KR101648277B1

KR101648277B1 - 미생물 오일의 분리방법

Info

Publication number: KR101648277B1
Application number: KR1020147015585A
Authority: KR
Inventors: 헨드릭 루이스 비즐; 알베르트 샤아프
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2000-08-02
Filing date: 2001-08-01
Publication date: 2016-08-12
Also published as: EP1178118A1; CN1447860A; JP2012019794A; EP1305440B2; US20040067574A1; CA2742152A1; CA2417571C; CA2417571A1; IL154146A; WO2002010423A8; ZA200300787B; WO2002010423A2; KR101515317B1; KR20130109249A; EA006979B1; MXPA03000878A; JP2016208974A; DK1305440T3; WO2002010423A3; EA200300212A1

Abstract

예를 들면, 미생물 세포로부터 하나 이상의 다불포화 지방산(PUFA)을 포함하는 미생물 또는 단세포 오일을 추출하며, 용매에 대한 필요성이 회피되는 방법이 개시된다. 발효 후에, 미생물 세포는 저온 살균, 세척되며 기계적(예를 들면, 균질화), 물리적(비등 또는 건조), 화학적(용매) 효소적(세포벽 분해 효소) 기술에 의해 세포벽이 용해되거나 파쇄된다. 이어서, (PUFA를 함유하는) 오일이 생성 세포벽 파편으로부터 분리된다. 이는 원심분리에 의해 달성되며, 이에 따라 (세포벽 파편을 함유하는) 수성상으로부터 분리될 수 있는 오일을 함유하는 오일상(상층)이 생긴다. 오일은 이어서 추출될 수 있고 필요에 따라 PUFA는 오일로부터 정제되거나 분리될 수 있다.

Description

미생물 오일의 분리방법{ISOLATION OF MICROBIAL OILS}

본 발명은 단세포 유기체 (또는 미생물)로부터의, 바람직하게는 하나 이상의 다불포화 지방산(PUFA)을 포함하는 미생물 (또는 단세포) 오일의 추출 (및 그리고 나서 분리)에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 미생물 세포벽의 파쇄 또는 용해에 이은, 생성되는 세포 파편으로부터 오일의 분리를 수반한다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 회수된, 바람직하게는 PUFA를 지닌 미생물 오일에 관한 것이다.

다불포화 지방산, 즉 PUFA는 자연에서 발견되며 광범위의 상이한 PUFA가 상이한 단세포 유기체(조류, 진균 등)에 의해 생산된다. 이들은 예를 들면, 식품(예를 들면, 유아용 분유), 영양 보충물 및 약제에 포함되는 등 용도가 많다.

대부분의 미생물 PUFA 생산공정에서 미생물은 우선 발효조내 적당한 배지에서 배양된다. 미생물 바이오매스는 이어서 수거되어 바이오매스로부터 지질의 후속 추출이 가능하도록 적당한 용매로 처리된다. 지질은 통상적으로 수개의 정제 단계를 거친다. 공정 중에는 지질이 지질분해 또는 산화 조건, 예를 들면 가열(산소의 존재하)에 노출될 경우 및/또는 리파제 또는 리폭시게나제에 기인하여 분해가 일어날 수 있기 때문에 주의해야 한다. 당업계에서는 (세포를 강제로 부수고 열어 그에 따라 내용물이 산소에 노출됨으로써 생기는 것과 같은) 산화를 피하기 위하여, 용매를 사용하여 온전한 전체 세포로부터 PUFA를 추출할 수 있음을 교시하고 있다(WO-A-97/36996 및 WO-A-97/37032 참조). 용매의 사용은 미생물 바이오매스로부터 지질을 제거하는 일반적인 방식이다(WO-A-98/50574).

비록 이들 추출방법이 수년간 사용되어 왔지만, 용매는 제거할 필요가 있으며 이에 따라 추가 비용이 초래된다. 또한, 지질을 식품에 사용하고자 하는 경우에, 헥산 같은 특정 용매는 완전히 제거되거나, 또는 극소량으로만 존재하는 것이 중요하다. 헥산이 증발에 의해 제거될 경우, 이는 가열을 수반할 수 있고, 이러한 가열은 비용을 가중시킬 뿐만 아니라 지질의 분해도 초래할 수 있다. 더욱이, 환경적인 고려사항의 증가로, 지질의 추출을 위한 용매의 사용이 점점 비용이 많이 들고 비인기적이 되어 가고 있다.

본 발명은 따라서 이러한 문제점을 해결하거나 최소한 완화시키는 데 있다. 본 출원인은 PUFA를 포함하는 것들과 같은 지질이 용매의 필요없이 미생물 세포로부터 효율적으로 추출될 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 일면에 따라, 미생물 세포로부터 오일(또는 지방 또는 지질, 이들 용어는 상호 교환적으로 사용됨)의 수득방법이 제공되며, 이 방법은 (a)(미생물 세포의) 세포벽을 파쇄시켜(또는 용해시켜) 세포로부터 오일을 방출시키는(또는 유리시키는) 단계를 포함한다. (미생물 또는 단세포) 오일은 이어서 (b)생성되는 세포벽 파편의 적어도 일부로부터 분리시킬 수 있다. 그런 다음 (c)(미생물) 오일 (또는 하나 이상의 PUFA)를 회수, 정제 및/또는 분리할 수 있다. 오일의 양호한 수율이 용매의 필요없이 상기 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 바람직하게는, 오일은 PUFA, 즉 하나 이상의 PUFA를 포함할 것이다. 바람직하게는, (단계 (a) 및 (b)를 포함하는) 상기 방법은 무용매 공정이다.

최근의 PUFA 제조 공정은 미생물 세포를 온전하게 유지하는 것을 옹호하고 있다(WO-A-97/36996). 이러한 공보는 미생물을 발효시킨 다음, 발효 뒤에 세포를 가열하여 미생물 바이오매스를 생성시키는 PUFA 제조법을 기재하고 있다. 물은 바이오매스로부터 제거되고, 생성되는 물질은 압출되어 다공성 과립을 형성한다. 이어서, PUFA는 용매, 통상적으로 헥산과의 접촉에 의해 과립 내측의 온전한 세포로부터 추출된다. 이어서, 헥산을 증발시켜 조 오일을 생성시킨다. 이러한 공정 전반에 걸쳐서 세포는 바람직하지 않은 산화를 초래할 것으로 생각되는 대기중의 산소가 PUFA와 접촉하는 것을 방지하도록 온전하게 유지된다. 그러나, 본 발명에 이르러 세포가 사실상 용해되면 양질의 PUFA 오일이 수득될 수 있으며; 대기에 의한 잠재적인 산화가 용매 필요성을 피하는 이점에 의해 보상될 수 있음이 밝혀졌다.

PUFA 및 미생물

PUFA는 단일 PUFA 또는 둘 이상의 상이한 PUFA일 수 있다.

PUFA 또는 각각의 PUFA는 n-3 또는 n-6 계통일 수 있다. 바람직하게는, 이는 C18, C20 또는 C22 PUFA이거나 적어도 18개의 탄소원자와 3개의 이중결합이 있는 PUFA이다.

PUFA는 유리 지방산, 염의 형태로, 지방산 에스테르로서(예를 들면, 메틸 또는 에틸 에스테르), 인지질로서 및/또는 모노-, 디- 또는 트리글리세라이드 형태로 제공될 수 있다.

적당한 (n-3 및 n-6) PUFA로는 하기의 것들이 포함된다:

적당하게는 (다이노플라젤레이트 dinoflagellate) 크립테코디니움 Crypthecodinium 또는 (진균) 쓰라우스토키트리움 Thraustochytrium 같은 조류 또는 진균으로부터의 도코사헥사엔산(DHA, 22:6 Ω3);

γ-리놀렌산(GLA, 18:3 Ω6);

α-리놀렌산(ALA, 18:3 Ω3);

컨쥬게이트 리놀레산(옥타데카디엔산, CLA);

디호모-γ-리놀렌산(DGLA, 20:3 Ω6);

아라키돈산(ARA, 20:4 Ω6); 및

에이코사펜타엔산(EPA, 20:5 Ω3).

바람직한 PUFA에는 아라키돈산(ARA), 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 및/또는 γ-리놀렌산(GLA)이 포함된다. 특히, ARA가 바람직하다.

PUFA는 천연(예를 들면, 식물성 또는 해양성) 공급원으로부터 유래할 수 있거나 단세포 또는 미생물원으로부터 유래할 수도 있다. 따라서, PUFA는 미생물, 조류 또는 식물 기원(또는 공급원)일 수 있다(또는 이로부터 올 수 있다). 특히, PUFA는 박테리아, 진균 또는 효모에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게는 뮤코랄레스(Mucorales) 목의 진균, 예를 들면 모르티에렐라(Mortierella), 파이코마이시즈(Phycomyces), 블레이케슬리아(Blakeslea), 아스퍼질러스, 쓰라우스토키트리움, 피티움(Pythium) 또는 엔토몹토라(Entomophthora)가 바람직하다. ARA의 바람직한 공급원은 모르티에렐라 알피나(M. alpina), 블레이케슬리아 트리스포라(B. trispora), 아스퍼질러스 테레우스(A. terreus) 또는 피티움 인시디오섬(P. insidiosum)으로부터 온다. 조류는 다이노플라젤레이트일 수 있고/있거나 포피리디움(Porphyridium), 닛쯔키아(Nitszchia), 또는 크립테코디니움(Crypthecodinium)(예를 들면, 크립테코디니움 코니 C. cohnii)이 포함된다. 효모에는 피키아 시페리(Pichia ciferii) 같은 피키아 또는 사카로마이시즈 속의 것들이 포함된다. 박테리아는 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속의 것들일 수 있다.

본 발명의 공정에서, 미생물 세포(또는 미생물)는 먼저 (예를 들면, 수성) 배양 배지를 함유하는 발효조 용기에서와 같이 적당히 배양되거나 발효시킬 수 있다. 발효 조건은 생성되는 바이오매스내 높은 오일 및/또는 PUFA 함량을 위해 최적화될 수 있다. 원할 경우 및 예를 들면, 발효를 마친 후, 미생물은 사멸되고/사멸되거나 저온살균시킬 수 있다. 이러한 과정은 바람직하지 않은 효소, 예를 들면 오일을 분해시키거나 PUFA의 수율을 감소시킬 수 있는 효소를 불활성화시킬 수도 있다.

이어서, 발효 브로쓰(바이오매스와 배양 배지)를 발효조로부터 제거(예를 들면, 유출 let out)시킬 수 있으며, 세포벽 파쇄 장치(예를 들면, 호모지나이저)로 보내질 수 있다. 필요하다면, 액체(통상적으로 물)는 그로부터 (우선) 제거될 수 있다. 적당한 고체 액체 분리 기술이 이용될 수 있다. 이러한 과정(탈수)은 원심분리 및/또는 여과에 의해 수행될 수 있다. 세포는 예를 들면, (물과 같은) 수용액을 사용하여 세척하여 예를 들면, 세포외 수용성 또는 수-분산성 화합물을 제거할 수 있다. 이어서, 세포를 파쇄 또는 용해에 즉시 쓸 수 있다.

세포 용해(단계 (a))

이어서, 미생물 세포의 세포벽을 파쇄(또는 용해)시킬 수 있다. 이러한 과정은 하나 이상의 효소적, 물리적 또는 기계적 방법 또는 기술을 사용하여 예를 들면, 고 전단 조건에서 달성될 수 있다. 물리적 기술로는 세포벽이 파열되는 충분한 온도로 세포를 가열 및/또는 건조시키는 과정이 포함된다. 이러한 과정은 비등을 포함할 수 있다.

효소적 방법은 하나 이상의 효소, 예를 들면 세포벽 분해 효소에 의한 용해를 포함한다. 세포벽 분해 효소는 용해 효소일 수 있다. 다른 효소로는 (예를 들면, 알칼라인) 프로테아제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 키티나제 및/또는 펙티나제가 포함된다. 다른 세포벽 분해물질, 예를 들면, 염, 알칼리, 및/또는 하나 이상의 계면활성제 또는 세제가 하나 이상의 효소와 병행하여 또는 그 대신에 사용될 수 있다. 물리적, 기계적 및/또는 효소적 방법의 조합이 또한 고려된다.

기계적 기술이 사용될 경우, 이는 예를 들면 호모지나이저를 사용하는 균질화를 포함할 수 있다. 이는 세포벽을 파쇄할 수 있는 볼 밀 또는 여타 기계일 수 있다. 적당한 호모지나이저는 폴리트론 호모지나이저 같은 고압 호모지나이저(예를 들면, 300 내지 500 kg/cm² 또는 바의 압력에서)를 포함한다. 다른 균질화 기술은 입자, 예를 들면 모래 및/또는 글래스 비드(예를 들면, 비드 밀의 사용)와의 혼합을 수반할 수 있다. 대안의 기계적 기술은 밀링 장치(예를 들면, 호모블렌더)의 사용을 포함한다. 세포벽의 다른 파쇄 방법은 초음파, 스프레이 건조 및/또는 가압이나 고압의 어플라이언스를 포함한다. 여기에서의 마지막 기술은 콜드-프레싱으로 불린다: 이 기술은 100 내지 600 또는 700바(Atm 또는 kg/cm²), 예를 들면, 150 내지 500바, 최적으로는 200 내지 400의 압력에서 수행될 수 있다.

균질화는 세포벽 파쇄의 바람직한 방법이다. 파쇄(예를 들면, 균질화)하는 동안 고압 및/또는 저압에서, 호모지나이저를 1 내지 3회 통과할 수 있다. 예를 들면, Gaulin^TM 호모지나이저를 사용할 수 있다. 파쇄(예를 들면, 균질화)하는 동안의 압력은 300 내지 900바, 예를 들면 400 내지 800바, 최적으로는 500 내지 600 또는 700바(Atm 또는 kg/m²)일 수 있다. 필요에 따라 저압, 예를 들면 150 내지 300바가 사용될 수 있다. 따라서 작업 압력은 호모지나이저의 유형, 통과 횟수 등에 따라 150 내지 900바로 다양할 수 있다.

비록 세포 용해가 화학적으로 수행될 수는 있지만, 공정(에서의 이러한 단계)가 바람직하게는 무-용매성임에 따라 이는 바람직하게 사용되지 않는다.

세포벽의 파쇄는 발효로부터 생기는 브로쓰에서 수행될 수 있거나, 예를 들면 세포는 여전히 배양 배지에 함유될 수 있거나 그러한 배지가 존재할 수 있다. 파쇄하는 동안 1종 이상의 첨가제가 첨가되거나 존재할 수 있거나(알칼리 금속 염, 예를 들면 NaCl 같은) 또는 파쇄 후에 첨가될 수도 있다(예를 들면, 균질화된 브로쓰에). 파쇄하는 동안 유기 용매(예를 들면, MeOH, 클로로포름)는 바람직하게는 존재하지 않는다. 파쇄는 (임의로 세척 및/또는 농축된) 바이오매스상에서(예를 들면, 고체 액체 분리 후) 수행될 수 있다. 파쇄는 따라서 세포와 물을 포함하되 용매를 함유하지 않는 (예를 들면, 수성) 조성물상에서 수행된다.

세포벽 파쇄를 개선하기 위하여, 파쇄는 약 10 내지 200 g/l의 건조 물질 함량에서 수행될 수 있다. 이는 발효 브로쓰상에서, 예를 들면 발효 후에 수행될 수 있거나, 브로쓰로부터, 예를 들면 브로쓰를 탈수 및/또는 고체/액체 분리에 투입시킨 후 유도될 수 있다.

필요에 따라, 파편으로부터 오일의 분리를 조장하기 위하여 분리 유도물질을 이 단계에서, 예를 들면 균질화된 물질에 첨가할 수 있다.

세포 파편으로부터 오일의 분리(단계 (b))

미생물 오일을 이어서 형성된 세포벽 파편의 적어도 일부로부터 분리해낸다. 이 단계에서 오일 또는 지질 상 또는 층에 존재할 수 있다(그리고 이는 PUFA를 포함할 수 있다). 이는 상부층일 수 있다. 이러한 층은 예를 들면, 세포벽 파편을 함유하는 (더 낮은) 수성층 위에 존재할 수 있다. (PUFA를 포함하는) 오일층은 이어서 수성층(또는 상)으로부터 분리될 수 있다. 1종 이상의 계면활성제 또는 세제가 이러한 과정을 돕기 위해 존재하거나 첨가될 수 있다.

세포벽 파편의 적어도 일부로부터 오일의 분리는 기계적 방법, 특히 원심분리를 이용하여 바람직하게 달성되거나 보조된다. 적당한 원심분리는 Westfalia^TM(반- 및 공업적 규모) 또는 Beckman^TM(예를 들면, 실험실용 원심분리기)로부터 달성될 수 있다. 원심분리(예를 들면, 실험실 규모 원심분리)는, 2 또는 4 내지 8 또는 15분, 예를 들면 3 또는 5 내지 7 또는 12, 최적으로는 4 또는 5 내지 6 또는 10분(체류시간)간 지속될 수 있다.

원심분리력(g)은 1,000 또는 2,000 내지 10,000 또는 25,000g, 예를 들면 3,000 또는 5,000 내지 8,000 또는 20,000g, 최적으로는 4,000 내지 6,000g, 또는 7,000 내지 9,000g일 수 있지만, 원심분리는 12,000g, 15,000g, 20,000g 또는 25,000g까지의 중력에서 사용될 수 있다. 원심분리는 4,000 내지 14,000 rpm, 예를 들면 6,000 내지 12,000 rpm, 최적으로는 8,000 내지 10,000 rpm에서 수행될 수 있다. 1회 이상의 원심분리가 필요할 수도 있다. 특정 원심분리기를 사용할 경우 최대 중력은 더 낮을 수도 있으며, 예를 들면 Westfalia^TM 원심분리기(예를 들면, 모델 NA-7)를 사용할 경우 6000g일 수 있다. 유량은 100 내지 500 리터/시간, 예를 들면 150 내지 450 l/hr, 최적으로는 200 내지 400 l/hr일 수 있다. 원심분리에 의해 2상 시스템(지방 또는 오일 상층 및 하부 수성층) 또는 3상 시스템(지방 또는 오일 상층, 중앙 수성층 및 통상적으로 세포 파편을 함유하는 바닥층)이 초래될 수 있다.

분리를 보조하는 분리 유도물질, 또는 유도제가 첨가될 수 있다. 이는 단계 (a) 동안, 단계 (a) 후 단계 (b) 전, 또는 단계 (b) 동안 존재하거나 보충될 수 있다. 이는 분리된 오일과 수성상의 형성을 보조할 수 있다. 유도물질은 수성상의 밀도를 증가시킬 수 있으며, 이는 이어서 오일상보다 한층 더 조밀하게 될 수 있다. 적당한 유도물질로는 알칼리 금속 염, 예를 들면 NaCl이 포함된다. 유도물질은 10 내지 150 g/l, 예를 들면 30 내지 130 g/l, 최적으로는 50 내지 100 g/l의 농도로 첨가될 수 있다.

오일은 무-카로티노이드성, 예를 들면 β-카로틴일 수 있다. 파쇄와 분리 뒤에, 본 발명의 공정은 오일 또는 하나 이상의 PUFA의 추출, 정제 또는 단리를 추가로 포함할 수 있다.

용매 회피

본 발명 공정의 이점 중 하나는 용매에 대한 필요성을 피할 수 있다는 점이다. (이러한 맥락에서 용매는 물을 배제하는데, 배양 배지가 통상적으로 수성이고 세포가 물로 세척될 수 있기 때문이다). 따라서, 단계 (a)에서 세포벽의 파쇄 동안, 또는 단계 (b)에서 세포벽 파편의 적어도 일부로부터 PUFA의 분리에서 (예를 들면, 유기) 용매가 사용되지 않을 수 있다. 바람직하게는, 오일 또는 하나 이상의 PUFA의 추출, 정제 또는 단리에 (예를 들면, 유기) 용매가 사용되지 않는다. 따라서, 본질에 있어서, 공정은 무-용매성일 수 있다. 따라서, 단계 (a), (b) 및 임의로 또한 (c)는 (예를 들면, 유기) 용매 없이, 예를 들면 오일(또는 PUFA)를 위한 용매, 예를 들면 헥산과 같은 알칸, 알콜(예를 들면, 메탄올) 또는 할로알칸(예를 들면, 클로로포름)의 필요없이 수행될 수 있다.

바람직하게는, 계면활성제의 사용도 피할 수 있으며, 파쇄와 분리 단계 (a) 및 (b) 각각 또는 둘 모두가 또한 계면활성제의 필요없이, 예를 들면 세제의 부재하에서 수행될 수 있다.

본 발명의 두 번째 일면은 첫 번째 일면의 공정에 의해 제조 가능한(또는 제조된) 오일에 관한 것이다.

오일이 PUFA를 포함하면, PUFA는 바람직하게는 주로 트리글리세라이드 형태이다(50%, 70% 또는 심지어 90% 또는 95% 이상).

오일은 하기 특징(또는 성분) 중 하나 이상을 지닐 수 있다:

(a)0.01 내지 1.0%, 예를 들면 0.05 내지 0.5%, 바람직하게는 0.1 내지 0.2%의 스테롤, 예를 들면 데스모스테롤, 또는 세포 파편;

(b)0.1 내지 2.0%, 예를 들면 0.3 내지 1.5%, 바람직하게는 0.5 내지 1.0%의 인지질 또는 트리글리세라이드; 및/또는

(c)0.1, 0.05 또는 0.001% 이하의 디글리세라이드.

오일은 정제되거나 필요에 따라 산 및/또는 알칼리로 처리될 수 있다.

PUFA(또는 PUFA 함유 오일)은 추가의 다운스트림 프로세싱, 예를 들면 검 제거, 중화, 표백, 탈취, 또는 동결 방지 처리에 투입될 수 있다.

전체 프로토콜

따라서, 본 발명의 바람직한 공정은 단계 (a) 내지 (h)를 포함한다:

(a)미생물 세포를 예를 들면, 이들이 미생물 오일 또는 적어도 하나의 PUFA를 생산하는 조건하에서 배양;

(b)임의로, 세포를 가열하거나 저온살균하여 세포를 사멸시키고/시키거나 바람직하지 않은 효소를 불활성화;

(c)임의로, 예를 들면 원심분리, 여과 또는 적당한 고체-액체 분리 기술로 (수성) 액체를 제거(예를 들면, 탈수),

(d)임의로, 미생물 세포를 예를 들면, 물로 세척하여, 바람직하게는 세포외 수용성 또는 수-분산성 화합물을 제거;

(e)미생물 세포의 세포벽을 예를 들면, 물리적, 효소적 또는 기계적 기술(균질화와 같은, 예를 들면 호모지나이저 또는 볼 밀 사용)로 파쇄 또는 분해시킴. 이는 미생물 세포에 존재하는 오일 및/또는 PUFA의 일부를 방출시킬 수 있다. (기계적) 파쇄는 화학적 및/또는 효소적 파쇄로 보충되거나 이로 대체될 수 있다. 분리 유도물질이 예를 들면, 두 층의 형성을 보조하기 위하여, 후속 단계에 첨가될 수 있다.;

(f)세포벽 파편으로부터 미생물 오일(또는 PUFA)의 분리, 예를 들면 생성되는 세포벽 파편으로부터 오일상 및/또는 수성상의 형성 및 이어서 분리. 이는 임의로는 하나 이상의 염의 첨가, pH 쉬프트(알칼리성쪽으로)와 함께 원심분리를 포함할 수 있고, 하나 이상의 세포 분해 효소, 계면활성제 또는 유화제의 존재를 수반할 수 있다. (예를 들면, 상부) 오일상 및 (예를 들면, 하부) 수성상을 수득할 수 있다. 오일상은 PUFA를 함유할 수 있다. 수성상은 세포 파편을 함유할 수 있다.

(g)오일(또는 오일상으로부터 PUFA)의 추출, 정제 또는 단리로 예를 들면 PUFA-함유 오일의 생성; 및

(h)임의로, 산 처리(또는 검 제거), 알칼리 처리(또는 중화), 표백, 탈취, 냉각(또는 동결 방지 처리). 이는 유리 지방산(FFA), 단백질, 인지질, 미량 금속, 색소, 탄수화물, 비누, 산화 산물, 황, 색소 분해 산물, 스테롤, 포화 트리글리세라이드 및/또는 모노- 또는 디-글리세라이드와 같은 바람직하지 않은 물질을 제거할 수 있다.

열 처리 또는 저온살균은 바람직하게는 하나 이상의 오일(또는 PUFA) 분해 효소를 불활성화시키거나 변성시킨다. 가열온도는 70 내지 90℃, 예를 들면 약 80℃일 수 있다. 이는 리파제 및/또는 리폭시게나제와 같은 효소를 불활성화시키거나 변성시킬 수 있다.

하나 이상의 (예를 들면, 물 및/또는 유용성) 항산화제, 예를 들면 비타민 C, 아스코빌 팔미테이트 및/또는 토코페롤을 첨가할 수 있으며, 이는 단계 (b) 후에, 또는 후속 단계에서, 예를 들면, 정제(상기 (h) 단계) 전이나 후와 같이 추출 후에 수행될 수 있다.

예를 들면 다른 바람직하지 않은 화합물 또는 성분을 제거하기 위하여, 하나 이상의 추가 가열이 있을 수 있다. 예를 들면, 가열은 산 pH에서 수행되어 예를 들면, 인지질, 미량 금속, 색소, 탄수화물 및/또는 단백질 같은 성분을 제거할 수 있다. 여기에서, 온도는 50 내지 80℃, 예를 들면 55 내지 75℃, 최적으로는 60 내지 70℃일 수 있다. pH는 1 내지 6, 예를 들면 2 내지 5, 최적으로는 3 내지 4의 pH일 수 있다. 이는 검의 제거 및/또는 단백질 및/또는 수용성 또는 수-분산성 화합물의 제거를 이끌 수 있다.

대안으로 또는 부수적으로 추가 가열 단계(이번에는 알칼리성 pH에서)가 이용될 수 있다. pH는 8 내지 13, 예를 들면 9 내지 12, 최적으로는 10 내지 11의 pH일 수 있다. 온도는 선행 단락에서 기재된 것과 동일할 수 있다.

장비(공업용 프로세스 플랜트)

본 발명의 세 번째 일면은 첫 번째 일면의 방법 수행을 위한 장치에 관한 것이다. 세 번째 일면은 따라서 하기 (a) 내지 (c)를 포함할 수 있다:

(a)임의로 (예를 들면, 직접) 연결된, 미생물 세포 배양(또는 발효) 수단(예를 들면, 발효조);

(b)임의로 연결된, 미생물 세포의 세포벽 파쇄(또는 용해) 수단(예를 들면, 호모지나이저);

(c)(생성되는) 세포 파편으로부터 (생성되는) 오일의 분리 수단.

세포와 배양 배지(예를 들면, 브로쓰)는 (b)의 수단에 직접 보내질 수 있다. 각각의 수단은 규정된 순서로 자리 잡을 수 있으며, 이에 따라 첫 번째 일면의 공정 단계의 순서를 따르게 된다. 앞서 기재된 바와 같은 파쇄 및 분리 단계 중 임의의 단계 또는 전 단계를 수행하기 위한 수단, 예를 들면 분리 유도물질 첨가 수단(예를 들면, 균질화된 물질에), 또는 전체 프로토콜에 기재된 단계 중 임의 단계를 수행하기 위한 수단(예를 들면, 가열/저온살균 수단, 고체-액체 분리 수단 등)이 제공될 수 있다.

본 발명의 일면의 특질 또는 특징은 필요한 변경을 가하여 또다른 일면에 적용될 수 있다.

PUFA를 포함하는 것들과 같은 지질이 용매의 필요없이 미생물 세포로부터 효율적으로 추출될 수 있음을 발견하였다.

본 발명은 이하에서 예로서, 단지 설명을 위해 제공되는데 불과한 하기 실시예를 참조로 하여 설명된다.

[실시예]

실시예 1: 모르티에렐라 알피나의 발효 브로쓰로부터 조 PUFA ( ARA ) 오일의 제조

아라키돈산(ARA)을 함유하는 모르티에렐라 알피나(65℃에서 1시간 동안 사전에 저온살균)의 발효 브로쓰를 600바(600 Atm)에서 MC-4 APV Gaulin^TM 호모지나이저로 1회 균질화하여 세포벽을 파쇄시킨다. NaCl을 균질화된 브로쓰에 가하여 100 g/l의 최종 농도가 되게 만든다. 계속해서, 균질화된 브로쓰를 10분간 9,000 rpm(약 20,000 g에 해당)으로 Sorval RC 5B 원심분리기를 사용하여 원심분리시키며, 이에 따라 아라키돈산-농축 오일 상층과 세포 파편을 함유하는 하부 수성층이 생성된다.조 PUFA 오일이 회수된다.

오일의 수율은 9%이다(세포내 오일 기준). (오일)층은 다음과 같은 대략적인 조성을 갖는다: 0.1% 데스모스테롤; 0.7% 인지질; 6.7% 트리글리세라이드; 0.1% 디글리세라이드, 70% 물 및 20% 배지 성분과 세포 파편.

실시예 2: 모르티에렐라 알피나의 발효 브로쓰로부터 조 PUFA ( ARA ) 오일의 제조

아라키돈산(ARA)을 함유하는 모르티에렐라 알피나(65℃에서 1시간 동안 사전에 저온살균)의 발효 브로쓰를 600바(600 Atm)에서 MC-4 APV Gaulin^TM 호모지나이저로 1회 균질화하여 세포벽을 파쇄시킨다. 계속해서, 균질화된 브로쓰를 Westfalia^TM NA-7 디스크 원심분리기를 사용하여 최대 속도에서(약 8,000 rpm, 디스크 스택에서 약 8,000 g에 해당) 원심분리시키며, 이에 따라 (원심분리기로부터 회수된) 아라키돈산-농축 오일 상층과 세포 파편을 함유하는 하부 수성층이 생성된다. 조 PUFA 오일이 회수된다: 오일의 수율은 95%이다(세포내 오일 기준). 조 오일은 다음과 같은 대략적인 조성을 갖는다: 1 내지 2% 스테롤 및 세포 파편; 3 내지 4% 인지질; 4% 모노글리세라이드; 6% 디글리세라이드; 및 나머지는 트리글리세라이드.

실시예 3: 크립테코디니움 코니의 발효 브로쓰로부터 조 PUFA ( DHA ) 오일의 제조

발효 후 조류 크립테코디니움 코니의 발효 브로쓰(65℃에서 1시간 동안 저온살균) 20 리터를 APV Gaulin^TM 호모지나이저(유형: Lab 60/60-10 TB SX)에 의해 매번 600바(Atm)에서 3회 균질화시켜 조류 세포벽을 용해시킨다. 계속해서, NaCl을 균질화된 브로쓰에 가하여 50 g/l의 최종 농도로 만든다. 실험실 규모 원심분리기(Beckman^TM JM/6E)를 사용하여 브로쓰를 800 ml 분량으로 각각 5분간 5,000 g에서 원심분리시켜 오일을 회수한다. 이렇게 함으로써 DHA-농축 지방질 상층(조 오일)과 하부 수성층이 생성된다. 조 오일이 지방질 상층으로부터 회수된다.

실시예 4: 크립테코디니움 코니의 발효 브로쓰로부터 조 PUFA ( DHA )의 제조

발효 후 조류 크립테코디니움 코니의 발효 브로쓰(65℃에서 1시간 동안 저온살균) 20 리터를 APV Gaulin^TM 호모지나이저(유형: Lab 60/60-10 TB SX)에 의해 매번 600바(Atm)에서 3회 균질화시켜 조류 세포벽을 용해시킨다. 계속해서, 실험실 규모 원심분리기(Beckman^TM JM/6E)를 사용하여 브로쓰를 800 ml 분량으로 각각 5분간 5,000 g에서 원심분리시켜 조 오일을 회수한다. 이렇게 함으로써 DHA-농축 지방질 상층(조 오일)과 하부 수성층이 생성된다. 조 PUFA 오일은 지방질 상층으로부터 회수된다.

Claims

(a) 미생물 세포의 세포벽을 파쇄시켜 오일을 방출시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 형성된 세포벽 파쇄물의 적어도 일부로부터 오일을 분리하는 단계를 포함하되,
상기 오일이 하나 이상의 다불포화 지방산(PUFA)의 50% 초과를 트리글리세라이드 형태로 포함하고,
단계 (a) 및 (b)에서 상기 오일을 위한 용매가 사용되지 않는,
조류 세포 또는 모르티에렐라 세포인 미생물 세포로부터 하나 이상의 PUFA를포함하는 오일을 수득하는 방법.
제 1 항에 있어서,
세포가 물리적으로, 효소적으로 또는 기계적으로 파쇄되는, 방법.
제 2 항에 있어서,
파쇄가 균질화(homogenisation)를 포함하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
(c) 미생물 오일 또는 하나 이상의 PUFA를 추출, 정제 또는 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (b)에서의 분리가 원심분리에 의해 수행되는, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
분리에 의해 미생물 오일을 포함하는 오일층, 및 수성층이 형성되는, 방법.
제 6 항에 있어서,
오일층이 수성층 위의 상부층인, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
오일이 C₂₀ 또는 C₂₂ Ω-3 또는 Ω-6 PUFA로부터 선택된 PUFA를 포함하는, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
미생물 세포가 조류 세포인, 방법.
제 4 항에 있어서,
단계 (c)에서 오일 또는 PUFA를 위한 용매가 사용되지 않는, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (a)에 앞서, 오일의 생산을 가능하게 하는 조건하에서 미생물 세포를 배양하거나 발효시키는 단계를 포함하는, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
세포벽의 파쇄가 하나 이상의 세포벽 분해 효소 또는 계면활성제에 의해 보조되는, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (b) 동안 분리 유도물질이 존재하는, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 하나 이상의 PUFA를 포함하는 미생물 오일.
제 1 항에 있어서,
PUFA가 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 및 γ-리놀렌산으로부터 선택되는, 방법.
제 15 항에 있어서,
PUFA가 아라키돈산 및 도코사헥사엔산으로부터 선택되는, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (a)에 앞서, 세포를 저온살균하는 단계를 포함하는, 방법.
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