KR101773601B1 - 세포 배양 방법, 세포 배양 장치, 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법, 및 계수용 장치 - Google Patents

Abstract

배양 용기 내에 있어서의 세포의 응집덩어리의 형성 제어, 응집덩어리의 분해 제어를 실시함으로써, 세포의 증식 효율을 보다 향상시킨다. 또한, 배양계를 개방하는 일 없이, 또한 세포 밀도에 관계없이, 배양 용기 내의 세포수를 계측하는 것을 가능하게 한다. 배양 용기에 외력을 가하여 배양 용기 내에 있어서의 세포의 응집덩어리의 형성 제어 및 응집덩어리의 분해 제어의 적어도 한쪽의 제어를 해서 세포의 배양을 한다. 배양 용기에의 외력의 부여는, 평평하게 둔 배양 용기의 상면으로부터 교반 부재를 소정의 압입량으로 채워 소정의 속도로 수평 방향으로 이동시키고, 배양 용기 내의 세포의 응집덩어리의 형성 및 분해의 적어도 한쪽을 제어한다. 또한, 밀봉된 용기 내의 액체중의 계수 대상물의 수를 계측하는 방법으로써, 용기의 적어도 일부의 두께를 조정하여, 조정한 범위의 적어도 일부를 측정 대상 범위로서 해당 측정 대상 범위에 있어서의 계수 대상물의 수를 계측한다.

Description

세포 배양 방법, 세포 배양 장치, 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법, 및 계수용 장치{CELL CULTURE METHOD, CELL CULTURE DEVICE,METHOD FOR COUNTING SUBJECT MATTERS TO BE COUNTED IN CONTAINER AND DEVICE FOR COUNTING}

본 발명은, 세포나 조직, 미생물 등의 세포를 배양하기 위한 세포 배양 방법, 세포 배양 장치, 및 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법, 계수용 장치에 관한 것이다.

근래, 의약품의 생산이나, 유전자 치료, 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에 있어서, 세포나 조직, 미생물 등을 인공적인 환경하에서 효율적으로 대량으로 배양하는 것이 요구되고 있다.

이와 같은 세포의 대량 배양으로, 특히 부유계 세포를 배양할 때는, 통상, 교반 날개를 갖춘 배양조를 이용한 교반배양이 일반적이다. 그러나, 특히 외력에 의한 대미지에 약한 세포나, 응집덩어리를 형성하면서 증식하는 세포의 경우, 교반 날개를 사용하지 않고, 세포를 배양 용기에 봉입하여, 정치(靜置) 하고(세포가 저면에 가라앉은 상태로) 배양을 하고, 세포의 증식에 따라 용기 저면적이 큰 것으로 바꾸기나, 용기의 수를 늘리는 방법이 넓게 사용되고 있다. 그러나 이 정치 배양에서는, 세포의 증식에 따라 세포의 응집덩어리가 커지면, 점차 각 세포에의 산소나 영양분의 공급이 부족해져서, 증식 효율이 저하된다고 하는 문제가 있었다.

또한 용기를 바꿀 때에, 일단 배양액은 교반 되어 산소나 영양분의 치우침은 해소되지만, 그때마다, 바꾸는 조작시에 생기는 세포에의 대미지에 의해서 증식 효율이 저하 되는 문제가 있었다.

한편, 배양 용기의 교반을 상시 실시하는 진탕 배양도 널리 행해지고 있다.

예를 들면, 특허 문헌 1에 기재된 세포 배양 장치에 의하면, 회전이나 진탕 등 다양한 패턴으로 배양 용기를 적재한 받침을 작동시킬 수 있어서 배양 용기 내의 배양액 교반이 가능하다.

또한, 특허 문헌 2나 특허 문헌 3에 기재된 세포 배양 장치는, 배양 용기 내의 액체 배지를 기포가 발생하지 않게 진탕하여, 세포가 손상하지 않게, 물결의 움직임에 의해 산소를 공급하는 구조로 되어 있다.

이와 같은 세포 배양 장치에 의한 진탕 방법으로는, 배지 전체가 격렬하게 교반되므로, 세포는 각기 따로따로 분리되며, 산소나 영양분은 전체에 확산되고, 각 세포에 충분한 공급이 가능하다.

또한, 이러한 세포 배양에 있어서는, 세포의 증식과 더불어, 배양액에 있어서의 세포의 밀도를 적정한 범위로 유지할 필요가 있다.

즉, 배양액에 있어서의 세포 밀도가 너무 크면 각 세포에 충분한 산소나 영양을 공급할 수 없게 되어, 세포 증식 효율이 저하한다. 또한, 배양액에 있어서의 세포 밀도가 너무 작아도 충분한 증식 효율을 얻을 수 없다.

그래서 세포 배양에 있어서는, 배양 중에 세포 밀도를 파악하기 위해서, 적당 한 배양 용기 내에 있어서의 배양액 중의 세포수를 계측할 필요가 있었다.

예를 들면, 특허 문헌 4에는, 세포의 증식에 맞추어 배양액에 있어서의 세포 밀도를 적정하게 유지할 수 있는 세포 배양 장치가 개시되어 있다.

이러한 세포 배양 장치를 사용해서 세포수의 계측을 하는 경우, 종래는 배양 용기 내에 이어지는 샘플링용 포트로부터 배양 세포가 포함되는 배양액을 채집해서, 소정의 완충액을 첨가하여 배양액에 있어서의 세포 측정에 적절한 밀도로 조정한 후, 계수반에 주입해서, 사람이나 기계에 의해서 그 수를 판독하여, 세포 밀도를 산출하고 있었다.

또한, 특허 문헌 5에는, 촬영 수단을 갖춘 배양 장치가 개시되어 있다. 이 배양 장치에 의하면, 세포 화상을 정기적으로 취득하고, 보존하는 것이 가능하게 되어 있다.

그러나 세포의 종류에 따라서는, 세포의 증식은, 세포가 뿔뿔이 흩어진 상태에서는 일어나기 어렵고, 개개의 세포가 접착하여, 적정한 사이즈의 응집덩어리를 형성했을 때에, 증식 효율이 향상되는 것이 있다. 구체적으로는 신경줄기세포나 배성(胚性)줄기세포, 간세포, 각막줄기세포, 췌장섬 세포 등의 접착 세포 외에, 혈구 세포 등의 부유 세포도 들 수 있다.

그러한 세포의 경우, 종래의 정치 배양에서는, 바꾸어 옮기는 타이밍마다, 배양 용기를 격렬하게 교반하기 때문에, 그때마다 세포는 뿔뿔이 흩어져서, 세포의 증식 효율이 저하된다는 문제가 있었다.

또한, 특허 문헌 1 내지 3에 기재된 세포 배양 장치 등에 의해서 진탕 배양을 하는 경우도, 마찬가지로 배지 전체가 격렬하게 교반되어 배지 속에 뿔뿔이 흩어져서 부유 하는 상태가 되므로, 세포는 적정한 사이즈의 응집덩어리가 되기 어렵고, 세포의 증식 효율을 최적화하는 것은 어렵다는 문제가 있었다.

또한, 특허 문헌 4에 기재된 세포 배양 장치를 사용해서 배양액 중의 세포를 계수하는 경우, 배양 용기 내로부터 배양액을 채집할 필요가 있어서, 배양계가 개방되므로, 잡균 등이 혼입되는 오염의 리스크가 있었다.

또한, 특허 문헌 5에 기재된 배양 장치에 의하면, 세포 화상을 취득할 수는 있지만, 그 화상에 따라 세포수를 정확하게 계측해서, 세포 밀도를 얻는 것은 곤란했다.

즉, 특허 문헌 5에 기재된 촬영 수단에 의해서 배양 용기 내의 세포를 촬영하는 경우, 세포 화상의 세포수를 계측하여, 이것을 해당 촬영 수단의 시야 내에 있어서의 배양액의 용적으로 나눔으로써, 세포 밀도를 산출할 수 있다.

그러나, 이와 같이 세포 용기 내의 세포를 직접 관찰하는 경우, 도 24에 도시하는 바와 같이, 세포의 밀도가 크고 세포가 서로 겹칠 때는, 세포수를 정확하게 계측할 수 없다. 또한, 세포의 밀도가 너무 작을 때는, 전체의 밀도 예측이 어렵고, 산출되는 세포 밀도의 정도(精度)가 낮아져 버리는 문제가 있었다.

이와 같이 촬영 수단을 사용해서 배양 용기 내의 세포를 직접 계측하는 경우, 종래의 계수반을 사용해서 실측하는 경우와 비교하면, 계수반의 두께가 통상 0.1 mm정도인데 대해서 배양 용기의 두께는 12 cm정도이며, 그 두께가 100 내지 200배가 되어 있다.

그래서, 촬영 수단에서 볼 수 있는 세포수는, 같은 체적 밀도라도 계수반을 이용해서 실측하는 경우의 100 내지 200배가 되어 버린다. 따라서, 배양 용기 내의 세포는 서로 겹치는 경우가 많고, 배양 용기 내의 세포를 직접 관측해서 세포수를 계측하는 것은, 곤란했다.

그래서, 본 발명자 등은 열심히 연구한 결과, 배양 용기의 두께를 조정하여, 촬영 수단에서 보이는 세포수를 계측 가능한 수로 한 후에, 배양 용기 내의 세포수를 직접 관측에 의해서 계측함으로써, 실측치에 가까운 세포 밀도를 얻는데 성공했다.

본 발명은, 상기 사정을 감안하여 이루어진 것으로, 배양 용기 내에 있어서의 세포의 응집덩어리의 형성 제어, 응집덩어리의 분해 제어를 함으로써, 응집덩어리를 적정한 사이즈로 조정해서, 세포의 증식 효율을 향상시키는 것이 가능한 세포 배양 장치, 및 세포 배양 방법의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은, 배양계를 개방하는 일 없이, 또한 증식한 세포의 밀도에 관계없이, 배양 환경하의 모든 밀도 범위에서 세포수를 계측하는 것이 가능한 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법, 및 계수용 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 세포의 배양 방법은, 배양 용기를 사용한 세포의 배양 방법이며, 배양 용기에 외력을 가함으로써, 배양 용기 내에 있어서의 세포의 응집덩어리의 형성 제어 및 응집덩어리의 분해 제어의 적어도 한쪽의 제어를 해서 세포의 배양을 하는 방법으로 되어있다.

또한, 본 발명의 세포 배양 장치는, 배양 용기를 사용해서 세포를 배양하는 세포 배양 장치이며, 배양 용기를 재치(載置)하는 적재대와 배양 용기를 소정의 압입량(押"책받침부수+入"量)으로 채우고, 소정의 속도로 수평 방향으로 이동 가능한 교반 부재를 갖추어 교반 부재를 이동시켜서 배양 용기에 외력을 가함으로써, 배양 용기 내의 세포의 응집덩어리의 형성 및 분해의 적어도 한쪽을 제어하는 구성으로 되어있다.

또한, 본 발명의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법은, 밀봉된 용기 내의 액체 중의 계수 대상물의 수를 계측하는 방법이며, 용기의 적어도 일부의 두께를 조정하고, 조정한 범위의 적어도 일부를 측정 대상 범위로서 해당 측정 대상 범위에 있어서의 계수 대상물의 수를 계측하는 방법으로 되어있다.

또한, 본 발명의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법은, 용기의 액체를 교반하고, 액체 중의 계수 대상물을 균등화한 후에, 용기의 적어도 일부의 두께를 조정하는 방법으로 되어있다.

또한, 본 발명의 계수용 장치는, 밀봉된 용기 내의 액체 중의 계수 대상물의 수를 계측하기 위한 계수용 장치이며, 용기를 적재하는 적재대와 용기에 있어서의 측정 대상 범위를 포함한 적어도 일부를 소정의 두께로 조정하는 조정 부재를 갖춘 구성으로 되어있다.

또한, 본 발명의 계수용 장치에, 조정 부재에 의해서 용기의 두께를 조정하기 전에, 용기 내의 액체를 교반하는 교반 부재를 갖춘 구성으로 할 수도 있다.

또한, 본 발명의 계수용 장치에, 용기 내의 계수 대상물을 촬영하는 촬영 수단과 촬영된 화상 내의 계수 대상물의 수를 계측하는 계수 수단과 계수 수단에 의한 계측의 결과, 계수 대상물의 수가 소정의 범위 내에 없는 경우, 화상내의 계수 대상물의 수가, 소정의 범위 내가 되도록, 조정 부재를 구동하여, 용기의 적어도 일부를 소정의 두께로 조정시키는 구동장치를 갖춘 구성으로 할 수도 있다.

본 발명에 의하면, 세포나 조직, 미생물 등의 세포 배양을 함에 있어서, 응집덩어리를 적정한 사이즈로 조정하고, 세포의 증식 효율향상이 가능해진다.

또한, 본 발명에 의하면, 배양계를 개방하지 않고, 증식한 세포의 밀도에 관계없이, 세포수 계측이 가능해진다.

도 1은 본 발명의 제1 실시 형태의 세포 배양 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명의 제1 실시 형태의 세포 배양 장치에 있어서의 구동장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명의 제1 실시 형태의 세포 배양 장치의 개략 측면도이다.
도 4는 본 발명에 있어서의 세포의 응집덩어리의 형성과 세포의 응집덩어리의 분해를 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명의 제2 실시 형태의 세포 배양 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명의 제3 실시 형태의 세포 배양 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 7은 본 발명의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법의 원리를 나타내는 도이다.
도 8은 본 발명의 제4 실시 형태의 계수용 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 9는 본 발명의 제4 실시 형태의 계수용 장치에 의한 용기의 두께 조정 방법(두께를 줄이는 경우)을 나타내는 도이다.
도 10은 본 발명의 제4 실시 형태의 계수용 장치에 의한 용기의 두께 조정 방법(두께를 늘리는 경우)을 나타내는 도이다.
도 11은 본 발명의 제 실시 형태의 계수용 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 12는 본 발명의 제6 실시 형태의 계수용 장치의 기본 위치를 나타내는 도이다.
도 13은 본 발명의 제6 실시 형태의 계수용 장치의 교반 상태를 나타내는 도이다.
도 14는 본 발명의 제6 실시 형태의 계수용 장치의 두께 조정 및 침전 대기 상태(두께를 감소시키는 경우)를 나타내는 도이다.
도 15는 본 발명의 제6 실시 형태의 계수용 장치의 현미경 관찰 상태를 나타내는 도이다.
도 16은 본 발명의 제6 실시 형태의 계수용 장치의 두께 조정 및 침전 대기 상태(두께를 증가시키는 경우)를 나타내는 도이다.
도 17은 본 발명의 제1 실시 형태의 세포 배양 장치를 사용해서 실시한 교반 조건의 종류를 나타내는 도이다.
도 18은 본 발명의 제1 실시 형태의 세포 배양 장치를 사용해서 실시한 각 교반 조건에 의한 세포 상태의 결과를 정리한 도이다.
도 19는 본 발명의 실시예 1 내지 5 및 비교예 1에서 사용한 배양 용기를 나타내는 도이다.
도 20은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 있어서의 세포의 화상을 나타내는 도이다.
도 21은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1의 결과를 나타내는 도이다.
도 22는 본 발명의 실시예 2 내지 5에 있어서의 세포의 화상을 나타내는 도이다.
도 23은 본 발명의 실시예 2 내지 5의 결과를 나타내는 도이다.
도 24는 종래의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법을 나타내는 도이다.

이하, 본 발명의 세포 배양 방법 및 세포 배양 장치의 바람직한 실시 형태에 대해서, 도면을 참조하면서 설명한다.

[제1 실시 형태]

도 1 내지 도 4를 참조하여, 본 발명의 제1 실시 형태에 대해서 설명한다. 도 1은, 본 실시 형태의 세포 배양 장치의 구성을 나타내는 도면이다. 도 2는, 본 실시 형태의 세포 배양 장치에 있어서의 구동장치의 구성을 나타내는 도면이다. 도 3은, 본 실시 형태의 세포 배양 장치의 개략 측면도이다. 도 4는, 본 발명에 있어서의 세포의 응집덩어리의 형성과 세포의 응집덩어리의 분해를 나타내는 도면이다.

[세포 배양 장치 (10)]

도 1에 도시하는 바와 같이, 본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10)는, 배양 용기 (11), 적재대 (13), 교반 부재 (14)를 갖추고 있고 배양 용기 (11)에 있어서의 수용부 (11-1)에는 배양액(배지)과 세포가 봉입(封入)되어 튜브 (12)가 접속되어 있다.

배양 용기 (11)는, 연포재(軟包材)를 재료로 주머니 모양(백형)으로 형성한 용기이다. 이와 같이, 배양 용기 (11)의 재료로 연포재를 사용함으로써, 배양 용기 (11)에 가요성(可撓性)유연성을 부여할 수 있다.연포재로서는, 예를 들면, 일본특허 공개공보 제2002-255277호 공보(연포재 필름 시트를 사용한 식품 포장체 및 식품의 꺼내기 방법)나, 일본특허 공개공보 제2004-323077호 공보(가압 추출형의 주머니 모양 용기)에 기재되어 있는 것 등을 사용할 수 있다.

또한, 배양 용기 (11)는, 세포 배양에 필요한 가스 투과성을 가지고 있으며 내용물을 확인할 수 있도록, 일부 또는 전부가 투명성을 가지고 있다. 이러한 조건을 충족시키는 배양 용기의 재료로서는, 예를 들면 폴리올레핀(polyolefin), 에틸렌 초산비닐 공중합체, 스틸렌계 일래스터머(elastomer), 폴리에스텔계 열가소성 일래스터머, 실리콘계 열가소성 일래스터머, 실리콘 고무 등을 들 수 있다.

튜브 (12)는, 배양 용기 (11)내의 배양액 및 세포를 외부로부터 주입, 또는, 외부로 회수하기 위한 것이며, 배양 용기 (11)의 사방 각변은 밀봉되어 있지만, 적어도 2개 이상의 튜브 (12)가 접속되어 있다. 이 중 1개는 배양 세포나 배지를 외부로부터 배양 용기 (11)에 주입하기 위한 주입용, 다른 1개는 배양 세포나 배지를 배양 용기 (11)로부터 회수하기 위한 회수용이다. 또한, 도 1에 도시하는 바와 같이, 튜브 (12)가 3개 장착되어 있을 때는, 3개째는, 배양 세포나 배지를 샘플로서 배양 용기 (11)로부터 꺼내기 위한 샘플링용으로서 사용할 수 있다.

이 튜브 (12)의 재질로서는, 적당히 사용 환경에 맞추어 선택하면 된다. 예를 들면, 실리콘 고무, 연질 염화 비닐 수지, 폴리 부타디엔 수지, 에틸렌 초산비닐 공중합체, 염소화 폴리에틸렌 수지, 폴리우레탄계 열가소성 일래스터머, 폴리에스텔계 열가소성 일래스터머, 실리콘계 열가소성 일래스터머, 스틸렌계 일래스터머, 예를 들면, SBS(스틸렌부타디엔스틸렌), SIS(스틸렌이소프렌스틸렌), SEBS(스틸렌에틸렌부틸렌스틸렌), SEPS(스틸렌에틸렌프로필렌스틸렌), 폴리올레핀 수지, 불소계 수지 등을 사용할 수 있다.

적재대 (13)는, 그 상면에 배양 용기 (11)가 재치되고 다시 그 배양 용기 (11) 상면에 교반 부재 (14)가 배설(配設)되는 평면의 받침대이다.

이 적재대 (13)의 상면 중, 배양 용기 (11)가 재치되는 부분의 네 귀퉁이에는 고정부재 (13-1)가 입설(立設)되어 있다. 한편, 배양 용기 (11)의 네 귀퉁이에는, 고정부재 (13-1)가 계입(係入)하는 구멍 (11-2)이 천설 (穿設)되어 있다.

고정부재 (13-1)의 각각의 배양 용기 (11)의 각 구멍 (11-2)을 통과시킴으로써, 배양 용기 (11)를 적재대 (13) 상면에 정치시킬 수 있다. 또한, 교반 부재 (14)의 이동에 따라 배양 용기 (11)가 어긋나는 것을 막을 수 있다.

또한 고정부재는, 상기 부재에 한정할 필요는 없고, 배양 용기 (11)가 어긋나는 것을 막는 기구를 가지는 것이면 여러 가지 것을 사용할 수 있다.

교반 부재 (14)는, 배양 용기 (11)에 외력을 가함으로써, 배양 용기 (11)내에 있어서의 세포의 응집덩어리의 형성과 세포의 응집덩어리의 분해를 제어한다.

본 실시 형태의 세포 배양 방법에서는, 도 3에 도시하는 바와 같이, 교반 부재 (14)에 의해서 배양 용기 (11)를 소정의 압입량(押"책받침부수+入"量)으로 채우면서(소정의 양으로 누르면서), 이 교반 부재 (14)를 적재대 (13)와 평행으로 소정의 속도로 이동시킨다. 이 이동은, 소정의 사이클로 반복해서 실행된다. 이 교반 부재 (14)로서는, 예를 들면 롤러를 사용할 수 있다.

이와 같이, 본 실시 형태에 의하면, 교반 부재 (14)를 사용함으로써 배양 용기에 외력을 가하여 배양 용기 (11)내의 교반을 미세조정할 수 있고 세포의 응집덩어리의 형성에 적절한 교반을 하는 것 및 세포의 응집덩어리의 분해에 적절한 교반을 하는 것이 가능하게 되어 있다.

지지대 (15)는, 도 1에 도시하는 바와 같이, 적재대 (13)의 양측에 한 곳씩 윗쪽으로 향해서 입설(立設)한, 교반 부재 (14)의 양단을 회전 가능하게 지지하는 베어링부와 이들 베어링부를 연결하는 연결부에 의해서 형성되어 있다.

이 지지대 (15)는, 도 2에 도시하는 바와 같이, 연결부 밑에 장착한 로드형 전동 실린더 (17)(수직 방향 동작용 액츄에이터)에 의해서 상하로 이동시킬 수 있고 지지대 (15)에 장착된 교반부재 (14)에 의한 배양 용기 (11)에 대한 압입량을 0.1밀리 단위로 섬세하게 조정하는 것이 가능하다.

또한, 로드형 전동 실린더 (17)는, 슬라이더형 전동 실린더 (21)(수평 방향 동작용 액츄에이터) 상의 이동대 (16)에 장착되어있고 적재대 (13)에 대해서 수평 방향으로 이동한다. 또한, 이동대 (16)의 수평 방향에의 이동 속도를 컨트롤 함으로써, 지지대 (15)에 장착된 교반 부재 (14)의 이동 속도를 조정한다.

본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10)에 있어서의 구동장치는, 지지대 (15), 이동대 (16), 로드형 전동 실린더 (17), 슬라이더형 전동 실린더 (21) 등에 의해서 구성되어 있다.

이와 같이, 본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10)에 의하면, 로드형 전동 실린더 (17) 및 슬라이더형 전동 실린더 (21)를 사용하여, 교반 부재 (14)에 의한 배양 용기 (11)에 대한 압입량이나 교반 부재 (14)의 이동 속도를 조정할 수 있고 이로써 배양 용기 (11)내의 배양액의 교반을 제어하여, 세포의 응집덩어리의 사이즈를 최적으로 조정이 가능하다.

또한 교반부재의 동작 제어에는, 로드형 전동 실린더 (17)나 슬라이더형 전동 실린더 (21)와 같은 전동 액츄에이터로 바꾸어, 공기압이나 유압, 전자력을 이용한 액츄에이터를 사용하거나 모터나 캠을 사용한 구성으로 하거나 할 수도 있다.

<세포의 응집덩어리의 형성>

여기서, 도 4에 도시하는 바와 같이, 세포 배양에 있어서는, 세포의 종류에 따라 배양에 적절한 세포의 응집덩어리의 사이즈가 있다.

즉, 배양 세포에는, 단체에서의 분열 속도는 낮고, 서로 접착해서 일정한 응집덩어리를 형성해서 비로서 충분한 분열을 개시 하는 성질이 있다.

통상의 정치 배양에 있어서, 배양 초기의 세포 밀도가 낮은 상태에서는, 확산에 의해서 세포가 접착하며 점차 응집덩어리를 형성하지만, 그 속도는 비교적 느리다.

그래서 종래는, 배양 초기에는 예를 들면 웰 플레이트를 사용해서 강제적으로 세포를 한 곳에 고밀도로 모음으로써 세포가 접착하기 쉽게 하거나 소용량의 용기를 사용해서 세포가 증식 하는데 따라서 보다 큰 용기를 사용하거나 함으로써, 세포 밀도의 저하를 방지하면서 배양하고 있었다.

이에 대해, 본 실시 형태에서는, 교반함으로써 배양 용기 (11)내의 저면에 떠도는 세포를 적극적으로 움직여서, 세포끼리 접착하는 확률을 높여서 적정한 사이즈의 응집덩어리를 보다 빠르게 형성 가능하게 하고 있다.

이로써, 본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10)를 사용한 세포 배양 방법에 의하면, 세포 배양의 개시시에 있어서, 세포가 뿔뿔이 흩어진 상태 시에, 세포가 접촉해서 적절한 사이즈의 응집덩어리가 형성되는 것을 촉진할 수 있고 세포 증식 효율을 향상시키는 것이 가능해지고 있다.

또한, 이러한 세포의 응집덩어리의 형성 제어는, 배양의 초기(파종시)에 한정되는 것이 아니고, 예를 들면 세포의 배양중에 배양 용기 (11)에 대해서 과잉 외력을 가한 결과, 응집덩어리가 붕괴해서, 세포가 뿔뿔이 흩어진 경우 등에서도 매우 적합하게 실시할 수 있어서 세포 증식 효율 향상이 가능해지고 있다.

<세포의 응집덩어리의 분해>

한편, 세포의 응집덩어리가 너무 커지면 , 응집덩어리의 내부가 산소 부족또는 영양 부족이 되어, 증식 효율은 저하한다.

그래서, 응집덩어리가 거대화했을 때는, 배양액에 강한 흐름(난류)을 일으켜서 응집덩어리를 분해시키는 것이 바람직하다.

본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10)를 사용한 배양 방법에 의하면, 응집덩어리가 거대화 되었을 때는, 교반 부재 (14)의 압입량과 이동 속도를 조정함으로써, 배양액에 강한 흐름을 일으킬 수 있도록 교반을 제어하고, 응집덩어리를 적절한 사이즈로 분해하는 것이 가능해지고 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10) 및 이것을 사용한 세포 배양 방법에 의하면, 교반 부재 (14)에 의해서 배양 용기 (11)를 소정의 압입량으로 채우면서, 이 교반 부재 (14)를 적재대 (13)와 평행으로 소정의 속도로 이동시킬 수 있고 배양 용기에 가하는 외력의 힘을 적절히 제어할 수 있다.

그러므로, 배양 용기 (11)내에 있어서의 교반을 미조정하여 세포의 응집덩어리 형성에 적절한 교반을 할 수 있는 동시에, 세포가 각각 뿔뿔이 흩어지지 않도록 응집덩어리를 분해할 수도 있고 세포의 응집덩어리를 증식에 적합한 사이즈로 조정이 가능하다.

[제2 실시 형태]

다음에, 본 발명의 제2 실시 형태에 대해서, 도 5를 참조하여 설명한다. 이 도면은, 본 실시 형태의 세포 배양 장치의 구성을 나타내는 도면이다.

본 실시 형태는, 배양 용기 (11)를 칸막이부재를 사용해서 배양부와 확장 가능부로 분할해서, 배지 용적을 세포의 증식에 맞추어 적절한 크기로 조정 가능한 세포 배양 장치 (10)에서 , 배양부를 교반 부재(교반롤러) (14)에 의해서 교반 가능하게 한 점에서 제1 실시 형태와 다르다. 또한, 본 실시 형태에서는, 배양 용기 (11)의 양단을 클램프 부재 (23)로 고정하고 있다. 그 외의 점에 대해서는, 제1 실시 형태와 같다.

즉, 도 5에 도시하는 바와 같이, 본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10)는, 배양 용기 (11)를 칸막이롤러(칸막이부재) (22)를 사용해서 분할하고, 배양액과 세포를 봉입하는 배양부와 칸막이롤러 (22)를 이동하여 배양부의 용적을 확장시키기 위한 확장 가능부를 설정하고 있다. 이 칸막이롤러 (22)는, 교반 부재(교반롤러) (14)와 평행으로 설치되어 적재대 (13)와 평행으로 이동할 수 있도록 되어 있다.

이와 같은 칸막이롤러 (22)를 사용함으로써, 배양부의 용적을 연속적으로 변화시킬 수 있고 세포 증식에 따라 칸막이롤러 (22)를 이동시켜서, 배양부의 용적을 늘림으로써, 세포 밀도를 적정한 범위내로 유지가 가능해졌다.

이 도면의 예에서는, 두 개의 칸막이롤러 (22)를 사용해서 배양 용기 (11)를 상하 방향에서 끼워 넣어 구분하는 구성으로 되어있으나, 이것에 한정되는 것이 아니고, 하나의 칸막이롤러 (22)에 의해서 배양 용기 (11)를 윗쪽으로부터 적재대 (13)에 대해서 누름으로써, 배양 용기 (11)를 배양부와 확장 가능부로 구분하는 구성으로 하는 것도 가능하다.

또한 이러한 칸막이부재를 사용해서 배양 용적을 제어하고, 배양 효율을 향상시키는 기술에 대해서는, 본 출원인에 의한 국제 공개 제2008/136371호 팜플렛 및 국제 공개 제2008/136339호 팜플렛에 상세하게 기재되어 있다.

본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10)및 이것을 사용한 세포 배양 방법에 의하면, 칸막이롤러 (22)를 사용하여, 배양 용적의 크기를, 높은 세포 증식 효율을 얻을 수 있도록 제어할 수 있고 또한, 배양부에 있어서의 세포의 응집덩어리의 사이즈를, 높은 세포 증식 효율을 얻을 수 있도록 조정할 수 있다.

그래서, 세포의 증식 효율을 더욱 향상시키는 것이 가능해졌다.

[제3 실시 형태]

다음에, 본 발명의 제3 실시 형태에 대해서, 도 6을 참조하여 설명한다. 이 도면은, 본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10)의 구성을 나타내는 도면이다.

본 실시 형태는, 배양 용기 (11)내의 세포를 촬영하여 응집덩어리의 사이즈가 소정 범위내인지 여부를 자동 판정하여, 이 판정 결과에 따라 응집덩어리를 적절한 사이즈로 조정하는 점에서 제1 실시 형태와 다르다. 그 외의 점에 대해서는, 제1 실시 형태와 같다.

즉, 본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10)는, 도 6에 도시하는 바와 같이, 제1 실시 형태의 구성에 더하여 촬영 장치 (30)와 제어장치 (40)를 갖추고 있다.

촬영 장치 (30)는, 제어장치 (40)로부터 촬영의 지시 정보를 수신하면, 배양 용기 (11)내의 세포를 촬영하고, 얻어진 화상을 제어장치 (40)에 송신한다. 촬영 장치 (30)에 의한 촬영의 지시 정보는 소정의 타이밍으로 제어장치 (40)로부터 자동적으로 송신할 수 있다.

이 촬영 장치 (30)로서는, 예를 들면 위상차 현미경의 경통(鏡筒)에 CCD 카메라를 장착하여 사용할 수 있다.

제어장치 (40)는, 세포 배양 장치 (10)에 있어서의 교반 부재 (14)를 이동시키기 위한 구동장치와 촬영 장치 (30)를 제어하는 정보처리 장치이다. 도 6에 도시하는 바와 같이, 제어장치 (40)는, 촬영 장치 제어부 (41), 응집덩어리 사이즈 판정부 (42), 및 구동장치 제어부 (43)를 갖추고 있다.

촬영 장치 제어부 (41)는, 소정의 타이밍으로, 촬영 장치 (30)에 대해서 촬영을 하기 위한 지시 정보를 송신해서, 촬영 장치 (30)로부터 촬영된 화상을 수신한다.

응집덩어리 사이즈 판정부 (42)는, 촬영 장치 제어부 (41)에 화상이 수신되면, 이 화상 정보에 있어서의 세포의 응집덩어리의 사이즈가, 소정의 범위내인지 아닌지를 판정한다. 이 소정의 범위로서는, 예를 들면 100μm ~ 600μm로 할 수 있다. 이 응집덩어리의 사이즈로서는, 촬영된 응집덩어리의 평균치 등을 이용할 수 있다.

그리고, 판정의 결과, 세포의 응집덩어리의 사이즈가, 소정 범위보다 작은 경우 또는 큰 경우에, 그 판정 결과를 구동장치 제어부 (43)에 출력한다.

구동장치 제어부 (43)는, 응집덩어리 사이즈 판정부 (42)로부터 입력한 판정 결과에 따라, 교반 부재 (14)의 압입량, 이동 속도, 및 이동시키는 사이클을 결정하고, 이러한 구동 조건에 따라서 로드형 전동 실린더 (17), 및 슬라이더형 전동 실린더 (21)를 제어한다.

이로써, 세포의 응집덩어리의 사이즈가, 소정 범위보다 작은 경우는, 배양 용기 (11)내의 세포의 응집덩어리를 적절한 사이즈까지 형성하고, 세포의 응집덩어리의 사이즈가, 소정 범위보다 큰 경우는, 이것을 적절한 사이즈까지 분해하여, 증식에 최적인 사이즈로 조정할 수 있다.

또한 이러한 처리를 실시하기 위해서, 제어장치 (40) 또는 구동장치 제어부 (43)에, 다양한 응집덩어리의 사이즈와 각각의 경우에 적절한 교반 부재 (14)의 압입량, 이동 속도, 및 이동시키는 사이클을 대응하게 하여 기억하는 테이블 등을 보유시키는 것이 바람직하다.

이상 설명한 바와 같이, 본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10) 및 이것을 사용한 세포 배양 방법에 의하면, 배양 용기 (11)의 응집덩어리의 사이즈를 자동적으로 조정할 수 있고 안정적으로 세포 증식 효율을 향상시키는 것이 가능해진다.

다음에, 본 발명의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법의 원리에 대해서, 도 7을 참조하여 설명한다.

이 도면은, 현미경을 사용해서 배양 용기 내의 세포를 직접 관찰하고, 그 수를 계측하는 모습을 나타낸 것이며, 도 7(A)은, 종래와 같이, 용기의 두께를 조절하지 않고, 관측하는 경우를 나타내고 있다. 또한 배양액으로서 그 비중이 세포의 비중보다 작은 것을 사용함으로써, 세포를 용기 바닥에 가라앉혀 현미경 관찰에 적절한 것으로 할 수 있다. 또한 반대로 비중이 큰 배양액을 사용해서 세포를 용기 상부에 모아 관찰하도록 해도 된다.

도 7(A)의 경우, 용기 내의 세포수가 증가함에 따라, 현탁하여 정치시켰을 때에, 점차 겹쳐짐이 생긴다. 따라서, 이 방법으로는 세포를 대량으로 배양하는 경우에, 세포수를 정확하게 계측할 수 없다.

그래서 본 발명에서는, 세포수가 너무 많아서 정확하게 계측할 수 없는 경우에는, 도 7(B)에 도시하는 바와 같이, 용기의 두께를 감소시킴으로써, 관측 범위(측정 대상 범위)에 있어서의 세포수를 감소시켜서, 계측에 적절한 세포수로 조정한다.

이로써, 배양 용기에 의해서 세포를 대량으로 배양하는 경우라도, 배양 용기 내의 세포를 직접 관찰함으로써, 배양계를 개방하는 일 없이, 세포수를 계측하는 것이 가능해졌다.

또한, 배양 용기 내의 세포수가 적고, 배양 용기 전체의 밀도 예측이 어려운 경우에도, 용기의 두께를 증대시킴으로써, 관측 범위 내에 있어서의 세포수를 증가시켜서, 계측에 적합한 세포수로 조정할 수 있다.

[제4 실시 형태]

다음에, 본 발명의 제4 실시 형태의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법, 및 계수용 장치에 대해서, 도 8을 참조하여 설명한다. 이 도면은, 본 실시 형태의 계수용 장치의 구성을 나타내는 도면이다.

본 실시 형태의 계수용 장치 (50)는, 동 도에 도시하는 바와 같이, 두께 조정 부재 (51), 적재대 (13), 촬영 수단 (52), 구동장치 (53), 구동장치 (54), 및 조명 (55)을 갖추고 있고 적재대 (13)상에 배양 용기 (11)를 배치하고, 배양 용기 (11)내의 배양 세포수를 계측한다.

두께 조정 부재 (51)는, 적재대 (13)상의 배양 용기 (11)의 두께를 조절한다. 이 도면의 예에서는, 두께 조정 부재 (51)는 배양 용기 (11)를 압압(押壓)하기 위한 평면 부분을 가지는 압압판으로 이루어지고, 연포재로 이루어진 배양 용기 (11)의 일부를 위로부터 압압 함으로써, 그 두께를 감소시키는 것이 가능하다.

또한, 두께 조정 부재 (51)에 있어서의 적어도 배양 용기 (11)의 측정 대상 범위의 윗쪽 부분은 투명한 재료로 이루어지고, 해당 부분을 조명 (55)에 의해서 윗쪽으로부터 비추어, 현미경 및 CCD 카메라로 이루어진 촬영 수단 (52)에 의해서 하부로부터 관찰하도록 되어 있다.

도한 두께 조정 부재 (51)는, 도 8에 나타내는 평면 부분에 의해서 배양 용기 (11)를 압압 하는 압압판으로 한정되는 것이 아니고, 롤러나 인장 부재를 사용해서 구성할 수도 있다.

예를 들면 롤러에 의해서 배양 용기 (11)를 상하 양쪽으로부터 죄면서 이동시켜서, 배양 용기 (11)의 수평면적을 감소시킴으로써, 배양 용기 (11)의 두께를 증가시킬 수 있다. 반대로, 배양 용기 (11)의 수평면적을 증가시킴으로써, 배양 용기 (11)의 두께를 감소시킬 수도 있다. 또한, 인장 부재를 사용해서 배양 용기 (11)를 수평 방향으로 잡아늘림으로써, 배양 용기 (11)의 두께를 감소시킬 수도 있다.

적재대 (13)는, 배양 용기 (11)를 재치시키기 위한 평면의 받침대이며, 두께 조정 부재 (51)과 함께, 계수용 적재 장치를 구성한다.

이 적재대 (13)에 있어서의 측정 대상 범위의 하부 부분은, 유리판 (56) 등의 투명한 부재에 의해서 구성되어 촬영 수단 (52)에 의해서 하부로부터 배양 용기 (11)를 관측할 수 있게 되어 있다.

구동장치 (53)는, 도 8에 도시하는 바와 같이, 볼 나사에 의해서, 두께 조정 부재 (51)를 상하로 이동시키는 것이다. 이로써 적재대 (13)상의 배양 용기 (11)에 두께 조정 부재 (51)를 대고, 배양 용기 (11)의 두께를 조절 가능하게 하고 있다.

이 구동장치 (53)에는, 예를 들면 로드형 전동 실린더(수직 방향 동작용 액츄에이터)를 사용할 수 있고 이로써, 배양 용기 (11)의 두께를 0.01밀리 단위로 섬세하게 조정이 가능하다.

또한, 구동장치 (54)는, 도 8에 도시하는 바와 같이, 볼 스크류 나사에 의해서, 촬영 수단 (52)을 적재대 (13)에 대해서 수평 방향으로 이동하는 것이다. 이 구동장치 (54)에 의해서, 배양 용기 (11)내에 있어서의 세포의 촬영시 외에는, 촬영 수단 (52)을 적재대 (13)의 외측에 배치하고, 촬영시에 촬영 수단 (52)을 배양 용기 (11)의 측정 대상 범위 아래로 이동시킬 수 있다.

또한 구동장치 (53)이나 구동장치 (54)를, 전동 액츄에이터 외에, 공기압이나 유압, 전자력을 이용한 액츄에이터를 사용해서 구성하거나 또는 모터나 캠을 사용해서 구성할 수도 있다.

조명 (55)은, 두께 조정 부재 (51)를 통해서 배양 용기 (11)에 있어서의 측정 대상 범위를 비추고, 촬영 수단 (52)에 의한 세포의 촬영에 필요한 밝기를 제공한다. 또한, 이 때 조정한 배양액의 두께에 따라 빛의 투과량이 다르고, 촬영한 화상에 명암차가 생기므로, 배양액의 두께에 따라, 광량의 조정을 하는 것이 바람직하다.

배양 용기 (11)는, 제1 실시 형태와 같은 것을 사용할 수 있다.

다음에, 본 실시 형태의 계수용 장치에 의한 배양 용기 (11)의 두께 조정의 예에 대해서, 도 9 및 도 10을 참조해서 설명한다. 도 9는 용기의 두께를 줄이는 경우를 나타내는 것이며, 도 10은 용기의 두께를 늘리는 경우를 나타내는 것이다.

배양 용기 (11)의 두께를 줄이는 경우, 용기의 두께 조정은, 도 8에 나타내는 것 외에, 예를 들면, 도 9의 (a)에 도시하는 바와 같이, 두께 조정 부재 (51)를 배양 용기 (11)의 하부로부터 압압 함으로써 실시할 수 있다. 또한 도시하지 않았으나, 이 때 배양 용기 (11)의 상면의 위치를 유리판 등에 의해서 고정하는 것이 바람직하다.

또한, 배양 용기 (11)가 수평으로 늘릴 수 있는 재료로 이루어진 경우에는, 도 9 (b)에 도시하는 바와 같이, 배양 용기 (11)의 전체면을 덮을 수 있는 두께 조정 부재 (51)를 사용해서 배양 용기 (11)를 압압 해서, 배양 용기 (11)의 두께를 감소시킬 수도 있다. 또한, 도 9의 (c)에 도시하는 바와 같이, 두께 조정 부재 (51)에 의해서 배양 용기 (11)를 늘려서, 그 두께를 감소시킬 수도 있다. 이 경우, 배양 용기 (11)의 가장자리 일단을 고정하는 동시에, 수평 방향 반대측의 가장자리를 인장 부재로 이루어진 두께 조정 부재 (51)에 의해서 끌어당기는 구성으로 하거나 또는 2개의 두께 조정 부재 (51)를 사용하여, 배양 용기 (11)의 수평 방향 양단을 당김으로써, 배양 용기 (11)를 늘리는 구성으로 할 수도 있다. 이러한 유연한 배양 용기 (11)의 재료로서는, 예를 들면 실리콘 고무 등을 사용할 수 있다.

또한, 도 9 (d)에 도시하는 바와 같이, 두께 조정 부재 (51)로서 롤러 등을 사용해서, 이것을 이동시킴으로써, 배양 용기 (11)의 수평면적을 증가시키고, 배양 용기 (11)의 두께를 감소시킬 수도 있다.

한편, 배양 용기 (11)의 두께를 늘리는 경우는, 예를 들면, 도 10 (e)에 도시하는 바와 같이, 배양 용기 (11)의 상면의 일부를 두께 조정 부재 (51)에 의해서 압압 하고, 배양 용기 (11)에 있어서의 압압한 부분 이외의 두께를 증가시키도록 할 수 있다.

또한, 도 10 (f)에 도시하는 바와 같이, 두께 조정 부재 (51)로써 롤러 등을 사용해서, 이것을 이동시킴으로써, 배양 용기 (11)의 수평면적을 감소시키고, 배양 용기 (11)의 두께를 증가시킬 수도 있다.

다음에, 본 실시 형태의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법에 대해서, 도 8을 참조하여 보다 상세하게 설명한다.

우선, 배양 용기 (11)내의 세포수를 계측하는 공정에 앞서, 배양 용기 (11)내의 배양액을 교반하는 것이 바람직하다. 또한 배양액의 교반 수단에 대해서는, 제 실시 형태에 있어서, 상세하게 설명한다.

다음에, 구동장치 (54)를 사용하여, 촬영 수단 (52)을 배양 용기 (11)의 측정 대상 범위아래로 이동시킨다.

다음에, 구동장치 (53)를 사용하여, 두께 조정 부재 (51)를 강하시켜서, 배양 용기 (11)의 두께를 소정의 두께로 조정한다.

이 때, 소정의 두께는, 세포의 종류, 배양 용기의 사이즈, 측정 대상 범위의 면적, 및 배양 기간 등에 따라 다양한 값을 취할 수 있다.

다음에, 조명 (55)에 의해서 측정 대상 범위를 비추고, 촬영 수단 (52)에 의해서 촬영한다. 그리고, 촬영한 화상상의 세포를 계수한다. 이때, 촬영 수단 (52)으로부터 계수 수단에 촬영한 화상을 송신시키고, 이 계수 수단에 의해서 자동적으로 세포수를 계측할 수 있다. 이러한 계수 수단으로서는, 공지의 세포 계수 분석 장치나 세포수 계측 장치 등을 이용할 수 있다.

여기서, 본 실시 형태에서는, 배양액으로서 비중이 배양 세포보다 작은 것을 사용함으로써, 배양 세포를 배양 용기 (11)의 바닥에 침전시켜서, 촬영 수단의 초점을 침전된 세포에 맞춤으로써 이것들을 촬영할 수 있다. 그러나, 세포 밀도가 크고, 측정 대상 범위에 있어서의 세포가 서로 겹치는 경우는, 세포수를 올바르게 계수할 수 없다.

그래서, 본 실시 형태의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법에서는, 이와 같이 측정 대상 범위에 있어서의 세포가 서로 겹치는 경우는, 두께 조정 부재 (51)를 이동시켜서 배양 용기 (11)의 두께를 감소하고, 계측 대상의 세포수를 줄임으로써, 세포를 계측 가능하게 하고 있다.

또한 측정 대상 범위에서 서로 겹치는 일 없이 관측할 수 있는 최대 세포수는, 대체로 측정 대상 범위의 면적을 배양 세포의 평균 수평면적으로 나눈 수 미만이라고 생각할 수 있다. 그래서, 세포를 계수 한 결과, 세포수가 해당 최대 세포수 이상으로 산출되어 있는 경우는, 배양 용기 (11)의 두께를 더욱 감소시켜서, 재차 계수를 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 세포를 측정 대상 범위에 조밀하게 늘어놓았을 경우의 수를 보다 정확하게 추정해서, 그 추정치를 최대 세포 수로써 사용하는 등, 그 외의 값을 배양 용기 (11)의 두께 조정을 할지 말지의 판단에 이용할 수도 있다.

또한, 세포를 계수 한 결과, 세포수가 일정치 미만인 경우는, 얻을 수 있는 세포 밀도의 정밀도가 낮아지므로, 배양 용기 (11)의 두께를 증가시킨 후에, 재차 계수를 하는 것이 바람직하다. 이러한 배양 용기 (11)의 두께를 증가시키는 계측용 장치에 대해서는, 제6 실시 형태에서 상세하게 설명한다.

이와 같이 하여 측정 대상 범위 내에 있어서의 세포수가 계측되면, 이 세포수를 측정 대상 범위의 용적으로 나눔으로써, 세포 밀도를 산출할 수 있다. 또한 얻어진 세포 밀도를 배양 용기 (11)의 용적으로 곱셈함으로써, 배양 용기 (11) 전체의 세포수를 산출할 수 있다.

이러한 세포 밀도 및 배양 용기 (11) 전체의 세포수도, 계수 수단에 의해 서 자동적으로 산출시킬 수 있다.

이와 같이, 본 실시 형태에 의하면, 배양 용기 (11)내의 세포수가 많고, 배양 용기 (11)를 그대로 직접 관측했을 경우에는, 세포수를 정확하게 계측할 수 없는 경우라도, 배양 용기의 두께를 감소시킴으로써, 세포수를 계측할 수 있고 배양 용기 (11)내의 세포 밀도를 산출하는 것이 가능해졌다.

[제5 실시 형태]

다음에, 본 발명의 제 실시 형태의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법, 및 계수용 장치에 대해서, 도 11 및 도 2를 참조해서 설명한다. 도 11은, 본 실시 형태의 계수용 장치의 구성을 나타내는 도면이다. 도 2는, 제1 실시 형태의 세포 배양 장치에 있어서의 구동장치(교반부재용)의 구성을 나타내는 도면이며, 본 실시 형태에서도 같은 것을 이용할 수 있다.

본 실시 형태의 계수용 장치는, 제4 실시 형태의 계수용 장치의 구성에 더하여, 교반 부재를 갖추고 있다. 본 실시 형태에서는, 이 교반 부재를 사용해서 배양 용기 (11)내의 배양액을 교반함으로써, 세포를 관측하기 쉽게 분산할 수 있도록 되어 있다. 그 외의 점은, 제4 실시 형태와 같은 것으로 할 수 있다.

교반 부재 (14)는, 배양 용기 (11)에 대고 이동함으로써, 배양 용기 (11)내에 있어서의 배양액을 교반하고, 배양액 중의 배양 세포를 분산시키는 것이다. 이 교반 부재 (14)로서는, 예를 들면 도 11에 도시하는 바와 같이 롤러를 사용할 수 있다.

이 도면의 예에서는, 교반 부재 (14)에 의해서 배양 용기 (11)을 소정의 압입량으로 채우면서, 이 교반 부재 (14)를 적재대 (13)와 평행으로 소정의 속도 및 소정의 사이클로 반복 이동시킴으로써, 배양액을 교반하는 구성으로 되어 있다.

지지대 (15)는, 도 11에 도시하는 바와 같이, 적재대 (13)의 양측에 한 곳씩 윗쪽으로 향해서 입설한, 교반 부재 (14)의 양단을 회전 가능하게 지지하는 베어링부와 이들 베어링부를 연결하는 연결부에 의해서 형성되어 있다.

또한, 이 지지대 (15)는, 도 2에 도시하는 바와 같이, 연결부 밑에 장착한 로드형 전동 실린더 (17)(수직 방향 동작용 액츄에이터)에 의해서 상하로 이동시킬 수 있어서 지지대 (15)에 장착된 교반 부재 (14)에 의한 배양 용기 (11)에 대한 압입량을 0.1밀리 단위로 섬세하게 조정이 가능하다.

또한, 로드형 전동 실린더 (17)는, 슬라이더형 전동 실린더 (21)(수평 방향 동작용 액츄에이터) 상의 이동대 (16)에 장착되어 있고 적재대 (13)에 대해서 수평 방향으로 이동한다. 또한, 이동대 (16)의 수평 방향으로 이동 속도를 컨트롤 함으로써, 지지대 (15)에 장착된 교반 부재 (14)의 이동 속도를 조정한다.

또한 교반부재 14의 동작 제어에는, 로드형 전동 실린더 (17)나 슬라이더형 전동 실린더 (21)와 같은 전동 액츄에이터로 바꾸어, 공기압이나 유압, 전자력을 이용한 액츄에이터를 사용하거나 모터나 캠을 사용한 구성으로 할 수도 있다.

본 실시 형태의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법, 및 계수용 장치에 의하면, 배양 용기 (11)내의 세포수를 계측함에 앞서, 교반 부재 (14)를 배양 용기 (11)에 소정의 압입량으로 채운 상태에서, 교반 부재 (14)를 수평 방향으로 일정시간 왕복 운동을 하게 할 수 있다.

이로써, 배양 용기 (11)내의 배양액을 교반할 수 있고 배양 용기 (11)내에 있어서의 배양 세포를 계수하기 쉽게 분산시키는 것이 가능해진다.

[제6 실시 형태]

다음에, 본 발명의 제6 실시 형태의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법, 및 계수용 장치에 대해서, 도 12 내지 도 16을 참조해서 설명한다. 이들 도면은 각각, 본 실시 형태의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법에 있어서의 계수용 장치의 기본 위치(도 12), 교반 상태(도 13), 두께 조정 및 침전 대기 상태(계수하는 세포를 줄이고 싶은 경우, 도 14), 현미경 관찰 상태(도 15), 두께 조정 및 침전 대기 상태(계수 하는 세포를 늘리고 싶은 경우, 도 16)를 나타내는 모식도이다.

본 실시 형태의 계수용 장치는, 제 실시 형태의 계수용 장치의 구성에 더해서, 더욱 배양 용기 (11)의 두께를 증가시키기 위한 두께 조정 부재를 갖추고 있다. 그 외의 점은, 제 실시 형태와 같은 것으로 할 수 있다.

이하, 본 실시 형태의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법에 있어서의 계수용 장치의 동작 순서에 대해서, 배양 용기 (11)의 두께를 증가시키는 동작 및 감소시키는 동작을 포함해서 설명한다.

(1) 기본 위치

먼저, 도 12를 참조하여, 본 실시 형태의 계수용 장치의 구성요소의 기본 위치에 대해서 설명한다.

이 도면에 있어서, 적재대 (13)에는 현미경 관찰용 관측구멍이 형성되어 이 관측구멍의 상부에 적재대 (13)의 상면의 일부를 구성하는 유리판 (56)이 끼워져 있다.

배양 용기 (11)는 적재대 (13)상에 배치되고 이 적재대 (13)의 관측구멍의 윗쪽에 두께 조정 부재 (51-1)(압압판)이 배치되어 있다. 이 두께 조정 부재 (51-1)를 하부로 이동시켜서, 배양 용기 (11)를 압압 하여, 그 두께를 감소시키도록 되어 있다.

또한, 배양 용기 (11)의 가장자리 일단에는 두께 조정 부재 (51-2)(롤러)가 배치되어 이것을 이동시킴으로써, 배양 용기 (11)의 수평면적을 감소시켜서, 두께를 증가시키는 것이 가능하게 되어 있다.

또한 배양 용기 (11)의 윗쪽에는 교반 부재 (14)(롤러)가 배치되고 이 교반 부재 (14)를 하부로 이동시켜서 배양 용기 (11)에 댄 상태로, 수평 방향으로 이동시킴으로써, 배양 용기 (11)내의 배양액을 교반하는 것이 가능하게 되어 있다.

또한, 기본 위치에서는, 세포를 촬영하기 위한 촬영 수단 (52)을 구성하는 현미경 (52-1)으로 CCD 카메라 (52-2), 및 조명 (55)은, 적재대 (13)의 외측에 배치되어 있다.

(2) 교반 상태

다음에, 도 13을 참조하여, 용기 내의 계수 대상물의 수의 계수를 실시하기에 앞서, 배양 용기 (11)내의 배양액을 교반하는 순서에 대해서 설명한다.

우선, 도 12의 기본 위치로부터 교반 부재 (14)를 하부로 이동시키고, 배양 용기 (11)을 소정의 압입량으로 채운다. 다음에, 이 교반 부재 (14)를 적재대 (13)와 평행으로, 소정의 속도 및 소정의 사이클로 반복해서 이동시킨다.

이로써, 배양 용기 (11)내의 배양액을 교반해서, 배양액 중의 세포를 균등화하는 것이 가능해진다.

(3) 두께 조정 및 침전 대기 상태(두께를 감소시키는 경우)

다음에, 도 14를 참조하여, 배양 용기 (11)의 두께를 감소시켜서, 계수하는 세포를 줄이는 순서에 대해서 설명한다.

우선, 교반 부재 (14)를 윗쪽으로 이동시켜서 도 12의 기본 위치로 되돌려서, 두께 조정 부재 (51-1)를 하부로 이동시키고, 배양 용기의 두께를 감소시킨다. 이 때, 두께 조정 부재 (51-1)에 의해서, 적재대 (13)의 관측공상의 영역을 포함한 배양 용기 (11)의 일부를 압압 해서, 배양 용기 (11)의 측정 대상 범위의 두께를 소정의 사이즈로 조정한다. 이때, 배양 환경하에 있어서, 배양 용기 (11)의 두께가 작을수록, 계수하는 세포를 줄일 수 있다.

배양 용기 (11)의 두께를 감소시킨 후, 배양 용기 (11)내의 세포가 침전 할 때까지 정치시킨다.

(4) 현미경 관찰 상태

다음에, 도 15를 참조하여, 세포 계수를 하는 순서에 대해서 설명한다.

배양 용기 (11)의 두께를 감소시킨 상태에서, 배양 용기 (11)내의 세포가 침전 한 후, 도 15에 도시하는 바와 같이, 현미경 (52-1)과 CCD 카메라 (52-2)로 이루어지는 촬영 수단 (52), 및 조명 (55)을 도 12의 기본 위치에서 수평 방향으로 이동시키고, 촬영 수단 (52)를 관측구멍의 바로 밑에, 조명 (55)을 관측구멍의 윗쪽에 배치시킨다. 그리고, CCD 카메라 (52-2)에 의해서 배양 용기 (11)내에 침전 되어 있는 세포를 촬영한다.

이와 같이 해서 얻은 화상을 도시하지 않은 계수 장치에 입력하고, 이 계수 장치에 의해서 화상 내에 있어서의 세포수를 측정하고, 얻은 세포수를, 측정 대상 범위(CCD 카메라 (52-2)에 의해서 관측된 배양 용기 (11)에 있어서의 영역)의 용적으로 나눔으로써, 배양 용기 (11)내의 세포 밀도를 산출할 수 있다.

이로써, 배양 용기 (11)내의 세포가 증식하고, 그대로의 두께로 침전시키면, 처짐이 생겨서 정확하게 계수할 수 없는 경우라도, 배양 용기 (11)의 두께를 조정함으로써 계수 가능하게 할 수 있고 배양 용기 (11)내의 세포 밀도를, 배양계를 개방하는 일 없이, 산출이 가능해진다.

(5) 두께 조정 및 침전 대기 상태(두께를 증가시키는 경우)

한편, 배양의 초기 단계 등에 있어서는, 세포수가 적기 때문에, 계수는 할 수 있지만, 얻을 수 있는 세포 밀도의 정밀도가 낮아지는 경우가 있다.

이 때문에, 관측되는 세포수가 적은 경우는, 도 16에 도시하는 바와 같이, 배양 용기 (11)의 두께를 증가시켜서, 측정 대상 범위에 있어서의 세포수를 늘리고 나서, (4)에서 설명한 현미경을 관찰한다.

즉, (2)의 교반후, 교반 부재 (14)를 윗쪽으로 이동시켜서 도 12의 기본 위치로 되돌려서, 롤러로 이루어진 두께 조정 부재 (51-2)를 측정 대상 범위 방향으로 이동시켜서 배양 용기 (11)를 압압 하여, 배양 용기 (11)의 두께를 증가시킨다. 이때, 배양 용기 (11)에 있어서의 측정 대상 범위의 두께를 일정하게 하기 위해서, 두께 조정 부재 (51-1)를 측정 대상 범위상에 배양 용기 (11)의 상면에 접촉시키는 위치로 이동한다. 그리고, 배양 용기 (11)내의 세포가 침전할 때까지 정치시킨다.

이로써, 측정 대상 범위 내의 세포수를 증가시킬 수 있고 배양 용기 (11)내의 세포수가 적은 경우에, 보다 정확하게 세포 밀도를 산출하는 것이 가능하게 된다.

배양 용기 (11)내의 세포수가 적은 경우의 구체적인 세포수는, 세포의 종류나 측정 대상 범위의 면적 등에 따라 적당하게 결정되지만, 예를 들면 0 또는 10 미만의 수로 할 수 있다.

또한 상술한(1) ~ (5)의 순서에 따라서, 배양 용기 (11)의 두께를 조절한 후에, 측정 대상 범위 내의 세포에 겹쳐짐이 보이거나, 또는, 세포가 보이지 않거나 또는 거의 볼 수 없는 경우는, 재차(1) ~ (5)의 순서에 따라서, 배양 용기 (11)의 두께를 조절하여, 세포수의 계수를 한다.

이와 같이, 본 실시 형태에 의하면, 배양 용기 (11)내의 세포수가 적고, 배양 용기 (11)를 그대로 직접 관측하면, 정확한 세포 밀도를 얻을 수 없을 가능성이 있는 경우, 배양 용기의 두께를 증가시킴으로써, 배양 용기 (11)내의 세포 밀도를 보다 정확하게 산출할 수 있다.

실시예

다음에, 제1 실시 형태의 세포 배양 장치 (10)를 사용하여 세포 배양을 한 실시예에 대해서 설명한다. 우선, 도 17 및 도 18을 참조하여, 각종 배양 조건과 각각의 경우의 교반 정도에 대해서 설명한다. 도 17은, 본 실시 형태의 세포 배양 장치 (10)를 사용해서 실시한 교반 조건의 종류를 나타내는 도면이며, 도 18은, 각 교반 조건에 의한 세포 상태의 결과를 정리한 도면이다.

본 발명의 배양 방법에서는, 도 17에 도시하는 바와 같이, 교반 부재 (14)를 사용해서 배양 용기 (11)를 윗쪽으로부터 대고 이 교반 부재 (14)를 적재대 (13)에 대해서 평행으로 이동시킴으로써, 배양 용기 (11)내의 배지를 교반한다.

이 교반 부재 (14)를 배양 용기 (11)에 댈 때의 압입량은, 다양한 값을 취할 수 있지만, 예를 들면 이 도면에 도시하는 바와 같이, 배양 용기 (11)의 두께가 10.5 mm인 경우에는, 2 mm, 4 mm, 6 mm, 8 mm 등의 값을 취할 수 있다.

그리고, 각 압입량에 따라, 교반 부재 (14)의 이동 속도를 각각 조정함으로써 배양 용기 (11)내의 배양액의 교반을, 세포의 응집덩어리의 형성에 적절한 것, 또는, 세포의 응집덩어리의 분해에 적절한 것으로 제어한다.

교반 부재 (14)의 이동 속도로서는, 예를 들면 같은 도면에 도시하는 바와 같이, 2.5mm/s, 12.5mm/s, 50 mm/s등의 값을 취할 수 있다.

또한 교반 부재 (14)의 직경은, 특히 한정되지 않지만, 교반을 정확하게 제어하기 위해서, 배양 용기 (11)의 두께에 대해서, 0.5배 내지 3.0배로 하는 것이 바람직하다.

도 18은, 상기와 같은 교반 조건으로 교반을 했을 경우에, 배양 용기 (11)내의 배양액이, 각각 어느 정도 교반 되었는지를 나타내고 있다.

이 도면에 도시하는 바와 같이, 압입량이 2 mm로 이동 속도가 2.5mm/s, 12.5mm/s 일 때, 및 압입량이 4 mm로 이동 속도가 2.5mm/s 일 때는, 배양 용기 (11)내의 세포는 모두 가라앉은 채였다.

본 명세서에 있어서, 이와 같은 교반을 '약교반'이라고 부른다. 이와 같은 '약교반'의 교반을 실시함으로써, 세포의 응집덩어리의 형성을 촉진하는 것이 가능해진다.

또한, 도 18에 있어서, 압입량이 2 mm이고 이동 속도가 50 mm/s 일 때, 압입량이 4 mm이고 이동 속도가 12.5mm/s, 50 mm/s 일 때, 압입량이 6 mm이고 이동 속도가 2.5mm/s, 12.5mm/s 일 때, 및 압입량이 8 mm이고 이동 속도가 2.5mm/s 일 때는, 배양 용기 (11)내의 배양액은 어느 정도 교반되어 있지만, 세포는 거의 가라앉은 채였다. 또한 압입량이 6 mm이고 이동 속도가 50 mm/s 일 때, 및 압입량이 8 mm이고 이동 속도가 12.5mm/s 일 때는, 배양 용기 (11)내의 배양액은 어느 정도 교반되어 있어서 세포는 거의 떠오르고 있었다.

이와 같은 세포가 거의 가라앉은 채로의 상태와 거의 떠오르는 상태와의 경계 부근의 교반 조건에 있어서의 교반을 본 명세서에서, 중교반이라고 부른다. 이러한 중교반의 교반을 함으로써, 세포의 응집덩어리를 과도하게 분해하는 일 없이, 적절한 사이즈로 조정하는 것이 가능해진다.

한편, 도 18에 있어서, 압입량이 8 mm이며 이동 속도가 50 mm/s 일 때는, 배양 용기 (11)내의 배양액은 격렬하게 교반되어 세포는 모두 떠오르고 있었다. 이러한 세포가 모두 떠오르는 교반을 본 명세서에 있어서, '강교반'이라고 부른다. 이러한 '강교반'에서는, 세포의 응집덩어리는 개개의 세포로 뿔뿔이 분해되어 버려서, 강교반을 반복함으로써 세포는 현탁상태가 되지만, 세포는 뿔뿔이 흩어진 상태가 되면 증식 효율은 오히려 저하되어 버린다.

종래의 세포 배양에 있어서의 교반에서는, 통상 배양 용기가 격렬하게 교반되는 결과, 강교반에 해당하는 교반을 하고 있어서 증식 효율의 저하를 초래 하는 문제가 있었으나, 본 발명에 의해서 이러한 문제를 해소하는 것이 가능해졌다.

다음에, 본 발명의 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법, 및 계수용 장치에 의해서, 배양 용기 (11)의 두께를 조절해서 세포수를 계측한 실시예, 및 배양 용기 (11)의 두께를 조절하지 않고 세포수를 계측한 비교예에 대해서 설명한다.

(실시예 1)

배양 용기 (11)로서 LDPE(직쇄형상 저밀도 폴리에틸렌)제, 필름두께 0.15 mm의 백을 사용하였다. 배양 용기 (11)는, 도 19에 도시하는 바와 같이, 칸막이 부재(고무 롤러)로 구분함으로써, 배양을 하는 영역인 배양부의 장변을 250 mm, 단변을 210 mm로 하고, 해당 배양부에 배양액 640 ml를 넣어 사용하였다. 또한 이 때의 배양 용기 (11)를 평평하게 놓았을 때의 용기 두께는, 용기 상면이 완전한 수평면이 되지 않지만, 대략 16 mm였다. 관찰 범위(측정 대상 범위)의 수평면의 사이즈는 한 변이 0.5 mm의 정방형이다.

배양액으로서 세포 과학 연구소의 AlyS505N-0 배지를 사용하는 동시에, 배양 세포로서 사람 백혈병 T림프종의 JurkatE6.1주를 세포 배양용 디쉬에서 필요량을 증식 시킨 것을 사용하였다.

교반 부재 (14)로서 직경 12 mm의 롤러를 사용하고, 압입량 13 mm, 속도 50 mm/s, 왕복 회수 10회의 교반 조건에 의해 교반을 하였다.

교반 직후에, 폭 50 mm, 두께 3 mm, 길이는 배양 용기 (11)의 장변보다 큰 아크릴판으로 이루어진 두께 조정 부재를 강하하여, 백의 두께를 3.1 mm로 조정하였다. 그리고, 12분간 정치 한 후, 관측 범위를 촬영하여, 세포수의 계수를 하였다. 또한, 이 세포수와 관측 범위의 용적에 따라 세포 밀도를 산출하였다. 촬영한 사진을 도 20에, 관측 범위내 세포수, 세포 밀도, 실측 밀도, 및 실측치비를 도 21에 나타낸다.

또한 실측 밀도는, 종래의 방법에 의해서 계수반(원 셀 카운터(원 셀社 제품))을 사용하고, 백으로부터 회수한 배양액중의 세포수를 계측하고, 이것을 관측 범위의 용적으로 나누어서 얻었다.

(비교예 1)

실시예 1과 동일한 배양 용기 (11)및 배양액을 사용하여, 동일한 교반 조건으로 교반을 하였다.

다음에, 백의 두께를 조절하는 일 없이, 60분간 정치 한 후, 관측 범위를 촬영하였다. 백의 상면은 압압을 하지 않았기 때문에 물결모양의 요철이 생기고 백의 두께는 대략 16 mm였다.

이 경우, 세포과 겹쳐짐이 보이고 세포수의 계수를 하지 못하고, 밀도의 산출도 할 수 없었다. 그 결과를 도 20, 도 21에 나타낸다.

(실시예 2)

실시예 1과는 세포 밀도가 다른 배양액을 사용하는 동시에, 세포수의 계측에 있어서, 백의 두께를 11.0 mm로 하고, 그 후의 정치 시간을 45분간으로 한 점 이외는, 실시예 1과 같게 하여, 실험을 하였다. 배양액과 배양 세포의 종류는, 실시예 1과 같지만, 본 실시예에서는 실시예 1과 비교해서 배양 세포수가 적은 것을 사용했다. 그 결과를 도 22 및 도 23에 나타낸다.

(실시예 3)

세포수의 계측에 있어서, 백의 두께를 7.0 mm로 하고, 그 후의 정치 시간을 30분간으로 한 점 이외는, 실시예 2와 같게 하여, 실험을 하였다. 그 결과를 도 22및 도 23에 나타낸다.

(실시예 4)

세포수의 계측에 있어서, 백의 두께를 4.0 mm로 하고, 그 후의 정치 시간을 12분간으로 한 점 이외는, 실시예 2와 같게 하여, 실험을 하였다. 그 결과를 도 22 및 도 23에 나타낸다.

(실시예 5)

세포수의 계측에 있어서, 백의 두께를 3.1 mm로 하고, 그 후의 정치 시간을 12분간으로 한 점 이외는, 실시예 2와 같게 하여, 실험을 하였다. 그 결과를 도 22 및 도 23에 나타낸다.

도 20 및 도 21에 나타내는 바와 같이, 백의 두께를 조정하지 않은 비교예 1에서는, 세포가 서로 겹쳐져 있어서 정확하게 계수할 수 없었다. 또한 계수 불가능이란, 실제로 계산할 수 없는 경우 외에, 계수 결과가 소정치(관측 범위 내에서 눈으로 볼 수 있는 최대 세포수) 이상의 경우로 할 수 있다.

이에 대해서, 실시예 1에서는, 백의 두께를 감소시킴으로써, 세포수를 계측할 수 있고 배양 용기 (11)내에 있어서의 세포 밀도를 산출하는 것이 가능했다.

또한, 도 22 및 도 23에 나타내는 바와 같이, 실시예 2 ~ 5에서는, 백의 두께를 감소시킴에 따라, 계측된 세포수가 적어진 것을 알 수 있다. 또한, 산출된 세포의 밀도는, 모두 실측 밀도와 비교해서 크게 다른 것은 아니었다.

따라서, 세포수가 많고, 그 계수를 할 수 없는 경우, 세포 밀도가 클수록, 백의 두께를 더욱 크게 감소시킴으로써, 세포를 계측 가능하게 할 수 있는 것을 알았다.

이러한 실험 결과로부터, 본 발명의 계수용 장치를 사용한 용기 내의 계수 대상물의 계수 방법에 의하면, 배양계(培養係)를 개방하는 일 없이, 또한 세포 밀도에 관계없이, 배양 용기 내의 세포수를 계측할 수 있어서 세포 밀도를 산출할 수 있는 것이 분명해졌다.

본 발명은, 이상의 실시 형태로 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 범위 내에서, 다양한 변경 실시가 가능하다는 것은 말할 필요도 없다.

예를 들면, 배양 용기 (11)를 코너 부분이 생기지 않도록 모퉁이를 둥근 형상으로 하거나 교반 부재 (14)를 원기둥형상이 아니고, 도 17에 나타내는 단면을 별모양 등의 다양한 형상으로 구성하여, 다양한 교반 효과를 얻을 수 있도록 하는 등 적당히 변경하는 것이 가능하다.

또한, 상기 실시 형태 및 실시예에서는, 배양 세포를 계측 대상으로 하고 있으나, 이것으로 한정되는 것이 아니고, 예를 들면 플랑크톤 등 기타의 유기체, 또는 무기물을 계측 대상으로 하는 것도 가능하다. 배양 용기 내의 액체에는, 배양액등의 액체 외에, 반유동체도 포함된다. 또한, 배양 용기 (11)내의 배양액으로서 배양 세포의 비중보다 큰 것을 사용함으로써, 배양 세포를 배양 용기 (11)내의 상부에 위치시킬 수 있고 이것을 계수 하도록 해도 된다. 또한, 상기 실시 형태 및 실시예에 있어서 세포를 계수 할 뿐만 아니라, 세포의 생육 상태 등을 관찰할 수도 있다.

본 발명은, 대량의 세포를 배양할 필요가 있는 바이오 의약이나 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에 있어서, 적합하게 이용이 가능하다.

Claims (12)

1. 밀봉된 배양용기 내의 배양액 중의 세포의 수를 계측하는 방법이며, 상기 배양용기의 적어도 일부의 두께를 조정한 후에 해당 두께가 조정된 범위의 적어도 일부를 측정 대상 범위로서 해당 측정 대상 범위를 촬영하고, 얻어진 화상 중의 상기 세포의 수를 계측하는 것에 의해서 상기 두께가 조정된 측정 대상 범위에 있어서의 세포의 수를 계측하는 것을 특징으로 하는 배양용기 내의 세포의 계수 방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 배양용기 내의 배양액을 교반해서 상기 배양액 중의 상기 세포를 균등화한 후에, 상기 배양용기의 적어도 일부의 두께를 조정하는 것을 특징으로 하는 배양용기 내의 세포의 계수 방법.
   
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 계측된 상기 세포의 수를 사용하여 상기 배양액 중의 세포의 밀도를 산출하고, 상기 배양액 전체에 있어서의 세포의 수를 산출하는 것을 특징으로 하는 배양용기 내의 세포의 계수 방법.
   
4. 삭제
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 측정 대상 범위에 있어서의 상기 세포가 서로 겹치는 일 없이 관측할 수 있는 최대 세포수보다 큰 경우 상기 배양용기의 적어도 일부의 두께를 감소시킨 후, 상기 세포의 수를 계측하는 것을 특징으로 하는 배양용기 내의 세포의 계수 방법.
   
6. 제 5항에 있어서, 두께 조정 부재를 이용하여, 상기 배양용기를 압압(押壓) 또는 상기 배양용기를 늘려서 상기 배양용기의 적어도 일부의 두께를 감소시키는 것을 특징으로 하는 배양용기 내의 세포의 계수 방법.
   
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 측정 대상 범위에 있어서의 상기 세포의 수가 0이상 10미만인 경우 상기 배양용기의 적어도 일부의 두께를 증가시킨 후, 상기 세포의 수를 계측하는 것을 특징으로 하는 배양용기 내의 세포의 계수 방법.
   
8. 제 7항에 있어서, 두께 조정 부재를 사용하여, 상기 배양용기를 압압(押壓)하고, 상기 배양용기의 적어도 일부의 두께를 증가시키는 것을 특징으로 하는 배양용기 내의 세포의 계수 방법.
   
9. 삭제
10. 밀봉된 배양용기 내의 배양액 중의 세포의 수를 계측하기 위한 계수용 장치이며,
    상기 배양용기를 적재하는 적재대와;
    상기 배양용기에 있어서의 측정 대상 범위를 포함한 적어도 일부의 두께로 조정하는 조정 부재와;
    상기 배양용기 내의 상기 세포를 촬영하는 촬영 수단과;
    촬영된 화상내의 상기 세포의 수를 계측하는 계수 수단과;
    상기 계수 수단에 의한 계측의 결과, 상기 측정대상범위에서 상기 세포가 서로 겹치는 일 없이 관측할 수 있는 최대 세포수보다 큰 경우 상기 배양용기의 적어도 일부의 두께를 감소시키도록 상기 조정부재를 구동하거나, 또는 상기 세포의 수가 0 이상 10 미만인 경우 상기 배양용기의 적어도 일부의 두께를 증가시키도록 상기 조정 부재를 구동하는 구동장치;
    를 갖춘 것을 특징으로 하는 계수용 장치.
    
11. 제 10항에 있어서, 상기 조정 부재에 의해서 상기 배양용기의 두께를 조정하기 전에 상기 배양용기 내의 배양액을 교반하는 교반 부재를 갖춘 것을 특징으로 하는 계수용 장치.
    
12. 삭제

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