KR101635802B1 - 생체분자를 적외선（ｉｒ）계 정량하기 위한 장치 및 방법 - Google Patents

생체분자를 적외선（ｉｒ）계 정량하기 위한 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IR 계 수법을 이용하여 샘플 내의 하나 이상의 생체분자를 정량하는 방법, 이러한 방법에 사용하기 위한 샘플 홀더 장치뿐만 아니라 이러한 샘플 홀더 장치를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

생체분자를 적외선（ＩＲ）계 정량하기 위한 장치 및 방법{Devices and methods for infrared(IR) based quantitation of biomolecules}
관련 출원의 교차 기재
본 출원은 그 내용 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 포함되는, 2011년 4월 14일 출원된 미국 특허 가출원 61/475,434호를 우선권 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 샘플 내의 분석물을 정량하기 위한 적외선 분광광도계 방법 및 이 방법에 사용하는 장치에 관한 것이다.
적외선(IR) 분광장치는 샘플 분석을 위해 연구 실험실에서 일반적으로 사용되는 분석 도구이다. 전자기 스펙트럼의 IR 영역은 가시영역의 하단(약 14,300 cm-1 의 파수)에서부터 마이크로파 영역(20 cm-1 근처)까지 걸쳐있다. 통상, IR을 흡수하는 분자의 경우, 분자 내의 진동 또는 회전이 분자의 쌍극자 모멘트에서 순 변화를 유발해야 한다. 방사선의 교대하는 전계는 분자의 쌍극자 모멘트에서의 변동과 상호작용하며 또 방사선의 주파수가 분자의 진동 주파수와 매치(match)되면, 그 방사선은 흡수되며, 그에 의해 분자 진동의 진폭 변화를 초래한다.
전형적으로, 생체분자(biomolecule), 예컨대 단백질의 정량 분석을 위해, 가장 일반적으로 사용되는 수법은 비색수법(예컨대 쿠마씨 블루 에세이, 로우리 에세이, BCA 에세이 및 피어스 660 프로테인 에세이) 및 UV 분광 수법(예컨대 280 nm에서 흡수)을 포함한다. 당해 분야에 공지된 대부분의 정량 방법의 경우, 사용자는 사용자가 정량을 실시할 때마다 전형적으로 정량될 분석물과 동일한 분자인 검량체(calibrant)를 사용하여 검량곡선(calibration curve)을 작성해야 한다.
발명의 요약
본 발명은, 당해 분야에 공지된 대부분의 방법에 비하여, 실시하는 시간이 덜 소요될 뿐만 아니라 적은 샘플 부피를 필요로 하며, 또한 당해 분야에 공지된 대부분의 방법이 필요로 하는 특수한 샘플 제조 단계를 필요로 하지 않는, 샘플 내의 분석물, 특히 생체분자를 정량하는 개선된 방법을 제공한다. 또한 본 발명에 따른 방법은 사용자가 분석물을 정량할 때마다 검량곡선을 작성할 필요성을 제거하고 또 검량체가 정량될 분석물과 동일한 분자일 것을 필요로 하지 않는다. 본 발명은 또한 특허청구된 방법에 사용하기 위한 장치를 제공한다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 샘플 내의 하나 이상의 생체분자를 정량하기 위한 IR계 방법이 제공된다.
샘플 내의 하나 이상의 생체분자를 정량하는 본 발명에 따른 일개 방법에서, 상기 방법은,
(a) 샘플 함유를 위해 소수성 영역(region)에 의해 둘러싸인 친수성 영역을 포함하는 다공성 막을 포함하는 샘플 홀더(sample holder)를 제공하는 단계;
(b) 상기 막의 친수성 영역을 샘플 부피와 접촉시키는 단계;
(c) 상기 막 위의 샘플 부피를 건조시키는 단계;
(d) 상기 막 위의 샘플 부피를 4000-400 cm-1 스펙트럼 범위 내의 파장을 포함하는 적외선 빔, 또는 상기 스펙트럼 범위의 임의 부분에 노출시켜, 적외선 흡수 스펙트럼을 얻는 단계를 포함하고;
상기 적외선 흡수 스펙트럼 중의 하나 이상의 흡수 피크 면적(area)은 샘플 내의 하나 이상의 생체분자의 양과 상관관계가 있다.
샘플 내의 하나 이상의 생체분자를 정량하는 본 발명에 따른 다른 방법에서, 상기 방법은,
(a) 샘플 함유를 위해 소수성 영역에 의해 둘러싸인 친수성 영역을 포함하는 다공성 막을 포함하는 샘플 홀더를 제공하는 단계;
(b) 상기 막의 친수성 영역을 샘플 부피와 접촉시키는 단계;
(c) 상기 막 위의 샘플 부피를 건조시키는 단계;
(d) 단계 (c) 이후에 적외선 흡수에 의해 샘플 부피 내의 물의 존재를 검출하고 또 필요한 경우 물의 존재가 검출되지 않을 때까지 단계 (c)를 반복하는 단계; 및
(e) 상기 막 위의 건조된 샘플 부피를 4000-400 cm-1 스펙트럼 범위 내의 파장을 포함하는 적외선 빔, 또는 상기 스펙트럼 범위의 임의 부분에 노출시켜, 적외선 흡수 스펙트럼을 얻는 단계를 포함하며;
상기 적외선 흡수 스펙트럼 중의 하나 이상의 흡수 피크 면적(area)은 샘플 내의 하나 이상의 생체분자의 양과 상관관계가 있다.
특허청구된 방법에 따른 일부 실시양태에서, 하나 이상의 생체 분자는 핵산, 단백질, 지질, 다당류 및 지질다당류(lipopolysaccharides)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적 지질다당류는 내독소(endotoxin)이다.
다양한 실시양태에서, 스펙트럼 중의 하나 이상의 흡수 피크 면적 각각은 샘플 내의 특정 생체분자의 양과 상관관계가 있다.
일부 실시양태에서, 특허청구된 발명에 따른 방법은 분석물을 정량할 때마다 검량 곡선을 작성할 필요가 없다.
본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 하나 이상의 검량 곡선을 사용된 기기 상으로 프리로딩(pre-load)함으로써, 사용자가 샘플 내의 분석물을 정량하려고 할 때마다 검량 곡선을 작성할 필요를 제거한다. 단백질 및 펩티드 정량의 경우에서, 상기 정량은 폴리펩티드 분자 내에 존재하는 아미드 결합의 수 또는 아미드 결합의 농도를 기본으로 하며, 또 따라서 상기 정량은 분자의 아미노산 서열과는 독립적이다. 따라서, 분석물(예컨대 단백질 또는 펩티드)을 정량할 때마다 검량 곡선의 작성을 필요로 하고 또 검량체가 정량되는 분석물과 동일한 분자여야할 필요가 있는 당해 분야에서 공지되고 사용되는 대부분의 방법과는 달리, 본 발명에 따른 방법에서는 임의 단백질이 검량 곡선의 작성을 위한 검량체로서 사용될 수 있고, 이어 검량 곡선은 사용될 기기 상에 프리로딩된다.
유사하게, 예컨대 핵산, 탄수화물 등과 같은 다른 분석물의 경우, 임의의 적합한 검량체가 검량 곡선 작성을 위해 사용될 수 있고, 이 검량곡선은 사용될 기기 상에 프리로딩된다. 본 발명에 따른 방법은 아주 소량의 샘플 부피의 분석물을 정량하기 위해 사용될 수 있다. 특허청구된 본 발명에 따른 다양한 실시양태에서, 샘플 부피는 0.1 내지 20 ㎕ 범위이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 샘플 부피는 약 2 내지 5 ㎕ 이하, 또는 1 ㎕ 미만이다.
일부 실시양태에서, 상기 샘플은 예컨대 혈액, 혈장, 혈청 및 요와 같은 생물학적 유체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 샘플은 환경적 샘플, 약학적 샘플 또는 식품 샘플이다. 다른 실시양태에서, 샘플은 연료 샘플이다.
일부 실시양태에서, 샘플은 세포 용해물(lysate) 또는 조직 용해물을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 샘플은 조(crude) 샘플이다.
일부 실시양태에서, 다공성 막은 한외여과막이다. 다른 실시양태에서, 다공성 막은 미세다공성 막이다.
특허청구된 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 다공성 막은 PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드), PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌), 친수성 PTFE 및 폴리에틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체 물질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다공성 막은 친수성 PTFE를 포함한다. 그러나, 특허청구된 본 발명에 따른 방법에서는 적합한 중합체 물질이 사용될 수 있다. 중합체 물질/막의 선택은 정량될 분석물에 따라 크게 달라질 것이다. 예컨대, 관심을 두고 있는 분석물과 동일한 파장에서 흡수하거나 및/또는 흡수 측정을 방해하는 중합체 물질의 사용은 바람직하지 않을 것이다.
일부 실시양태에서, 샘플이 스포팅(spotted)되는 다공성 막은 편의상 샘플 홀더라고 지칭되는 장치 내에 포함된다. 특정 실시양태에서, 상기 샘플 홀더는 카드 형태이고 또 이를 편의상 샘플 홀더 카드라 칭한다.
특허청구된 본 발명에 따른 다양한 실시양태에서, 상기 샘플 홀더는 샘플 부피가 막 위에 함유되는 면적을 포함하는 다공성 막을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 함유를 위한 면적은 소수성 영역 이내의 친수성 영역을 포함하고, 이때 샘플 부피는 친수성 영역 내에 함유된다.
일부 실시양태에서, 소수성 영역은 친수성 다공성 막의 플라즈마 처리에 의해 생성된다. 다른 실시양태에서, 상기 소수성 영역은 친수성 다공성 막의 열처리에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, 친수성 영역은 소수성 영역의 하나 이상의 스포트 또는 하나 이상의 라인(lines)을 포함한다.
샘플 부피는 친수성 영역의 직경으로 함유되는 것이 중요하다. 친수성 영역의 직경은 사용될 IR 기기의 빔 직경에 따라 달라지며, 이때 빔은 친수성 영역 내에 함유된 샘플을 통과한다. 정확한 정량을 용이하게 하기 위하여, 친수성 영역의 직경이 IR 빔 직경에 비하여 작거나 또는 동일한 것이 바람직하다. 이에 의해 전체 샘플 부피는 IR 빔에 가시적으로 되고 또 정확한 정량이 달성된다.
일부 실시 양태에서, 샘플 홀더의 친수성 영역의 직경은 2.0 mm 내지 9.2 mm 범위이다. 일부 실시양태에서, 친수성 영역의 직경은 3.0 mm 내지 6 mm 범위이다. 일부 실시양태에서, 막 위에 스포팅되는 샘플 부피는 계면활성제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 샘플 부피가 막 위에 스포팅되기 전 또는 이후에 막 위로 스포팅된다.
도 1은 장래에 사용하기 위해 작성한 예시적 검량 곡선이다. 1일에서 검량 곡선을 작성하기 위하여 BSA를 사용하였다(점선). 수일 이후(예컨대 이 경우에서는 4일 후) 4 mg/ml BSA 샘플을 만들어 미리 작성한 검량 곡선에 대해 확인하였다.
도 2는 특허청구 발명에 따른 예시적 샘플 홀더의 개략도이다. 예시적 샘플 홀더는 소수성 영역에 의해 둘러싸인 친수성 영역을 각각 포함하는 4개의 상이한 막 스포트를 포함하는 카드이다. 샘플 스포트 1, 2 및 3으로 지칭된 스포트는 적합한 완충액 중에서 관심을 갖고 있는 생체분자를 함유하는 샘플 부피를 스포팅하기 위한 것을 의미하는 반면에, 스포트 B는 블랭크 용액 또는 완충액 만의 부피를 스포팅하기 위해 사용된다. 스포트 1, 2 및/또는 3 상에 스포팅된 샘플 부피는 동일 샘플 용액을 나타내거나 또는 상이한 샘플 용액을 구성할 수 있다.
도 3은 동일 샘플 내의 단백질 및 핵산을 정량하기 위한 대표적 실험의 결과를 나타내는 적외선 흡수 스펙트럼이다. 이 실험에 사용된 단백질은 BSA이었다. X축은 파수 cm- 1를 나타내고 또 Y축은 흡수 단위를 나타낸다. 그래프는 DNA 및 단백질(즉, BSA) 모두 본 발명에 따른 IR계 방법을 이용하여 동일 샘플 내에서 정량될 수 있음을 나타낸다.
도 4는 샘플 내의 펩티드를 정량하기 위한 대표적 실험의 결과를 나타내는 적외선 흡수 스펙트럼이다. 정량을 위한 이 실험에는 BSA가 단백질 표준으로 사용되었다. X축은 파수 cm- 1를 나타내고 또 Y축은 흡수 단위를 나타낸다.
도 5는 물 중의 지질다당류, 즉 내독소를 정량하기 위한 실험의 결과를 나타내는 적외선 흡수 스펙트럼이다. X축은 파수 cm- 1를 나타내고 또 Y축은 흡수 단위를 나타낸다. 이 스펙트럼은 물 중의 LPS의 농도가 20 ㎍/㎕에서 0.2 ㎍/㎕로 감소함에 따라서 스펙트럼 세기도 감소함을 나타낸다. 또한, 이 실험을 이용하여 LPS를 사용한 검량 곡선을 작성하고 또 내독소의 정량을 위해 사용하였다.
도 6은 샘플 내에서 물의 존재를 모니터/측정/검출하기 위한 실험의 결과를 도시하는 적외선 흡수 스펙트럼이다. X축은 파수 cm- 1를 나타내고 또 Y축은 흡수 단위를 나타낸다. 스펙트럼에 도시된 바와 같이, 물이 샘플에 존재하면, 물의 OH 결합과 관련된 진동 결합 스트레치(stretching)와 벤딩(bending)으로 인한 스펙트럼 간섭이 존재하고, 이는 단백질 아미드 결합의 해상도를 방해한다. 그러나, 샘플이 건조되어 물이 증발함에 따라서, 물과 관련된 스펙트럼 세기는 스펙트럼에 도시된 바와 같이 감소한다.
도 7은 계면활성제(예컨대 SDS)를 샘플에 부가할 때 샘플의 더욱 균일한 분포 및 흡수 프로파일을 나타내는 그래프를 도시한다. X축은 파수 cm- 1를 나타내고 또 Y축은 흡수 단위를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 플라즈마계 샘플 함유에 사용하기 위한 고정부(fixture) 및 샘플 홀더 카드 어셈블리의 개방도 및 밀폐도를 각각 도시한다. 도 8a는 완전히 조립된, 샘플 홀더 카드 및 고정부의 2개 측면의 개방 구조를 도시한다. 도 8b는 진공 플라즈마 환경 내에서 샘플 홀더 카드 및 고정부 어셈블리의 밀폐 단면 개략도를 도시하며, 이때 소수성인 것이 바람직한 샘플 홀더 카드 상의 막의 면적은 플라즈마 처리에 노출되는 반면에, 샘플이 스포팅되는 친수성 영역은 플라즈마 처리로부터 보호된다.
도 9는 플라즈마 처리 이후의 샘플 홀더 카드의 개략도를 도시한다. 친수성 면적은 플라즈마 처리에 노출된 소수성 면적에 의해 둘러싸인 막의 보호된 영역을 나타낸다.
도 10a 내지 도 10d는 탄성중합체 밀봉부(seals)(플라즈마 처리 방법의 경우)를 적합하게 배치하는 것에 의해 또는 가열된 플래튼(platen)의 형상(열처리 방법의 경우)에 의해 생성될 수 있는 샘플 홀더 카드의 막 내의 소수성 영역과 친수성 영역의 예시적 형상/패턴을 도시한다.
도 11은 가열된 플래튼 및 실리콘 기재를 비롯한 막 내의 소수성 샘플 함유 면적을 생성하기 위한 엠보싱 고정부 및 샘플 홀더 카드 시스템의 확대도이다.
도 12a 및 도 12b는 샘플 카드 홀더가 시스템에 배치된 후 엠보싱 헤드/가열된 플래튼 시스템의 개방 및 밀폐 단면도를 각각 도시한다.
도 13a 내지 도 13d는 도 13a(0초) 및 도 13b(30초)에 도시한 바와 같은 열처리되지 않은 막과 비교한, 도 13c (0초) 및 도 13d(30초)에 도시된 바와 같은 열처리 이후에 막이 샘플 함유 면적 내에 샘플(예컨대 물)을 보유하는 것을 도시하는 실험 결과를 도시한다.
도 14a 및 도 14b는 샘플의 "커피 링" 증착 패턴에 대한 각각 화학적 및 물리적 파괴 효과를 도시한다. 도 14a는 세제(SDS)를 샘플에 부가할 때 화학적 파괴에 의한 증가된 균일한 샘플 분포를 도시한다. 물 및 포스페이트 완충 염수(PBS)에 용해된 사이토크롬 C(10 mg/ml)는 친수성 PTFE 막(2 및 5 μL) 상에 놓고 건조시켰다. 샘플에 SDS 부가는 더욱 균일한 샘플 분포를 초래한다(PBS + SDS 도시되지 않음). 도 14b는 샘플 분포의 물리적 파괴(소수성 배리어를 변경하는 것에 의해)가 샘플 면적 중앙에 다수의 "커피 링"과 더 많은 샘플을 초래함을 도시한다.
도 15는 샘플에 대한 SDS 부가 효과를 나타내는 막대 그래프이다. SDS(1 및 5%)를 사이토크롬 C 샘플에 부가하고 건조시켰다. SDS의 부가는 각 피크 면적에서 증가를 초래하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 적외선 분광장치(IR)를 이용하여 샘플 내의 하나 이상의 생체분자를 정량하기 위한 개선된 방법뿐만 아니라 특허청구된 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 장치를 제공한다.
본 발명의 개시내용이 더욱 잘 이해되기 위하여, 특정 용어를 먼저 정의한다. 부가적 정의는 상세한 설명을 통하여 설명된다.
I. 정의
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "정량하다", "정량", "정량하는", "측정하다" 또는 "측정"은 특허청구된 본 발명에 따른 방법을 이용하여 샘플 내의 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 것을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "분석물"은 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 정량할 필요가 있는 관심을 두고 있는 임의 분자를 지칭한다. 다양한 실시양태에서, 분석물은 생체분자이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "생체분자"는 특허청구된 본 발명에 따른 방법을 이용하여 정량하는 것이 바람직한, 관심을 두고 있는 임의 생물학적 물질을 지칭한다. 예시적 생체분자는 단백질, 펩티드, DNA와 RNA를 비롯한 핵산 분자, 지질, 탄수화물 및 내독소(예컨대 지질다당류)를 포함한다. 임의의 생체분자는, 그 생체분자가 전자기 스펙트럼의 적외선 범위에서 흡수할 수 있는 한, 특허청구된 본 발명에 따른 방법을 이용하여 정량될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은 특허청구된 본 발명에 따른 방법을 이용하여 정량될 분석물(예컨대 생체분자)을 포함하는 임의 매질을 지칭한다. 샘플은, 비제한적으로, 예컨대 식품 물질(예컨대 가금류, 신선 육류, 우유, 요거트, 유가공품, 제빵 제품, 음료, 맥주, 레몬에이드, 쥬스, 치즈, 식물, 과일, 어류 등), 물 또는 하수(예컨대 우물, 호수, 강, 바다, 하수 운하, 음용 수돗물 등), 임상 시편(예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 가래, 조직, 요, 타액, 호흡기관으로부터 얻은 샘플/체액 등), 토양 및 화장품 및 약제(예컨대 로션, 크림, 연고, 용액, 의약, 점안제 및 귀약 등)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플은 세포 또는 조직 용해물을 포함한다. 특허청구된 본 발명의 다양한 실시양태에서, 샘플은 조 샘플을 구성할 수 있으며, 즉 특허청구된 방법에 사용하기 전에 어떠한 제조 또는 처리를 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, 소 부피의 샘플(예컨대 0.1-20 ㎕)은 샘플 홀더(예컨대 카드 형태) 내에 함유된 막의 친수성 영역 위로 피펫팅되거나 또는 스포팅된 다음 건조시키고 이어 샘플을 IR계 분광장치에 노출시킨다. 카드 상의 샘플 부피는 임의의 적합한 방법을 이용하여 건조될 수 있다. 예컨대, 샘플 부피는 공기 건조되거나 또는 대류 가열기 또는 통상의 오븐 또는 마이크로웨이브 오븐을 이용하여 건조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 건조 메카니즘은 IR 시스템에 통합되는 것으로 간주된다. 일반적으로, 물은 정확한 정량을 얻는데 장애가 될 수 있으므로 정량하기 전에 샘플 부피 내에 미량의 물의 존재도 없는 것이 바람직하다.
특허청구된 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 샘플 부피가 스포팅되는 막은 건조 단계에 처리된 다음 적외선 흡수에 의해 물의 존재를 검출한다. 물이 검출되면, 상기 막은 다시 건조 단계에 처리되며 또 물의 존재가 검출되지 않을 때까지 상기 건조 단계를 반복한다. 전형적으로, 건조 단계 이후의 흡수에서 어떠한 변화가 없는 것은 물의 존재가 검출되지 않음을 나타내거나, 다르게는 샘플이 IR 분석을 위해 충분히 건조하다는 것을 의미한다.
특허청구된 본 발명의 방법의 방법 및 장치는 아주 소 부피의 샘플을 사용할 수 있게 하여 샘플 내의 분석물의 정확한 정량을 달성하게 한다. 다양한 실시양태에서, 상기 샘플 부피는 약 0.05 ㎕, 0.1 ㎕ 또는 0.2 ㎕ 또는 0.3 ㎕ 또는 0.4 ㎕또는 0.5 ㎕ 또는 0.6 ㎕ 또는 0.7 ㎕ 또는 0.8 ㎕ 또는 0.9 ㎕ 또는 1.0 ㎕ 또는 1.5 ㎕ 또는 2 ㎕ 또는 2.5 ㎕ 또는 3 ㎕ 또는 3.5 ㎕ 또는 4 ㎕ 또는 4.5 ㎕ 또는 5 ㎕ 또는 5.5 ㎕ 또는 6 ㎕ 또는 6.5 ㎕ 또는 7 ㎕ 또는 7.5 ㎕ 또는 8 ㎕ 또는 8.5 ㎕ 또는 9 ㎕ 또는 9.5㎕ 또는 10㎕ 또는 10.5 ㎕ 또는 11 ㎕ 또는 11.5 ㎕ 또는 12 ㎕ 또는 12.5 ㎕ 또는 13 ㎕ 또는 13.5 ㎕ 또는 14 ㎕ 또는 14.5 ㎕ 또는 15 ㎕ 또는 15.5 ㎕ 또는 16 ㎕ 또는 16.5 ㎕ 또는 17 ㎕ 또는 17.5 ㎕ 또는 18 ㎕ 또는 18.5 ㎕ 또는 19 ㎕ 또는 19.5 ㎕ 또는 20 ㎕ 또는 20 ㎕보다 크다. 본 명세서에 기재된 장치와 방법은 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 검출과 정량의 하한을 증가시키기 위하여 샘플 부피의 복수의 알리쿼트(aliquots)를 샘플 홀더 카드에 적용하고 알리쿼트 사이의 샘플 부피를 건조시키는 것에 아주 적은 부피의 사용을 용이하게 한다. 예컨대 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 검출하기 어렵거나 또는 검출할 수 없을 수 있는 아주 적은 수준의 분석물을 함유하는 샘플의 경우에서, 특정 샘플 부피(예컨대 10-20 ㎕)의 다수 알리쿼트를 샘플 홀더 카드 상에 스포팅하고, 상이한 알리쿼트 사이에서 샘플 부피를 건조시킬 수 있다. 따라서, 10-20 ㎕의 아주 적은 부피가 각 적용에서 샘플 홀더 카드에 스포팅되지만, 샘플 부피의 다수회 적용에 의해 50 ㎕ 내지 100 ㎕ 또는 그 이상의 전체 샘플 부피가 적용되고, 적용 사이에서 샘플 부피를 건조시킨다.
일부 실시양태에서, 20 ㎕의 샘플 부피를 카드에 적용한 다음 그 카드를 건조시키는 것에 의해 100 ㎕ 이상의 샘플 부피를 샘플 홀더 카드에 적용할 수 있다. 샘플 부피가 완전히 건조되면, 부가적인 20 ㎕의 샘플 부피를 샘플 홀더 카드에 적용될 수 있고 또 그 카드는 다시 건조될 수 있다. 이 방법은 카드 상에 필요한 샘플 부피를 스포팅하도록 다수회 반복될 수 있다. 이러한 수법의 이점은 분석물 검출/정량의 한도를 증가시킬 수 있는 점이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "용해하다", "용해" 또는 "용해하는"은 세포막을 개방하여 세포의 내용물이 방출되게 하는 것에 의해 세포 또는 조직이 파쇄될 수 있는 임의 수단을 지칭한다. 세포 또는 조직을 용해하기 위해 이용될 수 있는 예시적 방법은, 비제한적으로, 효소적 방법, 초음파, 기계적 작용(예컨대 전단력 및 밀착) 및 화학적 방법을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 공유결합으로 함께 결합된 2 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 핵염기(예컨대 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)의 임의 사슬을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 특허청구된 본 발명에 따른 방법을 이용하여 정량된 생체분자는 핵산 분자이다. 핵산 분자는, 비제한적으로, 바이러스성 게놈, 또는 그의 일부, DNA 또는 RNA, 세균성 게놈, 그의 일부, 진균, 식물 또는 동물 게놈, 또는 그의 일부, 메신저 RNA(mRNA), 리보소말 RNA(rRNA), 트랜스퍼 RNA(tRNA), 플라스미드 DNA, 미토콘드리아 DNA, 또는 합성 DNA 또는 RNA를 포함한다. 핵산 분자는 선형(예컨대 mRNA), 환형(예컨대 플라스미드), 또는 분기된 형태뿐만 아니라 이중가닥 또는 단일가닥 형태로 제공될 수 있다. 핵산 분자는 핵산의 작용 또는 거동을 변경하기 위해, 예컨대 3'-말단 디데옥시뉴클레오티드를 부가하여 부가적 뉴클레오티드가 핵산에 부가되지 않게 하기 위해, 변형된 염기를 포함할 수 있다.
용어 "파장"은 일반적으로 파동의 1개 피크 또는 능선과 그 다음 피크 또는 능선 사이의 거리를 지칭한다. 이것은 그의 주파수로 나뉜 파동의 속도와 동일하며 또 파동의 속도와 그의 기간을 곱한 것과 동일하다. 파장은 이동하는 파동 및 정지 파동뿐만 아니라 다른 공간의 파동 패턴의 특징이다. 파장은 흔히 그리스 문자 람다(λ)로 표시된다. 사인파가 고정된 파동 속도로 움직인다고 가정하면, 파장은 그 파동의 주파수와 반비례한다. 따라서, 더 높은 주파수를 갖는 파동은 파장이 더 짧고, 또 더 낮은 주파수를 갖는 파동은 파장이 더 길다.
용어 "파수"는 그 파장 상호간 비례하는 파동 특성이다. 일반적으로 cm-1 단위로 측정되며 또 단위 거리당 파장의 수, 즉 1/λ (이때, λ는 파장임)로 정의될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "흡수 피크 면적" 또는 "흡수 피크 면적들"은 샘플을 본 명세서에 기재한 바와 같이 IR 분광장치에 노출한 후에 관찰된 하나 이상의 적외선 흡수 스펙트럼을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 IR계 방법을 이용하여 적외선 흡수 스펙트럼이 얻어지면, 스펙트럼 중의 하나 이상의 피크 아래의 면적은 피크를 가로지르는 기준선을 그리고 그 피크 내에 포함되는 면적을 측정하는 것에 의해 산출된다. 기준선은 전형적으로 아래에 도시된 바와 같이 스펙트럼 상의 피크 전후의 지점을 기준으로 하여 그린다:
Figure 112012022417575-pat00001
특허청구된 방법에 따른 일부 실시양태에서, 피크 면적은 샘플 내의 분석물의 농도 또는 양과 상관관계가 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 내의 단백질의 농도는 다음과 같이 측정된다. 제1 단계로서, 공지된 농도의 단백질 표준을 포함하는 검량체를 사용하여 검량 곡선을 작성하고, 그 검량 곡선을 IR 분광계 기기에 프리로딩한다. 동일한 검량 곡선은 상기 기기가 샘플 내의 단백질을 정량하기 위해 이용될 때 마다 사용될 수 있다. 또한, 검량체가 분석될 샘플에 존재해야할 필요는 없고, 또는 다시 말해 검량체는 샘플과는 완전히 상이한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 예컨대, 특정 실시양태에서, 예컨대 BSA와 같은 단백질 표준 용액은 다양한 공지 농도의 완충액으로 제조될 수 있다. 상기 표준 용액은 카드 형태의 샘플 홀더 내의 막의 친수성 영역에 적용되며, 상기 막이 건조되고 또 IR 기기, 예컨대 브루커 IR 기기를 이용하여 흡수 스펙트럼을 측정한다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명에 따른 방법에는 임의의 적합한 IR 기기가 사용될 수 있는 것으로 본다.
대부분의 현대적 IR 흡수 기기는 미켈슨 간섭계(interferometer)와 함께 포리어-변환 수법을 이용한다. 특허청구된 방법에 따른 일부 실시양태에서, IR 흡수 스펙트럼을 얻기 위하여, 간섭계의 1개 거울이 이동하여 방사선에서 간섭을 생성하여 검출기에 도달한다. 모든 파장은 간섭계를 통과하기 때문에, 인터페로그램(interferogram)은 복잡한 패턴이다. 파수(cm-1)의 함수인 흡수 스펙트럼은 거울 이동(cm)의 함수인 인터페로그램의 포리어 변환으로부터 얻는다. 이러한 디자인은 분산성 기기의 참조 셀(reference cell)을 갖지 않기 때문에, 참조 스펙트럼을 기록하여 메모리에 저장하고 샘플 스펙트럼으로부터 차감한다.
다른 예시적 IR 흡수 기기는 분산성 IR 흡수 기기 및 단일 파장 IR 기기를 포함한다. 분산성 IR 분광계는 광의 상이한 파장을 분산시키기 위하여 단색화장치(monochromator)에서 회절 격자를 이용한다. 일반적으로, 분산성 IR 분광계는 FTIR 기기에 의해 교체된다. 단일 파장 IR 기기는 신속한 반응의 역학을 측정하기 위하여 단일 IR 파장을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
특허청구된 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, FTIR 기기는 하나 이상의 생체분자를 정량하기 위해 사용된다. 아미드 I 및 아미드 II 피크(1800-1450 cm-1)를 포함하는 곡선 하의 면적은 상기 기기에 내장된 소프트웨어에 의해 산출된다. 예컨대, 브루커 IR 분광계는 브루커 오푸스(Bruker Opus) 소프트웨어를 포함한다. 검량 곡선은 피크 아래의 면적 대 단백질 표준의 농도를 플럿하여 수립된다. 공지 농도의 표준에 의해 작성된 검량 곡선을 이용하여, 샘플 내의 분석물의 농도가 측정된다.
일반적으로, 검량 곡선은 분석물 양 또는 농도에 대한 관찰된 신호의 예상값 사이의 함수 관계의 그래프적 표시를 지칭한다. 전형적으로, 공지 농도의 검량체 범위를 포함하는 표준은 검량 곡선 작성에 사용된다. 샘플에 의해 얻은 스펙트럼은 표준과 비교하여 소망하는 분석물의 농도를 얻는다.
본 명세서에 기재된 방법에 따른 일부 실시양태에서, 상기 방법은 샘플 내의 물에 의한 흡수를 모니터링/검출하는 단계를 더 포함한다. 물은 ~3400 내지 1600 cm-1 에서 흡수하므로, 많은 생체분자에 의해 얻은 스펙트럼과 중복된다. 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 샘플 내 물의 양이 감소함에 따라서 감소하는 물에 의한 흡수와 관련된 스펙트럼 세기에서 변화를 모니터링하기 위한 내장 소프트웨어를 포함하는 IR 기기가 사용된다. 따라서, 물과 관련된 스펙트럼 세기를 모니터링하는 것에 의해, 사용자는 샘플이 더 건조되어야 하는지 여부를 결정할 수 있다. 전형적으로, 물에 의한 흡수와 관련된 스펙트럼 세기는 샘플 스펙트럼 세기가 2 또는 3개 이상의 연속적인 판독될 때까지 건조 방법 동안 수차례 측정되므로, 그 샘플이 실제 정량에 맞게 건조한 것임을 확인한다.
일부 실시양태에서, 계면활성제는 본 발명의 방법을 사용하여 분석될 샘플에 포함된다. 계면활성제는 막에 스포팅될 샘플에 포함되거나 또는 샘플이 스포팅되기 전 또는 후 막에 부가될 수 있다. 예컨대 소듐 도데실 설페이트(SDS) 또는 Tween 20과 같은 계면활성제 또는 예컨대 글리세롤과 같은 화학적 첨가제는 용액의 표면 장력을 감소시켜, 한 면적 내의 샘플의 균일한 분포를 허용한다.
하나 이상의 생체분자를 함유하는 수성 샘플을 친수성 PTFE 기질 위에서 건조시키면, 샘플이 건조됨에 따라서 농도 구배가 형성된다. 이러한 증착 패턴은 가장 바깥 주변에서 최고량의 샘플 증착, 및 샘플 면적의 중심에서 최저량을 초래한다. 이러한 패턴은 흔히 "커피 링" 또는 "도넛" 패턴이라 칭한다. 계면활성제의 부가 등에 의해 수성 샘플의 표면 장력이 감소되면, 샘플의 증착은 전체 샘플 면적에 걸쳐 더욱 균일해 진다. 샘플이 에너지 공급원에 의해 조사되는 경우, 계면활성제를 포함시키는 것이 에너지 공급원에 노출될 면적 내에서 샘플의 더욱 균일한 분포를 초래한다.
예시적 계면활성제는, 비제한적으로, 폴리에틸렌계 비이온성 계면활성제(Tween 20, Tween 40, Tween 60 및 Tween 80)를 포함한다. 소듐 도데실 설페이트(SDS), 암모늄 라우릴 설페이트, 소듐 라우릴 에테르 설페이트(SLES), 소듐 스테아레이트와 같은 음이온성 계면활성제도 사용된다. 일부 실시양태에서, 계면활성제의 농도는 약 1% 또는 약 2% 또는 약 3% 또는 약 4% 또는 약 5% 또는 약 6% 또는 약 7% 또는 약 8% 또는 약 9% 또는 약 10%이다. 특정 실시양태에서, 계면활성제의 농도는 약 5%이다.
예시적 화학적 첨가제는 비제한적으로 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜과 같은 폴리올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적 첨가제의 농도는 약 1% 또는 약 2% 또는 약 3% 또는 약 4% 또는 약 5% 또는 약 6% 또는 약 7% 또는 약 8% 또는 약 9% 또는 약 10%이다. 특정 실시양태에서, 화학적 첨가제의 농도는 약 5%이다.
IR계 방법을 이용하여 샘플 내의 하나 이상의 생체분자를 정량하기 위해 사용되는 장치뿐만 아니라 이러한 장치를 제조하는 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 생체분자의 정량에 사용되는 장치는 다공성 막(예컨대 한외여과 막 또는 미세다공성 막)을 포함하는 카드 형태의 샘플 홀더이다. 일반적으로, 한외여과 막은 0.1 ㎛ 보다 작은 기공 크기를 갖는 것으로 이해된다.
일부 실시양태에서, 샘플 홀더에 함유된 다공성 막은 소수성 영역에 의해 둘러싸인 친수성 영역을 포함한다. 친수성 영역은 물에 의해 즉각 습윤화될 수 있는 막의 영역 및 샘플이 통상 막으로 스포팅되거나 피펫팅되는 영역이다. 또한 전형적으로 IR 빔에 노출되는 영역이기도 하다.
일부 실시양태에서, 막의 친수성 영역은 물에 의해 수화되지 않는 소수성 영역에 의해 둘러싸인다.
일부 실시양태에서, 샘플 함유를 위한 면적은 친수성 영역 내에 생성된 소수성 영역의 라인 또는 스포트 형태의 친수성 및 소수성 영역의 형상/패턴을 포함한다. 예시적 형상과 패턴은 도 8a 내지 도 8d에 도시되어 있다. 이러한 형상과 패턴은 계면활성제나 화학적 첨가제의 부가와 마찬가지로 IR 빔에 노출되는 면적 내에서 샘플의 더욱 균일한 분포를 가능하게 한다.
적외선 분광광도계 분석에 사용하기 위한 샘플 홀더 카드는 미세다공성 막을 포함하는 종래 기술에 이미 기재되어 있고, 예컨대 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있는 미국 특허 5,470,757호 및 5,764,355호에 기재되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 샘플 함유를 위해 소수성 면적에 의해 둘러싸인 친수성 면적을 포함하는 샘플 홀더 카드는 개시하고 있지 않다. 또한 상기 특허들은 샘플 홀더 카드 및 예컨대 샘플 내의 하나 이상의 생체분자의 정량, 매우 적은 샘플 부피의 이용 및 매 정량시마다 검량 곡선을 작성할 필요가 없는 것과 같은 본 명세서에 기재된 바와 같은 개선점을 개시하고 있지 않다.
카드 형태의 샘플 홀더는 접착제에 의해 막 기판에 적층된 종이 카드 스톡의 2개 층으로부터 전형적으로 제조된다. 샘플 홀더는 또한 접착제에 의해 접착될 수 있는 플라스틱과 같은 다른 물질로부터 제작될 수 있다. 또한 샘플 홀더는 접착제 사용없이 작성될 수 있고 또 열에 노출될 때 카드 스톡에 접착하는 카드 스톡 상에서 코팅을 통하여 적층된다. 일부 실시양태에서, 샘플 홀더는 약 1.4 인치(3.55cm) 폭 x 2.5 인치(6.35 cm) 길이의 카드 형태이며 또 적어도 4개의 샘플을 유지할 수 있다. 그러나, 샘플 홀더는 1 내지 96개 샘플 이하((예컨대 96-웰 플래튼 포맷)를 함유할 수 있도록 고안될 수 있다. 샘플 홀더가 IR 빔에 노출되는 IR 계의 캐리어에 정확하게 삽입되는 것을 확인하기 위하여, IR 시스템에 맞게 샘플 홀더를 배열하는 카드 형태일 때, 샘플 홀더 고안에 노치(notch)를 혼입할 수 있다. 샘플 홀더는 또한 IR 빔이 샘플을 함유하는 친수성 영역을 통하여 통과하도록 정확하게 배열되는 것이 중요하다.
본 명세서에 기재된 샘플 홀더 카드는 제작이 용이하고, 비용 효과적이며 또 일회용으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 이하의 실시예에 의해 더욱 자세하게 설명되며, 이들 실시예는 제한을 의미하지 않는다. 본 출원을 통하여 인용된 모든 참고문헌, 특히 및 공개된 특허 출원의 내용뿐만 아니라 도면은 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1: 장래의 샘플 정량을 위한 검량 곡선의 작성
본 명세서에 기재된 샘플 내의 하나 이상의 생체분자를 정량하는 방법은 정량 실험을 기기에서 실시할 때마다 검량 곡선을 작성할 필요를 제거한다. 이는 사용자가 정량 에세이를 실시할 때마다 전형적으로 새로운 검량 곡선 또는 표준 곡선을 작성할 필요가 있는 관련 기술의 현재 에세이에 비교하여 개선된 점이다.
본 명세서에 기재된 방법에서, 사용자는 검량 곡선 또는 표준 곡선을 일단 작성하면 이를 장래 분석을 위해 사용할 수 있다. 일개 실험으로서, 검량 곡선은 다음과 같이 작성한다. 다양한 농도의 분석물(BSA)의 용액을 완충액으로 제조하고 본 명세서에 기재한 바와 같은 FTIR계 검출 방법을 이용하여 분석하였다. 도 1의 그래프는 분석물의 농도 또는 양(X축)에 대한 피크 면적 또는 피크 높이(Y축)를 도시한다. 이 검량의 선형 범위는 피크 면적이 공지될 때 미공지 샘플의 농도를 산출하기 위해 사용된다.
전형적인 방정식은 y = mx + c이며, 이때 c= Y 축 상에서 인터셉트; m = 선의 기울기; y = 피크 면적 또는 높이; 및 x = 분석물의 농도 또는 양임. 또한, 사용자는 원래의 검량 곡선에 데이터를 부가하여 정량의 통계적 관련성을 증가시킬 수 있다.
도 1은 다양한 공지 농도의 BSA 완충액을 사용하여 1일에 작성된 검량 곡선 및 동일 곡선에 대하여 수일 후에 정량된 단백질의 미공지 농도의 관련 샘플의 예를 도시한다.
실시예 2: 샘플 내의 생체분자의 정량을 위한 일반적 과정
대표적인 실험으로, 하나 이상의 생체분자(예컨대, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 등)를 함유하는 샘플은 탈이온수 또는 적합한 완충액에 제조한다. 약 0.2-10 ㎕의 블랭크 용액(예컨대 탈이온수 또는 완충액 단독)을 예컨대 카드 형태의 샘플 홀더(이후 샘플 홀더 카드라 칭함)에 함유된 막의 친수성 영역에 가한다. 제조된 샘플의 동일 부피를, 동일 샘플 홀더 카드 또는 상이하지만 동일한 샘플 홀더 카드 상에 존재할 수 있는, 하나 이상의 스포트에 가한다. 상기 샘플 홀더 카드는 이어 하나 이상의 다음 수법을 이용하여 건조된다: 가열(40-60℃, 0.5-2분); 압축 공기/질소 또는 다른 불활성 가스(0.5-2분) 또는 마이크로웨이브 오븐. 상기 샘플 홀더 카드는 이어 IR 기기의 샘플 구획에 삽입한다. 블랭크 용액의 투과/흡수 스펙트럼은 바탕(background)에 대한 스펙트럼을 얻기 위하여 4000 내지 400 cm-1에서 측정한 다음 동일 파장 범위에서 샘플의 측정을 실시하였다. 상기 시스템 내에 내장되어 있고 다양한 농도의 표준을 사용하여 작성된 검량 곡선을 사용하여 미공지 샘플의 농도를 결정하였다.
도 2는 블랭크를 가하기 위한 1개 스포트(B라 칭함) 및 3개 샘플을 가하기 위한 스포트(1, 2 및 3이라 칭함)를 나타내는 예시적 샘플 홀더 카드의 이미지를 도시한다. 그러나, 상기 논의한 바와 같이, 샘플 홀더 카드는 샘플 적용을 위한 임의 수의 스포트를 갖도록 설계될 수 있다.
실시예 3: IR 분광장치를 이용하여 샘플 내의 단백질 및 핵산의 정량
대표적 실험으로서, 샘플 내의 단백질 및 핵산은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 다음과 같이 정량하였다.
일개 실험으로서, 소혈청 알부민(BSA; Sigma Cat#A-7030) 및 데옥시리보핵산(DNA; Ambion Cat#AM9680 전단된(sheared) 연어 정자 DNA)을 다양한 비율(10 대1 ㎍ 비율 및 역비율)로 함께 혼합하고 또 1xPBS 완충액에 용해시켰다. 1㎕ 샘플은 P10 레이닌(Rainin) 피펫을 이용하여 친수성 PTFE 막 새플 홀더 카드 상에, 도 2에 도시된 샘플 홀더 카드의 위치 1, 2 또는 3에 피펫팅하였다. 상기 샘플이 제조된 완충액 동일 부피는 도 2에 도시된 바와 같이 샘플 홀더 카드 상의 위치 B에 피펫팅하였다.
완충액 및 샘플 스포트를 함유하는 샘플 홀더 카드는 고압 공기를 이용하여 건조시켰다. 샘플 홀더 카드를 IR 기기에 삽입하고 또 완충액의 흡수/투과 스펙트럼을 4000 내지 400 cm-1 사이에서 최초로 측정하였다. 이어, 샘플의 스펙트럼은 바탕 스펙트럼으로서 완충액 스펙트럼을 이용하여 측정하였다. 단백질 및 핵산의 양은 단백질의 경우 1700 내지 1400 cm-1의 스펙트럼 범위를 이용하고 또 핵산의 경우 1120-940 cm-1의 스펙트럼 범위를 이용하여 측정하였다. 단백질 및 핵산 모두 1700-1400 cm-1의 파장 범위에서 흡수를 나타내었다. 따라서, 핵산의 농도가 측정되면, 1700-1400 cm-1 사이의 피크 면적을 이용하여 얻어지는 바와 같은 단백질 + 핵산의 농도로부터 차감되어 단백질 단독의 농도를 제공한다. 따라서, 단백질 및 핵산의 농도는 단일 실험으로 결정될 수 있다. 이 실험에서, 검량 곡선은 완충액 또는 탈이온수에 용해된 단백질 및 DNA의 순수한 샘플을 사용하여 단백질 및 DNA에 대하여 독립적으로 작성하였다. 이러한 실험의 결과는 도 3에 도시한다.
실시예 4: IR 을 사용하여 샘플 내의 펩티드의 정량
다른 대표적 실험으로서, 본 발명에 따른 방법은 펩티드를 정량하기 위해 사용될 수 있다. 일개 실험으로서, 펩티드 샘플을 물에 1 mg/ml 농도로 용해시켰다. P2 레이닌 피펫을 이용하여 2㎕ 부피의 샘플을 친수성 PTFE 막 함유 샘플 홀더 카드 상에 도 2에 도시된 바와 같이 피펫팅하고, 또 40℃ 가열기에서 건조시켰다. 동일 샘플 홀더 카드는 또한 블랭크(B)라 불리는 위치를 보유하며, 여기에는 샘플이 용해된 물 2 ㎕ 부피를 피펫팅하였다. 상기 카드를 IR 기기에 삽입하고 또 물/완충액 블랭크의 흡수/투과 스펙트럼을 측정한 다음 물/완충액 스펙트럼을 바탕값으로 사용하여 샘플의 측정을 실시하였다. 펩티드의 양은 1700 내지 1400 cm-1 사이의 스펙트럼 범위를 이용하여 측정하였다. 검량 곡선은 완충액/물 중의 검량체로서 BSA의 순수 샘플을 사용하여 작성하였다. 이러한 실험의 결과는 도 4에 도시한다.
실시예 5: IR 을 사용하여 샘플 내의 지질다당류의 정량
대표적 실험으로서, 본 발명에 따른 방법은 샘플 내의 지질다당류의 양을 정량하기 위하여 사용되었다. 특히, 내독소, (지질다당류(LPS); 시그마 L2630),와 같은 지질다당류를 1 x PBS 완충액에 용해시켜 20 mg/ml 스톡 용액을 얻었다. P2 레이닌 피펫을 이용하여 2 ㎕ 부피 샘플을 친수성 PTFE 막 함유 샘플 홀더 카드 상에 도 2의 이미지에 도시된 바와 같이 피펫팅하고, 또 40℃ 가열기에서 건조시켰다. 샘플 홀더 카드는 또한 블랭크(B)라 불리는 위치를 함유하며, 샘플이 용해된 완충액 2 ㎕ 부피가 적용된다. 샘플 홀더 카드를 IR 기기에 삽입하고 또 완충액의 스펙트럼을 먼저 측정한 다음 샘플의 스펙트럼을 측정하여, 블랭크 완충액 스펙트럼을 바탕값으로 하였다. LPS 희석의 적정은 스톡 용액 산출을 기본으로 기록하여 검량 곡선을 얻었다. 이러한 실험의 결과는 도 5에 도시한다.
실시예 6: IR 을 사용하여 샘플 내의 물의 존재를 모니터링
샘플 내의 물의 존재를 검출하기 위하여 본 명세서에 기재된 방법을 이용할 수 있다. IR계 방법을 이용하여 분석할 샘플 내에는 물이 존재하는 것이 바람직하지 않은데, 이는 물이 생체분자의 정량, 예컨대 특히 단백질/펩티드 정량의 경우 정확성에 나쁜 영향을 줄 수 있기 때문이다.
대표적 실험으로서, Milli Q 물 중의 10 mg/ml BSA(시그마 Cat #A-7030) 용액 2㎕를 예컨대 카드 형태의 샘플 홀더(이후 샘플 홀더 카드라 지칭) 내에 함유된 막의 친수성 영역에 적용하였다.
IR 분광계의 IR 빔 내에 습윤 샘플을 배치시키고 또 IR 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 흡수 스펙트럼은 신호 세기 및 물의 증발에 따른 신호 프로필 변화로서 기록하였다.
흡수 스펙트럼에 대한 신호 세기가 3개의 연속적인 측정 동안에 걸쳐 일정하게 유지되면, 그 샘플은 건조한 것으로 것으로 간주되며 또 소프트웨어(예컨대 브루커 인스트루먼트의 경우 오푸스 소프트웨어)는 4000-400 cm-1 사이에서 BSA의 흡수 스펙트럼을 수집하고 또 내장 검량 곡선을 이용하여 상기 용액 중의 BSA의 농도를 결정한다. 이러한 실험의 결과는 도 6에 도시하며, 이는 샘플이 건조됨에 따라 물과 관련된 신호 세기에서 감소를 나타낸다.
실시예 7: 샘플의 분포에 대한 계면활성제의 효과
수성 용액은 IR 빔에 노출될 막의 면적 상에서 균일한 건조 및 균일한 분포를 얻는 것과 관련된 문제를 가질 수 있다.
이 실험은 계면활성제를 샘플 용액에 부가하면 IR 빔에 노출될 면적 상의 샘플의 균일한 분포와 그에 따른 더욱 정확한 정량을 초래함을 보여준다. 대표적 실험으로서, 5㎕의 10 mg/ml 사이토크롬 C 단백질 샘플 용액을 사용하고, 이는 PBS에 용해되고 또 5% SDS를 사용하거나 사용하지 않고 건조시켰다. 샘플을 샘플 홀더 카드 상에 스포팅하고 또 전체 직경 4.5 mm의 IR 빔 내에 배치하였다.
SDS를 갖지 않는 샘플의 약 10% 만이 IR 빔을 흡수하고 있는 것으로 관찰되었는데, 이는 샘플의 대부분이 샘플 면적의 외부 1 mm에 함유되어 있었기 때문이다. 그러나, SDS가 존재하는 샘플에서는, 더욱 균일한 샘플 분포가 더 많은 IR 흡수를 초래하였는데, 이는 샘플이 빔의 최대 조사(1/e2) 내에 있었기 때문이다. 통합된 아미드 1 및 2 피크 면적(1725 내지 1479 cm-1)은 SDS를 갖지 않는 샘플에 비하여 약 3배 정도 더 높았다. 이러한 실험의 결과는 도 7에 도시한다. IR 흡수 스펙트럼의 X축은 파수(cm-1)를 도시하는 반면, Y축은 흡수 단위를 도시한다.
실시예 8: 샘플 함유를 위해 플라즈마 처리를 사용하여 샘플 홀더 카드의 제작
본 명세서에 기재된 바와 같이 샘플 내의 하나 이상의 생체분자를 정량하기 위한 방법에 사용될 수 있는 샘플 홀더도 본 발명의 범위에 포함된다. 일부 실시양태에서, 샘플 홀더는 카드 형태이고, 또 이것은 편의상 샘플 홀더 카드라 지칭한다. 샘플 홀더 카드는 정확한 흡수 스펙트럼을 얻어서 결국 관심을 두고 있는 하나 이상의 생체분자의 정량을 얻도록 IR 빔 내에 샘플을 함유할 수 있어야 한다.
본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 샘플 홀더 카드를 제조하기 위한 일개 방법에서, 샘플 함유를 위한 면적을 생성하기 위하여 진공 플라즈마 환경이 이용되었다. 샘플 홀더 카드에 사용된 출발 막은, 스미토모에 의해 상품명 Poreflon으로 시판되고 있는 친수성 PTFE 막이었다. 이 막은 0.03 ㎛ (HHPSW-005-30)의 평균 크기의 기공을 포함하고 또 물 습윤성 표면을 부여하기 위하여 친수성 처리에 의해 피복된다. Poreflon 친수성 막을 진공 플라즈마 환경에 노출하면 자연적으로 소수성 PTFE를 노출하는 표면으로부터 처리를 청정하게 한다.
도 8a 및 도 8b는 조립된 샘플 홀더 카드가 플라즈마 노출되도록 위치하는 마스킹 고정부의 실험적 개방도 및 밀폐도를 각각 나타낸다. 상기 막은 각각의 중심에 12.5 mm 관통공을 가진 2개의 강성 접착제 피복된 종이 시트로 이루어진 카드로 제작된다. 상기 2개 종이 시트는 스미토모 친수성 막이 시트 사이에 샌드위치되게 하여 조립되어 조립된 종이 카드 내의 구멍을 덮는다. 조립된 카드(10)는 도 8a에 도시되며, 고정부(12)는 개방 구조로 있다. 친수성 막(14)을 함유하는 조립된 카드(10)는, 도 8a 및 도 8b에 도시한 바와 같이, 카드를 중앙에 놓기 위하여 프레임(16)을 함유하는 마스킹 고정부(12) 내에 배치된다. 탄성중합체 밀봉부(18)는 중심에 있도록 배치된 막 카드(10)의 대향면에 존재한다. 탄성중합체 밀봉부(18)를 둘러싸는 것은 4개의 구멍(19)이며, 이는 플라즈마 가스가 처리될 막(14)에 접근하도록 소통을 제공한다. 이어 마스킹 고정부(12)는 도 8b의 단면도에 도시한 바와 같이 밀폐되고, 그에 따라 탄성중합체 밀봉부(18)는 카드(10) 내의 막(14)의 대향면에 대하여 압착 밀봉된다. 고정부(12)를 친수성 막(14)을 함유하는 샘플 홀더 카드(10) 상에 밀폐하기 위하여 예컨대 클램프에 의한 힘이 사용되었다.
고정부(12)에 위치한 카드(10)는 이어 진공 플라즈마 환경에 배치되며, 그의 밀폐 단면도는 도 8b에 도시되어 있다. 이용될 수 있는 예시적 진공 플라즈마 시스템은 해릭 진공 플라즈마 시스템(Harrick Vacuum Plasma System) 모델 PDC-001이다. 시스템 내의 챔버(20)는 진공 펌프(도시되지 않음)를 이용하여 가스 배기되었다. 대기 가스를 챔버(20)에 도입하고 또 약 2-5 cc/분의 유동 속도로 유지하였다. RF 발생기(도시되지 않음)에 대하여 전력을 공급하고 또 10초 내지 7분 범위의 시간 동안 유지시켰다. 샘플 홀더 카드(10)의 탄성중합체 밀봉부(18) 사이의 막(15) 영역은 플라즈마로부터 보호되는 반면에, 나머지 외부는 점으로 도시된 바와 같이 플라즈마에 노출되었다.
도 8a 및 도 8b에 도시된 고정부를 이용한 플라즈마 노출 실험은 1분 이상의 가공 시간이 탄성중합체 밀봉부(18)의 위치에서 생기는 예리한 일시적 에지(transition edge)와 더불어 친수성 및 소수성 영역의 분명한 정의를 초래하였다. 1분 미만의 플라즈마 가공 시간은 희미한 일시적 에지를 초래하거나 일시적 에지를 전혀 초래하지 않으며, 이는 함유되지 않은 샘플과 친수성을 유지하도록 한다.
도 9는 실시예에 기재된 방법을 이용하여 제조된 소수성 영역(26)에 의해 둘러싸인 친수성 영역(24)을 갖는 막을 함유하는 예시적 샘플 홀더 카드(22)를 도시한다. 2개 영역의 경계는 일시적 에지 또는 라인(28)이다.
상기 논의한 바와 같이, 샘플은 IR 빔 내에 가능한한 균일하게 분포되는 것이 바람직하다. 균일한 분포를 이루는 한가지 방법은 상기 기재한 바와 같이 계면활성제를 샘플에 부가하는 것이다. 균일한 분포를 이루는 다른 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 막 상에 친수성 면적과 함께 배치된 소수성 면적의 팬턴/형상을 생성하는 것이다.
건조 점적은 커피 링 현상과 함께 흔히 간찰되는 것과 같은 건조 점적의 외부 에지를 따라 우선적으로 샘플을 침적시킬 것으로 이해된다. 이러한 건조 패턴을 최소화하기 위하여, 친수성 영역을 둘러싸는 소수성 영역은 더 개질될 수 있다. 이것은 예컨대 친수성 면적 내에 소수성 스포트 또는 라인의 막 위에 패턴을 유발하도록 막 위에 탄성중합체 밀봉부를 적절하게 배치하는 것에 의해 달성될 수 있다. 이러한 패턴은 훨씬 작은 점적을 초래하여 더 작은 건조 패턴을 초래한다. 더 작은 건조 패턴은 IR 빔 내에서 더욱 균일한 구조로 샘플을 침적한다. 막 위로 구조화될 수 있는 가능한 형상/패턴은 라인, 점, 별모양 및 기타 일반적 형상일 수 있다. 또한, 외부 소수성 영역은 별모양, 사각형 등과 같은 형상일 수 있다. 탄성중합체 밀봉부를 적합하게 고정부 상에 배치하는 것에 의해 작성될 수 있는 예시적 소수성/친수성 패턴은 도 10a 내지 도 10d에 도시되어 있다. 친수성 영역은 참조번호(30)로 표시되며 또 소수성 영역은 참조번호(32)로 표시된다.
실시예 9: 샘플 함유를 위해 열처리를 이용하여 샘플 홀더 카드의 작성
다른 실험으로서, 본 발명에 따른 IR 방법에 사용하기 위한 샘플 홀더 카드는, 카드 중의 막 상에 샘플 함유를 달성하기 위한 다른 수법으로서 열처리를 이용하여 다음과 같이 작성하였다.
예시적 실험으로서, 친수성 PTFE 막의 표면 습윤성은 가열된 플래튼에 대한 노출에 의해 변경되어, 샘플 함유를 위한 영역을 생성한다. 사용된 친수성 PTFE 막은 스미토모에 의해 상품명 Poreflon으로 시판되며, 0.5 ㎛의 평균 기공 크기(HHPSW-005-30)를 가지고 또 물 습윤성 표면을 부여하기 위하여 친수성 처리에 의해 피복된다. 일반적으로, 본 실시예에 기재된 방법을 이용하여, 0.05 ㎛ 내지 0.45 ㎛ 범위의 기공 크기 및 30 ㎛ 내지 80 ㎛ 범위의 두께를 갖는 Poreflon 막은 가열된 플래튼을 사용하여 변형되었다.
실시예 8의 경우, 친수성 PTFE 막은 4개의 10 mm 관통공을 갖는 접착제 피복된 종이 시트로 이루어진 카드로 작성하였다. 2개 종이 시트는 스미토모 친수성 막이 시트 사이에 샌드위치되게 하여 조립하여 조립된 조이 카드 내의 구멍을 덮었다. 친수성 막(36)을 함유하는 이렇게 조립된 카드(34)는 도 11에 도시된 바와 같이 칼-로드(cal-rods)(도시되지 않음) 및 가열된 플래튼(42)에 부착된 뉴마틱 실린더(도시되지 않음)를 함유하는 엠보싱 고정부(38)에 배치시켰다. 실린더는 가열된 플래튼(42)을 샘플 홀더 카드(34) 내의 막(36) 위에 및 막(36)의 하부를 지지하는 네스트(40) 상의 탄성중합체 패드(44) 위에 배치한다. 가열된 플래튼(42)은 솟아오른 돌기부(boss)(46)를 함유하며 또 네스트(40)는 탄성중합체 패드(44)를 함유하며, 솟아오른 돌기부(46)와 정렬되며, 샘플 홀더 카드(34)가 그 사이에 위치하면, 가열된 플래튼(42)과 직접 접촉하는 영역을 초래하여 소수성으로 된다.
엠보싱 고정부/카드/가열된 플래튼 어셈블리의 개방 및 밀폐 단면도는 도 12a 및 도 12에 각각 도시된다.
가열된 플래튼(42)이 소정 시간 동안 (예컨대 5초 내지 5분) 막(360에 노출된 후, 실린더(도시되지 않음)는 막 카드(34)로부터 떨어져 가열된 플래튼(42)으로 이동하였다.
실시예 8의 경우, 함유 영역의 형상은 변형될 수 있다. 열처리의 경우, 함유된 면적의 형상은 막과 인접하게 존재하는 솟아오른 돌기부 및 탄성중합체 패드의 형상에 의해 제어될 수 있으므로, 가열된 플래튼의 솟아오른 돌기부와 접촉하는 막 부분은 소수성으로 되는 반면, 가열된 플래튼과 접촉하지 않는 부분은 친수성으로 잔존한다.
실시예 8에 기재된 바와 같은 플라스마 처리를 이용하거나 또는 현재의 실시예에 기재된 열처리를 이용하여 작성한 소수성 영역이 샘플을 함유하는데 효과적임을 확인하기 위하여, 열처리된 또는 플라즈마 처리된 및 미치리 막의 샘플 함유 특성을 물을 샘플로 사용하여 조사하였다. 도 13a 및 도 13b는 열처리 또는 플라즈마 처리되지 않은 막의 샘플 함유 특성을 도시하고 또 도 13c 및 도 13d는 열처리 또는 플라즈마 처리된 막의 샘플 함유 특성을 도시한다. 물 2 ㎕를 샘플(50)로서 샘플 홀더 카드(54)의 친수성 막(52) 상으로 스포팅하였다. 도 13a는 시간 0에서 물 샘플(50)을 도시하고 도 13b는 30초 시간에서 물 샘플(50)을 도시한다. 도 13b에 도시한 바와 같이, 물 샘플은 막 영역을 전체에 걸쳐 퍼져서, IR 빔의 직경보다 더 큰 직경의 더 넓은 습윤 면적을 초래하였다. 반면에, 시간 0 (도 13c) 및 30초 시간(도 13d)에서의 도 13c 및 도 13d에 도시된 바와 같이, 열처리 막 또는 플라즈마 처리 막의 경우, 물 샘플(50)은 소수성 배리어 영역(58)에 의해 둘러싸인 막의 친수성 영역(56) 내에 함유되어 있었다. 따라서, 본 실시예에 기재된 바와 같은 열처리 또는 플라즈마 처리는 외부 소수성 배리어 영역(56)에 의해 둘러싸인 내부 친수성 영역(56)을 작성하기 위해 이용될 수 있다.
실시예 10: 화학적 또는 물리적 파괴를 통한 샘플의 균일한 분포
FTIR 분석용의 수성 생물학적 샘플을 건조시키면 샘플 면적의 외부 에지에서 샘플의 농도가 가장 높아, 소위 "커피 링" 또는 "도넛 링" 패턴을 형성하는 것과 같이 불균일한 샘플 분포 패턴을 초래하고, 이는 다시 부정확한 정량을 초래할 수 있음이 관찰되고 있었다.
본 명세서에 기재된 대표적 실험으로서, 도 14a에 도시된 바와 같이, 계면활성제 또는 세제의 사용은 샘플로 하여금 샘플 함유 면적에서 더욱 균일한 패턴으로 건조되게 하여 더욱 균일한 샘플 분포를 초래하였다. 또한, 샘플 면적에서 소수성 배리어-패턴(예컨대 "X" 크로스 패턴)의 부가는, 도 14b에 도시된 바와 같이, 샘플이 더욱 샘플 면적의 중앙을 향하여 건조되게 하여, 계면활성제 첨가제를 사용한 효과와 유사한 샘플 분포를 초래한다. 샘플의 분포 또는 "커피 링"의 파괴는 더 높은 농도 및 더 낮은 %의 변화 계수(% CV)를 초래하였다.
사용될 수 있는 계면활성제는, 비제한적으로, Tween 20 및 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 포함한다. 일 개 실험으로서, 건조된 사이토크롬 C 샘플의 링 패턴은 샘플이 용해되는 용액(예컨대 PBS 대 H2O)에 따라 달라질 수 있음을 나타내었다. IR 빔 내에서 샘플 분포의 차이는 샘플을 통한 IR 빔의 투과에 영향을 줄 수 있다. 링 패턴을 파괴하여 더 균일한 샘플 분포를 얻기 위하여, 세제 또는 계면활성제들이 샘플에 부가되거나 또는 샘플이 스포팅되어 건조되는 막에 직접 부가될 수 있다.
하기 표 1에서, 사이토크롬 C 단백질의 아미드 1 및 2 피크 면적은 SDS 부재(H2O 만 존재) 및 SDS 존재(1 및 5%)하에서 산출하였다. SDS의 부가는 산출된 샘플 면적의 증가뿐만 아니라 % 변화 계수(% CV)의 감소(9.1에서 2.3%)를 초래하였다.
도 15는 하기 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이 일람표로된 데이터를 나타내는 막대 그래프를 도시한다. SDS의 부가에 따른 샘플 값의 증가 및 % CV의 감소는 샘플의 더욱 균일한 분포(더 많은 샘플이 전체 IR 빔 내에 존재)에 기인하며 또 샘플들 사이에는 적은 변화가 존재한다(샘플의 균일한 분포 대 링 형성의 경우에서 차이).
표 1 및 2, 컬럼 B에서 아미드 1 및 2 피크 면적은 오푸스(OPUS) 6.5 소프트웨어(브루커 제조)를 이용하여 산출하였다. 평균값뿐만 아니라 % CV도 산출하였다. SDS(1% 및 5%)를 샘플에 부가하고 또 피크 면적 및 % CV도 재분석하였다.
Figure 112012022417575-pat00002
Figure 112012022417575-pat00003
본 출원을 통하여 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허는 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
본 명세서는 참고로 포함된 명세서 내에 인용된 참고문헌의 가르침을 참고로 가장 완전히 이해될 수 있을 것이다. 본 명세서 내의 실시양태들은 본 발명에서 실시양태들의 예시를 제공하며, 본 발명의 범위의 제한으로 의미되지 않아야 한다. 당업자들은 다른 실시양태도 본 발명에 포함됨을 익히 알고 있을 것이다. 모든 문헌과 발명은 전체적으로 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 참고문헌에 포함된 물질이 본 발명과 반대되거나 또는 일치하지 않는 경우, 본 명세서는 이러한 물질이 중복되는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 어떠한 참고문헌의 인용은 그러한참고가 본 발명의 종래 기술이면 허용되지 않는다.
다르게 정의되지 않는 한, 특허청구범위를 비롯한 본 명세서에 사용된 성분, 세포 조직, 처리 조건 등을 나타내는 모든 번호는 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해된다. 따라서, 다르게 나타내지 않는 한, 숫자 변수는 대략적인 것이며 또 본 발명에 의해 얻고자 하는 소망하는 특성에 따라 다변할 수 있다. 다르게 나타내지 않는 한, 어떠한 요소 앞에 붙는 용어 "적어도"는 순서적으로 매 원소를 지칭하는 것으로 의미한다. 당업자들은 통상의 방법을 이용하여 본 명세서에 기재된 본원발명의 특정 실시양태의 등가물을 인식하고 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위에 포함되는 것으로 의미한다.
본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않는 한, 본 발명의 다수의 변형 및 변이가 가능함은 당업자들에게 명백한 것이다. 본 명세서에 기재된 특정 실시양태는 예시적으로만 제공되는 것이고 어떠한 의미로든 제한을 의미하지 않는다. 명세서 및 실시예는 예시적으로 간주되어야 하며, 본 발명의 진정한 범위와 정신은 첨부한 하기 특허청구범위에 의해 표시된다.

Claims (24)

  1. (a) 샘플 함유를 위해 소수성 영역에 의해 둘러싸인 친수성 영역을 포함하는 다공성 막을 포함하는 샘플 홀더를 제공하는 단계;
    (b) 상기 막의 친수성 영역을 샘플 부피와 접촉시키는 단계;
    (c) 상기 막 위의 샘플 부피를 건조시키는 단계;
    (d) 상기 막 위의 샘플 부피를 4000-400 cm-1 스펙트럼 범위 내의 파장을 포함하는 적외선 빔, 또는 상기 스펙트럼 범위의 임의 부분에 노출시켜, 적외선 흡수 스펙트럼을 얻는 단계를 포함하고;
    i) 상기 적외선 흡수 스펙트럼 중의 하나 이상의 흡수 피크 면적(area)은 샘플 내의 하나 이상의 생체분자의 양과 상관관계가 있고,
    상기 소수성 영역은 친수성 다공성 막의 플라즈마 처리 또는 열처리에 의해 생성되는, 샘플 내의 하나 이상의 생체분자를 정량하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 생체분자는 핵산, 단백질, 지질, 다당류 및 지질다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 지질다당류가 내독소(endotoxin)인 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 사용자가 분석물을 정량할 때마다 검량 곡선을 작성할 필요가 없는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 샘플 부피가 0.1-20 ㎕인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 샘플 부피가 1 ㎕ 이하인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 다공성 막이 장치 내에 함유된 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 장치가 샘플 홀더 카드인 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 샘플이 생물학적 유체를 포함하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 생물학적 유체가 혈액, 혈장, 혈청 및 요로 이루어진군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 샘플이 세포 또는 조직 용해물을 포함하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 샘플이 조 샘플인 방법.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 샘플 홀더 카드가 샘플이 막에 함유되어 있는 면적을 포함하는 다공성 막을 포함하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 다공성 막이 한외여과 막인 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 다공성 막이 미세다공성 막인 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 다공성 막이 PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드), PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌), 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체 물질을 포함하는 방법.
  17. 제 13항에 있어서, 막 위에 샘플을 함유하기 위한 면적은 소수성 영역으로 둘러싸인 친수성 영역을 포함하는 방법.
  18. 삭제
  19. 제 17항에 있어서, 상기 샘플은 친수성 영역 내에 함유되는 방법.
  20. 삭제
  21. 샘플 홀더 카드가 소수성 영역으로 둘러싸인 친수성 영역을 포함하는 다공성 막을 포함하고, 샘플이 친수성 영역의 경계 내에 함유되어 있는 제1항에 따른 방법에 사용하기 위한 샘플 홀더 카드.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 친수성 영역의 직경이 2.0 mm 내지 10 mm 범위인 샘플 홀더 카드.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 친수성 영역의 직경이 3.0 mm 내지 6 mm 범위인 샘플 홀더 카드.
  24. (a) 샘플 함유를 위해 소수성 영역에 의해 둘러싸인 친수성 영역을 포함하는 다공성 막을 포함하는 샘플 홀더를 제공하는 단계;
    (b) 상기 막의 친수성 영역을 샘플 부피와 접촉시키는 단계;
    (c) 상기 막 위의 샘플 부피를 건조시키는 단계;
    (d) 적외선 흡수를 이용하여 샘플 부피 내의 물의 존재를 검출하고 또 필요한 경우, 물의 존재가 검출되지 않을 때까지 단계 (c)를 반복하는 단계; 및
    (e) 상기 막 위의 건조된 샘플 부피를 4000-400 cm-1 스펙트럼 범위 내의 파장을 포함하는 적외선 빔, 또는 상기 스펙트럼 범위의 임의 부분에 노출시켜, 적외선 흡수 스펙트럼을 얻는 단계를 포함하며;
    i) 상기 적외선 흡수 스펙트럼 중의 하나 이상의 흡수 피크 면적은 샘플 내의 하나 이상의 생체분자의 양과 상관관계가 있고,
    상기 소수성 영역은 친수성 다공성 막의 플라즈마 처리 또는 열처리에 의해 생성되는, 샘플 내의 하나 이상의 생체분자를 정량하는 방법.
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