CN111471589A - 一种红外定量pcr核酸检测装置 - Google Patents

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蓝新正
龙文博
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Abstract

本发明属于医疗器械领域，具体地，涉及一种用于病原体核酸检测的红外定量装置。本发明利用宽谱红外光谱技术，先确定病原体核酸的特征红外光谱图；在检测样本时，采用聚合酶链式反应(PCR)技术对样本核酸进行扩增，再结合可调谐二极管激光吸收光谱(TDLAS)技术，检测该病原体核酸特征吸收峰，并转换得到该核酸浓度。相比于荧光PCR方法，本发明提供的检测装置基于红外光谱法，能够提高检测精度，且不需要长时间的扩增过程，能有效缩短检测时间，具有可便携化、准确、快速检测病毒的优点。

Description

一种红外定量PCR核酸检测装置
技术领域
本发明涉及医疗器械领域，更具体地，涉及一种红外定量PCR核酸检测装置。
背景技术
病毒由蛋白质外壳和内部的遗传物质组成，依靠细胞生存，病毒会攻击特定宿主细胞，并借宿主细胞复制，给人类带来疾病和生命的危险，例如HIV、流感病毒、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2冠状病毒等。早发现、早诊断和早治疗是预防病毒感染暴发事件的最有效途径，检测病毒的方法有分子生物学方法、免疫学检查法和形态学检查法等。在感染病毒早期，由于抗体的形成需要一定时间，在患者体内仅有病毒核酸，无法检测到抗体。因此，分子生物学方法中的核酸检测常作为病毒感染的临床诊断标准。
基于聚合酶链式反应(PCR)的核酸检测技术具有灵敏度高和特异性好的特点，在PCR检测过程中，引入特定荧光探针(实时荧光PCR方法)可实时监测PCR过程，并能实现定量检测。荧光定量PCR技术检测病毒的具体方法是：(1)采集病毒样本；(2)破坏病变细胞，释放核酸；(3)对核酸进行PCR扩增，并加入荧光探针，直至微量病毒数目可以通过仪器检测得到；(4)检测荧光信号并进行分析。PCR技术通过把引物加到DNA模板单链或RNA一端，在聚合酶的作用下，通过变性、退火、延伸等步骤，根据生物DNA双链复制的原理，可以将选定的基因片段进行链式扩增。PCR扩增时若同时加入一个经过设计的特异性的荧光探针，即每扩增一条DNA或RNA，就有一定强度的荧光信号的生成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此可以根据荧光信号强度来实时定量确定PCR扩增的过程。
中国专利CN110724764A中公开了一种人冠状病毒和呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测方法及其应用，采用特定的引物与荧光探针，对急性呼吸道病毒感染患者的呼吸道样本提取核酸后进行检测，成功检测出冠状病毒和合胞病毒。荧光PCR可以较为快速的确定疑似病人是否感染病毒，但是在扩增的过程中，即使特异荧光探针被引入，仍有可能发生猝灭，降低荧光信号的强度，因此荧光PCR方法检测病毒的灵敏度不足，易导致“假阴性”的结果。而且，由于修饰的荧光物质的量子产率受限，在早期检测低含量病毒时，要扩增到足够多的量才能进行判断，需要较长时间的扩增过程，严重影响筛查效率。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种红外定量PCR核酸检测装置，旨在解决目前荧光PCR检测时间长、存在“假阴性”结果的问题，以降低当前病毒的检测限，实现快速、准确检测病原体核酸。
为实现上述目的，本发明提供了一种红外定量PCR核酸检测装置，包括红外光源、分光单元、红外光探测单元和信号采集处理单元；
所述红外光源用于发射可调谐的红外激光，经所述分光单元入射到PCR扩增后的核酸样本中；
所述红外光探测单元用于接收通过所述核酸样本出射的红外光，再转化为电信号后传输至所述信号采集处理单元。
进一步地，所述红外光源为TDLAS红外激光器。
优选地，所述红外光源为垂直共振腔表面发射激光器或量子级联激光器。
进一步地，所述信号采集处理单元包括信号采集模块、信号放大模块和计算机。
进一步地，所述计算机在进行信号处理时，采用深度学习算法提取病原体样本的特征。
进一步地，所述分光单元为光开关阵列。
进一步地，所述红外光探测单元为微型红外光探测器阵列。
本发明所构思的以上技术方案借鉴红外气体分析法，根据病原体核酸具有特征红外谱的原理，结合高性能光源与探测器，构建红外定量检测装置，与现有技术相比，能够取得以下有益效果：
(1)相比于荧光PCR检测，本发明提供的装置基于红外光谱法，直接针对病原体核酸的成分和结构进行检测，能够提高检测精度；而且能降低PCR扩增的数量要求，不需要长时间的倍增过程，有效缩短了检测时间，同时相对荧光PCR方法具有更高的灵敏度；
(2)针对结构成分相似的不同病毒核酸，采用深度学习算法提取不同红外光谱图的特征，并给出区分度较大的特征组合，从而进一步提高准确度；
(3)本发明的红外光路部分采用微型红外光源和微型红外光探测器，与现有的大型分析仪器相比，具备较好的便携性、易操作性，利于在更大的范围内装备本方法所衍生出的仪器，提高病原体核酸筛查范围与效率。
附图说明
图1是按照本发明实施例病原体核酸检测基本原理示意图；
图2是本发明实施例中检测病原体核酸的红外定量检测装置示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明的检测原理基于红外光谱法：红外光谱分析方法利用分子对特定波长红外线的选择性吸收可获得分子中含有的化学键或官能团的信息，可同时对样品多个组分进行定性和定量分析。在气体分子检测领域，非分散性红外线技术(NDIR)与可调谐二极管激光吸收光谱(TDLAS)方法已被用作精确确定气体种类与浓度。红外光谱分析方法相比于其他的分析方式具有精度高、选择性好的特点，适合于有机分子种类与浓度的检测。
病原体核酸作为一种生物有机物大分子，同样会存在特定的红外光吸收谱线。使用宽谱红外光照射样本，确定病原体核酸的特征红外光谱图。在实际应用检测样本时，采用TDLAS技术，该激光光源具有线宽窄、波长可调、功率高的特点，可以测量吸收峰很相近的特征峰，能获得较为准确的光谱图，分辨率较高，而且易小型化、集成化。根据病原体核酸特征红外光谱区域，选择合适的近红外或中远红外激光器作为光源，引入待测样本后，经过样本吸收后的红外光被探测器接收，并转换为电信号，通过该信号的强弱可直接计算出目标物质的浓度。此外，针对结构成分相似的不同病毒核酸，可采用深度学习算法提取不同红外光谱图的特征，并给出区分度较大的特征组合，从而进一步提高准确度。
本发明提供的红外定量PCR核酸检测装置，包括红外光源、分光单元、红外光探测单元和信号采集处理单元；红外光源用于发射可调谐的红外激光，经分光单元入射到PCR扩增后的核酸样本中；红外光探测单元用于接收通过核酸样本出射的红外光，再转化为电信号后传输至信号采集处理单元。
具体检测方法包括以下步骤：
(1)使用PCR技术对病毒核酸样本进行扩增；
(2)选择相应波段的红外光源照射扩增后的样本；
(3)利用红外光探测单元收集经过样本吸收后的红外光并转换为电信号；
(4)通过该信号的强弱计算出目标物质的浓度。
实施例一
如图1-2所示，本发明实施例包括红外光源、光开关阵列、PCR方法扩增后的病毒核酸样本、红外光探测器阵列、信号采集/放大模块。由红外光源发射可调谐的红外激光，通过光开关阵列进行分光，并控制不同通道红外光的开启和关闭，红外光入射到样本中。红外光源可以选择TDLAS红外激光器。根据朗伯-比尔定律，有机物的特定基团或化学键会吸收相应波段的红外光，同时该有机物的浓度与该吸收谱线的强度呈正相关，经过样本后的红外光为出射红外光，由红外光探测器阵列接收出射红外光，把光信号转化为电信号。红外光探测器阵列的电信号由信号采集/放大模块采集并放大，然后传输给计算机进行分析。
采用PCR技术扩增目标核酸，将多个样本同时放置到样本槽中待测。红外光源采用垂直共振腔表面发射激光器(VCSEL)，采用自动精密温度控制(ATC)和功率控制(APC)技术保证了光功率和波长的稳定，制造工艺与发光二极管(LED)兼容。VCSEL激光器作为光源，发出的近红外波段的光由光开关阵列进行分光，通过光开关阵列来调整照射各个待测核酸样本的入射红外光，通过VCSEL激光器调整入射红外光的频率，由红外光探测器阵列接收不同频率的通过核酸样本的出射红外光，由信号采集/放大模块采集探测器的电信号并放大，传输给计算机分析，从而得到待测样本的特征红外光谱图。将此光谱图与已经标定的一定浓度的标准病毒核酸的红外光谱图进行对比，若二者的特征峰一致，则可判断样本中含有目标病毒核酸，进而根据红外光谱图特征峰的光强判断病毒核酸的浓度。
针对结构成分相似的不同病毒核酸，可以采用深度学习算法进一步提高检测病毒的准确性：建立红外光谱图的数字特征(吸收波长范围、吸收红外谱强度)；计算机在进行信号处理分析时，采用人工神经网络、卷积神经网络等深度学习算法提取病原体样本的特征，实现对相似病原体的高精度区分。
作为改进的实施例，红外光源采用量子级联激光器(QCL)。首先采用PCR技术对目标样本中的核酸数量进行扩增到一定量，放置到样本槽中待测。QCL是能够发射光谱在中红外和远红外频段激光的半导体激光器。QCL光谱范围宽，有较好的波长可调谐性，很高的输出功率，同时也可以工作在室温环境下。将QCL激光器作为光源，控制发出红外光的波长，其发出的中、远红外波段的光由光开关阵列进行分光，得到入射红外光，入射红外光通过扩增后的样本，特定频率的红外光被吸收，最后由红外光探测器实现光电转换，通过模数转换和放大，以及计算机处理，得到待测样本的红外光谱图，进行判定。
相比于荧光PCR方法，红外光谱法直接测定病毒基因序列和结构，更加精确，能够提高检测精度，且不需要长时间的扩增过程，能降低PCR扩增的数量要求，能有效缩短检测时间，同时相对荧光PCR方法具有更高的灵敏度。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种红外定量PCR核酸检测装置，其特征在于，包括红外光源、分光单元、红外光探测单元和信号采集处理单元；
所述红外光源用于发射可调谐的红外激光，经所述分光单元入射到PCR扩增后的核酸样本中；
所述红外光探测单元用于接收通过所述核酸样本出射的红外光，再转化为电信号后传输至所述信号采集处理单元。
2.如权利要求1所述的红外定量PCR核酸检测装置，其特征在于，所述红外光源为TDLAS红外激光器。
3.如权利要求2所述的红外定量PCR核酸检测装置，其特征在于，所述红外光源为垂直共振腔表面发射激光器或量子级联激光器。
4.如权利要求1所述的红外定量PCR核酸检测装置，其特征在于，所述信号采集处理单元包括信号采集模块、信号放大模块和计算机。
5.如权利要求4所述的红外定量PCR核酸检测装置，其特征在于，所述计算机在进行信号处理时，采用深度学习算法提取病原体样本的特征。
6.如权利要求1-5任一项所述的红外定量PCR核酸检测装置，其特征在于，所述分光单元为光开关阵列。
7.如权利要求1-5任一项所述的红外定量PCR核酸检测装置，其特征在于，所述红外光探测单元为微型红外光探测器阵列。
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