매트릭스로 이루어진 나노입자 형태의 코어층과, 상기 코어층 주위를 둘러싸며 폴록사머 188로 이루어진 쉘층을 포함하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 건강식품 조성물을 제공한다.
상기 건강식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품 조성물은 상기 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품 조성물에 함유된 상기 유효성분의 유효용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
본 발명은 MHY498 및 지질 매트릭스로 이루어진 나노입자 형태의 코어층과, 상기 코어층 주위를 둘러싸며 폴록사머 188로 이루어진 쉘층을 포함하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자를 유효성분으로 함유하는 과색소침착 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 등으로 제형화 될 수 있다. 한편, 상기 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학 조성물은 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물 중 유효성분의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : MHY498 합성
피페리딘(piperidine)은 에탄올에 치환된 2,4-디하이드록시벤즈알데하이드(2,4-dihydroxybenzaldehyde)와 티아졸리딘-2,4-디온(thiazolidine-2,4-dione) 용액에 첨가되었다. 반응물은 여러 단계를 거친 뒤, MHY498은 고형의 황색 가루로 얻었다. MHY498의 자세한 합성방법은 대한민국 특허 10-2013-0045887호(2013.05.06 공개)에 기재되어 있다. 폴록사머 188(Poloxamer 188, Kolliphor® P188), 포스포텅그스텐 산(phosphotungstic acid), 테트라졸리움 염료(3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide, MTT) 및 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)에서 구매하였다. RPMI 1640 배지, 트립신(trypsin), 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)은 하이클론(Hyclone, Logan, UT)에서 구매하였다. 폰타나-메이슨 염색 키트(fontana-masson staining kit)는 싸이텍(ScyTek, Utah, USA)에서 구매하였고, 다른 모든 시약 및 용매는 상업적으로 이용 가능한 가장 높은 분석용 등급으로 사용하였다.
실시예 2 : MHY498 - SLN 제조
MHY-SLN는 변형된 o/w 에멀젼 용매 증발(emulsion solvent evaporation) 방법에 의해 제조되었다. 간략하게, 10 mg의 MHY498, 150 mg의 콤프리톨(compritol) 888 ATO 및 100 mg의 포스포리폰 90 G(phospholipon 90G)를 10 ml의 무수 에탄올(anhydrous ethanol)에 용해하고 80℃에서 가열하여 유기상을 제조하였다. 유기상을 0.5% w/v 차가운 폴록사머 용액으로 천천히 주입하고, 후드에서 1000 rpm으로 4시간 동안 교반하여 용매를 증발시켰다. 고형 지질 나노입자는 25,000 g에서 1시간 동안 원심분리하여 펠렛(pallet)으로 얻었고 물에 재용해하여 현탁액으로 보관하였다. 결정성을 평가하기 위해, MHY-SLN 현탁액을 24시간 동안 -50℃에서 동결건조 시켰다.
실시예 3 : 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM )에 의한 MHY - SLN의 물리화학적 특성
MHY-SLN 형태학(morphology)은 네가티브 염색(negative staining) 방법을 이용하여 투과 전자 현미경(H-7600, Hitachi, Japan)으로 분석하였다. 간략하게, 희석된 MHY-SLN 현탁액 한 방울을 200-메쉬 포름바 쿠퍼 그리드(200-mesh formvar copper grid)에 마운팅(mounting)하고 실온에서 건조시켰다. 그 후, 샘플을 1% (w/v) 포스포텅그스텐 산으로 네가티브 염색한 다음 투과 전자 현미경으로 관찰하였다.
실시예 4 : 입자 크기의 결정 분석
입자 크기 및 MHY-SLN의 제타 전위(zeta potentials)는 멜버른 제타시져 나노 ZS 시스템(Malvern Zetasizer Nano ZS system, Malvern Instruments, Worcestershire, U.K.)을 이용하여 측정하였다. 간략하게, 각 샘플 5 μl를 2 ml의 밀리큐 워터(MilliQ water)에 희석하고, 입자 크기 및 제타 전위는 25℃에서 측정하였다.
실시예 5 : 약물 로딩(loading) 및 캡슐화 효율
SLN에서 MHY498의 양은 UV 분광 광도법(UV-spectrophotometry)으로 측정하였다. 간략하게, 200 μl MHY-SLN 현탁액을 동결건조 시키고, 무수 에탄올에 용해시켰다. MHY498을 포함하는 에탄올 용액은 볼텍서(vortexer)를 이용하여 하루 동안 진탕한 후, 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 모아 376 nm에서 UV 분광 광도법으로 분석하였다. 모든 실험은 3 반복으로 수행하였다. 측정된 결과로부터, SLN에서 MHY498의 총량 및 SLN의 중량을 계산하였다. 약물 로딩 및 약물 캡슐화 효율(%)은 하기 계산식을 사용하여 계산하였다.
[계산식 1]
Figure 112016088909713-pat00001
[계산식 2]
Figure 112016088909713-pat00002
실시예 6 : X-선 회절(X-Ray diffraction, XRD )
SLN에서 MHY498의 물리적 상태는 XRD(Miniflex, Rigaku co., Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다. X선 튜브는 40 kV 및 40 mA로 실행되었다. 산란 각도(Scattering angles)는 브레그 법칙(Bragg’s equation) (nλ=2d sin θ)을 이용하여 짧은 간격으로 변형되었다. 모든 분말 시료는 5-40°의 2θ 각에서 주사(scan)되었고, 주사 속도(scanning rate)는 2θ/분이었다. 샘플은 단독 MHY498, 콤프리톨 888 ATO 및 MHY-SLN을 사용하여 수행되었다.
실시예 7 : 시차주사열량계(differential scanning calorimetry, DSC )
DSC는 DSC-8000(Perkin-Elmer, USA)을 이용하여 수행되었다. 10℃/분의 가열 속도(heating rate), 20-220℃의 온도 범위를 적용하였고, 분석은 20 ml/분의 질소 퍼지(nitrogen purge) 하에서 수행되었다. 샘플 약 10 mg이 분석을 위해 사용되었다. 샘플은 단독 MHY498, 콤프리톨 888 ATO 및 MHY-SLN을 사용하였으며, 빈 알루미늄 샘플 판은 기준(reference)으로 사용되었다.
실시예 8 : In vitro 방출 실험
SLN로부터 체외로 방출된 MHY498은 투석 백-확산 기법(dialysis bag-diffusion technique)에 의해 측정되었다. 12,000-14,000(Visking® dialysis tubing, Servia)의 분자량을 차단하는 투석 백이 사용되었다. 방출 배지는 150 ml 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.4)와 1% 트윈 80(tween 80)이 포함되었다. 투석 막은 하루 동안 담갔다가 3 ml MHY-SLN 현탁액으로 채운 후, 양단을 밀봉하고 방출 배지에 넣었다. 실험은 37℃에서 수행되었고, 50 rpm 속도로 교반하였다. 샘플은 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 및 24시간째에 회수하였고 각 샘플 1 ml은 새로운 배지로 대체되었다. 샘플은 UV 분광 광도법으로 분석하였고, 각 제제로부터의 방출은 3 반복으로 수행하였다.
실시예 9 : In vitro 피부 침투 실험
In vitro 피부 침투 실험은 3-구역 프란츠 확산 세포(3-station Franz diffusion cell, PermeGear, Inc., Hellertown, PA, USA)를 사용하여 수행하였고 C57BL/6 마우스(수컷 7주, 25 g)의 전층 등쪽 피부를 사용하였다. 간략하게, 각 마우스는 CO2 기체를 이용하여 안락사 시키고, 전기 트리머(trimmer)를 이용하여 등쪽 부분을 털을 제거한 후, 헤어 제거 크림(Veet® Hair-Removal Cream, Reckit Benckiser, Inc., UK)을 5분 동안 발라 털을 완벽하게 제거하였다. 피부를 수집하고, 피하 지방 조직은 인산완충식염수로 세척하는 동시에 무딘(blunt) 가위를 이용하여 제거하였다. 프란츠 확산 세포 교반기는 37℃의 온도를 유지하기 위해 회류수조(circulatory water jacket)와 연결하였다. 리셉터 구획(receptor compartment)은 7 ml의 인산완충식염수(pH 7.4)와 1 ml의 에탄올로 채웠다. 에탄올은 배수 상태를 원활하게 하기 위해 보조제(solubilizer)로 사용되었다. 마우스 피부는 각질층 측을 외측을 향하게 하여 세포에 마운팅 되었다. 피부의 확산 면적은 0.95 cm2 였다. 도너 구획(donor compartment)은 MHY-SLN 현탁액 300 μg로 채웠고 증발을 막기 위해 파라핀(paraffin)으로 덮었다. 리셉터 용액(receptor solution)은 일정한 rpm으로 교반하였다. 특정 시간 시점(1, 2, 3, 4, 6, 12, 24 및 48시간)에서 샘플 2 ml을 회수하여 동일 부피의 새로운 용액으로 대체하였다. 모든 샘플은 0.22 μm의 기공 크기를 가지는 셀룰로오스 멤브레인 필터(cellulose membrane filter)를 이용하여 여과시키고 UV 분광 광도법으로 분석하였다. 상기 절차는 에탄올과 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 2:1 비율에 MHY498 300 μg을 포함한 MHY498 용액에서도 수행되었다.
실시예 10 : 피부 침투 매개 변수
마우스 피부를 통해 침투된 MHY498의 누적량(QMHY)은 시간에 대하여 플롯팅(plottine)하고 하기 계산식을 이용하여 계산하였다.
[계산식 3]
Figure 112016088909713-pat00003
여기서, Vr과 Vt는 각각 리셉터 및 도너 구획의 부피이다. Ct는 각각의 샘플링 시간에 리셉터 구역의 MHY498 농도를 나타낸다. Ci는 i 번째 샘플의 약물 농도이며, A는 효과적인 피부 표면적(0.95 cm2)이다. 피부를 통한 MHY498 플럭스(flux)는, J/(μg·cm2·h), 단위 면적 대 시간 당 마우스 피부를 통해 침투한 MHY498의 누적량을 도시한 그래프의 직선 부분의 기울기로부터 계산되었다.
실시예 11 : In vivo MHY498 - SLN의 평가
MHY-SLN의 탈색소(depigmentation) 활성을 평가하기 위해, 동물실험 모델로 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 동물실험 방법은 부산대학교 동물 관리 위원회로부터 승인을 받고 부산대학교에서 발행한 동물실험 지침을 따라 수행되었다. 5주된 수컷 C57BL/6 마우스는 샘타코바이오코리아(Samtako bio Korea)에서 구입하였다. 마우스는 12시간 낮/12시간 밤 사이클, 표준 사료 및 식수로 이루어진 표준 조건 하에서 보관되었고, 동물실험이 시작되기 전 7일 동안 순응시켰다. 마우스 피부의 등쪽은 실험을 위해 사용되었고 마우스 털은 전기 트리머와 헤어 제거 크림을 이용하여 제거하였다.
마우스는 무작위로 6마리씩 세 그룹(UV-정상군, MHY-용액, MHY-SLN)으로 나누었고, 각 그룹은 마우스 등쪽 피부에 멜라닌 생성을 유도하기 위해, 크로스링커(crosslinker, BEX-800, Ultra-Lum, Inc., Claremont, CA, USA)를 이용하여 450 mJ/cm2 강도의 자외선-B(ultraviolet radiation-B, UVB)로 조사되었다. 각 그룹은 격일로 2주 동안 UVB 조사에 노출되었다. 마우스 등쪽에 두 개의 2 cm2 면적을 선택하고, MHY-SLN 현탁액 또는 MHY-용액 200 μg을 각각 MHY-SLN 또는 MHY-용액 그룹에 14일 동안 처리하였다. UV 대조군은 미처리되었다.
처리 중에, 피부 밝기는 CIE는 국제 조명 위원회(Commission Internationale de l`Eclairage color system)에서 설명된 바와 같이 L*, a* 및 b*의 값을 사용하여 기술하는 CR-10 분광 광도계(spectrophotometer) (Konica Minlota Sensing, Inc., Sakai, Osaka, Japan)를 이용하여 측정하였다. 마우스는 14일 후 희생시키고, 피부조직은 조직학적 평가를 위해 수집하였다.
실시예 12 : 조직학적 평가
피부 생검 표본은 10% 포름알데히드(formaldehyde) 용액에 24시간 동안 고정시키고 표준 방법에 따라 파라핀 블록에 포매(embedded)하였다. 섹션(5 μm의 두께)은 유리 슬라이드에 고정시키고 멜라닌 세포와 멜라닌을 관찰하기 위해 폰타나 & 메이슨 염색(Fontana & Masson stain)을 수행하였다. 슬라이드는 광학 현미경으로 관찰하였고, 이미지는 추가 공정 없이 촬영하였다.
실시예 13 : In vitro L929 피부 세포를 이용한 세포 독성 실험
마우스 섬유아세포인 L929 세포주는 한국 세포주 은행(KCLB, Korea)에서 제공 받았고, 10%(v/v) 우태아혈청, 100 IU/㎖ 페니실린 G 소디움(penicillin G sodium) 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate)가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
세포는 96 웰 플레이트에 웰 당 5 × 104 세포로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지는 MHY498이 농도 별로(50, 100, 200, 400 μg/ml) 첨가된 MHY-SLN 현탁액을 포함하는 새로운 배지로 대체하고 24시간 동안 배양하였다. 표준 MTT 용액을 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 시험 물질 및 MTT 용액을 함유하는 배지는 제거하고 DMSO 150 μl를 각 웰에 첨가하였다. 540 nm에서 측정된 흡광도는 각 웰의 생존 세포의 농도에 비례된다. 비처리 세포는 대조군으로 사용하였다. 데이터는 4 반복으로 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타내었다(n=4). 세포 생존율은 하기 계산식을 이용하여 계산하였다.
[계산식 4]
Figure 112016088909713-pat00004
실시예 14 : 통계 분석
결과는 세 개 실험의 평균값(±표준 편차)으로 나타내었다. 모든 in vivo 데이터 분석은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism 5.0, GraphPad Software, Inc., LA Jolla, CA, USA)에서 unpaired Student’s t-test로 수행되었다. P 값이 < 0.05 일 때, 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험예 1 : MHY -SLN 제조 및 특성
MHY498-SLN은 변형된 에멀젼 용매 증발 방법에 의해 제조되었다. MHY498, 콤프리톨 888 ATO 및 포스포리폰 90 G는 유기상으로 사용되었고, 폴록사머 188는 수성상으로 사용되었다. 뜨거운 유기상을 뜨거운 폴록사머 188 용액으로 주입하였을 때, SLN의 수율은 매우 낮게 나타났다(~25%). 뜨거운 폴록사머 188은 MHY498를 가용화시키고 이는 SLN 매트릭스에서 MHY498의 방출의 원인일 수 있다. MHY498 방출을 방지하기 위해, 뜨거운 유기상을 차가운 폴록사머 188 용액으로 주입하였고 4℃에서 교반하였다. 그 결과, 고수율과 충분한 약물 로딩과 함께 MHY-SLN의 손쉬운 배합을 가져왔다. MHY-SLN의 물리화학적 특성은 하기 표 1에 나타내었다.
제제 Yield(%) DL(wt. %) EE(%) Size(nm) ZP(Mv) PDI
MHY-SLN 88.5±1.7 3.4±0.4 77.63±4.7 207.4±39 -29.8±1.2 0.269
*축약어(abbreviations): DL, drug loading; EE, encapsulation efficiency; MHY-SLNs, MHY498-loaded solid lipid nanoparticles; PDI, polydispersity index; ZP, zeta potential
크기는 SLN 폐쇄적 성질을 위한 중요한 매개 변수이다. 일반적으로 SLN 입자 크기는 피부 침투를 증진시키는 폐쇄적 성질을 지니는 크기인 400 nm 보다 작다. 도 1B를 참조하여 보면, 크기-분포 히스토그램에서, MHY-SLN은 400 nm 이하의 입자 크기로 제조된 것을 확인하였다. 도 1A를 참조하여 보면, 투과 전자 현미경 이미지에서도 MHY-SLN 입자 크기를 확인하였다. 제타 전위는 수성 콜로이드 분산(aqueous colloidal dispersion)의 안정성에 관련된 정보를 공급한다. 높은 제타 전위 값(>|30| mV)의 입자는 응집하는 경향이 감소한다. SLN은 표면에 네가티브 전하(negative charge)를 띤다. MHY-SLN은 -29.8 mV의 제타 전위를 보였고, SLN 매트릭스에 MHY498 로딩은 입자 안정성에 영향을 미치지 못하는 것을 확인하였다.
XRD 및 DSC은 SLN 매트릭스의 물리적 상태를 결정하기 위한 방법으로 널리 사용된다. XRD와 DSC 데이터는 약물이 입자 매트릭스에 로드되어 있는지 여부를 확인하는데 도움을 준다. 도 1은 MHY498, 콤프리톨 및 동결 건조된 MHY-SLN의 XRD 데이터이다. 각 샘플은 입사각의 넓은 범위에 걸쳐 스캐닝함으로써 XRD를 통해 식별될 수 있는 특유의 결정성 도메인(crystalline domains)을 가진다. MHY498의 XRD 패턴은 결정성을 나타내는 2θ=27.5°로 최대 피크 강도와 함께 여러 좁은 피크를 보였다. 콤프리톨은 2θ=21.18°로 최대 피크 강도와 함께 두 개의 날카로운 피크를 보였다. MHY-SLN 회절도(diffractogram)에서, 하나의 주요 피크는 2θ=21.29°로 콤프리톨 회절도와 겹쳐졌다. 또한, MHY498 특정 피크가 MHY-SLN 회절도에서 사라졌는데, 이는 SLN 매트릭스에서 비결정성 또는 분자적으로 분산 상태를 나타낸다. 결정성 정도는 피크 강도와 관련되어 있다. 날카로운 피크는 높은 결정성 입자 상태를 나타내는 반면에 좁은 피크는 낮은 결정성 입자 상태를 나타낸다. 콤프리톨과 비교하였을 때, MHY-SLN에서 피크 강도는 감소되었다. DSC는 엔탈피(enthalpies) 또는 녹는점(melting point)에 기초하여 샘플의 결정성을 측정한다. MHY498, 콤프리톨 및 동결 건조된 MHY-SLN의 온도 기록도(thermogram)는 도 1D에 나타내었다. MHY-SLN의 온도 기록도는 110℃에서 결정성 MHY498의 융해 피크(melting peak)를 나타내지 않았고 이는 MHY498이 SLN 매트릭스에서 비결정성 상태인 것을 의미한다. 본 발명에서는 MHY498 및 콤프리톨은 무수 에탄올에 용해되었고, 따라서 MHY498은 균일하게 지질에 분산된다. 이 결과는 비결정성 상태에서 SLN에서 약물이 나타내는 이전 보고서의 결과와 일치한다. 콤프리톨(79℃)의 녹는점은 MHY-SLN(76)에서 약하게 감소되었다. 이는 SLN이 β 형태인 것을 나타낸다. 녹는점 강하(depression)는 작은 입자 크기(nm 단위), 고 표면적 및 계면활성제(surfactant) 존재 때문일 수 있다.
실험예 2 : In vitro 방출 실험
In vitro 방출 실험은 입자 매트릭스로부터 약물 방출 거동을 결정하기 위해 수행되었다. 방출 패턴은 생체 내 설정에서 실시간으로 약물의 용량 및 치료를 결정하는 것을 돕는다.
도 2를 참조하여 보면, MHY-SLN는 두 개의 상(bi-phasic)의 방출 패턴을 보이는 것을 확인하였다. MHY498의 약 70%는 최초 6시간 내에 SLN 매트릭스로부터 방출되었고, MHY498의 이 초기 신속한 방출은 피부를 통한 침투를 증가시키는 중요한 역할을 하며 피부를 통한 약물의 확산은 농도 구배에 따라 증가한다. MHY498(> 90%)의 나머지는 MHY-SLN의 장기적 방출 특성을 가지면서 48시간에 걸쳐 방출되었다. 약물의 무정형(amorphous form)은 SLN 매트릭스로부터 장기적인 방출을 이끄는 느린 확산이 일어나게 한다. MHY-SLN의 XRD 및 DSC 데이터는 SLN 매트릭스에서 비결정성 상태를 설명한다. 두 개의 상의 방출 패턴은 피부 전달에서 중요할 수 있다. 초기 신속한 방출은 충분한 농도 구배를 제공함으로써 MHY498 피부 침투를 용이하게 한다. 반면에 지속적인 방출은 국소 농도를 유지하여 MHY498의 장기적인 항-멜라닌 생성 효과를 나타낸다.
실험예 3 : In vitro 피부 침투 실험
MHY-SLN의 피부 침투성을 MHY 용액과 비교하여 평가하였다. 에탄올과 프로필렌 글리콜(2:1 비율)은 MHY 용액에 사용되었다. 에탄올과 프로필렌 글리콜은 다양한 국소 투여 형태에서 피부 연화제, 용매 및 침투 촉진제로 널리 사용된다.
도 3은 MHY 용액 및 MHY-SLN의 피부 침투 패턴을 나타낸다. MHY-SLN은 MHY 용액보다 높은 피부 침투를 보였다. MHY 용액의 경우에는, 초기 피부 침투가 4시간이 걸렸다. 지체 시간은 피부 침투 연구에서 일반적인 현상이다. 에탄올 및 프로필렌 글리콜에 대한 유사한 지체 시간은 이전에도 보고되었다. 프로필렌 글리콜을 사용하는 것이 각질층을 탈수하여 피부 비틀림을 야기할 수 있다. 그러나, SLN 매트릭스로부터 MHY498 피부 침투는 30분 후에 시작되었고 48시간 후에 MHY 용액에서 관찰된 것보다 높은 전체 침투를 나타냈다.
플럭스(flux)는 단위 시간 당 단위 면적 당 피부를 가로 지르는 물질의 양을 측정함으로써 피부 침투성을 평가하는데 사용되는 또 다른 매개 변수이다. 서로 다른 시간(12시간, 24시간, 48시간) 간격에서 플럭스가 결정되고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2를 참조하여 보면, MHY-SLN은 MHY 용액보다 2배 더 높은 플럭스를 보였다.
MHY-SLN의 높은 피부 침투도는 용액 제제에는 존재하지 않는 SLN의 막 형성 능력을 발생시킬 수 있다. 막 형성은 경피 수분 손실을 방지하여 피부 수분을 발생시킨다. 도 7을 참조하여 보면, 단단히 배치된 각질층이 부어오르고, 각질 세포 패킹(packing)이 느슨해지면서 MHY498이 효과적으로 피부를 침투하는 것을 보여준다.
제제 Flux (J) 12 h
μg/h.cm2 		Flux (J) 24 h
μg/h.cm2 		Flux (J) 48 h
μg/h.cm2
MHY-SLN 5.7 ± 1.1 4.1 ± 0.4 3.28 ± 0.6
MHY-용액 1.7 ± 0.5 1.8 ± 0.3 1.8 ± 0.1
실험예 4 : In vivo MHY - SLN 평가
MHY-SLN의 in vivo 효능은 정성적 밝기와 정량적 밝기에 기초하여 평가되었다. C57BL/6 마우스 등의 피부에 UVB 방사선 조사하였다. UVB 방사선은 피부의 표피층을 투과할 수 있다. UVB 방사선(290-320 nm)은 피부의 멜라닌 세포에서 MSH 수용체(receptor)를 증가시켰고, 이는 UVB-유도 멜라닌 생성을 야기시킴으로써, 멜라닌 세포는 기저 표피층에 증가되고 축적되었다. 멜라닌 세포는 피부 침착(darkening) 및 색소 침착에 원인이 된다.
도 4A와 도 4B는 각각 정성적 및 정량적 피부 밝기 비교하여 나타낸 것이다. L 값은 피부의 밝기를 나타내는 지표로, 64-68의 L 값은 밝은 피부, 40-45의 L 값은 어두운 피부를 나타낸다. 초기 UV 방사 전, 피부 조직은 65 ± 2의 L 값을 가지는 밝기였다. UV가 방사되지 않은 정상군에서, 14일 동안 격일로 처리된 UV 방사는 피부를 어둡게 만들었고 L 값은 40 아래로 떨어졌다. MHY 용액군에서, 피부 밝기의 점진적인 감소가 관찰되었으나, 정상군보다는 밝은 피부 밝기를 보였다. 대조적으로, MHY-SLN군에서 피부 밝기는 14일 후에 거의 변동을 보이지 않았다. 상술한 바와 같이, MHY498은 속도-제한 효소(rate-limiting enzyme) 티로시나아제(tyrosinase)를 억제함으로써 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 방지한다. 그러므로, 멜라닌 과잉생산을 조절하여 정상 피부 밝기를 유지하는 것을 돕는다. 에탄올과 프로필렌 글리콜 또한 피부를 투과하는 능력을 가진다. 이들은 MHY 용액으로부터 MHY498 침투를 증가시킬 수 있으나 멜라닌 생성을 효과적으로 방지할 수 없다.
상기 결과는 조직학적 평가에 의해 확인되었다. 자외선 조사에 반응하여, 피부는 방사선의 효과를 중화하기 위해 멜라닌 세포로부터 멜라닌을 생성한다. 폰타나-메이슨 염색은 멜라닌을 검은색으로 염색하는 일반적인 조직학적 기법으로 표피에서 멜라닌 검출을 가능하게 한다. 도 5를 참조하여 보면, 멜라닌 양은 UV-정상군에서 가장 높고 이는 자외선 유도 멜라닌 생성의 증거를 제공한다. MHY 용액군에서는, 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하지 못하여 멜라닌 생성이 유의하게 증가하는 것이 관찰되었다. 그러나, MHY-SLN군에서는, 표피에서 거의 메라닌이 관찰되지 않았다. MHY-SLN은 자외선 유도 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하였다.
실험예 5 : In vitro 세포 독성 실험
국소 약물의 피부 독성은 큰 우려가 되고 있다. 모든 제제의 전반적인 성능은 독성 프로파일과 관련되어 있다. 따라서 MHY-SLN 세포 독성은 마우스 섬유아세포인 L929 세포주를 이용하여 평가되었고 MHY 용액과 비교하였다. L929 세포주는 생체 적합성 및 약물 세포 독성과 같은 다른 실험 셋팅에서도 일반적으로 사용된다.
도 6을 참조하여 보면, MHY-SLN은 400 μg MHY498/ml 농도까지 세포 독성을 보이지 않았고(세포 생존율 >90%), 따라서 200 μg MHY498/ml이 in vivo 실험에 사용되었다. SLN 제제에 사용된 지질은 비독성이며 생체 적합한 것으로 여겨진다. 잠재적 독성 문제는 안정화제(계면 활성제 및 공-계면 활성제) 때문에 고려될 필요가 있다. MHY 용액의 경우에는, 세포 생존율이 80% 미만으로 독성을 나타냈다. 빈 용액과 MHY 용액을 비교했을 때, 독성은 사용된 용액으로부터 부여되었을 수 있다. 에탄올과 프로필렌 글리콜은 피부의 지질 구조를 변경할 수 있고 피부 보호막을 손상시킬 수 있는 것으로 알려져 있으며, 독성을 지닐 수 있다. 또한, 사용된 용매 농도는 MHY498을 용해시키기 위해 요구되는 최소 농도였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

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  5. i) (Z)-5-(2,4-디하이드록시벤질리덴)티아졸리딘-2,4-디온(MHY498), 글리세릴 베헤네이트 및 포스파티딜콜린을 무수 에탄올에 용해하여 혼합 용액을 제조하는 단계;
    ii) 상기 i) 단계의 혼합 용액을 가열하여 유기상을 제조하는 단계;
    iii) 상기 ii) 단계의 유기상을 차가운 폴록사머 188 용액으로 주입한 후 교반시키는 단계; 및
    iv) 상기 iii) 단계 이후, 원심분리하여 고형 지질 나노입자를 획득하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 ii) 단계에서의 가열은 70 내지 90℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 iii) 단계에서의 차가운 폴록사머 188 용액에서 폴록사머 188은 0.3 내지 0.7%(w/v)를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 iii) 단계에서의 차가운 폴록사머 188 용액의 온도는 1 내지 10℃인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 iii) 단계에서의 교반은 800 내지 12000 rpm에서 3 내지 5시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  10. 제 5항에 있어서, 상기 iv) 단계 이후에, 동결 보호제를 부가하고 동결 건조하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  11. 제 5항에 있어서, 상기 고형 지질 나노입자의 크기는 100 내지 400 nm인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 고형 지질 나노입자의 제조방법.
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