CN101892152B - 一种牵张-电联合刺激细胞培养装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牵张-电联合刺激细胞培养装置,包括细胞培养箱、细胞培养腔固定框架、细胞培养腔、步进电机和信号发生器;培养箱设有与外界相通的孔道;细胞培养腔固定在细胞培养腔固定框架内,细胞培养腔包括固定螺杆、槽体、固定夹具、弹性膜、滑动夹具和滑动螺杆,弹性膜固定在固定夹具和滑动夹具上,固定夹具连接固定螺杆,滑动夹具连接滑动螺杆,固定夹具、弹性膜和滑动夹具位于槽体内部,滑动螺杆连接步进电动机;信号发生器与细胞培养腔内的金属电极连接。本发明克服了现有方法不能模拟体内细胞处于牵张力、电刺激同时存在的物理微环境的缺陷,建立了牵张力刺激联合电刺激下的细胞培养方法,将促进细胞、组织培养方法及相关组织工程反应器的发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种牵张-电联合刺激细胞培养装置,属于细胞工程和组织工程技术领域。
背景技术
在组织工程中,细胞、组织的体外功能化培养已成为组织工程的核心,也是形成组织工程产业的必要技术基础。而提供与细胞体内生存条件相近似的体外生长环境,对于细胞、组织的三维培养和功能化至关重要,其中,力学、电学等物理影响因子在其中起着不可忽视的作用。
力学环境对器官、组织、细胞甚至亚细胞等各个层次的生命活动都有重要的影响。力学环境的调控在细胞、组织工程培养过程中起着关键性作用,对其施加一定的牵张力,可以保持和进一步发挥细胞的功能。有关牵张力学因素的生物学效应和作用机制已在多种细胞和组织中得到研究,研究表明周期性机械牵张可促进成骨细胞的功能,使TGF-β、IGF-1、bFGF、骨桥素、I型胶原的mRNA水平上升,骨钙素、胶原蛋白等分泌增加(Cillo JE Jr,et al.,2000;Fong KD,et al.,2003);可以提高骨骼肌细胞组织力学特性(Powell,et al.,2002);可以调控组织工程血管塑形(Seliktar D,et al.,2003);可促进内皮细胞(Hayoz D,et al.,2007)、软骨细胞(Waldman,S.D.et al.,2003)、成纤维细胞(Altman GH,et al.,2002)的功能、分化、增殖及细胞外基质表达等。心脏作为心血管系统的核心,处于不断地舒缩过程中,并时刻受到血流的冲击。在心肌细胞培养过程中加载周期性牵张能较好地促进心肌细胞的增殖和骨架构建,Akhyari等将人心肌细胞种植在凝胶上,连续加载周期性牵张14天(20%,1.3HZ),可显著促进心肌细胞的骨架构建,细胞内RNA和蛋白质合成增多,肌原纤维的数量增多,单个心肌细胞肥大,收缩力增强(Akhyari,et al.,2002)。Zimmermann等将新生大鼠心肌细胞与I型胶原混合之后接受7天被动牵张(10%,2HZ),较好地改善了心肌细胞分化、收缩的力度及电生理性能,可以观察到一致排列的心肌细胞束、高度有序的肌小节、细胞桥粒、T管,以及一个围绕心肌细胞的发育良好的基膜。缝隙连接蛋白Cx-43高度表达,细胞之间产生了有效的电学联接,能看到有节律的自行整体收缩(W.H.Zimmermann,et al.,2002)。
除了复杂的力学环境,电学环境也是体内细胞生长的重要微环境之一。在生理电场存在的情况下,细胞产生分裂、分化和迁移。没有电场的细胞培养环境缺少了一种胚胎自然发育过程中所具有的细胞外环境。通过模拟体内细胞、组织生长所处的电学微环境,可为体外细胞、组织的生长提供较为真实的环境,能使细胞快速、优质扩增。如电刺激可以诱导人成骨细胞钙离子浓度的增加,促进成骨细胞的增殖、生长因子的分泌以及细胞外基质的合成(Khatib L,et al.,2004;Supronwicz PR,et al.,2002);使用导电聚吡咯作为培养基质材料对神经细胞PC-12等进行培养,实验显示聚吡咯膜支持鸡的包含雪旺氏细胞的坐骨神经细胞、纤维原细胞和其它神经节派生细胞的生长和分化,对PC-12而言,加电刺激比不加电刺激神经节要增长近一倍。(Schmidt CE,et al.,1997;Ze Zhang,et al.,2007);MilicaRadisic等将新生大鼠心室肌细胞种植入胶原支架,采用模仿天然心脏组织的电脉冲信号(方波,2ms,5V/cm,1Hz)对细胞进行刺激8天,诱发了心肌细胞的有序生长、排列,提高了心肌细胞同步收缩的程度(是未加电脉冲心肌细胞收缩程度的7倍),增加了α-肌动蛋白、心肌钙蛋白等心脏蛋白分泌量,观察到高度的组织超微结构,如间隙连接、Z线、H带、I带和A带等,并观察到力学刺激研究下所没有的M线、闰盘等结构(Milica Radisic,et al.,2004)。
由以上可知,力刺激或电刺激的分别加载,能促进细胞的生长。但细胞本身处于力、电同时存在的环境,这两个环境是缺一不可的,对于维持细胞正常功能、分化、分泌等都是非常重要的。而现有的细胞、组织培养方法都没有综合这两种环境影响。目前已经有研究者开始考虑将这两种因素的综合影响应用在组织、细胞的培养中(Feng ZG,2005;魏严等,2008)。但是,国内至今还未发现可同时对细胞加载力电刺激的培养装置。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有方法不能模拟体内细胞处于牵张力、电刺激同时存在的物理微环境的技术问题,提出一种牵张-电联合刺激细胞培养装置,采用牵张力刺激与电刺激联合加载,将细胞置于牵张刺激与电刺激的联合作用下,模拟体内细胞生存环境,促进细胞的生长及分化,构建出具有特定功能的细胞或组织。
本发明的一种牵张-电联合刺激细胞培养装置,包括培养箱、细胞培养腔固定框架、细胞培养腔、步进电机和信号发生器;
培养箱两侧分别设有一个与外界相通的孔道,培养箱内的步进电机与信号发生器的电源线分别通过孔道与各自的电源连接,培养箱为密封结构,培养箱提供细胞生长所需的二氧化碳、温度和湿度环境;
所述的细胞培养腔固定在细胞培养腔固定框架内部,细胞培养腔固定框架置于培养箱内,细胞培养腔包括固定螺杆、槽体、固定夹具、弹性膜、滑动夹具和滑动螺杆,所述的槽体的两端固定在细胞培养腔固定框架内,固定夹具、弹性膜和滑动夹具位于槽体内部,并且弹性膜的两端分别固定在固定夹具和滑动夹具上,固定夹具的另一端连接固定螺杆,固定螺杆通过固定螺母固定在细胞培养腔固定框架上;滑动夹具的另一端连接滑动螺杆,滑动螺杆穿过槽体与步进电机连接;所述的弹性膜上接种所需要培养的细胞;
细胞培养腔的槽体内设有两个金属电极,分别与信号发生器的正极、负极连接。
本发明的优点在于:
(1)本发明提供的牵张刺激与电学刺激联合加载方式更接近于细胞生长、发育的体内环境,力电联合作用可改善细胞生长条件,从而促进细胞生长、提高细胞活性;
(2)本发明既可用于细胞、组织培养,也可用于细胞、组织生长研究,并且对细胞体外扩增、细胞/支架复合物的体外构建及功能化有积极的意义;
(3)本发明操作简单,稳定性好,具有较大的应用前景。
附图说明
图1是本发明一种牵张-电联合刺激细胞培养装置的结构示意图;
图2是本发明细胞培养腔固定框架的结构示意图;
图3是本发明细胞培养腔的结构示意图;
图4是本发明固定夹具、弹性膜和滑动夹具的结构示意图;
图5是本发明采用金属电极的结构示意图;
图中:
1-细胞培养箱 2-细胞培养腔固定框架 3-细胞培养腔 4-步进电机
5-信号发生器
101-孔道
201-“C”型框架 202-“I”型框架 203-开口 204-圆孔
301-固定螺母 302-固定螺杆 303-槽体 304-固定夹具
305-弹性膜 306-滑动夹具 307-盖子 308-滑动螺杆
309-“C”型主体结构 310-压片 311-螺钉 312-螺孔
501-金属网电极
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明是一种牵张-电联合刺激细胞培养装置,如图1所示的,包括细胞培养箱1、细胞培养腔固定框架2、细胞培养腔3、步进电机4和信号发生器5;
培养箱1两侧分别设有一个与外界相通的孔道101,培养箱1内的步进电机4的电源线与信号发生器5的电源线分别通过孔道101与外界电源连接。培养箱1为密封结构,培养箱1提供细胞生长所需的二氧化碳、温度和湿度环境;
细胞培养腔固定框架2置于培养箱1内,如图2所示,细胞培养腔固定框架2为可拆装结构,包括“C”型框架201和“I”型框架202,“C”型框架201的开口203,用于放置并且固定细胞培养腔3的槽体303,开口203上设有圆孔204;两个“C”型框架的开口相对向内,两个“C”型框架之间通过两个平行“I”型框架连接,形成封闭的框架结构,用于放置并且固定细胞培养腔的槽体,用于安装、搭建细胞培养腔固定框架2。
细胞培养腔3如图3、图4所示,包括固定螺母301、固定螺杆302、槽体303、固定夹具304、弹性膜305、滑动夹具306、盖子307和滑动螺杆308;
其中固定夹具304和滑动夹具306均包括“C”型主体结构309、压片310和螺钉311,“C”型主体结构309中空部分的背部设有螺孔312。将弹性膜305的两端通过压片310分别固定在固定夹具304和滑动夹具306的“C”型主体结构309的中空部分,然后螺钉311将压片310压紧,固定弹性膜305。
固定夹具304、滑动夹具306和弹性膜305置于槽体303内部,槽体303两端对应螺孔312的位置也设有通孔,固定螺杆302依次穿过固定夹具304背部的螺孔312、槽体303的通孔和“C”型框架201中的圆孔204,然后用固定螺母301将固定螺杆302和固定夹具304固定。滑动螺杆308依次穿过滑动夹具306背部的螺孔312、槽体303的通孔和“C”型框架201中的圆孔204,连接步进电机4;固定夹具304一端通过固定螺母固定后,步进电机4工作带动滑动螺杆308和滑动夹具306移动,拉伸弹性膜305。
所述的弹性膜材料为下列中的一种:
(1)硅橡胶、凝胶、胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸或聚己内酯;
(2)聚乳酸与聚乙醇酸按(90~10)∶(10~90)比例共聚的无规共聚物;
(3)聚乳酸-壳聚糖、聚乳酸-胶原不同聚合物形成的复合材料。
槽体303内部盛有细胞培养液,盖子307盖在槽体303上,起到通气隔菌的作用。
固定夹具304、弹性膜305、滑动夹具306、滑动螺杆308与步进电机4构成牵张刺激加载系统,通过改变步进电机4的转速,提供不同频率的牵张刺激,牵张刺激是指频率为零的静态牵张或者不同频率的动态牵张刺激,由步进电机4产生。
所述的牵张刺激加载系统通过步进电机4拉动细胞培养腔3的滑动螺杆308和滑动夹具306,从而拉伸固定在固定夹具304和滑动夹具306上的弹性膜305,对接种于其上的细胞施加牵张刺激。
所述的信号发生器5的正极、负极与细胞培养腔3内的金属电极连接,细胞培养腔3中金属电极安装方式如图5所示,在细胞培养腔体3内,弹性膜305两端的两个压片310外包一层金属网,将两个金属网作为金属网电极501,通过电极线将两个金属网电极501分别与信号发生器5的正极、负极相连,信号发生器5产生电刺激,所述的电刺激产生的电场方向与步进电机4牵张方向相同。
所述的金属电极,分为不锈钢电极或铂电极。两者都可用作电极,铂电极惰性比不锈钢电极好,但是价格高,可以根据经费来考虑。
细胞培养腔3内的金属电极、电极线和信号发生器5构成电刺激加载系统,通过改变信号发生器5的电压或者电流,提供不同大小的电刺激,电刺激为恒电压、脉冲电压或者直流微电流,由信号发生器产生。
细胞培养腔3提供细胞生长空间,通过与步进电机4和信号发生器5相连,为细胞提供牵张力-电刺激共同作用的生长环境。
本发明的细胞培养具体过程如下:
将细胞种植于弹性膜305上,将弹性膜305固定于细胞培养腔3的固定夹具304和滑动夹具306中,在槽体303加入培养基浸没弹性膜305,通过牵张刺激加载系统拉伸弹性膜305,提供静态或动态牵张刺激;信号发生器5与细胞培养腔3内金属电极相连提供电学刺激,在加载期间使弹性膜305上的细胞处于机械载荷和电载荷双重刺激的环境下生长、发育,最后完成细胞的培育。
实施例1:
在无菌条件下把1-3天龄SD大鼠乳鼠的心肌细胞按1×105/cm2密度接种在弹性膜305上,所述的弹性膜305采用硅橡胶膜,预培养3天后,将接种心肌细胞的弹性膜305放置在固定夹具304和滑动夹具306的“C”型主体结构309上,压片310外包裹有一层不锈钢金属网电极501,然后将压片310放置在弹性膜305上,用螺钉311将压片310压紧,从而固定弹性膜305。把固定有弹性膜305的固定夹具304和滑动夹具308放入细胞培养腔3的槽体303内,固定夹具304放置在左边,滑动夹具308放置在右边。再将细胞培养腔3放入细胞培养腔固定框架2中,通过固定螺杆302和滑动螺杆308固定细胞培养腔3。将10ml细胞培养液加入细胞培养腔3的槽体303内,加上盖子307。
将连接好的装置放入培养箱1中,以保证细胞生长对温度、湿度及二氧化碳的要求。分别将步进电机4的电源线和信号发生器5的电极线穿过培养箱1侧面的孔接入培养箱1内。步进电机4与细胞培养腔3的滑动螺杆308相连,步进电机4工作后通过滑动螺杆308,带动滑动夹具306,从而拉伸被夹具夹紧的弹性膜305,对弹性膜305上的心肌细胞加载牵张刺激。由细胞培养腔3内夹具中压片310的金属网电极501引出电极线,与信号发生器5的正、负极相连。打开调节好的步进电机4和信号发生器5的电源,使得牵张力刺激和电刺激联合作用于心肌细胞,使细胞在牵张载荷和电载荷双重刺激的环境下生长、发育,完成培养物的培育。
施加的牵张力刺激为动态牵张应变20%,频率为1Hz,电刺激为电脉冲信号,幅值为150mV,脉冲宽度为5ms,频率为1Hz,刺激时间为12h。
实施例2:
在无菌条件下把平滑肌细胞按1×105/cm2密度接种在弹性膜305上,所述的弹性膜305采用聚乳酸膜,细胞贴壁第二天,将接种人平滑肌细胞的弹性膜305放置在固定夹具304和滑动夹具306的“C”型主体结构309上,压片310外包裹有一层铂网电极501,然后将压片310放置在弹性膜305上,用螺钉311将压片310压紧,从而固定弹性膜305。把固定有弹性膜305的固定夹具304和滑动夹具308放入细胞培养腔3的槽体303内,固定夹具304放置在左边,滑动夹具308放置在右边。再将细胞培养腔3放入细胞培养腔固定框架2中,通过固定螺杆302和滑动螺杆308固定细胞培养腔3。将10ml细胞培养液加入细胞培养腔3的槽体303内,加上盖子307。
将连接好的装置放入培养箱1中,以保证细胞生长对温度、湿度及二氧化碳的要求。分别将步进电机4的电源线和信号发生器5的电极线穿过培养箱1侧面的孔接入培养箱1内。步进电机4与细胞培养腔3的滑动螺杆308相连,步进电机4工作后通过滑动螺杆308,带动滑动夹具306,从而拉伸被夹具夹紧的弹性膜305,对弹性膜305上的平滑肌细胞加载牵张刺激。由细胞培养腔3内夹具中压片310的金属网电极501引出电极线,与信号发生器5的正、负极相连。打开调节好的步进电机4和信号发生器5的电源,使得牵张力刺激和电刺激联合作用于平滑肌细胞,使细胞在牵张载荷和电载荷双重刺激的环境下生长、发育,完成培养物的培育。
施加的牵张力刺激为静态牵张应变10%,电刺激为恒电压,幅值为200mV,刺激时间为6h。
实施例3:
在无菌条件下把骨骼肌细胞按1×105/cm2密度接种在弹性膜305上,所述的弹性膜305采用可降解聚合物材料,如聚乳酸与聚乙醇酸按90~10∶10~90比例共聚的无规共聚物(PLGA),细胞贴壁第二天,将接种骨骼肌细胞的PLGA膜放置在固定夹具304和滑动夹具306的“C”型主体结构309上,压片310外包裹有一层不锈钢金属网电极501,然后将压片310放置在PLGA膜上,用螺钉311将压片310压紧,从而固定PLGA膜。把固定有PLGA膜的固定夹具304和滑动夹具308放入细胞培养腔槽3的槽体303内,固定夹具304放置在左边,滑动夹具308放置在右边。再将细胞培养腔3放入细胞培养腔固定框架2中,通过固定螺杆302和滑动螺杆308固定细胞培养腔。将10ml细胞培养液加入细胞培养腔3的槽体303内,加上盖子307。
将连接好的装置放入培养箱1中,以保证细胞生长对温度、湿度及二氧化碳的要求。分别将步进电机4的电源线和信号发生器5的电极线穿过培养箱1侧面的孔接入培养箱1内。步进电机4与细胞培养腔3的滑动螺杆308相连,步进电机4工作后通过滑动螺杆308,带动滑动夹具306,从而拉伸被夹具夹紧的PLGA膜,对PLGA膜上的骨骼肌细胞加载牵张刺激。由细胞培养腔3内夹具中压片310的金属网电极501引出电极线,与信号发生器5的正、负极相连。打开调节好的步进电机4和信号发生器5的电源,使得牵张力刺激和电刺激联合作用于骨骼肌细胞,使细胞在牵张载荷和电载荷双重刺激的环境下生长、发育,完成培养物的培育。
施加的牵张力刺激为动态牵张应变15%,频率为1Hz,电刺激为100μA恒电流,刺激时间为6h。
上述牵张力刺激、电刺激参数的设置,材料的改变是根据所培养的细胞特点不同进行选择的。
Claims (1)
1.一种牵张-电联合刺激细胞培养装置,其特征在于:包括培养箱、细胞培养腔固定框架、细胞培养腔、步进电机和信号发生器;
培养箱两侧分别设有一个与外界相通的孔道,培养箱内的步进电机与信号发生器的电源线分别通过孔道与各自的电源连接,培养箱为密封结构,培养箱提供细胞生长所需的二氧化碳、温度和湿度环境;
所述的细胞培养腔固定在细胞培养腔固定框架内部,细胞培养腔固定框架置于培养箱内,细胞培养腔包括固定螺杆、槽体、固定夹具、弹性膜、滑动夹具和滑动螺杆,所述的槽体的两端固定在细胞培养腔固定框架内,固定夹具、弹性膜和滑动夹具位于槽体内部,并且弹性膜的两端分别固定在固定夹具和滑动夹具上,固定夹具的另一端连接固定螺杆,固定螺杆通过固定螺母固定在细胞培养腔固定框架上;滑动夹具的另一端连接滑动螺杆,滑动螺杆穿过槽体与步进电机连接;所述的弹性膜上接种所需要培养的细胞;
细胞培养腔的槽体内设有两个金属电极,分别与信号发生器的正极、负极连接;
所述的细胞培养腔固定框架包括两个“C”型框架和两个“I”型框架,两个“C”型框架的开口相对向内,两个“C”型框架之间通过两个平行“I”型框架连接,形成封闭的框架结构,“C”型框架的开口用于固定细胞培养腔的槽体;
固定夹具和滑动夹具均包括“C”型主体结构和压片,“C”型主体结构的中空部分设有螺孔,弹性膜的两端通过压片分别固定在固定夹具和滑动夹具的“C”型主体结构的中空部分,压片和弹性膜之间通过螺钉压紧在固定夹具和滑动夹具上;
所述的槽体内部盛有细胞培养液,槽体上有盖子;
所述的槽体两端对应固定夹具和滑动夹具上螺孔的位置设有通孔,固定螺杆依次穿过固定夹具背部的螺孔、槽体的通孔和“C”型框架中的圆孔,与固定螺母连接;滑动螺杆依次穿过滑动夹具背部的螺孔、槽体的通孔和另一个“C”型框架中的圆孔,连接步进电机;
所述的弹性膜材料为下列中的一种:
(1)硅橡胶、凝胶、胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸或聚己内酯;
(2)聚乳酸与聚乙醇酸按(90~10)∶(10~90)比例共聚的无规共聚物;
(3)聚乳酸-壳聚糖、聚乳酸-胶原不同聚合物形成的复合材料;
所述步进电机带动滑动螺杆运动,进而带动滑动夹具牵引弹性膜产生牵张,所述的牵张是指频率为零的静态牵张或不同频率的动态牵张;
所述的槽体的金属电极安装方式为:在弹性膜两端的两个压片外分别包一层金属网,将两个金属网作为金属网电极,通过电极线将两个金属网电极分别与信号发生器的正极、负极相连,信号发生器产生电刺激,所述的电刺激产生的电场方向与步进电机牵张方向相同;
所述的金属电极为不锈钢电极或铂电极;
所述的信号发生器产生的电刺激为恒电压、脉冲电压或直流微电流。
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