KR101587195B1

KR101587195B1 - 항균 및 항고혈압 프로바이오틱인 단리된 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 ｄｓｍ 21380과, 이 미생물을 포함하는 식품과 조성물 및 항고혈압제의 제조를 위한 이 미생물의 용도와, 식품에서 병원체 및 논-스타터 락토바실러스를 억제하기 위한 방법

Info

Publication number: KR101587195B1
Application number: KR1020107028013A
Authority: KR
Inventors: 엡 송기셉; 마리카 미켈싸르; 메를르 라트셉; 미켈 질머; 피르예 후트; 미메 우트; 케르스티 질머; 야네 우크스티; 씨리 콜얄
Original assignee: 오위 테르비슬리쿠 피마 바이오테흐놀로지아테 아렌두스케스쿠스
Priority date: 2008-05-13
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2016-01-21
Also published as: WO2009138091A9; EE200800026A; US20110177198A1; CY1113187T1; KR20110019371A; EE05340B1; EP2309870B1; WO2009138091A3; EP2309870A2; PL2309870T3; RU2010150716A; WO2009138091A2; RU2477750C2

Abstract

본 발명은 항균 및 항고혈압 프로바이오틱인 신규 분리된 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)과, 이러한 미생물을 포함하는 식품 (유제품, 예컨대 발효 식품 또는 치즈), 조성물 및 항고혈압 의약의 제조를 위한 상기 미생물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 식품에서 병원체 및 논-스타터 락토바실러스를 억제하기 위한 방법 및 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)을 사용하여 식품의 저장 수명을 연장시키는 방법에 관한 것이다.

Description

항균 및 항고혈압 프로바이오틱인 단리된 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 ＤＳＭ 21380과, 이 미생물을 포함하는 식품과 조성물 및 항고혈압제의 제조를 위한 이 미생물의 용도와, 식품에서 병원체 및 논-스타터 락토바실러스를 억제하기 위한 방법 {ISOLATED MICROORGANISM STRAIN LACTOBACILLUS PLANTARUM TENSIA DSM 21380 AS ANTIMICROBIAL AND ANTIHYPERTENSIVE PROBIOTIC, FOOD PRODUCT AND COMPOSITION COMPRISING SAID MICROORGANISM AND USE OF SAID MICROORGANISM FOR PREPARATION OF ANTIHYPERTENSIVE MEDICINE AND METHOD FOR SUPPRESSING PATHOGENS AND NON-STARTER LACTOBACILLI IN FOOD PRODUCT}

본 발명은 신규 미생물 및 이의 응용에 관한 것이다. 본 발명은 바이오테크놀러지 분야에 속하며, 식품 및 의약에 사용된다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 목표는 항균 및 항고혈압 프로바이오틱 미생물 균주인 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)이다. 본 발명은 기능성 식품의 조성물, 예컨대, 치즈에서의 이의 용도 및 항고혈압용 의약의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.

발효 식품 제조에 사용되는 락토바실러스는 수십세기 동안 소비되어 왔다. 지난 수십년간, 락토바실러스는 프로바이오틱으로서 널리 사용되어 왔다. 프로바이오틱이란, 적정량으로 투여되었을 때, 숙주에게 건강 상의 장점을 제공하는 사람 기원의 살아 있는 미생물을 말한다. 흔히 사용되는 프로바이오틱은 기능성 식품을 제조하기 위하여 사용된다. 적절한 영양 성분 이외의 천연 첨가제를 함유하고 있는 경우 (프리- 또는 프로바이오틱) 그 식품은 기능성이 있는 것으로 간주되고, 이는 건강 상태 및 웰빙을 향상시키기 위하여 및/또는 질병의 위험을 낮추기 위하여 체내에서 1가지 이상의 표적 기능에 긍정적인 영향을 미친다.

프로바이오틱 제품은 전통 식품 (요구르트, 쿼크 (quark), 커드 (curds))일 수도 있고, 유제품 보충 성분 (동결 건조된 미생물 배양액)일 수도 있다.

유럽 국가에서는 건강 상의 요구가 보충된 수종의 프로바이오틱이 판매되고 있다.

항균 프로바이오틱

기회 감염성 병원체 및 식품의 병원체, 예를 들어 살모넬라에 대응한 항균 프로바이오틱들이 특허 출원에 기재되어 있다. WO2008/039531 (Little Columet Holdings KKC)에서는, 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophilus ), 락토바실러스 불가리쿠스 (L. bulgaricus ), 락토바실러스 카세이 (L. casei ), 락토바실러스 파라카세이 (L. paracasei ), 락토바실러스 퍼멘튬 (L. fermentum ), 락토바실러스 플란타늄 (L. plantanum ), 락토바실러스 람노수스 (L. rhamnosus ), 락토바실러스 살리바리우스 (L. salivarius ), 비피도박테리움 비피듐 ( Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스 (B. infantis ), 비피도박테리움 아니말리스 서브스피시즈 락티스 (B. animalis subsp . lactis ), 비피도박테리움 롱굼 (B. longum), 스트렙토코커스 테르모필루스 ( Streptococcus thermophilus ), 엔테로코쿠스 패칼리스 ( Enterococcus faecalis ) 및 엔테로코쿠스 패시움 (E. faecium ) 균주의 사용이 기재되어 있다. 이러한 균주의 경구 투여는 장내에서 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni ), 이. 콜라이 (E. coli ), 에스 . 아우레우스 (S. aureus ), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera ), 박테로이데스 에스피 (Bacteroides sp ), 클로스트리듐 에스피 (Clostridium sp ), 클렙시에렐라 에스피 (Klebsiella sp ), 리스테리아 에스피 (Listeria sp ), 프로테우스 에스피 ( Proteus sp ), 살모넬라 에스피 ( Salmonella sp), 시겔라 에스피 (Shigella sp ) 및 베일로넬라 에스피 (Veillonella sp)를 억제하는 데 도움을 준다.

특허 출원 WO 2008/016214 (Bioneer Corporation)는 이. 콜라이 (E. coli ), 에스. 아우레우스 (S. aureus ), 에스. 티피무리움 (S. typhimurium ), 비. 세레우스 (B. cereus ), 엘. 모노사이토게네스 (L. monocytogenes ) 및 피. 미라비리스 (P. mirabilis)에 대한 항균 활성을 가지는 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri) 균주 BNR17를 개시하고 있다.

이 기술 분야의 숙련자는 치즈 성숙 동안에 나타나는 논-스타터 락토바실러스 (non starter lactobacilli (NSLAB))에 의하여 치즈에서 유발되는 문제를 잘 알고 있다. 이러한 미생물은 원하지 않은 단백질 분해, 각종 바람직하지 않은 향료 화합물의 출현 및 상업적 품질의 치즈 손상을 유발할 수 있다.

치즈 성숙 과정 도중, pH 조절제, 항산화제 및 보존제 (NaCl)로 NSLAB의 균수에 영향을 미치는 것은 실패하였다. 치즈에 프로바이오틱 락토바실러스를 포함하는 상이한 항균 화합물 (락트산 및 아세트산, H₂O₂)을 생성하는 길항 미생물을 첨가하는 것 역시도 비효과적이었다. H₂O₂ 생성 프로바이오틱 락토바실러스는 몇 명의 저자들에 의하여 기재된 바가 있다 (Ouwehand, A.C. Westerlund, Antimicrobial components of lactic acid bacteria. In: Lactic acid bacteria: microbiological and functional aspects. Eds. Salminen, S; Wright, A., .Ouwehand, A.C. 2004, pp 375-395, New York, Marcel Dekker; Huet, P., Shchepetova, J., Loivukene, K., Kullisaar, T., Mikelsaar, M. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens. J. Appl. Microbiol., 2006, 100, 1324-1332).

인간 및 식물 기원의 락토바실러스는 단백질과 지방이 풍부하고 탄수화물이 적은 치즈 환경에서 적응을 잘 못하는데, 이러한 환경은 이 락토바실러스에게 이례적인 (atypical) 것이다. 그러므로, 프로바이오틱 락토바실러스를 포함하는 단 몇 가지 종류의 치즈만이 시판되고 (Gardiner, G, Ross, R. P, Collins, J. H, Fitzgerald, G, and Stanton. C. Development of a probiotic cheddar cheese containing human derived Lactobacillus paracasei strains, Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64,. 6: 2192-2199; Ross, R P, Fitzgerald, G F, Collins, J K, O'sullivan, G C, Stanton, C G. Process for the manufacture of probiotic cheese, US Patent 6872411, Patent application WO 99/62348 AI), 여기에서, 첨가된 프로바이오틱 박테리아는 복제능, 즉 이들의 생리학적, 생화학적 특성의 발현에 대한 전제가 되는 복제능을 유지한다. 그러나, 전하는 바에 따르면, 프로바이오틱 LGG를 함유하는 치즈에서, 이 균주의 존재는 검출되지 않는다 (Coeuret V Probiotic lactobacilli from feed or cheese origin: enumeration, identification, properties and specific use. Thesis de Doctoral de Univ. De Caen Basse Normandie, France 2004; Coeuret V, Dubernet S, Bernardeau M, Gueguen M, Vernon Jp. Isolation, characterization and identification of lactobacilli focusing mainly on cheeses and other dairy products. Lait, 2003, 269-306).

병원체에 대한 강한 억제 활성을 가지는 프로바이오틱 락토바실러스를 식품에 첨가하는 것과 인간 개체에게 투여하는 것은 식품으로 인한 감염을 피할 수 있도록 도와준다. 박테리오신을 생성하기 위한 살아 있는 락토바실러스 (LB)의 능력은 음식 유래 병원체를 비롯한 관련 그람 양성 및 그람 음성 박테리아의 억제 및 제거를 위하여 필수 조건이다. 박테리오신은 식품의 품질을 개선하고 이의 저장 수명을 연장시켜 주도록 도와준다. 식품에서 LB에 의하여 전술한 항균 물질이 천연 합성되는 것 또는 식품에 합성 유사체를 적용하는 것은 예를 들면 스프레드 치즈와 같은 낮은 제조 온도 및 NaCl 농도의 식품의 경우와, 온화한 기후의 나라에서 필수적이다 (Lindgren and Dobrogosz Antimicrobial compounds, including bacteriocins produced by LAB increase the self life of the product, FEMS Microbiol Rew 1990, 87 149-164).

보자 (boza)에서 분리한 엘. 플란타룸 (L. plantarum ) 및 엘. 퍼멘툼 (L. fermentum) 균주는 그람 양성 미생물을 억제하는 박테리오신을 생성하는 특성을 가진다. 이들 박테리오신은 항균 특성을 가지는 단백질이거나 펩티드이다 (Mollendorff J.W., Todorov, S. D., Dicks, L:.M:.T. Comparison of Bacteriocins Produced by Lactic-Acid Bacteria Isolated from Boza, a Cereal-Based Fermented Beverage from the Balkan Peninsula Current Microbiol. 2006, 53; 209-216). 플란타리신 (plantaricin)의 생성은 몇몇 엘. 플란타룸 (L. plantarum ) 균주에 대해서는 전형적인 것이다. IIa 서브 클래스는 식품 유래의 병원체 억제 박테리오신을 포함하고, IIb 서브 클래스는 폭넓은 활성 범위, 즉 플란타리신 EF 및 플란타리신 JK, 플란타리신 S의 디펩티드 박테리오신에 결합 (harbour)한다. (Maldonado A., Ruiz-Barba JL, Floriano B, Jimenez-Diaz R., Int J Food Microbiol. 2002, 77(1-2):117-124. "The locus responsible for production of plantaricin S, a class IIb bacteriocin, produced by L. plantarum LPCO10, is widely distributed among wild-type L. Plantarum strains isolated from olive fermentation"). 잘 알려져 있는 것은, 야채 발효 과정에서 플란타리신 S를 생성하는 엘. 플란타룸 균주 LP RJ1 및 LPRJL2의 적용이다 (WO02/05665, WO0060948, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas). 후자의 균주는 콜리신을 가지는 항균 화합물의 유사한 군에 속하는데, 이는 동일한 종 및 속의 구성원을 대부분 공격한다 (Heinaru A, Tallmeister E. Colicin susceptibility of shigellas and coli bacteria related to episomal resistance and colicinogenicity or dissociation into S-R forms. Geneetika, 1971, 7, 5, 113-122 (in Russian). 그러므로, 이들은 원하지 않는 논-스타터 락토바실리의 억제를 위한 유망한 물질이 된다.

플란타리신의 생성은 여러 가지 유전자로 조절되는데, 일부는 가끔 일어나고, 일부는 규칙적으로 일어난다. 그러므로, 플란타리신 생성에서 표현형 차이가 일어난다. 박테리오신 생성과 관련된 게놈 위치는 플란타룸 균주 11 (Lactobacillus plantarum strain 11)에 기재되어 있다. plnEFI 및 plnJKLR로 명명되는 유전자의 이들 두개의 오페론은 각각 이중 글리신형 리더 서열을 가지는 2개의 소형 양이온성 박테리오신 유사 펩티드를 코딩하는 유전자 짝 plnEF 및 plnJK를 가진다. (Diep, D. B., Havarstein, L. S. & Nes, I. F. Characterization of the locus responsible for the bacteriocin production in Lactobacillus plantarum C11. J Bacteriol 1996, 178, 4472-4483). NSLAB를 억제할 수 있고, 유전자 EF 및 JK를 코딩하는 풀 셋트의 플란타리신을 보유하는 엘. 플란타룸 (L. plantarum) 균주에 관해서는 어떠한 기재도 없다.

항고혈압 프로바이오틱

과체중, 비만 및 혈압 증가, 혈당 증가와 아테롬성 콜레스테롤증의 기타 위험한 마커를 포함한 징후가 있는 대사 증후군을 앓는 사람이 점점 증가하고 있다. 지방이 풍부한 식품 (치즈 포함)도 전혀 문제가 없는 것은 아닌데, 왜냐하면 이들 식품은 아테롬성 동맥 경화증, 염증, II형 당뇨병 및/또는 지방 과산화증을 발병할 위험을 증가시킬 수 있기 때문이다 (Raff M., Tholstrup T., Basu S., Nonboe P., Sorensen MT, Straarup EM. 138.509-514. 건강하고 젊은 남성에서 공액 리놀렌산 및 버터가 풍부한 식단은 지질 과산화증을 증가시키지만, 아테롬성 동맥경화증, 염증 또는 당뇨병 마커에는 영향을 미치지 않는다 (American Society for Nutrition J. Nutr. 2008, 138:509-514).

공액 리놀레산 (CLA)은 18-탄수화물 리놀렌산의 2가지 자연 발생 이성질체 (LA, cis-9, cis-12-18:2)를 말한다. CLA는 천연 생체 수소화 및 산화 과정에서 형성된다. CLA 이성질체는 루멘에서 리놀레산의 생체 수소화 과정에 형성되고, 또한 유선에서 배센산의 전환을 통하여 형성된다. 최적의 투여량에서, 공액 리놀레산 (CLA) 이성질체는 매우 높은 건강 완화 가능성을 가지고 있는데, 즉, 이러한 것으로는 항균성, 항암성, 항당뇨병성, 항비만성 및 항알러지성이 있다. 항고혈압 효과는 몇 가지 연구 그룹에 의하여 증명된 바 있다 (Inoue K., Okada F., Ito R., Kato S., Sasaki S., Nakajima S., Uno A., Saijo Y., Sata F., Yoshimura Y., Kishi R. and Nakazawa H., Perfluorooctane sulfonate (PFOS) and related perfluorinated compounds in human maternal and cord blood samples: assessment of PFOS exposure in a susceptible population during pregnancy, Environ . Health Perspect . 112 (2004), pp. 1204-1207).

그러나, 식품으로 다량의 CLA를 보충하는 것은 무리가 있다. 하루에 CLA 5g을 섭취하는 것은 8-이소프로스타글란딘 F₂의 증가된 농도 (83%)에서 발현되는 지질 과산화 (LPO)를 증가시키는 것으로 증명되었다 (Raff M., Tholstrup T., Basu S., Nonboe P., Sorensen MT, Straarup EM. 138.509-514. A diet rich in conjugated linoleic acid and butter increases lipid peroxidation but does not affect atherosclerotic, inflammatory, or diabetic risk markers in healthy young men American Society for Nutrition J. Nutr. 2008, 138:509-514).

CLA 생성에 대한 조절능 및 생리학적으로 관련있는 항산화능을 모두 가지는 락토바실러스 균주를 사용하는 것이 가장 좋은 방법이다. 생리학적으로 관련 있는 항산화 LAB를 식품에 첨가하는 것은 LPO를 증가시키고, 지방 풍부 식품, 예컨대, 치즈의 생체 적합성을 향상시킨다. 타루투 대학 (Tartu University) 특허 EE04580 및 연구 논문에 기재된 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum ME-3)은 현저한 생리학적 항산화능을 가진다 (Kullisaar T, Zilmer M, Mikelsaar M, Vihalemm T, Annuk H, Kairane C, Kilk A. Two antioxidative lactobacilli strains as promising probiotics. Int. J. Food Microbiol., 2002, 72, 215-224; Kullisaar, T., Songisepp, E., Mikelsaar, M., Zilmer, K., Vihalemm, T., Zilmer, M. Antioxidative probiotic fermented goats' milk decreases oxidative stress-mediated atherogenicity in human subjects. Br. J. Nutr., 2003, 90, 449-456; Truusalu, K. Naaber, P., Kullisaar, T., Tamm, H., Mikelsaar, R-H., Zilmer, K., Rehema, A., Zilmer, M., Mikelsaar, M. The influence of antibacterial and antioxidative probiotic lactobacilli on gut mucosa in a mouse model of Salmonella infection. Microbial Ecology in Health and Disease 2004, 16:4, 180-187).

인간 혈액 및 소변에서 폴리아민의 농도는 상이한 폴리아민 농도를 가지는 식품 섭취 여부에 따라 변동하지만, 이. 콜라이 및 특정 혐기성 미생물 등의 인간 장내 마이크로플로라 (microflora) 중의 내부 폴리아민 프로듀서(producer)와 관련되어 있다 (Marino M. Maifreni M, Moret S., Rondinini G. The capacity of Enterobacteriaceae sp. to produce biogenic amines in cheese. Letters of Microbiology, 2000, 31, 169-173). 몇 가지 식품 제품은 비교적 높은 농도로 폴리아민을 함유하는데, 예컨대, 오렌지는 푸트레신 (putrescine) 1330 ㎍/100 g에 해당하는 상당량을 함유한다 (Larque E., Sabater-Molina M., Zamora S. Biological significance of dietary polyamines. Nutrition, 2007, 23, 87-95.). CLA 및 폴리아민의 중간 농도를 생성할 수 있고, 동시에 생리학적으로 관련 있는 항산화활성을 가지는 락토바실러스 균주는 지금까지 기재된 바가 없다.

혈압은 일산화질소 (NO) 등의 화합물, 지질 과산화(LPO), 산화 저밀도 지질단백질 (ox-LDL) 및 글루타치온 레드-ox 시스템 (GSSG/GSH)의 성분에 의하여 조절되는데, 이들 물질은 혈관의 유연함을 조절하고 이들의 혈관 수축에 영향을 미친다.

더욱이, LPO, ox-LDL, GSSG/GSH 수준의 증가는 아테롬성 동맥경화증에 있어 하나의 중요한 위험 인자이다. 아세틸화 스퍼미딘의 대사는 아세틸화된 형태와 폴리아민 보통 형태를 통하여 혈관 확장 (혈압 저하) 효과에 대한 추가의 가능성을 제공한다 (Myung CS, Blankenship JW, Meerdink DJ. A mechanism of vasodilatory action of polyamines and acetylpolyamines: possible involvement of their Ca2+ antagonistic properties, J Pharm Pharmacol. 2000, 52:695-707).

우유 중의 일부 펩티드는 안지오텐신 전환 효소 I (ACE)의 억제를 통하여 혈압 강하 효과를 가진다 (Meisel, H. & Bocklemann, W. Bioactive peptides encrypted in milk proteins: proteolytic activation and tropho-functional properties. In: Proceedings of the sixth symposium on lactic acid bacteria: genetics, metabolism and applications. 19-23 September. Veldhoven (W. N. Konings, O. P. Kuipers, and J. Huis in`t Veld., eds.) Kluver Academic Publishers, the Netherlands. 1999, pp. 207-215 (1999)).

일산화질소 (NO)는 항균 및 항염증 활성 및 혈압 강하 특성 같은 유리한 효과를 가지는 생활성 화합물에 속한다 (Janeway, CA, Travers, P, Walport, M, Shlomchik, MJ.　 2005.　 Immunobiology: The Immune System in Health and Disease.　 New York, NY:　 Garland Science Publishing). NO는 혈관의 연근육의 이완, ACE 억제 또는 내생성 보호 기작 (preconditioning) 의 촉진 등의 상이한 경로를 통하여 혈압에 영향을 미친다 (Jones SP, Bolli R The ubiquitous role of nitric oxide in cardioprotection. J Mol Cell Cardiol 2006; 40: 16-23).

오늘날, NO를 내생적으로 생성하고, 내생성 NO 생성을 촉진하는 프로바이오틱 미생물에 관한 몇 가지 기재만이 입수 가능하다. 내생성 NO 생성을 촉진하는 락트산 박테리아는 발리오 사 (Valio Ltd)의 EE00200230A 및 EE20020023의 특허 출원에 기재되어 있다. 특허 출원 EE00200230A는 광분해 활성을 가지고 디펩티드 및 트리펩티드를 생성하는 락토바실러스 균주 엘. 헬베티쿠스 (L. helveticus ) LBK-16H, DSM 13137를 기재하고 있다. 락트산 발효로 인하여 카제인으로부터 유래된 이러한 디펩티드 및 트리펩티드는 나노 여과에 의하여 농축되며, 발효유 제품을 포함하는 식품으로 적용되었을 때, 항고혈압 펩티드를 함유하는 식품이 생성되게 되는 것이다. 특허 출원 EE200200231는 디펩티드 및 트리펩티드 생성능 외에, 균주 엘. 헬베티쿠스 (L. helveticus ) LBK-16H, DSM 13137는 두 개의 세포주에서 NO를 생성할 수 있다 (마우스 및 인간 엔테로사이트)는 것을 기재하고 있다. 균주는 펩티드 및 NO의 생성을 통하여 혈압 강하를 돕는다. 저자들은 박테리아 세포가 유일한 NO 프로듀서가 아니라는 것을 지적하고 있다 (13 페이지 8~9째줄).

미국 특허 US7183108 (Compagnie Gervais Danone, 2007)은, NO 생성의 증가로 인하여 락토바실리우스 카세이 (Lactobacillus casei)가 항염증능을 가진다는 것을 기재하고 있다 (NO는 염증 촉진 사이토카인 활성화된 엔테로사이트에 의하여 생성된다). 그리고 반대로, 박테리아 NO 생성은 엔테로사이트가 염증 촉진 사이토카인 및 박테리아 리포폴리사카라이드에 의하여 이미 활성화되었을 때 하향 조절된다는 것도 기재하고 있다.

문헌 [Korhonen et al. 2001 (Korhonen K, Reijonen TM, Remes K, Malmstroem, K, Klaukka T, Korppi M. Reasons for and costs of hospitalization for paediatric asthma: A prospective 1-year follow-up in a population-based setting. Pediatr Allergy Immunol 2001:12:331-338)]은, 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus ) GG는 장내 상피 세포에 의하여 또는 염증 촉진 사이토카인의 유도에 의하여 NO 생성을 촉진할 수 있다는 것을 나타내고 있다. 이들 저자들은 LGG 및 NO 생성의 가능한 바람직한 관계를 지적하고 있다.

유럽 특허 EP0951290 (Laboratories Standa S.A., 2002)는 장내에서, 추측하기로는 엔테로사이트에서 NO의 생성을 위한 조성물에 적용되는 NO-생성 프로피오니박테리아를 기재하고 있다. 동일 문헌에, 균주 락토바실러스 파르시미니스 (Lactobacillus farciminis)는 음성 실험예로서 언급되어 있다 (소량의 NO 프로듀서). 그러나, USA 특허 US 7294337 (Institut National de la Recherche Agronomique, 2007)는 엘.파르시미니스 (L. farciminis)는 페리토니움 복막 신장 후 항염증 효과 및 통증의 억제를 위하여 충분량의 NO를 생성할 수 있음을 증명하였다.

엘. 퍼멘툼 (L. fermentum) 균주 LF1은 인간 세포 배양의 부재 하에서 MRS 브로쓰에서 NO를 호기적으로 생성할 수 있음이 기재된 바 있다. 동일한 저자에 의하여 시험된 엘. 플란타룸 균주 (L. plantarum ) DSM9843 (LP2)는 본 출원인의 균주인 엘. 플란타룸 (L. plantarum ) 텐시아 DSM 21380과는 반대로, 유사하게 작용할 수 없었다 (J.Xu, W.Verstraete. Evaluation of nitric oxide production by lactobacilli. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, 56:504-507). 전술한 특성을 가지는 프로바이오틱으로서의 균주를 인간 개체에게 혼입하는 것은, 전술한 바와 같이 균주의 NO 생성능 및 혈압 경로에 영향을 미치는 NO의 능력 때문에 혈압을 조절할 수 있게 한다.

식품에서 낮은 생존율과는 별도로, 프로바이오틱 박테리아의 선택은 장내 환경을 통과하는 데 있어, 균주의 낮은 생존율 문제에 직면하게 된다. 그러므로, 이렇게 장의 상부 뿐만 아니라 하부에서 생존할 수 있는 프로바이오틱 락토바실러스가 필요한 실정이다. 국제 특허 출원 WO 91/05850 (Tartu University et al., 1989)은 박테리아 장세균총 이상 (dysbiosis)의 경우에 결장내 마이크로플로라를 조정하기 위하여 유용한 것으로서 엘. 플란타룸 (L. plantarum 38)을 기재하고 있다. 유럽 특허 EP0554418 B1 (Probi AB, 1998)은 인간 장에서 엘. 플란타룸 (L. plantarum ) 299 (DSM 6595)의 양호한 콜론화 특성을 기재하고 있으며, 장내 감염에 대하여 수술 환자를 위한 오트밀 드링크를 사용하는 균주의 적용을 기재하고 있다. 국제 특허 출원 WO2007/003917 A1 (Matforsk AS et al, 2006)은 락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum ) DSM 16997 (DSM 17320) 균주 및 엘. 펜토수스 (L. pentosus (DSM17321)) 균주를 육류 제품에서의 스타터 미생물로 기재하고 있다. 저자에 따르면, 이들 균주는 유해한 박테리아의 억제를 통하여 인간 장내 마이크로플로라의 균형을 맞추는 프로바이오틱으로서 또한 대장균으로서 기능할 수 있다고 한다. 이들 주장을 입증하기 위하여, 시험관내 실험 결과를 제시한다. 그러나, 생체내 (즉, 동물 모델 실험) 병원체 억제 능력에 관하여는 증거를 제시하지는 않았다. 뿐만 아니라, 소시지 환경에서 낮은 pH 값에서의 논-스타터 락토바실리 (NSLAB)의 생존은 기재되어 있지만, 논-스타터 락토바실리의 억제는 증명하지 않았다. 증거 없이, 전술한 프로바이오틱 균주를 투여함으로써 프로바이오틱 균주가 면역 자극에 기여하고 수술 후 장내의 패혈증 저하 특성을 가지며 환자의 웰빙을 개선시킨다고만 되어있다.

특허 EE04097 B1 (Probi AB, 2003)은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 299v (DSM 9843)을 요도 감염의 치료에 적용하지만, 이 균주는 이의 만노스 특이적 접착 때문에 인간의 결장내 상피에 접착될 수 있고, 접착 부위에 대하여 유해한 요도 병원체와 경쟁함을 기재하고 있다. REA (제한 효소 타입) 분석에 따르면, 모든 전술한 균주는 서로 다른 것이며, 명백히 구분되는 크로모좀 특성에 대하여 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)과는 다른 것들이다.

항균 프로바이오틱 미생물인 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 항균 물질, 즉 락트산, 아세트산, CLA, NO, H₂O₂을 생성하고, 항균 화합물을 코딩하는 플라타리신 IIb 유전자 짝 EF 및 JK를 보유한다. 이의 대사물을 사용하여, 락토바실러스 플란타룸 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum DSM 21380)은 논-스타터 락토바실러스 및 장내 병원체 양자를 시험관내에서 억제한다. 이 균주는 저온 및 탄수화물 결핍 조건 (예컨대, 치즈)에서 생식하여 락토바실러스들 중 우점균이 될 수 있다.

항균 활성 외에도, 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 NO, CLA의 생성 및 항산화성 때문에 항고혈압 및 항산화 프로바이오틱이 되고, 시험관내에서 소량의 폴리아민 티라민 및 푸트레신을 생성하며, 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)를 포함하는 치즈의 3주 섭취 후 지원자의 장내 마이크로플로라 중 우점균이 된다. 인간의 장내에서 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)의 양호한 군집 형성 능력은 DGGE 프로파일 및 전통적인 박테리아학적인 방법 양자를 사용하여 대변 시료로부터 검출 가능하였다. 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 인체에서 수축기 혈압 및 이완기 혈압을 낮추는 것과 함께, 푸트레신 및 아세틸화된 스퍼미딘의 대사를 상당히 활성화한다.

균주 특성 설명

본 발명의 목적인 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 에스토니아 및 스웨덴 아동의 마이크로플로라의 비교 연구 도중 건강한 아동의 대변으로부터 분리된 것이다. 미생물 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 건강한 1세 에스토니아 아동의 대변의 희석액을 접종함으로써 분리되었다 (0.04% 티오글리콜산을 함유하는 인산 완충액 중 10^-2 - 10^-7 ; pH 7.2). 희석액을 새로 조제한 MRS 아가 배지 (Oxoid)에 접종하고, 산소를 공급하며 37℃에서 배양하였다. 본 발명의 목적이 되는 균주를 콜로니 및 세포의 형태적 특징에 따라 락토바실러스 아종으로 분류하였다. 후술하는 바와 같이, 예비 동정 및 더 정확한 동정을 하였다.

미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)이 건강한 아동의 장에서 유래되었다는 사실은, 이의 GRAS (Generally Recognized As Safe; 일반적으로 안전하다고 인식되는) 상태를 증명하는 것이며, 이는 곧 이러한 미생물 균주가 인간 개체에게 무해하며 경구 투여용으로 적합하다는 것을 의미한다.

미생물 락토바실러스 플란타룸 텐시아 균주는 독일 미생물 균주 보존 센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁 번호 DSM 21380으로서 2008년 4월 16일에 기탁되었다.

배양-형태학 특징은 MRS 아가 및 MRS 브로쓰 (OXOID)에서 배양한 후 검사하였다. 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 그람 양성균이고, 규칙적 형태의 스포어를 형성하지 않는 막대형이며, 단쇄 또는 짝을 이룬 상, 단상이다 (occuring singly, in pairs or in short chains).

생리학-생화학적 특징

MRS 브로쓰는 미호기성 환경 (microaerobic)에서 24 내지 48시간 동안에 균주를 배양하기에 적합한데, 그 이후 브로쓰 중에서 균질하고 탁한 성장이 발생한다. 호기성 조건에서 37℃에서 (CO₂/O₂/N₂ 대기: 10/5/85)에서 48시간 성장시킨 후 MRS 아가 플레이트 상의 콜로니는 직경 2 내지 2.5 mm의 원형이고, 부드럽고 (sooth), 온전하며 (entire), 볼록형 (convex)이고 백색이었다.

최적 성장 온도는 37℃이다. 이는 15℃ 및 45℃에서도 성장한다. 성장 환경의 최적 pH는 6.5이다.

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 카탈라아제 및 옥시다아제에 반응하지 않았고, 우발적 헤테로발효성 (facultatively heterofermentative)이었으며, 글루코스로부터 기체를 생성하지 않았고, 아르지닌 가수 분해가 없었다.

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 API 50CHL System (bioMerieux, France) 키트를 사용하여 생화학적 활성을 기초로 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum ) (균주 타입과의 일치성: 양호, ID %-99.9, T index -0.86)으로 동정되었다.

락토바실러스 플란타룸 ATCC 15917 (Lactobacillus plantarum ATCC 14917)과 비교 결과, API 50CHL에 의한 예비 동정이 확인되었다.

API 50 CHL에 따른 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)의 탄수화물 활용 특징은 다음과 같다. 리보스, L-아라비노스, 갈락토스, D-글루코스, D-프럭토스, D-만노스, 만니톨, α 메틸-D-만노사이드, α 메틸-D-글루코사이드, N 아세틸-글루코사민, 아미그달린 (amygdalin), 아르부틴 (arbutine), 에스쿨린 (esculine), 살리트신 (salitsin), 셀로바이오스 (cellobiose), 말토스, 락토스, 멜리바이오스 (melibiose), D-아라비노스, 사카로스, 트레할로스, 멜레지토스 (melezitose), D-라피노스 (raffinose), β-gentiobiose(젠티오바이오스), D-투라노스 (turanose), 글루코네이트 (gluconate)에 대하여 양성 반응. 녹말에 대하여 약한 반응.

API ZYM 시험 키트 (bioMerieux, France)에 따르면, 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 루신 아릴아미다아제, 산 포스파타아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 및 아세토인 활성을 가진다. 발린 아릴아미다아제, 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라아제, β-갈락토시다아제, 시스틴 아릴아미다자에, 에스테라아제 (C4), 에스테라아제 (C8), N-아세틸-β-글루코스아미다아제에 대한 약한 반응이 검출되었다.

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)의 분자량 확인은 참조 균주 락토바실러스 플란타룸 ATCC 14917 (Lactobacillus plantarum ATCC 14917)에 대비하여 내부 전사 스페이서 폴리머라아제 체인 리액션 [Internal-Transcribed Spacer Polymerase Chain Reaction (ITS-PCR)]으로 확인하였다 (도 1).

방법. 균주 동정은 참조 균주 락토바실러스 플란타룸 ATCC 14917 (Lactobacillus plantarum ATCC 14917)과 대비하여 ITS-PCR으로 확인하였다.

락토바실러스 분리체로부터의 DNA 추출을 라이소자임 (Serva, Sweden; 20 mg/ml), 뮤타노라이신 (Sigma; 0.5 mg/ml) 및 프로테이나아제 K 용액 (Fermentas, Lithuania; 14.6 mg/ml)을 사용하여 수행하였다.

DNA 증폭을 1.5U Taq 폴리머라아제 (Fermentas, Lithuania), 각 프라이머 0.5 μM (16S-1500F 및 23S-32R; DNA Technology AS), 200 μM 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 (Amersham Pharmacia Biotech, Germany), 2 mM MgCl₂ 및 연구 중인 DNA 2㎕를 함유하는 1xTaq 폴리머아라제 완충액 중에서 수행하였다.

이어서, PCR 생성물을 Taq I 제한 효소 (Fermentas, Lithuania)를 사용하여 분해하였다. PCR 생성물을 1xTBE 완충액 중의 2% 아가로스 겔 상에서 분리하였다 (전압 100V). 밴딩 패턴을 UV광으로 가시화하고, 참조 균주 (L. plantarum ATCC 14917)와 비교하였다.

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380) 분자 핑거프린트를 펄스장-겔-전기영동 (PFGE)를 사용하여 참조 균주 (L. plantarum )와 비교하였다 (도 2).

방법. 펄스장-겔-전기영동 (PFGE)법을 위하여, 락토바실러스 균주를 37℃에서 24시간 동안 MRS 브로쓰에서 생장시켰다. 이 세포를 SE 완충액 (75mM NaCl, 25mM EDTA, pH=7.4)으로 세척하고, 세포 현탁액 밀도를 1.5 (OD₆₀₀)로 조정하였다. 락토바실러스 단리체로부터의 DNA 추출을 EC 완충액 ((50mM EDTA (pH 8.5), 0.5% Na-라우릴사코신, 0.2% Na-데옥시콜레이트 2 mg/ml 라이소자임, 10U 뮤타놀신) 중에서 수행하고, 이어서 1 mg/ml 프로테이나아제 K 용액 (100 mM EDTA-1% 사코실-0.2% 데옥시콜레이트, pH 8.0)을 함유하는 완충액 중에서 수행하였다. 분해된 탐침을 TE 완충액으로 세척하고, 2 mm로 절단한 다음에, 효소 50U Not I (Bio-Rad)로 밤새 추출하였다. 22시간 동안 14℃에서 CHEF-DR II (Bio-Rad) 중에서 전기 영동을 수행하였다. 밴딩 패턴을 UV 광 일루미네이터로 가시화하였다.

항생제에 대한 내성

방법. 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)을 E-test (AB Biodisk, Solna)의 항생제 스트립을 사용하여 시험하였다. MIC (최소 억제 농도; minimal inhibitory concentration)를 유럽 위원회 (EUC)가 권고한 전염병 브레이크 포인트(break point)에 따라 측정하였다. 아래 표 1은 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)의 항생제 내성을 나타낸다.

항생제	MIC* (㎍/ml)	MIC* (㎍/ml)	EUC 항생제 내성 MIC* 브레이크 포인트 값 (㎍/ml)
항생제	락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)	대조 균주 락토바실러스 플란타룸 DSM 21379 (L. plantarum DSM 21379)	EUC 항생제 내성 MIC* 브레이크 포인트 값 (㎍/ml)
앰피실린	0.25	0.19	4
젠타마이신	1.5	1	64
스트렙토마이신	16	6	64
에립토마이신	0.19	0.25	4
클린다마이신	0.032	0.016	2
테트라사이클린	8	6	32
클로람페니콜	2	2	8
사이프로/오플록사신	32	32	4
퀴노프리스틴/달포프리스틴	1	1	4
(*: 최소 억제 농도)

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 대부분의 주요 항생제에 대한 내성을 나타내지 않았다.

사이프로플록사신에 대한 다소 높은 MIC가 전술한 야생형 균주의 정상적인 범위에서 검출되었다. 그러므로, 아마도 야생형 균주인 것으로 보이고 (Vankerckhoven V, Huys G, Vancanneyt M, Vael C, KlareI, Romond M-B, Entenza J M, Moreillon P, D. Wind R, Knol J, Wiertz E, Pot B., Vaughan E. E, Kahlmeter G, Goossens H. Biosafety assessment of probiotics used for human consumption: recommendations from the EU-PROSAFE project. Trends in Food Science & Technology 2008; 19: 102e114), 프로바이오틱으로서 균주의 적용 동안에 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)의 항생제 내성 유전자의 수평 전달은 예측할 수 없었다.

기능적 특성

대사의 특성

방법. 24시간 및 48시간 동안 미호기성 환경 (microaerobic milieu) 중에 인큐베이션한 후 기체 크로마토그래피 방법 (Hewlett-Packard 6890)에 의하여 대사물의 특징을 측정하였다 (표 2). 엘. 플란타룸 (L. plantarum) 균주를 48시간 동안 MRS 아가에서 미호기성 환경에서 성장시켰다 (10% CO₂). 락토바실러스 배양액의 현탁액 (McFarland 4.0 탁도 표준, 10⁹CFU/ml)을 0.9% NaCl 용액 중에 제조하였다. 이 현탁액 1.0 ml를 MRS 브로쓰 9.0 ml에 전달하였다. 대사물 농도 (mmol/l,)를 모세관 컬럼 (HP-INNOWax (15 m × 0.25 mm; 0.15 μm))을 사용하여 검출하였다. 컬럼 온도 프로그램은 60℃ 1분, 20℃/분 120℃ 10분; 검출기 (FID) 350℃이었다.

H₂O₂의 전기 화학적 측정을 Apollo 4000 프리 라디칼 애널라이저 (WPI, Berlin, Germany) 및 타입 ISO-HPO2 및 ISO-NOP의 전극을 사용하여 MRS 브로쓰 500㎕ 중의 24시간 된 전세포로 수행하였다.

ISO-HPO2 전극 시그널을 5-7분마다 기록하였다. 평균 시그널 강도를 계산하였다. 각 실험 포인트를 4회 독립적으로 평행 측정하고, 각 평행값을 2회 측정하였다. H₂O₂ 농도를 전극 시그널의 강도에 따라 표준 곡선에 따라 계산하였다. 아래 표 2는 전세포의 H₂O₂ 농도 (㎍/ml) 및 24 및 48시간 동안 미호기성 배양시 MRS 브로쓰 중의 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)의 아세트산, 락트산 및 숙신산 농도 (mmol/l)를 나타낸다.

락토바실러스 플란타룸	아세트산 (mmol/l)		락트산 (mmol/l)		숙신산 (mmol/l)		H₂O₂ (㎍/ml)
락토바실러스 플란타룸	24 h	48 h	24 h	48 h	24 h	48 h	전세포 24 h
텐시아 DSM 21380	1.4	1.7	112.2	129.2	0.6	0.6	196.4 ±128.8
DSM 21379	2.1	2.4	133.3	186.6	0.6	0.6	288.9 ±175.8

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 아세트산, 락트산 및 과산화수소 상당량을 생성한다. 그러나 Apollo 애널라이저 시그널에 따른 후자의 농도는 대조군 균주보다 다소 낮다.

병원체 및 논-스타터 락토바실러스에 대한 항균 활성

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 논-스타터 락토바실러스 및 수종의 장내 병원체에 대한 중간 정도의 길항 활성을 MRS 아가 상에서 시험관내에서 발현하였다 (표 3). 이러한 특성은 식품의 저장 수명의 연장을 위한 균주의 사용을 가능하게 한다. 아래 표 3은 변형된 MRS 아가 배지 상의 병원체 및 논-스타터 락토바실러스에 대한 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380) 항균 활성을 나타낸다 (병원체 성장 억제 구역, mm)

병원체	성장 억제 구역 ( mm )
논-스타터 락토바실러스 (NSLAB)	8.6 ± 4.07
리스테리아 모노사이토게네스 ( Listeria monocytogenes )	25.1 ±1.7
예르시니아 엔테로코리티카 ( Yersinia enterocolitica )	13.5 ± 1.7
살모넬라 엔테리티디스 ( Salmonella enteritidis )	25.2 ±1.5
에스.엔테리카 세로바 티피무륨 (S. enterica serovar Typhimurium)	22.8 ±0.1
시겔라 소네이 ( Shigella sonnei )	25.1 ±1.6
에스케리치아 콜라이 ( Escherichia coli )	29.8 ±3.7
엔테로박터 사카자키 ( Enterobacter sakazakii )	18.5 ±3.61
캄필로박터 제주니 ( Campylobacter jejuni )	12.9 ±5.2

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)의 스트릭-라인 (streak-line) 절차 중의 시험관내 항균 활성 (대사물의 항균 효과)는 이. 콜라이에 대하여 가장 높았고, 그 다음이 살모넬라 에스피 (Salmonella sp.), 시겔라 에스피 (Shigella sp ) 및 리스테리아 에스피 (Listeria sp.)의 성장 억제능이었다. 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)의 가장 낮은 항균 활성은 다른 락토바실러스 (NSLAB)에 대한 것이었다.

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 박테리오신 유전자

방법: 락토바실러스 플란타룸 WCFS1 유전자 plnE , plnF plnJ 및 plnK에 기반한 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 박테리오신 인코딩 유전자의 검출. 이들 유전자는 박테리오신 전구체 펩타이드를 코딩한다 (Lactobacillus plantarum WCFS1 genome annotation - Kleerebezem et al 2003. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Feb 18; 100 (4): 1990-5). PCR 프라이머를 Primer Express^®를 사용하여 디자인하였다. 락토바실러스 플란타룸 WCFS1로 주석이 달린 게놈 (Lactobacillus plantarum WCFS1 annotated genome)을 NCBI 게놈 브라우저 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genomes)로부터 다운로드하였다.

디자인된 프라이머를 E1F, E1R, F1F, F1R, J1F, J1R, K2F, K2R (참조: 서열 목록)으로 지정하였고, PCT 반응 결과, 모든 전술한 서열에 대한 양성 시그널이 있었다. 엘. 플란타룸 (L. plantarum BAA-793 NCIMB 8826)을 양성 대조군으로서, 엘. 플란타룸 (L. plantarum DSM 21379)을 음성 대조군으로서 사용하였다. 아래 표 4는 락토바실러스 플란타룸 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum DSM 21380)의 게놈 DNA 박테리오신 인코딩 유전자 plnE , plnF , plnJ and plnK의 증폭된 PCR 생성물의 존재를 나타낸다.

	유전자
	plnE	plnF	plnJ	plnK
락토바실러스 플란타룸 BAA-793 (NCIMB )8826 (L. plantarum BAA-793 (NCIMB 8826))	+	+	+	+
락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)	+	+	+	+
락토바실러스 플란타룸 DSM 21379 (L. plantarum DSM 21379)	+	+	-	-

다른 항균 화합물 중에서도 엘. 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)의 길항 활성은 전술한 유전자 산물, 예컨대, 항균 펩타이드에 기반한 것이다. 펩티드 E & F 및 J & K는 디펩티드를 통하여 최대 반응을 얻기 위하여 동시에 발현되어야 한다.

엘. 플란타룸 텐시아 DSM 21380에 의한 공액 리놀레산 ( CLA )의 생성

방법. MRS 브로쓰 (de Mann-Rogosa-Sharpe, Oxoid, UK) 및 탈지유 중에서 전술한 측정법에 의하여 CLA의 생성을 측정하였다.

MRS 브로쓰 39.9 mg/l (중간)

탈지유 19.2 mg/l (중간)

치즈 3.0 ±0.3 mg/g

엘. 플란타룸 텐시아 DSM 21380 ( L. plantarum Tensia DSM 21380)에 의한 일산화질소 ( NO )의 생성

방법. Apollo 4000 프리 라디칼 애널라이저 (WPI, Berlin, Germany) 및 전극 타입을 사용하여 MRS 브로쓰 500μ 중에 24시간 된 전세포로 일산화질소 생성물 측정을 수행하였다. ISO-NOP 전극 시그널을 5-7분 동안 기록하였다. 평균 시그널 강도를 계산하였다. 각 실험 지점을 4회 독립 평행으로 측정하고, 각 평행을 2회 측정하였다. NO 농도를 전극 시그널의 강도와 관련 있는 표준 곡선에 따라 계산하였다. 아래 표 5는 엘. 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)에 의하여 생성된 NO 농도를 나타낸다 (μM).

균주 번호	NO 농도 (μM)
락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)	2.6 ±0.8
락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21379 (L. plantarum DSM 21379)	2.7 ±1.2
락토바실러스 코프로필러스 (L. coprophilus )	2.1 ±1.1
락토바실러스 플란타룸 (L. plantarum )	2.1 ±0.9
락토바실러스 파라카세이 에스에스피 파라카세이 균주 번호 1 (L. paracasei ssp paracasei strain no1)	1.3 ±0.8
락토바실러스 파라카세이 에스에스피 파라카세이 균주 번호 2 (L. paracasei ssp paracasei strain no 2)	1.8 ±0.9
락토바실러스 파라카세이 에스에스피 파라카세이 균주 번호 3 (L. paracasei ssp paracasei strain no 3)	2.8 ±1.6
락토바실러스 부크네리 (L. buchneri )	2.0 ±1.1

엘. 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)은 다른 8개의 락토바실러스 아종 균주와 비교하여, 가장 뛰어난 NO 생성 균주였다.

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 ( L. plantarum Tensia DSM 21380)의 항산화 활성

방법. 미생물 세포의 TAA 및 TAS의 검출을 위하여, 엘. 플란타룸 텐시아 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) 균주를 MRS 브로쓰 (Oxoid, U.K.) 중에서 24시간 동안 37℃에서 인큐베이트하였다. 미생물 세포를 4℃에서 원심분리 (1500 RPM, 10분간)하여 회수하고, 펠릿을 등장 식염수 (4℃)로 세척한 다음에, 1.15% KCl (Sigma, USA) 중에 현탁시켰다. 현탁액의 밀도는 1.1 x 10⁹ 박테리아 세포 ml^-1)의 OD ₆₀₀이었다. 총 항산화 활성 (Total antioxidative activity; TAA)은 리놀렌산 시험 (LA-시험)을 사용하여 측정하였고 (Kullisaar, T, Songisepp, Mikelsaar M, Zilmer, K, Vihalemm, T, Zilmer, M. British J of Nutrition. Antioxidant probiotic fermented milk decreases oxidative stress-mediated atherogenicity in human. 2003, 90, 2, 449-456), 총 항산화 상태 (total antioxidative status; TAS)를 시판 키트로 측정하였다 (TAS, Randox Laboratories Ltd., UK) (표 6). 아래 표 6은 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)의 총항산화 활성 (TAA) 및 총항산화 상태 (TAS)를 나타내는 것이다.

균주	TAA (%)	TAS (mmol/l)
락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)	22±5	0.05±0.02
락토바실러스 플란타룸 DSM 21379 (L. plantarum DSM 21379)	26±1.2	0.13±0.04

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380) 균주의 TAA 및 TAS 값은 락토바실러스 플란타룸 DSM 21379 (Lactobacillus plantarum DSM 21379)보다 다소 더 낮았다.

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)의 매개 변수들은 락토바실러스 퍼멘툼 (L. fermentum ME-3 (DSM14241)) 균주의 항산화 수치보다 더 낮았다 (ME-3, TAA: 29±0.7; TAS: 0.16±0.03).

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 ( Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)의 시험관내 폴리아민 생성

방법. 미생물 균주를 맥파랜드 (McFarland) 탁도 표준 (10⁹ CFU/ml)에 따라 생리 식염수 중에 현탁시키고, 각 균주 현탁액 0.5 ml를 탈카르복실화 매질 (4.5 ml) 중에 접종한 다음, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이트하였다 (Bover-Cid et al., 1999).

BA의 검출을 위하여, 매질 200 ㎕를 나코비치법 (Nakovich, L. Analysis of biogenic amines by GC/FID and GC/MS. Thesis, Virginia polytechnic institute, USA. 2003)의 변형법으로 GC 분석에 맞추어 유도체화하였다.

GC 분석은 모세관 컬럼 HP-5 19091J-413 (30 m ×0.32 mm; 0.25 ㎛)이 장착된 기체 크로마토그래피 HP 6890 Series GC 시스템으로 수행하였다. 컬럼 온도 프로그램은 160℃ 1분, 20℃/분 280℃ 15분; 및 검출기 (FID) 300℃였다. 아래 표 7은 탈카르복실화 매질 중의 시험관내 폴리아민의 농도를 나타낸다 (Arena, M. E., Manca de Nadra, M. C. Biogenic amine production by Lactobacillus . J. Applied Microbiology 2001, 90, 158-162.)

시료	폴리아민 (㎍/ml) 및 생체 유래 아민
	아르지닌		글루타민		라이신		오르니틴		히스티딘
	푸트레신	카다베린	푸트레신	카다베린	푸트레신	카다베린	푸트레신	카다베린	히스타민
락토바실러스 플란 타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)	0	0	0	0	0	0.3	0.5	0.6	0
락토바실러스 플란 타룸 DSM 21379 (L. plantarum DSM 21379)	0	0.4	1.2	0.5	0	0.4	1.9	0	0
이. 콜라이 ATCC 700336 (E. coli ATCC 700336)	18.4	1.7	12.3	18.4	1.8	240	1599.3	3.5	105.1

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)은 오르니틴으로부터 폴리아민 푸트레신 소량을 생성하였다. 생체 유래 아민으로부터, 카다베린 미량이 검출되었다. 히스타민은 생성되지 않았다.

도 1: ITS-PCR에 의한 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380) 분자 동정
1. 락토바실러스 플란타룸 DSM 21379 (L. plantarum DSM 21379)
2. 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)
3. 락토바실러스 플란타룸 CRL 972 (ATCC 14917)(L. plantarum CRL 972 (ATCC 14917))
M- 100bp 마커 (Fermentas)
도 2: 락토바실러스 플란타룸 대조군 균주와 비교한 락토바실러스 텐시아 DSM 21380 분자 핑거프린트 (펄스장 겔 전기영동 특성, PFGE).
1. 람다 래더 PFG 마커 (New England Bio Labs Inc.)
2. 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)
3. 락토바실러스 플란타룸 DSM 21379 (L. plantarum DSM 21379) (대조군)
도 3. DGGE 방법에 의한 치즈에서 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380) 존재 (프로바이오틱 첨가제 첨가 치즈, 대조군 치즈, 프리바이오틱 첨가제 첨가 치즈)
DGGE 겔-전기영동 형태 시험- 치즈
1. 치즈 번호 529
2. 대조군 치즈
3. 치즈 번호 5
4. 엘. 플란타룸 (L. plantarum) 균주 번호 1
5. 치즈 번호 9-1
6. 엘. 플란타룸 (L. plantarum ) DSM 21379
7. 치즈 번호 19
8. 엘. 플란타룸 (L. plantarum ) 균주 번호 1
9. 치즈 번호 9-2
10. 엘. 플란타룸 (L. plantarum ) DSM 21379
11. 엘. 플란타룸 (L. plantarum ) Tensia DSM 21380 치즈
12. 엘. 플란타룸 (L. plantarum ) Tensia DSM 21380 순수 배양액
13. 치즈 번호 4
14. 치즈 번호 12
15. 엘. 플란타룸 (L. plantarum ) 균주 번호 1
16. 엘. 플란타룸 (L. plantarum ) DSM 21379
도 4. 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380) 그룹에서 피어슨 UPMAG 클러스터 분석에 의한 락토바실러스 종
도 5. 수축기 혈압의 감소 (모집(recruitment)시 수축기 혈압과 비교하여 시험의 막바지 혈압)
(a) 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)를 함유하는 치즈 섭취 후 락토바실러스 계수의 최소 증가 (FISH)와의 비례 관계 (r=0.615, p=0.044, n=11)
(b) 모집시의 값과 비교하여 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)를 함유하는 치즈 섭취 후 지원자의 소변에서 푸트레신의 증가와의 관계 (r=0.631, p=0.037, n=11).

실시예 1: 식품에서 NSLAB 미생물의 억제

에스토니아 치즈를 사용한 시험

방법. 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380) 미생물을 낙농회사 E-Piim의 치즈 우유에 넣고 (접종량 3x10⁸CFU/vat), 이 우유를 응유 (renneted) (25 분)하였다. 커드를 절단하고 (25분), 가열하고 (34℃, 15분), 건조시키고 (25분), 압축하고, 배수시키고 (1시간), 염수 중에서 20시간 가염하고 (12℃; 20% NaCl; pH 4,7), 배수 및 건조시키고 (8시간), 봉투에 넣어 최소 4주 동안 12℃에서 성숙시켰다. 아래 표 8은 성숙 28일째 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)를 함유하는 치즈에서의 락토바실러스 함량을 나타낸다.

	락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacill us plantarum Tensia DSM 21380)를 함유하는 치즈	대조군 치즈 pH 5.1	락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380)를 함유하는 치즈 (지원자 시험에 사용된 것)			대조군 치즈
		대조군 치즈 pH 5.1	3일	28일	3개월	3일	28일	3개월
락토바실러스 에스피 ( Lactobacillu s sp )	10⁹	9x10⁵	6x10⁵	5x10⁸	5x10⁷	ND	10⁸	10⁷
락토바실러스 플란타룸 (L. plantarum )	10⁹	2x10³	6x10⁵	5x10⁸	5x10⁷	ND	ND	ND
락토바실러스 카세이 (L. casei )	ND	8x10⁵	ND	ND	ND	ND	ND	ND
락토바실러스 부크네리 (L. buchneri )	ND	10⁵	ND	ND	ND	ND	ND	ND
OHOL*	ND	ND	ND	ND	ND	ND	2x10³	ND
OHOL - 강제적 호모발효(homofermentative) 락토바실러스 ND - 불검출

락토바실러스 플란타룸 균수는 대조군 치즈와 비교하여, 28일째까지는 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 치즈에서보다 1000배 더 높았다. 대조군 치즈에서, 호모발효 락토바실러스인 락토바실러스 카세이 (L. casei ) 및 락토바실러스 부크네리 (L. buchneri ) 균주가 존재한 반면, 모든 전술한 종은 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380 )을 함유하는 치즈에서 부존재하였다. 그러므로, 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)은 이 균주를 함유하는 치즈를 오염시키는 미생물을 억제하고 치즈의 NSLAB을 억제하는 능력을 가진다. 치즈를 오염시키는 미생물을 억제하는 능력은 제조 후 식품에서 발생하는 병원체를 억제하는 능력일 수도 있다. 그러므로, 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 첨가하면 식품의 저장 수명을 연장시키는 것을 도울 수 있다.

DGGE 에 의한 치즈에서 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 ( L. plantarum Tensia DSM 21380)의 검출

방법. 미생물 DNA를 키트 [QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)]에 의하여 치즈로부터 분리하였고, 이를 프라이머 968-GC-f (GGGAACGCGAAGAACCTTA-GC), 1401-r (CGGTGTGTACAAGACCC)로 증폭시켰다.

PCR 생성물을 Dcode^TM 시스템 기술 (Bio-Rad, Hercules, California)을 사용하여 30~60% 아크릴아미드 함유 겔 상에서 DGGE 전기 영동으로 분리하였다 (도 3).

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 ( L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 치즈에서 생체 아민의 검출

방법. 치즈 샘플을 추출하고 (50% 메탄올 용액 20 ml를 치즈 10 g에 넣고, 45℃에서 1시간 동안 인큐베이트한 다음, 30℃로 냉각시키고 원심분리하였다), 상층 200㎕를 타르투 대학 미생물학과에서 나코비치법 ((Nakovich, L. 2003, GC/FID 및 GC/MS에 의한 생체 아민의 분석)의 변형법으로 GC 분석을 위하여 유도체화하였다.

GC 분석은 모세관 컬럼 HP-5 19091J-413 (30 m ×0.32 mm; 0.25 ㎛)이 장착된 기체 크로마토그래피 HP 6890 Series GC 시스템으로 수행하였다. 컬럼 온도 프로그램은 160℃ 1분, 20℃/분 280℃ 15분; 및 검출기 (FID) 350℃였다. 아래 표 9는 산업적 시험으로부터 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 시험 치즈에서 생체 아민 및 폴리아민을 나타낸다.

시료	제조 3~4일 후 치즈에 포함된 생균수	아민 (mg/kg)			성숙한 치즈 속의 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) 생균수
시료	제조 3~4일 후 치즈에 포함된 생균수	티라민	푸트레신	카다베린
락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) 1. 뱃치	6.5x10⁸	0.69	1.32	0	10⁶
대조군 치즈 1. 뱃치	-	2.31	1.82	0	-
락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) 2. 뱃치	4.5x10⁶	2.65	7.46	0	6x10⁸
대조군 치즈 2. 뱃치		5.64	1.84	0	10⁷
락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) 3. 뱃치	2x10⁶	5.49	7.29	0	10⁸
대조군 치즈 3. 뱃치	-	0	0	0	-

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)은 치즈 1 kg당 티라민 0.69 내지 5.48 mg을 생성하였고, 푸트레신은 그보다 더 적은 양, 즉 1.32-7.46 mg/kg을 생성하였다.

실시예 2: NIH 마우스를 사용한 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 ( L. plantarum Tensia DSM 21380) 안전성 시험

에스토니아 수의학 및 식품 이사회 (Estonian Veterinary and Food Board)의 승인을 받기 위하여, 프로바이오틱 균주 및 이들 균주를 함유하는 식품의 안정성을 시험해야만 한다.

방법. NIH 마우스를 사용한 실험 모델에서, 마우스 3개군을 30일간 상이한 치즈를 섭취하도록 하였다 (아무런 첨가제가 없는 대조군 치즈, 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 치즈). 마우스를 양호한 컨디션에 있도록 하고, 치즈를 투여하였더니, 체중 증가가 초래되었으며, 털이나 소화에서의 변화는 검출되지 않았다. 투여된 균주 또는 다른 미생물이 혈류나 조직으로 이동되는 것은 검출되지 않았다. 간 및 비장의 형태 및 조직학 평가를 통한 병리학적 변화도 관찰되지 않았는데, 이는 곧 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)의 안전성을 증명하는 것이다.

실시예 3. 건강한 지원자의 혈액 지수 및 마이크로플로라에 미치는 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 ( L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 치즈의 효과

임상 시험 (무작위화된 맹검 교차 위약 제어 시험)의 목표는 건강한 지원자에 미치는 항균 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)를 함유하는 치즈의 장 마이크로플로라에 미치는 효과 및 안전성을 평가하기 위한 것이다.

참가자 및 방법: 참가자는 건강한 남성 및 여성 지원자로서 12명이었다 (남/여 5/7: 21세 내지 43세). 당뇨병을 제외시키기 위하여, 글루코스 및 글리코헤모글로빈 HbA1c을 혈청에서 검출하였다.

시험된 치즈는 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하였다 (생균수 5x 10⁸ CFU/치즈 (g)). 섭취 전, 시험 치즈를 30일 동안 12℃에서 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)와 함께 인큐베이트하였다. 첨가제가 없는 보통의 에스토니아 치즈를 대조군으로서 사용하였다. 시험은 무작위 맹검 교차 위약 제어 시험이었다. 시험 치즈를 3주간 섭취하는 것으로 시작하여, 2주간의 세척 기간을 두고, 그 이후 대조군 치즈를 3주간 소비하였다. 투여량은 50 g/1일이었다. 아래 표 10은 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 프로바이오틱 치즈의 섭취 후 건강한 지원자의 임상 데이터를 나타낸다.

	락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 프로바이오틱 치즈		대조군 치즈		P 값
	기준선	처리 후	기준선	처리 후	P 값
BMI (kg/m²)	24.1 ± 3.6	24.2 ±3.6	23.8 ±3.5	23.9 ±3.6	0.625/0.399
수축기 혈압 (mm Hg)	112.9 ±10.4	107.1 ±10.4	110.3 ±8.3	109.3 ±9.4	0.016/0.655
이완기 혈압 (mm Hg)	78.8 ±7.1	74.3 ± 8.8	74.8 ± 5.2	75.7 ± 8.3	0.021/0.668
체질량 지수 (BMI) (kg/m²): 19-25 kg/m² - 정상, 26-30 kg/m² -과체중, 30 이상 -비만

수축기 및 이완기 혈압은 프로바이오틱 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) (5x10⁸CFU/g x 50 g) 포함 치즈의 3주 소모 후 상당히 낮아졌다. 균주 텐시아 DSM 21380을 포함하는 치즈의 3주 소모는 체질량 지수를 증가시키지 않았다.

장내 마이크로플로라에 대한 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 ( L. plantarum Tensia DSM 21380)의 효과

방법. 대변 마이크로플로라 및 락토바실러스 종의 정량 분석은, 타르투 대학 미생물학과에서 개발한 방법이었다 (Mikelsaar ME, Vaejaots ME, Lenzner AA. Anaerobe Inhalts- und Wandmikroflora des Magen-Darm-Kanals. Die Nahrung, 1984, 23, 6/7, 727-733; Sepp E., Julge K., Vasar M., Naaber P., Bjoerksten B., Mikelsaar M. Intestinal microflora of Estonian and Swedish infants. Acta Paediatrica, 1997, 86, 956-961). 아래 표 11은 건강한 지원자의 대변에서 락토바실러스 수를 나타낸다 (log₁₀ cfu/대변 (g)).

	락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 프로바이오틱 치즈		대조군 치즈			P 값페어드 t-검증BL1 vs PRO/ BL2 vs PL
	BL1 평균±표준편차 범위 (중간값)	PRO 평균±표준편차 범위 (중간값)		BL2 평균±표준편차 범위 (중간값)	PL 평균±표준편차 범위 (중간값)	P 값페어드 t-검증BL1 vs PRO/ BL2 vs PL
LB 총균수 cultivation	5.1 ± 1.9 0 - 6.3 (5.9)	6.7 ± 1.0 4.9- 8.6 (6.7)	5.7 ±1.4 4.0 - 8.6 (5.3)	ND	0.025/
LB 총균수 FISH	8.4 ± 0.1 8.1 - 8.6 (8.4)	8.4 ± 0.3 7.9 - 9.1 (8.3)	8.4 ± 0.3 8.0 - 8.8 (8.3)	8.3 ±0.3 7.6 - 9.0 (8.2)	0.748 / 0.244
L. plantarum * 범위/중간값 우점도	0 - 5.3 (0) 3 / 12	0 - 8.6 (5.9) 10 / 12 0 - 4.3 (0) 2 / 12	ND		0.006 / ND
ND - 검출되지 않음

락토바실러스 총균수 및 락토바실러스 플란타룸*의 우점도는 지원자의 대변에서 증가되었다 (p=0.006). 아래 표 12는 모집시 (BL1). 프로바이오틱 치즈 섭취 후 (PRO) 및 회복시 (BL2)의 지원자의 대변 샘플 중 종의 락토바실러스 플란타룸의 우점도를 나타낸다.

그룹	BL 1	PRO	BL 2
1 그룹 (n=12)	3 / 12	10 /12	2 / 12
2 그룹 (n=12)	2 / 12	3 /12	4 / 12

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) 그룹에서 종으로서 엘. 플란타룸 (L. Plantarum)의 증가가 검출되었다 (Fischer exact test, 3/12 vs 10/12, p=0.006).

그러므로, 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)은 유익한 락토바실러스 생균수를 증가시키는 것을 통하여 인간의 장내마이크로플로라에 긍정적인 영향을 미친다.

놀랍게도, 헤테로발효 락토바실러스 생균수의 증가로 인하여 (FHEL; 4.73±1.3 vs. 5.7±1.3, p= 0.029), 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)이 속하는 발효군에서 강제 호모발효 락토바실러스 (OHOL) 생균수 증가가 검출되었다 (4.6±1.1 vs. 5.7±1.5, p= 0.014). 그러므로, 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)은 GT 락토플로라 (lactoflora)를 안정화시키는 데 상당히 기여한다.

분자적 방법에 의한 지원자의 대변 락토바실러스 생균수 ( fluorescent in situ hybridization , FISH )

방법. 대변 샘플을 PBS 완충액 중에 1/10으로 희석시켰다. 미생물 세포를 4% 포름알데하이드 용액으로 고정시키고, 4℃에서 보관하였다. FISH를 염료 Cy3을 사용하여 태깅한 탐침 Lab 158을 사용하는 함센 (Harmsen) 방법으로 수행하였다. 태깅된 미생물 세포를 형광 현미경으로 계수하였다.

결과를 표 11에 제시하고, 박테리아 분석 결과와 함께 실었다. FISH에 의하면 (이 방법은 사멸 세포도 기록함), 락토바실러스 균수는 실질적으로 변화하지 않고 유지되었다.

치즈를 섭취한 지원자를 포함하는 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 ( L. plantarum Tensia DSM 21380)의 대변으로부터의 락토바실러스 DGGE 특징

방법. 이어서, PCR 생성물을 Dcode^TM 시스템 기술을 사용하여 30~60% 아크릴아미드 함유 겔 중에서 DGGE 전기 영동으로 분리하였다 (Bio-Rad, Hercules, California). 겔을 피소니 식 (Peasoni correlation)에 따라 BioNumerics 2.5 (Applied Maths, Belgium) 소프트웨어로 분석하였다 (Heilig HG, Zoetendal EG, Vaughan EE, Marteau P, Akkermans, ADL, de Vos WM. Molecular diversity of Lactobacillus ssp. and other Lactic acid bacteria in the human intestine as determined by specific amplification of 16S ribosomal DNA. Appl Envir Microbiol 2002; 68: 114-123).

겔 사진 (도 4)은, 16S rDNA 증폭에 따른 개체의 대변에서 우점균인 락토바실러스 종의 특징을 나타내고 있다. UMPAG 소프트웨어를 사용하여, 상이한 겔 상의 추정 매트릭스 코인씨던스 (putative matrix coincidence)를 분석할 수 있는데, 즉, 상이한 겔/상이한 분석 간의 유의한 차이 (>20%)를 검출하는 것이 가능하다. 아래 표 13은 임상 시험 도중 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)에서 락토플로라의 변동을 나타낸다.

표 13은 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) 그룹에서, 12 내지 21일째 10명의 사람에서 원산지 (indigenous) 락토플로라 패턴이 변화되었음을 나타낸다 (p<0.05).

결과에 따라, 엘. 플란타룸 군집화 연구에서 박테리아 방법에 의하여 얻었다. 4명에게서는 그 변화가 2주 후에도 안정하게 남아있었다.

지원자의 소변에서 폴리아민 및 생체 아민의 함량

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 치즈 섭취 전 후 및 안정화 기간의 생체 아민의 평가를 위하여, 아침 소변 및 기체 크로마토그래피법을 사용하였다.

방법. 소변 샘플을 어글랜드법 (Ugland HG; Krough M, Rasmussen KE: Aqueous alkylchloroformate derivatization and solid-phase microextraction: determination of amphetamines in urine by capillary gas chromatography. J Chromatography B Biomed Sci Appl 1997; 701:29-38)의 변형법으로 GC 분석을 위하여 프로필클로로포르메이트로 유도체화시켰다.

모세관 컬럼 (capillar colonne) HP-5 19091J-433 (30 m ×0.25 ㎛; 0.25 mm)이 장착된 기체 크로마토그래피 HP 6890 시리즈 GC 시스템 (Hewlett Packard, Avondale, PA, USA)으로 GC 분석을 수행하였다. 컬럼 온도 프로그램은 150℃ 1 min, 20℃/min 280℃ 5분간; 및 검출기 (FID) 250℃이다. 생체 아민 농도는 nmol/mol 크레아틴에 따라 계산하였다. 아래 표 14는 아침 소변에서 측정된 엘. 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) 치즈를 섭취한 지원자에서의 폴리아민을 나타낸다 (nmol/mol 크레아틴).

	락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) 첨가제를 함유하는 프로바이오틱 치즈		대조군 치즈		P 값
	BL1 평균±표준편차 범위 (중간값)	PRO 평균±표준편차 범위 (중간값)	BL2 평균±표준편차 범위 (중간값)	PL 평균±표준편차 범위 (중간값)	paired t- test BL1 vs PRO / BL2 vs PL
Put	0.110±0.139 0-0.467 (0.046)	0.090 ±0.120 0-0.396 (0.041)	0.073 ±0.110 0-0.384 (0.037)	0.027 ±0.024 0-0.055 (0.037)	0.496/ 0.275
acPut	0.607 ±0.558 0-2.159 (0.478)	0.567 ±0.431 0.191-1.758 (0.430)	0.817 ±1.027 0.091-3.916 (0.550)	0.573 ±0.391 0.182-1.403 (0.486)	0.510 / 0.677
DAP	0.148 ±0.125 0-0.344 (0.159)	0.056 ±0.084 0-0.205 (0)	0.090 ±0.163 0-0.432 (0)	0.061 ±0.099 0-0.246 (0)	0.016 / 0.844
acSpd	0.181 ±0.137 0-0.428 (0.144)	0.227 ±0.142 0.053-0.493 (0.182)	0.197 ±0.148 0.039-0.495 (0.195)	0.258 ±0.221 0.041-0.686 (0.186)	0.016 / 0.244
Cad	0.012 ±0.026 0-0.084 (0)	0.038 ±0.062 0-0.156 (0)	0.041 ±0.077 0-0.248 (0)	0.015 ±0.037 0-0.123 (0)	0.125 / 0.
BL1- 기준선 1, 모집시, PRO -프로바이오틱 처리 후, BL 2-기준선 2, 회복 Put -푸트레신, acPut-N-아세틸푸트레신, DAP-1.3-디아미노프로판, acSpd-N8-아세틸스퍼미딘, Cad - 카다베린

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 프로바이오틱 치즈의 섭취는 프로바이오틱 기간의 말기에 지원자의 소변에서 아세틸화된 스퍼미딘을 증가시켰는데, 이는 혈액 및 조직에서 폴리아민의 대사를 개선시켰음을 나타낸다. 소변중 DAP 농도는 감소되었다.

상관 관계

수축기 혈압의 감소는 락토바실러스 균수의 증가와, 소변중 푸트레신의 증가와 관련되어 있는 것으로 발견되었다 (도 5).

안전성

지원자에게 치즈로 시험한 후, 전신 염증 마커 (U-CRP, 초민감성 CRP 및 백혈구)의 값은 변하지 않았고, 정상 범주 내에 있었다 (표 15). 필수적인 알러지 마커 IgE의 값에도 변화는 감지되지 않았다.

프로바이오틱 치즈의 섭취는 WBC 균수에서도 변화를 유발하지 않았다 (leucogram). 시험 말기의 세포 수의 비율은 모집시의 값과 비교하여 변하지 않고 남아있었다. 아래 표 15는 시험 초기 및 말기의 염증 마커를 나타낸다.

	락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) 첨가제를 함유하는 프로바이오틱 치즈		대조군 치즈		P값	표준 값
	전	후	전	후	P값	표준 값
U-CRP, mg/L	1.1 ±0.6	1.0 ±0.3	1.4 ±0.9	1.6 ±1.3	0.3 / 0.9	< 5 mg/L
백혈구 총수 x10⁹/L	5.2 ±0.8	5.6 ±1.3	5.1 ±1.1	5.5 ±1.1	0.6 / 0.14	4 - 10 x 10⁹/L

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 프로바이오틱 치즈의 섭취는 비정상적인 불편함 (비정상적인 통증, 복부 팽만, 더부룩함)을 유발하지 않았고, 체질량 지수, 글루코스 및 지질 수준의 증가를 유발하지 않았다.

그러므로, 건강한 개체에서, 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 치즈의 섭취는 전신 염증, 알러지 거부 반응을 유발하지 않았을 뿐만 아니라, 필수적인 기관에 유해하지 않다.

실시예 4. 노령의 건강한 개체의 혈액 지수에 미치는 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 ( L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 치즈의 효과

임상 시험 도중 (무작위 맹검 교차 위약 제어), 노령의 건강한 개체의 혈액 지수에 미치는 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 치즈의 안정성 및 효과에 대하여 시험하였다.

참가자 및 방법. 참가자는 건강한 지원자들이었는데 남성 및 여성을 포함하여 21명이었다 (남/여 2/19; 61-84세). 당뇨병을 배제시키기 위하여, 혈청으로부터 글루코스 및 글리코헤모글로빈 HbA1c을 검출하였다.

시험된 치즈는 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하였다 (생균수 2x 10⁷ CFU/치즈 (g)). 섭취하기 전에, 시험 치즈를 12℃에서 30시간 동안 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)과 함께 인큐베이트하였다. 첨가제가 없는 보통의 에스토니아 치즈를 대조군으로서 사용하였다. 시험은 랜덤 맹검 교차 위약 제어 시험이었다. 시험 치즈의 3주 섭취로 시작하여, 2주간 세척 기간을 두고, 이후에 대조군 치즈를 3주간 섭취하도록 하였다. 투여량 50 g/1일. 아래 표 16은 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 포함하는 치즈의 섭취 후 노령의 건강한 지원자의 임상 데이터를 나타낸다.

	락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)를 함유하는 프로바이오틱 치즈		대조군 치즈		P 값
	기준선	처리후	기준선	처리후	P 값
BMI (kg/m²)	27.6 ±4.1	27.5 ±4.2	27.5 ±4.0	27.6 ±4.2	0.723 / 0.793
수축기 혈압 (mm Hg)	138.1 ±16.6	132.2 ±16.2	138.7 ±21.4	135.2 ±21.1	0.038 / 0.185
이완기 혈압 (mm Hg)	77.2 ±7.7	73.1 ±8.0	76.4 ±8.9	74.8 ±9.2	0.004 / 0.246
체질량지수 (BMI) (kg/m²): 19-25 kg/m² -정상, 26-30 kg/m² -과체중, 30 이상-비만

혈압 (수축기 및 이완기 양자)의 감소가 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) (2x 10⁷/g x 50 g)를 함유하는 프로바이오틱 치즈의 3주 소모후 노령 개체에서 검출되었다. 동시에, 비교적 고지방 함량의 치즈의 섭취는 노령 지원자의 체질량 지수를 증가시키지 않았다 (표 16).

안전성

락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) (2x 10⁷/g x 50 g)을 함유하는 프로바이오틱 치즈의 섭취는 비정상적인 불편함 (비정상적인 통증, 복부 팽만감, 더부룩함)을 유발하지 않았다.

치즈 실험 후, 참가자의 전신 염증 마커 (U-CRP 및 백혈구)의 값은 증가되지 않았고 정상 범주 내에 있었다 (표 17). 아래 표 17은 모집시 및 시험 말기의 노령 건강한 지원자의 혈액의 염증 마커를 나타낸다.

	락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380) (2x 10⁷/g x 50 g)를 함유하는 프로바이오틱 치즈		대조군 치즈		P값	표준 값
	전	후	전	후	P값	표준 값
U-CRP, mg/L	0.13/0.81	0.13/ 0.81	0.13 / 0.8	0.13 /0.81	0.13 /0.81	< 5 mg/L
백혈구 총수 x10⁹/L	5.1 ±1.3	4.9 ±1.3	5.0 ±1.0	5.0 ±1.6	0.33/0.33	4 - 10 x 10⁹/L

필수 알러지 마커 IgE 또는 신장 및 간 마커의 값에서 비정상은 검출되지 않았다 (혈청 크레아틴, 알부민, 알라닌 트랜스아미나아제 (ALAT), 아스파테이트 트랜스아미나아제 (ASAT)).

처리 기간 및 위약 기간의 총 콜레스테롤 수준을 비교한 결과, 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 프로바이오틱 치즈의 섭취 후 상당한 감소가 검출되었다. 프로바이오틱 치즈 섭취 후 0.3 유닛만큼 혈청 글루코스 함량의 증가된 것은 바람직하지 않은 효과였지만, 이는 위약군과 비교하면 통계학적으로 유의하지 않은 것이었으며 (표 18), 정상 범주 내에 남아 있었다. 표 18은 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)를 함유하는 치즈의 섭취 후 노령의 건강한 지원자의 혈청 생화학적 파라미터를 나타낸다.

	프로바이오틱 치즈		대조군 치즈		P 값 (BL1 vs BL2, PRO vs PL)
	BL1	PRO	BL2	PL	P 값 (BL1 vs BL2, PRO vs PL)
글리코스, mmol/l	5.1 ±0.5	5.4 ±0.5	5.3 ±0.5	5.4 ±0.4	0.036 / 0.144 (0.212, 0.757)
총 콜레스테롤, mmol/l	5.7 ±0.8	5.6 ±0.8	5.9 ±0.9	5.7 ±0.8	0.343 / 0.198 (0.044, 0.087)
HDL- 콜레스테롤, mmol/l	1.7 ±0.4	1.6 ±0.4	1.7 ±0.4	1.7 ±0.5	0.411 / 0.514 (0.073, 0.118)
LDL- 콜레스테롤, mmol/l	3.9 ±0.8	3.8 ±0.7	4.1 ±0.9	3.8 ±0.7	0.557 / 0.052 (0.075, 0.9187)
트리글리세리드, mmol/l	1.1 ±0.6	1.1 ±0.6	1.2 ±0.5	1.1 ±0.5	0.380 / 0.394 (0.411, 0.097)

그러므로, 노령 건강한 개체에서 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (L. plantarum Tensia DSM 21380)을 함유하는 치즈의 섭취는 전신 염증, 알러지 거부 반응을 유발시키지 않았고, 이는 필수 기관에 유해하지 않았다.

독일 미생물 균주 보존 센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)

DSM21380

20080416

SEQUENCE LISTING <110> Bio-Competence Centre of Healthy Dairy Products Songisepp, Epp Mikelsaar, Marika R?sep, Merle Zilmer, Mihkel H?t, Pirje Utt, Meeme Zilmer, Kersti ?sti, Janne K?jalg, Siiri <120> Isolated microorganism strain Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 as antimicrobial and antihypertensive probiotic, food product and composition comprising said microorganism and use of said microorganism for preparation of antihypertensive medicine and method for suppressing pathogens and nonstarter lactobacilli in food product <130> 898US <140> PCT/EE2009/000005 <141> 2009-05-12 <150> EE200800026 <151> 2008-05-13 <170> PatentIn version 3.3 <160> 10 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> primer_bind <222> (375855)?375871) <223> Designation of the sequence: E1F, location the sequence measured against the positive control Lactobacillus plantarum WCFS1 <400> 1 atcggcaggc ccaacag 17 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> primer_bind <222> (375954)?375934) <223> Designation of the sequence: E1R, location the sequence measured against the positive control Lactobacillus plantarum WCFS1 <400> 2 gcgtgaccgt gaattaaatg c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> primer_bind <222> (375837)?375857) <223> Designation of the sequence: F1F, location of the sequence measured against the positive control Lactobacillus plantarum WCFS1 <400> 3 gacagcgcta atgacccaat c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> primer_bind <222> (375954)?375934) <223> Designation of the sequence: F1R, location the sequence measured against the positive control Lactobacillus plantarum WCFS1 <400> 4 gcgtgaccgt gaattaaatg c 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> primer_bind <222> (366953)?366971) <223> Designation of the sequence: J1F, location the sequence measured against the positive control Lactobacillus plantarum WCFS1 <400>5 cccaacaacc ccgttcaac 19 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> primer_bind <222> (367060)?367035) <223> Designation of the sequence: J1R, location of the sequence measured against the positive control Lactobacillus plantarum WCFS1 <400> 6 tgctacagta aagggagagg tatgac 26 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> primer_bind <222> (366670)?366696) <223> Designation of the sequence: K2F, location the sequence measured against the positive control Lactobacillus plantarum WCFS1 <400> 7 acttattata atcccttgaa ccaccaa 27 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> primer_bind <222> (366796)?366772) <223> Designation of the sequence: K2R, location the sequence measured against the positive control Lactobacillus plantarum WCFS1 <400> 8 gctgacgctg aaaagaatat ttctg 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (503858)?503872) <223> Designation of the sequence: 968-GC-f, location the sequence measured against the positive control Lactobacillus plantarum WCFS1 <400> 9 gggaacgcga agaaccttag c 21 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Escherichia coli, <220> <221> primer_bind <222> (504289)?504273) <223> Designation of the sequence: 1401-r location the sequence measured against the positive control Lactobacillus plantarum WCFS1 <400> 10 cggtgtgtac aagaccc 17

Claims

-식품 중의 오염미생물을 억제하고,
-결장 락토바실러스들 중 우점균이 되며,
-유기체 내에서 폴리아민의 대사를 증가시키고,
-혈압을 낮추기
위하여, 공액 리놀레산 (CLA), 과산화수소 (H₂O₂), 일산화질소 (NO)를 생성하고, 플란타리신을 코딩하는 유전자 plnE, plnF, plnJ, plnK 및 항산화 활성을 가지는 항균 및 항고혈압 프로바이오틱인 단리된 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380 (Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380).
제1항에 있어서, 상기 억제될 오염미생물은 논-스타터 (non-starter) 락토바실러스, 원유에 존재하는 병원체, 제조 후 발생하는 식품 내 병원체 또는 이들의 조합인 것인 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380.
제1항에 있어서, 동결 건조된 형태의 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380를 포함하는 식품.
제4항에 있어서, 상기 식품은 유제품인 것인 식품.
제5항에 있어서, 상기 식품은 발효유 제품인 것인 식품.
제6항에 있어서, 상기 식품은 치즈인 것인 식품.
혈압 강하를 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380를 포함하는 약학적 조성물.
삭제
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380의 동결 건조 분말 또는 배양액을 식품에 첨가하는 것을 포함하는 식품에서 병원체 및 논-스타터 락토바실러스의 억제 방법.
제10항에 있어서, 상기 식품은 유제품인 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 유제품은 발효유 제품, 치즈, 코티지 치즈, 커드, 요구르트, 아이스크림, 버터, 또는 스프레드 치즈인 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 텐시아 DSM 21380을 식품에 첨가하는 것을 포함하는 식품의 저장 수명 연장 방법.