BR102012008874B1

BR102012008874B1 - dispositivos e métodos de quantificação biomolecular baseados em intravermelho (iv)

Info

Publication number: BR102012008874B1
Application number: BR102012008874A
Authority: BR
Inventors: Utzat Christopher; Chernokalskaya Elena; Clark Philip; Amara Ryan; Scott Rider Timothy; Joshi Vivek
Original assignee: Emd Milipore Corp
Priority date: 2011-04-14
Filing date: 2012-04-16
Publication date: 2020-01-21
Also published as: CN102901712B; US9018584B2; SG185189A1; US20130062523A1; AU2012202079A1; EP2511692A2; EP2511692B1; CN105466879B; JP5723319B2; AU2012202079B2; KR20120117642A; EP2511692A3; IN2012DE01026A; CN105466879A; BR102012008874A2; CN102901712A; JP2012225910A; ES2661322T3; WO2012141831A1; WO2012141831A9

Abstract

dispositivo e métodos de quantificação biomolecular baseados em infravermelho (iv), onde o método compreende as etapas de: fornecer um suporte de amostra tendo uma membrana porosa com uma região hidrofílica rodeada por uma região hidrofóbica para contenção de amostra; contatar a região hidrofílica da membrana com um volume de amostra; secar o volume de amostra na membrana; expor o volume de amostra na membrana a um raio infravermelho compreendendo um comprimento de onda na gama espectral de 4000-400 cm-1 ou qualquer porção da gama espectral de 4000-400 cm-1, para assim obter um espectro de absorção infravermelho; e em uma ou mais áreas de pico de absorção no aspectro de absorção de infravermelho se correlaciona com a quantidade de uma ou mais biomoléculas na amostra; enquanto o dispositivo compreende um cartão de suporte de amostra tendo uma membrana porosa que inclui uma região hidrofílica rodeada por uma região hidrofóbica, em que a amostra está contida nos limites da região hidrofílica.

Description

DISPOSITIVOS E MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS

EM INFRAVERMELHO (IV).

Referência cruzada com Pedidos Relacionados [1] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente provisional americano n° 61/475.434, depositado em 14 de abril de 2011, o conteúdo completo do qual está incorporado por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção [2] A presente invenção se refere ao campo de métodos espectrofotométricos para quantificação de analitos em uma amostra e dispositivo para uso nos métodos.

Contexto [3] Espectroscopia infravermelha (IV) é uma ferramenta analítica comumente usada em laboratórios de pesquisa para análise de amostras. A região IV do espectro eletromagnético se estende desde a extremidade inferior da região visível (número de onda de aproximadamente 14.300 cm-¹) para a região de micro-ondas (perto de 20 cm-¹). Normalmente, para uma molécula absorver IV, as vibrações ou rotações dentro da molécula devem causar uma mudança líquida no momento de dipolo da molécula. O campo elétrico alternado da radiação interage com flutuações no momento de dipolo da molécula e se a frequência da radiação coincidir com a frequência vibracional da molécula, então a radiação é absorvida, causando assim uma mudança na amplitude da vibração molecular.

[4] Tipicamente, para a análise quantitativa de

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2/46 biomoléculas, por exemplo, proteínas, as técnicas mais comumente usadas são técnicas colorimétricas (ex., o ensaio Coomassie azul, o ensaio Lowry, o ensaio BCA e o ensaio Pierce de 600 proteínas) e técnicas de espectroscopia UV (ex., absorção a 2 8 0nm). No caso da maioria dos métodos de quantificação no estado da técnica, um usuário precisa gerar uma curva de calibração usando um calibrador que tipicamente é a mesma molécula que o analito sendo quantificado, cada vez que um usuário realiza a quantificação.

Resumo da Invenção [5] A presente invenção proporciona métodos melhorados para quantificação de analitos, especialmente biomoléculas, em uma amostra, o que requer menos tempo para executar bem como menos volume de amostra que a maioria dos métodos conhecidos no estado da técnica e, ademais, não exige etapas especiais de preparação das etapas, como exigem a maioria dos métodos conhecidos no estado da técnica. Além disso, os métodos de acordo com a presente invenção também obviam a necessidade para um usuário gerar uma curva de calibração cada vez que um analito é quantificado e também não exige que o calibrador seja a mesma molécula que o analito sendo quantificado. A presente invenção também fornece dispositivos para uso nos métodos reivindicados.

[6] Em um aspecto de acordo com a presente invenção, um método baseado em IV para quantificar uma ou mais biomoléculas em uma amostra é proporcionado.

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3/46 [7] Em um método para quantificação de uma ou mais biomoléculas em uma amostra de acordo com a presente invenção, o método compreende as etapas de: (a) proporcionar um suporte de amostra compreendendo uma membrana porosa que compreende uma região hidrofílica para contenção de amostra; (b) contatar a região hidrofílica da membrana com um volume de amostra; (c) secar o volume de amostra na membrana; (d) expor o volume de amostra na membrana a um raio de luz infravermelho compreendendo um comprimento de onda de 4000-400 cm-¹, ou qualquer porção da faixa espectral, para assim obter um espectro de absorção no infravermelho; em que uma ou mais áreas de pico de absorção no espectro de absorção no infravermelho correlaciona-se com a quantidade de uma ou mais biomoléculas na amostra.

[8] Em outro método para quantificação de uma ou mais biomoléculas em uma amostra de acordo com a presente invenção, o método compreende as etapas de: (a) proporcionar um suporte de amostra compreendendo uma membrana porosa que compreende uma região hidrofílica rodeada por uma região hidrofóbica para contenção de amostra; (b) contatar a região hidrofóbica da membrana com um volume de amostra; (c) secar o volume de amostra na membrana; (d) detectar a presença de água no volume de amostra após a etapa (c) por absorção infravermelha e repetir a etapa (c), se necessário, até que a presença da água seja indetectável; e (c) expor o volume de amostra seco na membrana para um raio de luz infravermelho

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4/46 compreendendo um comprimento de onda na faixa espectral de 4000-400 cm-¹ ou qualquer porção da faixa espectral, para assim obter um espectro de absorção infravermelho; em que uma ou mais áreas de pico de absorção no espectro de absorção no infravermelho correlaciona-se com a quantidade de uma ou mais biomoléculas na amostra.

[9] Em algumas corporificações de acordo com os métodos reivindicados, uma ou mais biomoléculas são selecionadas do grupo consistindo de ácidos nucleicos, proteínas, lipídeos, polissacarídeos, e lipopolissacarídeos. Um lipopolissacarídeos exemplar é uma endotoxina.

[10] Em várias corporificações, cada uma ou mais áreas de pico de absorção no espectro correlaciona-se com a quantidade de uma determinada biomolécula na amostra.

[11] Em algumas corporificações, um método de acordo com a invenção reivindicada não exige a geração de uma curva de calibração cada vez que um analito é quantificado.

[12] Em algumas corporificações de acordo com a presente invenção, uma ou mais curvas de calibração são pré-carregadas ao instrumento utilizado, assim obviando a necessidade de gerar uma curva de calibração cada vez que um usuário deseja quantificar um analito em uma amostra. No caso de quantificação de proteína e peptídeo, a quantificação é baseada em um número de ligações amida ou a concentração de ligações amida presentes na molécula polipeptídica e, portanto, a quantificação é independente

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5/46 da sequência de aminoácidos da molécula. Consequentemente, ao contrário da maioria dos métodos conhecidos e usados no estado da técnica que exigem a geração de uma curva de calibração cada vez que um analito (ex., proteína ou peptídeo) é quantificado e ainda exigem que o calibrante seja a mesma molécula que o analito sendo quantificado, nos métodos de acordo com a invenção reivindicada, qualquer proteína pode ser usada como um calibrador para a geração de uma curva de calibração que é subsequentemente précarregada ao instrumento sendo usado.

[13] Do mesmo modo, em caso de outros analitos, por exemplo, ácidos nucleicos, carboidratos etc., qualquer calibrador adequado pode ser usado para a geração de uma curva de calibração que é pré-carregada a um instrumento sendo usado. Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser usados para quantificar analitos em um volume de amostra muito pequeno. Em várias corporificações de acordo com os métodos reivindicados, o volume de amostra varia de 0,1 a 20 ql. Em uma determinada corporificação, o volume de amostra é cerca de 2 a 5 ql ou menos, ou menos de 1 ql.

[14] Em algumas corporificações, a amostra compreende um fluido biológico tal como, por exemplo, sangue, plasma, soro e urina. Em outras corporificações, a amostra é uma amostra ambiental, uma amostra farmacêutica ou uma amostra de alimento. Em outras corporificações ainda, a amostra é uma amostra de combustível.

[15] Em algumas corporificações, a amostra compreende célula lisada ou tecido lisado.

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6/46 [16] Em várias corporificações, a amostra é uma amostra crua.

[17] Em algumas corporificações, a membrana porosa é uma membrana de ultrafiltração.

[18] Em outras corporificações, a membrana porosa é uma membrana microporosa.

[19] Em algumas corporificações de acordo com os métodos da invenção reivindicada, a membrana porosa compreende um material polimérico selecionado do grupo consistindo de PVDF (Fluoreto de polivinilideno), PTFE (Politetrafluoretileno), PTFE hidrofílico e polietileno. Em uma determinada corporificação, uma membrana porosa compreende PTFE hidrofílico. Porém, é contemplado que quaisquer materiais poliméricos adequados podem ser usados nos métodos de acordo com a invenção reivindicada. A seleção de material polimérico/membrana seria altamente dependente no analito sendo quantificado. Por exemplo, Seria indesejável usar um material polimérico que absorva no mesmo comprimento de onda que o analito de interesse e/ou interfira com as medidas de absorbância.

[20] Em algumas corporificações, a membrana porosa sobre a qual a amostra é manchada é contida em um dispositivo, referido como um suporte de amostra para conveniência. Em uma determinada corporificação, o suporte de amostra é sob a forma de um cartão e é referido como suporte de amostra para conveniência.

[21] Em várias corporificações de acordo com os métodos reivindicados, o suporte de amostra compreende uma

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7/46 membrana porosa que compreende uma área dentro da qual o volume da amostra está contido na membrana. Em algumas corporificações, a área para contenção de amostra compreende uma região hidrofílica em uma região hidrofóbica, em que o volume de amostra está contido na região hidrofílica.

[22] Em algumas corporificações, a região hidrofóbica é criada por tratamento com plasma de uma membrana porosa hidrofílica. Em outras corporificações, a região hidrofóbica é criada por um tratamento térmico de uma membrana hidrofílica porosa.

[23] Em algumas corporificações, a região hidrofílica inclui um ou mais locais ou uma ou mais linhas de regiões hidrofóbicas.

[24] É importante que o volume de amostra esteja contido no diâmetro da região hidrofílica. O diâmetro da região hidrofílica é dependente do diâmetro de raio de luz do instrumento de IV sendo usado, onde o raio de luz passa através da amostra contida na região hidrofílica. A fim de facilitar quantificação precisa, é desejável ter o diâmetro de região hidrofílica menor que ou igual ao diâmetro do raio de luz IV. Isso assegura que o volume de amostra inteiro seja visível ao raio de luz IV e quantificação precisa é alcançada.

[25] Em algumas corporificações, o diâmetro da região hidrofílica do suporte de amostra varia de 2,0 mm a 9,2 mm. Em algumas corporificações, o diâmetro da região hidrofílica varia de 3,0 mm a 6 mm. Em algumas

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8/46 corporificações, o volume de amostra que é manchado sobre uma membrana compreende um surfactante. Em algumas corporificações, um surfactante é manchado sobre uma membrana antes ou após o volume de amostra ser manchado sobre a membrana.

Breve Descrição dos Desenhos [26] A Figura 1 é um exemplo de curva de calibração gerada para uso em momentos futuros. BSA foi usado para gerar uma curva de calibração em um dia (linha pontilhada). Uma amostra de BSA de 4 mg/ml foi criada dias depois (ex., 4 dias depois neste caso) e verificada contra a curva de calibração gerada anteriormente.

[27] A Figura 2 é uma representação esquemática de um suporte de amostra de acordo com a invenção reivindicada. Um suporte de amostra exemplar é um cartão que inclui 4 pontos diferentes de membrana, cada um compreendendo uma região hidrofílica rodeada por uma região hidrofóbica, para aplicação de uma solução de volume de amostra. Os pontos referidos como pontos de amostra 1, 2 e são destinadas para detectar um volume de amostra contendo uma biomolécula de interesse em um tampão adequado, enquanto o Ponto B é usado para detectar um volume de uma solução em branco ou tampão sozinho. Os

volumes	de amostra detectados	na	mancha 1,	2 e/ou	3
poderiam	representar uma solução	de	volume ou constituir
soluções	diferentes de amostra.
	[28] A Figura 3 é um	espectro de	absorção	no

infravermelho representando os resultados de um experimento

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9/46 representativo para quantificar proteína e ácido nucleico na mesma amostra. A proteína usada neste experimento foi BSA. O eixo-X representa o número de onda em cm-¹ e o eixoY representa as unidades de absorção. O gráfico demonstra que ambos DNA e proteína (isto é, BSA) podem ser quantificados na mesma amostra usando os métodos baseados em IV de acordo com a presente invenção.

[29] A Figura 4 é um espectro de absorção no infravermelho representando os resultados de um experimento representativo para quantificar peptídeo em uma amostra. BSA foi usada como uma proteína padrão neste experimento para quantificação. O eixo-X representa o número de onda em cm-i e o eixo-Y representa as unidades de absorção.

[30] A Figura 5 é um espectro de absorção no infravermelho representando os resultados de um experimento para quantificar um lipossacarídeo (LPS) em água, que é uma endotoxina. O eixo-X representa o número de onda em cm-1 e o eixo-Y representa as unidades de absorção. O espectro demonstra que a intensidade espectral diminui conforme a concentração de LPS na água diminui de 20 pg/pl para 0,2 pg/pl. Ademais, uma curva de calibração usando LPS é gerada usando este experimento e usada para quantificação subsequente de endotoxinas.

[31] A Figura 6 é um espectro de absorção no infravermelho representando os resultados de um experimento para monitorar/medir/detectar a presença de água em uma amostra. O eixo-X representa o número de onda em cm-1 e o eixo-Y representa as unidades de absorção. Conforme

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10/46 representado no espectro, quando a água está presente na amostra, há interferência espectral da ligação vibracional se alongando e se flexionando associada com as ligações de OH de água, que interfere com a resolução de ligações amida de proteína. Porém, conforme a amostra é secada e a água evapora, a intensidade espectral associada com água diminui, conforme também representado no espectro.

[32] A Figura 7 representa um gráfico demonstrando uma distribuição mais uniforme e perfil de absorção de uma amostra, quando um surfactante (ex., SDS) é adicionado à amostra. O eixo-X representa o número de onde em cm-¹ e o eixo-X representa as unidades de absorção.

[33] As Figuras 8A e 8B representam visões abertas e fechadas, respectivamente, de uma fixação e montagem de cartão suporte de amostra para uso em um plasma baseado em contenção de amostra baseada em plasma. A Figura 8A representa uma configuração aberta de um cartão suporte de amostra totalmente montado e os dois lados de uma fixação. A Figura 8B representa um diagrama esquemático de corte transversal fechado de um cartão suporte de amostra e montagem de fixação dentro de um ambiente de plasma vácuo, onde a área da membrana no cartão suporte de amostra que é desejado para ser hidrofóbico é exposto ao tratamento de plasma, enquanto a região hidrofílica na qual uma amostra é detectada é protegida de tratamento de plasma.

[34] A Figura 9 representa um esquemático de um cartão suporte de amostra subsequente ao tratamento de plasma. A área hidrofílica representa a região protegida da

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11/46 membrana, que é rodeada por uma área hidrofóbica que foi exposta a tratamento de plasma. A área hidrofílica representa a região protegida da membrana, que é rodeada por uma área hidrofóbica que foi exposta a tratamento de plasma.

[35] As Figuras 10A a 10D representam formatos/padrões exemplares de regiões hidrofóbicas e hidrofílicas dentro de uma membrana de um cartão suporte de amostra, que podem ser criados ao posicionar adequadamente os selos elastoméricos (em caso de método de tratamento de plasma) ou por formato de uma mesa de prensa aquecida (em caso do método de tratamento térmico).

[36] As Figuras 11 são uma vista expandida de uma fixação incrustada em relevo e sistema de cartão de suporte de amostra para gerar uma área de contenção de amostra hidrofóbica no interior da membrana, incluindo uma mesa de prensa aquecida e uma base de silicone.

[37] As Figuras 12A e 12B representam visões em corte transversal abertas e fechadas, respectivamente, de um sistema de cabeça/mesa de prensa aquecida incrustada em relevo, após o cartão de suporte de amostra ser colocado no sistema.

[38] As Figuras 13A a 13D representam os resultados de um experimento para mostrar que uma membrana retém uma amostra (ex. água) no interior da área de contenção da amostra subsequente ao tratamento térmico, conforme mostrado na Figura 13C (em 0 segundo) e a Figura 13D (em 0 segundo) relativa a uma membrana que não foi

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12/46 sujeita a tratamento térmico, conforme mostrado na Figura 13A (em 0 segundo) e a Figura 13B (em 0 segundo).

[39] As Figuras 14A e 14B representam os efeitos de rompimento químico e físico, respectivamente, no padrão de deposição amostra “anel de café”. A Figura 14A representa distribuição aumentada de distribuição de amostra por rompimento químico quando um detergente (SDS) é adicionado à amostra. Citocromo C (10mg/ml), dissolvido em ambos água e Salina Tamponada com Fosfato (PBS) foi colocado em uma membrana hidrofílica PTFE (2 5 qL) e secado. A adição de SDS à amostra resulta em uma distribuição mais uniforme da amostra (PBS + SD não mostrada). A Figura 14B representa rompimento físico de distribuição de amostra (modificando barreiras hidrofóbicas) resultando em múltiplos anéis de café” e mais amostra no centro da área de amostra.

[40] A Figura 15 é um gráfico de barras representando o efeito da adição de SDS a uma amostra. SDS (1 e 5%) foi adicionado a amostras de Citocromo C e secado. A adição de SDS resultou em um aumento na área de pico respectiva.

[41] A Figura 16 é um gráfico mostrando uma área de pico que se correlaciona com a concentração ou quantidade de um analito em uma amostra.

Descrição Detalhada da Invenção [42] A presente invenção proporciona métodos melhorados para quantificação de uma ou mais biomoléculas em uma amostra usando espectroscópio (IV) de infravermelho

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13/46 bem como dispositivos para uso nos métodos de acordo com a invenção reivindicada.

[43] A fim de que a presente divulgação possa ser mais prontamente entendida, certos termos são antes definidos. Definições adicionais são estabelecidas através da descrição detalhada.

I. Definições [44] O termo quantificar, quantificação, quantificar, medir ou medida, conforme usado indiferentemente aqui, se refere à determinação da quantia ou concentração de um analito em uma amostra, usando os métodos de acordo com a invenção reivindicada. O termo analito, conforme usado aqui, se refere a qualquer molécula de interesse que seja desejável para quantificar usando os métodos descritos aqui. Em várias corporificações, um analito é uma biomolécula.

[45] O termo biomolécula conforme usado aqui, se refere a qualquer material biológico de interesse, que seja desejável para quantificar usando os métodos de acordo com a invenção reivindicada. Biomoléculas exemplares incluem proteínas, peptídeos, moléculas de ácidos nucleicos incluindo DNA e RNA, lipídeos, carboidratos e endotoxinas (ex., lipopolissacarídeo). É contemplado que qualquer biomolécula pode ser quantificada usando os métodos de acordo com a invenção reivindicada, contanto que a biomolécula seja capaz de absorver no âmbito infravermelho do espectro eletromagnético.

[46] O termo amostra, conforme usado aqui, se

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14/46 refere a qualquer meio, que inclui um analito (ex., uma biomolécula) a ser quantificado usando os métodos de acordo com a presente invenção. Uma amostra pode incluir, mas não é limitado a, por exemplo, uma substância alimentar (ex., frango, carne fresca, leite, iogurte, produtos lácteos, produtos de padaria, bebidas, cerveja, limonada, sucos, queijos, vegetais, fruta, peixe etc.), um corpo de água ou esgoto (ex., lagoa, lago, rio, oceano, canais de esgoto, água potável de torneira etc.), um espécime clínico (ex., sangue, plasma, soro, escarro, tecido, urina, saliva, amostra/fluido do trato respiratório etc.), solo e cosméticos e farmacêuticos (ex., loções, cremes, pomadas, soluções, medicamentos, colírios, gotas para os ouvidos etc.). Em uma determinada corporificação, uma amostra compreende uma célula ou lisado tecido. Em várias corporificações da invenção reivindicada, uma amostra pode constituir uma amostra crua, isto é, não exige qualquer preparação ou tratamento antes do uso nos métodos reivindicados.

[47] Em algumas corporificações, um volume pequeno de amostra (ex., 0,1-20 ql) é pipetado ou manchado à região hidrofílica de uma membrana contida em um suporte de amostra (ex., em forma de um cartão) e subsequentemente secado após expor a amostra a espectroscopia baseada em IV. O volume de amostra no cartão pode ser secado usando qualquer método adequado. Por exemplo, o volume da amostra pode ser ar seco ou secado usando um aquecedor convencional ou um forno convencional ou mesmo um forno de micro-ondas.

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É contemplado que em algumas corporificações, um mecanismo de secagem é incorporado ao sistema IV. Em geral, é desejável que não haja traços de água presentes em uma amostra de volume antes da quantificação conforme água possa apresenta um impedimento para obter quantificação precisa.

[48] Em algumas corporificações dos métodos reivindicados, uma membrana sobre a qual uma amostra de volume é manchada é sujeita a uma etapa de secagem seguida pelo uso de absorção infravermelha para detectar a presença de água. Se for detectada água, a membrana é sujeita a uma etapa de secagem novamente e a etapa de secagem é repetida até que a presença de água seja indetectável. Tipicamente, nenhuma mudança adicional na absorção após uma etapa de secagem é indicativa de que a presença de água é indetectável, ou em outras palavras, a amostra é suficientemente seca para análise de IV.

[49] Os métodos e dispositivos de acordo com a invenção reivindicada permitem o uso de um volume muito pequeno para alcançar quantificação precisa de um analito na amostra. Em várias corporificações o volume de amostra é cerca de 0,05 pl, 0,1 pl ou 0,2 pl ou 0,3 pl ou 0,4 pl ou 0,5 pl ou 0,6 pl ou 0,7 pl ou 0,8 pl ou 0,9 pl ou 1,0 pl ou 1,5 ul ou 2 pl ou 2,5 pl ou 3 ul ou 3,5 ul ou 4 ul ou 4,5 ul ou 5 ul ou 5,5 ul ou 6 pl ou 6,5 pl ou 7 pl ou 7,5 pl ou 8 pl ou 8,5 pl ou 9 pl ou 9,5 pl ou 10 pl ou 10,5 pl ou 11 pl ou 11,5 pl ou 12 pl ou 12,5 pl ou 13 pl ou 13,5 pl ou 14 pl ou 14,5 pl ou 15 pl ou 15,5 pl ou 16 pl ou 16,5 pl ou 17

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16/46 μΐ ou 17,5 μΐ ou 18 μΐ ou 18,5 μΐ ou 19 μΐ ou 19,5 μΐ ou 20 μΐ ou maior que 20 μΐ. Contudo, os dispositivos e métodos descritos aqui facilitam o uso de volumes muito pequenos para quantificação de uma ou mais biomoléculas, a fim de aumentar o limite inferior de detecção e quantificação usando os métodos descritos aqui, alíquotas múltiplas de um volume de amostra podem ser aplicado ao cartão de suporte de amostra, com secagem do volume de amostra entre as alíquotas. Por exemplo, em caso de amostras contendo níveis muito baixos de analitos, que pode ser difícil de detectar ou indetectável usando os métodos descritos aqui, alíquotas múltiplas de certo volume de amostra (ex. 10-20 μΐ) podem ser manchadas no cartão de suporte de amostra, com secagem do volume de amostra entre as diferentes alíquotas. Portanto, contudo, apenas um pequeno volume de 10-20 μΐ é detectado em cada aplicação, um volume total de amostra de 50 μΐ a 100 μΐ ou mais poderia ser aplicado no total sobre as aplicações múltiplas do volume de amostra, com secagem de cada volume de amostra entre as aplicações.

[50] Em algumas corporificações, um volume de amostra de 100 μΐ ou mais é aplicado ao cartão de suporte de amostra aplicando 20 μΐ de volume de amostra ao cartão e secando o cartão. Uma vez que o volume de amostra esteja completamente seco, 20 μΐ adicionais de volume de amostra podem ser aplicados ao cartão de suporte de amostra e o cartão pode ser secado novamente. Este processo pode ser repetido inúmeras vezes para detectar o volume de amostra exigido no cartão. A vantagem desta técnica é que ela

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17/46 aumenta o limite da detecção/quantificação de analito.

[51] Conforme usado aqui, o termo lisar, lise ou lisando se refere a qualquer meio pelo qual uma célula ou tecido pode ser partido aberto, por exemplo, ao comprometer a membrana da célula e possivelmente causando os conteúdos das células a serem liberados. Métodos exemplares que pode ser usados para lisar uma célula ou tecido incluem, mas não são limitados a, métodos enzimáticos, ultrassom, ação mecânica (ex., cisalhamento e impactação) e métodos químicos.

[52] Conforme usado aqui, o termo ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico se refere a qualquer cadeia de ou mais nucleotídeos, nucleotídeos ou nucleobases (ex., deoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos) ligados convalentemente entre si. Em algumas corporificações, uma biomolécula que é quantificada usando os métodos de acordo com a invenção reivindicada é uma molécula de ácido nucleico. Moléculas de ácido nucleico incluem, mas não se limitam a, genomas virais, ou porções destes, seja DNA ou RNA, genomas bacteriais, ou porções destes, genomas de fungos, plantas ou animais, ou porções destes, RNA mensageiro (mRNA), RNA ribossômico (rRNA), RNA de transferência (tRNA), DNA de plasmídeo, DNA mitocondrial, ou DNA ou RNA sintético. Uma molécula de ácido nucleico pode ser proporcionada em uma forma linear (ex. mRNA), circular (ex. plasmídeo), ou ramificada, bem como uma forma de fita dupla ou de fita simples. Moléculas de ácido nucleico podem incluir bases modificadas para

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18/46 alterar função ou comportamento do ácido nucleico, ex., adição de um dideoxinucleotídeo do terminal 3' para bloquear nucleotídeos adicionais de serem adicionados ao ácido nucleico.

[53] O termo “comprimento de onda” geralmente se refere à distância entre um pico ou crista de uma onda e o próximo pico ou onda. É igual à velocidade da onda dividida por sua frequência, e para a velocidade da onda vezes seu período. O comprimento da onda é uma característica de ambas as ondas viajantes e ondas estacionárias, bem como outros padrões espaciais da onda. O comprimento da onda é comumente designado pela letra grega lambda (λ). Presumindo que uma onda sinusoidal está se movendo mais rápido que uma onda de velocidade fixa, o comprimento da onda é inversamente proporcional à frequência da onda. Portanto, ondas com frequências mais altas têm comprimento mais curtos, e ondas com frequências mais baixas têm comprimento mais longos.

[54] O termo “número de onda” é uma propriedade de uma onda proporcional ao recíproco de seu comprimento de onda. É geralmente medido em unidades de cm-¹ e pode ser definido pelo número de comprimento de ondas por unidade de distância, isto é, l/λ onde λ é o comprimento de onda.

[55] O termo “área de absorção de pico” ou “áreas de absorção de pico” conforme usado aqui, se refere a uma ou mais partes de um espectro de absorção no infravermelho observado após a exposição de uma amostra de espectroscópio de IV, conforme descrito aqui. Uma vez que um espectro de

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19/46 absorção no infravermelho é obtido usando os métodos baseados em IV descritos aqui, a área sob um ou mais picos no espectro é calculada ao desenhar uma linha de base através do pico e medir a área incluída no pico. A linha de base é tipicamente desenhada montada em pontos antes e após o pico no espectro, conforme representado na figura 16.

[56] Em algumas corporificações de acordo com os métodos reivindicados, uma área de pico se correlaciona com a concentração ou quantidade de um analito em uma amostra.

[57] Em algumas corporificações, a concentração de proteína em uma amostra é medida como segue. Em uma primeira etapa, uma curva de calibração é gerada usando um calibrador, que inclui padrões de proteína de concentração conhecida, e a curva de calibração é pré-carregada a um instrumento de espectrômetro de IV. A mesma curva de calibração pode subsequentemente ser usada cada vez que o instrumento é usado para quantificar proteína em uma amostra. Ademais, não é exigido que o calibrador esteja presente na amostra sendo analisada, ou em outras palavras, poderia ser derivado de uma fonte completamente diferente que a amostra. Por exemplo, em uma determinada corporificação, soluções de padrão de proteína tal como, por exemplo, BSA, são preparadas em um tampão em várias concentrações conhecidas. As soluções padrão são aplicadas à região hidrofílica de uma membrana em um suporte de amostra na forma de um cartão, a membrana é secada e o espectro de absorção é medido usando um instrumento de IV,

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20/46 por exemplo, o instrumento Bruker de IV. Sem desejar limitar-se pela teoria, é contemplado que qualquer instrumento de IV adequado pode ser usado nos métodos de acordo com a presente invenção.

[58] A maioria dos instrumentos modernos de absorção de IV usam técnicas da transformada de Fourier com um interferômetro de Michelson. Em algumas corporificações de acordo com os métodos reivindicados, a fim e obter um espectro de absorção de IV, um espelho do interferômetro se move para gerar interferência na radiação atingindo o detector. Já que todos os comprimentos de onda estão passando através do interferômetro, o interferograma é um padrão complexo. O espectro de absorção como uma função de número de onda (cm-¹) é obtido a partir de uma transformada de Fourier do interferograma, que é uma função do movimento do espelho (cm). Este desenho não tem a célula de referência de um instrumento dispersivo, então um espectro de referência é gravado e armazenado em memória para subtrair do espectro da amostra.

[59] Outros instrumentos de absorção de IV incluem instrumentos dispersivos de absorção de IV e instrumentos de comprimento de onda simples de IV. Espectrômetros de IV dispersivo usam rede de difração em um monocromador usam grade de difração em um monocromador a fim de dispersar os diferentes comprimentos de onda de luz. Em geral, espectrômetros de IV dispersivo foram substituídos por instrumentos FTIV. Instrumentos de comprimento de onda simples podem ser usados para monitorar

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21/46 um comprimento de onda simples de IV para medir a cinética de uma reação rápida.

[60] Em algumas corporificações de acordo com a invenção reivindicada, um instrumento FTIV é usado para a quantificação de uma ou mais biomoléculas.

	[61]	Área sob a	curva	que abrange	picos	de amido
I e amido	II	(1800 - 1450	cm-1)	é calculada	pelo	software
embutido	no	instrumento.	Por	exemplo, o	espectrômetro
Bruker de	IV	inclui o software	Bruker Opus.	Uma	curva de

calibração é então configurada que marca áreas sobre o pico x concentração do padrão de proteína. Usando a curva de calibração gerada pelo padrão de concentração conhecida, a concentração de um analito em uma amostra é subsequentemente medida.

[62] Em geral, uma curva de calibração se refere a uma exibição gráfica da relação funcional entre o valor esperado do sinal observado para a quantidade ou concentração de analito. Tipicamente padrões abrangendo uma gama de concentrações conhecidas de um calibrador são usados para gerar uma curva de calibração. O espectro obtido com a amostra é então comparado com os padrões para obter a concentração do analito desejado.

[63] Em algumas corporificações de acordo com os métodos descritos aqui, os métodos incluem ainda uma etapa de monitoramento/detecção de absorção por água em uma amostra. A água absorve ~3400 e 1600 cm-¹, assim se sobrepondo com o espectro obtido com muitas biomoléculas. Em algumas corporificações de acordo com a presente

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22/46 invenção um instrumento de IV é usado que inclui um software embutido para monitorar a alteração em intensidade espectral associada com a absorção pela água, que diminui conforme a quantidade de água na amostra reduz. Da mesma forma, ao monitorar a intensidade espectral associada a água, um usuário pode determinar se uma amostra precisa ser ainda mais seca. Tipicamente, a intensidade espectral associada com a absorção por água é medida alguns minutos durante o processo de secagem, até que a mesma intensidade espectral é observada por 2 ou 3 ou mais leituras consecutivas, assim confirmando que a amostra está seca para a quantificação real.

[64] Em algumas corporificações, um surfactante é incluído na amostra sendo analisada usando os métodos da invenção. Um surfactante pode tanto ser incluído na amostra sendo manchada a uma membrana como pode ser adicionado à membrana antes ou após a amostra ser manchada. Um surfactante, tal como, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS) ou Tween 20 ou um aditivo químico, por exemplo, Glicerol, reduz a tensão superficial de uma solução, assim permitindo uma distribuição uniforme de amostra em uma área.

[65] Quando uma amostra aquosa contendo uma ou mais biomoléculas é secada em um substrato hidrofílico PTFE, um gradiente de concentração é formado conforme a amostra seca. Este padrão de deposição resulta na quantidade mais alta de amostra sendo depositada no perímetro mais externo, e a quantidade mais baixa no centro

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23/46 da área de amostra. Este padrão é frequentemente referido como um padrão “anel de café” ou rosquinha. Quando a tensão superficial da amostra aquosa é reduzida, tal como com a adição de um surfactante, a deposição da amostra é mais uniforme através da área total de amostra. No caso em que a amostra esteja sendo interrogada com uma fonte de energia, inclusão de um surfactante resulta em uma distribuição mais uniforme da amostra na área sendo exposta à fonte de energia.

[66] Surfactantes exemplares incluem, mas não se limitam a, polioxietileno baseado em surfactantes não iônicos tais como (Tween 20, Tween 40, Tween 60 e Tween 80). Surfactantes aniônicos tais como Dodecil sulfato de sódio (SDS), Lauril sulfato de Amônio, Lauril éter sulfato (SLES), Estearato de sódio. Em algumas corporificações, a concentração de um surfactante é cerca de 1% ou cerca de 2%

ou cerca	de	3% ou cerca	de 4% ou cerca de	5%	ou cerca de	6%
ou cerca	de	7% ou cerca	de 8% ou cerca	de	9% ou cerca	de
10%. Em	uma	determinada	corporificação,	a	concentração	de

um surfactante é cerca de 5%.

[67] Aditivos químicos exemplares incluem, mas sem se limitar a, polióis tais como glicerol, etileno glicol, propileno glicol, dipropileno glicol. Em algumas corporificações, a concentração de aditivo químico é cerca

de	1% ou	cerca	de	2%	ou cerca	de	3% ou	cerca	de	4% ou	cerca
de	5% ou	cerca	de	6%	ou cerca	de	7% ou	cerca	de	8% ou	cerca
de	9% ou	cerca	de	10	%. Em uma	determinada corporificação, a

concentração de um aditivo químico é cerca de 5%.

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24/46 [68] Também englobada pela presente invenção são dispositivos usados para quantificação de uma ou mais biomoléculas em uma amostra usando um método baseado em IV bem como métodos para fazer tais dispositivos. Em algumas corporificações de acordo com a presente invenção, um dispositivo usado para quantificação de biomoléculas é um suporte de amostra em forma de um cartão que inclui uma membrana porosa (por exemplo, uma membrana de ultrafiltração ou uma membrana microporosa). Em geral uma membrana de ultrafiltração é entendida como tendo um tamanho de poro menor que 0,1 μη.

[69] Em algumas corporificações, uma membrana porosa contida em um suporte de amostra inclui uma região hidrofílica rodeada por uma região hidrofóbica. A região hidrofílica é a região da membrana que é instantaneamente molhável por água e a região onde a amostra é normalmente manchada ou pipetada para a membrana. Também é a região que é tipicamente exposta ao raio IV.

[70] Em algumas corporificações, a região hidrofílica da membrana é rodeada por uma região hidrofóbica, que não é molhada por água.

[71] Em algumas corporificações, a área para contenção de amostra inclui formas/padrões de regiões hidrofílicas e hidrofóbicas, por exemplo, na forma de linhas ou manchas de regiões hidrofóbicas criadas na região hidrofílica. Formas e padrões exemplares são mostrados nas Figuras 8A a 8D. Tais formas e padrões também permitem uma distribuição mais uniforme de uma amostra na área sendo

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25/46 exposta ao raio IV, assim como a adição de um surfactante ou um aditivo químico.

[72] Cartões de suporte de amostra para uso em análise espectrométrica de infravermelho foram previamente descritos no estado da técnica que inclui uma membrana microposa, por exemplo, aquelas discutidas nas Patentes Norte-Americanas US5470757 e US5764355, incorporadas por referência aqui em sua totalidade. Porém, não há nenhum ensinamento de cartões de suporte de amostra que inclua uma área hidrofílica rodeada por uma área hidrofóbica para contenção de amostra, como no caso da presente invenção. Ademais, estas patentes também não descrevem cartões de suporte de amostra que demonstram a melhoria descrita aqui, por exemplo, a quantificação de uma ou mais biomolécula em uma amostra, uso de volume muito pequeno de amostra e nenhuma necessidade para a geração de uma curva de calibração para cada operação etc.

[73] O suporte de amostra em forma de um cartão é tipicamente fabricado de duas camadas de cartolina de papel laminado com adesivo ao substrato da membrana. O suporte de amostra também pode ser fabricado a partir de outras substâncias tais como plásticos que podem ser aderidos com um adesivo. Ademais, o suporte de amostra poderia ser construído sem qualquer adesivo e laminado por meio de um revestimento na cartolina que adere à cartolina quando exposta ao calor. Em algumas corporificações, um suporte de amostra está na forma de um cartão que tem cerca de 1,4 polegadas de largura por 2,5 polegadas de comprimento e

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26/46 pode segurar pelo menos 4 amostras. Porém, um suporte de amostra pode ser projetado de tal forma que pode conter de 1 até 96 amostras ou mais (por exemplo, um formato de placa-96). Um entalhe pode ser incorporado ao projeto do suporte de amostra, especialmente quando é na forma de um cartão, para orientar o suporte de amostra no sistema IV a fim de verificar que o suporte de amostra é inserido corretamente ao carregador do sistema IV para ser exposto a um raio IV. Também é importante que o suporte de amostra seja orientado corretamente para que o raio IV passe através da região hidrofílica contendo a amostra.

[74] Os cartões de suporte de amostra descritos aqui são fáceis de fabricar, e são rentáveis e descartáveis.

[75] Esta invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitadores. Os conteúdos de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo deste pedido, bem como as Figuras, são incorporados a este por referência.

Exemplos

Exemplo	1:	Geração de	curva	de calibração para
quantificações	de amostras	futuras
	[76]	Os métodos	de quantificar uma ou mais

biomoléculas em uma amostra descrita aqui obviam a necessidade de gerar uma curva de calibração, cada vez que um experimento de quantificação é operado em um instrumento. Esta é uma melhoria sobre os ensaios atuais no

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27/46 estado da técnica, em que um usuário tipicamente será exigido para gerar uma nova calibração ou curva padrão cada vez que um ensaio de quantificação é executado.

[77] Em métodos descritos aqui, um usuário gera uma calibração ou curva padrão uma vez e pode usar aquilo para análises futuras. Em um experimento, uma curva de calibração foi gerada como segue. Soluções de várias concentrações de analito (BSA) foram preparadas em tampão e analisadas usando métodos de detecção baseados em FTIV conforme descrito aqui. O gráfico na Figura 1 mostra a área de pico ou altura de pico (eixo Y) contra concentração ou

quantidade de	analito (eixo X).	O	âmbito	linear desta
calibração é	usado para cálculo	de	concentração de uma
amostra desconhecida quando a área	de	pico é	conhecida.
[78]	A equação típica é	y =	mx +	c, em que c =

Interceptar no eixo Y, m = vertente da linha; y = área ou altura de pico, e x = concentração ou quantidade de analito. Ademais, o usuário pode adicionar dados à curva de calibração original para aumentar a relevância estatística da quantificação.

[79] A Figura 1 é um exemplo de curva de calibração que foi gerada, usando várias concentrações conhecidas de BSA em um tampão em um dia, e uma amostra relevante de concentração desconhecida de proteína quantificada dias depois contra a mesma curva.

Exemplo 2: Protocolo Geral para quantificação de uma biomolécula em uma amostra [80] Em um experimento representativo, uma

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28/46 amostra contendo uma ou mais biomoléculas (por exemplo, proteína, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídeos, etc.) é preparada em água deionizada ou um tampão adequado. Aproximadamente 0,2 - 10 pl de uma solução em branco (por exemplo, água deionizada ou tampão sozinho) é aplicado à região hidrofílica da membrana contida em um suporte de amostra, por exemplo, na forma de um cartão (referido aqui como um cartão de suporte de amostra). O mesmo volume da solução preparada de amostra é aplicado a um ou mais locais, que podem estar presentes no mesmo cartão de suporte de amostra ou em um cartão de suporte de amostra diferente, mas idêntico. O cartão de suporte de amostra é subsequentemente seco usando uma das seguintes técnicas: calor (40 - 60°C, 0,5 - 2 minutos); ar comprimido/nitrogênio ou qualquer outro gás inerte (0,5 - 2 minutos) ou um forno de micro-ondas. O cartão de suporte de amostra seco é subsequentemente inserido ao compartimento de amostra do instrumento IV. O espectro de transmissão/absorção da solução em branco é medido entre 4000 e 400 cm-¹ a fim de obter um espectro para o fundo seguido de uma medida da amostra no mesmo âmbito de comprimento de onda. Usando uma curva de calibração que é embutida ao sistema e gerada usando padrões em várias concentrações, concentração de amostra desconhecida é determinada subsequentemente.

[81] A figura 2 representa a imagem de um cartão de suporte de amostra que mostra um local para aplicação do vazio (referido como B) e locais para três amostras

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29/46 (referidas como 1, 2 e 3). Porém, conforme discutido acima, um cartão de suporte de amostra pode ser projetado para ter qualquer número de locais para aplicação de amostra.

Exemplo 3: Quantificação de proteína e ácido nucleico e uma amostra usando espectroscópio de IV [82] Em um experimento representativo, ambos proteína e ácido nucleico foram quantificados como segue usando os métodos de acordo com a presente invenção.

[83] Em um experimento, albumina de soro bovino (BSA; SIGMA Cat#A-7030) e ácidos deoxirribonucleicos (DNA;

Ambion Cat#AM9680 DNA de Esperma de salmão tosquiado foram misturados em conjunto em várias proporções (10 a 1pg em proporções iguais e inversas) e dissolvidas em um tampão IxPBS. Amostras de 1pl foram pipetadas usando uma pipeta Rainin a um cartão de suporte de amostra de membrana PTFE hidrofílica, nas posições 1, 2 e 3 do cartão de suporte de amostra mostrado na Figura 2. O mesmo volume do tampão na qual a amostra acima foi preparada foi pipetado na posição B do cartão de suporte de amostra, conforme mostrado na Figura 2.

[84] O cartão de suporte de amostra contendo ambos o tampão e os locais de amostra foram secos usando ar de alta pressão. O cartão de suporte de amostra foi inserido no instrumento IV e o espectro de absorção/transmissão do tampão foi primeiro medido entre 4000 e 400 cm-¹. Subsequentemente, o espectro da amostra foi medido usando espectro de tampão como espectro de fundo. A quantidade de proteína e ácidos nucleicos é

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30/46 determinada usando um âmbito espectral de 1700 - 1400 cm-¹ para proteínas e 1740 - 1400 e 1120 - 940 cm-i para ácidos nucleicos. Deve ser notado que as proteínas e ácidos nucleicos absorvem no âmbito de comprimento de onda de 1700

- 1400 cm-i. Da mesma forma, uma vez que a concentração de ácidos nucleicos é determinada, ela pode ser subtraída da concentração de proteína mais ácidos nucleicos, conforme obtido usando áreas de pico entre 1700 - 1400 cm-i, assim proporcionando concentração de proteína sozinha. Portanto, a concentração de proteínas e ácidos nucleicos pode ser determinada em um único experimento. Neste experimento, curvas de calibração foram geradas independentemente para proteínas e DNA usando amostras puras de proteína e DNA dissolvidas em um tampão ou água deionizada. Os resultados de tal experimento são representados na Figura 3.

Exemplo 4: Quantificação de peptídeos em uma amostra usando IV [85] Em outro experimento representativo, é demonstrado que os métodos de acordo com a presente invenção poderiam ser usados para quantificar peptídeos. Em um experimento, uma amostra de peptídeo foi dissolvida em água a uma concentração de 1 mg/ml. Volume de amostras de 2 pl das amostras foi pipetado usando uma pipeta P2 Rainin em uma membrana PTFE hidrofílica contendo cartão de suporte de amostra, conforme representado na Figura 2, e seco em um aquecedor a 40°C.O mesmo cartão de suporte de amostra também continha uma posição chamada em branco (B), em que um volume de 2pl de água no qual a amostra é dissolvida foi

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31/46 pipetada. O cartão foi inserido no instrumento IV e o espectro de absorção/transmissão da água/tampão em branco foi medido após a medida das amostras usando espectro de água/tampão como fundo. A quantidade de peptídeo foi determinada usando um âmbito espectral de 1700 - 1400 cm-¹. A curva de calibração foi gerada usando amostras puras de BSA como calibradores em tampão/água. Os resultados de tal experimento são representados na Figura 4.

Exemplo 5: Quantificação de lipopolissacarídeos em uma amostra usando IV [86] Em um experimento representativo, os métodos de acordo com a presente invenção foram usados para quantificar um lipopolissacarídeo em uma amostra. Especificamente, um lipopolissacarídeo tal como uma endotoxina, (Lipopolissacarídeo (LPS); SIGMA L2630), foi dissolvido em um tampão 1XPBS para obter uma solução de reserva de 20 mg/ml. Amostras de volume de 2 pl foram pipetadas usando uma pipeta Rainin P2 a uma membrana PTFE hidrofílica contendo cartão de suporte de amostra, conforme representado na imagem na Figura 2, e secas usando um aquecedor a 40°C. O cartão de suporte de amostra também continha uma posição chamada em branco (B), em que um volume de pl do tampão no qual a amostra é dissolvida é aplicado. O cartão de suporte de amostra foi inserido no instrumento IV e o espectro do tampão foi primeiro medido seguido pelo espectro da amostra, que considera o espectro de tampão em branco como o espectro de fundo. Uma titulação de diluições LPS foi registrada com base em cálculo de

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32/46 solução de reserva a fim de obter uma curva de calibração. Os resultados de tal experimento são representados na Figura 5.

Exemplo 6: Monitorando a presença de água em uma amostra usando IV [87] Os métodos descritos aqui também podem ser usados para detectar a presença de água em uma amostra. É largamente indesejável ter água em uma amostra sendo analisada usando métodos baseados em IV já que a água pode afetar a precisão de quantificação de biomoléculas, por exemplo, especialmente no caso de quantificação de proteína/peptídeo.

[88] Em um experimento representativo, 2pl de uma solução de 10 mg/ml de BSA (Sigma Cat #A-7030) em água Milli Q foi aplicado à região hidrofílica da membrana contida em um suporte de amostra, por exemplo, na forma de um cartão (referido aqui como cartão de suporte de amostra).

[89] A amostra úmida foi então colocada no raio de IV de um espectrômetro de IV e o espectro de absorção de IV foi medido. Os espectros de absorção são medidos conforme a intensidade do sinal e o perfil do sinal mudam, por exemplo, devido a evaporação da água.

[90] Quando a intensidade de sinal para o espectro de absorção permanece constante acima de 3 medidas consecutivas, a amostra é considerada seca e o software (por exemplo, o software Opus no caso do instrumento Bruker) coleta o espectro de absorção do BSA entre 4000

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400 cm-¹ e usando uma curva de calibração embutida determina a concentração de BSA naquela solução. Os resultados de tal experimento são representados na Figura 6, que mostra uma diminuição de intensidade de sinal associada a água conforme a amostra é seca.

Exemplo 7: Efeito de um surfactante na distribuição de amostra [91] Soluções aquosas podem ter um problema para secar uniformemente e obter uma distribuição uniforme na área da membrana sendo exposta a um raio IV.

[92] Este experimento demonstra que a adição de um surfactante a uma solução de amostra resulta em uma distribuição uniforme da amostra na área sendo exposta ao raio IV e consequentemente quantificação mais precisa. Em um experimento representativo, uma amostra de proteína Citocromo C de 5 pl de 10mg/ml foi usada, que foi dissolvida em PBS e seca com e sem 5% de SDS. A amostra foi manchada em um cartão de suporte de amostra e colocada em um raio IV com um diâmetro total de 4,5mm.

[93] Foi observado que apenas 10% da amostra sem SDS estava absorvendo o raio IV já que a maior parte da amostra estava contida no 1mm exterior da área de amostra. Porém, na amostra na qual a SDS estava presente, uma distribuição mais uniforme da amostra resultou em mais absorção do IV já que a amostra estava dentro da irradiação

máxima	(1/e	²) do raio.	A área de	pico	1 e 2	integrada	de
amida	1725	a 1479 cm-1)	era cerca	de 3	vezes	mais	alta	que
aquela	com	a amostra	sem SDS.	Os	resultados	de	tal

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34/46 experimento são representados na Figura 7. O eixo X neste espectro de absorção de IV representa o número de onda (cm^x) em que o eixo Y representa as unidades de absorção.

Exemplo 8: Fabricação de um cartão de suporte de amostra usando tratamento de plasma para contenção de amostra [94] Também abrangidos pela presente invenção estão suportes de amostra que podem ser usados nos métodos para quantificar uma ou mais biomoléculas em uma amostra, conforme descrito aqui. Em algumas corporificações, um suporte de amostra está sob a forma de um cartão, e é referido como cartão de suporte de amostra para conveniência. É imperativo que os cartões de suporte de amostra sejam capazes de conter a amostra dentro do raio IV a fim de obter um espectro preciso de absorção e consequentemente quantificação de uma ou mais biomoléculas de interesse.

[95] Em um método para fabricar um cartão de suporte de amostra para uso nos métodos de acordo com a presente invenção um ambiente de plasma vácuo foi usado para gear uma área para contenção de amostra. A membrana de partida usada no cartão de suporte de amostra era uma membrana PTFE hidrofílica, que é vendida pela Sumitomo sob a marca Poreflon. A membrana compreende poros de um tamanho médio 0,03 pm (HHPSW-005-30) e é revestida com tratamento de hidrofilização para partilhar uma superfície permeável a água. Expor a membrana hidrofílica de Poreflon a um ambiente de plasma vácuo limpa o tratamento de uma superfície expondo a PTFE hidrofóbica naturalmente.

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35/46 [96] As Figuras 8A e 8B representam as visões experimentais abertas e fechadas, respectivamente, de uma fixação de mascaramento dentro da qual um cartão de suporte de amostra é colocado para exposição ao plasma. A membrana foi fabricada em um cartão consistindo de duas folhas de papel adesivas revestidas que tinham um furo de 12,5 mm através do centro de cada. Duas folhas de papel foram montadas com a membrana hidrofílica Sumitomo imprensada entre elas, assim cobrindo o furo no cartão de papel montado. O cartão montado (10) é mostrado na Figura 8A, com a fixação (12) em uma configuração aberta. O cartão montado (10) contendo a membrana hidrofílica (14) foi posicionado na fixação de mascaramento (12) contendo um quadro (16) para centralizar o cartão, conforme representado nas Figuras 8A e 8B. Selos elastométricos (18) estavam presentes nos lados opostos do cartão de membrana centralizado e posicionado (10). Rodeando os selos elastométricos (18) estão quatro buracos (19), que proporcionam comunicação para o gás de plasma para acessar a membrana (14) para ser tratada. A fixação de mascaramento (12) foi subsequentemente fechada, conforme representado em uma vista em corte transversal na Figura 8B, para que os selos elastoméricos (18) sejam compressivamente selados contra os lados opostos da membrana (14) no cartão (10). Uma força, por exemplo, por meio de grampos, foi usada para fechar a fixação (12) ao cartão de suporte de amostra (10) contendo a membrana hidrofílica (14).

[97] O cartão (10) posicionado na fixação (12)

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36/46 foi subsequentemente colocado em um ambiente de plasma vácuo, a vista fechada em corte transversal da qual é representada na Figura 8B. Um sistema exemplar de plasma vácuo que pode ser usado é o sistema Harrick Vacuum Plasma Modelo PDC-001. A câmara (20) dentro do sistema foi evacuada de gás usando uma bomba a vácuo (não mostrada). Gás atmosférico foi introduzido à câmara (20), e mantido em uma taxa de fluxo de aproximadamente 2-5 cc/min. A energia de um gerador RF (não mostrado) foi aplicada e mantida por um período de tempo variando de 10 segundos a 7 minutos. A região da membrana (15) do cartão de suporte de amostra (10) entre os selos elastoméricos (18) foi protegida do plasma, enquanto o exterior restante foi exposto ao plasma, que é representado por pontos.

[98] O experimento de exposição ao plasma usando a fixação descrita nas Figuras 8A e 8B mostrou que um tempo de processamento maior que 1 minuto resultou em uma definição clara de região hidrofílica e hidrofóbica com uma borda afiada de transição ocorrendo na posição dos selos elastoméricos (18). Menos de 1 minuto de tempo de processamento de plasma resultou em uma borda de transmissão borrada para absolutamente nenhuma borda de transição, resultando em uma membrana permanecendo hidrofílica e a amostra que não foi contida.

[99] A Figura 9 representa um cartão de suporte de amostra (22) contendo uma membrana tendo uma região hidrofílica (24) rodeada por uma região hidrofóbica (26) feita usando o método descrito neste Exemplo. A fronteira

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entre as	duas	regiões é uma borda ou	linha	transitória
(28).
	[100]	Conforme discutido	acima,	é ainda
desejável	ter	amostras distribuídas	tão uniformemente

quanto possível dentro dos raios IV. Uma maneira de alcançar uma distribuição uniforme é a adição de um surfactante a uma amostra, como discutido acima. Outra maneira de alcançar uma distribuição uniforme é criar padrões/formas de áreas hidrofóbicas intercaladas com áreas hidrofílicas em uma membrana, como discutidas aqui.

[101] É entendido que uma gota de secagem depositará a amostra preferencialmente ao longo da borda externa da gota de secagem como é comumente observado com o fenômeno anel de café. Para minimizar este padrão de secagem, a região hidrofóbica rodeando a região hidrofílica pode ser ainda modificada. Isto pode ser alcançado, por exemplo, ao posicionar adequadamente os selos elastoméricos na membrana de uma maneira que resulte em um padrão da membrana dos locais ou linhas hidrofóbicos na área hidrofílica. Tal padrão é esperado para resultar em múltiplas gotas menores assim criando padrões menores e menores de secagem. Estes padrões menores de secagem depositam a amostra em uma configuração no raio IV. É entendido que as possíveis formas/padrões que podem ser configurados para a membrana pode ser na forma de linhas, pontos, formatos de estrela ou outros formatos comuns. Ademais, a região hidrofóbica externa também pode ter um formato tal como um formato de estrela etc. Padrões

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38/46 hidrofóbicos/hidrofílicos exemplares que podem ser gerados ao posicionar adequadamente os selos elastoméricos na fixação são representados nas Figuras 10A -10D. Regiões hidrofílicas são mostradas pela referência numérica 30 e as regiões hidrofóbicas são mostradas pela referência numérica 32.

Exemplo 9: Fabricação de cartão de suporte de amostra usando tratamento térmico para contenção de amostra [102] Em outro experimento, um cartão de suporte de amostra para uso em métodos IV de acordo com a presente invenção foi fabricado como segue, usando tratamento térmico como outro meio alternativo para alcançar contenção de amostra na membrana no cartão.

[103] Em um experimento exemplar, o molhamento de uma membrana PTFE hidrofílica foi alterado por exposição a uma mesa de prensa aquecida, a fim de criar uma região para contenção de amostra. A membrana PTFE hidrofílica que foi usada é vendida pela Sumitomo sob a marca Poreflon, tem um tamanho médio de poro de 0,05 pm (HHPSW-005-30) e é revestida com tratamento de hidrofilização para partilhar uma superfície permeável a água. Em geral, usando os métodos descritos neste exemplo, qualquer membrana Poreflon com tamanho médio de poro variando de 0,05 pm - 0,45 pm e espessura variando entre 30 pm a 80 pm podem ser modificadas usando uma mesa de prensa aquecida.

[104] Como no caso do Exemplo 8, a membrana PTFE hidrofílica foi fabricada em um cartão consistindo de

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39/46 folhas de papel adesivas revestidas que tinham quatro buracos de (4)10 mm. Duas folhas de papel foram montadas com a membrana hidrofílica Sumitomo imprensada entre as folhas, assim cobrindo os buracos no cartão de papel montado. Este cartão montado (34) contendo uma membrana hidrofílica (36) foi posicionado a uma fixação incrustada (38) que contém um cilindro pneumático (não mostrado) ligado a cal-rods (não mostrados) e uma mesa de prensa aquecida (42), conforme representado na Figura 11. O cilindro posiciona a mesa de prensa aquecida (42) na ou acima da membrana (36) no cartão de suporte de amostra (34) e as almofadas elastoméricas (44) em ninho (40) suporta a parte inferior da membrana (36). A mesa de prensa aquecida (42) contém bojos levantados (46) e o ninho (40) contem as almofadas elastoméricas (44), que se alinham com os bojos levantados (46), quando o cartão de suporte de amostra (34)

é colocado ali entre, o que resulta em regiões que	estão	em
contato	direto com	a mesa de	prensa aquecida (43)	para	se
tornar	hidrofóbica.
	[105]	Vistas em	corte transversal	aberto	e
fechado	da fixação	incrustada	em relevo/cartão/montagem	de

mesa de prensa aquecida são representadas nas Figuras 12A e 12B, respectivamente.

[106] Depois que a mesa de prensa aquecida (42) foi exposta à membrana (36) para uma quantidade fixa de tempo (por exemplo, 5 segundos a 5 minutos), o cilindro (não mostrado) moveu a mesa de prensa aquecida (42) para longe do cartão de membrana (34).

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40/46 [107] Como também no caso do Exemplo 8, a forma de área contida pode ser modificada. Em caso de um tratamento térmico, a forma da área contida pode ser controlada pela forma dos bojos levantados e almofadas elastoméricas que estão em estreita proximidade à membrana, de forma que as porções da membrana em contato com os bojos levantados da mesa de prensa aquecida se tornaram hidrofóbicos, enquanto que as porções que não estão em contato com a mesa de prensa aquecida permanecem hidrofílicas.

[108] A fim de confirmar que a área hidrofóbica usando tanto o tratamento de plasma descrito no Exemplo 8 ou usando tratamento térmico descrito no Exemplo atual, foi eficaz ao conter a amostra, as propriedades da amostra de contenção ou ambos calor ou membranas de plasma tratadas e não tratadas foram investigados usando água como uma amostra. As Figuras 13A -13B representam as propriedades da amostra de contenção de uma membrana não sujeita a calor ou tratamento de plasma e as Figuras 13C e 13D representam as propriedades da amostra de contenção de uma membrana que foi sujeita seja a tratamento térmico ou tratamento de plasma. Um volume de 2 μΐ de água como amostra (50) foi manchado à membrana hidrofílica (52) de um cartão de suporte de amostra (54). A Figura 13A representa a amostra de água (50) em tempo zero e a Figura 12B representa a amostra de água (50) em tempo de 30 segundos.

Conforme mostrado na Figura 13B, a amostra de água espalhada através da área de membrana, que resultou na área

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41/46 molhada sendo maior em diâmetro que o diâmetro de um raio IV. Enquanto que, no caso do tratamento térmico de membrana ou membrana de plasma tratado nas Figuras 13C e 13D, ambos em tempo zero (Figura 13C) bem como em 30 segundos (Figura 13D), a amostra de água (50) foi contida na região hidrofílica (56) da membrana rodeada por uma região de barreira hidrofóbica (58). Da mesma forma, calor ou tratamento de plasma, conforme descrito aqui, pode ser usado para gerar uma região interna hidrofílica (56)

rodeada (56).	por uma	região	externa	de barreira	hidrofóbica
Exemplo	10: Distribuição	uniforme	de amostra	através de
ruptura	química ou	física
	[109]	Foi observado	que, secar	uma amostra

biológica aquosa para análise FTIV muitas vezes resulta em um padrão desigual de distribuição de amostra, com concentração mais alta da amostra na borda externa da área de amostra, assim formando o chamado “anel de café” ou “anel de rosquinha, que pode resultar em quantificação imprecisa.

[110] Em um experimento representativo descrito aqui, o uso de um surfactante ou um detergente resultou em uma distribuição mais uniforme de amostra fazendo a amostra secar em um padrão mais uniforme na área de contenção da amostra, conforme representado na Figura 14A. Ademais, a adição de um padrão de barreira hidrofóbica (por exemplo um padrão cruz X) na área de amostra pode fazer com que a amostra seque mais em direção ao centro da

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42/46 área padrão, conforme demonstrado na Figura 14B, resultando em uma distribuição de amostra próxima dos efeitos de usar um aditivo surfactante. A distribuição da amostra ou rompimento do “anel de café” resultaram em uma concentração mais alta e um percentual mais baixo de coeficiente de variação (%CV).

[111] Exemplos de surfactantes que podem ser usados incluem, mas não se limitam a, Tween 20 e dodecil sulfato de sódio (SDS). Em um experimento, o padrão anel de uma amostra de Citocromo C seco foi mostrado para variar com base na solução na qual a amostra foi dissolvida (por exemplo, PBS contra H2O). As diferenças na distribuição de amostra no raio IV pode influenciar a transmissão do raio de IV através da amostra. A fim de romper o padrão anel, resultando em uma distribuição mais uniforme da amostra, detergentes ou surfactantes podem ser adicionados à amostra, ou diretamente à membrana na qual a amostra é manchada e seca.

[112] Na Tabela I abaixo, a área de pico de amida 1&2 de proteína Citocromo C foi calculada na ausência (H2O apenas) e presença de SDS (1 e 5%). A adição de SDS resultou em um aumento de área de amostra calculada bem como uma diminuição no coeficiente por cento de variação (%CV) (por exemplo, de 9,1 a 2,3%).

[113] A Figura 15 representa uma representação de gráfico de barras dos dados tabulados, mostrada nas Tabelas 1 e 2 abaixo. O aumento em valor de amostra e diminuição em %CV com a adição do SDS é devido a

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43/46 uma distribuição mais uniforme de amostra (mais amostra está dentro do total de raio IV) e menos variabilidade está presente entre amostras (distribuição uniforme de amostra verso diferenças em caso de formação-anel).

[114] As áreas de pico Amida nas Tabelas 1 e 2, coluna B, foram calculadas usando software OPUS 6,5 (Bruker). O valor médio foi calculado bem como o %CV. SDS (1 e 5%|) foi adicionado às amostras e a área de pico e %CV foi reanalizado.

TABELA 1
Proteína	Quant. [mg/ml]	Volum e (ul)	Aditi vo	Quan t.	Amostr a	B Amida 1&2
Citocrom o C	10	2	d H2O		1	6,137
Citocrom o C	10	2	d H2O		2	5,225
Citocrom o C	10	2	d H2O		3	5,309
						5,557	= Média
0,504	_ Desenv. padrão
9.1	= % CV
Citocrom o C	10	2	SDS	1	1	9,969
Citocrom o C	10	2	SDS	1	2	9,525
Citocrom o C	10	2	SDS	1	3	9,802
						9,765	= Média
0,224	_ Desenv. padrão
2,3	= % CV
Citocrom o C	10	2	SDS	5	1	24,15 6
Citocrom	10	2	SDS	5	2

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o C						24,04 5
Citocrom o C	10	2	SDS	5	3	22,74 5
						23,64 9	= Média
0,785	_ Desenv. padrão
3,3	= % CV

TABELA 2
Proteína	Quant. [mg/ml]	Volum e (ul)	Modificaçã o	Amostr a	Amida 1&2
Citocrom o C	10	5		1	21,35 2
Citocrom o C	10	5		2	20,78 3
Citocrom o C	10	5		3	24,80 2
					22,31 2	= Média
2,175	_ Desenv. padrão
9.7	= % CV
Citocrom o C	10	5	x	1	24,52 6
Citocrom o C	10	5	x	2	23,59 9
Citocrom o C	10	5	x	3	23,87 7
					24,00 1	= Média
	= Desenv.

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0,476	padrão
2,0	= % CV

[115] Os conteúdos de todas as referências, patentes e pedidos de patentes publicados citados neste pedido são incorporados a este por referência.

[116] A especificação é mais completamente entendida em vista dos ensinamentos das referências citadas na especificação que são ora incorporadas por referência. As corporificações na especificação proporcionam uma ilustração de corporificações nesta invenção e não devem ser interpretadas para limitar seu escopo. O perito na arte prontamente reconhece que muitas outras corporificações são abrangidas por esta invenção. Todas as publicações e invenções são incorporadas por referência em sua totalidade. Na medida em que o material incorporado por referência contradiz ou é inconsistente com a presente especificação, a presente especificação substituirá qualquer referido material. A citação de quaisquer referências aqui não é uma admissão de que tais referências são estado da técnica à presente invenção.

[117] Salvo se de outra forma indicado, todos os números expressando quantidades de ingredientes, cultura de células, condições de tratamento, e assim por diante usados na especificação, incluindo reivindicação, devem ser entendidos como sendo modificados em todas as instâncias pelo termo “cerca de”. Da mesma forma, salvo se de outra forma indicado em contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podem variar dependendo das propriedades desejadas para ser obtidas pela presente invenção. Salvo se

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46/46 indicado de outra forma, o termo “pelo menos” precedendo uma série de elementos deve ser entendido para se referir a cada elemento na série. Aqueles técnicos no assunto reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes às corporificações específicas da invenção descritas aqui. Tais equivalentes são destinados a ser abrangidos pelas seguintes reivindicações.

[118] Muitas modificações e variações desta invenção podem ser feitas sem se afastar de seu espírito e escopo, e serão aparentes àqueles técnicos no assunto. As corporificações específicas descritas aqui são oferecidas a título de exemplo apenas e não se destinam a serem limitativas de qualquer forma. Pretende-se que a especificação e exemplos sejam considerados como exemplares apenas, com um verdadeiro escopo e espírito da invenção sendo indicados pelas seguintes reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV) compreendendo as etapas de:

(a) fornecer um suporte de amostra tendo uma membrana porosa com uma região hidrofílica rodeada por uma região hidrofóbica para contenção de amostra;

(b) contatar a região hidrofílica da membrana com um volume de amostra;

(c) secar o volume de amostra na membrana;

caracterizado por compreender adicionalmente as etapas de:

(d) expor o volume de amostra na membrana a um raio infravermelho compreendendo um comprimento de onda na gama espectral de 4000-400 cm-¹ ou qualquer porção da gama espectral de 4000-400 cm-i, para assim obter um espectro de absorção infravermelho; e

i) em que uma ou mais áreas de pico de absorção no espectro de absorção de infravermelho se correlaciona com a quantidade de uma ou mais biomoléculas na amostra.
2) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV) , de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por uma ou mais biomoléculas ser selecionada de um grupo consistindo de ácidos nucleicos, proteínas, lipídeos, polissacarídeos e lipopolissacarídeos.
3) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV) , de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o lipopolissacararídeo ser uma endotoxina.

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4) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por não exigir um usuário para gerar uma curva de calibração cada vez que uma amostra é analisada para quantificação de uma ou mais biomoléculas.
5) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o volume de amostra variar de 0,1-20μ1.
6) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de o volume de amostra ser 1 μ1 ou menos.
7) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a membrana porosa estar contida em um dispositivo.
8) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por pelo fato de o dispositivo ser um cartão de suporte de memória.
9) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a amostra compreender um fluido biológico.

10) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de o fluido biológico ser selecionado do grupo consistindo em sangue, plasma, soro e

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3/5 urina.

11) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV) , de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a amostra compreender célula lisada ou tecido l isado. 12) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV) , de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a amostra ser uma amostra crua. 13) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV) , de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por pelo fato de o cartão de suporte de

amostra compreender uma membrana porosa com uma área dentro da qual a amostra está contida na membrana.

14) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a membrana porosa ser uma membrana de ultrafiltração.
15) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo fato de a membrana porosa ser uma membrana microporosa.
16) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a membrana porosa compreender um material polimérico selecionado do grupo consistindo de PVDF (fluoreto de polivinilideno), politetrafluoretileno, politetrafluoretileno hidrofílico, polietileno e polipropileno.
17) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM

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4/5

INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de a área de contenção de amostra na membrana compreender uma região hidrofílica rodeada por uma região hidrofóbica.
18) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por pelo fato de a região hidrofílica ser criada pelo tratamento de plasma de uma membrana hidrofílica porosa.
19) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de a amostra estar contida na região hidrofílica.
20) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de a região hidrofílica ser criada pelo tratamento térmico de uma membrana hidrofílica porosa.
21) DISPOSITIVO para uso no método descrito nas reivindicações de 1 a 20, 22 e 24, caracterizado por compreender um cartão de suporte de amostra tendo uma membrana porosa que inclui uma região hidrofílica rodeada por uma região hidrofóbica, em que a amostra está contida nos limites da região hidrofílica.
22) DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de o diâmetro da região hidrofílica variar de 2,0 a 10mm.
23) DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de o diâmetro da região hidrofílica

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5/5 varia de 3,0 a 6 mm.
24) MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO BIOMOLECULAR BASEADOS EM INFRAVERMELHO (IV), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de:

(d) detectar a presença de água na membrana usando absorção infravermelha e repetindo a etapa (c), se necessário, até que nenhuma água seja detectada.