ES2661322T3

ES2661322T3 - Dispositivos y métodos para cuantificación de biomoléculas basada en infrarrojos (IR)

Info

Publication number: ES2661322T3
Application number: ES12162822.6T
Authority: ES
Inventors: Elena Chemokalskaya; Vivek Joshi; Phillip Clark; Christopher Utzat; Ryan Amara; Timothy Scott Rider
Original assignee: EMD Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 2011-04-14
Filing date: 2012-04-02
Publication date: 2018-03-28
Anticipated expiration: 2032-04-02
Also published as: KR101635802B1; EP2511692A2; AU2012202079B2; BR102012008874A2; CN105466879B; SG185189A1; EP2511692A3; BR102012008874B1; JP5723319B2; WO2012141831A9; JP2012225910A; WO2012141831A1; AU2012202079A1; US20130062523A1; IN2012DE01026A; EP2511692B1; US9018584B2; CN102901712B; KR20120117642A; CN102901712A

Abstract

Un método para la cuantificación de una o más biomoléculas en una muestra (50), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un contenedor (22) de muestras que comprende una membrana (14) porosa que comprende una región (24) hidrófila rodeada por una región (26) hidrófoba para la contención de la muestra, en donde la región hidrófoba se crea por tratamiento con plasma de una membrana porosa hidrófila o bien en donde la región hidrófoba se crea por tratamiento con calor de una membrana porosa hidrófila; (b) poner en contacto la región hidrófila de la membrana con un volumen de muestra, en donde la región hidrófila tiene un diámetro; (c) secar el volumen de muestra sobre la membrana; y (d) exponer el volumen de muestra sobre la membrana a un haz de infrarrojos que tiene un diámetro igual a o más grande que el diámetro de la región hidrófila, y que comprende una longitud de onda en el intervalo espectral de 4.000-400 cm-1 o cualquier porción del intervalo espectral de 4.000-400 cm-1, para obtener de este modo un espectro de absorción de infrarrojos; en donde una o más áreas de picos de absorción en el espectro de absorción de infrarrojos se correlaciona con la cantidad de la una o más biomoléculas en la muestra.

Description

Dispositivos y métodos para cuantificación de biomoléculas basada en infrarrojos (IR)

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de EE.UU. Nº 61/475.434, presentada el 14 de abril de 2011.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de los métodos espectrofotométricos de infrarrojos para la cuantificación de analitos en una muestra y dispositivos para uso en los métodos.

Antecedentes

La espectroscopía de infrarrojos (IR) es una herramienta analítica usada habitualmente en los laboratorios de investigación para análisis de muestras. La región IR del espectro electromagnético se extiende desde el extremo inferior de la región visible (número de ondas de aproximadamente 14.300 cm-1) hasta la región de microondas (cerca de 20 cm-1). Habitualmente, para que una molécula absorba IR, las vibraciones o rotaciones dentro de la molécula deben causar un cambio neto en el momento dipolar de la molécula. El campo eléctrico alternante de la radiación interactúa con las fluctuaciones en el momento dipolar de la molécula y, si la frecuencia de la radiación concuerda con la frecuencia vibracional de la molécula, entonces la radiación es absorbida, causando de este modo un cambio en la amplitud de la vibración molecular.

Típicamente, para el análisis cuantitativo de biomoléculas, p.ej., proteínas, las técnicas usadas más habitualmente son técnicas colorimétricas (p.ej., el ensayo del azul de Coomasie, el ensayo de Lowry, el ensayo BCA y el ensayo de Proteínas Pierce 660) y técnicas espectroscópicas de UV (p.ej., absorción a 280 nm). En el caso de la mayoría de los métodos de cuantificación conocidos en la técnica, un usuario necesita generar una curva de calibración usando un calibrante, que típicamente es la misma molécula que el analito que se cuantifica, cada vez que un usuario lleva a cabo la cuantificación.

Un artículo de Emanuel Carrilho et al. titulado “Paper Microzone Plates” publicado en Analytical Chemistry, vol. 81, nº 15, 1 de agosto de 2009, páginas 5990-5998, se refiere a placas de microzonas de papel, fabricadas haciendo patrones en láminas de papel usando fotolitografía en zonas hidrófilas rodeadas por barreras poliméricas hidrófobas.

El documento JP 2010008290 describe un tratamiento localizado de membranas para potenciar la inmovilización de biomoléculas a la membrana. Se aplica un tratamiento hidrófilo a una membrana hidrófoba para formar la región inmovilizante de biopolímero.

Compendio de la invención

Según la invención, se proporciona un método para la cuantificación de una o más biomoléculas en una muestra, comprendiendo el método las etapas de:

(a): proporcionar un contenedor de muestras que comprende una membrana porosa que comprende una región hidrófila rodeada por una región hidrófoba para la contención de la muestra; en donde la región hidrófoba se crea por tratamiento con plasma de una membrana porosa hidrófila o bien en donde la región hidrófoba se crea por tratamiento con calor de una membrana porosa hidrófila;

(b): poner en contacto la región hidrófila de la membrana con un volumen de muestra, en donde la región hidrófila tiene un diámetro;

(c): secar el volumen de muestra sobre la membrana; y

(d): exponer el volumen de muestra sobre la membrana a un haz de infrarrojos que tiene un diámetro igual a o más grande que el diámetro de la región hidrófila, y que comprende una longitud de onda en el intervalo espectral de 4.000-400 cm-1 o cualquier porción del intervalo espectral de 4.000-400 cm-1, para obtener de este modo un espectro de absorción de infrarrojos;

en donde una o más áreas de picos de absorción en el espectro de absorción de infrarrojos se correlaciona con la cantidad de la una o más biomoléculas en la muestra.

Preferiblemente, la una o más biomoléculas se selecciona del grupo que consiste en ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, polisacáridos y lipopolisacáridos, opcionalmente una endotoxina.

Convenientemente, el método no requiere que un usuario genere una curva de calibración cada vez que se analiza una muestra para la cuantificación de la una o más biomoléculas.

Preferiblemente, el volumen de muestra varía de 0,1-20 μl y opcionalmente, 1 μl o menos.

Convenientemente, la membrana porosa está contenida dentro de un dispositivo.

Preferiblemente, el dispositivo es una tarjeta contenedora de muestras, que comprende una membrana porosa que comprende un área dentro de la que la muestra está contenida sobre la membrana.

Convenientemente, la muestra comprende un fluido biológico y, opcionalmente, el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma, suero y orina.

Preferiblemente, la muestra comprende un lisado celular o tisular, opcionalmente una muestra bruta.

Convenientemente, la membrana porosa es una membrana de ultrafiltración o una membrana microporosa.

Preferiblemente, la membrana porosa comprende un material polimérico seleccionado del grupo que consiste en PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)), poli(tetrofluoroetileno), poli(tetrofluoroetileno) hidrófilo, polietileno y polipropileno.

Convenientemente, el método comprende además la etapa de detectar la presencia de agua sobre la membrana usando absorbancia de infrarrojos y repitiendo la etapa (c), si fuera necesario, hasta que no se detecte agua.

Preferiblemente, el diámetro de la región hidrófila varía de 2,0 mm a 10 mm.

Convenientemente, el diámetro de la región hidrófila varía de 3,0 mm a 6 mm.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una curva de calibración ilustrativa generada para el uso en tiempos futuros. Se usó BSA para generar una curva de calibración en un día (línea de puntos). Se creó una muestra de BSA de 4 mg/ml días después (p.ej., 4 días después en este caso) y se confrontó con la curva de calibración generada previamente.

La Figura 2 es una representación esquemática de un contenedor de muestras ilustrativo. El contenedor de muestras ilustrativo es una tarjeta que incluye 4 puntos de membrana diferentes, que comprenden cada uno una región hidrófila rodeada por una región hidrófoba para aplicar un volumen de disolución de la muestra. Los puntos denominados puntos de muestra 1, 2 y 3, están destinados a depositar un volumen de muestra que contiene una biomolécula de interés en un tampón adecuado, mientras que el Punto B se usa para depositar un volumen de una disolución en blanco o tampón solo. Los volúmenes de muestra depositados sobre los puntos 1, 2 y/o 3 podrían representar la misma disolución de muestra o constituir disoluciones de muestras diferentes.

La Figura 3 es un espectro de absorción de infrarrojos que representa los resultados de un experimento representativo para cuantificar proteína y ácido nucleico en la misma muestra. La proteína usada en este experimento fue BSA. El eje X representa el número de ondas en cm-1 y el eje Y representa las unidades de absorbancia. El gráfico demuestra que pueden ser cuantificados tanto ADN como proteína (es decir, BSA) en la misma muestra usando el método basado en IR según la presente invención.

La Figura 4 es un espectro de absorción de infrarrojos que representa los resultados de un experimento representativo para cuantificar péptido en una muestra. Se usó BSA como patrón de proteína en este experimento de cuantificación. El eje X representa el número de ondas en cm-1 y el eje Y representa las unidades de absorbancia.

La Figura 5 es un espectro de absorción de infrarrojos que representa los resultados de un experimento para cuantificar un lipopolisacárido (LPS) en aguapara cuantificar un lipopolisacárido (LPS) en agua, que es una endotoxina. El eje X representa el número de ondas en cm-1 y el eje Y representa las unidades de absorbancia. El espectro demuestra que la intensidad espectral disminuye según disminuye la concentración de LPS en agua de 20 μg/μl a 0,2 μg/μl. Además, usando este experimento se genera una curva de calibración usando LPS, y se usa para la cuantificación posterior de endotoxinas.

La Figura 6 es un espectro de absorción de infrarrojos que representa los resultados de un experimento para monitorizar/medir/detectar la presencia de agua en una muestra. El eje X representa el número de ondas en cm-1 y el eje Y representa las unidades de absorbancia. Como se representa en el espectro, cuando está presente agua en la muestra, hay una interferencia espectral del estiramiento y la flexión de enlaces vibracional asociados con los enlaces -OH del agua, lo que interfiere con la resolución de los enlaces amida de la proteína. Sin embargo, según se seca la muestra y se evapora el agua, la intensidad espectral asociada con el agua disminuye, como se representa también en el espectro.

La Figura 7 representa un gráfico que demuestra una distribución y perfil de absorción más uniformes de una muestra, cuando se añade un tensioactivo (p.ej., SDS) a la muestra. El eje X representa el número de ondas en cm-1 y el eje Y representa las unidades de absorbancia.

Las Figuras 8A y 8B representan vistas abierta y cerrada, respectivamente, de un ensamblaje de un elemento fijo y una tarjeta contenedora de muestras para uso en la contención de una muestra basada en plasma. La Figura 8A representa una configuración abierta de una tarjeta contenedora de muestras totalmente ensamblada y los dos lados de un elemento fijo. La Figura 8B representa una vista esquemática en sección transversal cerrada de un montaje de

una tarjeta contenedora de muestras y un elemento fijo dentro de un entorno de plasma a vacío, donde el área de la membrana sobre la tarjeta contenedora de muestras que se desea que sea hidrófoba es expuesta al tratamiento con plasma, mientras que la región hidrófila sobre la que se deposita una muestra está protegida del tratamiento con plasma.

La Figura 9 representa la vista esquemática de una tarjeta contenedora de muestras posteriormente al tratamiento con plasma. El área hidrófila representa la región protegida de la membrana, que está rodeada por un área hidrófoba que fue expuesta al tratamiento con plasma.

Las Figuras 10A-10D representan formas/patrones ilustrativos de regiones hidrófobas e hidrófilas dentro de una membrana de una tarjeta contenedora de muestras, que pueden ser creados posicionando adecuadamente los sellos elastoméricos (en caso del método de tratamiento con plasma) o por la forma de la platina calentada (en caso del método de tratamiento con calor).

La Figura 11 es una vista expandida de un sistema de elemento fijo y tarjeta contenedora de muestras embutibles para generar un área de contención de muestras hidrófoba dentro de la membrana, que incluye una platina calentada y una base de silicona.

Las Figuras 12A y 12B representan vistas en sección transversal abierta y cerrada, respectivamente, de un sistema cabezal/platina calentada embutibles, después de colocarse la tarjeta contenedora de muestras en el sistema.

Las Figuras 13A-13D representan los resultados de un experimento para mostrar que una membrana retiene una muestra (p.ej., agua) dentro del área de contención de muestras posteriormente a un tratamiento con calor, como se muestra en la Figura 13C (en 0 segundos) y la Figura 13D (en 30 segundos) en relación a una membrana que no fue sometida a tratamiento con calor, como se muestra en la Figura 13A (en 0 segundos) y la Figura 13B (en 30 segundos).

Las Figuras 14A y 14B representan los efectos de una disrupción química y física, respectivamente, sobre el patrón de deposición de “anillo de café” de la muestra. La Figura 14A representa una distribución de la muestra uniforme aumentada por disrupción química cuando se añade un detergente (SDS) a la muestra. Se colocó citocromo C (10 mg/ml), disuelto tanto en agua como en Suero Salino Tamponado con Fosfato (PBS) sobre una membrana de PTFE hidrófila (2 y 5 ul) y se secó. La adición de SDS a la muestra da como resultado una distribución más uniforme de la muestra (PBS + SDS no mostrados). La Figura 14B representa la disrupción física de la distribución de la muestra (cambiando barreras hidrófobas) dando como resultado múltiples “anillos de café” y más muestra en el centro del área de la muestra.

La Figura 15 es un gráfico de barras que representa el efecto de la adición de SDS a una muestra. Se añadió SDS (1 y 5%) a muestras de Citocromo C y se secaron. La adición de SDS dio como resultado un aumento en el área de pico respectiva.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método para la cuantificación de una o más biomoléculas en una muestra usando espectroscopía de infrarrojos (IR).

A fin de que la presente descripción pueda ser entendida más fácilmente, se definen primero ciertos términos. Se exponen definiciones adicionales en toda la descripción detallada.

I. Definiciones

El término “cuantificar”, “cuantificación”, “medir” o “medida”, como se emplea de manera intercambiable en la presente memoria, se refiere a la determinación de la cantidad o concentración de un analito en una muestra, usando el método según la invención reivindicada. El término “analito”, como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier molécula de interés que es deseable cuantificar usando los métodos descritos en la presente memoria. En diversas realizaciones, un analito es una biomolécula.

El término “biomolécula”, como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier material biológico de interés que es deseable cuantificar usando los métodos según la invención reivindicada. Las biomoléculas ilustrativas incluyen proteínas, péptidos, moléculas de ácidos nucleicos, que incluyen ADN y ARN, lípidos, carbohidratos y endotoxinas (p.ej., lipopolisacárido). Se contempla que cualquier biomolécula puede ser cuantificada usando los métodos según la invención reivindicada, siempre y cuando la biomolécula sea capaz de absorber en el intervalo infrarrojo del espectro electromagnético.

El término “muestra”, como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier medio que incluye un analito (p.ej., una biomolécula) para ser cuantificado usando los métodos según la presente invención. Una muestra puede incluir, pero no se limita a, p.ej., una sustancia alimenticia (p.ej., aves de corral, carne fresca, leche, yogur, productos lácteos, productos de panadería, bebidas, cerveza, limonada, zumos, quesos, verduras, fruta, pescado, etc.), un cuerpo de agua o aguas residuales (p.ej., estanque, lago, río, océano, canales de aguas residuales, agua potable,

etc.), un espécimen clínico (p.ej., sangre, plasma, suero, esputo, tejido, orina, saliva, muestra/fluido del tracto respiratorio, etc.), tierra, y productos cosméticos y farmacéuticos (p.ej., lociones, cremas, pomadas, soluciones, medicinas, gotas oculares y óticas, etc.). En una realización particular, una muestra comprende un lisado celular o tisular. En diversas realizaciones de la invención reivindicada, una muestra puede constituir una muestra bruta, es decir, no requiere ninguna preparación o tratamiento antes del uso en los métodos reivindicados.

En algunas realizaciones, se pipetea o deposita un pequeño volumen de muestra (p.ej., 0,1-20 μl) sobre la región hidrófila de una membrana contenida en un contenedor de muestras (p.ej., en la forma de una tarjeta) y posteriormente se seca, seguido de exponer la muestra a espectroscopía basada en IR. El volumen de muestra sobre la tarjeta puede ser secado usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, el volumen de muestra puede ser secado al aire o secado usando un calentador de convección o una estufa convencional o incluso un horno de microondas. Se contempla que, en algunas realizaciones, esté incorporado un mecanismo de secado en el sistema IR. En general, es deseable que no haya trazas de agua presentes en un volumen de muestra antes de la cuantificación, ya que el agua puede presentar un obstáculo para obtener una cuantificación exacta.

En algunas realizaciones de los métodos reivindicados, una membrana sobre la que se deposita un volumen de muestra es sometida a una etapa de secado, seguido del uso de absorbancia de infrarrojos para detectar la presencia de agua. Si se detecta agua, la membrana se somete a una etapa de secado de nuevo, y la etapa de secado se repite hasta que la presencia de agua sea indetectable. Típicamente, que no haya ningún cambio adicional en absorbancia después de una etapa de secado es indicativo de que la presencia de agua es indetectable, o, en otras palabras, la muestra está suficientemente seca para el análisis IR.

Los métodos según la invención reivindicada permiten el uso de un volumen de muestra muy pequeño para conseguir una cuantificación exacta de un analito en la muestra. En diversas realizaciones el volumen de muestra es aproximadamente 0,05 μl, 0,1 μl o 0,2 μl o 0,3 μl o 0,4 μl o 0,5 μl o 0,6 μl o 0,7 μl o 0,8 μl o 0,9 μl o 1,0 μl o 1,5 μl o 2 μl o 2,5 μl o 3 μl o 3,5 μl o 4 μl o 4,5 μl o 5 μl o 5,5 μl o 6 μl o 6,5 μl o 7μl o 7,5 μl o 8μl o 8,5 μl o 9μl o 9,5 μl o 10μl

: o 10,5 μl o 11μl o 11,5 μl o 12 μl o 12,5 μl o 13 μl o 13,5 μl o 14 μl o 14,5 μl o 15μl o 15,5 μl o 16μl o 16,5 μl o 17μl

: o 17,5 μl o 18 μl o 18,5 μl o 19 μl o 19,5 μl o 20 μl o mayor que 20 μl. Aunque los dispositivos y métodos descritos en la presente memoria facilitan el uso de volúmenes muy pequeños para la cuantificación de una o más biomoléculas, a fin de aumentar el límite inferior de detección y cuantificación usando los métodos descritos en la presente memoria, pueden aplicarse múltiples alícuotas de un volumen de muestra a la tarjeta contenedora de muestras, con secado del volumen de muestra entre las alícuotas. Por ejemplo, en el caso de muestras que contienen niveles muy bajos de analitos, que pueden ser difíciles de detectar o indetectables usando los métodos descritos en la presente memoria, pueden depositarse múltiples alícuotas de un cierto volumen de muestra (p.ej., 10-20 μl) sobre la tarjeta contenedora de muestras, con secado del volumen de muestra entre las diferentes alícuotas. Por lo tanto, aunque sólo se deposita un pequeño volumen de 10-20 μl sobre la tarjeta contenedora de muestras en cada aplicación, podría aplicarse un volumen de muestra total de 50 μl a 100 μl o más en total en las aplicaciones múltiples del volumen de muestra, con secado de cada volumen de muestra entre las aplicaciones.

En algunas realizaciones, se aplica un volumen de muestra de 100 μl o más a la tarjeta contenedora de muestras aplicando un volumen de muestra de 20 μl a la tarjeta y secando la tarjeta. Una vez que el volumen de muestra está completamente seco, pueden aplicarse 20 μl adicionales de volumen de muestra a la tarjeta contenedora de muestras y la tarjeta puede secarse de nuevo. Este proceso puede ser repetido múltiples veces para depositar el volumen de muestra requerido sobre la tarjeta. La ventaja de esta técnica es que aumenta el límite de la detección/cuantificación del analito.

Como se emplea en la presente memoria, el término “lisar”, “lisis” o “lisado” se refiere a cualquier medio por el que una célula o tejido puede romperse y abrirse, p.ej., comprometiendo la membrana celular y causando posiblemente que el contenido de la célula sea liberado. Los métodos ilustrativos que pueden usarse para lisar una célula o tejido incluyen, pero no se limitan a, métodos enzimáticos, ultrasonidos, acción mecánica (p.ej., cizallamiento e impactación) y métodos químicos.

Como se emplea en la presente memoria, el término “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico” se refiere a cualquier cadena de dos o más nucleótidos, nucleósidos o nucleobases (p.ej., desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos) unidos covalentemente entre sí. En algunas realizaciones, una biomolécula que se cuantifica usando los métodos según la invención reivindicada es una molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, genomas víricos, o porciones de los mismos, ADN o bien ARN, genomas bacterianos, o porciones de los mismos, genomas fúngicos, vegetales o animales, o porciones de los mismos, ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ARNr), ARN de transferencia (ARNt), ADN plasmídico, ADN mitocondrial, o ADN o ARN sintético. Una molécula de ácido nucleico puede estar provista en una forma lineal (p.ej., ARNm), circular (p.ej., plásmido), o ramificada, así como una forma de doble hebra o de hebra simple. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden incluir bases modificadas para alterar la función o comportamiento del ácido nucleico, p.ej., la adición de un didesoxinucleótido 3’-terminal para bloquear que se añadan nucleótidos adicionales al ácido nucleico.

El término “longitud de onda” se refiere generalmente a la distancia entre un pico o cresta de una onda y el siguiente pico o cresta. Es igual a la velocidad de la onda dividida por su frecuencia, y a la velocidad de una onda multiplicada

por su periodo. La longitud de onda es una característica tanto de ondas viajeras como de ondas estacionarias, así como de otros patrones de onda espaciales. La longitud de onda se designa habitualmente por la letra griega lambda (λ). Suponiendo que una onda sinusoidal se está moviendo a una velocidad de onda fija, la longitud de onda es inversamente proporcional a la frecuencia de la onda. Por lo tanto, las ondas con frecuencias más altas tienen longitudes de onda más cortas, y las ondas con frecuencias más bajas tienen longitudes de onda más largas.

El término “número de ondas” es una propiedad de una onda proporcional al inverso de su longitud de onda. Se mide generalmente en unidades de cm-1, y puede definirse por el número de longitudes de onda por unidad de distancia, es decir, 1/λ, donde λ es la longitud de onda.

El término “área de pico de absorción” o “áreas de picos de absorción”, como se emplea en la presente memoria, se refiere a una o más partes de un espectro de absorción de infrarrojos observado después de la exposición de una muestra a espectroscopía IR, como se describe en la presente memoria. Una vez que se obtiene un espectro de absorción de infrarrojos usando los métodos basados en IR descritos en la presente memoria, se calcula el área bajo uno o más picos en el espectro dibujando una línea de base a través del pico y midiendo el área encerrada en el pico. La línea de base se dibuja típicamente en base a puntos antes y después del pico en el espectro, como se muestra en la Figura 16.

En algunas realizaciones según los métodos reivindicados, un área de pico se correlaciona con la concentración o cantidad de un analito en una muestra.

En algunas realizaciones, la concentración de proteína en una muestra se mide como sigue. Como primera etapa, se genera una curva de calibración usando un calibrante, que incluye patrones de la proteína de concentración conocida, y la curva de calibración se precarga sobre un instrumento espectrómetro IR. Puede usarse posteriormente la misma curva de calibración cada vez que se use el instrumento para cuantificar la proteína en una muestra. Además, no se requiere que el calibrante esté presente en la muestra que se analiza, o, en otras palabras, podría derivarse de una fuente completamente diferente a la muestra. Por ejemplo, en una realización particular, se preparan en un tampón disoluciones de una proteína patrón tal como, por ejemplo, BSA, en diversas concentraciones conocidas. Las disoluciones del patrón se aplican a la región hidrófila de una membrana en un contenedor de muestras en la forma de una tarjeta, se seca la membrana y se mide el espectro de absorción usando un instrumento IR, p.ej., el instrumento IR Bruker. Sin desear estar limitados por la teoría, se contempla que puede usarse cualquier instrumento IR adecuado en los métodos según la presente invención.

La mayoría de los instrumentos de absorción IR modernos usan técnicas de transformada de Fourier con un interferómetro Michelson. En algunas realizaciones según los métodos reivindicados, para obtener un espectro de absorción IR, un espejo del interferómetro se mueve para generar interferencia en la radiación que alcanza el detector. Dado que todas las longitudes de onda están pasando a través del interferómetro, el interferograma es un patrón complejo. El espectro de absorción en función del número de ondas (cm-1) se obtiene a partir de la transformada de Fourier del interferograma, que es función del movimiento del espejo (cm). Este diseño no tiene la celda de referencia de un instrumento dispersivo, con lo que se registra un espectro de referencia y se almacena en la memoria para restarlo del espectro de la muestra.

Otros instrumentos de absorción IR ilustrativos incluyen instrumentos de absorción IR dispersivos e instrumentos IR de longitud de onda única. Los espectrómetros IR dispersivos usan filtración por difracción en un monocromador, a fin de dispersar las diferentes longitudes de onda de la luz. En general, los espectrómetros IR dispersivos han sido reemplazados por instrumentos FTIR. Pueden usarse instrumentos IR de longitud de onda única para monitorizar una única longitud de onda IR para medir la cinética de una reacción rápida.

En algunas realizaciones según la invención reivindicada, se usa un instrumento FTIR para la cuantificación de una

o más biomoléculas. El área bajo la curva que abarca picos de amida I y amida II (1.800-1.450 cm-1) se calcula mediante el programa informático incorporado en el instrumento. Por ejemplo, el espectrómetro IR Bruker incluye el programa informático Bruker Opus. Después se establece una curva de calibración que representa gráficamente el área bajo el pico frente a la concentración del patrón de proteína. Usando la curva de calibración generada por el patrón de concentración conocida, se mide posteriormente la concentración de un analito en una muestra.

En general, una curva de calibración se refiere a una presentación gráfica de la relación funcional entre el valor esperado de la señal observada a la cantidad o concentración de analito. Típicamente, se usan patrones que abarcan un intervalo de concentraciones conocidas de un calibrante para generar una curva de calibración. El espectro obtenido con la muestra se compara después con los patrones para obtener la concentración del analito deseado.

En algunas realizaciones según los métodos descritos en la presente memoria, los métodos incluyen además una etapa de monitorizar/detectar la absorción por el agua en la muestra. El agua absorbe a ~3.400 y 1.600 cm-1 , solapándose de este modo con el espectro obtenido con muchas biomoléculas. En algunas realizaciones según la presente invención, se usa un instrumento IR que incluye un programa informático incorporado para monitorizar el cambio en la intensidad espectral asociada con la absorción por el agua, que disminuye según se reduce la cantidad de agua en la muestra. Por consiguiente, monitorizando la intensidad espectral asociada con el agua, un usuario

puede determinar si la muestra necesita ser secada adicionalmente. Típicamente, la intensidad espectral asociada con la absorción por el agua se mide varias veces durante el proceso de secado, hasta que se observa la misma intensidad espectral para 2 o 3 o más lecturas consecutivas, confirmando de este modo que la muestra está seca para la cuantificación real.

En algunas realizaciones, se incluye un tensioactivo en la muestra que se analiza usando los métodos de la invención. Puede incluirse un tensioactivo en la muestra que se deposita sobre una membrana o bien puede añadirse a la membrana antes o después de depositar la muestra. Un tensioactivo, tal como, p.ej., dodecilsulfato de sodio (SDS) o Tween 20 o un aditivo químico, p.ej., glicerol, reduce la tensión superficial de una disolución, permitiendo de este modo una distribución uniforme de la muestra dentro de un área.

Cuando una muestra acuosa que contiene una o más biomoléculas se seca sobre un sustrato de PTFE hidrófilo, se forma un gradiente de concentración según se seca la muestra. Este patrón de deposición da como resultado que se deposita la cantidad de muestra más alta en el perímetro más exterior, y la cantidad más baja en el centro del área de la muestra. Este patrón se denomina a menudo patrón de “anillo de café” o “donut”. Cuando la tensión superficial de la muestra acuosa se reduce, tal como con la adición de un tensioactivo, la deposición de la muestra es más uniforme a través del área de muestra total. En el caso en que la muestra está siendo examinada con una fuente de energía, la inclusión de un tensioactivo da como resultado una distribución más uniforme de la muestra dentro del área que es expuesta a la fuente de energía.

Los tensioactivos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos no iónicos basados en polioxietileno tales como (Tween 20, Tween 40, Tween 60 y Tween 80). Tensioactivos aniónicos tales como dodecilsulfato de sodio (SDS), laurilsulfato de amonio, laurilétersulfato de sodio (SLES), estearato de sodio. En algunas realizaciones, la concentración de un tensioactivo es aproximadamente 1% o aproximadamente 2% o aproximadamente 3% o aproximadamente 4% o aproximadamente 5% o aproximadamente 6% o aproximadamente 7% o aproximadamente 8% o aproximadamente 9% o aproximadamente 10%. En una realización particular, la concentración de un tensioactivo es aproximadamente 5%.

Los aditivos químicos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, polioles tales como glicerol, etilenglicol, propilenglicol, dipropilenglicol. En algunas realizaciones, la concentración de aditivo químico es aproximadamente 1% o aproximadamente 2% o aproximadamente 3% o aproximadamente 4% o aproximadamente 5% o aproximadamente 6% o aproximadamente 7% o aproximadamente 8% o aproximadamente 9% o aproximadamente 10%. En una realización particular, la concentración de un aditivo químico es aproximadamente 5%.

La presente descripción también abarca dispositivos usados para la cuantificación de una o más biomoléculas en una muestra usando un método basado en IR, así como métodos para preparar tales dispositivos. En algunas realizaciones según la presente descripción, un dispositivo usado para la cuantificación de biomoléculas es un contenedor de muestras en la forma de una tarjeta que incluye una membrana porosa (p.ej., una membrana de ultrafiltración o una membrana microporosa). En general, se entiende que una membrana de ultrafiltración tiene un tamaño de poro más pequeño que 0,1 μm.

En algunas realizaciones, una membrana porosa contenida en un contenedor de muestras incluye una región hidrófila rodeada por una región hidrófila. La región hidrófila es la región de la membrana que es humedecible instantáneamente por el agua, y la región donde la muestra se deposita o pipetea habitualmente sobre la membrana. Es también la región que es expuesta típicamente al haz IR.

En algunas realizaciones, la región hidrófila de la membrana está rodeada por una región hidrófoba, que no es humedecida por el agua.

En algunas realizaciones, el área para la contención de la muestra incluye formas/patrones de regiones hidrófilas/hidrófobas, p.ej., en la forma de líneas o puntos de regiones hidrófobas creados dentro de la región hidrófila. Se muestran formas y patrones ilustrativos en las Figuras 8A-8D. Tales formas y patrones permiten también una distribución más uniforme de una muestra dentro del área que es expuesta al haz IR, justo como la adición de un tensioactivo o un aditivo químico.

Se han descrito previamente en la técnica tarjetas contenedoras de muestras para el uso en análisis espectrofotométrico de infrarrojos que incluyen una membrana microporosa, p.ej., las discutidas en las patentes de EE.UU. Nos. 5.470.757 y 5.764.355. Sin embargo, no se han dado a conocer tarjetas contenedoras de muestras que incluyan un área hidrófila rodeada por un área hidrófoba para la contención de muestras, como en el caso de la presente descripción. Además, estas patentes tampoco describen tarjetas contenedoras de muestras ni métodos que demuestren las mejoras descritas aquí, p.ej., la cuantificación de más que una biomolécula en una muestra, el uso de un volumen de muestra muy pequeño y la no necesidad de la generación de una curva de calibración para cada ensayo, etc.

El contenedor de muestras en la forma de una tarjeta se fabrica típicamente a partir de dos capas de cartulina laminadas con adhesivo al sustrato de la membrana. El contenedor de muestras también podría fabricarse a partir de cualquier otra sustancia, tal como plástico, que pueda ser adherida con un adhesivo. Además, el contenedor de muestras podría construirse sin ningún adhesivo y laminarse por medio de un revestimiento sobre la cartulina que se

adhiere a la cartulina cuando es expuesta al calor. En algunas realizaciones, un contenedor de muestras está en la forma de una tarjeta que es aproximadamente de 3,5 cm (1,4 pulgadas) de ancho por 6,4 cm (2,5 pulgadas) de largo, y puede contener al menos 4 muestras. Sin embargo, un contenedor de muestras puede diseñarse de tal modo que pueda contener de 1 muestra hasta 96 muestras o más (p.ej., un formato de placa de 96 pocillos). Puede incorporarse una muesca en el diseño del contenedor de muestras, especialmente cuando está en la forma de una tarjeta, para orientar el contenedor de muestras con el sistema IR a fin de verificar que el contenedor de muestras está insertado correctamente en el soporte del sistema IR para ser expuesto a un haz IR. También es importante que el contenedor de muestras esté orientado correctamente, de tal modo que el haz IR pase a través de la región hidrófila que contiene la muestra.

Las tarjetas contenedoras de muestras descritas en la presente memoria son fáciles de fabricar, son rentables y desechables.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben ser interpretados como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de una curva de calibración para futuras cuantificaciones de muestras

Los métodos para cuantificar una o más biomoléculas en una muestra descritos en la presente memoria obvian la necesidad de generar una curva de calibración, cada vez que se ejecute un experimento de cuantificación en un instrumento. Esto es una mejora sobre los ensayos actuales en la técnica, donde se requerirá típicamente que un usuario genere una nueva curva de calibración o estándar cada vez que se realice un ensayo de cuantificación.

En los métodos descritos en la presente memoria, un usuario genera una curva de calibración o estándar una vez, y puede usarla para análisis futuros. En un experimento, se generó una curva de calibración como sigue. Se prepararon en tampón disoluciones de diversas concentraciones de analito (BSA) y se analizaron usando métodos de detección basados en FTIR descritos en la presente memoria. El gráfico en la Figura 1 muestra el área de pico o altura de pico (eje Y) frente a la concentración o cantidad de analito (eje X). El intervalo lineal de esta calibración se usa para el cálculo de la concentración de una muestra desconocida cuando se conoce el área de pico.

La ecuación típica es y = mx + c, donde c = punto de corte en el eje Y, m = pendiente de la línea; y = área o altura de pico, y x = concentración o cantidad de analito. Adicionalmente, el usuario puede añadir datos a la curva de calibración original para aumentar la relevancia estadística de la cuantificación.

La Figura 1 es un ejemplo de una curva de calibración que se generó usando diversas concentraciones conocidas de BSA en un tampón en un día, y una muestra relevante de concentración desconocida de proteína cuantificada días después frente a la misma curva.

Ejemplo 2: Protocolo general para la cuantificación de una biomolécula en una muestra

En un experimento representativo, se prepara en agua desionizada o un tampón adecuado una muestra que contiene una o más biomoléculas (p.ej., proteína, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, etc.). Se aplican aproximadamente 0,2-10 μl de una disolución en blanco (p.ej., agua desionizada o tampón solo) a la región hidrófila de la membrana contenida en un contenedor de muestras, p.ej., en la forma de una tarjeta (denominada tarjeta contenedora de muestras en la presente memoria). Se aplica el mismo volumen de la disolución de la muestra preparada a uno o más puntos, que pueden estar presentes en la misma tarjeta contenedora de muestras o en una tarjeta contenedora de muestras diferente pero idéntica. La tarjeta contenedora de muestras se seca posteriormente usando una de las siguientes técnicas: calor (40-60 ºC, 0,5-2 minutos); aire/nitrógeno comprimido o cualquier otro gas inerte (0,5-2 minutos) o un horno de microondas. La tarjeta contenedora de muestras seca se inserta posteriormente en el compartimento de muestras del instrumento IR. Se mide el espectro de transmisión/absorción de la disolución en blanco entre 4.000 y 400 cm-1 a fin de obtener un espectro para el fondo, seguido de la medida de la muestra en el mismo intervalo de longitudes de onda. Usando una curva de calibración que está incorporada en el sistema y fue generada usando patrones a diversas concentraciones, se determina posteriormente la concentración de la muestra desconocida.

La Figura 2 representa la imagen de una tarjeta contenedora de muestras ilustrativa que muestra un punto para aplicar el blanco (denominado B) y puntos para tres muestras (denominados 1, 2 y 3). Sin embargo, como se discutió anteriormente, una tarjeta contenedora de muestras puede diseñarse para tener cualquier número de puntos para la aplicación de muestras.

Ejemplo 3: Cuantificación de proteína y ácido nucleico en una muestra usando espectroscopía IR

En un experimento representativo, se cuantificaron tanto proteína como ácido nucleico en una muestra como sigue, usando los métodos según la presente invención.

En un experimento, se mezclaron entre sí albúmina de suero bovino (BSA; SIGMA Cat#A-7030) y ácidos

desoxirribonucleicos (ADN; Ambion Cat#AM9680, ADN de esperma de salmón cizallado) en diversas proporciones (10 a 1 μg en relaciones iguales e inversas) y se disolvieron en tampón 1xPBS. Se pipetearon muestras de 1 μl usando una pipeta P10 Rainin sobre una tarjeta contenedora de muestras con membrana de PTFE hidrófila, en las posiciones 1, 2 y 3 de la tarjeta contenedora de muestras mostrada en la Figura 2. Se pipeteó el mismo volumen del tampón en el que se preparó la muestra anterior en la posición B sobre la tarjeta contenedora de muestras, mostrada en la Figura 2.

La tarjeta contenedora de muestras, que contenía los puntos tanto del tampón como de la muestra, se secó usando aire a alta presión. La tarjeta contenedora de muestras se insertó en el instrumento IR y se midió primero el espectro de absorción/transmisión del tampón entre 4.000 y 400 cm-1. Posteriormente, se midió el espectro de la muestra usando el espectro del tampón como espectro de fondo. La cantidad de proteína y ácidos nucleicos se determina usando el intervalo espectral de 1.700-1.400 cm-1 para proteínas y 1.740-1.400 y 1.120-940 cm-1 para ácidos nucleicos. Es de apuntar que tanto las proteínas como los ácidos nucleicos absorben en el intervalo de longitudes de onda de 1.700-1.400 cm-1. Por consiguiente, una vez que se determina la concentración de ácidos nucleicos, esta puede ser restada de la concentración de proteína mas ácidos nucleicos, obtenida usando áreas de pico entre 1.700-1.400 cm-1, proporcionando de este modo la concentración de proteína sola. Por tanto, la concentración de proteínas y ácidos nucleicos puede determinarse en un solo experimento. En este experimento, se generaron curvas de calibración independientemente para proteínas y ADN usando muestras puras de proteína y ADN disueltos en un tampón o agua desionizada. Los resultados de un experimento tal se representan en la Figura 3.

Ejemplo 4: Cuantificación de péptidos en una muestra usando IR

En otro experimento representativo, se demuestra que los métodos según la presente invención podrían usarse para cuantificar péptidos. En un experimento, se disolvió una muestra de péptido en agua hasta una concentración de 1 mg/ml. Se pipeteó un volumen de 2 μl de las muestras usando una pipeta P2 Rainin sobre una tarjeta contenedora de muestras que contenía una membrana de PTFE hidrófila, representada en la Figura 2, y se secó en un calentador a 40ºC. La misma tarjeta contenedora de muestras contenía también una posición llamada blanco (B), donde se pipeteó un volumen de 2 μl del agua en la que está disuelta la muestra. La tarjeta se insertó en el instrumento IR y se midió el espectro de absorción/transmisión del blanco de agua/tampón, seguido de la medida de las muestras usando el espectro del agua/tampón como fondo. La cantidad de péptido se determinó usando el intervalo espectral de 1.700-1.400 cm-1 . Se generó una curva de calibración usando muestras puras de BSA como calibrante en tampón/agua. Los resultados de un experimento tal se representan en la Figura 4.

Ejemplo 5: Cuantificación de lipopolisacáridos en una muestra usando IR

En un experimento representativo, se usaron los métodos según la presente invención para cuantificar un lipopolisacárido en una muestra. Específicamente, se disolvió un lipopolisacárido tal como una endotoxina, (Lipopolisacárido (LPS); SIGMA L2630), en un tampón 1XPBS para obtener una disolución madre de 20 mg/ml. Se pipeteó un volumen de 2 μl de las muestras usando una pipeta P2 Rainin sobre una tarjeta contenedora de muestras que contenía una membrana de PTFE hidrófila, representada en la Figura 2, y se secó en un calentador a 40ºC. La misma tarjeta contenedora de muestras contenía también una posición llamada blanco (B), donde se aplica un volumen de 2 μl del tampón en el que está disuelta la muestra. La tarjeta contenedora de muestras se insertó en el instrumento IR y se midió primero el espectro del tampón, seguido del espectro de la muestra, lo que contempla al espectro del tampón de blanco como espectro de fondo. Se registró un cálculo de la titulación de diluciones de LPS en base a la disolución madre a fin de obtener una curva de calibración. Los resultados de un experimento tal se representan en la Figura 5.

Ejemplo 6: Monitorización de la presencia de agua en una muestra usando IR

Los métodos descritos en la presente memoria también pueden usarse para detectar la presencia de agua en una muestra. Es sumamente indeseable tener agua en una muestra que se analiza usando métodos basados en IR, ya que el agua puede afectar a la exactitud de la cuantificación de biomoléculas, por ejemplo, especialmente en el caso de una cuantificación de proteína/péptido.

En un experimento representativo, se aplicaron 2 μl de una disolución de 10 mg/ml de BSA (Sigma Cat # A-7030) en agua Milli Q a la región hidrófila de la membrana contenida en un contenedor de muestras, p.ej., en la forma de una tarjeta (denominada tarjeta contenedora de muestras en la presente memoria).

Después la muestra húmeda se colocó dentro del haz IR de un espectrómetro IR y se midió el espectro de absorción IR. Los espectros de absorción se registran como el cambio de la intensidad de señal y del perfil de señal, por ejemplo, debido a la evaporación del agua.

Cuando la intensidad de señal para el espectro de absorción permanece constante durante 3 medidas consecutivas, se considera que la muestra está seca, y el programa informático (p.ej., el programa informático Opus en el caso del instrumento Bruker) recoge el espectro de absorción de BSA entre 4.000-400 cm-1 , y usando una curva de calibración incorporada determina la concentración de BSA en esa disolución. Los resultados de un experimento tal se representan en la Figura 6, que muestra una disminución en la intensidad de señal asociada con el agua según se seca la muestra.

Ejemplo 7: Efecto de un tensioactivo sobre la distribución de la muestra

Las disoluciones acuosas pueden tener un problema con secarse uniformemente y obtener una distribución uniforme sobre el área de la membrana que es expuesta a un haz IR.

Este experimento demuestra que la adición de un tensioactivo a una disolución de una muestra da como resultado una distribución uniforme de la muestra sobre el área que es expuesta al haz IR y por consiguiente una cuantificación más exacta. En un experimento representativo, se usó una disolución de muestra de 5 μl de 10 mg/ml de la proteína Citocromo C, que se disolvió en PBS y se secó con y sin SDS al 5%. La muestra se depositó sobre una tarjeta contenedora de muestras y se colocó dentro de un haz IR con un diámetro total de 4,5 mm.

Se observó que sólo aproximadamente el 10% de la muestra sin SDS estaba absorbiendo el haz IR, dado que la mayoría de la muestra estaba contenida en el 1 mm exterior del área de la muestra. Sin embargo, en la muestra en la que estaba presente SDS, una distribución más uniforme de la muestra dio como resultado más absorción del IR, dado que la muestra estaba dentro de la irradiancia máxima (1/e2) del haz. El área de picos 1 y 2 de amida integrada

(1.725 a 1.479 cm-1) fue aproximadamente 3 veces más alta que la de la muestra sin SDS. Los resultados de un experimento tal se representan en la Figura 7. El eje X en este espectro de absorción IR representa el número de ondas (cm-1), mientras que el eje Y representa las unidades de absorbancia.

Ejemplo 8: Fabricación de una tarjeta contenedora de muestras usando tratamiento de plasma para la contención de la muestra

La presente descripción abarca también contenedores de muestras que pueden usarse en los métodos para cuantificar una o más biomoléculas en una muestra, como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, un contenedor de muestras está en la forma de una tarjeta, y se denomina tarjeta contenedora de muestras por conveniencia. Es imperativo que las tarjetas contenedoras de muestras puedan contener la muestra dentro del haz IR, a fin de obtener un espectro de absorción exacto y por consiguiente una cuantificación de la una o más biomoléculas de interés.

En un método para fabricar una tarjeta contenedora de muestras para uso en los métodos según la presente invención, se usó un entorno de plasma a vacío para generar un área para la contención de la muestra. La membrana de partida usada en la tarjeta contenedora de muestras fue una membrana de PTFE hidrófila, que vende Sumitomo bajo el nombre de marca Poreflon. La membrana comprende poros de un tamaño que tiene de media 0,03 μm (HHPSW-005-30) y está revestida con un tratamiento de hidrofilización para comunicar una superficie humedecible por el agua. Exponer la membrana hidrófila Poreflon a un entorno de plasma a vacío limpia el tratamiento de la superficie, exponiendo el PTFE hidrófobo por naturaleza.

Las Figuras 8A y 8B representan las vistas abierta y cerrada experimentales, respectivamente, de un elemento fijo enmascarante dentro del que está colocada una tarjeta contenedora de muestras ensamblada para la exposición al plasma. La membrana estaba fabricada en una tarjeta que consistía en dos láminas rígidas de papel revestidas con adhesivo que tenían un agujero a su través de 12,5 mm en el centro de cada una. Las dos láminas de papel se ensamblaron con la membrana hidrófila de Sumitomo intercalada entre ellas, cubriendo de este modo el agujero en la tarjeta de papel ensamblada. La tarjeta (10) ensamblada se muestra en la Figura 8A, con el elemento (12) fijo en una configuración abierta. La tarjeta (10) ensamblada que contenía la membrana (14) hidrófila estaba posicionada en el elemento (12) fijo enmascarante que contenía un marco (16) para centrar la tarjeta, como se representa en las Figuras 8A y 8B. Estaban presentes sellos (18) elastoméricos en los lados opuestos de la tarjeta (10) de membrana centrada y posicionada. Rodeando los sellos (18) elastoméricos hay cuatro agujeros (19), que proporcionan comunicación para que el gas de plasma acceda a la membrana (14) a ser tratada. El elemento (12) enmascarante se cerró posteriormente, como se representa en una vista en sección transversal en la Figura 8B, con lo que los sellos (18) elastoméricos están sellados compresivamente contra los lados opuestos de la membrana (14) en la tarjeta (10). Se usó una fuerza, p.ej., por medio de abrazaderas, para cerrar el elemento (12) fijo sobre la tarjeta (10) contenedora de muestras que contenía la membrana (14) hidrófila.

La tarjeta (10) posicionada en el elemento (12) fijo se colocó posteriormente en un entorno de plasma a vacío, cuya vista en sección transversal se representa en la Figura 8B. Un sistema de plasma a vacío ilustrativo que puede usarse es el sistema de Plasma a Vacío Harrick Modelo PDC-001. La cámara (20) dentro del sistema fue evacuada de gas usando una bomba de vacío (no mostrada). Se introdujo gas atmosférico en la cámara (20), y se mantuvo a un caudal de aproximadamente 2-5 cc/min. Se aplicó la energía de un generador RF (no mostrado) y se mantuvo durante un periodo de tiempo que varió de 10 segundos a 7 minutos. La región de la membrana (15) de la tarjeta

(10) contenedora de muestras entre los sellos (18) elastoméricos se protegió del plasma, mientras que el exterior restante se expuso al plasma, que se representa mediante puntos.

El experimento de exposición a plasma que usa el elemento fijo descrito en las Figuras 8A y 8B mostró que cualquier tiempo de procesamiento mayor que 1 minuto dio como resultado una definición clara de la región hidrófila e hidrófoba, produciéndose un nítido borde de transición en la posición de los sellos (18) elastoméricos. Los tiempos de procesamiento con plasma menores que 1 minuto dieron como resultado un borde de transición borroso a ningún borde de transición en absoluto, dando como resultado una membrana que permaneció hidrófila y que la muestra no

fue contenida.

La Figura 9 representa una tarjeta (22) contenedora de muestras ilustrativa que contiene una membrana que tiene una región (24) hidrófila rodeada por una región (26) hidrófoba preparada usando el método descrito en este Ejemplo. El límite entre las dos regiones es un borde o línea (28) de transición.

Como se discutió anteriormente, es deseable además tener la muestra distribuida tan uniformemente como sea posible dentro del haz IR. Una manera de conseguir una distribución uniforme es la adición de un tensioactivo a una muestra, como se discutió anteriormente. Otra manera de conseguir una distribución uniforme es crear patrones/formas de áreas hidrófobas intercaladas con áreas hidrófilas sobre la membrana, como se discute en la presente memoria.

Se entiende que una gota de secado depositará la muestra preferentemente a lo largo del borde exterior de la gota de secado, tal como se observa habitualmente con los fenómenos de anillo de café. Para minimizar este patrón de secado, la región hidrófoba que rodea a la región hidrófila puede ser modificada adicionalmente. Esto puede conseguirse, por ejemplo, posicionando adecuadamente los sellos elastoméricos sobre la membrana de una manera que dé como resultado un patrón sobre la membrana de puntos o líneas hidrófobos dentro de un área hidrófila. Se espera que tal patrón dé como resultado múltiples gotas más pequeñas, creando de este modo patrones de secado cada vez más pequeños. Estos patrones de secado más pequeños depositan la muestra en una configuración más uniforme dentro del haz IR. Se entiende que las posibles formas/patrones que pueden ser configurados sobre la membrana pueden estar en la forma de líneas, puntos, formas de estrella y otras formas comunes. Además, la región hidrófoba exterior también puede ser una forma tal como una forma de estrella, una forma de cuadrado, etc. Los patrones hidrófobos/hidrófilos ilustrativos que pueden generarse posicionando adecuadamente los sellos elastoméricos sobre el elemento fijo se representan en las Figuras 10A-10D. Las regiones hidrófilas se muestran mediante la referencia numérica 30, y las regiones hidrófobas se muestran mediante la referencia numérica 32.

Ejemplo 9: Fabricación de una tarjeta contenedora de muestras usando tratamiento con calor para la contención de muestras

En otro experimento, se fabricó una tarjeta contenedora de muestras para el uso en los métodos IR según la presente invención como sigue, usando tratamiento con calor como otro medio alternativo para conseguir la contención de muestras sobre la membrana en la tarjeta.

En un experimento ilustrativo, la humectabilidad superficial de una membrana de PTFE hidrófila fue alterada mediante la exposición a una platina calentada, a fin de crear una región para la contención de muestras. La membrana de PTFE hidrófila que se usó es vendida por Sumitomo bajo el nombre de marca Poreflon, tiene un tamaño de poro que tiene de media 0,05 μm (HHPSW-005-30) y está revestida por un tratamiento de hidrofilización para comunicar una superficie humedecible por el agua. En general, usando los métodos descritos en este ejemplo, cualquier membrana Poreflon con un tamaño de poro que varíe de 0,05 μm-0,45 μm, y un espesor que varíe entre 30 μm y 80 μm puede ser modificada usando una platina calentada.

Como en el caso del Ejemplo 8, la membrana de PTFE hidrófila se fabricó en una tarjeta que consistía en láminas de papel revestido con adhesivo que tenían cuatro (4) agujeros a su través de 10 mm. Las dos láminas de papel se ensamblaron con la membrana hidrófila de Sumitomo intercalada entre las láminas, cubriendo de este modo los agujeros en la tarjeta de papel ensamblada. Esta tarjeta (34) ensamblada que contenía una membrana (36) hidrófila se posicionó en un elemento (38) fijo embutible que contiene un cilindro neumático (no mostrado) unido a calentadores “cal-rods” (no mostrados) y una platina (42) calentada, como se representa en la Figura 11. El cilindro posiciona la platina (42) calentada sobre o por encima de la membrana (36) en la tarjeta (34) contenedora de muestras, y almohadillas (44) elastoméricas en el nido (40) soportan el lado inferior de la membrana (36). La platina calentada (42) contiene protuberancias (46) elevadas, y el nido (40) contiene almohadillas (44) elastoméricas, que se alinean con las protuberancias (46) elevadas cuando se coloca la tarjeta (34) contenedora de muestras entre ellas, lo que da como resultado que las regiones que están en contacto directo con la platina (42) calentada se hacen hidrófobas.

Se representan vistas en sección transversal abierta y cerrada del ensamblaje elemento fijo embutible/tarjeta/platina calentada en las figuras 12A y 12B, respectivamente.

Después de que se expuso la platina (42) calentada a la membrana (36) durante una cantidad de tiempo fijada (p.ej., 5 segundos a 5 minutos), el cilindro (no mostrado) movió la platina (42) calentada alejándola de la tarjeta (34) de membrana.

Como también en el caso del Ejemplo 8, la forma del área contenida puede ser modificada. En el caso del tratamiento con calor, la forma del área contenida puede ser controlada mediante la forma de las protuberancias elevadas y las almohadillas elastoméricas que están en estrecha proximidad a la membrana, de tal modo que las porciones de la membrana en contacto con las protuberancias elevadas de la platina calentada se hacen hidrófobas, mientras que las porciones que no entran en contacto con la platina calentada permanecen hidrófilas.

A fin de confirmar que el área hidrófoba generada usando el tratamiento con plasma descrito en el Ejemplo 8 o bien

usando el tratamiento con calor descrito en el Ejemplo actual, fue eficaz en contener la muestra, se investigaron las propiedades de contención de muestras de membranas tanto tratadas con calor o plasma como no tratadas, usando agua como muestra. Las Figuras 13A-13B representan las propiedades de contención de muestras de una membrana no sometida a tratamiento con calor o plasma, y las Figuras 13C y 13D representan las propiedades de contención de muestras de una membrana que fue sometida a tratamiento con calor o bien tratamiento con plasma. Se depositó un volumen de 2 μl de agua como muestra (50) sobre la membrana (52) hidrófila de una tarjeta (54) contenedora de muestras. La Figura 13A representa la muestra (50) de agua en el tiempo cero, y la Figura 12B representa la muestra (50) de agua en el tiempo 30 segundos. Como se muestra en la Figura 13B, la muestra de agua se extendió por toda el área de la membrana, lo que dio como resultado que el área humedecida era más ancha en diámetro que el diámetro de un haz IR. Mientras que, en el caso de la membrana tratada con calor o la membrana tratada con plasma, como se representa en las Figuras 13C y 13D, tanto en tiempo cero (Figura 13C) como en 30 segundos (Figura 13D), la muestra (50) de agua fue contenida dentro de la región (56) hidrófila de la membrana rodeada por una región (58) de barrera hidrófoba. Por consiguiente, puede usarse un tratamiento con calor o con plasma, como se describe en la presente memoria, para generar una región (56) hidrófila interior rodeada por una región (56) de barrera hidrófoba exterior.

Ejemplo 10: Distribución uniforme de una muestra por medio de disrupción química o física

Se ha observado que el secado de una muestra biológica acuosa para análisis FTIR da como resultado a menudo un patrón de distribución de muestra no uniforme, con la concentración de muestra más alta en el borde exterior del área de la muestra, formando de este modo un patrón llamado “anillo de café” o “anillo de donut”, lo que puede dar como resultado una cuantificación inexacta.

En un experimento representativo descrito en la presente memoria, el uso de un tensioactivo o un detergente dio como resultado una distribución más uniforme de la muestra, causando que la muestra se secara en un patrón más uniforme en el área de contención de la muestra, como se representa en la Figura 14A. También, la adición de un patrón de barrera hidrófoba (p.ej. patrón en aspa “X”) en el área de la muestra puede causar que la muestra se seque más hacia el centro del área de la muestra, como se representa en la Figura 14B, dando como resultado una distribución de la muestra cercana a los efectos de usar un aditivo tensioactivo. La distribución de la muestra o la disrupción del “anillo de café” dieron como resultado una concentración más alta y un coeficiente de variación en porcentaje más bajo (%CV).

Los ejemplos de tensioactivos que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, Tween 20 y dodecilsulfato de sodio (SDS). En un experimento, se mostró que el patrón en anillo de una muestra de citocromo C secada varía en base a la disolución en la que se disolvió la muestra (p.ej. PBS frente a H2O). Las diferencias en la distribución de la muestra dentro del haz IR pueden influir en la transmisión del haz IR a través de la muestra. Para romper el patrón en anillo, dando como resultado una distribución más uniforme de la muestra, pueden añadirse detergentes o tensioactivos a la muestra, o directamente a la membrana sobre la que la muestra se deposita y seca.

En la Tabla 1 a continuación, se calcularon el área de pico de amida 1 y 2 de la proteína Citocromo C en ausencia (H2O solamente) y presencia de SDS (1 y 5%). La adición de SDS dio como resultado un aumento del área de la muestra calculada, así como una disminución en el coeficiente de variación en porcentaje (%CV) (p.ej., de 9,1 a 2,3%).

La Figura 15 representa una representación gráfica de barras de los datos tabulados, mostrados en las Tablas 1 y 2 a continuación. El aumento en el valor de la muestra y la disminución en %CV con la adición de SDS es debido a una distribución más uniforme de la muestra (hay más muestra dentro del haz IR total) y está más presente menos variabilidad entre muestras (distribución uniforme de la muestra frente a diferencias en el caso de formación de anillos).

Las áreas de pico de Amida 1 y 2 en las Tablas 1 y 2, columna B, se calcularon usando el programa informático OPUS 6.5 (Bruker). Se calculó el valor medio, así como el %CV. Se añadió SDS (1 y 5%) a las muestras y se reanalizaron el área de pico y el %CV.

Tabla 1.

Proteína Citocromo C Citocromo C Citocromo C: Cantidad [mg/ml] 10 10 10 Volumen (ul) 2 2 2 Aditivo dH2O dH2O dH2O Cantidad (%) Muestra 1 2 3 B Amida 1 y 2 6,137 5,225 5,309 5,557 0,504 9,1 = Media = Desv. est. = %CV

Citocromo C Citocromo C Citocromo C Citocromo C Citocromo C Citocromo C: 10 10 10 10 10 10 2 2 2 2 2 2 SDS SDS SDS SDS SDS SDS 1 1 1 5 5 5 1 2 3 1 2 3 9,969 9,525 9,802 9,765 0,224 2,3 24,156 24,045 22,745 23,649 0,785 3,3 = Media = Desv. est. = %CV = Media = Desv. est. = %CV

Tabla 2.

Proteína: Cantidad [mg/ml] Volumen (ul) Modificación Muestra Amida 1 y 2

Citocromo C: 10 5 1 21,352

Citocromo C: 10 5 2 20,783

Citocromo C: 10 5 3 24,802

22,312: = Media

2,175: = Desv. est.

9,7: = %CV

Citocromo C: 10 5 X 1 24,526

Citocromo C: 10 5 X 2 23,599

Citocromo C: 10 5 X 3 23,877

24,001: = Media

0,476: = Desv. est.

2,0: = %CV

Las realizaciones dentro de la memoria descriptiva proporcionan una ilustración de realizaciones en esta invención, y no debe interpretarse que limitan su alcance. El experto en la materia reconoce fácilmente que esta invención abarca muchas otras realizaciones.

La citación de cualesquiera referencias en la presente memoria no es una admisión de que tales referencias sean técnica anterior a la presente invención.

A menos que se indique otra cosa, es de entender que todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivos celulares, condiciones de tratamiento, etcétera, usados en la memoria descriptiva, incluyendo las 5 reivindicaciones, son modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones, y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la presente invención. A menos que se indique otra cosa, es de entender que el término “al menos” que precede a una serie de elementos se refiere a cada elemento en la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán averiguar usando no más que experimentación de rutina, muchos

10 equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en la presente memoria. Se pretende que tales equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Pueden hacerse muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su alcance, como será evidente para los expertos en la técnica. Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria se ofrecen a modo de ejemplo solamente, y no pretenden ser limitantes de ninguna manera. Se pretende que la memoria

15 descriptiva y los ejemplos se consideren como ilustrativos solamente, siendo indicado un alcance real de la invención por las siguientes reivindicaciones.

La presente invención proporciona un método para cuantificar una o más biomoléculas en una muestra usando técnicas basadas en IR.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la cuantificación de una o más biomoléculas en una muestra (50), comprendiendo el método las etapas de:

(a)

proporcionar un contenedor (22) de muestras que comprende una membrana (14) porosa que comprende una región (24) hidrófila rodeada por una región (26) hidrófoba para la contención de la muestra, en donde la región hidrófoba se crea por tratamiento con plasma de una membrana porosa hidrófila o bien en donde la región hidrófoba se crea por tratamiento con calor de una membrana porosa hidrófila;

(b)

poner en contacto la región hidrófila de la membrana con un volumen de muestra, en donde la región hidrófila tiene un diámetro;

(c)

secar el volumen de muestra sobre la membrana; y

(d)

exponer el volumen de muestra sobre la membrana a un haz de infrarrojos que tiene un diámetro igual a o más grande que el diámetro de la región hidrófila, y que comprende una longitud de onda en el intervalo espectral de 4.000-400 cm-1 o cualquier porción del intervalo espectral de 4.000-400 cm-1, para obtener de este modo un espectro de absorción de infrarrojos;

en donde una o más áreas de picos de absorción en el espectro de absorción de infrarrojos se correlaciona con la cantidad de la una o más biomoléculas en la muestra.
2.

El método de la reivindicación 1, en donde la una o más biomoléculas se selecciona del grupo que consiste en ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, polisacáridos y lipopolisacáridos, opcionalmente una endotoxina.
3.

El método de la reivindicación 1, en donde el método no requiere que un usuario genere una curva de calibración cada vez que se analiza una muestra para la cuantificación de la una o más biomoléculas.
4.

El método de la reivindicación 1, en donde el volumen de muestra varía de 0,1-20 μl y opcionalmente 1 μl o menos.
5.

El método de la reivindicación 1, en donde la membrana porosa está contenida dentro de un dispositivo.
6.

El método de la reivindicación 5, en donde el dispositivo es una tarjeta contenedora de muestras, que comprende una membrana porosa que comprende un área dentro de la que la muestra está contenida sobre la membrana.
7.

El método de la reivindicación 1, en donde la muestra comprende un fluido biológico y, opcionalmente, el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma, suero y orina.
8.

El método de la reivindicación 1, en donde la muestra comprende lisado celular o tisular, opcionalmente una muestra bruta.
9.

El método de la reivindicación 1, en donde la membrana porosa es una membrana de ultrafiltración o una membrana microporosa.
10.

El método de la reivindicación 1, en donde la membrana porosa comprende un material polimérico seleccionado del grupo que consiste en PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)), poli(tetrofluoroetileno), poli(tetrofluoroetileno) hidrófilo, polietileno y polipropileno.
11.

El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de detectar la presencia de agua sobre la membrana usando absorbancia de infrarrojos y repitiendo la etapa (c), si fuera necesario, hasta que no se detecte agua.
12.

El método de la reivindicación 1, en donde el diámetro de la región hidrófila varía de 2,0 mm a 10 mm.
13.

El método de la reivindicación 1, en donde el diámetro de la región hidrófila varía de 3,0 mm a 6 mm.