KR101667431B1 - Ｆｍｏｃ-기재 가수분해성 링커의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 플루오렌 고리계의 9-히드록시메틸기에 대해 보호기를 사용하는 Fmoc (9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐)-기재 화합물의 신규 제조 방법을 제공한다. 이 화합물은 단백질 또는 펩티드 약물의 개질에 유용하다.

Description

ＦＭＯＣ-기재 가수분해성 링커의 제조 방법{METHOD FOR PREPARING FMOC-BASED HYDROLYSABLE LINKERS}
<관련 출원의 상호 참조>
본 출원은 2007년 6월 26일자 미국 가출원 제60/937,125호를 우선권 주장하며, 그의 전문을 본원에 참조인용한다.
본 발명은 단백질 및 펩티드 약물의 개질에 유용한 가수분해성 링커의 제조에 관한 것이다.
대부분의 단백질 또는 펩티드 약물은 수명이 짧고 흔히 생체내 순환 반감기가 짧다. 단백질 또는 펩티드 약물은 경구적으로 흡수되지 않음을 감안할 때, 치료적으로 활성인 약물을 순환계에 장기간 유지하는 것은 임상적 중요성이 자명한 바람직한 특성이다.
단백질 또는 펩티드 약물의 임상적 특성을 개선하기 위한 한 가지 매력적인 전략은 단백질 또는 펩티드 약물을 중합체로, 예를 들어 폴리알킬렌-옥시드[Roberts et al., Advan Drug Rev. 54, 459-476 (2002)] 또는 폴리시알산과 같은 다당류[Fernandes et al., Biochim Biophys Acta 1341, 26-34 (1997)], 덱스트란류 또는 히드록시 에틸 전분으로 개질하는 것이다. 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)에 의한 개질이 한동안 공지되었다. 그러나, PEG에 의한 단백질의 개질은 흔히 단백질 활성의 감소로 이어진다. 따라서, 가수분해성 또는 분해성 화학 링커를 사용하여 중합체의 단백질 또는 펩티드 약물에의 분리가능한 커플링을 허용하는 대체 시스템이 개발되었다 (US 6,515,100, US 7,122,189, WO 04/089280, WO 06/138572). 단백질-중합체 접합체는 전구 약물로서 간주될 수 있으며, 단백질의 활성은 제어된 방출 메커니즘을 통해 접합체로부터 방출될 수 있다. 이 개념을 사용하여, 약물의 약동학적 특성의 개선을 얻을 수 있다[Zhao et al., Bioconjugate Chem. 17, 341-351 (2006)]. 따라서, WO 04/089280에는 가수분해성 PEG-링커의 사용이 제안되어 있다. (명세서에 언급된 모든 문헌을 본원에 참조인용한다.)
문헌[Tsubery et al., J Biol Chem. 279, 38118-38124 (2004)]에는 Fmoc (9-플루오레닐메틸 카르바메이트) 기에 기초한 단백질의 유도체화를 위한 가수분해성 PEG-링커가 기재되어 있다. 플루오렌기가 말레이미도프로피온산 무수물 및 N-히드록시숙신이미드와 반응하고, 이것이 추가로 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 단백질과 그의 아미노기에 의해 반응한다. 그러나, MAL-FMS-OSU (9-히드록시메틸-2-(아미노-3-말레이미도-프로피오네이트)-7-술포 플루오렌 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트)라는 명칭의 가수분해성 링커의 합성은 낮은 수율 및 감소된 재현성이라는 문제가 있다. 상기 문헌[Tsubery et al.]에 따른 합성에 있어서의 주요 문제는 9-히드록시메틸-2-아미노 플루오렌과 말레이미도 프로피온산 무수물의 반응에 의한 말레이미드기의 도입이다. 이 단계에서, 9-위치의 OH기의 에스테르화 같은 원치 않는 부반응이 일어난다. 따라서, OH기의 보호를 위한 추가의 단계를 포함하는 개선된 합성이 개발되었다.
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물의 신규 합성 방법을 제공한다.
Figure 112010004677931-pct00001
식 중, PG는 보호기이고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 위치 중 적어도 하나는 라디칼 Y에 결합된다.
Y는 N-말레이미딜-잔기를 함유하는 라디칼이다.
라디칼 Y에 결합되는 것 외에, 화학식 1의 화합물은 임의로는 이용가능한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 위치 중 적어도 하나에서 라디칼 X에 결합될 수 있다.
X는 -SO3-R3이다.
R3은 수소, (C1-C8)-알킬 및 (C1-C8)-알킬-R4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
R4는 중합체이다.
본 발명의 화합물은 플루오렌 고리계의 9-히드록시메틸기에 대해 보호기를 사용하는 다단계 프로토콜에 따라 제조된다. 이 유도체를 추가로 개질하여 숙신이미딜 에스테르와 같은 활성화 에스테르를 생성할 수 있다.
본 발명은 보호기를 사용하여 화학식 1의 화합물 생성하는 합성에 의해 상기 문제를 극복할 수 있게 한다. 화학식 1의 화합물은 활성 말레이미드(MAL) 및 N-히드록시숙신이미드(OSU = NHS)기를 함유하는 MAL-FMS-OSU 및 기타 MAL-Fmoc-OSU-유도체와 같은 가수분해성 링커를 생성하는 이후 반응 단계에 적합한 전구체이며, 목적 생성물을 높은 수율 및 순도로 제공한다. 이 링커는 1종 이상의 중합체로 추가로 개질할 수 있고, 이어서 펩티드 또는 단백질 약물의 개질에 사용할 수 있다.
화학식 1의 화합물은 아미노-치환 플루오렌으로부터 출발하여 제조된다. 신규 합성 프로토콜은 하기 프로토콜의 단계 4에서 플루오렌의 9 위치의 히드록시메틸기에 보호기를 도입한다. 하기 합성 반응식은 일례로서 화학식 1의 화합물의 제조를 예시한다.
Figure 112010004677931-pct00002
Figure 112010004677931-pct00003
추가의 반응 단계들:
Figure 112010004677931-pct00004
단계 1:
제1 단계에서(상기 반응식 참조), 아미노-치환된 플루오렌의 아민기를, 예를 들어 BOC(tert-부틸옥시카르보닐)-무수물 등과의 반응에 의해 BOC기로 보호한다. 다른 적합한 아민용 보호기[Greene et al., Protective Groups in organic synthesis, John Wiley ＆ Sons, Inc., Third Edition, New York (1999)]를 사용할 수 있다. 추가의 예는 Z (벤질옥시카르보닐)기이다.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 위치에 하나 초과의 라디칼 Y를 갖는 화학식 1의 화합물을 합성하기 위해 다수의 아미노기로 치환된 플루오렌 유도체를 유사한 반응에 사용할 수 있다.
단계 2:
제2 단계에서, 예를 들어 NaH 또는 리튬디이소프로필아미드(LDA) 및 에틸 포르메이트 및 이어서 NaBH4, 또는 DIBAL(디이소부틸알루미늄 히드리드) 같은 다른 환원제와 MeOH 중에서 반응시켜, 플루오렌 코어의 9 위치에 히드록시메틸기를 도입한다.
단계 3:
제3 단계에서, 예를 들어 HClCF3COOH 또는 p-톨루올술폰산으로 BOC 보호기를 제거한다.
단계 4:
제4 단계에서, 예를 들어 tBDMS-Cl [Corey et al., J Am Chem Soc. 94, 6190-6191 (1972)] 또는 4,4'-트리메톡시트리틸클로리드와 같은 실릴 할로게니드와 반응시켜, 9-히드록시메틸기를 보호한다.
한 실시양태에서, 실릴 할로게니드는 tBDMS-Cl (tert-부틸디메틸실릴 클로리드)이다. 바람직하게는, tBDMS-Cl과의 반응은 DMF(디메틸포름아미드) 중에서 이미다졸과 함께 수행한다. 실릴 보호기의 사용에 의해 분자는 더욱 친유성이 되므로, 하나 초과의 라디칼 Y에 결합되는 화합물의 제조가 촉진된다.
단계 5:
제5 단계에서, 예를 들어 아미노기를 말레이미도알킬산 또는 말레이미도알킬산 무수물과 반응시켜, N-말레이미딜 잔기를 도입한다.
말레이미딜기는 티올기에 대해 반응성이다. 따라서, PEG-SH와 같은 개질 중합체는 가수분해성 링커에 공유결합되어 중합체로 개질된 가수분해성 링커를 생성할 수 있다.
단계 6:
이 선택적 단계에서, 라디칼 X (-SO3R3)를 플루오렌 고리계에 도입한다. 이 산성 기에 의해 화합물은 더욱 친수성이 되어, 이후 커플링 반응을 수성 용매 중에서 수행할 수 있게 한다. 또한, 술폰산기는 중합체의 OH기와의 에스테르화에 의한 제2 중합체의 커플링을 가능하게 한다.
이 절차는 라디칼 X를 도입하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 위치에 라디칼 Y를 포함할뿐 아니라 이용가능한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 위치 중 적어도 하나에 라디칼 X를 포함하는 화학식 1의 화합물을 생성할 수 있게 한다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 라디칼 X는 2, 4, 5, 및/또는 7 위치에 결합된다. 다른 실시양태에서, 라디칼 X는 7 위치에 결합된다.
다른 실시양태에서, 라디칼 X (-SO3R3)는 단계 4 후에 플루오렌 고리계에 도입된다. -SO3R3이 -SO3H일 경우, -SO3H기는 에스테르화에 의해 보호될 수 있다.
추가의 반응 단계들:
말레이미도알킬산과 축합시킨 후, 9-히드록시메틸에서 보호기(PG)를 제거함으로써 탈보호시켜 하기 화학식 2의 화합물을 생성한다. 탈보호는 바람직하게는 BF3, 예를 들어 BF3·Et2O (보론 트리플루오리드 에테레이트)로 수행한다.
Figure 112010004677931-pct00005
MAL-FMS-OSU 또는 그의 유도체는 화학식 2의 화합물을 N-히드록시숙신이미드 또는 그의 유도체, 예컨대 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트와 반응시켜 합성할 수 있다. 숙신이미딜에스테르의 형성을 위한 반응 조건은 당업계에 주지되어 있다. 숙신이미딜-개질된 화학식 2의 화합물을 SH-중합체와 반응시켜 추가로 개질한 후 펩티드 또는 단백질 약물의 아미노기와 반응시켜, 중합체를 함유하는 가수분해성 링커를 갖는 펩티드 또는 단백질 약물의 접합체를 생성할 수 있다.
상기 예시된 프로토콜은 화학식 1의 화합물을 생성한다.
<화학식 1>
Figure 112010004677931-pct00006
식 중, PG는 보호기이고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 위치 중 적어도 하나는 라디칼 Y에 결합된다.
Y는 N-말레이미딜-함유 잔기이다.
적어도 하나의 라디칼 Y로 치환된 화학식 1의 화합물은 또한 이용가능한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 위치 중 적어도 하나에서 라디칼 X에 결합될 수 있다.
X는 -SO3-R3이다.
R3은 독립적으로 수소, (C1-C8)-알킬 및 (C1-C8)-알킬-R4로 이루어진 군으로부터 선택된다. "C1-C8-알킬"은 탄소 원자 1 내지 8개를 갖는 1가 알킬기를 가리킨다. 이 용어는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 헥실 등과 같은 기로 예시된다. 선형 및 분지형 알킬이 포함된다.
R4는 중합체이다. 중합체의 예는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리시알산(PSA), 히드록시알킬 전분(HAS) 등이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 PG가 실릴기인 화학식 1의 화합물에 관한 것이다. 실릴기의 예는 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, 또는 t-부틸디페닐실릴이다. 다른 실시양태에서, PG는 tert-부틸디메틸실릴기이다.
한 실시양태에서, Y는
Figure 112010004677931-pct00007
이고,
R1은 각각 독립적으로 (C1-C8)-알킬이다.
한 실시양태에서, R1은 각각 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 및 헥실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
R2는 독립적으로 -C(O)NR-, -C(O)NR-(C1-C8)-알킬-NR-, -NRC(O)- 및 -NRC(O)-(C1-C8)-알킬-NR (여기에서, R은 독립적으로 수소 또는 (C1-C8)-알킬임)로 이루어진 군에서 선택된다.
한 실시양태에서, R2는 -C(O)NH-이다.
다른 실시양태에서, R2는 -NHC(O)-이다.
한 실시양태에서, 화학식 1의 화합물은 1, 2, 3, 또는 4 위치 중 적어도 하나에서 라디칼 Y에 결합된다.
다른 실시양태에서, 화학식 1의 화합물은 1, 2, 3, 또는 4 위치 중 적어도 하나에서 라디칼 Y에 결합되며, 추가로 5, 6, 7, 또는 8 위치 중 적어도 하나에서 라디칼 X에 결합된다.
또 다른 실시양태에서, 화학식 1의 화합물은 2 또는 3 위치 중 적어도 하나에서 적어도 하나의 라디칼 Y로 치환되고, 추가로 7 또는 8 위치 중 적어도 하나에서 라디칼 X에 결합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 화학식 1의 화합물은 적어도 하나의 라디칼 Y로 치환되며, 라디칼 X는 7 위치에 결합된다.
또 다른 실시양태에서, 화학식 1의 화합물은 2 및 7 위치에서 라디칼 Y에 결합된다.
또 다른 실시양태에서, 화학식 1의 화합물은 2 및 7 위치에서 각각 라디칼 Y 및 라디칼 X에 결합된다.
또 다른 실시양태에서, 화학식 1의 화합물은 하기와 같다:
Figure 112010004677931-pct00008
Figure 112010004677931-pct00009
Figure 112010004677931-pct00010
본 발명을 하기 실시예에 의해 설명하겠다(본 발명은 실시예로 국한되지 않음).
<실시예>
MAL-Fmoc-OSu 분자는 하기 프로토콜(실시예 1 내지 8)에 따라 합성할 수 있다.
실시예 1: 2-( Boc -아미노) 플루오렌 의 합성 [Albericio et al., Synth Commun. 31, 225-32 (2001)]
Figure 112010004677931-pct00011
2-아미노플루오렌 (14.4 g, 79.7 mmol)의 현탁액을, 빙욕으로 냉각시킨 145 ㎖의 디옥산-H2O (2:1 / V:V)과 42.5 ㎖의 2 N NaOH의 혼합물 내에서 천천히 교반하여 제조하였다. 이어서, Boc2O (19.1 g, 87.7 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 25℃에서 교반을 계속하였다. 이어서, 반응이 발생한 후 TLC [2-(Boc-아미노) 플루오렌에 대한 Rf = 0.75, CHCl3-MeOH-HOAc (95:5:3)]하고, 2 N NaOH를 첨가하여 pH를 9 내지 10으로 유지하였다. 24 시간 후, TLC 분석은 2-아미노플루오렌[Rf = 0.60; CHCl3-MeOH-HOAc (95:5:3)]의 존재를 나타냈으며, 따라서 추가로 5.2 g의 Boc2O (23.8 mmol, 0.3 당량)를 첨가하고, 출발 생성물이 완전히 사라질 때까지 추가의 3 시간 동안 반응을 계속하였다. 현탁액을 1 M KHSO4로 pH 3으로 산성화시켰다. 고체를 여과하고 차가운 H2O 30 ㎖, 디옥산-H2O (2:1) 30 ㎖, 헥산 30 ㎖로 세정하고 진공건조하였다. 생성물은 옅은 황색 분말(30.1 g, 90％ 수율)로서 TLC에 의해 순수한 것으로 나타났으며[Rf = 0.75; CHCl3/MeOH/HOAc 95:5:3], NMR에 의해 분석하였다.
Figure 112010004677931-pct00012
실시예 2: 9- 히드록시메틸 -2-( Boc -아미노) 플루오렌 의 합성 [Albericio et al., Synth Commun. 31, 225-32 (2001)]
Figure 112010004677931-pct00013
140 ㎖의 건조 THF(나트륨으로부터 새로 증류함) 중의 2-(Boc-아미노) 플루오렌(13.49 g, 47.9 mmol)의 용액을 아르곤 분위기하에 20 ㎖의 건조 THF 중의 60％ NaH 6.3 g (160 mmol, 3.3 당량)의 현탁액에 조심스럽게 첨가하였다. 기체 발생 및 자발적 가온이 관찰되었다. 2-(Boc-아미노) 플루오렌을 모두 첨가한 후에, 반응 혼합물을 40℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 9.7 ㎖의 에틸 포르메이트 (120 mmol, 2.5 당량)를 격렬한 수소 버블링을 피하기 위해 서서히 첨가하였다. 처음엔 걸쭉하고 밝은 갈색이었던 현탁액은 에틸 포르메이트를 첨가하자 신속하게 짙은 갈색 용액으로 투명해졌고, 이를 1 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응이 발생한 후, TLC [중간 생성물에 대한 Rf = 0.52, CHCl3-MeOH-HOAc (95:5:3)]하였다. 반응을 얼음 칩 및 100 ㎖의 H2O로 급냉시키고, 회전 증발에 의해 유기 용매를 제거하였다. 수성 상에 10 ㎖의 2 N NaOH를 첨가하고, 이를 3 × 50 ㎖의 디에틸에테르로 세정하고, 빙욕에서 냉각시키고, 25 ㎖의 빙초산(glacial HOAc)으로 pH 5까지 산성화시켰다. 이때 나타난 회백색 침전물을 300 ㎖의 EtOAc에 용해시켰다. 수성 상을 50 ㎖의 EtOAc로 추출하고, 유기 상을 2 × 75 ㎖의 포화 NaHCO3 및 1 × 75 ㎖의 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 제거하였다.
9-포르밀-2-(Boc-아미노) 플루오렌을 100 ㎖의 메탄올 중에 현탁시키고, 2.0 g의 NaBH4 [52.9 mmol, 출발 2-(Boc-아미노) 플루오렌에 대해 1.1 당량]를 조금씩 나누어 첨가하였다. 빠르게 투명해진 현탁액을, 출발 생성물이 사라질 때까지 실온에서 4 시간 동안 자석으로 교반하였다 [TLC, Rf = 0.57, PE:MTBE (1:2)]. 반응 혼합물을 300 ㎖의 H2O로 희석하고, 15 ㎖의 빙초산으로 pH 5.0로 산성화하고, 침전물을 150 ㎖의 EtOAc에 직접 용해시켰다. 유기 상을 3 × 50 ㎖ 포화 NaHCO3 및 1 × 50 ㎖ 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 회전 증발시켜 고체를 얻었으며, 이것은 추가 정제 없이 사용될 수 있었다. 생성물을 NMR로 분석하였다(13.1 g, 88％ 수율).
Figure 112010004677931-pct00014
실시예 3: 9- 히드록시메틸 -2-아미노 플루오렌의 합성
Figure 112010004677931-pct00015
13.0 g의 9-히드록시메틸-2-(Boc-아미노) 플루오렌을 110 ㎖의 아세토니트릴에 용해시키고, 환류하에 교반하였다. 42 ㎖의 2 N HCl (2.0 당량, 84 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 45 분 동안 환류하에 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 반응을 TLC로 모니터링하였다 [Rf = 0.1, PE-MTBE (1:2)]. 용매를 회전 증발에 의해 부분적으로 제거하고, 잔류물을 70 ㎖의 2 N HCl에 용해시켰다. 용액을 2 × 50 ㎖ MTBE로 조심스럽게 세정하였다. 수성 상을 Na2CO3에 의해 pH 9로 조정하고, 2 × 70 ㎖의 EtOAc로 추출하였다. 유기 상을 50 ㎖의 염수로 세정하고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하였다. 생성물을 추가의 정제 없이 사용하였다. 구조의 동일성은 NMR로 확인하였다 (8.76 g, 99％ 수율).
Figure 112010004677931-pct00016
실시예 4: tert - 부틸디메틸실록시 -9- 메틸 -2- 아미노플루오렌의 합성
Figure 112010004677931-pct00017
5.91 g의 이미다졸(86.8 mmol, 2.1 당량)을 24 ㎖의 건조 DMF에 용해시키고, 아르곤 분위기하의 빙욕에서 10 분 동안 교반하였다. 건조 DMF에 용해된 7.47 g의 tert-부틸디메틸실릴 클로리드 (49.6 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 얼음 상에서 15 분 동안 교반한 후, 40 ㎖의 건조 DMF에 용해된 8.73 g의 9-히드록시메틸-2-아미노 플루오렌 (41.3 mmol)을 냉각 및 아르곤 분위기하에서 적가하였다. 반응을 15 분 동안 얼음 상에서 및 이어서 실온에서 계속하였다. 반응을 TLC로 모니터링하였다 [표제 생성물 Rf = 0.6, PE-MTBE (1:2)]. 2 시간 후, 출발 생성물 [Rf = 0.1, PE-MTBE (1:2)]은 사라졌고, 반응 혼합물을 400 ㎖의 CH2Cl2로 희석하고 100 ㎖의 5％ NaHCO3를 첨가하였다. 유기 상을 5 × 200 ㎖의 H2O로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. CH2Cl2를 회전 증발에 의해 제거하고, DMF를 톨루엔과의 공비증류에 의해 제거하였다. 잔류하는 갈색 오일 (13.4 g, 99％ 수율)을 NMR로 분석하고 추가의 정제 없이 사용하였다.
Figure 112010004677931-pct00018
실시예 5: tert - 부틸디메틸실록시 -9- 메틸 -2-(아미노-3- 말레이미도프로피오네 이트) 플루오렌의 합성
Figure 112010004677931-pct00019
건조 THF (나트륨으로부터 새로 증류함) 중 13.5 g의 9-tert-부틸디메틸실록시메틸-2-아미노플루오렌(41.5 mmol)의 용액에 9.42 g의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(75.7 mmol, 1.1 당량) 및 651 mg의 1-히드록시벤조트리아졸(4.8 mmol, 0.1 당량)을 첨가하였다. 13.5 g (41.5 mmol, 1.1 당량)의 3-말레이미도프로피온산을 50 ㎖의 건조 THF에 용해시키고 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기하에 밤새 교반하고, 생성물 형성을 TLC로 모니터링하였다 [출발 물질 Rf = 0.6, 표제 생성물 Rf = 0.18, PE-MTBE (1:2)].
출발 물질을 검출할 수 없게 되었을 때 곧바로 디시클로헥실우레아를 여과 제거하고, THF를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔류하는 고체를 200 ㎖의 CH2Cl2에 용해시키고, 50 ㎖의 5％ NaHCO3 및 50 ㎖의 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 갈색 결정을 20 ㎖의 MTBE 중에 분쇄하였다. 잔류물을 여과한 후 세정 용액이 무색으로 유지될 때까지 소량의 MTBE로 여러번 세정하였다. 황색 결정(10.5 g, 53％ 수율)을 NMR로 분석하였다.
Figure 112010004677931-pct00020
실시예 6: 9- 히드록시메틸 -2-(아미노-3- 말레이미도프로피오네이트 ) 플루오렌의 합성
Figure 112010004677931-pct00021
10.3 g의 tert-부틸디메틸실록시-9-메틸-2-(아미노-3-말레이미도프로피오네이트) 플루오렌 (21.6 mmol)을 230 ㎖의 CH2Cl2에 아르곤 분위기하에서 용해시켰다. 35 ㎖의 보론 트리플루오리드 에테레이트를 30 분 동안 적가하였다. 반응을 TLC로 모니터링하였다[출발 물질 Rf = 0.6, 표제 생성물 Rf = 0.38, CH2Cl2-메탄올(10:1)]. 출발 물질이 사라진 후 곧바로 용액을 포화 NaHCO3 용액으로 가수분해하였다. 생성된 결정을 여과하였다. 모액의 유기 상을 증발시켰다. 이 잔류물 및 필터 케이크를 250 ㎖의 EtOAc 및 120 ㎖의 5％ NaHCO3에 재용해시켰다. 유기 상을 1 × 50 ㎖의 5％ NaHCO3, 50 ㎖의 H2O, 및 50 ㎖의 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하였다. 생성물의 구조를 NMR 및 질량 분광 분석법으로 확인하였다.
Figure 112010004677931-pct00022
Figure 112010004677931-pct00023
실시예 7: 9- 히드록시메틸 -2-(아미노-3- 말레이미도프로피오네이트) 플루오렌 N-히 드록시숙신이미 딜 카르보네이트의 합성
Figure 112010004677931-pct00024
7.3 ㎖의 무수 THF 중 1.8 g의 피리딘의 용액으로부터 1.7 ㎖(5.1 mmol)를 교반되는 75 ㎖의 건조 THF (나트륨으로부터 새로 증류함) 중 0.93 g의 9-히드록시메틸-2-(아미노-3-말레이미도프로피오네이트) 플루오렌 (2.6 mmol) 및 1.1 g 트리포스겐 (3.6 mmol, 1.4 당량)의 용액에 적가하였다. 40 분 후, 침전된 피리딘 히드로클로리드 염을 셀라이트 상에서 여과해 내고, THF를 회전 증발에 의해 제거하였다. 얻어진 오일을 75 ㎖의 건조 테트라히드로푸란 중에 1.1 g의 N-히드록시숙신이미드 (13.6 mmol, 5.3 당량)와 함께 용해시켰다. 이어서, 2.6 ㎖의 피리딘 용액 (8.2 mmol)을 첨가하고, 용액을 40 분 동안 교반하였다. 추가로 침전된 약간의 피리딘 히드로클로리드 염을 셀라이트 상에서 여과해 내고, THF를 회전 증발에 의해 제거하였다. 얻어진 오일을 70 ㎖의 클로로포름에 용해시키고, 4 × 40 ㎖의 0.1 N HCl, 3 × 50 ㎖의 수성 5％ NaHCO3 용액에 이어 1 × 40 ㎖의 물, 40 ㎖의 염수로 세정한 후, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 클로로포름을 회전 증발에 의해 제거하였다. 구조적 동일성을 NMR 및 질량 분광 분석법에 의해 확인하였다.
Figure 112010004677931-pct00025
Figure 112010004677931-pct00026
실시예 8: 9- 히드록시메틸 -2-(아미노-3- 말레이미도프로피오네이트 )-7- 술포 플루오렌 N- 히드록시숙신이미딜 카르보네이트의 합성
Figure 112010004677931-pct00027
60 ㎖의 트리플루오로아세트산 중 1.2 g의 9-히드록시메틸-2-(아미노-3-말레이미도프로피오네이트) 플루오렌 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트(2.1 mmol)의 용액에 7 ㎖의 클로로술폰산을 첨가하였다. 30 분 후, 반응 혼합물을 4℃로 냉각시키고, 350 ㎖의 차가운 디에틸에테르를 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과하고, 디에틸에테르로 두 번 세정하고, 진공 건조시켰다.
구조적 동일성은 질량 분광 분석법으로 확인하였다.
ESI-MS (실측치): (M+H)+: 583.9
ESI-MS (계산치): (M+H)+: 583
2,7-디아미노플루오렌으로부터 출발하는 MAL2-Fmoc-OSu의 합성을 실시예 9에 예시한다.
실시예 9: 9- 히드록시메틸 -2,7-디-(아미노-3- 말레이미도프로피오네이트) 플루오렌 N- 히드록시숙신이미딜 카르보네이트의 합성
Figure 112010004677931-pct00028
9-히드록시메틸-2,7-디-(아미노-3-말레이미도프로피오네이트) 플루오렌 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트를 실시예 1 내지 8에 기재된 바와 같은 조건에서 제조하였다. 문헌[Albericio et al., Synth Commun. 31, 225-32 (2001)]에 의해 기재된 바와 같이 2,7-디아미노플루오렌의 아미노기를 BOC2O로 보호하였다. 이어서, 리튬디이소프로필아미드(LDA) 및 에틸 포르메이트와의 반응에 의해 포르밀기를 9 위치에 도입하였다. 얻어진 알데히드를 나트륨 보로히드리드에 의해 상응하는 알콜로 환원시켜 9-히드록시메틸-2,7-디-(Boc-아미노) 플루오렌을 형성하였다. 이어서, BOC 보호기를 CH3CN 중 2 N HCl로 제거하고, 9-히드록시메틸-2,7-디아미노플루오렌을 얻었다. 이어서, 실시예 5에 기재된 바와 같이 tert-부틸디메틸실릴클로리드와의 반응에 의해 OH기를 보호하여 tert-부틸디메틸실록시-9-메틸-2,7-디아미노플루오렌을 형성하였다. 이어서, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 및 히드록시벤조트리아졸의 존재하에서 자유 아미노기와 말레이미도프로피온산의 반응을 수행하여, tert-부틸디메틸실록시-9-메틸-2,7-디-(아미노-3-말레이미도프로피오네이트) 플루오렌을 얻었다. 보론 트리플루오리드 에테레이트에 의해 9 위치의 OH기를 탈보호한 후에, 9-히드록시메틸-2,7-디-(아미노-3-말레이미도프로피오네이트) 플루오렌이 형성되었다. 마지막으로, 트리포스겐 및 N-히드록시숙신이미드와의 반응을 실시하여, 9-히드록시메틸-2,7-디-(아미노-3-말레이미도프로피오네이트) 플루오렌 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트를 제조하였다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 2의 화합물의 9-히드록시메틸기를 PG를 도입하는 실릴 보호 시약과 반응시키는 단계, 및 이어서 이 화합물을 N-말레이미딜 시약과 반응시켜 하기 화학식 1의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1의 화합물의 제조 방법.
    <화학식 1>
    Figure 712015001290019-pct00029

    식 중, O-PG는 실릴 에테르이고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 위치 중 적어도 하나는 라디칼 Y에 결합되고;
    Y는
    Figure 712015001290019-pct00033
    구조를 갖는 N-말레이미딜-잔기를 함유하는 라디칼이고;
    R1은 (C1-C8)-알킬이고;
    R2는 -NRC(O)- 및 -NRC(O)-(C1-C8)-알킬-NR- (여기에서, R은 독립적으로 수소 또는 (C1-C8)-알킬임)로 이루어진 군에서 선택되고;
    X는 7 위치에 임의로 결합되는 -SO3-R3이고;
    R3은 독립적으로 수소, (C1-C8)-알킬 및 (C1-C8)-알킬-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는 중합체이다.
    <화학식 2>
    Figure 712015001290019-pct00030

    식 중, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 위치 중 적어도 하나는 아민에 결합된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 실릴 보호 시약이 실릴 할라이드인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 실릴 할라이드가 tert-부틸디메틸실릴 클로리드 (tBDMS-Cl)인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 tBDMS-Cl과의 반응을 디메틸포름아미드 (DMF) 중에서 이미다졸과 함께 수행하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 N-말레이미딜 시약이 말레이미도알킬산인 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제3항에 있어서, 7 위치에 라디칼 X가 결합되는 방법.
  9. 삭제
  10. 하기 화학식 1의 화합물.
    <화학식 1>
    Figure 712015001290019-pct00032

    식 중, O-PG는 실릴 에테르이고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 위치 중 적어도 하나는 라디칼 Y에 결합되고; 라디칼 X는 7 위치에 임의로 결합되고;
    Y는
    Figure 712015001290019-pct00034
    구조를 갖는 N-말레이미딜-함유 잔기이고;
    X는 -SO3-R3이고;
    R3은 독립적으로 수소, (C1-C8)-알킬 및 (C1-C8)-알킬-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산(PSA) 또는 히드록시알킬 전분(HAS)이고;
    R1은 (C1-C8)-알킬이고;
    R2는 독립적으로 -NRC(O)- 및 -NRC(O)-(C1-C8)-알킬-NR- (여기에서, R은 수소 또는 (C1-C8)-알킬임)로 이루어진 군에서 선택된다.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서, O-PG가 t-부틸디메틸실릴 에테르인 화합물.
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