CN108458986A - 脱氧核糖核酸红外光谱分析测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种脱氧核糖核酸红外光谱分析测定方法，包括步骤：1)用无核酸酶水配制脱氧核糖核酸溶液，用紫外分光光度计测定脱氧核糖核酸溶液的A260/A280在1.8‑2.0之间，作为待测样品；2)取待测样品溶液滴于微孔板上，干燥至微孔内形成表面平整的薄膜；3)用带有高通量筛选附件HTS‑XT的傅里叶红外光谱仪扫描，求取平均光谱；4)将待测样品的光谱与已知的脱氧核糖核酸标准光谱图进行比对，根据特征峰的相似度对待测样品进行鉴定。本发明提供一种兼顾分析效率和分析准确度的脱氧核糖核酸红外光谱分析测定方法，可在2小时内完成120个样品的光谱采集，是一种高效，重现性高，准确度高的脱氧核糖核酸检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及红外光谱检测技术领域，具体地说，涉及一种脱氧核糖核酸红外光谱分析测定方法。
背景技术
脱氧核糖核酸携带着遗传信息，在生物体生长、发育和繁殖过程中起着重要作用，可应用于很多领域，如癌症诊断，药物治疗和种属鉴别等。一般来说，传统脱氧核糖核酸的研究手段，都是依据脱氧核糖核酸序列，比较费时，依赖于经验丰富的操作人员和已知的特异性序列信息。因此，有必要开发一种简单、快速和可靠的方法分析脱氧核糖核酸。脱氧核糖核酸的碱基顺序决定生物体的特异性，其多样性也构成了脱氧核糖核酸组成与结构的多样性。因此，脱氧核糖核酸的组成与结构的差异也能表现出生物体的特异性。傅里叶红外光谱是一种快速、简单、无损技术，能反映脱氧核糖核酸的组成与结构广泛应用于诸多研究，如脱氧核糖核酸损伤，区分癌症组织和正常组织等。此外，近几年，脱氧核糖核酸的红外光谱被应用于物种鉴别。
但是脱氧核糖核酸是一种微量物质，其特性很容易受到如温度、采样方式、样品量等因素影响。不同采样方式脱氧核糖核酸红外光谱的重复性、准确度和分析效率皆有不同；干燥温度可能会影响脱氧核糖核酸的分子结构，从而影响其红外光谱的重复性和准确度；样品量可能会改变脱氧核糖核酸干燥薄膜的均匀度，从而影响光谱的重复性和准确度。因此，开发一种脱氧核糖核酸红外光谱分析测定方法很有必要，为脱氧核糖核酸的微小结构分析提供技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种脱氧核糖核酸红外光谱分析测定方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的脱氧核糖核酸红外光谱分析测定方法，包括以下步骤：
1)用无核酸酶水配制脱氧核糖核酸溶液至浓度0.333-33.33μg/μL，用紫外分光光度计测定脱氧核糖核酸溶液的A260/A280在1.8-2.0之间(优选A260/A280为1.8)，作为待测样品；
2)取15μL待测样品溶液滴于微孔板上，干燥至微孔内形成表面平整的薄膜；
3)用带有高通量筛选附件HTS-XT的傅里叶红外光谱仪扫描，求取平均光谱；
4)将待测样品的光谱与已知的脱氧核糖核酸标准光谱图进行比对，根据特征峰的相似度对待测样品进行鉴定。
不同物种的主要特征峰有4个：1658-1665cm-1，1225-1235cm-1，1085-1095cm-1，965-970cm-1。除了上述4个主要特征峰，还需出现其他小峰，才能判断样品中是否含有DNA。对于小峰，尚无统一的确定标准，根据实际经验进行判断。
其中，牛和鱼类DNA标准谱图的特征峰见表1。
表1
优选地，步骤1)中所述脱氧核糖核酸溶液的浓度为0.667-6.667μg/μL，更优选6.667μg/μL。
前述的方法，步骤3)中傅里叶红外光谱扫描范围为4000cm-1-400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数≥32次(优选64-256次，更优选64次)。
优选地，步骤2)中干燥的温度为20-70℃，更优选20-40℃，最优选30℃。
本发明中所述的脱氧核糖核酸可来自小牛胸腺、鲑鱼等任何含有遗传物质DNA的物种。
在本发明的一个具体实施方式中，以小牛胸腺脱氧核糖核酸(CT-DNA)为检测对象，具体方法如下：
1)供试样本为小牛胸腺脱氧核糖核酸钠盐标准品(sigma，美国)，准确称取1mg脱氧核糖核苷酸溶解于150μL无核酸酶水，混合均匀，配制6.667μg/μL的脱氧核糖核酸溶液。
2)为了确保样品可靠性，小牛胸腺脱氧核糖核酸溶液纯度经过超微量紫外分光光度计(Midrop，中国)鉴定，A260/A280为1.8-2.0(优选1.8)，表明小牛胸腺脱氧核糖核酸溶液纯度高。
3)取15μL小牛胸腺脱氧核糖核酸测定溶液滴于96孔硅板上，30℃干燥0.5h，形成表面平整的薄膜。
4)用带有高通量筛选附件(HTS-XT)的傅里叶红外光谱仪扫描，其中扫描范围为4000cm-1-400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数64次，重复操作三次，求取平均光谱。
5)将红外光谱和萨特勒红外光谱库中小牛胸腺脱氧核糖核酸标准谱图比对，其特征峰相似度达95.07％。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明建立一种兼顾分析效率和分析准确度的脱氧核糖核酸红外光谱分析测定方法。通过傅里叶变换红外光谱，可直观反映出脱氧核糖核酸的组成与结构信息。采用本方法2小时内，可完成120个样品的光谱采集，是一种高效，重现性高，准确度高的脱氧核糖核酸检测方法。
附图说明
图1为本发明实施例6中不同前处理温度的小牛胸腺脱氧核糖核酸红外光谱特征峰比值。其中，A：1697cm-1和1661cm-1；B：1491cm-1和966cm-1；C：889cm-1、835cm-1和785cm-1。所有峰比值都是除以1092cm-1峰强。
图2为本发明实施例6中不同样品量的小牛胸腺脱氧核糖核酸红外光谱及其标准差。其中，A、B、C、D、E分别表示样品量为100μg、、30μg、10μg、5μg和2.5μg。
图3为本发明实施例6中不同取样方式小牛胸腺脱氧核糖核酸的红外光谱测定结果。
图4为本发明实施例7中鲑鱼脱氧核糖核酸红外光谱分析测定结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的带有高通量筛选附件HTS-XT的傅里叶红外光谱仪购自HTS-XT/Tensor 27，Bruker Inc，德国。
实施例1-5小牛胸腺脱氧核糖核酸的红外光谱分析测定方法
1、供试样本为小牛胸腺脱氧核糖核酸钠盐标准品(Sigma，美国)，准确称取Xμg脱氧核糖核苷酸溶解于150μL无核酸酶水，混合均匀，配制Yμg/μL的脱氧核糖核酸溶液。
2、为了确保样品可靠性，小牛胸腺脱氧核糖核酸溶液纯度经过超微量紫外分光光度计(Midrop，中国)鉴定，A260/A280为1.8，表明小牛胸腺脱氧核糖核酸溶液纯度高。
3、取15μL小牛胸腺脱氧核糖核酸测定溶液滴于96孔硅板上，Z℃干燥0.5h，形成表面平整的薄膜。
4、用带有高通量筛选附件(HTS-XT)的傅里叶红外光谱仪扫描，其中扫描范围为4000cm-1-400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数64次，重复操作三次，求取平均光谱。
5、将红外光谱和萨特勒红外光谱库中小牛胸腺脱氧核糖核酸标准谱图比对，其特征峰相似度见表2。
表2
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
| X | 1000 | 300 | 100 | 50 | 25 |
| Y | 6.667 | 2 | 0.667 | 0.333 | 0.1667 |
| Z | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 |
| 对应的样品量，μg | 100 | 30 | 10 | 5 | 2.5 |
| 对应的标准差 | 0.02 | 0.0117 | 0.0185 | 0.093 | 0.1163 |
| 对应的信噪比 | 67.604214 | 41.670922 | 28.457264 | 7.6112625 | 3.305694 |
| 特征峰相似度，％ | 94.24 | 93.42 | 92.33 | 94.65 | 92.88 |
每种样品量均做10个平行。其中，信噪比计算公式如下：
其中，y1660是1660cm-1处特征峰强度，yin是在1900-1800cm-1无特征峰噪音阶段的响应值，max(yin)和min(yin)分别是无特征峰阶段(1900-1800cm-1)的最大值和最低值。根据一般的定性标准，信噪比要大于3，定量标准，信噪比要大于10。
实施例6脱氧核糖核酸红外光谱测定关键因素分析
1、不同采样方式的红外光谱测定分析
红外光谱采样方式分别为溴化钾压片法、显微红外点模式、显微红外成像模式(Spotlight 400，PerkinElmer Inc，美国)以及HTS-XT法。所有采集方式均为透射模式。
溴化钾压片法：小牛胸腺脱氧核糖核酸纤维状样品与溴化钾按1:100比例，取0.5mg小牛胸腺脱氧核糖核酸样品和50mg KBr样品混合研磨，压片，红外光谱扫描。光谱扫描范围4000cm-1-400cm-1，分辨率4cm-1，累积次数32次。三次平行，取平均光谱。
取0.5mg的小牛胸腺脱氧核糖核酸溶液15μL，于30℃烘箱形成干燥薄膜，分别进行显微红外点模式、显微红外图像模式和HTS-XT法红外光谱扫描。三次平行，取平均光谱。
显微红外点模式：光谱采集范围4000cm-1-750cm-1,空间分辨率50μm×50μm，光谱分辨率4cm-1，累积次数64次。每个样品取10点，每点光谱基线校正和最高峰归一化处理求取单个样品的平均光谱。
显微红外成像模式：光圈大小50×50μm，红外光谱扫描。光谱采集范围4000cm-1-750cm-1，空间分辨率为50μm×50μm，光谱分辨率4cm-1,累积次数16次。所有图像都使用Spectrum IMAGE Software(PerkinElmer，美国)软件进行降噪、基线校正和归一化处理。
HTS-XT法：光谱扫描范围4000cm-1-400cm-1，分辨率4cm-1，累积次数64次。
与标准谱图比较，不同采样方式的红外谱图相似度如表3所示。显微图像的红外谱图相似度最高，其次是HTS-XT法，KBr压片法和显微红外点模式。但从效率角度考虑，HTS-XT是一种快速、可实现大量样品自动化光谱采集的采样方式。2小时内，HTS-XT法可完成120个样品的光谱采集，KBr压片法完成8个样品的光谱采集，显微红外点模式采集了4个样品，显微红外图像模式尚未采集完一个样品的光谱。综合来看，HTS-XT法是一种高效，重现性高，准确度高的采样方式。
表3不同傅里叶红外光谱采集方式特点
2、不同前处理温度红外光谱的测定分析
取100μg小牛胸腺脱氧核糖核酸溶解于15μL无核酸水，静置过夜。然后取15μL小牛胸腺脱氧核糖核酸测定溶液滴于96孔硅板上分别于20℃，30℃，40℃，50℃，60℃和70℃烘箱形成干燥薄膜，HTS-XT法红外光谱扫描。扫描范围4000cm-1-400cm-1，分辨率4cm-1，累积次数64次。三次平行，取平均光谱。
结果如图1所示，不同前处理温度的小牛胸腺脱氧核糖核酸红外光谱特征峰比值。随着温度的升高，各特征峰峰强皆有不同程度的改变。有些特征峰随温度的升高而缓慢增强，有些特征峰随温度的升高而突然下降，有些特征峰随温度呈先上升后下降的趋势，到70℃时，小牛胸腺脱氧核糖核酸红外光谱特征峰皆有显著变化，而且其标准差也显著高于其他温度，从而说明70℃已接近小牛胸腺脱氧核糖核酸的变性温度。兼顾实验的准确性和分析效率，宜采用约30℃干燥DNA样品。
3、不同样品量的红外光谱测定分析
分别取100μg，30μg，10μg，5μg，2.5μg小牛胸腺脱氧核糖核酸溶解于15μL无核酸水，分别配制成浓度为6.667μg/μL，2.000μg/μL，0.667μg/μL，0.333μg/μL，0.1667μg/μL的小牛胸腺脱氧核糖核酸溶液，静置过夜。然后分别取15μL小牛胸腺脱氧核糖核酸测定溶液滴于96孔硅板上，30℃烘箱形成干燥薄膜，HTS-XT法红外光谱扫描。光谱扫描范围4000cm-1-400cm-1，分辨率4cm-1，累积次数64次。每浓度取10个平行样本。
不同样品量的小牛胸腺脱氧核糖核酸红外光谱如图2所示。随着样品量的减小，其红外光谱吸光度逐渐变小，但稀释效应并不改变出峰位置。这说明稀释效应并不改变分子的化学结构。与此同时，当样品量降至10μg时，红外光谱的标准差呈上升趋势，这主要是因为吸光度降至0.1以下时，红外光谱噪音开始变大，信噪比逐渐降低。当样品量降至2.5μg时，小牛胸腺脱氧核糖核酸红外光谱信噪比已低于3。相关研究表明当信噪比小于3时，该特征峰可能是噪音或者掺杂物形成的，结果不可信。综合红外光谱的重复性和准确度两方面考虑，宜选择6.667μg/μL小牛胸腺脱氧核糖核酸溶液。经过基线校正和最大、最小归一化处理的5μg和100μg的CT-DNA与标准谱图的相似度分别为94％和94.01％。因此当实际样品量较少时，宜采用不小于5μg的CT-DNA。
4、不同取样方式小牛胸腺脱氧核糖核酸红外光谱测定
取5μg CT-DNA实验样本分别溶解于15μl、30μl、45μl和60μl的无核酸水，制备成样品1、样品2、样品3和样品4，静置过夜。取15μl样品1、2、3和4分别滴于96孔硅板上，30℃烘箱形成干燥薄膜。随后，样品2重复操作一次，认为二次取样，样品3重复两次，认为三次取样，样品4重复三次，认为四次取样。所有样品采用HTS-XT法采集红外光谱，光谱扫描范围4000-400cm-1,分辨率4cm-1，累积次数64次。每种取样方式，各10个平行样本。
不同取样方式的CT-DNA红外光谱如图3所示。随着取样次数的增加，基线逐渐平稳，标准差逐渐降低，到4次取样时，基线已基本平稳。但随着增加取样方式，红外光谱的相似度和信噪比逐渐减小。其中3次和4次取样的信噪比已小于3，结果不可信(表4)。
表4不同取样方式的小牛胸腺脱氧核糖核酸红外光谱特性分析(5μg样品)
实施例7鲑鱼脱氧核糖核酸红外光谱分析测定
1、供试样本为鲑鱼胸腺脱氧核糖核酸钠盐标准品(Sigma，美国)，准确称取1000μg脱氧核糖核苷酸溶解于150μL无核酸酶水，混合均匀，配制6.667μg/μL的脱氧核糖核酸溶液。
2、为了确保样品可靠性，鲑鱼脱氧核糖核酸溶液纯度经过超微量紫外分光光度计(Midrop，中国)鉴定，A260/A280为1.8，表明鲑鱼脱氧核糖核酸溶液纯度高。
3、取15μL鲑鱼脱氧核糖核酸测定溶液滴于96孔硅板上，30℃干燥0.5h，形成表面平整的薄膜。
4、用带有高通量筛选附件(HTS-XT)的傅里叶红外光谱仪扫描，其中扫描范围为4000cm-1-400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数64次，重复操作三次，求取平均光谱，结果如图4所示。DNA样品的红外光谱具有鲑鱼DNA骨架特征峰：1660cm-1，1235cm-1，1090cm-1和966cm-1。将红外光谱和萨特勒红外光谱库中脱氧核糖核酸标准谱图比对，根据特征峰的相似度对供试样本进行鉴定。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.脱氧核糖核酸红外光谱分析测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用无核酸酶水配制脱氧核糖核酸溶液至浓度0.333-33.33μg/μL，用紫外分光光度计测定脱氧核糖核酸溶液的A260/A280在1.8-2.0之间，作为待测样品；
2)取15μL待测样品溶液滴于微孔板上，干燥至微孔内形成表面平整的薄膜；
3)用带有高通量筛选附件HTS-XT的傅里叶红外光谱仪扫描，求取平均光谱；
4)将待测样品的光谱与已知的脱氧核糖核酸标准光谱图进行比对，根据特征峰的相似度对待测样品进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述脱氧核糖核酸溶液的浓度为0.667-6.667μg/μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述脱氧核糖核酸溶液的浓度为6.667μg/μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中傅里叶红外光谱扫描范围为4000cm-1-400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数≥32次。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中傅里叶红外光谱扫描范围为4000cm-1-400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数64-256次。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)干燥的温度为20-70℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)干燥的温度为20-40℃。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)干燥的温度为30℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用无核酸酶水配制6.667μg/μL的脱氧核糖核酸溶液，用紫外分光光度计测定脱氧核糖核酸溶液的A260/A280在1.8-2.0之间，作为待测样品；
(2)取15μL待测样品溶液滴于微孔板上，30℃干燥0.5h，至微孔内形成表面平整的薄膜；
(3)用带有高通量筛选附件HTS-XT的傅里叶红外光谱仪扫描，重复操作三次，求取平均光谱；
(4)将待测样品的光谱与已知的脱氧核糖核酸标准光谱图进行比对，根据特征峰的相似度对待测样品进行鉴定。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核酸来自小牛胸腺、鲑鱼。
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