JP4758314B2 - 骨格筋の培養用足場、同培養装置及び骨格筋の形成方法 - Google Patents
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Description
筋組織をアクチュエータとしてとらえるならば、従来の人工的なアクチュエータでは得ることのできないしなやかさ、フレキシビリティと、投入エネルギーに比し発生されるエネルギーが大きいという高効率性を有している。このため、再生医療、ロボット等の分野で、培養筋を用いたしなやかなアクチュエータが望まれている。
シャーレの中で筋芽細胞を培池全面に1層培養し、離して置いた対向する二つの固形物のまわりに培養した最初の1層の筋細胞シートをシャーレからはがして巻きつけて丸め、両端を縛ることにより棒状をした筋肉様のものが得られ、筋肉様のものに電気刺激を与えると筋肉のように収縮する。
培養容器内の培養液中に前記端部固定部を固定した前記培養用足場を浸漬する工程と、
前記培養用足場に骨格筋の筋芽細胞を播種することにより定着させる工程と、
前記端部固定部1と端部固定部2間に機械的外力を加えひもの軸方向に繰り返し伸縮させる機構により前記ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体のひもの軸方向に伸縮させることにより、ひもの軸に平行に骨格筋の筋芽細胞を配向させて筋原繊維を形成するように成長させる工程と
を有することを特徴とする。
請求項4記載の骨格筋の形成方法は、ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体からなる骨格筋の培養用足場の一の端部に端部固定部1を、他の端部に端部固定部2を、前記ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体を挟み込んで固定する工程と、
培養容器内の培養液中に前記端部固定部を固定した前記培養用足場を浸漬する工程と、
前記培養用足場に骨格筋の筋芽細胞を播種することにより定着させる工程と、
前記端部固定部1を前記培養容器に固定し、圧電材料を用いたバイモルフ型圧電素子の一端を前記端部固定部2に固定し、周期的電気信号を前記バイモルフに与えることにより、前記端部固定部1と前記端部固定部2の間の距離を伸縮させるように駆動させて、前記ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体をひもの軸方向に伸縮させることにより、ひもの軸に平行に骨格筋の筋芽細胞を配向させて筋原繊維を形成するように成長させる工程と
を有することを特徴とする。
本発明において骨格筋とは、動物の運動を目的とする筋肉をいう。筋芽細胞の由来の動物の種類はアクチュエータとして使えるものであれば限定されず、人間、哺乳類その他が挙げられる。
骨格筋は、細長い筋線維が束になって構成される。構成単位となる筋原線維は多くの核を有する一つの細長い細胞であって長軸方向にアクチミオシン構造を有している。 筋線維には2種類あり、ミトコンドリアに富んで酸素を利用した持続的な収縮の可能な遅筋(Type 1、赤筋)と、ミトコンドリアは比較的少なくピルビン酸による瞬発的な収縮の可能な速筋(Type 2、白筋)にわけられる。本発明の骨格筋は目的に応じ遅筋、速筋いずれでもよい。
機械的刺激を与えるためには、足場は少なくとも培養液中で一定の伸縮性を有することが必要である。伸縮性を有すれば一定方向に機械的刺激を与えて筋芽細胞を一定の方向に成長融合させることができるからである。
足場を伸縮させるためには、必ずしも足場の外からの外力によらず、足場が自己伸縮する、たとえば電歪性、化学的、電磁気的等による変形材料で作られていてもよい。そのような材料として電歪性樹脂等が挙げられる。
更に、バイモルフ型のような構造のものであれば、表面が伸長しその間裏面が弛緩し、電位を反転させることで表面が弛緩し裏面が伸長するように、面毎に伸縮させることができる。
足場材料としてはコラーゲン、セルロース等が伸縮性と細胞接着性を有し更に、生体適合性、製作容易性を併せ有するため好ましく、特にコラーゲンが好ましい。セルロースの場合は直線状の繊維では伸縮性が不足するため編まれたものが好ましい。足場材料は、強度を補強するため短繊維あるいは長繊維等が複合されたものであってもよい。
又、足場の形状は扁平又は網状であることが好ましい。扁平であれば筋芽細胞を播種する際に、筋芽細胞を含む培養液を足場上に散布する場合に、扁平面を上向きにしておくことにより、接着効率を上げることができるからである。
筋芽細胞は足場を覆って成長するが、網目状であれば裏面への回り込みが容易となるからである。
更に足場は管状であってもよい。管状であれば管内に筋芽細胞を播種、接着させることができ、扁平化させることも容易である。播種を管内部にも行うには管の外面に播種するのとは別途操作で管内壁にも播種してもよいし、播種時に管の上側表面に細胞が通過できる開口を設けておいてもよい。
培養装置は必要に応じ、筋の培養に通常必要とされる温度湿度制御装置、培養液供給、あるいは循環装置、無菌装置が用いられてもよい。
筋芽細胞が一方向に配向して筋繊維を形成するように成長させるためには、筋芽細胞の成長させたい方向に電場を形成する様、足場に電極が付着され、電極に電流を与える電源装置が付帯されていることが好ましい。
尚、再生用途等として骨格筋に血管を形成させやすくするため、繊維芽細胞を筋芽細胞播種時に一部混合または交互に播種してもよい。
(足場の作製)
コラーゲン溶液(組織培養用コラーゲン酸性溶液pH3.0)を用い、溶液中で電気泳動法を用いることにより、長軸状に伸びた直径約1mmのひも状コラーゲンゲルを作製した。
足場を支持するための端部固定部は樹脂で作製し、縦2mm×横1.5mm×高さ1.5mmmの直方体形状とし、2分割して足場を挟み込む構造とする。端部固定部の設計形状を模式図1に示す。図2は端部固定部を基部と上部に2分割した状態であり、互いに組み合わせることにより直方体のマイクロ構造物を形成する。中央にはひも状コラーゲンを固定するための突起を形成する。また構造物は空洞を有しており,軽量化とともに細胞の接着性向上を考慮した。図3は組み立てた状態を示しており、中央部の空洞部にひも状コラーゲンを挟み込み,突起でひも状コラーゲンを固定する構造を有している。
また両端部固定部の一部に穴を開け、プラチナワイヤーを差し込むことにより、電極を形成した。
端部固定部の作製はマイクロ光造形装置(D−MEC社製:商品名ACCULAS)を用いて行った。マイクロ構造物の3次元CADデータを作製し、そのデータを薄い断面体にスライスし等高線データに変換する。1スライス層を10μmと設定し、積層することにより構造物を作製した。光造形にはアクリル系感光樹脂を使用した。本マイクロ光造形装置はレーザー光の走査による光造形ではなく、画像パターンを直接縮小露光する方式であり、露光面の空間分解能(画素)は1.7μm角であり、高さ方向の分解能は1スライス層2〜10μmの積層が可能である。図4にマイクロ光造形装置を用いて作製した端部固定部の基部の写真を示す。端部固定部は両端用に2個作製した。固定部の底部は光造形の基板に対して前面ではなく一部のみ基板と接着させておくと、造形後またはコラーゲンを組み込み後容易に基板から取り外しが可能となり、足場への機械的刺激の付加を容易に行うことができる。
ひも状コラーゲンゲルの片端を上記基部と上部で挟み固定し、他端も同様に端部固定部を固定する。図5にひも状コラーゲンゲルの両側に端部固定部を装着した状態の写真を示す。マイクロ構造物中の突起物の組み合わせにより、コラーゲンゲルはマイクロ構造物と十分に固着されている。両端に固定部が固定された足場の端部固定部を含む構造物の全長は8mmであった。図6にひも状コラーゲンの集合体の両端部を端部固定部で固定したものの模式図を示す。図7にひも状コラーゲンの集合体の両端部を端部固定部で固定したものの写真を示す。
骨格筋の培養装置の模式図を図8に示す。シャーレを培養容器に用い、シャーレに一方の端部固定部1を接着固定できるようにした装置である。圧電材料を用いたバイモルフ型圧電素子の一端を固定し、もう一端を端部固定部2と固定し、バイモルフ型圧電素子に印加する電圧を制御することにより足場に機械的な応力を加えることができる。パルスッジェネレータにより電圧波形をパルスにすると急峻なパルス状の伸縮を加えることが可能になり、電圧波形をのこぎり状、正弦波状等にすると連続した繰り返しの伸縮を加えることができる。
さらに電気的刺激を加えることができるように、パルスジェネレータから両端部固定部に電気接続できるようになっている(図示省略)。
培養液中に浸漬した足場にratの大腿筋より抽出した筋芽細胞を培養液と共に液中で静かに放出することにより落下させ播種させた。バイモルフ型圧電素子に印加する電圧を制御することにより足場に機械的な応力を加えることができる。
播種時に足場の下に皿状の受け部を当てがい、播種後除去した。筋芽細胞の付着効率が向上した。
播種後一定時間経過した後にバイモルフ型圧電素子を駆動させて、伸縮を繰り返しながら、電気的刺激も併せ加えて培養した。一定時間の経過は細胞の播種を確実にするためのものであり、数分から2時間程度がよい。
2 端部固定部1
3 端部固定部2
4 シャーレ
11培養装置本体
12バイモルフ型圧電素子
13パルスジェネレータ
Claims (4)
- ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体の一端が端部固定部1で挟み固定され、他端が端部固定部2にて挟み固定されていることを特徴とする骨格筋の培養用足場。
- 筋芽細胞が播種された、ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体の一端が端部固定部1で挟み固定され、他端が端部固定部2にて挟み固定されている骨格筋の培養用足場と、同足場と培養液を収める容器と、前記端部固定部1と端部固定部2間に機械的外力を加えひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体のひもの軸方向に繰り返し伸縮させる機構とを備えることを特徴とする骨格筋の培養装置。
- ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体からなる骨格筋の培養用足場の一の端部に端部固定部1を、他の端部に端部固定部2を、前記ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体を挟み込んで固定する工程と、
培養容器内の培養液中に前記端部固定部を固定した前記培養用足場を浸漬する工程と、
前記培養用足場に骨格筋の筋芽細胞を播種することにより定着させる工程と、
前記端部固定部1と端部固定部2間に機械的外力を加えひもの軸方向に繰り返し伸縮させる機構により前記ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体のひもの軸方向に伸縮させることにより、ひもの軸に平行に骨格筋の筋芽細胞を配向させて筋原繊維を形成するように成長させる工程と
を有することを特徴とする骨格筋の形成方法。 - ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体からなる骨格筋の培養用足場の一の端部に端部固定部1を、他の端部に端部固定部2を、前記ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体を挟み込んで固定する工程と、
培養容器内の培養液中に前記端部固定部を固定した前記培養用足場を浸漬する工程と、
前記培養用足場に骨格筋の筋芽細胞を播種することにより定着させる工程と、
前記端部固定部1を前記培養容器に固定し、圧電材料を用いたバイモルフ型圧電素子の一端を前記端部固定部2に固定し、周期的電気信号を前記バイモルフに与えることにより、前記端部固定部1と前記端部固定部2の間の距離を伸縮させるように駆動させて、前記ひも状コラーゲンゲル又はひも状コラーゲンゲルの集合体をひもの軸方向に伸縮させることにより、ひもの軸に平行に骨格筋の筋芽細胞を配向させて筋原繊維を形成するように成長させる工程と
を有することを特徴とする骨格筋の形成方法。
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