CN110904090B - 模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法和培养装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种模拟体内力‑电微环境的动态细胞培养方法和培养装置，培养方法为：在体外将细胞种植在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加起始时间和频率一致、方向一定的循环动态载荷和循环动态电场，各循环周期内，载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值后维持一定时间，再随时间逐渐减小，柔性基材的形变率与载荷同步变化；培养装置包括细胞培养室、夹头、压头、用于带动夹头沿平行于柔性基材的方向作往复运动的机构I、用于带动压头沿垂直于柔性基材的方向作往复运动的机构II以及电刺激装置。本发明的培养方法可以准确模拟体内复杂的电学、力学环境，本发明的培养装置组装简便，使用方便，极具推广价值。

Description

模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法和培养装置
技术领域
本发明属于细胞培养设备或装置技术领域，涉及一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法和培养装置。
背景技术
体外细胞培养是指在体外环境下，通过模拟体内环境使细胞生长、发育、迁移。细胞的体外培养是判断植入人体材料的细胞生长发育情况的必要技术基础，而模拟与体内细胞生存条件一致的体外生长环境是至关重要的，其中，机械力、电场等影响因子在其中起着不可忽视的作用。
力学环境刺激引起的信号转导通路影响着人体内多种细胞的形态和功能。大量研究显示，机械应力刺激能够影响心肌细胞、肺泡细胞、骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞等细胞的形态结构或增殖分化。例如，心肌细胞在机械拉伸力下能够促进基因表达的改变和蛋白质的合成。此外，心肌膜在机械应力作用下变形引起蛋白质构象变化，这些蛋白质锚定到细胞膜上，进而影响离子通道。周期性机械应力刺激可以促进细胞外基质合成与软骨细胞的增殖。
生物电广泛存在于再生和发育的组织、肿瘤转移与炎症中，内生性电场能够调控细胞的迁移分化和神经生长。研究显示，电刺激可以增加控制细胞的迁移并促进细胞增殖、增加DNA的合成、上调特异性蛋白的表达。
单一的力学刺激和单一的电场刺激对于细胞生物学行为的作用已经被广泛研究，但目前综合考虑力学、电场联合刺激应用于细胞或组织培养的装置较为少见。国内现已存在剪切力、电同时刺激的设备以及拉伸力、电同时刺激的设备，但是体内环境应力方向主要是横向或轴向应变，剪切力无法实现这些应变，拉伸力只能实现横向应变。不同体内环境，细胞和组织应变方向不同，理想的模拟体内细胞生长环境的动态细胞培养装置能够根据所模拟环境的具体应变方向、大小和生物电信号强弱与频率等合理选择施加应力的方向及其大小、频率等参数。现有电场刺激多采用金属电极与培养液中离子运动形成电回路的形式，这会引起细胞培养液中的离子及蛋白质的分布不匀、pH变化等问题导致培养液变质，影响模拟效果。
因此，研究一种较好地模拟体内力-电微环境(即力学、电场环境力)的动态细胞培养方法及其培养装置具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中的细胞培养方法和培养装置无法准确模拟体内细胞复杂力-电微环境的问题，提供一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法和培养装置。本发明通过对黏附有细胞的柔性基材施加力学和电场刺激，提供了一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法及其培养装置，并且可以选择柔性基材应变方向，以实现精确模拟体内环境。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，在体外将细胞种植在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷和循环动态电场，以实现模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法；
循环动态载荷和循环动态电场的施加频率为f，循环动态载荷的施加方向为DF，具体为平行或垂直于柔性基材的方向，循环动态电场的施加方向为平行于柔性基材的方向；
循环动态载荷和循环动态电场的起始时间和频率保持一致；
各循环周期内，载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值后维持一定时间，再随时间逐渐减小；
柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，稳定一段时间后，再由b线性减小至a；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿DF的最大位移，DF为平行于柔性基材的方向时，b0为柔性基材被夹持的两端之间的初始距离；DF为垂直于柔性基材的方向时，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的初始等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆；
各循环周期内，电场的施加时间占总时间的百分比(即占空比)为D，电场强度为E。
作为优选的技术方案：
如上所述的模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，所述体内力-电微环境为人心肌运动时心肌处细胞力-电微环境，f的取值范围为0.5～2Hz，DF为垂直于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为10％～20％，D的取值范围为0.1％～40.0％，E的取值范围为5～500mV/mm；f和D的取值范围是根据人正常心脏搏动频率确定的，a和b是根据实际心脏搏动变形得出，E根据心脏处生物电信号大小确定；
或者，所述体内力-电微环境为人成骨过程中成骨处细胞力-电微环境，f的取值范围为2～30Hz，DF为垂直于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为1％～15％，D的取值范围为5.0％～40.0％，E的取值范围为0.01～10mV/mm；f、a、b、D、E的取值范围是根据骨组织所处力学负荷环境与生物电信号确定的。
或者，所述体内力-电微环境为人神经细胞力-电微环境，f的取值范围为0.1～200Hz，DF为平行于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为1％～5％，D的取值范围为10.0％～90.0％，E的取值范围为0.5～100mV/mm；f、D的取值范围是根据人神经细胞传递电信号平均频率和动作电位持续时间确定的(人神经细胞产生动作电位的频率理论值到1000Hz，但实际很少超过200Hz)，a和b是根据神经细胞变形范围确定，E根据人神经细胞所产生动作电位大小确定；
或者，所述体内力-电微环境为人视网膜细胞力-电微环境，f的取值范围为0.05～1Hz，DF为平行于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为1％～3％，D的取值范围为10.0％～50.0％，E的取值范围为50～1000mV/mm；f、D的取值范围是根据人视网膜细胞产生动作电位的频率和动作电位持续时间确定的，a和b是根据视网膜变形范围确定，E根据人视网膜细胞所产生动作电位大小确定；
或者，所述体内力-电微环境为人肌腱和韧带运动时肌腱和韧带处细胞力-电微环境，f的取值范围为0.5～2Hz，DF为平行于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为4％～10％，f的取值范围是根据人日常行为时的肌腱和韧带的运动频率确定的，a和b是根据日常肌腱和韧带的形变范围确定的，D的取值范围为40.0％～90.0％，E的取值范围为5～500mV/mm；E根据人肌腱和韧带处细胞所产生动作电位大小确定，D根据人日常行为时的肌腱和韧带的运动持续时间确定。
本发明还提供采用如上所述的模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置，包括细胞培养室、用于夹持柔性基材并对柔性基材施加载荷的夹头、用于对柔性基材施加载荷的压头、用于带动夹头沿平行于柔性基材的方向作往复运动的机构I、用于带动压头沿垂直于柔性基材的方向作往复运动的机构II以及用于对柔性基材施加方向平行于柔性基材的电场的电刺激装置，夹头和压头位于细胞培养室内。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置，机构I主要由驱动电机、可调圆盘、导轨、滑块和拉伸杆组成，可调圆盘的一面与驱动电机的输出轴垂直连接，另一面与导轨连接，导轨与滑块滑动连接，滑块与拉伸杆的一端连接，拉伸杆的另一端与夹头连接，拉伸杆平行于柔性基材。
如上所述的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置，滑块与拉伸杆可拆卸连接。
如上所述的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置，机构II与机构I共用驱动电机、可调圆盘、导轨和滑块，机构II还包括连杆、移动夹持块、行程导轨、正齿轮、齿条、加压连杆和加压杆，连杆的一端与滑块可拆卸连接，另一端与移动夹持块连接，移动夹持块与行程导轨滑动连接，同时与正齿轮连接，正齿轮与齿条啮合，同时与加压连杆连接，加压连杆与加压杆的一端连接(具体通过螺钉可拆卸地连接)，加压杆的另一端与压头连接，行程导轨、齿条和加压杆垂直于柔性基材。
如上所述的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置，电刺激装置主要由通过导线相互连接的信号发生器(信号发生器可以实现两种给电方式，一种是脉冲给电，另一种是恒压直流给电)、数字万用表和金属电极组成，金属电极设置在夹头上，夹头由绝缘材料制成。
如上所述的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置，夹头的工作面上设有多道沟槽，金属电极设置在中间沟槽内。
如上所述的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置，还包括计算机，压头带有压力传感器，夹头带有拉力传感器，压力传感器、拉力传感器、驱动电机、信号发生器和数字万用表与计算机相连。
如上所述的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置，数字万用表、信号发生器、驱动电机、可调圆盘、导轨、滑块、连杆、正齿轮、移动夹持块、齿条、行程导轨设置在箱体内部；
细胞培养室的侧部和底部设有密封圈，拉伸杆和加压杆穿过密封圈穿入细胞培养室内，细胞培养室的顶部设有带卡槽的封盖和贯穿孔，细胞培养室的底部设有支腿，支腿的长度大于加压杆。
采用如上所述的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置进行模拟体内力学、电学环境的动态细胞培养的具体步骤为：
(1)根据情况选择拉伸传动系统(机构I)或加压传动系统(机构II)，连接装置后将箱体置于培养箱(培养箱即细胞培养箱，为细胞培养提供气体、温度和湿度环境，整个装置需要放在培养箱中，来为细胞培养提供合适环境)中；
(2)将细胞种植在柔性基材上，使细胞在柔性基材上生长，将柔性基材放入培养室中夹紧；
(3)设置频率、位移、时间、占空比、电压等参数，进行动态培养，夹头沿水平方向做往复运动或压头沿竖直方向做往复运动，信号发生器产生电场，使柔性基材发生应变和电刺激，关闭培养箱箱门；
(4)动态培养可人为终止或至培养时间结束终止，打开培养室进行细胞换液或将柔性基材取出进行后续观察，完成动态培养。
有益效果：
(1)本发明的模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，可以模拟人体不同部位的力学环境和电场环境，在无菌环境下对柔性导电材料施加循环应变和电刺激，从而影响黏附在柔性基材上的细胞行为，更加接近于人体内细胞生长发育的环境，准确地模拟体内环境；
(2)本发明的模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，通过将电场作用于导电基材影响细胞行为，确保细胞受到均匀电场，并且避免了培养液中离子和蛋白质随电场迁移；
(3)本发明的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置，电极只设置在中间的沟槽处，避免了金属电极接触培养液，防止培养液在电场作用下产生电解质对细胞产生负面影响；
(4)本发明的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置，通过选择可调圆盘与加压传动系统连杆或与拉伸传动系统连杆的连接，驱动电机连接可调圆盘控制拉伸或加压行为，通过独立的信号发生器产生电场，可以进行拉伸力学和电场联合刺激或进行加压力学和电场联合刺激，从而更加精准地模拟体内环境。
附图说明
图1为本发明实施例7中施加循环动态载荷和循环动态电场的示意图；
图2为本发明一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置的结构示意图；
图3为本发明实施例9中施加循环动态载荷和循环动态电场的示意图；
其中，1-箱体，2-信号发生器，3-数字万用表，4-驱动电机，5-可调圆盘，6-导轨，7-滑块，8-螺钉，9-连杆，10-正齿轮，11-移动夹持块，12-齿条，13-行程导轨，14-拉伸杆，15-加压连杆，16-加压杆，17-夹头，18-压头，19-压力传感器，20-封盖，21-密封圈，22-拉力传感器，23-支腿，24-导线，25-金属电极，26-贯穿孔。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，是在体外将细胞种植在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷和循环动态电场，以实现模拟人心肌运动时心肌处细胞力-电微环境的动态细胞培养方法；
循环动态载荷和循环动态电场的施加频率为f，f的取值范围为0.5～2Hz，循环动态载荷的施加方向为DF，DF为垂直于柔性基材的方向，循环动态电场的施加方向为平行于柔性基材的方向；
循环动态载荷和循环动态电场的起始时间和频率保持一致；
各循环周期内，载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值后维持一定时间，再随时间逐渐减小；
柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，稳定一段时间后，再由b线性减小至a，a为0％，b的取值范围为10％～20％；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿DF的最大位移，DF为平行于柔性基材的方向时，b0为柔性基材被夹持的两端之间的初始距离；DF为垂直于柔性基材的方向时，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的初始等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆；
各循环周期内，电场的施加时间占总时间的百分比为D，D的取值范围为0.1％～40.0％，电场强度为E，E的取值范围为5～500mV/mm。
实施例2
模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，是在体外将细胞种植在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷和循环动态电场，以实现模拟人成骨过程中成骨处细胞力-电微环境的动态细胞培养方法；
循环动态载荷和循环动态电场的施加频率为f，f的取值范围为2～30Hz，循环动态载荷的施加方向为DF，DF为垂直于柔性基材的方向，循环动态电场的施加方向为平行于柔性基材的方向；
循环动态载荷和循环动态电场的起始时间和频率保持一致；
各循环周期内，载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值后维持一定时间，再随时间逐渐减小；
柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，稳定一段时间后，再由b线性减小至a，a为0％，b的取值范围为1％～15％，；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿DF的最大位移，DF为平行于柔性基材的方向时，b0为柔性基材被夹持的两端之间的初始距离；DF为垂直于柔性基材的方向时，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的初始等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆；
各循环周期内，电场的施加时间占总时间的百分比为D，D的取值范围为5.0％～40.0％，电场强度为E，E的取值范围为0.01～10mV/mm。
实施例3
模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，是在体外将细胞种植在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷和循环动态电场，以实现模拟人神经细胞力-电微环境的动态细胞培养方法；
循环动态载荷和循环动态电场的施加频率为f，f的取值范围为0.1～200Hz，循环动态载荷的施加方向为DF，DF为平行于柔性基材的方向，循环动态电场的施加方向为平行于柔性基材的方向；
循环动态载荷和循环动态电场的起始时间和频率保持一致；
各循环周期内，载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值后维持一定时间，再随时间逐渐减小；
柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，稳定一段时间后，再由b线性减小至a，a为0％，b的取值范围为1％～5％；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿DF的最大位移，DF为平行于柔性基材的方向时，b0为柔性基材被夹持的两端之间的初始距离；DF为垂直于柔性基材的方向时，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的初始等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆；
各循环周期内，电场的施加时间占总时间的百分比为D，D的取值范围为10.0％～90.0％，电场强度为E，E的取值范围为0.5～100mV/mm。
实施例4
模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，是在体外将细胞种植在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷和循环动态电场，以实现模拟人视网膜细胞力-电微环境的动态细胞培养方法；
循环动态载荷和循环动态电场的施加频率为f，f的取值范围为0.05～1Hz，循环动态载荷的施加方向为DF，DF为平行于柔性基材的方向，循环动态电场的施加方向为平行于柔性基材的方向；
循环动态载荷和循环动态电场的起始时间和频率保持一致；
各循环周期内，载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值后维持一定时间，再随时间逐渐减小；
柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，稳定一段时间后，再由b线性减小至a，a为0％，b的取值范围为1％～3％；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿DF的最大位移，DF为平行于柔性基材的方向时，b0为柔性基材被夹持的两端之间的初始距离；DF为垂直于柔性基材的方向时，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的初始等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆；
各循环周期内，电场的施加时间占总时间的百分比为D，D的取值范围为10.0％～50.0％，电场强度为E，E的取值范围为50～1000mV/mm。
实施例5
模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，是在体外将细胞种植在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷和循环动态电场，以实现模拟人肌腱和韧带运动时肌腱和韧带处细胞力-电微环境的动态细胞培养方法；
循环动态载荷和循环动态电场的施加频率为f，f的取值范围为0.5～2Hz，循环动态载荷的施加方向为DF，DF为平行于柔性基材的方向，循环动态电场的施加方向为平行于柔性基材的方向；
循环动态载荷和循环动态电场的起始时间和频率保持一致；
各循环周期内，载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值后维持一定时间，再随时间逐渐减小；
柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，稳定一段时间后，再由b线性减小至a，a为0％，b的取值范围为4％～10％；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿DF的最大位移，DF为平行于柔性基材的方向时，b0为柔性基材被夹持的两端之间的初始距离；DF为垂直于柔性基材的方向时，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的初始等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆；
各循环周期内，电场的施加时间占总时间的百分比为D，D的取值范围为40.0％～90.0％，电场强度为E，E的取值范围为5～500mV/mm。
实施例6
采用如实施例1～5任一项所述的模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置，其结构示意图如图2所示，包括细胞培养室、用于夹持柔性基材并对柔性基材施加载荷的夹头17、用于对柔性基材施加载荷的压头18、用于带动夹头17沿平行于柔性基材的方向作往复运动的机构I、用于带动压头18沿垂直于柔性基材的方向作往复运动的机构II、用于对柔性基材施加方向平行于柔性基材的电场的电刺激装置和计算机，夹头17和压头18位于细胞培养室内；
机构I由驱动电机4、可调圆盘5、导轨6、滑块7和拉伸杆14组成，可调圆盘5的一面与驱动电机4的输出轴垂直连接，另一面与导轨6连接，导轨6与滑块7滑动连接，滑块7与拉伸杆14的一端可拆卸连接，拉伸杆14的另一端与夹头17连接，拉伸杆14平行于柔性基材；
机构II与机构I共用驱动电机4、可调圆盘5、导轨6和滑块7；
机构II包括连杆9、移动夹持块11、行程导轨13、正齿轮10、齿条12、加压连杆9、加压杆16，连杆9的一端与滑块7可拆卸连接，另一端与移动夹持块11连接，移动夹持块11与行程导轨13滑动连接，同时与正齿轮10连接，正齿轮10与齿条12啮合，同时与加压连杆15连接，加压连杆15与加压杆16的一端连接(具体通过螺钉8可拆卸连接)，加压杆16的另一端与压头18连接，行程导轨13、齿条12和加压杆16垂直于柔性基材；电刺激装置主要由通过导线24相互连接的信号发生器2、数字万用表3和金属电极25组成，金属电极25设置在夹头17上，夹头17由绝缘材料制成；夹头17的工作面上设有多道沟槽，金属电极25设置在中间沟槽内；压头18带有压力传感器19，夹头17带有拉力传感器22，压力传感器19、拉力传感器22、驱动电机4、信号发生器2和数字万用表3与计算机相连；数字万用表3、信号发生器2、驱动电机4、可调圆盘5、导轨6、滑块7、连杆9、正齿轮10、移动夹持块11、齿条12、行程导轨13设置在箱体1内部；
细胞培养室的侧部和底部设有密封圈21，拉伸杆14和加压杆16穿过密封圈21穿入细胞培养室内，细胞培养室的顶部设有带卡槽的封盖20和贯穿孔26，细胞培养室的底部设有支腿23，支腿23的长度大于加压杆16。
实施例7
采用实施例6的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置进行动态细胞培养的步骤如下：
(1)连接可调圆盘、连杆和加压杆与加压连杆，并对细胞培养装置进行灭菌；
(2)将灭菌处理后的培养装置置于细胞培养箱中；
(3)将3*5cm的聚氨酯纤维增强聚吡咯膜置于细胞培养液中脱掺杂24小时；
(4)在超净工作台上将原生代心肌细胞接种到柔性导电聚氨酯纤维增强聚吡咯膜上，并在显微镜下观察细胞是否生长到材料上。
(5)旋下连接加压杆与加压连杆间螺钉，将细胞培养室取出，放入超净工作台上，将上述柔性导电聚吡咯膜涂层织物置于细胞培养室中，用夹头加紧该织物的两端，添加细胞培养液，盖上封盖，将细胞培养室放入细胞培养箱中，连接加压杆与加压连杆，关闭细胞培养箱；
(6)在计算机上设置培养时间为24小时，频率为1赫兹，垂直膜方向应变为10％，输出电场强度2.5伏特，电场的施加时间占总时间的百分比为12.5％，施加循环动态载荷和循环动态电场的示意图如图1所示；设置对照组，即将相同规格聚氨酯纤维增强聚吡咯膜在静态条件下培养24小时；
(7)24小时后，旋下加压杆与加压连杆间的螺钉，将细胞培养室取出，将培养室放入超净台中，打开封盖，取出柔性导电聚氨酯纤维增强聚吡咯膜；
(8)将柔性导电聚氨酯纤维增强聚吡咯膜进行处理，使用扫描电子显微镜观察聚氨酯纤维增强聚吡咯膜上的细胞形态，使用CCK8对细胞进行处理测量细胞增殖率，使用鬼笔环肽对细胞进行染色观察肌动蛋白应力纤维的分布情况，使用试剂盒测量胶原产量；
经过上述步骤对生长在聚氨酯纤维增强聚吡咯膜上的细胞进行动态培养后，实验结果表明动态刺激促进心肌细胞的取向及熟化，肌动蛋白增加400％，以及内皮化心肌组织的形成。
实施例8
采用实施例6的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置进行动态细胞培养的步骤如下：
(1)连接可调圆盘与拉伸杆，并对细胞培养装置进行灭菌；
(2)将灭菌处理后的培养装置置于细胞培养箱中；
(3)将3*5cm的聚吡咯膜涂层织物置于细胞培养液中脱掺杂24小时；
(4)在超净工作台上将成纤维细胞接种到聚吡咯膜涂层织物上，并在显微镜下观察细胞是否生长到聚吡咯膜涂层织物上；
(5)旋下连接可调圆盘与拉伸杆间螺钉，将细胞培养室取出，放入超净工作台上，将上述柔性导电聚吡咯膜涂层织物置于细胞培养室中，用夹头加紧该织物的两端，添加细胞培养液，盖上封盖，将细胞培养室放入细胞培养箱中，连接可调圆盘与拉伸杆，关闭细胞培养箱；
(6)在计算机上设置培养时间为24小时，频率为1赫兹，平行织物方向应变为10％，输出电场强度2.5伏特，电场的施加时间占总时间的百分比为40.0％；设置对照组，即将相同规格聚吡咯膜涂层织物在静态条件下培养24小时；
(7)24小时后，旋下连接可调圆盘与拉伸杆间螺钉，将细胞培养室取出，将培养室放入超净台中，打开封盖，取出柔性导电聚吡咯膜涂层织物；
(8)将柔性聚吡咯膜涂层织物进行处理，使用扫描电子显微镜观察聚吡咯膜涂层织物上的细胞形态，使用试剂盒测定平滑肌动蛋白基因表达，进行平滑肌动蛋白的免疫组织化学染色后，在显微镜下观察染色样品；
经过上述步骤对生长在聚吡咯膜涂层织物上的细胞进行动态培养后，实验结果表明动态刺激促进成纤维细胞的迁移能力，平滑肌动蛋白基因表达增加20％，以及平滑肌动蛋白阳性细胞数增加。
实施例9
采用实施例6的一种模拟体内力-电微环境的动态细胞培养装置进行动态细胞培养的步骤如下：
(1)连接可调圆盘与拉伸杆，并对细胞培养装置进行灭菌；
(2)将灭菌处理后的培养装置置于细胞培养箱中；
(3)将3*5cm的聚吡咯膜涂层织物置于细胞培养液中脱掺杂24小时；
(4)在超净工作台上将软骨细胞接种到聚吡咯膜涂层织物上，并在显微镜下观察细胞是否生长到聚吡咯膜涂层织物上；
(5)旋下连接可调圆盘与拉伸杆间螺钉，将细胞培养室取出，放入超净工作台上，将上述柔性导电聚吡咯膜涂层织物置于细胞培养室中，用夹头加紧该织物的两端，添加细胞培养液，盖上封盖，将细胞培养室放入细胞培养箱中，连接可调圆盘与拉伸杆，关闭细胞培养箱；
(6)在计算机上设置每24小时刺激2小时，共培养48小时，频率为1赫兹，平行织物的方向应变为3％，占空比为20％；输出电场强度分别为1、3、5伏特，该施加循环动态载荷和循环动态电场的示意图如图3所示，设置对照组，即将相同规格材料在静态条件下培养48小时；
(7)48小时后，旋下连接可调圆盘与拉伸杆间螺钉，将细胞培养室取出，将培养室放入超净台中，打开封盖，取出柔性导电聚吡咯膜涂层织物；
(8)将柔性聚吡咯膜涂层织物进行处理，使用扫描电子显微镜观察聚吡咯膜涂层织物上的细胞形态，使用CCK8对细胞进行处理测量细胞增殖率；
经过上述步骤对生长在聚吡咯膜涂层织物上的细胞进行动态培养后，实验结果表明电压为1V时，细胞形态与无刺激组相比细胞形态无明显差别，3V电压组与无刺激组相比，细胞数量和形态明显增多；5V电压组细胞形态呈不规则多角形，生长状态不佳。

Claims (7)

1.模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，其特征是：在体外将细胞种植在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷和循环动态电场，以实现模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法；
循环动态载荷和循环动态电场的施加频率为f，循环动态载荷的施加方向为DF，具体为平行或垂直于柔性基材的方向，循环动态电场的施加方向为平行于柔性基材的方向；
循环动态载荷和循环动态电场的起始时间和频率保持一致；
各循环周期内，载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值后维持一定时间，再随时间逐渐减小；
柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，稳定一段时间后，再由b线性减小至a；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿DF的最大位移，DF为平行于柔性基材的方向时，b0为柔性基材被夹持的两端之间的初始距离；DF为垂直于柔性基材的方向时，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的初始等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆；
各循环周期内，电场的施加时间占总时间的百分比为D，电场强度为E；
所述动态细胞培养方法采用动态细胞培养装置进行，所述动态细胞培养装置包括细胞培养室、用于夹持柔性基材并对柔性基材施加载荷的夹头、用于对柔性基材施加载荷的压头、用于带动夹头沿平行于柔性基材的方向作往复运动的机构I、用于带动压头沿垂直于柔性基材的方向作往复运动的机构II以及用于对柔性基材施加方向平行于柔性基材的电场的电刺激装置，夹头和压头位于细胞培养室内；
电刺激装置主要由通过导线相互连接的信号发生器、数字万用表和金属电极组成，金属电极设置在夹头上，夹头由绝缘材料制成；
夹头的工作面上设有多道沟槽，金属电极设置在中间沟槽内。
2.根据权利要求1所述的模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，其特征在于，所述体内力-电微环境为人心肌运动时心肌处细胞力-电微环境，f的取值范围为0.5～2Hz，DF为垂直于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为10％～20％，D的取值范围为0.1％～40.0％，E的取值范围为5～500mV/mm；
或者，所述体内力-电微环境为人成骨过程中成骨处细胞力-电微环境，f的取值范围为2～30Hz，DF为垂直于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为1％～15％，D的取值范围为5.0％～40.0％，E的取值范围为0.01～10mV/mm；
或者，所述体内力-电微环境为人神经细胞力-电微环境，f的取值范围为0.1～200Hz，DF为平行于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为1％～5％，D的取值范围为10％～90％，E的取值范围为0.5～100mV/mm；
或者，所述体内力-电微环境为人视网膜细胞力-电微环境，f的取值范围为0.05～1Hz，DF为平行于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为1％～3％，D的取值范围为10.0％～50.0％，E的取值范围为50～1000mV/mm；
或者，所述体内力-电微环境为人肌腱和韧带运动时肌腱和韧带处细胞力-电微环境，f的取值范围为0.5～2Hz，DF为平行于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为4％～10％，D的取值范围为40.0％～90.0％，E的取值范围为5～500mV/mm。
3.根据权利要求1或2所述的模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，其特征在于，机构I主要由驱动电机、可调圆盘、导轨、滑块和拉伸杆组成，可调圆盘的一面与驱动电机的输出轴垂直连接，另一面与导轨连接，导轨与滑块滑动连接，滑块与拉伸杆的一端连接，拉伸杆的另一端与夹头连接，拉伸杆平行于柔性基材。
4.根据权利要求3所述的模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，其特征在于，滑块与拉伸杆可拆卸连接。
5.根据权利要求4所述的模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，其特征在于，机构II与机构I共用驱动电机、可调圆盘、导轨和滑块，机构II还包括连杆、移动夹持块、行程导轨、正齿轮、齿条、加压连杆和加压杆，连杆的一端与滑块可拆卸连接，另一端与移动夹持块连接，移动夹持块与行程导轨滑动连接，同时与正齿轮连接，正齿轮与齿条啮合，同时与加压连杆连接，加压连杆与加压杆的一端连接，加压杆的另一端与压头连接，行程导轨、齿条和加压杆垂直于柔性基材。
6.根据权利要求5所述的模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，其特征在于，还包括计算机，压头带有压力传感器，夹头带有拉力传感器，压力传感器、拉力传感器、驱动电机、信号发生器和数字万用表与计算机相连。
7.根据权利要求6所述的模拟体内力-电微环境的动态细胞培养方法，其特征在于，数字万用表、信号发生器、驱动电机、可调圆盘、导轨、滑块、连杆、正齿轮、移动夹持块、齿条、行程导轨设置在箱体内部；
细胞培养室的侧部和底部设有密封圈，拉伸杆和加压杆穿过密封圈穿入细胞培养室内，细胞培养室的顶部设有带卡槽的封盖和贯穿孔，细胞培养室的底部设有支腿，支腿的长度大于加压杆。
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