KR101650054B1 - 생물 시료를 그대로의 모습으로 관찰하기 위한 전자 현미경에 의한 관찰 방법과 그것에 사용되는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물, 주사형 전자 현미경, 및 투과형 전자 현미경 - Google Patents

생물 시료를 그대로의 모습으로 관찰하기 위한 전자 현미경에 의한 관찰 방법과 그것에 사용되는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물, 주사형 전자 현미경, 및 투과형 전자 현미경 Download PDF

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히로시 스즈키
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이사오 오타
마사츠구 시로무라
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고쿠리츠켄큐카이하츠호진 카가쿠기쥬츠신코키코
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Abstract

전자 현미경을 사용해서 생물 시료를 살아있는 채로 관찰할 수 있고, 움직이고 있는 모양을 관찰할 수 있는 전자 현미경에 의한 관찰 방법과 그것에 사용되는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물, 주사형 전자 현미경 및 투과형 전자 현미경을 제공한다. 본 발명의 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법은 양친매성 화합물, 유지류 및 이온 액체로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 증발 억제용 조성물을 시료의 표면에 적용해서 박막을 형성하여 이 시료를 박막으로 덮는 공정과, 진공 하의 시료실에 수용된 이 박막으로 덮은 시료의 전자 현미경상을 표시 장치에 표시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

Description

생물 시료를 그대로의 모습으로 관찰하기 위한 전자 현미경에 의한 관찰 방법과 그것에 사용되는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물, 주사형 전자 현미경, 및 투과형 전자 현미경{ELECTRON-MICROSCOPIC EXAMINATION METHOD FOR EXAMINING BIOSAMPLE WHILE KEEPING SAID BIOSAMPLE UNCHANGED, AND COMPOSITION FOR EVAPORATION INHIBITION UNDER VACUUM, SCANNING ELECTRON MICROSCOPE, AND TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE FOR USE IN SAID METHOD}
본 발명은 주사형 전자 현미경이나 투과형 전자 현미경 등에 있어서 생물 시료를 그대로의 모습으로 관찰하기 위한 전자 현미경에 의한 관찰 방법과 그것에 사용되는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물, 주사형 전자 현미경, 및 투과형 전자 현미경에 관한 것이다.
주사형 전자 현미경 및 투과형 전자 현미경으로 시료의 관찰을 행하기 위해서는 시료를 진공 하에 두는 점에서 시료의 내진공성과, 상을 얻기 위해서 필요한 도전성의 부여가 필요하다.
주사형 전자 현미경의 시료의 조제는 시료를 미리 진공 건조함으로써 수분을 제거한 후에 도전성을 부여하여 2차 전자의 발생 효율을 높이기 위해서 도전 재료(백금, 탄소, 금, 팔라듐, 오스뮴 등)을 증착, 스퍼터링 등의 수단으로 시료의 표면에 코팅해서 행해진다.
금속이나 반도체 등과 같이 도전성을 갖고, 내진공성이 있는 것은 이러한 전처리는 필요로 하지 않지만 도전성이 없는 것은 도전성 재료에 도전막 코팅이 필요하다. 또한, 내진공성 등이 뒤떨어지는 것, 즉 진공 건조나 전자 현미경 관찰 시의 진공 중에서 전자빔 조사에 의해 변형되는 경우에도 도전성 재료에 의한 도전막 코팅이 필요하다.
생물/생체 시료는 대량의 수분을 포함하기 때문에 미리 진공 건조를 요하는 경우가 많다. 이 때문에 표면의 형상이 현저하게 변형되어 버리는 경우도 있어 살아있는 상태를 그대로의 상태에서 전자 현미경 관찰하는 것은 곤란했다.
겔상 물질, 식품 등의 습윤 시료의 함수 상태는 저진공 SEM이나 크라이오 SEM, 환경 제어형 SEM(ESEM) 등을 사용해서 상온에서의 관찰이 가능하다. 이들 방법에 의하면 습윤 시료에 한정되지 않고, 시료를 미처리인 채로 관찰 가능하다. 그러나, 고배율로의 관찰을 행하기 위해서는 고진공으로 할 필요가 있고, 시료의 내진공성 또는 도전성이 필요해진다. 그 때문에 생물/생체 시료의 관찰에 있어서도 살아있는 상태 그대로의 고배율로의 상을 얻는 것은 곤란했다.
최근에는 이온 액체를 사용한 전자 현미경 관찰 방법이 제안되고 있다. 특허문헌 1 및 비특허문헌 2에는 이온 액체를 사용해서 젖은 시료를 SEM 관찰한 것이 기재되어 있다. 세포로의 응용에 대해서도 비특허문헌 2에 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 2에는 이온 액체의 기술을 투과형 전자 현미경 관찰에 사용하는 방법이 개시되어 있다.
국제 공개 WO 2007/083756호 팜플렛 일본 특허 공개 2009-266741호 공보
Langmuir, 2011, 27, 9671-9675 Microsc. Res. Tech. 2011, 74, 415-420
그러나, 환경 SEM을 사용하는 관찰이나 상기 각 문헌에 의한 방법에서도 시료 그대로의 상태를 직접 고배율로의 전자 현미경상을 얻는 것은 되어 있지 않다. 그리고 생물/생체 시료에 관해서는 살아있는 그대로의 상태를 살아있는 채로 전자 현미경 관찰하는 것은 달성되어 있지 않다.
즉, 생물 시료에 있어서는 살아있는 채의 생물 시료가 움직이고 있는 모양의 전자 현미경 관찰을 행하는 것은 달성되어 있지 않다.
또한, 전자 현미경으로의 관찰 후 회수한 시료가 성장을 계속하는 것이나, 계속해서 산다고 할 수는 없었다. 즉, 생환을 하는 전자 현미경 관찰은 불가능하다고 여겨지고 있었다.
전자 현미경의 측정 환경은 진공 상태이기 때문에 시료는 극도의 건조 상태에 놓인다. 이 때문에 시료는 변형이나 변질이 일어나 살아있는 그대로의 상태에 가까운 상태를 관찰할 수 없다.
또한, 함수 시료에 있어서는 진공 하에 놓였을 때에 순식간에 동결되어버려 시료의 빙정에 의해 변형이나 변질이 일어나 원래 상태에 가까운 상태를 관찰할 수 없다.
생물 시료에 있어서는 진공 하에 놓이기 때문에 외계로부터 산소 공급이 끊겨 산소 부족 상태에 빠진다. 또한, 건조 상태에 놓이기 때문에 건어물과 같이 되어버려(오징어가 건오징어처럼 되어버린다) 생물 시료를 살아있는 그대로의 상태로 전자 현미경의 경체 내에 넣는 것은 어렵다.
건조 상태를 견딜 수 있는 생물이어도 생체 내에 포함되는 물이 얼어버리는 점에서 움직이고 있는 상태를 관찰하기 전에 또는 관찰 중에 죽어버린다.
전자 현미경에서의 관찰을 행하기 위해서 전자빔을 조사하지만 이 전자빔의 조사에 의한 전기적인 요인이나 열적인 요인 등에 의해 변형, 변성을 초래하지 않고, 생물 시료를 살아있는 그대로의 상태로 전자 현미경상을 얻는 것이 필요하다.
배리어성능에 관해서는 지금까지 유기물, 무기물, 유기/무기 하이브리드 소재를 사용해서 시료를 스핀코트, 증착, 도포하는 등의 수단에 의해 시료 표면에 막을 제작하여 배리어성능을 부여하는 기술은 제안되어 있지만, 이러한 배리어성능을 전자 현미경의 시료 제작에 응용하는 예는 지금까지 없다.
본 발명은 이상과 같은 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 진공 하에 있어서도 시료를 변형시키지 않고 시료 자체의 상태를 손상하는 것을 억제할 수 있다, 전자 현미경에 의한 관찰 방법과 그것에 사용되는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물, 주사형 전자 현미경, 및 투과형 전자 현미경을 제공하는 것을 과제로 하고 있다.
또한, 전자 현미경을 사용해서 생물 시료를 살아있는 채로 관찰할 수 있고, 움직이고 있는 모양을 관찰할 수 있는 전자 현미경에 의한 관찰 방법과 그것에 사용되는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물, 주사형 전자 현미경, 및 투과형 전자 현미경을 제공하는 것을 과제로 하고 있다.
상기 과제를 해결하기 위해서 본 발명의 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법은 양친매성 화합물, 유지류 및 이온 액체로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 증발 억제용 조성물을 시료의 표면에 적용해서 박막을 형성하여 이 시료를 박막으로 덮는 공정과, 진공 하의 시료실에 수용된 이 박막으로 덮은 시료의 전자 현미경상을 표시 장치에 표시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
또한, 본 발명의 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법은 양친매성 화합물, 유지류 및 이온 액체로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 증발 억제용 조성물을 시료의 표면에 적용하는 공정과, 증발 억제용 조성물을 적용한 시료에 전자선 또는 플라즈마를 조사해서 시료의 표면에 박막으로서 중합막을 형성하고, 이 중합막으로 시료의 표면 전체를 덮는 공정과, 진공 하의 시료실에 수용된 이 중합막으로 덮은 시료의 전자 현미경상을 표시 장치에 표시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
이 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법에 있어서의 바람직한 1개의 실시형태에서는 전자 현미경의 시료실 내에 있어서 시료 관찰용의 전자선을 시료에 조사함으로써 중합 반응시키고, 시료의 표면 전체에 박막으로서 중합막을 형성한다. 이 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법에 있어서의 바람직한 다른 실시형태에서는 전자 현미경에 의한 시료 관찰 전에 미리 전자 현미경의 시료 관찰용의 전자선과는 별도의 전자선 또는 플라즈마를 시료에 조사함으로써 중합 반응시키고, 시료의 표면 전체에 박막으로서 중합막을 형성한다.
이 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법에 있어서의 바람직한 다른 실시형태에서는 증발 억제용 조성물은 양친매성 화합물과, 금속 화합물 및 당으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유한다.
이 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법에 있어서의 바람직한 다른 실시형태에서는 함수 시료가 젖은 채인 상태의 전자 현미경상을 함수 시료의 파괴를 수반하지 않고 상기 표시 장치에 표시한다.
이 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법에 있어서의 바람직한 다른 실시형태에서는 증발 억제용 조성물을 생존하고 있는 생물 시료의 체표에 적용해서 박막을 형성하여 이 시료의 표면 전체를 박막으로 덮는 공정과, 진공 하의 시료실에 놓인 이 박막으로 덮은 생물 시료가 살아있는 채의 운동의 전자 현미경상을 표시 장치에 표시하는 공정을 포함한다. 이 경우, 바람직한 실시형태에서는 상기 박막에 의해 생물 시료체 내로부터의 증발에 따른 온도 저하를 억제해서 생물 시료에 운동능을 부여하고, 또한 생물 시료 그대로의 형태를 유지한다. 바람직한 다른 실시형태에서는 상기 박막에 의해 생물 시료가 활동할 수 있기 위한 체내 온도를 진공 하에 있어서도 유지한다.
이 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법에 있어서의 바람직한 다른 실시형태에서는 주사형 전자 현미경을 사용해서 시료의 차지 업을 일으키지 않고 시료의 전자 현미경상을 표시 장치에 표시한다.
본 발명의 진공 하에서의 증발 억제용 조성물은 진공 하에 있어서 증발성이 있는 물질을 함유하는 시료의 표면 전체에 박막을 형성해서 이 시료를 덮고, 상기 증발성이 있는 물질에 대하여 진공 하에 있어서 그 증발을 억제하는 배리어능을 부여하기 위해서 사용되는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물로서, 양친매성 화합물, 유지류,및 이온 액체로부터 선택되는 적어도 1종을 함유한다.
이 증발 억제용 조성물에 있어서의 바람직한 실시형태에서는 생존하고 있는 생물 시료의 체표에 박막을 형성해서 이 생물 시료를 덮고, 생물 시료 체내의 증발성이 있는 물질에 대하여 진공 하에 있어서 그 증발을 억제하는 배리어능을 부여하기 위해서 사용된다.
이 증발 억제용 조성물에 있어서의 바람직한 다른 실시형태에서는 증발 억제용 조성물을 적용한 시료에 전자선 또는 플라즈마를 조사함으로써 시료의 표면에 박막으로서 중합막이 형성되고, 이 중합막으로 시료가 덮인다.
이 증발 억제용 조성물에 있어서의 바람직한 다른 실시형태에서는 양친매성 화합물과, 금속 화합물 및 당으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유한다.
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본 발명의 투과형 전자 현미경은 상기 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법에 사용되는 투과형 전자 현미경으로서, 경체 내의 시료실에 배치하는 시료를 도입할 수 있는 예비 배기실과, 시료실 및 예비 배기실을 탈기하는 배기 장치를 구비하는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명의 투과형 전자 현미경은 상기 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법에 사용되는 투과형 전자 현미경으로서, 시료를 배치하는 그리드 메시의 양면 각각에 상기 증발 억제용 조성물에 전자선 또는 플라즈마를 조사해서 형성한 중합막을 갖는 것을 특징으로 하고 있다.
이 투과형 전자 현미경에 있어서의 바람직한 실시형태에서는 예비 배기실에 글로브 박스를 구비하고 있다.
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(발명의 효과)
본 발명에 의하면 시료를 변형시키지 않고 시료 그대로의 상태를 손상하는 일 없이 고배율로 관찰할 수 있다.
또한, 전자 현미경을 사용해서 살아있는 채의 생물 시료를 살아있는 채로 관찰할 수 있어 움직이고 있는 상태의 초미세 구조를 관찰할 수 있다.
도 1은 실시예 1의 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 2는 실시예 2의 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 3은 실시예 3의 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 4는 실시예 4의 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 5는 실시예 5의 TEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 6은 실시예 6의 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 7은 실시예 7의 TEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 8은 실시예 8의 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 9는 실시예 9의 TEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 10은 실시예 10의 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 11은 실시예 11의 중합막의 사진이다.
도 12는 실시예 11의 시료 표면의 중합막과 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 13은 실시예 12의 시료 표면의 중합막과 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 14는 실시예 13의 시료 표면의 중합막과 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 15는 실시예 14의 시료 표면의 중합막과 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 16은 실시예 15의 시료 표면의 중합막과 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 17은 실시예 16의 시료 표면의 중합막과 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 18은 실시예 17의 시료 표면의 중합막과 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 19는 실시예 18의 시료 표면의 중합막과 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 20은 실시예 19의 시료 표면의 중합막과 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 21은 실시예 20의 시료 표면의 중합막과 SEM 비디오 촬영의 모양을 나타내는 사진이다.
도 22는 본 발명의 주사형 전자 현미경의 일실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 23은 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 24는 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 25는 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 26은 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 27은 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 28은 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 29는 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 30은 본 발명의 투과형 전자 현미경의 일실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 31은 도 30의 요부를 모식적으로 나타낸 사시도이다.
이하에 본 발명을 상세하게 설명한다.
또한, 본 발명에 있어서 「진공」이란, 예를 들면 10-1㎩ 이하, 또한 10-2~10-4㎩, 특히 10-4~10-8㎩의 범위를 의미한다.
본 발명의 증발 억제용 조성물은 생물 시료를 살아있는 그대로의 상태로 전자 현미경의 경체 내에 넣고, 살아있는 그대로의 상태로 전자 현미경 관찰을 행하기 위해서 생물 시료의 표면에 배리어를 형성한다.
이 배리어는 진공 하에서도 생물 체내의 물이 건조되지 않고 액체 상태인 채로 유지할 수 있는 기능(수분 배리어성), 생체 내의 산소 등의 가스상 물질의 탈기를 억제하는 기능(가스 배리어성)을 갖고, 이들 수분/가스 배리어성능에 추가하여 전자 현미경상을 얻기 위해서 전자빔 조사에 의한 전기적이며 또한 열적인 변형 변질을 억제하는 기능(도전성/내열성)을 함께 갖는다.
현재의 광학 장치나 전자선 장치로 생물 시료 또는 비생물 시료를 관찰하려고 했을 때, 고진공 조건 하에서 행해지는 것이 보통이지만 이 조건 하에서는 대기압 하에 있어서의 시료의 상태와는 동떨어져버린다. 시료 중의 물, 가스상 분자를 대기압의 상태인 채로 유지할 수 없게 되어 현저한 대미지를 시료에 부여해버리는 경우도 있다. 원래의 형태를 그대로 유지하여 보다 고정밀하게 관찰하는 것이 요구되고 있다. 즉, 생물 시료이면 살아있는 그대로의 상태를 손상하는 일 없이 라이브로 동적 관찰이 가능한 것, 비생물 시료이어도 함수 시료의 건조 등의 대미지 없이 관찰 가능한 것이다.
본 발명자들은 양친매성 화합물, 유지류 그리고 이온 액체가 진공 하에 있어서 물과 공기(가스)를 유지하는(수분/가스 배리어 기능이 있는) 것을 발견했다. 이 용액을 생물 시료에 섞음으로써 균일한 보호막이 형성되어 대기압 및 진공 하에 있어서 수분/가스 배리어능이 발현된다.
특히, 이 용액을 전자 현미경으로의 생물 시료의 관찰에 사용하면 생물 시료가 전자 현미경의 경체 내에서 건조되지 않고, 변형, 변질을 수반하는 일 없이 살아있는 그대로의 상태를 유지할 수 있어 움직이고 있는 모양의 SEM 화상을 얻을 수 있었다. 고배율로 해도 전자빔에 의한 변형이나 변성도 없이 움직이고 있는 모양을 관찰할 수 있고, 대전하는 일 없이 양호한 SEM 관찰이 가능했다.
진공 하임에도 불구하고, 생물 시료가 살아있는 채로 있을 수 있었던 점에서 생체 내의 물은 얼지 않는다. 즉, 감압하는 데에 따르는 온도 저하가 억제되어 있는 것도 관측 결과로부터 시사되고, 이것은 양친매성 화합물 단독이나 양친매성 화합물과, 금속 화합물 또는 당과의 병용, 유지류 단독 또는 이온 액체 단독의 진공 하에서의 온도 측정의 실험으로부터 확인하고 있다.
이 결과로부터 양친매성 화합물이나, 양친매성 화합물과, 금속 화합물 또는 당과의 병용, 유지류, 또는 이온 액체가 수분/가스 배리어성능을 부여하는 보호막을 형성하는 것이 명백해졌다. 본 발명자는 이 수분/가스 배리어성능을 Surface Shielding Effect(SS 효과)라고 하고 있다.
양친매성 화합물이나, 양친매성 화합물과, 금속 화합물 또는 당과의 병용, 유지류, 또는 이온 액체가 Surface Shielding Effect(SS 효과)를 부여하지만, 이들의 배리어성능과 함께 도전성을 부여하는 것, 전자선에 의한 열적 대미지도 억제되는 점에서 다기능의 배리어성능막으로서 기능하는 것도 발견된다.
본 발명에 의하면 생물/생체 시료를 살아있는 그대로의 상태로 전자 현미경 관찰할 수 있다. 생물/생체 시료의 전자 현미경 관찰을 위한 용액을 제공하는 것에 한정되지 않고, 널리 Surface Shielding Effect(SS 효과)를 부여하는 SS 용액의 조성에 대해서 제공한다.
본 발명에 의하면 Surface Shielding Effect(SS 효과)를 부여하는 SS 용액은 양친매성 화합물을 함유하고, 또는 주성분의 양친매성 화합물과, 금속 화합물 또는 당을 함유하고, 또는 유지류를 함유하고, 또는 이온 액체를 함유하지만 이하의 항목에 열거하는 아미노산 및 그 유도체, 비타민류 및 그 유도체, 무기염류, 금속 산화물, 지방산 및 그 유도체, 도전성 고분자, 나노 클레이 등을 임의의 비율로 첨가해서 다양한 용도로 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 하나의 실시형태에 의하면 SS 용액은 양친매성 화합물을 주성분(기재)으로 하고 있다. 양친매성 화합물은, 예를 들면 계면활성제를 사용할 수 있다. 계면활성제는 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 양성 이온 계면활성제, 천연 유래의 계면활성제 등과 같이 분자 구조로부터 크게 구별되고 있다. 공업, 식품, 의료품 등 폭넓은 분야에서 사용되고 있지만 기본적으로 어느 계면활성제를 사용해도 있는 일정 배리어성능은 발현될 수 있다.
상기 계면활성제 중 음이온성 계면활성제로서는, 예를 들면 카르복실산형, 황산 에스테르형, 술폰산형, 인산 에스테르형으로 분류된다. 이 중 구체적으로는, 예를 들면 도데실황산 나트륨, 라우르산 나트륨, α-술포지방산 메틸에스테르나트륨, 도데실벤젠술폰산 나트륨, 도데실에톡실레이트 황산 나트륨 등을 들 수 있고, 그 중에서도 도데실벤젠술폰산 나트륨을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 계면활성제 중 양이온성 계면활성제로서는, 예를 들면 제 4 급 암모늄염형, 알킬아민형, 복소환 아민형으로 분류된다. 구체적으로는, 예를 들면 스테아릴트리메틸암모늄클로라이드, 디스테아릴디메틸암모늄클로라이드, 디데실디메틸암모늄클로라이드, 세틸트리피리듐클로라이드, 도데실디메틸벤질암모늄클로라이드 등을 들 수 있다.
상기 계면활성제 중 비이온 계면활성제로서는, 예를 들면 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌모노지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노지방산 에스테르, 수크로오스 지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 알킬폴리글리코시드, N-메틸알킬글루카미드 등을 들 수 있다. 그 중에서도 도데실알코올에톡시레이트, 노닐페놀에톡시레이트, 라우로일디에탄올아미드 이외에 TritonTMX(TritonTMX-100 등), Pluronic(R)(Pluronic(R) F-123, F-68 등), Tween(Tween 20, 40, 60, 65, 80, 85 등), Brij(R)(Brij(R) 35, 58, 98 등), Span(Span 20, 40, 60, 80, 83, 85)의 이름으로 시판되어 있는 것이 바람직하다.
상기 계면활성제 중 양성 계면활성제로서는, 예를 들면 라우릴디메틸아미노 아세트산 베타인, 도데실아미노메틸디메틸술포프로필베타인, 3-(테트라데실디메틸아미니오)프로판-1-술포네이트 등이 있지만, 3-[(3-콜라미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS), 3-[(3-콜라미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술포네이트(CHAPSO) 등을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 계면활성제 중 천연 유래의 계면활성제로서는, 예를 들면 레시틴, 사포닌이 바람직하고, 레시틴으로서 칭해지는 화합물 중 구체적으로는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜글리세롤 등이 바람직하다. 또한, 사포닌으로서는 키라야사포닌이 바람직하다.
상기 계면활성제 중 미생물 유래의 양친매성 화합물(바이오 계면활성제)로서는 람노리피드, 소포로리피드, 만노실에리스리톨리피드 등을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 계면활성제에 예시한 것 이외에 일반적으로 공지의 것으로서 사용되고 있는 계면활성제 중, 특히 화장품종에 사용되어 있는 계면활성제로서는, 예를 들면 아몬드 오일 PEG-6, 아실(C12，14) 아스파르트산 Na, 아실(C12, 14) 아스파르트산 TEA, 아라키데스-20, 스테아릴알코올, 알킬(C11, 13, 15) 황산 나트륨, 알킬(C11，13，15) 황산 TEA, 알킬(C11，13，15) 인산 칼륨, 알킬(C12，13) 황산 DEA, 알킬(C12，13) 황산 나트륨, 알킬(C12，13) 황산 TEA, 알킬(C12，14，16) 황산 암모늄, 알킬(C12-14) 옥시히드록시프로필알기닌염산염, 알킬(C12-14) 디아미노에틸글리신염산염, 알킬(C12-14) 황산 TEA, 알킬(C12-15) 황산 TEA, 알킬(C14-18) 술폰산 나트륨, 알킬(C16，18) 트리모늄클로라이드, 알킬(C28) 트리모늄클로라이드, 이소스테아라미드 DEA, 이소스테아릴알코올, 이소스테아릴글리세릴, 이소스테아릴라우릴디모늄클로라이드, 이소스테아르산 PEG-2, 이소스테아르산 PEG-3, 이소스테아르산 PEG-4, 이소스테아르산 PEG-6, 이소스테아르산 PEG-8, 이소스테아르산 PEG-10, 이소스테아르산 PEG-12, 이소스테아르산 PEG-15 글리세릴, 이소스테아르산 PEG-20, 이소스테아르산 PEG-20 글리세릴, 이소스테아르산 PEG-20 수첨 피마자유, 이소스테아르산 PEG-20 소르비탄, 이소스테아르산 PEG-30, 이소스테아르산 PEG-30 글리세릴, 이소스테아르산 PEG-40, 이소스테아르산 PEG-50 수첨 피마자유, 이소스테아르산 PEG-58 수첨 피마자유, 이소스테아르산 PEG-60 글리세릴, 이소스테아르산 PG, 이소스테아르산 소르비탄, 이소스테아르산 소르베스-3, 이소스테아르산 폴리글리세릴-2, 이소스테아르산 폴리글리세릴-3, 이소스테아르산 폴리글리세릴-4, 이소스테아르산 폴리글리세릴-5, 이소스테아르산 폴리글리세릴-6, 이소스테아르산 폴리글리세릴-10, 이소스테아레스-2, 이소스테아레스-10, 이소스테아레스-15, 이소스테아레스-22, 이소스테아로일 가수분해 콜라겐, 이소스테아로일 가수분해 콜라겐 AMPD, 이소스테아로일락트산 나트륨, 이소세테스-10, 이소세테스-20, 이소팔미트산 옥틸, 이소팔미트산 폴리글리세릴-2, 이소부티르산 아세트산 수크로오스, 운데실레노일 가수분해 콜라겐칼륨, 에틸렌디아민테트라키스히드록시이소프로필디올레산, 에폭시에스테르-1, 에폭시에스테르-2, 에폭시에스테르-3, 에폭시에스테르-4, 에폭시에스테르-5, 에루스산 글리세릴, 옥탄산 PEG-4, 노녹시놀-14, 옥틸도데세스-2, 옥틸도데세스-5, 옥틸도데세스-10, 옥틸도데세스-30, 옥테닐숙신산 덱스트린 TEA, 옥톡시놀-1, 옥톡시놀-2에탄술폰산 나트륨, 옥톡시놀-10, 옥톡시놀-25, 옥톡시놀-70, 올리브유 PEG-6, 올리고숙신산 PEG-3-PPG-20, 올레아미드 DEA, 올레아민옥시드, 올레일베타인, 올레일황산 나트륨, 올레일황산 TEA, 올레산 PEG-2, 올레산 PEG-10, 올레산 PEG-10 글리세릴, 올레산 PEG-15 글리세릴, 올레산 PEG-20 글리세릴, 올레산 PEG-30 글리세릴, 올레산 PEG-36, 올레산 PEG-40 소르비트, 올레산 PEG-75, 올레산 PEG-150, 올레산 PG, 올레산 수크로오스, 올레산 히드록시{비스(히드록시에틸)아미노}프로필, 올레산 폴리글리세릴-2, 올레산 폴리글리세릴-5, 올레산 폴리글리세릴-10, 올레오일 가수분해 콜라겐, 올레오일사르코신, 올레오일메틸타우린산 나트륨, 올레스-2, 올레스-3인산 DEA, 올레스-7인산 나트륨, 올레스-8인산 나트륨, 올레스-10, 올레스-10인산, 올레스-10인산 DEA, 올레스-20, 올레스-20인산, 올레스-30, 올레스-50, 올레핀(C14-16) 술폰산 나트륨, 양이온화 가수분해 밀단백-1, 양이온화 가수분해 밀단백-3, 양이온화 가수분해 콘키올린-2, 양이온화 가수분해 대두단백-1, 양이온화 가수분해 대두단백-2, 양이온화 가수분해 대두단백-3, 양이온화 덱스트란-2, 카프라미드 DEA, 우지지방산 글리세릴, 아프리코트커넬오일 PEG-6, 시트르산 디스테아릴, 시트르산 지방산 글리세릴, 쿼터늄-14, 쿼터늄-18, 쿼터늄-18 헥토라이트, 쿼터늄18 벤토나이트, 쿼터늄-22, 쿼터늄-33, 옥수수유 PEG-6, 옥수수유 PEG-8, 코카미도, 코카미도 DEA, 코카미도 MEA, 코카미도프로필베타인, 코카민옥사이드, 코코암포아세트산 나트륨, 코코암포디아세트산 2나트륨, 폴리옥시에틸렌트리데실황산 나트륨, 코코암포디프로피온산 2나트륨, 코코암포프로피온산 나트륨, 코코일알라닌 TEA, 코코일알기닌에틸 PCA, 코코일이세티온산 나트륨, 코코일 가수분해 카제인칼륨, 코코일 가수분해 케라틴칼륨, 코코일 가수분해 효모 칼륨, 코코일 가수분해 효모단백질 칼륨, 코코일 가수분해 밀단백칼륨, 코코일 가수분해 콜라겐, 코코일 가수분해 콜라겐칼륨, 코코일 가수분해 콜라겐나트륨, 코코일 가수분해 콜라겐 TEA, 코코일 가수분해 감자단백질 칼륨, 코코일 가수분해 대두단백질 칼륨, 코코일 가수분해 옥수수단백질 칼륨, 코코일 가수분해 아일랜드감자단백질 칼륨, 코코일글리신칼륨, 코코일글리신 TEA, 코코일글루탐산, 코코일글루탐산 칼륨, 코코일글루탐산 나트륨, 코코일글루탐산 TEA, 코코일사르코신, 코코일사르코신나트륨, 코코일사르코신 TEA, 코코일타우린나트륨, 코코일메틸알라닌, 코코일메틸알라닌나트륨, 코코일메틸타우린칼륨, 코코일메틸타우린마그네슘, 코코일메틸타우린나트륨, 코코글리세릴황산 나트륨, 코코디모늄히드록시프로필 가수분해 케라틴, 코코디모늄히드록시프로필 가수분해 콜라겐, 코코디모늄히드록시프로필 가수분해 실크, 코코베타인, 숙신산 PEG-50 수첨 피마자유, 숙신산 지방산 글리세릴, 코레스-10, 코레스-15, 아세트산 이소세테스-3, 아세트산 세테스-3, 아세트산 이소부틸, 아세트산 에틸, 아세트산 글리세릴, 아세트산 지방산 글리세릴, 아세트산 스테아르산 수크로오스, 아세트산 트리데세스-3, 아세트산 트리데세스-15, 아세트산 부틸, 아세트산 모노스테아르산 글리세릴, 아세트산 라네스-9, 디아세틸타르타르산 지방산 글리세릴, 디알킬(C12-15)디모늄클로라이드, 디알킬(C12-18)디모늄클로라이드, 디이소스테아르산 PEG-8, 디이소스테아르산 PG, 디이소스테아르산 폴리글리세릴-2, 디올레산 PEG-4, 디올레산 PEG-10, 디올레산 PEG-32, 디올레산 PEG-75, 디올레산 PEG-120 메틸글루코스, 디올레산 PEG-150, 디올레산 PG, 디올레산 글리콜, 디올레산 폴리글리세릴-6, 디우지알킬디모늄황산 셀룰로오스, 디코코디모늄클로라이드, 디아세트산 스테아르산 글리세릴, 디스테아릴디모늄클로라이드, 디스테아르산 PEG-2, 디스테아르산 PEG-12, 디스테아르산 PEG-20 메틸글루코스, 디스테아르산 PEG-120, 디스테아르산 PEG-250, 디스테아르산 PEG-트리메틸롤프로판, 디스테아르산 PG, 디스테아르산 PPG-20 메틸글루코스, 디스테아르산 글리콜, 디스테아르산 글리세릴, 디스테아르산 수크로오스, 디스테아르산 소르비탄, 디스테아르산 폴리글리세릴-6, 디스테아르산 폴리글리세릴-10, 디세틸디모늄클로라이드, 디세테아릴인산 MEA, 디히드록시에틸스테아릴베타인, 디팔미트산 PEG-3, 디히드록시에틸라우라민옥사이드, (디히드록시메틸실릴프로폭시)히드록시프로필 가수분해 카제인, (디히드록시메틸실릴프로폭시)히드록시프로필 가수분해 콜라겐, (디히드록시메틸실릴프로폭시)히드록시프로필 가수분해 실크, 디히드로코레스-15, 지방산(C8-22)폴리글리세릴-10, 디메티콘코폴리올, 디메티콘코폴리올에틸, 디메티콘코폴리올부틸, 디메틸스테아라민, 디라우르산 PEG-4, 디라우르산 PEG-12, 디라우르산 PEG-32, 디라우르산 수크로오스, 디라우레스 4인산, 디라우레스-10인산, 디라우로일글루탐산 마그네슘, 수산화 레시틴, 수첨 코코글리세릴, 수첨 대두지방산 글리세릴, 수첨 탈로우아미드 DEA, 수첨 탈로우글루탐산 2나트륨, 수첨 탈로우글루탐산 TEA, 수첨 라놀린, 수첨 라놀린알코올, 수첨 리조레시틴, 수첨 레시틴, 스테아라미드, 스테아라미드 DEA, 스테아라미드 MEA, 스테아라미드에틸디에틸아민, 스테아라미드프로필디메틸아민, 스테아라민옥시드, 스테아랄코늄클로라이드, 스테아랄코늄헥토라이트, 스테아릴디메틸베타인나트륨, 스테아릴트리모늄사카린, 스테아릴트리모늄브로마이드, 스테아릴베타인, 스테아릴황산 나트륨, 스테아르산 PEG-2, 스테아르산 PEG-6 소르비트, 스테아르산 PEG-10, 스테아르산 PEG-10 글리세릴, 스테아르산 PEG-14, 스테아르산 PEG-20 글리세릴, 스테아르산 PEG-23, 스테아르산 PEG-25, 스테아르산 PEG-40, 스테아르산 PEG-100, 스테아르산 PEG-120 글리세릴, 스테아르산 PEG-150, 스테아르산 PEG-200 글리세릴, 스테아르산 PG, 스테아르산 TEA, 스테아르산 글리콜, 스테아르산 글리세릴, 스테아르산 수크로오스, 스테아르산 스테아레스-4, 스테아르산 스테아로일디히드록시이소부틸아미드, 스테아르산 소르비탄, 스테아르산 폴리옥시에틸렌세틸에테르, 스테아르산 폴리글리세릴-2, 스테아르산 폴리글리세릴10, 스테아르산/말산 글리세릴, 스테알디모늄히드록시디프로필 가수분해 케라틴, 스테알디모늄히드록시디프로필 가수분해 콜라겐, 스테알디모늄히드록시디프로필 가수분해 실크, 스테알트리모늄클로라이드, 스테아레스-2인산, 스테아레스-3, 스테아레스-10, 스테아레스-16, 스테아레스-50, 스테아레스-80, 스테아레스-100, 스테아로일 가수분해 콜라겐칼륨, 스테아로일 가수분해 콜라겐나트륨, 스테아로일글루탐산, 스테아로일글루탐산 2나트륨, 스테아로일글루탐산 칼륨, 스테아로일글루탐산 나트륨, 스테아로일글루탐산 디옥틸도데실, 스테아로일콜라미노포르밀메틸피리듐클로라이드, 스테아로일락트산 칼슘, 스테아로일락트산 나트륨, 스테아로일메틸타우린나트륨, 술포숙신산(C12-14)파레스 2나트륨, 술포숙신산 PEG-2 올레아미드 2나트륨, 술포숙신산 PEG-4 코코일이소프로판올아미드 2나트륨, 술포숙신산 PEG-5 라우라미드 2나트륨, 술포숙신산 디옥틸나트륨, 술포숙신산 시토스테레스14-2나트륨, 술포숙신산 라우릴 2나트륨, 술포숙신산 라우레스 2나트륨, 세스퀴이소스테아르산 소르비탄, 세스퀴올레산 글리세릴, 세스퀴올레산 소르비탄, 세스퀴올레산 디글리세릴, 세스퀴스테아르산 PEG-20 메틸글루코스, 세스퀴스테아르산 소르비탄, 세스퀴스테아르산 메틸글루코스, 세틸디메티콘코폴리올, 세틸피리듐클로라이드, 세틸황산 나트륨, 세틸인산 DEA, 세틸인산 칼륨, 세테아릴알코올, 세테아릴글루코시드·세테아릴알코올, 세테아릴황산 나트륨, 세테아레스-10, 세테아레스-15, 세테아레스-22, 세테아레스-34, 세테아레스-55, 세테아레스-60, 세테아레스-60미리스틸글리콜, 세테아레스-100, 세테스-8인산, 세테스-10, 세테스-10인산, 세테스-12, 세테스-24, 세테스-45, 세트리모늄클로라이드, 세트리모늄사카린, 세트리모늄프로마이드, 세토레스-10, 세토레스-20, 세토레스-25, 탈로우아미드 MEA, 데카이소스테아르산 폴리글리세릴-10, 데카올레산 폴리글리세릴-10, 데카스테아르산 폴리글리세릴-10, 데실글루코시드, 테트라옥탄산 디글리세롤소르비탄, 테트라올레산 소르베스-30, 테트라올레산 소르베스-40, 테트라올레산 소르베스-60, 테트라스테아르산 소르베스-60, 도데실벤젠술폰산 TEA, 트리PEG-8알킬(C12-15) 인산, 트리(이소스테아르산 PEG-3)트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산 PEG-10 글리세릴, 트리이소스테아르산 PEG-15 수첨 피마자유, 트리이소스테아르산 PEG-20 수첨 피마자유, 트리이소스테아르산 PEG-30 글리세릴, 트리이소스테아르산 PEG-30 수첨 피마자유, 트리이소스테아르산 PEG-50 글리세릴, 트리이소스테아르산 PEG-50 수첨 피마자유, 트리이소스테아르산 PEG-160 소르비탄, 트리이소스테아르산 폴리글리세릴-2, 트리올레산 소르비탄, 트리올레산 폴리글리세릴-10, 트리스테아르산 PEG-3소르비트, 트리스테아르산 PEG-140 글리세릴, 트리스테아르산 PEG-160 소르비탄, 트리스테아르산 수크로오스, 트리스테아르산 소르비탄, 트리스테아르산 폴리글리세릴-10트리데세스-3아세트산 나트륨, 트리데세스-6아세트산 나트륨, 트리데세스-9, 트리데세스-10, 트리데세스-11, 트리데세스-20, 트리데세스-21, 트리히드록시스테아린, 트리베헨산 수크로오스, 트리라우릴아민, 트리라우레스-4인산, 트리라우레스-4인산 나트륨, 락트산 지방산 글리세릴, 노닐노녹시놀-10, 노닐노녹시놀-100, 노녹시놀-3, 노녹시놀-4황산 나트륨, 노녹시놀-6인산, 노녹시놀-6인산 나트륨, 노녹시놀-10, 노녹시놀-10인산, 노녹시놀-23, 노녹시놀-50, 노녹시놀-120, 퍼플루오로알킬PEG인산, 퍼플루오로알킬인산 DEA, 팜핵 지방산 아미드 DEA, 팜핵 지방산 아미드에틸히드록시에틸아미노프로피온산 나트륨, 팜핵 지방산 아미드프로필베타인, 팜지방산 글루탐산 나트륨, 팔미타미드 MEA, 팔미트산 PEG-6, 팔미트산 PEG-18, 팔미트산 PEG-20, 팔미트산 수크로오스, 팔미트산 소르비탄, 팔미트일아스파르트산 2TEA, 팔미트일메틸타우린나트륨, 낙화생유 PEG-6, 히드록시스테아르산 글리세릴, 히드록시프로필트리모늄 가수분해 카제인, 히드록시프로필트리모늄 가수분해 케라틴, 히드록시프로필트리모늄 가수분해 밀단백, 히드록시프로필트리모늄 가수분해 콜라겐, 히드록시프로필트리모늄 가수분해 실크, 히드록시라놀린, 프로피온산 PPG-2 미리스틸, 헵타스테아르산 폴리글리세릴-10, 헵타데실히드록시에틸카르복실레이트메틸이미다졸리늄, 베헤나미드프로필PG디모늄클로라이드, 베헤나민옥시드, 베헤네스-10, 베헤네스-30, 베헨산 글리세릴, 베헨트리모늄클로라이드, 벤잘코늄클로라이드, 펜타이소스테아르산 폴리글리세릴-10, 펜타옥탄산 디글리세롤소르비탄, 펜타올레산 PEG-40 소르비트, 펜타올레산 폴리글리세릴-6, 펜타올레산 폴리글리세릴-10, 펜타스테아르산 폴리글리세릴-10, 폴리아크릴산 칼륨, 폴리아크릴산 나트륨, 폴리아크릴산 암모늄, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르인산 TEA, 폴리옥시에틸렌에테르인산 나트륨, 폴리옥시에틸렌옥틸에테르인산, 폴리옥시에틸렌세틸스테아릴디에테르, 폴리옥시에틸렌피토스탄올, 폴리옥시에틸렌부틸에테르, 폴리옥시에틸렌코코넛지방산 디에탄올아미드, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르인산 TEA, 폴리옥시프로필렌카르복시알킬(C14-18)디글루코시드, 폴리옥시프로필렌글리세릴에테르인산, 폴리옥시프로필렌소르비트, 폴리올레산 수크로오스, 폴리글리세릴-2올레일, 폴리스테아르산 수크로오스, 아세트산 세틸, 아세트산 라놀린알코올, 폴리팜지방산 수크로오스, 폴리라우르산 수크로오스, 폴리리시놀레산 폴리글리세릴, 폴리리놀산 수크로오스폴록사머 181, 폴록사머 333, 폴록사민 304, 폴록사민 901, 폴록사민 1104, 폴록사민 1302, 폴록사민 1508, 말티톨히드록시알킬(C12，14), 미리스타마이드 DEA, 미리스타민옥시드, 미리스탈코늄클로라이드, 미리스틸PG히드록시에틸데카나마이드, 미리스틸베타인, 미리스틸황산 나트륨, 미리스트산 PEG-8, 미리스트산 PEG-20, 미리스트산 글리세릴, 미리스트산 수크로오스, 미리스트산 폴리글리세릴-10, 미리스트산 미레스-3, 미리스토일 가수분해 콜라겐, 미리스토일 가수분해 콜라겐칼륨, 미리스토일글루탐산, 미리스토일글루탐산 칼륨, 미리스토일글루탐산 나트륨, 미리스토일사르코신나트륨, 미리스토일메틸알라닌나트륨, 미리스토일메틸타우린나트륨, 미레스-3, 미레스-3황산 나트륨, 모노아세트산 모노스테아르산 글리세릴, 코코넛지방산 TEA, 코코넛지방산 글리세릴, 코코넛지방산 수크로오스, 코코넛지방산 소르비탄, 코코넛지방산 리신, 라우라미드 DEA, 라우라미드 MEA, 라우라미드프로필베타인, 라우라미노디아세트산 나트륨, 라우라미노프로피온산, 라우라미노프로피온산 나트륨, 라우라민옥사이드, 라우리미노디프로피온산 나트륨, 라우릴 DEA, 라우릴이소퀴놀리늄사카린, 라우릴이소퀴놀리늄프로마이드, 라우릴글루코시드, 라우릴디아미노에틸글리신나트륨, 라우릴디모늄히드록시프로필 가수분해 케라틴, 라우릴디모늄히드록시프로필 가수분해 콜라겐, 라우릴디모늄히드록시프로필 가수분해 실크라우릴술포아세트산 나트륨, 라우릴히드록시아세트산 아미드황산 나트륨, 라우릴히드록시술타인, 라우릴피리듐클로라이드라우릴베타인, 라우릴황산 DEA, 라우릴황산 칼륨, 라우릴황산 MEA, 라우릴황산 마그네슘, 라우릴황산 나트륨, 라우릴황산 TEA라우릴황산 암모늄, 라우릴인산, 라우릴인산 2나트륨, 라우릴인산 나트륨, 라우르산 PEG-2, 라우르산 PEG-4 DEA, 라우르산 PEG-6, 라우르산 PEG-8, 라우르산 PEG-8 글리세릴, 라우르산 PEG-9, 라우르산 PEG-10, 라우르산 PEG-12 글리세릴, 라우르산 PEG-23 글리세릴, 라우르산 PEG-32, 라우르산 PEG-75, 라우르산 PEG-150, 라우르산 PEG 소르비트, 라우르산 PG, 라우르산 TEA, 라우르산 글리세릴, 라우르산 수크로오스, 라우르산 폴리옥시에틸렌 수첨 피마자유, 라우르산 폴리글리세릴-6, 라우르산 폴리글리세릴-10, 라우르산 말티톨, 라우르트리모늄클로라이드, 라우르트리모늄프로마이드, 라우레스-2-황산 암모늄, 라우레스-3아세트산, 라우레스-3황산 TEA, 라우레스-3황산 암모늄, 라우레스-3인산, 라우레스-4인산, 라우레스-4인산 나트륨, 라우레스-4．5아세트산 칼륨, 라우레스-5아세트산, 라우레스-5황산 나트륨, 라우레스-6아세트산, 라우레스-6아세트산 나트륨, 라우레스-7인산, 라우레스-9, 라우레스-10, 라우레스-10아세트산, 라우레스-10아세트산 칼륨, 라우레스-16아세트산 나트륨, 라우레스-17아세트산 나트륨, 라우레스-40, 라우레스황산 TEA, 라우로암포PG아세트산 인산 나트륨, 라우로암포아세트산 나트륨, 라우로일아스파르트산, 라우로일 가수분해 콜라겐칼륨, 라우로일 가수분해 콜라겐나트륨, 라우로일 가수분해 실크나트륨, 라우로일글루탐산, 라우로일글루탐산 칼륨, 라우로일글루탐산 나트륨, 라우로일글루탐산 TEA, 라우로일글루탐산 디옥틸도데실, 라우로일글루탐산 디옥틸도데세스-2, 라우로일글루탐산 디옥틸도데실, 라우로일글루탐산 디콜레스테릴, 라우로일글루탐산 디스테아레스-2, 라우로일글루탐산 디스테아레스-5, 라우로일사르코신, 라우로일사르코신나트륨, 라우로일사르코신 TEA, 라우로일트레오닌칼륨, 라우로일락트산 나트륨, 라우로일메틸알라닌, 라우로일메틸알라닌나트륨, 라우로일메틸알라닌 TEA, 라우로일메틸타우린나트륨, 라네스-10, 라네스-25, 라네스-40, 라네스-75, 라놀린지방산 PEG-4, 라놀린지방산 PEG-12, 라놀린지방산 아미드 DEA, 라놀린지방산 이소프로필, 라놀린지방산 옥틸도데실, 라놀린지방산 글리세릴, 라놀린지방산 콜레스테릴, 라피륨클로라이드, 리시놀레산 아미드프로필베타인, 리시놀레산 글리세릴, 리시놀레산 수크로오스, 리시놀레산 폴리옥시프로필렌소르비트, 리시놀레산 폴리글리세릴-6, 리놀산 라놀릴, 리놀레아미드 DEA, 황산화 피마자유, 말산 라우라미드, 로진 가수분해 콜라겐, 로진 가수분해 콜라겐 AMPD 등을 들 수 있다.
상기 계면활성제 이외에 불소계의 계면활성제를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, 예를 들면 헵타데카플루오로-1-옥탄술폰산 암모늄, 펜타데카플루오로옥탄산 암모늄, 헵타데카플루오로옥탄술폰산, 헵타데카플루오로-1-옥탄술폰산 리튬, 펜타데카플루오로옥탄산, 펜타데카플루오로옥탄산 수화물, 헵타데카플루오로-1-옥탄술폰산 칼륨 등을 들 수 있다.
상기 계면활성제 이외에, 예를 들면 N-장쇄 아실글루탐산염, N-장쇄 아실아스파르트산염, N-장쇄 아실글리신염, N-장쇄 아실알라닌염, N-장쇄 아실트레오닌염, N-장쇄 아실사르코신염 등의 N-장쇄 아실 중성 아미노산염 등의 N-장쇄 아실아미노산염, N-장쇄 지방산 아실-N-메틸타우린염, 알킬술페이트 및 그 알킬렌옥사이드 부가물, 지방산 아미드에테르술페이트, 지방산의 금속염, 술포숙신산계 계면활성제, 알킬포스페이트 및 그 알킬렌옥사이드 부가물, 고급 알킬황산 에스테르염, 알킬에테르황산 에스테르염, 알킬히드록시에테르카르복실산염, 알킬에테르카르복실산 등의 음이온 계면활성제, 글리세린에테르 및 그 알킬렌옥사이드 부가물 등의 에테르형 계면활성제, 글리세린에스테르 및 그 알킬렌옥사이드 부가물 등의 에스테르형 계면활성제, 소르비탄 에스테르 및 그 알킬렌옥사이드 부가물 등의 에테르에스테르형 계면활성제, 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 디에탄올아미드 등의 지방산 알킬롤아미드, 폴리옥시알킬렌 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 다가 알코올 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 수첨 피마자유, 모노스테아르산 글리세린, 글리세린에스테르, 지방산 폴리글리세린에스테르, 아실아미노산 폴리글리세린에스테르, 소르비탄에스테르, 수크로오스지방산 에스테르 등의 에스테르형 계면활성제, 알킬글루코시드류, 경화 피마자유 피로글루탐산 디에스테르 및 그 에틸렌옥시드 부가물, 지방산 알칸올아미드 등의 질소 함유형의 비이온성 계면활성제 등의 비이온성 계면활성제, 알킬암모늄클로라이드, 디알킬암모늄클로라이드, 염화알킬트리메틸암모늄(C16-C22), 디알킬디메틸암모늄메토술페이트염 등의 지방족 아민염, 그들의 4급 암모늄염, 벤잘코늄염 등의 방향족 4급 암모늄염, 지방산 아실알기닌에스테르, N-장쇄 아실알기닌에틸피롤리돈카르복실산염, 아미드아민류, 스테아라미드프로필디메틸아민글루탐산염, 스테아라미드프로필디메틸아민황산염, 스테아라미드프로필디메틸아민피롤리돈카르복실산염, 베헤나미드프로필디메틸아민글루탐산염 베헤나미드프로필디메틸아민황산염, 베헤나미드프로필디메틸아민피롤리돈카르복실산염 등의 양이온 양친매성 화합물 및 알킬베타인, 알킬아미드베타인, 술포베타인, 이미다졸륨베타인, 아미노프로피오네이트, 카르복시베타인 등의 베타인형 양친매성 화합물, N-장쇄 아실아르기닌, N-(3-알킬(12,14)옥시-2-히드록시프로필)아르기닌염산염, 아미노카르복실산형 계면활성제, 이미다졸린형 계면활성제 등의 양성 계면활성제 등을 사용할 수도 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에 의하면 SS 용액은 양친매성 화합물과 금속 화합물을 포함한다. 금속 화합물로서는 금속 이온을 포함하는 것이면 폭넓게 사용할 수 있다.
상기 금속 화합물은 양이온과 음이온으로 이루어지는 염(단염)이어도, 2종류이상으로 이루어지는 염(복염)이어도 좋다.
상기 금속 화합물은 산화물, 수산화물, 할로겐화물, 황산염, 질산염, 탄산염, 아세트산염 등의 화합물이어도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면 염화나트륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 탄산수소나트륨, 염화칼륨, 염화스트론튬, 염화리튬, 염화하프늄, 염화철, 염화알루미늄, 염화아연, 염화구리, 염화코발트, 염화황산 마그네슘, 탄산 마그네슘 등을 들 수 있다.
상기 금속 화합물은 금속 산화물이어도 좋다. 금속 알콕시드는 MOR로 나타내어지는 화합물이며, 금속(M)과 알콕시드(RO-)(R은 탄화수소)로 이루어진다. 금속(M)으로서 구체적으로는 규소, 티탄, 알루미늄, 붕소, 지르코늄, 붕소, 바나듐, 텅스텐, 인, 게르마늄, 인듐, 하프늄, 몰리브덴 등을 들 수 있고, 여러 가지 알코올로부터 금속 알콕시드가 얻어진다. 이들 금속 알콕시드를 그대로 사용해도 좋고, 이들 금속 알콕시드를 산 또는 알칼리 존재 하에서 졸겔 반응을 행한 반응물을 사용해도 좋다. 금속 알콕시드로서는 단일 성분을 사용하지 않고 2종류 이상의 것을 혼합해도 좋다.
상기 금속 화합물은 금속 착체이어도 좋다.
본 발명의 다른 실시형태에 의하면 SS 용액은 양친매성 화합물과 당을 포함한다. 당·양친매성 화합물의 조합에 대해서 SS 효과를 부여하는 것은 본 발명자들에 의한 신지견이다. 당으로서는 단당류, 이당류, 올리고당, 다당류와 그 유도체를 배합한다. 구체적으로는 단당류로서 글루코오스, 프룩토오스 등을 들 수 있다. 이당류로서 수크로오스 등을 들 수 있는 이외에 다당류로서 헤파린, 콘드로이틴 황산, 풀루란, 펙틴, 구아검, 크산탄검, 카라기난, 프로필렌글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스 등을 들 수 있고, 특히 풀루란과 같은 다당류가 바람직하다. 그 외에 카라멜, 벌꿀, 밀랍을 사용해도 좋다.
또한, 본 발명의 다른 실시형태에 의하면 SS 용액은 유지류를 포함한다.
유지류로서는, 예를 들면 실리콘 오일 등을 들 수 있다. 실리콘 오일은 생물 시료의 조직 또는 세포의 수분 환경을 유지하는 수분 유지제로서 기능하고, 이것에 의해 살아있는 채의 생물 시료의 동적 관찰을 달성한다. 즉, 진공 하에 있어서도 조직이나 세포의 수가 손실되지 않는 배리어성능을 갖는 재료로서 사용할 수 있다.
실리콘 오일로서는, 예를 들면 25℃에 있어서의 점도가 1~100,000mPa·s인 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 「636-04001」, 신에쓰 실리콘 「KF-54」, 「KF-96」등을 사용할 수 있다.
실리콘 오일을 사용한 본 발명의 증발 억제용 조성물(SS 용액)은 실리콘 오일을 조성물 전체량에 대하여 바람직하게는 10중량% 이상 함유하고, 그 이외의 성분으로서 하기에 예시한 성분을 배합해도 좋다.
또한, 본 발명의 다른 실시형태에 의하면 SS 용액은 이온 액체를 포함한다.
이온 액체로서는, 예를 들면 이미다졸륨염류, 피리듐염류, 피페리디늄염류, 피롤리디늄염류, 4급 암모늄염류, 포스포늄류, 술포늄류, 피라졸륨류 등을 들 수 있다.
이미다졸륨염류로서는, 예를 들면 1-알킬-3-알킬이미다졸륨, 1,3-디메틸이미다졸륨, 1-에틸-3-메틸이미다졸륨, 1-부틸-3-메틸이미다졸륨, 1-헥실-3-메틸이미다졸륨, 3-메틸-1-옥틸이미다졸륨, 1-도데실-3-메틸이미다졸륨, 1-도데실-3-메틸이미다졸륨, 1-메틸-3-테트라데실이미다졸륨, 1-헥사데실-3-이미다졸륨, 1-옥타데실-3-메틸이미다졸륨, 1-알릴-3-메틸이미다졸륨, 1-알릴-3-에틸이미다졸륨, 1-알릴-3-부틸이미다졸륨, 1,3-디알릴이미다졸륨, 1-벤질-3-메틸이미다졸륨, 1-(2-히드록시에틸)-3-메틸이미다졸륨 등을 들 수 있다.
1-알킬-2,3-디알킬이미다졸륨염으로서는, 예를 들면 1-에틸-2,3-디메틸이미다졸륨, 1,2,3,-트리에틸이미다졸륨, 1,2-디메틸-3-프로필이미다졸륨, 1-부틸-2,3-디메틸이미다졸륨, 1-헥실-2,3-디메틸이미다졸륨, 1,3-디데실2-메틸이미다졸륨 등을 들 수 있다.
피리듐염류로서는, 예를 들면 1-메틸피리듐, 1-에틸피리듐, 1-부틸피리듐, 1-헥실피리듐, 1-에틸-3-메틸피리듐, 1-메틸-4-메틸피리듐, 1-프로필-4-메틸피리듐, 1-프로필-3-메틸피리듐, 1-부틸-2-메틸피리듐, 1-부틸-3-메틸피리듐, 1-에틸-3-히드록시메틸피리듐, 1-(3-히드록시프로필)피리듐 등을 들 수 있다.
피페리디늄염류로서는, 예를 들면 1-메틸-1-프로필피페리디늄, 1-부틸-1-메틸피페리디늄, 1-(메톡시에틸)-1-메틸피페리디늄 등을 들 수 있다.
피롤리디늄염류로서는, 예를 들면 1,1-디메틸피롤리디늄, 1-에틸-1-메틸피롤리디늄, 1-메틸-1-프로필피롤리디늄, 1-부틸-1-메틸피롤리디늄, 1-(메톡시에틸)-1-메틸피롤리디늄 등을 들 수 있다.
4급 암모늄염류로서는, 예를 들면 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 부틸트리메틸암모늄, 에틸-디메틸-프로필암모늄, 트리부틸메틸암모늄, 메틸트리옥틸암모늄, 2-히드록시에틸암모늄 등 이외에, 콜린, N,N-디에틸-N-메틸-N-(2-메톡시에틸)암모늄, 트리메틸아민옥시드 등을 들 수 있다.
포스포늄류로서는, 예를 들면 테트라부틸포스포늄, 트리부틸헥사데실포스포늄, 트리에틸펜틸포스포늄, 트리에틸옥틸포스포늄, 테트라옥틸포스포늄, 트리이소부틸메틸포스포늄, 트리부틸테트라데실포스포늄, 트리에틸테트라데실포스포늄 등을 들 수 있다.
술포늄류로서는 예를 들면 트리에틸술포늄, 디에틸메틸술포늄 등을 들 수 있다.
피라졸륨류로서는, 예를 들면 1-에틸-2,3,5-트리메틸피라졸륨, 1-프로필-2,3,5-트리메틸피라졸륨, 1-부틸-2,3,5-트리메틸피라졸륨 등 이외에 구아니디늄, N-(메톡시에틸)-N-메틸모르폴리늄 등을 들 수 있다.
상기 이온 액체로 칭해지는 화합물 중 음이온 부위는 다음과 같은 것이면 좋다. 즉, 포화/불포화 탄화수소기 이외에 방향족 탄화수소기, 에테르기, 알킬수산기, 클로라이드, 브로마이드, 이오다이드, 아세테이트, 락테이트, 메톡시술포네이트, 에톡시술포네이트, 디메톡시포스페이트, n-부틸술포네이트, 디에톡시포스페이트, 에틸술포네이트, n-헥실포스페이트, 하이드로겐포스페이트, 티오시아네이트, 옥틸술포네이트, 2-(2-메톡시에톡시)에틸술페이트, 트리시아노메탄, 테트라플루오로보레이트, 헥사플루오로포스페이트, 트리플레이트, 비스(트리플루오로메틸술포닐)이미드, 트리플루오로메탄술포네이트, 비스(플루오로술포닐)이미드, 비스(노나플루오로부탄술포닐)이미드, 에틸술페이트, 퍼플루오로부탄술포네이트, 디시안아미드, 트리플루오로아세테이트, 포르메이트, 인산 2수소 이온(디하이드로겐포스페이트), 탄산 수소, 메틸카르보네이트, 디부틸포스페이트, 트리스(펜타플루오로에틸)트리플루오로포스페이트, 비스[옥살레이트(2-)-O,O']보레이트, 데카노에이트, 비스(2,4,4-트리메틸펜틸)포스피네이트, 도데실벤젠술포네이트, p-트리엔술포네이트, 디에틸포스포네이트, 벤조에이트, 티오살리실레이트, 테트라클로로페라이트, 테트라클로로알루미네이트, 헥사플루오로안티모네이트 등이어도 좋다.
또한, 음이온 부위는 J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 2398-2399에 나타내는 방법에 의한 방법으로 이온 교환해서 얻어지는 임의의 아미노산이어도 좋다. 여기에서 말하는 아미노산은 모노머이어도, 디펩티드, 올리고펩티드이어도 좋다. 또한, 비특허문헌 3은 이미다졸륨염에 대하여 1:1의 비율로 대이온을 이루고 있지만, 본 발명에 있어서의 이온 액체에 대해서는 1:1의 비율일 필요는 없다.
또한, 본 발명에 의하면 SS 용액은 양친매성 화합물을 포함하고, 또는 양친매성 화합물과, 금속 화합물 또는 당을 포함하고, 또는 유지류를 포함하고, 또는 이온 액체를 포함하지만, 이들의 성분에 추가하여 이하의 항목에 열거하는 아미노산 및 그 유도체, 다가 알코올, 비타민류 및 그 유도체, 지방산 및 그 유도체, 고분자 재료 등을 임의의 비율로 첨가해도 좋다.
상기 SS 효과를 부여하는 용액의 조성분으로서 아미노산 및 그 유도체를 배합해도 좋다. 아미노산으로서는, 예를 들면 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 히스티딘 등의 단체, 염산염, 2분자 이상으로 결합하고 있는 것, 그 고분자 등을 들 수 있다. 이들은 1종 단독이어도 2종류 이상의 혼합물이어도 좋다. 또한, 이들의 유도체이어도 좋다.
상기 SS 효과를 부여하는 용액의 조성분으로서 다가 알코올 및 그 유도체를 배합해도 좋다. 수산기를 분자 내에 갖고, 저증기압 물질인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 글리세린, 트리글리세리드, 폴리레조르시놀, 폴리페놀, 탄닌산, 우루시올 등 상기 천연 유래의 양친매성 화합물에서 예시한 것 이외의 것을 들 수 있고, 특히 탄닌산을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 SS 효과를 부여하는 용액의 조성분으로서 비타민류 및 그 유도체와 관련 물질을 배합해도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면 비타민B1, 비타민B2, 비타민B3, 비타민B5, 비타민B6, 비타민B7, 비타민B9, 비타민B12, 비타민A, 비타민D, 비타민E, 비타민K, 또는 이들 유도체를 들 수 있다. 그 중에서도 레티날, β-카로텐, 비타민B3(니코틴산, 니코틴아미드), 비타민B6(피리독신, 피리독살, 피리독사민), 비타민B9(엽산)가 바람직하다. 이 밖에 비타민 유도체로서는 D-아라보아스코르브산 , 세토플라빈T, 4-데옥시피리독신염산염, 디벤조일티아민, 2,6-디-O-팔미트일-L-아스코르브산, 플라빈아데닌디뉴클레오티드 2나트륨 수화물, (+)-5,6-O-이소프로필리덴-L-아스코르브산, 6-O-팔미트일-L-아스코르브산, 프로플라빈헤미황산염 수화물, 피리독살염산염, 5-인산피리독살 1수화물, 피리독신3,4-디팔미테이트, 이소아스코르브산 나트륨 1수화물, 티아민디술피드 수화물, 티아민디술피드질산염 등을 들 수 있다. 비타민 관련 물질로서는 염화콜린, 브롬화콜린, 시트르산 2수소콜린, 중타르타르산 콜린코엔자임Q10, 보효소Qo, 메티오닌메틸술포닐클로라이드, 이노시톨류 등을 들 수 있다.
고분자 재료로서는, 예를 들면 폴리비닐알코올, 테프론(등록상표), 폴리불화 비닐리덴, 테트라에톡시실란, 테트라메톡시실란, 티탄이소프로폭시드, 지르코늄부톡시드 등을 들 수 있다.
상기 SS 효과를 부여하는 용액의 조성분으로서 상술한 이온 액체를 다른 필수 성분에 첨가해서 배합해도 좋다.
상기 SS 효과를 부여하는 용액의 조성분으로서 양친매성 화합물, 금속 화합물, 당 등 상기에 예시한 성분 이외에 하기의 성분을 배합해도 좋다.
배위 화합물: 크라운 에테르, 시클로덱스트린, 레조르신 환상 4량체, 칼릭스아렌, 덴드리머 등.
지방산과 그 유도체: 리놀산, 올레산, 팔미트산, 리놀레산 등.
당과 지방산의 유도체: 히알루론산, 세라미드, 양친매성 화합물, 콜라겐, 아미노산, 정유, 바셀린 등.
겔화제: Poly(pyridinium-1,4-diyliminocarbonyl-1,4-phenylenemethylene chloride 등.
색소: 클로로필, 카로테노이도(리코펜), 피코빌린, 멜라닌 등 외에 파프리카 색소, 말라카이트그린 등.
도전성 폴리머: 폴리아세틸렌, 폴리아닐린, 폴리티오펜 등 이외에 나피온 등.
나노 클레이: Nanoclay Nanomer(R) Laponite의 이름으로 상품화되어 있는 것이나 몬모릴로나이트 등.
질량 분석용 시약으로 주로 MALDI법에 사용되는 매트릭스 소재: 3-아미노-4-히드록시벤조산, 시나핀산, 에스쿨레틴, 4-히드록시아조벤젠-2'-카르복실산, 3-히드록시-2-피리딘카르복실산, 니코틴산, 2',4',6'-트리히드록시아세토페논, α-시아노-4-히드록시신남산, 2,5-디히드록시벤조산 등.
본 발명의 증발 억제용 조성물은 고체 상태나 액상이면 좋지만, 진공 하에 있어서 시료 조직의 수분 환경을 유지하기 위해서 액상에서 점성이 높은 상태인 것이 바람직하다. 또한, 고체 상태의 것은 사용할 때에는 액상태로 해서 사용할 수 있다.
본 발명의 증발 억제용 조성물은, 예를 들면 상기한 각 성분을 물, 유기 용제 등에 녹여서 시료에 직접 코팅하는 등 하면 시료의 표면에 매우 얇은 막을 형성할 수 있다.
본 발명의 증발 억제용 조성물에 있어서 양친매성 화합물과, 금속 화합물 및 당의 배합 비율은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 다음과 같은 조성이 바람직한 것으로서 예시된다.
(1) 양친매성 화합물(도데실벤젠술폰산나트륨)/금속 화합물(에틸렌디아민니켈 착체)=0.005/0.001~0.05/0.01
(2) 양친매성 화합물(도데실황산 나트륨)/금속 화합물(에틸렌디아민니켈 착체)=0.005/0.0001~0.05/0.001
(3) 양친매성 화합물(도데실벤젠술폰산 나트륨)/금속 화합물(테트라암민코발트 착체)=0.005/0.001~0.05/0.01
(4) 양친매성 화합물(Tween 20)/당(트레할로스)=3/1~20/2
(5) 양친매성 화합물(Tween 20)/당(풀루란)=3/0.2~20/2
(6) 양친매성 화합물(Tween 20/당(이눌린)=3/0. 1~20/7
본 발명의 증발 억제용 조성물은 도포, 부착, 코팅, 피복 등에 의해 시료 표면에 적용된다. 예를 들면, 도포의 경우에는 도포한 후 여분의 액을 킴와이프스와 같은 부드러운 천형상의 종이, 여과지 등으로 흡수한다. TEM 관찰을 위한 시료는 매체의 도포, 부착, 코팅, 피복, 포매 등에 의해 처리된다.
이렇게 해서 시료 표면에 형성되는 박막의 막두께는, 예를 들면 5㎚~1000㎚의 범위로 할 수 있다.
또한, 상기에 있어서 「생물 시료」에는 원핵생물 및 진핵생물이 포함된다.
원핵생물에는 진정 세균, 고세균이 포함된다.
진정 세균에는 아키도박테리아문, 아퀴피케문, 악티노박테리아문, 엘루시미크로비움문, 칼디세리쿰문, 클라미디아문, 클로로비움문, 클로로프렉수스문, 크리시오게네스문, 열탈유간균문, 열미균문, 남조세균문, 겜마티모나스문, 시네르기스테스문, 스피로헤타문, 딕티오글로무스문, 데이노코쿠스-테르무스문, 테네리쿠테스문, 탈철간균문, 테르모토가문, 니트로스피라문, 박테로이데스문, 피르미쿠테스문, 피브로박테르문, 푸소박테리아문, 부유균문문, 프로테오박테리아문, 우미균문, 렌티스페라문이 포함된다.
고세균에는 크렌고세균문(계), 유리고세균문(계), 코르고세균문(계), 나노고세균문, 타움고세균문이 포함된다.
진핵생물에는 원생생물계, 식물계, 균계, 동물계가 포함된다.
원생생물계에는 해초류(녹조, 갈조, 홍조, 규조류, 유글레나 식물문, 크립토식물문, 와편모식물문), 원생동물[섬모충문, 근족충류(아메바, 유공충, 태양충, 방산충), 포자충문(정단복합체충, 미포자충, 점액포자충), 편모충(트리파노소마류, 미포자충, 초편모충, 다편모충)], 그 외 변형균문, 세포성 점균, 라비린툴라, 2모균문이 포함된다.
식물계에는 녹조문, 이끼 식물문, 차축조문, 유관속식물아계[고생 송엽란문, 석송문, 속새식물문, 나도고사리삼목, 양치식물문, 구과식물문(소나무문), 소철문, 은행나무문, 마황문, 피자식물문[목련문(쌍떡잎식물강(목련강), 홑떡잎식물강(백합 강))]이 포함된다.
균계에는 호상균문(호상균), 접합균문(털곰팡이, 리조푸스), 자낭균문(효모, 빵곰팡이), 담자균문(버섯), 불완전균, 지의식물문이 포함된다.
동물계에는 해면동물문, 평판동물문(털납작벌레), 자포동물문(해파리, 말미잘, 산호), 유즐동물문(빗해파리), 중생동물문(이배충), 편형동물문(와충류, 플라나리아), 유형동물문(유충), 악구동물문, 복모동물문, 윤형동물문(담륜충), 동문동물문, 구두동물문, 내항동물문, 선형동물문(회충, C. elegans), 유선형동물문(노래기), 외항동물문, 추충동물문, 완족동물문, 연체동물문(조개, 오징어, 낙지), 새예동물문, 성구동물문(별벌레), 의충동물문, 환형 동물문(지렁이, 갯지렁이), 완보동물문(곰벌레), 오구동물문, 유조동물문(발톱 벌레), 절족동물문[협각아문(바다거미강, 검미아강(투구게), 거미강(거미, 전갈)], 갑각아문(새우, 게), 다족아문[지네 강(순각강, 지네), 작은지네강(결합강, 작은지네), 소각강(소각강, 노래기붙이), 배각강(배각강, 노래기)), 육각아문(내구강, 외구강(곤충강))), 유수동물문, 극피동물문(섬게, 불가사리, 거미불가사리, 해삼, 바다나리), 모악동물문(화살벌레), 반색동물문(의삭류), 척삭동물문(미색동물아문(멍게), 두색색동물아문(활유어), 척추동물아문[무악상강(먹장어강, 두갑강(칠성장어)), 악구상(연골어강(상어, 가오리, 은상어), 육기강(실라칸스, 폐어), 조기강, 양생강, 파충강, 포유강, 새강))]이 포함된다.
본 발명의 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법에 의하면 이상에 설명한 증발 억제용 조성물을 사용해서 증발 억제용 조성물을 시료의 표면에 적용하여 박막을 형성하여 이 시료를 박막으로 덮고, 진공 하의 시료실에 수용된 이 박막으로 덮은 시료의 전자 현미경상을 표시 장치에 표시함으로써 시료를 관찰할 수 있다.
특히, 이 증발 억제용 조성물을 시료의 표면에 적용한 후, 증발 억제용 조성물을 적용한 시료에 전자선 또는 플라즈마를 조사해서 시료의 표면에 박막으로서 중합막(폴리머의 막)을 형성하여 이 중합막으로 시료를 덮고, 진공 하의 시료실에 수용된 이 중합막으로 덮은 시료의 전자 현미경상을 표시 장치에 표시함으로써 시료를 관찰할 수 있다.
이 중합막은 전자 현미경의 시료실 내에 있어서 시료 관찰용의 전자선을 시료에 조사함으로써 중합 반응시켜 시료의 표면에 형성할 수 있다.
또는 전자 현미경에 의한 시료 관찰 전에 미리 전자 현미경의 시료 관찰용의 전자선과는 별도의 전자선 또는 플라즈마를 시료에 조사함으로써 중합 반응시켜서 시료의 표면에 형성할 수 있다.
조사 조건은 사용하는 증발 억제용 조성물 등에 의해 적당히 선택되고, 특별히 한정되지 않지만 일례로서는 종래 전처리를 하지 않고 증발 억제용 조성물로 덮은 생물 시료에 SEM의 전자빔(예를 들면, 5.0㎸ 정도)을 시료실 내에서 60분간 조사함으로써 고진공(예를 들면, 10-4~10-7㎩)에서의 살아있는 그대로의 생물 시료의 SEM 관찰, 예를 들면 통상의 FE-SEM으로의 관찰이 가능해진다.
또한, 다른 일례에서는 종래 전처리를 하지 않고 증발 억제용 조성물로 덮은 생물 시료에 미리 3분간 플라즈마를 조사함으로써 고진공에서의 살아있는 그대로의 생물 시료의 SEM 관찰이나 TEM 관찰이 가능해진다.
이러한 전자선이나 플라즈마의 조사에 의해 시료의 표면은 얇은 중합막으로 덮인다. 이 중합막의 두께는 생물 시료 표면에 형성할 경우에는, 예를 들면 5㎚~1000㎚의 범위로 할 수 있다.
플라즈마의 조사에 의한 중합은, 예를 들면 종래의 이온 스퍼터링 장치 등을 사용해서 압력 10-3~105㎩, -20~+80℃, 1~10㎸ DC의 조건에서 행할 수 있다. 또는 종래의 플라즈마 중합에서 사용되고 있는 반응관과 같은 장치나 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명에 있어서 전자 현미경에 의한 관찰을 위해서 SEM 관찰을 위한 시료는 증발 억제용 조성물의 도포, 부착, 코팅, 피복 등에 의해 처리된다. 예를 들면, 도포의 경우에는 도포한 후 여분의 액을 킴와이프스와 같은 부드러운 천형상의 종이, 여과지 등으로 흡수한다. TEM 관찰을 위한 시료는 증발 억제용 조성물의 도포, 부착, 코팅, 피복, 포매 등에 의해 처리된다.
본 발명에 의하면 시료를 변형시키지 않고 시료 그대로의 상태를 손상하는 일 없이 관찰할 수 있게 된다. 또한, 전자 현미경을 사용해서 살아있는 그대로의 생물 시료를 살아있는 채로 관찰할 수 있어 움직이고 있는 모양을 관찰할 수 있다. 본 발명에 의하면 SS 효과를 부여하는 조성물은 전자 현미경의 시료에 한정되지 않고, 진공 중에서의 시료의 손실을 억제할 수 있다.
본 발명의 증발 억제용 조성물은 전자 현미경에 의한 시료를 관찰하기 위한 양호한 가시화제로서 기능한다. 즉, 생물/생체 시료인 것을 종래의 탈수, 화학 고정, 전자 염색을 실시하는 일 없이 살아있는 것을 살아있는 그대로의 상태로 전자 현미경의 경체 내에 넣는 것을 가능하게 하고, 관찰 시에 있어서도 감압 하에 있어서의 건조, 빙정, 온도 변화에 의한 대미지를 억제하고, 또한 시료 중의 수분/가스를 배리어하는 Surface Shielding Effect(SS 효과)를 부여한다.
또한, 전자선 조사에 의한 대전을 방지하는 등 해서 진공 하에 있어서 전자선 조사에 의해 양호한 2차 전자상을 부여한다. 살아있는 그대로의 시료가 살아있는 채의 상태에서의 높은 배율로 전자 현미경 관찰을 가능하게 한다.
즉, 본 발명의 증발 억제용 조성물은 전자 현미경에 의한 시료를 관찰하기 위한 양호한 가시화제로서 기능하기 때문에 주사형 전자 현미경, 투과형 전자 현미경으로의 시료 관찰로의 이용에 적합하다.
전자 현미경에 의한 시료 관찰 방법에 있어서 시료를 변형시키지 않고 시료 그대로의 형상을 관찰하는, 특히 생물/생체 시료에 있어서는 살아있는 그대로의 상태를 관찰하기 위한 수단과 조성물(시약 재료)을 제공한다.
생물 시료의 표면에는 화학 물질에 의해 보호막이 형성된다. 그 막은 진공 하에 있어서 생물 시료에 포함되어 있는 물이나 공기(가스상 물질)가 빠져 나가버리는 것을 방지한다. 막의 형성은 대기압 조건 하에서도 진공 조건 하에서도 형성가능하며, 형성된 막은 진공 하에서는 보다 강견한 것이 된다. 막의 형성은 1매 막이어도 다층이어도 가능하다.
외계와 내계를 가로막기 위해서 무기 물질(세라믹스)로 덮는 등의 방법이 있다. 이 방법에서는 표면이 단단하여 시료의 움직임을 방해할 수 있거나, 살아있는 시료일 경우에는 호흡이 방해되어 죽어버리는 경우도 있다. 이에 대하여 본 발명에서는 시료 전체를 자루와 같은 것으로 가지런히 덮는 방법에 의해 이들의 문제를 해결하고 있다.
본 발명의 증발 억제용 조성물은 대기압 하 및 진공 하에 있어서 생물체 내의 물이나 가스 등의 증발성이 있는 물질에 대하여 배리어능을 부여한다. 그 능력에 의해 진공 하에 있어서 생물 내 물질의 증발을 방지할 수 있다. 그리고 증발에 따른 온도 저하를 일으키지 않고 운동능을 부여하고, 또한 생물 시료 그대로의 형태를 유지할 수 있고, 생물을 활동할 수 있기 위한 체내 온도를 감압 하에 있어서도 유지할 수 있다.
본 발명의 증발 억제용 조성물로 시료를 덮을 경우, 생물 시료이면 살아있는 그대로의 코팅이 가능하며, 코팅한 후에도 생물은 생존한다. 살아있는 생물의 체표를 본 발명의 증발 억제용 조성물에 의한 박막으로 덮음으로써 생물 시료의 살아있는 상태를 주사형 전자 현미경으로 또한 생물 미세 표면 등의 구조를 관찰할 수 있다.
그리고 본 발명의 증발 억제용 조성물에 의하면 살아있는 생물의 체표를 덮음으로써 생물 시료의 살아있는 상태를 주사형 전자 현미경으로 대전(차지 업)하는 일 없이 직접 관찰을 가능하게 한다.
또한, 전자 현미경으로의 관찰에 있어서 지금까지 필요로 되어 온 생물/생체 시료의 시료 제작에 필요했던 화학 고정→도전 염색→탈수→건조→코팅, 또는 화학고정→탈수→포매→초박절→전자 염색→코팅 등의 행정을 행하는 일 없이 고배율로의 관찰을 가능하게 한다.
본 발명의 증발 억제용 조성물은 생물 시료에 한정되지 않고, 함수 시료가 젖은 채의 상태를 시료의 파괴를 수반하지 않고 진공 하에서의 전자 현미경 관찰을 가능하게 한다.
본 발명의 증발 억제용 조성물은 전자 현미경에 의한 측정 중에 있어서도 시료의 변형, 변질을 억제하고, 측정의 전후에 있어서 현저한 대미지를 시료에 부여하지 않는다. 진공 하에 있어서 수분/가스 배리어성능, 시료 내의 온도의 현저한 저하의 억제 이외에 진공 하에 있어서 전자선을 조사해도 수분/가스 배리어성능, 시료 내의 온도의 현저한 저하의 억제를 발현하는 것 이외에 전자선 조사에 의한 대전의 방지, 열적 대미지의 억제를 부여한다. 시료가 생물 시료인 경우에는 살아있는 상태의 것을 살아있는 그대로로 관찰할 수 있고, 경체로부터 꺼내도 시료에 아무런 변화는 보이지 않는다.
본 발명에 있어서 주사형 전자 현미경 및 투과형 전자 현미경에 의한 시료 관찰은 지금까지 알려져 있는 구성의 장치에 의해 행할 수 있다.
주사형 전자 현미경은 일반적으로 경통부(경체)과 조작부로 구성되어 있다. 경통부에서는 전자총에 의한 전자선의 발생, 전자 렌즈에 의한 전자선의 추출, 전자 프로브의 정형, 편향 코일에 의한 전자 프로브의 시료 표면의 관찰 영역에서의 주사 등이 행해진다. 시료가 적재되는 시료실은 시료대와, 시료로부터 방출된 신호를 검출하는 검출기를 구비하고 있다. 이 경통부는 청정한 진공에서 유지되어야 하기 때문에 목적에 따른 진공 배기 기구가 설치된다.
조작부는 전자선의 발생, 전자 렌즈의 렌즈 작용, 비점 보정, 전자 프로브의 시료면 상에서의 주사 범위(배율)나 주사 속도 등의 제어를 행하고, 또한 검출된 신호를 CRT 상에 영상으로서 표시한다.
또한, 정지한 주사형 전자 현미경상에서는 노이즈가 적은 로우 스캔 화상으로 관찰·촬영하는 것이 일반적이었지만, 살아있는 생물 시료의 주사형 전자 현미경에 의한 관찰에서는 TV 모드에서의 관찰, 즉 동화의 영상이 주가 된다. 따라서, 주사형 전자 현미경에는 노이즈가 적은(S/N이 작은) TV 모드 화상 표시·녹화 회로를 부가하여 고화질의 TV 모드로 주사형 전자 현미경상의 표시와 녹화를 행하는 것도 고려된다.
본 발명에 있어서 주사형 전자 현미경 및 투과형 전자 현미경에 의한 시료 관찰은 지금까지 알려져 있는 구성의 장치에 의해 행할 수도 있지만, 이어서 설명하는 신규인 구성의 장치는 본 발명의 방법에 적합하다.
도 22는 본 발명의 주사형 전자 현미경의 일실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다. 이 주사형 전자 현미경(SEM)(1)은 경체 내의 시료실에 배치하는 시료(4)를 도입할 수 있는 예비 배기실(2)과, 시료실 및 예비 배기실(2)을 탈기하는 배기 장치(7)를 구비하고 있다.
SEM(1)에 의한 시료 관찰에 있어서는 시료실 안에 시료를 세팅해서 관찰하지만, 고진공을 유지하기 위해서 시료실과 외부 사이에 시료 교환실로서 예비 배기실(2)을 형성하고, 시료 교환봉(3)에 의해 시료(4)의 출납을 행하도록 하고 있다.
이 예비 배기실(2)은 진공 펌프 등의 배기 장치(7)와 연통하고, 이들 사이의 배기 통로에는 니들 밸브 등의 조절 밸브(6)가 설치되고, 조절 밸브(6)보다 배기 상류측에는 피라니 진공계 등의 진공계(5)가 설치되어 있다. 이와 같이 시료실 및 예비 배기실(2)을 배기 장치(7)에 의해 서서히 탈기할 수 있는 기구를 부착하여 일정한 진공도를 유지하도록 해서 각각의 진공도에 있어서 다른 작업을 수행할 수 있도록 구성되어 있다.
생체 시료를 SEM(1)으로 관찰할 경우에 생체 시료를 대기압 중으로부터 진공 중으로 들여오지 않으면 안된다. 그런데, 생체 시료는 물론 미세한 구조체이어도 배기 시의 압력 변화나 풍압에 의해 장해를 받는다. 따라서, 대기압으로부터의 진공 배기를 보다 완화하는 기구를 설치하는 것이 필요해진다.
그래서 이 실시형태에서는 로터리 펌프 영역의 도달 진공도까지의 진공 배기 속도를 제어할 수 있도록 진공계(5)와 조절 밸브(6)를 조합한 기구를 SEM(1)에 부착하고 있다. 이와 같이 단계적으로 배기하는 장치(다른 진공도로 사용 가능)는 예비 배기실(2)과 시료실을 크게 하고, 또한 큰 방에 대하여 효율 좋게 진공으로 할 수 있도록 고기능의 진공 펌프를 설치하고, 또한 진공도 컨트롤이 순식간에 행해지도록 하는 것이 바람직하다.
도 23은 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다. 도 23(a)는 SEM 본체와 전원의 정면도, 도 23(b)는 그 측면도, 도 23(c)는 글로브 박스를 분리한 상태의 측면도, 도 23(d)는 글로브 박스를 부착한 상태의 측면도, 도 23(e)는 글로브 박스에 불활성 가스 봄베를 부착한 상태를 나타내는 사시도이다.
이 실시형태에서는 예비 배기실(2)에 글로브 박스(12)를 구비하고 있다. 예비 배기실(2)에 글로브 박스를 설치함으로써 진공 내에서의 작업을 행할 수 있다.
도 23(c) 및 도 23(d)에 나타내는 바와 같이 전원(9)을 부착한 SEM(1)의 경체(8)의 하부의 시료실(10)에 글로브 박스(12)를, 글로브 박스(12) 내의 하우징(14) 내에 시료 폴더(11)가 수용되도록 가로 댐으로써 설치하고 있다.
글로브 박스(12)는 고무 장갑 등이 부착된 작업용 입구(15)와, 내부를 볼 수 있는 창부(14)를 갖고, 진공 하에서 시료를 취급하는 작업을 할 수 있도록 되어 있다. 그리고 시료를 덮는 박막을 대기압에 노출하는 일 없이 시료 도입부로서의 글로브 박스(12) 내로부터 시료 폴더(11)에 의해 SEM(1) 내의 시료실로 도입하는 것이 가능하다. 예를 들면, SEM(1)에 연결된 글로브 박스(12) 내에 플라즈마 중합막을 성막할 수 있다.
또한, 글로브 박스(12)는 진공 하에서 샘플을 취급할 수 있는 것 이외에 도 23(e)에 나타내는 바와 같이 글로브 박스(12) 내에 아르곤이나 질소 등의 불활성 가스를 도입할 수 있는 불활성 가스 봄베(16)를 설치해서 글로브 박스(12) 안을 불활성 가스로 치환해서 사용하는 것도 가능하다. 이것은 플라즈마 처리 등에 적합하다. 예를 들면, 예비 배기실(2) 내에 중합 반응에 의해 시료의 표면에 중합막을 형성할 때에 질소, 아르곤 등의 특정 가스를 충전해서 반응을 컨트롤할 수 있다.
도 24는 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다. 이 실시형태에서는 예비 배기실(2)에 플라즈마 조사 장치 또는 전자선 조사 장치(18)를 구비하고 있다.
또한, 이 플라즈마 조사 장치 또는 전자선 조사 장치(18)는 SEM(1)의 시료실에 설치해도 좋다.
또한, 예비 배기실(2)은 투명한 진공 용기(17)를 구비하고 있다. 이 투명한 진공 용기(17)를 통해 플라즈마 조사 장치 또는 전자선 조사 장치(18)로부터의 플라즈마나 전자선을 조사할 수 있도록 되어 있다.
예를 들면, 플라즈마 조사 장치로서 종래의 이온 에칭에 사용되고 있는 조사 부분이 고정되어 있는 타입의 것에 추가해서 조사 부분이 손에 들고 담아지는 핸디 타입의 물건을 부가해서 각각을 사용할 수 있도록 할 수도 있다. 또한, 플라즈마의 조사 지름을 수㎚~수십㎝의 범위로 조정할 수 있도록 해서 시료(4)의 사이즈에 따라 조사 면적·강도를 바꿀 수 있도록 하면 전류량의 컨트롤뿐만 아니라 조사 지름 자신의 사이즈도 변경할 수 있는 장치가 된다.
시료(4)가 배치되는 시료대는 전자선이나 플라즈마의 조사에 의해 시료 전체면이 균일하게 중합할 수 있도록 3차원적으로 회전하는 기능을 갖고 있어도 좋다. 또는 시료 이면에까지 중합이 미치도록 전자선 또는 플라즈마가 시료대를 통과할 수 있는 디자인을 실시할 수 있다. 또한, 예비 배기실(2) 내에서의 작업을 찍는 CCD 카메라를 설치해서 예비 배기 상태의 시료(4)의 모양 및 플라즈마 조사의 모양을 모니터링할 수 있다.
이상의 예 등과 같이 예비 배기실(2)에 플라즈마나 전자선을 여러 가지 조건에서 조사할 수 있는 장치를 장착함으로써 플라즈마 조사 장치 또한 전자선 조사 장치(18)의 조사 시간이나 전류량 등의 컨트롤을 자동 또는 수동으로 컨트롤할 수 있다.
도 25는 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다. 이 실시형태에서는 시료실 내부(19)에 시료(4)로의 작용이 가능한 3차원 매니퓰레이터 장치(21)를 구비하고 있다.
또한, 이 3차원 매니퓰레이터 장치(21)는 예비 배기실(2)에 설치해도 좋다.
이 3차원 매니퓰레이터 장치(21)는 대상이 되는 살아있는 그대로의 생물 등의 시료의 움직임을 제어하기 위해서(관촬영 시의 흔들림 경감을 포함한다) 사용된다.
이 3차원 매니퓰레이터 장치(21)는 미세 생체 해부, 자극, 생체 신호 도출 등에도 사용할 수 있다.
예를 들면, 시료의 이동, 시료의 미세 해부, 또는 물리적 또는 화학적 자극에 사용되는 부재를 이동하기 위한 이동 기구로서 시료실 내부(19)에 3차원 매니퓰레이터 장치(21)를 설치할 수 있다. 생체 시료로의 시약의 접촉, 침투 등의 반응을 다이나믹하게 SEM(1)으로 관찰하는 데에는 전자선을 내서 2차 전자상 등을 관찰하면서 반응 실험을 개시할 수 있는 장치를 필요로 한다. 그 때문에 이동 기구로서의 3차원 매니퓰레이터 장치(21)를 SEM(1)으로 관찰하면서 시료(4)의 미세 해부, 물리적 또는 화학적 자극 등을 행하는 장치로서 사용할 수 있다. 도 26은 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다. 이 실시형태에서는 시료실 내부(19)에 2차 전자 검출기(22)와 시료(4)의 상대 위치를 3차원적으로 조절할 수 있는 검출 위치 조절 기구를 구비하고 있다.
2차 전자 검출기(22)를 SEM(1) 내에서 이동 가능하게 하고, 필요에 따라 시료(4)에 가까이하거나 특별한 각도로 접하도록 한다. 이것에 의해 검출 2차 전자의 증강이 가능해진다.
이 검출 위치 조절 기구는 고속도 촬영 장치를 설치하는데에 적합하다. 즉, 스캔 속도를 높일 수 있고, 슬로우 재생이 가능한 TV 모드를 위해서 검출기의 영역 제어 및 검출기까지의 작동 거리 제어 등을 가능하게 하여 2차 전자를 낭비 없이 모을 수 있다. 전후의 차분을 취해서 움직임을 특징화하는 소프트 등도 보간 기술로서 적용할 수 있다.
도 27은 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다. 이 실시형태에서는 시료실 내부(19)에 시료(4)의 색정보를 취득할 수 있는 고속도 컬러 카메라(23)를 구비하고 있다.
본 발명에 의하면 살아있는 그대로의 시료(4)를 관찰할 수 있게 되므로 시료(4)의 색은 그대로 유지된다. 그래서 시료실 내부(19)에 고속도 컬러 카메라(23)를 설치하여 색 등의 정보도 기록할 수 있게 함으로써 기록한 실제의 색을 이용하여 SEM 관찰한 상에 유사 컬러로서 응용할 수 있다.
도 28은 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다. 이 실시형태에서는 시료실 내부(19)의 시료대(20)의 온도를 조절할 수 있는 온도 조절 장치(24)를 구비하고 있다.
예를 들면, 경체 외로부터 시료대(20)의 온도를 -20℃~100℃ 사이로 컨트롤할 수 있는 자장의 영향을 받지 않는 스테이지를 설치할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 시료대(20)의 온도를 일정하게(예를 들면, 37℃) 하는 장치로서 펠티에 소자 등을 설치할 수 있다.
이 온도 조절 장치(24)에 의해 시료대(20)에 배치되는 생물 시료 등의 시료(4)의 온도를 조절할 수 있다.
도 29는 본 발명의 주사형 전자 현미경의 다른 실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이다. 이 실시형태에서는 시료실 내부(19)에 각종 센서(25)를 구비하고 있다.
센서(25)로서는, 예를 들면 전기 센서, 광 센서, 가스 센서, 물 센서, 온도 센서 등을 들 수 있다. 또한, 미약광으로 측정할 수 있는 고감도 센서(암시야 카메라 부착)를 설치할 수 있다.
이 센서(25)에 의해 시료대(20)에 배치되는 생물 시료 등의 시료(4)의 정보를 얻거나, 물리적 또는 화학적 자극 등으로의 응답, 중합 반응 등의 감시나 측정 등을 행할 수 있다.
도 30은 본 발명의 투과형 전자 현미경의 일실시형태의 요부를 모식적으로 나타낸 도면이며, 도 31은 도 30의 요부를 모식적으로 나타낸 사시도이다. 이 실시형태에서는 시료를 배치하는 그리드 메시(33)의 양면의 각각에 상기 증발 억제용 조성물에 전자선 또는 플라즈마를 조사해서 형성한 중합막(32)을 갖고 있다.
도 30에 나타내는 바와 같이 샌드위치상의 TEM용 시료 폴터는 c-링(30), o-랑(31)의 아래에 상하의 중합막(32)으로 끼워진 그리드 메시(33)가 배치되어 있다. 중합막(32)은, 예를 들면 진공 그리스와 O-링에 의해 밀봉할 수도 있다.
도 31에 나타내는 바와 같이 시료의 세포(34)는 그리드 메시(33)에 플라즈마에 의한 중합막(32)을 겹쳐 그 중합막(32) 위에 세포(34)를 적재하여 상기 증발 억제용 조성물을 더 도포하고, 플라즈마 조사해서 중합막(32)을 형성한다. 예를 들면, 투과형 전자 현미경은 도 22의 SEM의 경우와 마찬가지로 경체 내의 시료실에 배치하는 시료를 도입할 수 있는 예비 배기실과, 시료실 및 예비 배기실을 탈기하는 배기 장치를 구비할 수 있다. 또한, 도 24의 SEM의 경우와 마찬가지로 시료실 또는 예비 배기실에 플라즈마 조사 장치 또는 전자선 조사 장치를 구비할 수 있다. 이와 같이 TEM의 예비 배기실 내에서 플라즈마 또는 전자선 중합이 행해지도록 개량한 중에 상기 증발 억제용 조성물을 도포하고, 플라즈마 조사해서 중합막(32)을 형성할 수 있다. 플라즈마의 조사 지름을 수㎚~수십㎝의 범위로 조절함으로써 시료의 사이즈에 따라 조사 면적을 변경할 수 있다. 또한, 이러한 방법에 의해 표적 세포 및 배양액을 시료 폴더 내에 밀봉함으로써 고진공 중이어도 살아있는 동적 해석을 행할 수 있다. 금 콜로이드를 결합시킨 시료도 관찰 가능하다. 또한, STEM(Scanning transmission electron microscope)을 개량해서 TEM 내에 넣은 살아있는 시료에 조사되는 전자선량을 감소시킴으로써 장시간의 관찰이 가능해진다.
실시예
이하에 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 조금도 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예에 있어서 SEM 관찰은 전형적으로는 전계 방사형 주사 전자 현미경[FESEM, S-4800(Hitachi)]을 사용해서 5.0㎸의 가속 전압으로 행했다. 생물 시료의 다이나믹한 움직임을 기록하기 위해서 SEM의 화상 데이터는 직접적으로 비디오·레코더(Hi-band digital formatted video recorder, Pioneer, DVR-DT95)로 전송했다.
TEM 관찰은 전형적으로는 120㎸의 가속 전압으로 JEM-1220(JEOL)을 사용해서 행했다.
플라즈마 중합은 전형적으로는 금속 타겟이 해체된 이온 스퍼터링 장치(JFC-1100, JEOL)에 의해 행하고, 약 1.0㎩의 진공 레벨에서 실온에 있어서 1.0㎸ DC(8.0㎃)로 3분간 플라즈마 조사를 행했다.
<실시예 1>
양친매성 화합물로서 소디움 라우릴벤젠술포네이트를 0.1% 수용액으로 하고, 금속 화합물로서 에틸렌디아민니켈 착체를 0.01wt%를 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 잎벌레를 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 1). 전자빔 조사 개시 후에도 잎벌레가 운동하는 모양이 관찰되었다.
그리고 SEM 관찰 후에 시료실로부터 잎벌레를 인출한 후에도 생존하고 있었다.
<실시예 2>
양친매성 화합물로서 소디움 라우릴벤젠술포네이트를 0.1% 수용액으로 하고, 금속 화합물로서 에틸렌디아민니켈 착체를 0.01wt%를 사용해서 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 톡토기를 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 2). 전자빔 조사 개시 후에도 톡토기가 운동하는 모양이 관찰되었다.
그리고 SEM 관찰 후에 시료실로부터 톡토기를 인출한 후에도 생존하고 있었다.
<실시예 3>
양친매성 화합물로서 Tween 20을 10% 수용액으로 하고, 당으로서 트레할로오스를 1%(w/v), 풀루란을 0.1%(w/v) 사용해서 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 아프리카 깔따구를 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 3). 전자빔 조사 개시 후에도 아프리카 깔따구가 운동하는 모양이 관찰되었다.
그리고 SEM 관찰 후에 시료실로부터 아프리카 깔따구를 인출한 후에도 생존하여 성충으로 변태했다.
<실시예 4>
양친매성 화합물로서 Tween 20을 10% 수용액으로 하고, 당으로서 트레할로오스를 1%(w/v), 풀루란을 0.1%(w/v) 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레(흰줄숲모기)의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 4). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
그리고 SEM 관찰 후에 시료실로부터 장구벌레의 유충을 인출한 후에도 생존하여 성충으로 변태했다.
<실시예 5>
양친매성 화합물로서 Tween 20을 10% 수용액으로 하고, 당으로서 트레할로오스를 1%(w/v), 풀루란을 0.1%(w/v) 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 TEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 5). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
<실시예 6>
양친매성 화합물로서 소디움 라우릴벤젠술포네이트를 0.1% 수용액으로 하고, 금속 화합물로서 에틸렌디아민니켈 착체를 0.01wt%를 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
개미를 젤라틴 캡슐로 감싸고, 대전 방지용 카본 테이프로 고정하여 젤라틴으로 구멍을 막았다. 이렇게 해서 개미를 젤라틴 캡슐에 넣어 내부의 대기를 유지하면서 관찰 부위의 다리만을 캡슐 밖으로 꺼내 증발 억제용 조성물을 이 다리 부분에 도포하고, 살아있는 SEM 관찰을 행했다. 다리 부분의 움직임을 비디오 촬영할 수 있었다(도 6).
그리고 SEM 관찰 후에 시료실로부터 개미를 인출한 후에도 생존하고 있었다.
<실시예 7>
양친매성 화합물로서 소디움 라우릴벤젠술포네이트를 0.1% 수용액으로 하고, 금속 화합물로서 에틸렌디아민니켈 착체를 0.01wt%를 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 송사리의 비늘을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 TEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 7). 전자빔 조사 개시 후에도 내부의 미세 구조가 변화되는 모양이 관찰되었다.
<실시예 8>
양친매성 화합물로서 Tween 20을 10% 수용액으로 하고, 당으로서 트레할로오스를 1%(w/v), 풀루란을 0.1%(w/v) 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
거피를 마이크로 튜브에 사육수째 봉입하고, 꼬리 지느러미만을 튜브 밖으로 꺼내서 덴탈 왁스로 구멍을 막았다. 이렇게 해서 거피를 마이크로 튜브에 넣어서 내부의 대기 및 수계를 유지하면서 관찰 부위의 꼬리 지느러미만을 튜브 밖으로 꺼내서 증발 억제용 조성물을 이 꼬리 지느러미에 도포하고, 살아있는 SEM 관찰을 행했다. 전자빔 조사 개시 후에도 꼬리 지느러미의 움직임을 비디오 촬영할 수 있었다(도 8).
그리고 SEM 관찰 후에 시료실로부터 거피를 인출한 후에도 생존하고 있었다.
<실시예 9>
양친매성 화합물로서 Tween 20을 10% 수용액으로 하고, 당으로서 트레할로오스를 1%(w/v), 풀루란을 0.1%(w/v) 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
히드라 외배엽성 상피세포를 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 TEM 시료실에 넣어서 전자빔 조사 개시 후에도 살아있는 채로 비디오 촬영했다(도 9). 도면 중 좌측이 광학 현미경상, 우측이 TEM의 비디오 촬영상이다. 종래의 전처리는 행하지 않고 상기 처리를 행한 후 직접적으로 고진공 하에서 3분간 전자선 조사(120㎸)를 행했다.
<실시예 10>
증발 억제용 조성물로서 유지류를 사용했다.
살아있는 플라나리아를 증발 억제용 조성물(실리콘 오일)에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 10). 전자빔 조사 개시 후에도 플라나리아가 운동하는 모양이 관찰되었다.
그리고 SEM 관찰 후에 시료실로부터 플라나리아를 인출한 후에도 생존하고 있었다.
<실시예 11>
양친매성 화합물로서 Tween 20을 사용했다. 자립한 박막을 제작하기 위해서 50%(v/v)의 Tween 20을 100% 에탄올에 용해하고, 유리 위에 스핀코터(3000rpm, 5s)(SC8001, Aiden)를 사용해서 넓혀서 플라즈마 중합했다. 중합 후의 박막은 유리판으로부터 에탄올 중에서 분해시켰다.
도 11(a)는 플라즈마 조사에 의해 작성한 자립성의 중합막(Tween 20)의 광학 현미경상, 도 11(b)는 Tween 20의 화학식, 도 11(c)는 막표면의 AFM상, 도 11(d)는 막단면의 TEM상이다. 도 11(d)에 있어서 화살표 사이가 Tween 20의 중합막이다. 조사측의 표면(화살촉 사이의 부분)에는 얇은 층이 형성되어 있었다.
이어서, 양친매성 화합물로서 Tween 20을 1% 수용액으로서 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 12). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
도 12는 SEM 종래상과, 플라즈마 조사막(Tween 20)으로 코팅된 시료에 의한 신규 SEM상이다. 도 12(a)는 장구벌레 광학 현미경상, 도 12(b)~도 12(d)는 SEM 종래상, 도 12(f)~도 12(n)은 플라즈마 조사 개체[Tween 20 도포 없음(도 12f-도 12i), 있음(도 12k-도 12n)], (도 12e, 도 12j, 도 12o)는 시료 단면의 TEM상이다.
살아있는 장구벌레(도 12a, time 0)에 SEM 내의 고진공 하에서 전자선을 30분 조사했다(도 12b-도 12d, time 30). 화살촉은 정전 대전의 영역을 나타낸다.
도 12f-도 12i에서는 1% Tween 20으로 덮은 살아있는 장구벌레에 3분간 플라즈마 조사하고(도 12f, time 0), 그 후 SEM으로 30분간 관찰했다(도 12g-도 12i).
도 12k-도 12n에서는 살아있는 장구벌레를 종래의 SEM으로 전자선 조사하고(도 12k는 광학 현미경상), 그 후 관찰했다(도 12l-도 12n).
도 12b, 도 12g, 도 12l 각각의 사각형 안을 확대하고(도 12c, 도 12h, 도 12m), 더 확대했다(도 12d, 도 12i, 도 12n).
(도 12e, 도 12j, 도 12o)는 시료 단면의 TEM상이며, 화살촉 사이의 층은 플라즈마 처리에 의해 형성된 중합막이다.
<실시예 12>
양친매성 화합물로서 TritonTMX-100을 사용했다. 1%(v/v)의 TritonTM X-100을 증류수에 용해하고, 유리 위에 스핀코터를 사용해서 넓혀서 플라즈마 중합하여 실시예 11과 마찬가지로 해서 자립성의 박막을 얻었다. 도 13(a)는 플라즈마 조사에 의해 작성한 자립성의 중합막(TritonTMX-100)의 광학 현미경상, 도 13(b)는 TritonTM X-100의 화학식이다.
이어서, 양친매성 화합물로서 TritonTM X-100을 1% 수용액으로서 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 13). 도 13c는 0min, 도 13d는 30min에서의 모양을 나타내고, 도 13d의 사각형 안을 확대하고(도 13e), 더 확대했다(도 13f). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
<실시예 13>
양친매성 화합물로서 pluronic(R) F-127을 사용했다. 1%(v/v)의 pluronic(R) F-127을 증류수에 용해하고, 유리 위에 스핀코터를 사용해서 넓혀서 플라즈마 중합하여 실시예 11과 마찬가지로 해서 자립성의 박막을 얻었다. 도 14(a)는 플라즈마 조사에 의해 작성한 자립성의 중합막(pluronic(R) F-127)의 광학 현미경상, 도 14(b)는 pluronic(R) F-127의 화학식이다.
이어서, 양친매성 화합물로서 pluronic(R) F-127을 1% 수용액으로서 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 14). 도 14c는 0min, 도 14d는 30min에서의 모양을 나타내고, 도 14d의 사각형을 확대하고(도 14e), 더 확대했다(도 14f). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
<실시예 14>
양친매성 화합물로서 Brij(R)35를 사용했다. 1%(v/v)의 Brij(R)35를 증류수에 용해하고, 유리 위에 스핀코터를 사용해서 넓혀서 플라즈마 중합하여 실시예 11과 마찬가지로 해서 자립성의 박막을 얻었다. 도 15(a)는 플라즈마 조사에 의해 작성한 자립성의 중합막(Brij(R)35)의 광학 현미경상, 도 15(b)는 Brij(R)35의 화학식이다.
이어서, 양친매성 화합물로서 Brij(R)35를 1% 수용액으로서 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 15). 도 15c는 0min, 도 15d는 30min에서의 모양을 나타내고, 도 15d의 사각형을 확대하고(도 15e), 더 확대했다(도 15f). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
<실시예 15>
양친매성 화합물로서 CHAPS를 사용했다. 1%(v/v)의 CHAPS를 증류수에 용해하고, 유리 위에 스핀코터를 사용해서 넓혀서 플라즈마 중합하여 실시예 11과 마찬가지로 해서 자립성의 박막을 얻었다. 도 16(a)는 플라즈마 조사에 의해 작성한 자립성의 중합막(CHAPS)의 광학 현미경상, 도 16(b)는 CHAPS의 화학식이다.
이어서, 양친매성 화합물로서 CHAPS를 1% 수용액으로서 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 16). 도 16c는 0min, 도 16d는 30min에서의 모양을 나타내고, 도 16d의 사각형을 확대하고(도 16e), 더 확대했다(도 16f). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
<실시예 16>
양친매성 화합물로서 MEGA8을 사용했다. 1%(v/v)의 MEGA8을 증류수에 용해하고, 유리 위에 스핀코터를 사용해서 넓혀서 플라즈마 중합하여 실시예 11과 마찬가지로 해서 자립성의 박막을 얻었다. 도 17(a)는 플라즈마 조사에 의해 작성한 자립성의 중합막(MEGA8)의 광학 현미경상, 도 17(b)는 MEGA8의 화학식이다.
이어서, 양친매성 화합물로서 MEGA8을 1% 수용액으로서 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 17). 도 17c는 0min, 도 17d는 30min에서의 모양을 나타내고, 도 17d의 사각형을 확대하고(도 17e), 더 확대했다(도 17f). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
<실시예 17>
양친매성 화합물로서 소디움 콜레이트를 사용했다. 1%(v/v)의 소디움 콜레이트를 증류수에 용해하고, 유리 위에 스핀코터를 사용해서 넓혀서 플라즈마 중합하여 실시예 11과 마찬가지로 해서 자립성의 박막을 얻었다. 도 18(a)는 플라즈마 조사에 의해 작성한 자립성의 중합막(소디움 콜레이트)의 광학 현미경상, 도 18(b)는 소디움 콜레이트의 화학식이다.
이어서, 양친매성 화합물로서 소디움 콜레이트를 1% 수용액으로서 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 18). 도 18c는 0min, 도 18d는 30min에서의 모양을 나타내고, 도 18d의 사각형을 확대하고(도 18e), 더 확대했다(도 18f). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
<실시예 18>
양친매성 화합물로서 n-도데실-β-D-말토사이드를 사용했다. 1%(v/v)의 n-도데실-β-D-말토사이드를 증류수에 용해하고, 유리 위에 스핀코터를 사용해서 넓혀서 플라즈마 중합하여 실시예 11과 마찬가지로 해서 자립성의 박막을 얻었다. 도 19(a)는 플라즈마 조사에 의해 작성한 자립성의 중합막(n-도데실-β-D-말토사이드)의 광학 현미경상, 도 19(b)는 n-도데실-β-D-말토사이드의 화학식이다.
이어서, 양친매성 화합물로서 n-도데실-β-D-말토사이드를 1% 수용액으로서 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 19). 도 19c는 0min, 도 19d는 30min에서의 모양을 나타내고, 도 19d의 사각형을 확대하고(도 19e), 더 확대했다(도 19f). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
<실시예 19>
양친매성 화합물로서 n-옥틸-β-D-글루코시드를 사용했다. 1%(v/v)의 n-옥틸-β-D-글루코시드를 증류수에 용해하고, 유리 위에 스핀코터를 사용해서 넓혀서 플라즈마 중합하여 실시예 11과 마찬가지로 해서 자립성의 박막을 얻었다. 도 20(a)는 플라즈마 조사에 의해 작성한 자립성의 중합막(n-옥틸-β-D-글루코시드)의 광학 현미경상, 도 20(b)는 n-옥틸-β-D-글루코시드의 화학식이다.
이어서, 양친매성 화합물로서 n-옥틸-β-D-글루코시드를 1% 수용액으로서 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 20).도 20c는 0min, 도 20d는 30min에서의 모양을 나타내고, 도 20d의 사각형을 확대하고(도 20e), 더 확대했다(도 20f). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
<실시예 20>
이온 액체로서 1,3-디알릴이미다졸륨 브로마이드 사용했다. 1%(v/v)의 1,3-디알릴이미다졸륨 브로마이드 증류수에 용해하고, 유리 위에 스핀코터를 사용해서 넓혀서 플라즈마 중합하여 실시예 11과 마찬가지로 해서 자립성의 박막을 얻었다. 도 20(a)는 플라즈마 조사에 의해 작성한 자립성의 중합막(1,3-디알릴이미다졸륨 브로마이드)의 광학 현미경상, 도 20(b)는 1,3-디알릴이미다졸륨 브로마이드의 화학식이다.
이어서, 이온 액체로서 1,3-디알릴이미다졸륨 브로마이드 1% 수용액으로서 사용하여 증발 억제용 조성물을 조제했다.
살아있는 장구벌레의 유충을 증발 억제용 조성물에 1분간 침지하고, 그 후 인출해서 잉여분을 닦아내고, 그 체표를 박막으로 덮었다.
그 후 SEM 시료실에 넣어서 비디오 촬영했다(도 21). 도 21c는 0min, 도 21d는 30min에서의 모양을 나타내고, 도 21d의 사각형을 확대하고(도 21e), 더 확대했다(도 21f). 전자빔 조사 개시 후에도 장구벌레의 유충이 운동하는 모양이 관찰되었다.
1 : 주사형 전자 현미경(SEM) 2 : 예비 배기실
3 : 시료 교환봉 4 : 시료
5 : 진공계 6 : 조절 밸브
7 : 진공 펌프 8 : 경체
9 : 전원 10 : 시료실
11 : 시료 폴더 12 : 글로브 박스
13 : 글로브 박스 내의 하우징 14 : 창부
15 : 작업용 입구 16 : 불활성 가스 봄베
17 : 진공 용기
18 : 플라즈마 조사 장치 또는 전자선 조사 장치
19 : 시료실 내부 20 : 시료대
21 : 3차원 매니퓰레이터 22 : 2차 전자 검출기
23 : 고속도 컬러 카메라 24 : 온도 조절 장치
25 : 센서 30 : c-링
31 : o-링 32 : 중합막
33 : 그리드 메시 34 : 세포

Claims (26)

  1. 삭제
  2. 양친매성 화합물, 유지류 및 이온 액체로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 증발 억제용 조성물을 진공 하에 있어서 증발성이 있는 물질을 함유하는 시료의 표면에 적용하는 공정과, 증발 억제용 조성물을 적용한 상기 시료에 전자선 또는 플라즈마를 조사해서 시료의 표면에 박막으로서 중합막을 형성하여 이 중합막으로 상기 시료의 표면 전체를 덮는 공정과, 진공 하의 시료실에 수용된 이 중합막으로 덮은 시료의 전자 현미경상을 표시 장치에 표시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    전자 현미경의 시료실 내에 있어서 시료 관찰용의 전자선을 시료에 조사함으로써 중합 반응시키고, 시료의 표면 전체에 박막으로서 중합막을 형성하는 것을 특징으로 하는 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    전자 현미경에 의한 시료 관찰 전에 미리 전자 현미경의 시료 관찰용의 전자선과는 별도의 전자선 또는 플라즈마를 시료에 조사함으로써 중합 반응시키고, 시료의 표면 전체에 박막으로서 중합막을 형성하는 것을 특징으로 하는 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    증발 억제용 조성물은 양친매성 화합물과, 금속 화합물 및 당으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 것을 특징으로 하는 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법.
  6. 제 2 항에 있어서,
    함수 시료가 젖어있는 그대로의 상태의 전자 현미경상을 함수 시료의 파괴를 수반하지 않고 상기 표시 장치에 표시하는 것을 특징으로 하는 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법.
  7. 제 2 항에 있어서,
    증발 억제용 조성물을 생존하고 있는 생물 시료의 체표에 적용해서 박막을 형성하여 이 시료의 표면 전체를 박막으로 덮는 공정과, 진공 하의 시료실에 놓인 이 박막으로 덮은 생물 시료가 살아있는 그대로의 운동의 전자 현미경상을 표시 장치에 표시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 박막에 의해 생물 시료체 내로부터의 증발에 따른 온도 저하를 억제해서 생물 시료에 운동능을 부여하고, 또한 생물 시료 그 자체의 형태를 유지하는 것을 특징으로 하는 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 박막에 의해 생물 시료가 활동할 수 있기 위한 체내 온도를 진공 하에 있어서도 유지하는 것을 특징으로 하는 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법.
  10. 제 2 항에 있어서,
    주사형 전자 현미경을 사용해서 시료의 차지 업을 일으키지 않고 시료의 전자 현미경상을 표시 장치에 표시하는 것을 특징으로 하는 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법.
  11. 진공 하에 있어서 증발성이 있는 물질을 함유하는 시료의 표면 전체에 박막을 형성해서 이 시료를 덮고, 상기 증발성이 있는 물질에 대하여 진공 하에 있어서 그 증발을 억제하는 배리어능을 부여하기 위해서 사용되는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물로서,
    양친매성 화합물, 유지류 및 이온 액체로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하고, 증발 억제용 조성물을 적용한 시료에 전자선 또는 플라즈마를 조사함으로써 시료의 표면 전체에 박막으로서 중합막이 형성되어 이 중합막으로 시료를 덮는 것을 특징으로 하는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    생존하고 있는 생물 시료의 체표에 박막을 형성해서 이 생물 시료를 덮고, 생물 시료체 내의 증발성이 있는 물질에 대하여 진공 하에 있어서 그 증발을 억제하는 배리어능을 부여하기 위해서 사용되는 것을 특징으로 하는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물.
  13. 삭제
  14. 제 11 항에 있어서,
    양친매성 화합물과, 금속 화합물 및 당으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 것을 특징으로 하는 진공 하에서의 증발 억제용 조성물.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제 2 항에 기재된 전자 현미경에 의한 시료의 관찰 방법에 사용되는 투과형 전자 현미경으로서,
    경체 내의 시료실에 배치하는 시료를 도입할 수 있는 예비 배기실과, 시료실 및 예비 배기실을 탈기하는 배기 장치를 구비하고, 상기 시료를 배치하는 그리드 메시의 양면의 각각에, 상기 증발 억제용 조성물에 전자선 또는 플라즈마를 조사해서 형성한 중합막을 갖는 것을 특징으로 하는 투과형 전자 현미경.
  24. 제 23 항에 있어서,
    예비 배기실에 글로브 박스를 구비하는 것을 특징으로 하는 투과형 전자 현미경.
  25. 제 23 항에 있어서,
    시료실 또는 예비 배기실에 플라즈마 조사 장치 또는 전자선 조사 장치를 구비하는 것을 특징으로 하는 투과형 전자 현미경.
  26. 삭제
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