JPH01265900A - Ｐｉｐｌｃを用いたドライケミストリーによる試料分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、臨床検査の分野に適用されるＰＩＰＬＣを用
いたドライケミストリー法による検体試料の分析法に関
し、特にドライケミストリー法による試料分析の精度を
高め、測定の正確化を図った分析法に関する。

従来の技術 臨床検査の分野に適用される臨床化学分析は近年口ざま
しい進歩を続けている。その方向は、利用者側からの分
析時間の短縮化と簡便化等の要求が強く、次第に液体の
試薬を用いたウェットケミストリー法からより簡便で安
定性の高いドライケミストリ一方式へと遷移しつつある
。このドライケミストリー法は、試薬が乾燥状態で保存
されていて、測定時にそれに液状の試料が加えられたと
き、その中の水分を溶媒として全化学反応が進行する分
析法であるとされている。このドライケミスｌ−ＩＪ−
法は、大別すると、試薬の必要成分が含浸、乾燥された
試験紙片を用いる試験紙法と、試薬層、展開層等からな
る多層フィルムを用いる多層フィルム法とに分けられる
。いずれの方式にあっても、乾燥試薬を用いる点につい
ては変りはない。

このドライケミストリー法によると、臨床化学検査で通
常測定される検査項目であれば、はとんど測定可能であ
るが、特に最近では酵素や蛋白質の定量分析にも頻繁に
応用され始めている。この中には、ヒトや動物の体液あ
るいは臓器抽出液中に含まれる膜結合酵素や膜結合糖蛋
白質等の定量分析も含まれている。

発明が解決しようとした課題 」−述した体液あるいは臓器抽出液中に含まれるアルカ
リ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）等の膜結合酵素や糖蛋白
質成分の定量にドライケミストリー法を利用した場合、
特に高濃度領域において検量線が著しく歪む現象があり
、定量性に欠ける大きな問題点かあった。しかし、従来
は原因不明の歪が生じたままで、検量線を強制的に曲げ
、この曲げた検量線をもとにコンピュータ処理により定
量値を算出していた。そのため、定量性の確度、精度が
著しく低下し、正確で精度の良い成績が得られなかった
。そこで、本発明者らは、原因探求のため鋭意検討した
結果、膜結合蛋白質のいくつかはホスファインントール
を中継にして細胞膜に共有結合で結合しており、測定時
に蛋白質と結合した細胞膜脂質か試験紙片やフィルム膜
の支持体の網目構造にひっかかり、だんご状になること
が判った。このため、特に高濃度領域において、重合体
を形成し、この内部に閉じ込められた内側の成分の反応
が阻止され、結果的に測定しようとした膜タンパクに比
例した発色度が得られなくなるためであると原因をつき
とめた。但し、原因は、明確となったものの、これまで
は十分な解決策を講じ得す、引き続き検討中であった。

したがって、従来のドライケミストリーを利用した分析
法では、ＡＬＰ等の膜結合酵素や糖蛋白質が、これと結
合した細胞膜脂質との相互作用によって分子同士の重合
反応を起こし、本来の酵素反応が完全に進行せず、結果
的に酵素量に比例した真の値が得られないといった問題
があった。

その後、本発明者は、検討の結果、ＰＩＰＬＣが膜結合
脂質の除去に適しているという知見を得て本発明をなす
に至ったのである。

本発明の目的は、ＰＩＰＬＣによって膜結合脂質を特異
的に切り取らせることにより、膜結合蛋白質等の被検試
料を膜脂質の干渉を受けることなく、本来あるべき真の
姿で正確に、かつ精度良く測定できるようにすることに
ある。

課題を解決するための手段 本発明は、セルロース膜等の担体に試薬成分を含浸・乾
燥させた試験紙片にＰＩ　ＰＬＣを固相化し、このＰＩ
　ＰＬＣを介して検体試料を点着させることを第１の特
徴としている。被検試料がヒトまたは動物の体液あるい
は臓器抽出液であって、その中に含まれた膜結合蛋白質
である場合は、予め試料をＰＩ　ＰＬＣ処理して点着し
、特定の化学反応をさせた後、膜結合蛋白質が比色定量
される。

本発明の別の構成によると、透明支持体上に形成された
試薬層、展開層等の多層フィルムの間にＰＩ　ＰＬＣの
固定層を介在形成させ、展開層上に点着された試料をＰ
Ｉ　ＰＬＣ固定層を通した後、試薬層において反応・発
色させることを特徴とした。

作用 生体膜と結合したＡＬＰ等を含む膜結合酵素又は膜結合
蛋白質等は、試験紙片又は多層フィルム＝６− 中に同相化されたＰＩＰＬＣを通すことにより検体と結
合した膜脂質を切り放すことができる。したかって、膜
脂質による化学反応の妨害がなくなり、測定試料に比例
した発色度が得られ、検量線の歪の現象がなくなる。結
果として、検量線の直線性が著しく改善される。

実施例 以下、本発明の実施例について図面を参照して説明する
。

本発明に係る試料分析法は、ＰＩ　ＰＬＣを用いたドラ
イケミストリー法である。このドライケミストリー法に
は、試験紙片及び多層フィルム法の両者が含まれる。い
ずれの方式においても使用するＰＩ　ＰＬＣの量は判定
条件等に合わせて最良と馬えられるものが採用される。

［実施例１］ 本実施例は、いねゆる試験紙法によるものであり、その
実施にあたり、第１図に示す装置構成が採られた。第１
図において、セルロース膜等の担体に対象とした試薬成
分を含浸・乾燥させた試験紙片１がプラスチック片２に
貼り付けられている。

この試験紙片１の試薬含浸部分にＰＩ　ＰＬＣ３が所定
量で固相化されている。このＰＩＰＬＣ３を介して被検
試料、例えばヒト血清を点着すると、試料と結合した膜
脂質かＰＩＰＬＣ３との酵素反応によって特異的に切り
取られ、本来の試料のみが試薬成分と反応し発色する。

そこで発色部に光源５からの光を照射し、その反射光を
フィルム６を通してフォトディテクタク７によって受光
検出し、これを光電変換し演算すると、周知の反射率分
光光度法による比色定量により試料成分が測定される。

［実　施　例　２コ 本実施例は多層フィルム方式によるものであり、その実
施にあたり第２図（ロ）に示す装置構成が採用された。

第２図（ロ）において、１０はマウント、１１は透明支
持体であって、この透明支持体１１上に試薬層１２、反
射層１３、展開層１４が多層に積層され、多層フィルム
を形成している。

この多層フィルムの反射層１３と展開層１４との間にＰ
Ｉ　ＰＬＣの固定化層１５が介在されている。

この装置構成において、小量の被検試料、例えばヒト血
清を展開層１４上に点着すると、その層内で均一に広が
り、その「ふるい」効果により蛋白脂質等の高分子成分
が濾別され、その他の試料成分は下層のＰＩＰＬＣ固定
層１５を通過する。ここで、上述と同様に試料中の膜脂
質がＰ　Ｉ　ＰＬＣとの酵素反応によって特異的に切り
取られ、試料成分のみが試薬層１２に運ばれる。そして
、試料成分に応じた化学反応が生じ、その反応で生成さ
れた色素が試薬層１２の下面に集積される。この発色部
分に光源１６からの光を照射し、その反射拡散光をフィ
ルム１７を通してフォトディテクタ１８で受光検出し、
これをデータ演算表示ユニット１９で光電変換し、演算
処理すると、上記同様に比色定量法により試料成分が分
析・測定される。

この場合、展開層１４内のＴｉＯ２等による反射光の吸
収率が測定され、計算処理された物質の濃度が表示ユニ
ット１９によって表示またはプリントアウトされる。ま
たＰ　Ｉ　ＰＬＣ膜層を別におかず、展開層にＰＩ　Ｐ
ＬＣを固定化しておくことも可能である。

なお、比較のために、第２図（イ）に従来法で用いられ
ていた装置構成を示す。この従来の装置構成では、試薬
層１２と展開層１４との間に反射層１３が介在している
だけである。したがって、当然のことなからＰ　Ｉ　Ｐ
ＬＣによる効果は全くない。

次に、第３図（イ）、（ロ）を用いて本発明方法による
測定結果について説明する。第３図（イ）は健康成人に
ついて調べた結果であり、図（ロ）は試料として５０Ｉ
Ｕ／ｍｌのＡＬＰの酵素活性を持つ閉塞性黄痕患者の血
清を用いて測定した結果である。０．１〜３．０ユニツ
トのＰ　Ｉ　ＰＬＣの使用量で効果があったが、この内
１ユニットのＰＩＰＬＣ処理において、図（イ）、（ロ
）に示すように、処理後は処理前に対して検量線の直線
性が著しく改善された。

以上のように、試験紙片又は多層フィルムにＰＩＰＬＣ
を固相化し、このＰＩ　ＰＬＣ処理によって試料成分と
結合した膜脂質を切り取ることによって、それとの相互
作用による定量の妨害、検量線の歪がな（なり、試料成
分量に見合った発色度が正確に得られ、定量の精度、確
度が著しく向上した。

なお、本発明は膜結合蛋白質や膜酵素アイソザイム分析
の他、従来のウェットケミストリー法（液体試薬）を用
いた検査項目の殆どすべての分析に応用可能である。

発明の詳細 な説明したように、本発明方法によれば、試料成分と結
合していた膜脂質が同相化されたＰＩＰＬＣを通すこと
により切り放され、それとの相互作用による分子同士の
重合反応がなくなるので、試料成分量に見合う発色度で
反射光量測定を行うことができ、本来あるべき真の姿で
正確に分析・定量することができる。したがって、測定
の精度が飛躍的に向上し、疾患臓器の推定をはじめ、臨
床検査における各種判定が誤りな（行える。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の第１の実施例を示す斜視図、第２
図（イ）、（ロ）はドライケミストリー法で用いられる
装置構成を示す模式図で、（イ）は従来のもの、（ロ）
は本発明に係るものである。 第３図（イ）、（ロ）はドライケミストリー法における
ＰＩＰＬＣ処理前と処理後の検量線の直線性に及ぼす影
響を表わすグラフ図である。 １・・・プラスチック片、 ２・・Φ試験紙片、 ３・・・ＰＩＰＬＣ層、 １１・・・透明支持体、 １２・−・試薬層、 １３・・Φ反射層、 １４・・−展開層、 １５・・・ＰＩＰＬＣ固定層。 の αン冬−一− く丁

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）セルロース膜等の担体に試薬成分を含浸・乾燥さ
   せた試験紙片にＰＩＰＬＣ（ホスファチヂルイノシトー
   ル特異的ホスホリパーゼＣ）を別の試験紙片もしくは同
   じ試験紙片に固相化し、このＰＩＰＬＣを利用して検体
   試料を予めもしくは同時処理後更に前記試験紙片を介し
   て反応を進めることを特徴としたＰＩＰＬＣを用いたド
   ライケミストリーによる試料分析方法。
2. （２）ヒトまたは動物の体液あるいは臓器抽出液を予め
   固相化したＰＩＰＬＣをフィルム多重層の一つは又は他
   の試薬と同一面上に点着し、酵素反応をさせた後、膜結
   合蛋白質を検出することを特徴とした請求項（１）記載
   のＰＩＰＬＣを用いたドライケミストリーによる試料分
   析法。
3. （３）透明支持体上に形成された試薬層、展開層等から
   成る多層フィルムの間にＰＩＰＬＣの固定層を挿入し、
   これに検体試料を添加して試料をＰＩＰＬＣによって処
   理した後、この処理された検体を更に、前記試薬層にお
   いて特定の反応をさせて検体中の成分を測定することを
   特徴としたＰＩＰＬＣを用いたドライケミストリーによ
   る試料分析法。
4. （４）検体試料がヒトまたは動物の体液あるいはその臓
   器抽出物であって、その中に含まれる膜結合蛋白質を検
   出することを特徴とした請求項（３）記載のＰＩＰＬＣ
   を用いたドライケミストリーによる試料分析法。