JP2016116482A

JP2016116482A - 細胞数計測装置

Info

Publication number: JP2016116482A
Application number: JP2014258237A
Authority: JP
Inventors: 岩田　博夫; Hiroo Iwata; 博夫岩田; 周平小長谷; Shuhei Konagaya; 健安藤; Takeshi Ando; 敏明山内; Toshiaki Yamauchi; 徳啓柴田; Noritaka Shibata
Original assignee: Panasonic Corp
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2016-06-30

Abstract

【課題】従来の細胞計測装置においては、ビニルのような軟らかい材料で出来たバック型培養容器に対して厚さ調整部材を押し付けることで細胞の浮遊をなくし、細胞数計測を行っているため、実用的な待ち時間で精度良く細胞懸濁液内の細胞数を計測することが困難であった。【解決手段】培養容器内に一般的規定量より少量の懸濁液を培養容器に播種し、培養容器を揺動させる駆動装置による特定の動きで、少量の懸濁液を培養容器全体に均一に均すことで、浮遊している細胞が短時間で培養容器底部に均一に落下させ、短時間で細胞数を計測する。【選択図】図１

Description

本発明は、培養容器の細胞懸濁液内の細胞数を計測する細胞数計測装置に関する。

従来、撮影画像から培養容器の底面における細胞の数を計測して、ばらつき状態を判別した後、細胞を均一に分散するように攪拌する装置が考案されている（例えば、特許文献１参照）。

また、少量の培地を培養容器内に均すために、円運動などの揺動運動を行う分注装置も考案されている（例えば、特許文献２参照）。

特開２０１０−９９０１１号公報特開平１１−２６６８５５号公報

しかしながら、特許文献１における装置においては、通常の細胞培養に必要な量の培地が入った培養容器を用いるため、播種後の浮遊する細胞が培養容器の底面に沈殿するまでに時間がかかる。そのため、細胞数計測を開始するまでに待ち時間が必要な場合があり、迅速な細胞数計測をすることができない可能性がある。

また、特許文献２における分注装置においては、細胞懸濁液といった培地に加えて細胞などの質量密度が異なる物質が混ざっている状態では、細胞を均一に均すことができない場合がある。

そこで、本発明は、実用的な待ち時間で精度良く細胞懸濁液内の細胞数を計測することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明における細胞数計測装置は、培養容器と、前記培養容器を揺動させる駆動装置と、前記培養容器内の計測対象物を撮影する撮影装置と、前記撮影装置で撮影された画像内の計測対象物の数を計測する計測手段と、から構成され、２ｍｌ以上かつ４ｍｌ以下の細胞懸濁液を前記培養容器である１０ｃｍシャーレに播種し、前記駆動装置により前記培養容器を揺動させることで前記細胞懸濁液を前記培養容器に均して前記細胞懸濁液内の細胞を前記培養容器の底部に落下させ、前記計測手段で細胞の数の計測を行うことを特徴とする。

以上のように、本発明によれば、実用的な時間で細胞懸濁液内の細胞数の計測を実現することができる。

本実施の形態１における細胞数計測装置の概要図本実施の形態１における細胞数計測のフローチャート本実施の形態１における細胞数計測の観察画像を示す図

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、同じ構成要素には同じ符号を付しており、説明を省略する場合もある。また、図面は、理解しやすくするためにそれぞれの構成要素を主体として、模式的に示している。

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１における細胞数計測装置１００の概要図である。

本実施の形態１の細胞数計測装置１００は、図１に示すように、所定量の細胞懸濁液１１０が入ったディッシュやプレートなどの培養容器１１１と、培養容器１１１を乗せる積載台１１２と、培養容器１１１を揺動させる揺動装置１１３と、制御装置１１４と、培養容器１１１内の計測対象物を撮影する撮影装置１１５と、撮影装置１１５を移動させる駆動装置１１６と、撮影された画像内の計測対象物の数を計測する細胞数計測手段１１７と、細胞種や培養容器などの条件を入力する条件入力部１１８と、から構成される。制御装置１１４は、揺動装置１１３の揺動量や揺動周波数を制御するとともに、撮影装置１１５の撮影や駆動装置１１６の動作、細胞数計測手段１１７での計測などの各動作を制御する。ここで、詳しくは後述するが、本発明における細胞懸濁液の所定量とは、細胞懸濁液の一般的な規定量より少量である。また、細胞懸濁液の一般的な規定量とは、培養容器１１１として１０ｃｍシャーレを用いる場合、１０ｍｌである。

制御装置１１４は、条件入力部１１８で入力された条件により、揺動装置１１３などの動作を変化させる。たとえば、揺動装置１１３の揺動量や揺動周波数は、条件入力部１１８に入力される細胞種類の情報と培養容器１１１の大きさおよび材質により変化する。また、駆動装置１１６の撮影位置は、条件入力部１１８に入力された培養容器１１１の種類により変化し、細胞数計測手段１１７の画像処理のパラメータ（細胞径の最大値や最小値など）は、細胞種類により変化する。

本発明は、培養容器１１１であるシャーレ内に播種する細胞懸濁液の量を、一般的な規定量より少量（具体的には１０ｃｍシャーレの場合に２〜４ｍｌ、特に３ｍｌ）としていることを特徴とする。この１０ｃｍシャーレの場合に２〜４ｍｌ、特に３ｍｌという量は、発明者らが、ヒトｉＰＳ細胞を用いて細胞懸濁液の容量や揺動装置１１３の揺動周波数および揺動回数の条件を変えて試行錯誤的実験に行うことで見出した量である。すなわち、発明者らは、１０ｃｍシャーレの場合に３ｍｌの細胞懸濁液の量が、ヒトｉＰＳ細胞に特に有効であることを確認している。なお、本発明における１０ｃｍシャーレとは、直径１０ｃｍ（１００ｍｍ）で、５０ｃｍ^２〜８０ｃｍ^２（５０００ｍｍ^２〜８０００ｍｍ^２）の培養面積を有し、表面がポリスチレンのものである。

本発明では、一般的規定量より少量（具体的には、１０ｃｍシャーレの場合、３ｍｌ）の細胞懸濁液を培養容器１１１に播種し、培養容器１１１を揺動させる駆動装置１１６により培養容器１１１の底面方向に平行で夫々が直行する２軸方向に対して１Ｈｚで２回揺動させることで、少量の細胞懸濁液を培養容器全体に均一にしている。本発明は、このようにして所定量（一般的な規定量より少量）の細胞懸濁液を均一にならすことで、細胞懸濁液内に浮遊している細胞を短時間で培養容器１１１の底部に落下させることが可能となり、短時間で細胞数の計測ができることを特徴とする。

ここで、１０ｃｍシャーレに対して２〜４ｍｌの細胞懸濁液の量が好ましい理由について考察する。例えば、細胞懸濁液の量が５ｍｌなど上記３ｍｌより多い場合には、培養容器１１１内での細胞懸濁液の深さが大きくなるため、浮遊している細胞に顕微鏡の焦点を合わせるには、その細胞が培養容器１１１の底面に落下するまで待つ必要があり、細胞数計測の時間が長くなる。逆に、例えば、細胞懸濁液の量が１ｍｌなど上記３ｍｌより少ない場合には、駆動装置１１６により培養容器１１１を揺動させても培養容器１１１全体に細胞懸濁液が均一に広がらず、正確な細胞数計測ができない場合がある。

発明者らは、このような浮遊している細胞の落下時間と細胞懸濁液の均しやすさの条件を満たす細胞懸濁液量について試行錯誤的に実験を行い、上記の最適な条件（１０ｃｍシャーレに対して２〜４ｍｌ、特に３ｍｌ）を見出した。また、その時に細胞懸濁液を均一に均す揺動の仕方（周波数や回数など）についても試行錯誤的に実験を行い、上記の最適な条件（２軸方向に１Ｈｚで２回ずつ揺動）を見出した。さらに、培養容器１１１である１０ｃｍシャーレに細胞懸濁液２〜４ｍｌを滴下したときには、培養容器１１１の壁による表面張力の影響を受けにくい培養容器１１１の中央部付近においては、細胞懸濁液の深さが１００μｍ程度となっており、細胞径が数１０μｍであることを考慮すると、培養容器１１１の底面への落下が容易に実現できることがわかる。すなわち、発明者らは、培養容器１１１である１０ｃｍシャーレに対して、２ｍｌ以上かつ４ｍｌ以下、更に好ましくは３ｍｌの細胞懸濁液を播種し、２軸方向に１Ｈｚで２回ずつ揺動させることで、細胞懸濁液内の細胞数が計測し易くなることを見出した。

続いて、細胞数計測装置１００を用いた培養容器１１１内の細胞数を計測する手順を、図２のフローチャートを用いて説明する。この手順は、発明者らの試行錯誤により、材料がポリスチレンの１０ｃｍシャーレに対して、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株に対してライフテクノロジーズ社製TrypLEを用いてシングルセルになるようにピペッティングを実施したもの）を用いたときに、精度良く細胞数を計測できたものである。

まず、チューブにシングルセル状態にした細胞懸濁液（培地はStemcell Technologies社製ｍＴｅＳＲ１を使用、表面張力は約２９ｍＮ／ｍ）を用意する（ステップＳ０１）。続いて、細胞懸濁液１ｍｌと他に準備したＰＢＳ（表面張力は約５０ｍＮ／ｍ）などの液体２ｍｌの合計３ｍｌを、チューブから培養容器１１１である１０ｃｍシャーレに注入し、ピペッティングにより混ぜる（ステップＳ０２、ステップＳ０３）。そして、駆動装置１１６により培養容器１１１を異なる２軸方向に１Ｈｚの周波数で２回ずつ揺動させることで、培養容器１１１内に細胞を均す（ステップＳ０４）。そして、細胞が培養容器１１１の底面に落下するまで静置する（ステップＳ０５）。その後、事前に設定した培養容器１１１内の複数の位置を撮影し、画像処理により細胞数を算出する（ステップＳ０６、ステップＳ０７）。例えば、図３のように得られた観察画像に対してパターンマッチングを行うことで、画像処理により細胞数計測を行う。そして、撮影した箇所の細胞数の平均値に対して事前に設定した比例定数をかけることで、培養容器１１１全体の細胞数を推定する（ステップＳ０８）。最後に、ステップＳ０１での元の細胞懸濁液の量およびステップＳ０２で混ぜた細胞懸濁液と他の液体の合計量から、元の細胞懸濁液の細胞数および細胞密度を算出する（ステップＳ０９）。

本発明の細胞培養装置は、再生医療や創薬分野で有用である。

１００細胞数計測装置
１１０細胞懸濁液
１１１培養容器
１１２積載台
１１３揺動装置
１１４制御装置
１１５撮影装置
１１６駆動装置
１１７細胞数計測手段
１１８条件入力部

Claims

培養容器と、前記培養容器を揺動させる駆動装置と、前記培養容器内の計測対象物を撮影する撮影装置と、前記撮影装置で撮影された画像内の計測対象物の数を計測する計測手段と、から構成され、
２ｍｌ以上かつ４ｍｌ以下の細胞懸濁液を前記培養容器である１０ｃｍシャーレに播種し、前記駆動装置により前記培養容器を揺動させることで前記細胞懸濁液を前記培養容器に均して前記細胞懸濁液内の細胞を前記培養容器の底部に落下させ、前記計測手段で細胞の数の計測を行う、
細胞数計測装置。
前記細胞懸濁液の量が３ｍｌである、
請求項１に記載の細胞数計測装置。
前記細胞懸濁液内の細胞がヒトiＰＳ細胞である、
請求項１または２に記載の細胞数計測装置。
前記駆動装置による前記培養容器の揺動は、異なる２軸方向に１Ｈｚの周波数で２回ずつ揺動させる動作である、
請求項１から３いずれか１項に記載の細胞数計測装置。