JP2006296282A - 高代謝能を有する培養筋細胞の作製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】筋芽細胞を培養する工程、(2)筋芽細胞を高アミノ酸含有培地で筋管細胞に分化誘導させる工程、及び(3)分化誘導した筋管細胞に電気パルス刺激を与える工程、から成る筋管細胞の作製方法、及び、該方法で作製された筋管細胞を用いるインスリン依存的な糖取り込み能の測定方法であって、インスリンを含有する培地で培養することによりインスリン刺激を与えた後、該培地に更に糖を添加して培養し、その後に糖取り込み能を測定することを特徴とする、前記測定方法。
【選択図】図9
Description
Biochem. Pharmacol.、2003年、第65巻, 249〜257頁 Am. J. Physiol. (Endoclinol Metab)、2002年、第283巻、E514〜524頁
1.(1)筋芽細胞を培養する工程、(2)筋芽細胞を高アミノ酸含有培地で筋管細胞に分化誘導させる工程、及び(3)分化誘導した筋管細胞に電気パルス刺激を与える工程、から成る筋管細胞の作製方法。
2.高アミノ酸含有培地に含まれる各アミノ酸の含量が表1に示された範囲にある、上記1記載の作製方法。
3.電気パルス刺激が10〜50V、0.001〜4Hz、1〜24msパルス幅にて0.5〜120時間与えられる、上記1又は2記載の作製方法。
4.電気パルス刺激が20〜40V、0.1〜1Hz、1〜24msパルス幅にて2〜24時間与えられる、上記3記載の作製方法。
5.少なくとも工程(3)を高酸素分圧状態の培地を用いて行う、上記1〜4のいずれか一項に記載の作製方法。
6.高酸素分圧状態が高酸素濃度ガスを培地に溶解させることにより得られるものである、上記5記載の作製方法。
7.工程(1)が1〜6日間、及び工程(2)が3〜12日間行われる、上記1〜6のいずれか一項に記載の作製方法。
8.弾性基体上で細胞を培養する、上記1〜7のいずれか一項に記載の作製方法。
9.弾性基体が予め細胞接着因子で処理されている、上記8に記載の作製方法。
10.細胞接着因子で予め処理された弾性半透膜から成る底部を有するインサートチャンバー内で細胞を培養し、上下方向に対向して設置された電極によって電気パルス刺激が与えられる、上記1〜9のいずれか一項に記載の作製方法。
11.下部平板電極、ウェル型培養皿、インサートチャンバー、蓋体、及び、上部電極を有する、上下対向電極型電気パルス刺激負荷培養装置。
12.インサートチャンバーの底部が細胞接着因子で予め処理された弾性半透膜から成る、上記11記載の培養装置。
13.上記11又は12記載の培養装置を用いて行うことを特徴とする、上記1〜10のいずれか一項記載の作製方法。
14.上記1〜10のいずれか一項に記載の方法で作製された筋管細胞を用いるインスリン依存的な糖取り込み能の測定方法であって、インスリンを含有する培地で培養することによりインスリン刺激を与えた後、該培地に更に糖を添加して培養し、その後に糖取り込み能を測定することを特徴とする、前記測定方法。
15.インスリンを含有する培地で5〜20分間培養し、該培地に更に10〜50mMのグルコースを添加して10〜50分間培養する、上記14記載の測定方法。
16.測定反応に使用する培地及び反応液が高酸素分圧状態にあることを特徴とする、上記15記載の測定方法。
17.高酸素分圧状態が高酸素濃度ガスを溶液に溶解させることにより得られるものである、上記16記載の測定方法。
18.上記14〜17のいずれか一項に記載の測定方法を利用する筋肉を標的とした薬剤のスクリーニング方法。
No.CRL1446)などを挙げることが出来る。
M and Pessin JE, J Biol Chem, 2001年、第276巻(45号), 42436-42444頁)に上記の点を改変したものを用いる。
上記装置のインサートチェンバー内の多孔性の半透膜上にコラーゲン(0.1〜100 μg/ml)、フィブロネクチン(1〜100
μg/ml)、及びエラスチン(1〜100 μg/ml)の細胞外基質と筋細胞の分化を促す薬剤(K252a=100 nM)の混合液を添加し、室温にて数時間放置した。その後、こうして特殊処理したインサートチェンバーから混合液を除去し、ダルベッコ改変リン酸生理食塩緩衝液にて数回洗浄したものに、マウス筋芽細胞株C2C12細胞を1 x 105個/ウェル(4ウェルプレート)となるように播種した。
次に、種々の条件で電気パルス刺激を行った際のC2C12細胞の糖取り込み量(エネルギー消費量)の変化を調べた。作製例1と同様にコンフルエント状態にしたC2C12筋芽細胞をDMEM + 2%牛血清で8日間培養した後、図5(A)に示した様々な条件で電気パルス刺激を行った。電気パルス刺激終了後、細胞を氷上に静置して代謝反応を停止させ、その後トリチウムで放射性標識した2-デオキシグルコース(0.1mM, 0.5uCi/ml)を4分間細胞に取り込ませ、その取り込み量の総和を液体シンチレーションカウンターを用いて細胞の糖取り込み量(糖代謝能)を測定した。その結果、ある一定の電気パルス刺激条件下で、電気パルス刺激依存的に細胞の糖取り込み量、すなわちエネルギー消費量が増大したことが示された(図5A)。更に、分化誘導培地として高アミノ酸含有培地(表1に記載される範囲の最高値のアミノ酸含量)を使用した場合に、電気パルス刺激を与えた後の2-デオキシグルコース取り込み量に影響を与えることが示された(図5B)。
次に、分化誘導方法に電気パルス刺激のみを組み合わせた場合のインスリン依存的糖取り込みの変化を調べた。作製例に従い、C2C12細胞を4ウェルプレートに播種し、3日間通常培地(DMEM + 10%牛胎児血清)でコンフルエントとなるまで培養し、その後、通常の分化誘導培地(DMEM + 2%牛血清)で引き続き8日間培養を行い、分化誘導を行った。次に、電気パルス刺激(40V, 1Hz, 24ms, 18h)を負荷した後、インスリンで60分間処理し、その後、上記の方法で2-デオキシグルコース取り込み量を測定して細胞の糖取り込み量(糖代謝能)を評価した。その結果、電気パルス刺激はインスリン依存的な糖取り込み量を増加させるが、基底状態の糖取り込み量をも増加させてしまうため、生体では観察できるインスリン依存性の糖代謝亢進能を、既存の測定系で観察することは困難であることが判明した(図6)。
比較例1と同様にC2C12細胞を分化誘導した。次に、無血清培地(低グルコース(5 mM)あるいは、高グルコース(25 mM)を含むDMEM)で4時間培養した後、インスリンで5分間処理した。その後、細胞抽出液を調製、ウェスタンブロット解析を行い、インスリンシグナル(AktやErkのリン酸化)を観察した。高グルコースDMEMで4時間前処理することによって、インスリンシグナルが減弱していることが明らかとなった(図7)。
作製例1に従って、C2C12筋芽細胞から分化誘導して得られた筋管細胞を4時間無血清培地(DMEM)で培養して血清中のホルモンの影響を除去した後、KRPH(10mM phosphate buffer, pH7.6, 1mM MgSO4, 1mM CaCl2, 136mM NaCl, 4.7mM KCl, 10mM HEPES (pH7.6)に溶解させた終濃度100nMインスリンで15分間刺激し、その後、100nMインスリンと所定濃度のグルコースを含有するKRPHに培地交換し、さらに45分間処理を継続した。処理後、氷上に細胞培養チャンバーを静置することによって代謝反応を停止させ、富酸素状態のKRPHで3回洗浄を行った。筋管細胞の糖取り込み能は、放射性標識した2-デオキシグルコース(0.1mM, 0.5uCi/ml)を細胞に4分間取り込ませ、どの程度の放射線量が細胞に取り込まれたかを測定することで評価した。インスリン処理15分後に適当な濃度(25 mM)のグルコースを添加することによって、基底状態の糖取り込み量が減少し、インスリン依存的な糖取り込みが極めてよく評価できる系になっていることが確認された。即ち、生体の筋で観察されるインスリン反応性が、本発明の測定方法によって再現できることが示された(図8)。
測定比較例1:
(2)ウェル型培養皿
(3)インサートチャンバー
(4)蓋体
(5)特殊処理済み半透膜
(6)上部電極
Claims (18)
- (1)筋芽細胞を培養する工程、(2)筋芽細胞を高アミノ酸含有培地で筋管細胞に分化誘導させる工程、及び(3)分化誘導した筋管細胞に電気パルス刺激を与える工程、から成る筋管細胞の作製方法。
- 高アミノ酸含有培地に含まれる各アミノ酸の含量が表1に示された範囲にある、請求項1記載の作製方法。
- 電気パルス刺激が10〜50V、0.001〜4Hz、1〜24msパルス幅にて0.5〜120時間与えられる、請求項1又は2記載の作製方法。
- 電気パルス刺激が20〜40V、0.1〜1Hz、1〜24msパルス幅にて2〜24時間与えられる、請求項3記載の作製方法。
- 少なくとも工程(3)を高酸素分圧状態の培地を用いて行う、請求項1〜4のいずれか一項に記載の作製方法。
- 高酸素分圧状態が高酸素濃度ガスを培地に溶解させることにより得られるものである、請求項5記載の作製方法。
- 工程(1)が1〜6日間、及び工程(2)が3〜12日間行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の作製方法。
- 弾性基体上で細胞を培養する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の作製方法。
- 弾性基体が予め細胞接着因子で処理されている、請求項8に記載の作製方法。
- 細胞接着因子で予め処理された弾性半透膜から成る底部を有するインサートチャンバー内で細胞を培養し、上下方向に対向して設置された電極によって電気パルス刺激が与えられる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の作製方法。
- 下部平板電極、ウェル型培養皿、インサートチャンバー、蓋体、及び、上部電極を有する、上下対向電極型電気パルス刺激負荷培養装置。
- インサートチャンバーの底部が細胞接着因子で予め処理された弾性半透膜から成る、請求項11記載の培養装置。
- 請求項11又は12記載の培養装置を用いて行うことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の作製方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法で作製された筋管細胞を用いるインスリン依存的な糖取り込み能の測定方法であって、インスリンを含有する培地で培養することによりインスリン刺激を与えた後、該培地に更に糖を添加して培養し、その後に糖取り込み能を測定することを特徴とする、前記測定方法。
- インスリンを含有する培地で5〜20分間培養し、該培地に更に10〜50mMのグルコースを添加して10〜50分間培養する、請求項14記載の測定方法。
- 測定反応に使用する培地及び反応液が高酸素分圧状態にあることを特徴とする、上記15記載の測定方法。
- 高酸素分圧状態が高酸素濃度ガスを溶液に溶解させることにより得られるものである、請求項16記載の測定方法。
- 請求項14〜17のいずれか一項に記載の測定方法を利用する筋肉を標的とした薬剤のスクリーニング方法。
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