JP6374929B2 - 撹拌培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、動植物の細胞・組織の一部または個体や微生物や菌体等、特に、幹細胞、動物細胞などの細胞を培養する培養装置に関するものである。

従来、培養槽内の細胞を含む培養液を、撹拌翼（回転翼）を回転させて撹拌して、該培養槽内の細胞を培養する回転翼式撹拌培養装置や、上下撹拌翼を上下往復動させて撹拌して、該培養槽内の細胞を培養する往復動翼式撹拌培養装置がある。

図１３は、前記従来の往復動翼式撹拌培養装置１を示し、２は、該撹拌培養装置１の培養槽であり、例えば、円筒状の胴部からなり、例えば、幹細胞や動物細胞などの細胞と培養液が容れられている。

３は、駆動軸であり、該駆動軸３は、前記培養槽２の天井部２ａの中央の開口部４を貫通して、前記培養槽２内に挿入されている。

また、前記駆動軸３の下端には、該駆動軸３に直交するように、上下撹拌翼５が連結固定され、該上下撹拌翼５は、例えば、長径と短径とを有する形状の板状体からなり、例えば、長方形又は楕円形又は長円形に形成されている。

また、該駆動軸３と前記開口部４の縁との間には、変形可能なベローズ６が設けられ、該ベローズ６により、前記培養槽２内を外部から気密に密閉すると共に、前記駆動軸３を上下動可能にしている。

７は、前記駆動軸３の上端部に連結された、前記天井部２ａの上方に設けられた往復駆動装置であり、該往復駆動装置７の駆動により、前記上下撹拌翼５が上下往復動するように形成される。

なお、前記往復駆動装置７は、図示しない支持装置により支持されている。

８は、前記往復駆動装置７の制御装置を示し、該制御装置８により、細胞にダメージを与えないようにすると共に、適切な混合均一性となるように、前記往復駆動装置７を駆動して、前記上下撹拌翼５を上下動させて、前記培養槽２内に容れられた細胞を含む培養液を撹拌し、培養するようにしていた。

なお、７ａは、前記制御装置８からの制御信号を受けて前記往復駆動装置７の運転を制御するドライバーである。

例えば、前記往復動翼式撹拌培養装置としては、例えば、特許文献１がある。

特開２００４−２４３１６１号公開公報

前記従来の往復動翼式撹拌培養装置においては、細胞にダメージを与えないように低せん断力で、かつ、槽内の混合均一性を高めるように、槽内を撹拌するために、培養槽内の液体の流動特性に基づいて、前記上下撹拌翼５の上下方向の振幅と、例えば、正弦曲線に基づく上下往復させる振動の周波数を定めて、前記上下撹拌翼５を上下往復動させていた。

また、従来の回転翼式撹拌培養装置においても、主に、槽内の混合均一性を高めるように、槽内を撹拌するために、前記回転翼の回転数を定めて、該回転翼を回転させていた。

しかしながら、上記従来のいずれの撹拌培養装置においても、撹拌は、槽内の流動特性のみを考慮して、単に細胞を培養するだけで、細胞濃度や、細胞径や、細胞の円形度や、細胞径の標準偏差などの細胞の状態についてまでは考慮されていなかった。

本発明者は、種々実験等により、回転翼式撹拌培養装置であれば、回転翼の回転速度（例えば、所望の時間中の回転翼の速度を表したもの。例えば、１回転中の速度を表したもの）を変更・維持するなど制御することにより、培養槽内の細胞濃度などの細胞の状態を調整（コントロール）できることを見出し、また、往復動翼式撹拌培養装置であれば、例えば、上下撹拌翼の振幅と、速度と、加速度とを変更・維持するなど制御することにより（又は、振幅と、周波数と、波形（所望の時間中の上下撹拌翼の速度を表したもの。例えば、振動の１周期中の上下撹拌翼の速度を表したもの、例えば、正弦波、矩形波、三角波等。以下同じ。）とを変更・維持するなど制御することにより）、培養槽内の平均細胞径や、細胞の平均円形度や、細胞径の標準偏差などの細胞の状態を調整（コントロール）できることを見出し、更に、撹拌培養中に、該培養中の前記細胞の状態を測定し、該測定値に応じ、回転翼の回転数や、上下撹拌翼の振幅、速度、加速度（又は、振幅、周波数、波形）のいずれか１つ、或いは、これらを組み合わせて、或いは、全てをそれぞれ変更・維持するなど制御して、最適な状態の細胞を培養することができることを見出した。

前記の目的を達成すべく、本願の撹拌培養装置は、細胞を含む培養液が容れられる培養槽と、該培養槽内の培養液を撹拌する撹拌手段と、前記培養液内の細胞の細胞データを取得する取得手段と、該取得手段により得られた細胞データから得られた細胞の状態に応じて、前記撹拌手段を制御する制御手段とよりなることを特徴とする。

また、前記取得手段は、前記培養槽内の細胞を含む培養液を撮像する、又は、該培養槽外に抽出した、前記培養槽内の細胞を含む培養液を撮像する撮像手段とよりなりなることを特徴とする。

また、前記取得手段は、前記培養槽内の細胞の細胞データを、又は、該培養槽外に抽出した、前記培養槽内の細胞の細胞データを取得する測定装置であることを特徴とする。

また、前記制御手段は、演算記憶処理装置よりなり、該演算記憶処理装置は、記憶部と、前記取得手段により得た細胞データから、細胞の状態を測定する測定部と、該測定された細胞の状態と、前記記憶部に記憶された、目的とする細胞の状態とを比較する比較部と、該比較部による結果に基づき、前記撹拌手段を制御する制御部とよりなることを特徴とする。

また、前記細胞の状態とは、細胞濃度、又は平均細胞径、又は細胞の平均円形度、又は細胞径の標準偏差のうち、少なくともいずれかであることを特徴とする。

前記撹拌手段は、撹拌翼を往復動させる手段、又は、撹拌翼を回転させる手段であることを特徴とする。

前記撹拌翼は、長方形又は楕円形又は長円形に形成されていることを特徴とする。

また、円筒状の胴部を有する撹拌槽内に挿入される、往復動する駆動軸の下端面部に直交するように連結固定する撹拌翼は、その中心を通る長径と短径を有する楕円の板状体からなり、 前記撹拌翼において、その中心を通る長径線と短径線で区切られる部分で、隣り合わない対角線部分の１対を前記長径線に沿って斜上方に折り曲げ形成し、或いは、隣り合わない対角部分の１対を前記長径線に沿って斜下方向に折り曲げ形成したことを特徴とする。

また、円筒状の胴部を有する撹拌槽内に挿入される、往復動する駆動軸の下端面部に直交するように連結固定する撹拌翼は、その中心を通る長径と短径を有する楕円の板状体からなり、 前記撹拌翼において、その中心を通る長径線と短径線で区切られる部分で、隣り合わない対角線部分の２対を前記長径線に沿ってそれぞれ斜上方又は斜下方向に折り曲げ、前記長径線又は短径線を隔てて隣り合う部分が上方と下方の互いに逆方向に突出して形成したことを特徴とする。

また、添加物自動添加装置を設けたことを特徴とする。

本発明の培養撹拌方法は、培養槽内の細胞を含む培養液を、撹拌手段により撹拌する第１工程と、該培養槽内の細胞の細胞データを取得する第２工程と、該細胞データから得られた細胞の状態に応じて、撹拌制御手段により、前記撹拌を制御する第３工程と、必要に応じて、前記第２工程と第３工程を繰り返す第４工程とよりなることを特徴とする。

本発明によれば、培養槽内の混合均一性を維持しながらせん断作用を抑制し、また、細胞の状態を所望の状態に調整（コントロール）できると共に、最適な状態の細胞に早期に培養できるようになる。

本発明の撹拌培養装置の一部縦断側面図である。 本発明の撹拌培養装置の他の実施例の一部縦断側面図である。 本発明の撹拌培養装置の更に他の実施例の一部縦断側面図である。 本発明の撹拌培養装置の更に他の実施例の一部縦断側面図である。 本発明の撹拌培養装置の撹拌翼の平面図である。 本発明の撹拌培養装置の撹拌翼の他の実施例の平面図である。 本発明の撹拌培養装置の撹拌翼の更に他の実施例の平面図である。 図７におけるＸ方向矢視図である。 図７におけるＹ方向矢視図である。 本発明の撹拌培養装置の撹拌翼の更に他の実施例の平面図である。 図１０におけるＸ方向矢視図である。 図１０におけるＹ方向矢視図である。 従来の撹拌培養装置の一部縦断側面図である。

本発明を実施するための形態の実施例を以下に示す。

本発明の実施例１を図１〜図４によって説明する。なお、従来と同じ符号には、同じ符号をつけ、説明を省略する。

図１は本発明の往復動翼式撹拌培養装置９を示す。該往復動翼撹拌培養装置９は、前記従来の往復動翼式撹拌培養装置１に、更に、培養槽２内の細胞から、該細胞の状態を測定（演算）する基礎となる細胞データを取得する取得手段１０と、該取得手段１０から得た細胞データから、細胞濃度、平均細胞径などの培養槽２内の細胞の状態を測定（演算）し、該測定（演算）の結果に基づき、前記往復駆動装置７の上下撹拌翼５の振幅、速度、加速度（又は、振幅、周波数、波形）のいずれか１つ、或いは、組み合わせて、或いは、全てをそれぞれ変更・維持するなど制御する制御手段１１を設ける。

前記細胞データとしては、例えば、培養液内の細胞を撮像した画像や、個々の細胞径、個々の細胞の円形度、細胞径分布、細胞濃度などがある。

また、前記細胞の状態とは、例えば、細胞濃度、平均細胞径、細胞の平均円形度、細胞径の標準偏差などがある。

前記取得手段１０としては、例えば、図１に示すように、取得手段１０ａとして、前記培養槽２内の培養液（細胞を含む。以下同じ。）を貯留するための、前記培養槽２外に設けた専用サンプリング容器１２と、前記培養槽２内の培養液をポンプ等の抽出手段（図示せず）により前記サンプリング容器１２内に抽出する、前記培養槽２の天井部２ａを貫通して設けたサンプリング管１３と、前記サンプリング容器１２内に貯められた培養液内の細胞を撮像するカメラ等の撮像手段１４とよりなる。

前記制御手段１１は、例えば、パソコンなどの演算記憶処理装置１５からなり、該演算記憶処理装置１５は、演算処理部１５ａと、記憶部１５ｂと、前記取得手段１０で得られた画像等の細胞データを用いて、例えば、画像処理や各種演算等を行うことにより、細胞濃度、平均細胞径、細胞の平均円形度、細胞径の標準偏差などの細胞の状態を測定（演算）する測定部１５ｃと、該測定された細胞の状態と、目的とする細胞の状態とを比較する比較部１５ｄと、この比較の結果に基づき、前記往復駆動装置７を駆動して、前記上下撹拌翼５の振幅、速度、加速度（又は、振幅、周波数、波形）を変更・維持するなど制御するための駆動部１５ｅと、各種情報をモニタ（図示せず）に表示させる外部出力部１５ｆなどによりなる。

なお、前記目的とする細胞の状態は、予め、前記演算記憶処理装置１５の記憶部１５ｂに記憶されている。

次に、本発明の撹拌培養装置の作動とその効果について説明する。

まず、培養槽２内に細胞を含む培養液を容れ、前記制御手段１１により、例えば、細胞にダメージを与えずに、混合均一性を高めるように、上下撹拌翼５を、例えば、正弦波に基づく振動において、所望の振幅、所望の周波数で上下動させて、前記培養容器２内の培養液を撹拌する。

次に、所望の時間経過後に、撹拌中における培養槽２内の培養液を所望の量だけ、前記サンプリング管１３を介して前記サンプリング容器１２に貯留し、該貯留された培養液を、前記カメラ等の撮像手段１４により撮像し、該撮像手段１４により得られた画像からなる細胞データを前記演算記憶処理装置１５の記憶部１５ｂに記憶させる。

次に、前記測定部１５ｃにより、前記記憶部１５ｂに記憶された画像からなる細胞データを、画像処理等して、細胞濃度、平均細胞径、細胞の平均円形度、細胞径の標準偏差などの細胞の状態を測定し、前記記憶部１５ｂに記憶させる。

次に、前記比較部１５ｃにより、前記記憶された測定された細胞の状態と、予め、前記記憶部１５ｃに記憶させた、目的とする細胞の状態とを比較し、比較の結果に応じて、例えば、目的とする細胞の状態と異なる場合には、目的の細胞の状態になるよう、前記駆動部１５ｅにより、前記撹拌駆動装置７を、上下撹拌翼５の振幅や、周波数を変更して、駆動するようにする。

例えば、平均細胞径を大きくするように調整したい場合には、例えば、前記往復駆動装置７の上下撹拌翼５の周波数が大きくなるように変更して駆動するようにする。

また、例えば、細胞濃度が高まるように調整したい場合には、その細胞の特性に応じたせん断力が生ずるように上下撹拌翼５の振幅、周波数、波形を調整するようにする、

また、例えば、細胞径の標準偏差を高めたい場合には、前記上下撹拌翼５の周波数を所望の範囲内、例えば、１．２〜３．０５Ｈｚ内となるように、調整するようにする。

なお、前記細胞の状態の調整のための、撹拌の制御、即ち、撹拌の振幅、周波数、波形（又は、振幅や、速度や、加速度。以下同じ。）の制御は一例であり、平均細胞径をコントロールするための振幅や周波数や波形の制御や、細胞の平均円形度をコントロールするための振幅や周波数や波形の制御や、細胞径の標準偏差をコントロールするための振幅や周波数や波形の制御は、それぞれ、細胞槽や撹拌翼の形状などの設置条件や、細胞や培養液の種類等の培養条件により異なるため、それぞれ対応する条件に応じて、振幅や周波数や波形を制御するようにする。

次に、更に、所望の時間経過後に、前記と同様に、撹拌中における培養槽２内の細胞データを取得し、細胞の状態を測定して、目的とする細胞の状態と比較して、目的の細胞の状態と異なる場合には、再度、前記駆動部１１ｅにより、前記上下撹拌翼５の振幅、周波数を変更して、前記往復駆動装置７を駆動し、前記培養槽２内の培養液を撹拌するようにする。

かかる操作を、撹拌培養中に所望の時間経過おきに行うようにする。

なお、リアルタイムで細胞データを取得し、制御するようにしてもよい。

なお、前記取得手段により得られた細胞データが、細胞の状態である場合には、該細胞データを細胞の状態として用いて、目的とする細胞の状態と比較するようにしてもよい。

また、上記撹拌培養において、例えば、適宜、撹拌を途中で停止させて、再度、撹拌を再開させるのは自由である。

本発明によれば、培養槽内の混合均一性を維持しながらせん断作用を抑制し、また、細胞の状態を所望の状態に調整（コントロール）できると共に、最適な状態の細胞に早期に培養できるようになる。

また、撹拌槽の違いやスケールなどの違いや、培養条件が異なり、上下撹拌翼の振幅や周波数の条件が不明な場合であっても、上下撹拌翼の振幅や周波数や波形を修正していくことにより、最適な状態の細胞に培養していくことができるようになる。

また、前記培養槽２に、更に、薬液や酸素などの添加物を自動で添加できる添加物自動添加装置（図示せず）を設け、平均細胞径や、細胞濃度などの細胞の状態に応じて、自動で添加物を追加するようにしてもよい。

また、前記撹拌槽２に、溶存酸素量センサーや、ＰＨセンサー等を設け、細胞の状態や溶存酸素量やＰＨ値等に応じて、前記添加物自動添加装置により、溶存酸素量やＰＨ値等を自動で、調整するようにしてもよい。

なお、図２に示すように、前記取得手段１０ａにおいて、サンプリング容器１２とサンプリング管１３を省略し、直接、撮像手段１４により、前記培養容器２内の培養液内の細胞を撮像するようにしてもよい（取得手段１０ｂ）。

なお、１６は、光源である。

また、図３に示すように、前記取得手段１０ａにおいて、サンプリング容器１２と、撮像装置１４を設ける代わりに、前記サンプリング管１３の途中の流路に、例えば、超音波粒度分布測定装置などの測定装置１７を設けて、該測定装置１７を用いて、前記サンプリング管１３に流れる個々の細胞の細胞径や、細胞分布などの細胞データを取得して（取得手段１０ｃ）、そして、前記測定部１５ｃにより、該細胞データから前記細胞の状態を測定するようにしてもよい。

また、図４に示すように、前記取得手段１０ａにおいて、サンプリング容器１２、サンプリング管１３、撮像手段１４の代わりに、前記培養槽２の天井部２ａを貫通して、その先端部を、該培養槽２内の培養液内に設けた、例えば、ＦＢＲＭ（収束ビーム反射測定法）技術に基づく、インラインセンサー式粒度分布・形状分析センサーからなる他の測定装置１８を設けてもよい（取得手段１０ｄ）。

そして、該他の測定装置１８を用いて、前記培養液２内の個々の細胞の細胞粒径、円形度、細胞分布などの細胞データを取得して、そして、前記測定部１５ｃにより、該細胞データから細胞の状態を測定するようにしてもよい。

なお、前記測定装置１７や、他の測定装置１８などにより取得した細胞データが、細胞の状態である場合には（即ち、上記装置により直接、細胞の状態を取得できる場合には）、該取得した細胞データを細胞の状態として用いて、目的とする細胞の状態と比較するようにしてもよい。

なお、上下撹拌翼５の翼径は、該上下撹拌翼が最小となる一方の側の径の翼先端と撹拌槽との距離Ａが、該一方の側の径と直交する他方の側の径の翼先端と前記撹拌槽との距離Ｂよりも、長く形成され、該距離Ａの空間により、前記上下撹拌翼５が上下した場合の液体の流路を確保できるように形成されている。

また、例えば、前記上下撹拌翼５の撹拌径は、培養槽径の３０％以上１００％未満である。

そして、例えば、前記培養槽２の横断面が円形の場合には、前記上下撹拌翼５は、図５に示すように、長径５ａと短径５ｂとを有する楕円形状又は長円形状の板状体１９からなる。

なお、前記板状体１９の代わりに、図６に示すように、円板翼の上下を切り取って形成した横長の板状体２０、又は長方形の板状体からなる上下撹拌翼を用いてもよい。

また、前記上下撹拌翼５の代わりに、図７〜図１０に示すように、例えば、楕円形に形成した板状体からなり、該楕円形の中心を通る長径線２１ａと短径線２１ｂとで区切られる部分において、前記短径線２１ｂに沿って切れ目を入れると共に隣り合わない対角部分の１対を前記長径線２１ａに沿って斜上方に折り曲げて、傾斜羽根部２２ａ、２２ａを有する上下撹拌翼２１を用いてもよい。

なお、前記傾斜羽根部２２ａの折り曲げ角度は、例えば、３０度である。

また、前記上下動撹拌翼５の代わりに、図８〜図１０に示すように、例えば、楕円形に形成した板状体からなり、前記楕円形の中心を通る長径線２３ａと短径線２３ｂとで区切られる部分において、前記短径線２３ｂに沿って切れ目を入れると共に、隣り合わない対角部分の２対を、前記長径線２３ａに沿ってそれぞれ斜上方又は斜下方に折り曲げて、前記長径線２３ａ又は短径線２３ｂを隔てて隣り合う部分が上方と下方の互いに逆方向に突出した傾斜羽根部２４ａ、２４ｂを有する上下撹拌翼２３を用いても良い。

前記実施例は、往復動式撹拌培養装置の場合を示したが、回転翼式撹拌培養装置においても、適用できる。

例えば、回転による撹拌の制御としては、回転翼の回転数（例えば、１回転中の速度を表したもの）を変化させるようにする。

前記回転翼式培養装置においては、例えば、細胞濃度を高めたい場合には、例えば、回転数を上げて、細胞濃度を調整するようにする。

本発明の細胞培養装置は、医療品関係、食品関係等における培養装置に利用される。

１ 往復動翼式撹拌培養装置
２ 培養槽
２ａ 天井部
３ 駆動軸
４ 開口部
５ 上下撹拌翼
５ａ 長径
５ｂ 短径
６ ベローズ
７ 往復駆動装置
７ａ ドライバー
８ 制御装置
９ 往復動翼式撹拌培養装置
１０ 取得手段
１０ａ 取得手段
１０ｂ 取得手段
１０ｃ 取得手段
１０ｄ 取得手段
１１ 制御手段
１２ サンプリング容器
１３ サンプリング管
１４ 撮像手段
１５ 演算記憶処理装置
１５ａ 演算処理部
１５ｂ 記憶部
１５ｃ 測定部
１５ｄ 比較部
１５ｅ 駆動部
１５ｆ 外部出力部
１６ 光源
１７ 測定装置
１８ 測定装置
１９ 板状体
２０ 板状体
２１ 上下撹拌翼
２１ａ 長径線
２１ｂ 短径線
２２ａ 傾斜羽根
２３ 上下撹拌翼
２３ａ 長径線
２３ｂ 短径線
２４ａ 傾斜羽根
２４ｂ 傾斜羽根

Claims (8)

1. 細胞を含む培養液が容れられる培養槽と、
   該培養槽内の培養液を撹拌する撹拌手段と、
   前記培養液内の細胞の細胞データを取得する取得手段と、
   該取得手段により得られた細胞データから得られた平均細胞径に応じて、前記撹拌手段を制御する制御手段とよりなることを特徴とする撹拌培養装置。
2. 細胞を含む培養液が容れられる培養槽と、
   該培養槽内の培養液を撹拌する撹拌手段と、
   前記培養液内の細胞の細胞データを取得する取得手段と、
   該取得手段により得られた細胞データから得られた細胞の平均円形度に応じて、前記撹拌手段を制御する制御手段とよりなることを特徴とする撹拌培養装置。
3. 細胞を含む培養液が容れられる培養槽と、
   該培養槽内の培養液を撹拌する撹拌手段と、
   前記培養液内の細胞の細胞データを取得する取得手段と、
   該取得手段により得られた細胞データから得られた細胞径の標準偏差に応じて、前記撹拌手段を制御する制御手段とよりなることを特徴とする撹拌培養装置。
4. 前記撹拌手段は、撹拌翼を往復動させる手段であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１に記載の撹拌培養装置。
5. 前記制御手段は、前記撹拌翼の振幅または周波数または波形を制御することを特徴とする請求項４に記載の撹拌培養装置。
6. 前記撹拌手段は、撹拌翼を回転させる手段であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１に記載の撹拌培養装置。
7. 前記撹拌手段は、撹拌翼を往復動させる手段であり、
   前記制御手段は、前記撹拌翼の周波数を変更して駆動する手段であることを特徴とする請求項１に記載の撹拌培養装置。
8. 前記撹拌手段は、撹拌翼を往復動させる手段であり、
   前記制御手段は、前記撹拌翼の周波数を所望の範囲内に調整する手段であることを特徴とする請求項３に記載の撹拌培養装置。

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