CN108802080A - 一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法，包括以下步骤：步骤1）、在玉米成熟种子中选定需要观察淀粉生长环结构的选定区域，使用金属刀片在选定区域切开玉米种子，并用金属刀片对玉米种子块的胚乳切面进行粗修平；步骤2）、使用超薄切片机将平整切面进行精修平；步骤3）、使用水蒸汽处理光滑切面，使光滑切面充分吸水后在恒温恒湿环境中密闭干燥；步骤4）、使用离子溅射镀膜仪对干燥后的光滑切面进行真空喷金处理；步骤5）、使用扫描电子显微镜观察并拍摄光滑切面处胚乳淀粉的生长环结构。通过本发明，相比于以前研究玉米胚乳淀粉生长环结构的方法，直接使用玉米成熟种子作为材料，其操作步骤简单，明显缩短了研究时间。

Description

一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法
技术领域
本发明属于淀粉结构特性分析技术领域，具体涉及一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法。
背景技术
玉米是一种重要的粮食作物、饲料作物和经济作物，其胚乳富含淀粉，在食品、医药、纺织、化工等领域中应用广泛。淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成的半晶体颗粒。淀粉颗粒悬浮于水中，在光学显微镜下呈现明暗相间的环带，被称为生长环。其中亮的生长环主要由直链淀粉组成，无晶体结构，易被水解，称之为无定形生长环；而暗的生长环是由支链淀粉侧链有规律地排列形成的，含有晶体结构，不易被水解，称之为半晶体生长环。淀粉生长环是淀粉半晶体结构的主要特征之一，反映了淀粉的显微结构和组装模式。玉米淀粉生长环是决定玉米淀粉结构和功能特性的主要因素之一，进而也决定了玉米淀粉的加工和利用。因此研究玉米淀粉的生长环结构对玉米淀粉的开发利用具有非常重要的意义。
淀粉悬浮液在普通光学显微镜下可直接观察到淀粉生长环的形态结构，但是不适用于小粒径的淀粉颗粒，也无法清晰地观察淀粉生长环的显微结构。通过淀粉的酶或酸水解，并借助扫描电子显微镜、透射电子显微镜和原子力显微镜可进一步观察生长环的显微结构。然而，这种方法往往会导致淀粉无定形生长环结构发生不同程度的水解破坏，难以观察到完整的生长环结构。此外，这种方法需要进行淀粉的提取和水解处理，制样的过程繁琐，耗时较长。为解决这些方法在玉米淀粉生长环结构研究中的缺陷，同时基于无定形生长环和半晶体生长环吸水膨胀特性的差异，我们发明了一种用于玉米成熟胚乳淀粉生长环的原位观察方法。一方面，该方法借助扫描电子显微镜可原位观察玉米胚乳中淀粉的生长环结构，避免了酸或酶水解对生长环结构的破坏。另一方面，该方法对玉米胚乳淀粉的生长环进行原位观察，无需进行淀粉的提取，整个过程简单快捷，大大降低了研究难度，缩短了研究时间。今后，该方法不仅可以广泛用于玉米成熟胚乳淀粉生长环结构的研究，而且也为其他作物淀粉生长环结构的研究提供技术参考。
发明内容
本发明的目的在于鉴于上述现有的玉米胚乳淀粉生长环观察方法的缺陷，提供一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法。
本发明的目的是这样实现的，一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）、准备干燥的玉米成熟种子，在玉米成熟种子的胚乳中选定需要观察淀粉生长环结构的选定区域，使用金属刀片在选定区域切开玉米成熟种子，使玉米成熟种子切分为2块玉米种子块，并对玉米种子块的切面进行粗修平，直至形成平整切面；
步骤2）、使用超薄切片机将玉米种子块上的平整切面进行精修平，直至形成光滑切面；
步骤3）、使用水蒸汽处理玉米种子块的光滑切面，使光滑切面充分吸水后在恒温恒湿环境中密闭干燥；
步骤4）、使用离子溅射镀膜仪对干燥后的玉米种子块的光滑切面进行真空喷金处理；
步骤5）、使用扫描电子显微镜观察并拍摄真空喷金处理后的玉米种子块的光滑切面处胚乳淀粉的生长环结构，实现玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察。
其中：步骤1）中，选取外形较好的干燥的玉米成熟种子，使用金属刀片在选定区域切开玉米种子，使得玉米种子形成2块玉米种子块，并用金属刀片轻轻刮去玉米种子块中选定区域切面的凸起，直至形成平整切面。所述玉米成熟种子中胚乳的选定区域可根据需要自由选择胚乳的各区域，可以为纵向上的胚乳冠部、胚乳中部和胚乳基部，也可以为横向上的近胚部和远胚部。
步骤2）中，使用超薄切片机将玉米种子块上的平整切面进行精修平时，将经步骤1）粗修平后的玉米种子块固定在超薄切片机样品夹上，使用锋利的玻璃刀对粗修平后的平整切面进行反复修平，每次修平时对粗修平后的平整切面所切割的厚度均为500 nm，直至形成光滑的切面。
步骤3）中，使用水蒸汽处理玉米种子块上的光滑切面，使光滑切面充分吸水后在恒温恒湿环境中密闭干燥；包括以下步骤；
（1）玉米种子块的固定，使用双面胶将修好的玉米种子块固定在条形薄片上，玉米种子块的光滑切面朝上，并保证光滑切面在水平方向不发生倾斜；
（2）玉米种子块光滑切面的吸水，将固定好玉米种子块的条形薄片反扣于盛水的容器上，使玉米种子块的光滑切面面向容器内，同时光滑切面与容器内的水面保持6-10 cm的距离，然后将盛有水的容器、反扣于盛水的容器上的固定好玉米种子块的条形薄片一起置于25-30 oC密闭烘箱中，使光滑切面在25-30 oC密闭烘箱中吸水36-48 h；
（3）玉米种子块光滑切面的干燥，将吸水后的玉米种子块静置在温度恒定为25-30 oC、湿度恒定为25-35%的封闭环境中自然干燥48-60 h。
所述条形薄片为金属或塑料条形薄片。
步骤4）中，将经步骤5）干燥后的玉米种子块小心去除胚组织，使用双面胶将玉米种子块固定在铝制样品台上，玉米种子块的光滑切面朝上，并保证光滑切面在水平方向不发生倾斜，然后将铝制样品台放入离子溅射镀膜仪中，盖紧离子溅射镀膜仪盖子对离子溅射镀膜仪的样品室进行抽真空处理，期间间歇性释放氩气，待真空度达到10-4 mbar时打开高压开关，使电流稳定在37 mA后对玉米种子块的光滑切面进行喷金处理，喷金时间为90-120 s。
步骤5）中，所述扫描电子显微镜观察及拍照，先将光滑切面喷金后的铝制样品台放入扫描电子显微镜的样品室中，并使铝制样品台归位，设置扫描电子显微镜加速电压为3KV或5 KV，电流为10μA，在低倍模式30X下寻找玉米种子块上光滑切面的目标区域；确定目标区域后，将扫描电子显微镜转换为高倍模式，设置扫描电子显微镜的物镜与玉米种子块的光滑切面之间的工作距离为8-10 mm，进行聚焦和调节像散；聚焦清晰后调好拍摄倍数，在慢扫模式下拍摄和保存图片，实现玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察。
本发明方法先进科学，通过本发明，包括的步骤为，（1）选取外形较好的干燥的玉米种子，选定需要观察淀粉生长环结构的胚乳区域(选定区域)，使用金属刀片在选定区域切开玉米种子，挑选大小合适的玉米种子块，并轻轻刮去玉米种子块中该区域切面的凸起，直至形成平整切面。（2）将刀片粗修平后的玉米种子块固定在超薄切片机样品夹上，设置切片厚度为500 nm（即，每次修平时对粗修平后的平整切面所切割的厚度均为500 nm），利用锋利的玻璃刀对切面进行反复修平，直至形成光滑切面；（3）使用金属刀片对附有光滑切面的玉米种子块进行修整，并用双面胶将修好的玉米种子块以光滑切面在上固定在条形的塑料或金属薄片上，同时保证光滑切面在水平方向不发生倾斜；（4）将固定好玉米种子块的条形薄片反扣于盛水的容器上，使切面与水面保持6-10 cm的距离，在25-30 oC密闭烘箱中吸水36-48 h；（5）将吸水后的样品（玉米种子块）静置在恒定温度为25-30 oC，恒定湿度为25-35%的封闭环境中自然干燥48-60 h；（6）将干燥后的玉米种子块小心去除胚组织，使用双面胶将玉米种子块以光滑切面在上固定在铝制样品台上，并保证切面在水平方向不发生倾斜，然后将铝制样品台放入离子溅射镀膜仪中，盖紧盖子进行抽真空处理，期间间歇性释放氩气，待真空度达到10-4 mbar时打开高压开关，使电流稳定在37 mA进行喷金处理（对光滑切面），喷金时间为90-120 s；（7）光滑切面喷金后的铝制样品台放入样品室中，使样品台归位，设置扫描电子显微镜的加速电压为3 KV或5 KV（不低于3 KV，不高于5 KV），电流为10μA，在低倍模式30X下寻找目标区域；（8）确定目标区域后，转换高倍模式，设置扫描电子显微镜物镜与光滑切面之间的工作距离为9 mm（在聚焦过程中会发生轻微变化），进行聚焦和调节像散，待聚焦清晰后调好拍摄倍数，在慢扫模式下拍摄和保存图片。
本发明的有益效果：
（1）相比于普通光学显微镜观察玉米淀胚乳粉的生长环结构，本发明不仅可以原位观察玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的形态结构，还可以进一步研究玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的显微结构。
（2）相比于传统基于酸或酶水解观察玉米胚乳淀粉生长环显微结构的方法，本发明未对淀粉进行水解，而是在玉米成熟种子的胚乳中原位观察淀粉的生长环显微结构，可以防止酸或酶对淀粉生长环的破坏，直接研究玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的完整结构；
（3）相比于以前研究玉米胚乳淀粉生长环结构的方法，本发明不需要进行淀粉提取和淀粉水解，而是直接使用玉米成熟种子作为材料，其操作步骤简单，明显缩短了研究时间，大大增加了方法的实用性和推广性。
本发明提供一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法，包括使用刀片和超薄切片机将玉米成熟种子的胚乳的选定区域进行修平直至形成光滑切面，随后使用水蒸汽处理光滑切面，使其充分吸水后在恒温恒湿的封闭环境中干燥，然后使用离子溅射镀膜仪对干燥后的切面进行真空喷金处理，最后借助扫描电子显微镜观察和拍摄淀粉的生长环结构。该方法可原位观察玉米成熟种子中胚乳淀粉的生长环结构，避免了酸或酶水解对生长环结构的破坏。此外，该方法直接利用玉米种子为材料，无需进行淀粉的提取，整个操作过程简单快捷，降低了研究难度，缩短了研究时间，具有很高的实用性和推广性。
附图说明
图1为实施例1中普通玉米B73胚乳淀粉生长环的显微结构低倍图。
图2为实施例1中普通玉米B73胚乳淀粉生长环的显微结构高倍图。
图3为实施例2中爆裂玉米SK胚乳淀粉生长环的显微结构低倍图。
图4为实施例2中爆裂玉米SK胚乳淀粉生长环的显微结构高倍图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
观察并拍摄普通玉米B73胚乳淀粉的生长环结构，主要步骤为：
（1）选取外形较好的干燥的B73玉米成熟种子，选择籽粒冠部（纵向）的胚乳组织作为目标区域（选定区域），然后使用不锈钢金属刀片切除其顶部1.0 mm区域，并用不锈钢金属刀片轻轻刮去切面的凸起区域，直至形成平整切面；
（2）将刀片粗修平的玉米种子块固定在超薄切片机样品夹上，设置切片厚度为500 nm，利用锋利的玻璃刀对切面进行反复修平，直至形成光滑切面。
（3）利用不锈钢刀片将精修后的玉米种子块的基部平整切除，保留剩余4 mm且附有光滑切面的玉米种子块；
（4）使用双面胶将修好的玉米种子块以光滑切面在上固定在载玻片上，并保证切面在水平方向不发生倾斜；
（5）将固定好玉米种子块的载玻片反扣于盛水的染缸上，使切面与水面保持8 cm的距离，在25 oC密闭烘箱中静置吸水48 h；
（6）吸水后的玉米种子块静置在温度恒定为30 oC，湿度恒定为25%的封闭房间中自然干燥48 h；
（7）使用解剖针和手术刀将干燥后的玉米块种子块小心去除胚组织，然后利用双面胶将玉米种子块以光滑切面在上固定在铝制样品台上，并保证切面在水平方向不发生倾斜，随后将样品台放入离子溅射镀膜仪（SCD500, Leica, Germany）中，盖紧盖子进行抽真空处理，期间间歇性释放氩气，待真空度达到10-4 mbar时打开高压开关，使电流稳定在37 mA进行喷金处理，喷金时间为90 s；
（8）喷金后的样品台放入场发射扫描电子显微镜（S4800 FESEM, Hitachi, Japan）的样品室中，并使样品台归位，设置场发射扫描电子显微镜的加速电压为5 KV，电流为10μA，在低倍模式30X下寻找目标区域；
（9）确定目标区域后，转换高倍模式1000X，设置场发射扫描电子显微镜的物镜与玉米种子块的光滑切面之间的工作距离为9 mm，在放大倍数为2000X下进行聚焦和调节像散，待聚焦清晰后，使用慢扫模式（CSS3）在放大倍数为1000X下拍摄图片（结果见图1）。
（10）重新选择目标区域，在放大倍数为10000X下对目标区域进行聚焦，待聚焦清晰后，使用慢扫模式（CSS3）在放大倍数为5000X下拍摄图片（结果见图2）。
实施例2
观察并拍摄爆裂玉米SK胚乳淀粉的生长环结构，主要步骤为：
（1）选取外形较好的干燥的SK玉米成熟种子，选择籽粒中部（纵向）的胚乳组织作为目标区域（选定区域），然后用不锈钢金属刀切除其顶部4.0 mm区域，并用不锈钢金属刀片轻轻刮去切面的凸起区域，直至形成平整切面；
（2）将刀片粗修平的玉米种子块固定在超薄切片机样品夹上，设置切片厚度为500 nm，利用锋利的玻璃刀对切面进行反复修平，直至形成光滑切面。
（3）利用不锈钢刀片将精修后的玉米种子块的基部平整切除，保留剩余4 mm且附有光滑切面的玉米种子块；
（4）使用双面胶将修好的玉米种子块以光滑切面在上固定在载玻片上，并保证切面在水平方向不发生倾斜；
（5）将固定好玉米种子块的载玻片反扣于盛水的染缸上，使切面与水面保持8 cm的距离，在25 oC密闭烘箱中静置吸水48 h；
（6）吸水后的玉米种子块静置在温度恒定为30 oC，湿度恒定为25%的封闭房间中自然干燥48 h；
（7）使用解剖针和手术刀将干燥后的玉米种子块小心去除胚组织，然后利用双面胶将玉米种子块以光滑切面在上固定在铝制样品台上，并保证切面在水平方向不发生倾斜，随后样品台放入离子溅射镀膜仪（SCD500, Leica, Germany）中，盖紧盖子进行抽真空处理，期间间歇性释放氩气，待真空度达到10-4 mbar时打开高压开关，使电流稳定在37 mA进行喷金处理，喷金时间为90 s；
（8）喷金后的样品台放入场发射扫描电子显微镜（S4800 FESEM, Hitachi, Japan）的样品室中，并使样品台归位，设置场发射扫描电子显微镜的加速电压为3 KV，电流为10μA，在低倍模式30X下寻找目标区域；
（9）确定目标区域后，转换高倍模式，设置场发射扫描电子显微镜的物镜与玉米种子块的光滑切面之间的工作距离为9 mm，在放大倍数为4000X下进行聚焦和调节像散，待聚焦清晰后，使用慢扫模式（CSS3）在放大倍数2000X下拍摄图片（结果见图3）。
（10）重新选择目标区域，在放大倍数为10000X下对目标区域进行聚焦，待聚焦清晰后，使用慢扫模式（CSS3）在放大倍数为5000X下拍摄图片（结果见图4）。
应说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制。本领域的普通技术人员应当理解，即使对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，也不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）、准备干燥的玉米成熟种子，在玉米成熟种子的胚乳中选定需要观察淀粉生长环结构的选定区域，使用金属刀片在选定区域切开玉米成熟种子，使玉米成熟种子切分为2块玉米种子块，并对玉米种子块的切面进行粗修平，直至形成平整切面；
步骤2）、使用超薄切片机将玉米种子块上的平整切面进行精修平，直至形成光滑切面；
步骤3）、使用水蒸汽处理玉米种子块的光滑切面，使光滑切面充分吸水后在恒温恒湿环境中密闭干燥；
步骤4）、使用离子溅射镀膜仪对干燥后的玉米种子块的光滑切面进行真空喷金处理；
步骤5）、使用扫描电子显微镜观察并拍摄真空喷金处理后的玉米种子块的光滑切面处胚乳淀粉的生长环结构，实现玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察。
2.根据权利要求1所述的一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法，其特征在于，步骤1）中，选取外形较好的干燥的玉米成熟种子，使用金属刀片在选定区域切开玉米种子，使得玉米种子形成2块玉米种子块，并用金属刀片轻轻刮去玉米种子块中选定区域切面的凸起，直至形成平整切面。
3.根据权利要求1或2所述的一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法，其特征在于，步骤1）中，所述玉米成熟种子中胚乳的选定区域可根据需要自由选择胚乳的各区域，可以为纵向上的胚乳冠部、胚乳中部和胚乳基部，也可以为横向上的近胚部和远胚部。
4. 根据权利要求1所述的一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法，其特征在于，步骤2）中，使用超薄切片机将玉米种子块上的平整切面进行精修平时，将经步骤1）粗修平后的玉米种子块固定在超薄切片机样品夹上，使用锋利的玻璃刀对粗修平后的平整切面进行反复修平，每次修平时对粗修平后的平整切面所切割的厚度均为500 nm，直至形成光滑的切面。
5.根据权利要求1所述的一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法，其特征在于，步骤3）中，使用水蒸汽处理玉米种子块上的光滑切面，使光滑切面充分吸水后在恒温恒湿环境中密闭干燥；包括以下步骤；
（1）玉米种子块的固定，使用双面胶将修好的玉米种子块固定在条形薄片上，玉米种子块的光滑切面朝上，并保证光滑切面在水平方向不发生倾斜；
（2）玉米种子块光滑切面的吸水，将固定好玉米种子块的条形薄片反扣于盛水的容器上，使玉米种子块的光滑切面面向容器内，同时光滑切面与容器内的水面保持6-10 cm的距离，然后将盛有水的容器、反扣于盛水的容器上的固定好玉米种子块的条形薄片一起置于25-30 oC密闭烘箱中，使光滑切面在25-30 oC密闭烘箱中吸水36-48 h；
（3）玉米种子块光滑切面的干燥，将吸水后的玉米种子块静置在温度恒定为25-30 oC、湿度恒定为25-35%的封闭环境中自然干燥48-60 h。
6.根据权利要求5所述的一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法，其特征在于，所述条形薄片为金属或塑料条形薄片。
7. 根据权利要求1所述的一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法，其特征在于，步骤4）中，将经步骤5）干燥后的玉米种子块小心去除胚组织，使用双面胶将玉米种子块固定在铝制样品台上，玉米种子块的光滑切面朝上，并保证光滑切面在水平方向不发生倾斜，然后将铝制样品台放入离子溅射镀膜仪中，盖紧离子溅射镀膜仪盖子对离子溅射镀膜仪的样品室进行抽真空处理，期间间歇性释放氩气，待真空度达到10-4 mbar时打开高压开关，使电流稳定在37 mA后对玉米种子块的光滑切面进行喷金处理，喷金时间为90-120s。
8. 根据权利要求1所述的一种玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察方法，其特征在于，步骤5）中，所述扫描电子显微镜观察及拍照，先将光滑切面喷金后的铝制样品台放入扫描电子显微镜的样品室中，并使铝制样品台归位，设置扫描电子显微镜加速电压为3KV或5 KV，电流为10μA，在低倍模式30X下寻找玉米种子块上光滑切面的目标区域；确定目标区域后，将扫描电子显微镜转换为高倍模式，设置扫描电子显微镜的物镜与玉米种子块的光滑切面之间的工作距离为8-10 mm，进行聚焦和调节像散；聚焦清晰后调好拍摄倍数，在慢扫模式下拍摄和保存图片，实现玉米成熟种子中胚乳淀粉生长环的原位观察。
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