KR101581184B1 - 항-브이피6 카멜리드 항체로부터 유래한 단량체 브이에이치에이치 도메인, 이합체 도메인, 면역화 방법, 로타바이러스 검출 방법, 조성물, 로타바이러스 감염의 예방 및 치료 방법 - Google Patents

항-브이피6 카멜리드 항체로부터 유래한 단량체 브이에이치에이치 도메인, 이합체 도메인, 면역화 방법, 로타바이러스 검출 방법, 조성물, 로타바이러스 감염의 예방 및 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-VP6 카멜리드 항체로부터 유래한 단량체 VHH 도메인, 이합체 도메인, 면역화 방법, 로타바이러스 검출 방법, 백신 조성물, 로타바이러스 감염의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다. 상기 도메인은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 또는 SEQ ID No. 4에 나타낸 아미노산 서열들중 어느 하나일 수 있고 A군 로타바이러스의 VP6 단백질에 결합한다.

Description

항-브이피6 카멜리드 항체로부터 유래한 단량체 브이에이치에이치 도메인, 이합체 도메인, 면역화 방법, 로타바이러스 검출 방법, 조성물, 로타바이러스 감염의 예방 및 치료 방법{MONOMERIC VHH DOMAIN DERIVED FROM ANTI-VP6 CAMELID ANTIBODIES, DIMERIC DOMAIN, IMMUNISATION METHOD, ROTAVIRUS DETECTION METHOD, COMPOSITION, PREVENTION AND TREATMENT METHODS FOR ROTAVIRUS INFECTIONS}
본 발명은 항-VP6 카멜리드(camelid) 항체로부터 유래한 단량체 VHH 도메인, 이합체 도메인, 면역 방법, 로타바이러스(rotavirus) 검출 방법, 백신 조성물, 로타바이러스 감염의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 카멜리드 항체로부터 유래한 단량체 도메인(VHH)에 관한 것으로, 상기 도메인은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 또는 SEQ ID No. 4에 나타낸 아미노산 서열들중 어느 하나일 수 있고 A군 로타바이러스의 VP6 단백질에 결합한다.
A군 로타바이러스(Group A rotavirus (RV))는 어린이 및 경제적으로 중요한 많은 동물 종(소, 돼지, 말, 남미 카멜리드(South American camelid) 등)의 새끼에서 심한 설사를 일으키는 주요 원인이다. 공중 건강 문제로서, RV는 개발도상국에서 심한 설사 관련 사망의 세 번째로 일반적인 원인이다(연간 2 백만명의 사망). 한편, 어린 송아지와 같은 소비용 동물에서 RV에 의해 유발되는 설사는 예방 및 치료와 관련된 고비용을 초래한다.
A군 RV는 삼중 단백질 캡시드(triple protein capsid)로 이루어진 입자이다. 외부 캡시드의 표면은 고가변성 항원(highly variable antigen)인 VP4 및 VP7 단백질로 이루어지며, 따라서, 27종 이상의 VP4 (P-타입) 변이체 및 16종 이상의 VP7(G-타입) 변이체가 보고되어 왔다. 각각의 G-P 타입의 조합은 다른 G-P 타입과 교차 반응성이 낮은 중화 항체를 유발하므로, 표적 종 내부에서 순환하는 서로 다른 종들을 백신에 포함시킬 필요가 있다.
중간 캡시드는 비리온(virion) 질량의 51%를 차지하는 삼합체 단백질(trimeric protein)로 이루어진다. VP6 단백질에 두 가지의 상이한 에피토프(epitope)가 존재하는지의 여부에 따라(단클론 항체 imAb 255/60 및 631/9에 의해 인식됨), A군 RV 균주들은 (Sb) I, II, I+Il 및 nol noil 아군(subgroup)으로 추가로 분류된다. 인간 RV는 대개 Sb II인 반면에, 동물 RV는 주로 Sb I 이다. VP6 단백질은 면역원성이 높으며, 자연적으로 감염된 인간 및 동물은 VP6 에피토프에 대하여 강한 체액 반응을 전개한다. 상기 언급한 아군에 상관없이, VP6는 A군 RV에서 고도로 보존되는 단백질이며(90% 이상의 아미노산 상동성), 그 공유된 공통 항원은 광범위한 반응성을 갖는 다클론 항혈청 또는 단클론 항체에 의해 검출될 수 있다. 따라서, VP6는 A군 RV를 검출하도록 디자인된 대부분의 면역진단 테스트에서 표적 항원으로 사용된다. 이러한 단백질에 대하여 검출된 항체는 시험관내에서 중화 활성이 없다. 그러나, IgA 단클론 항체는 마우스에서 바이러스의 세포내 복제를 차단한다.
오늘날, 동물에서 RV 유발 설사의 예방은 수동 면역에 기초하는 반면에, 인간의 경우에는 능동 면역이 사용된다. 동물의 경우, 비경구적인 불활화 바이러스 백신이 임신한 암컷에게 투여되어, 초유 및 젖을 통해 어미 항체를 전달하는 것을 통해 새끼를 보호한다. 이러한 방법은 심한 설사 증상을 예방하고 감염된 동물의 사망율 및 치사율을 감소시키는데 있어서 아주 효과적이지만, 감염 동물이 배설한 바이러스의 양을 유의적으로 감소시키지 못하기 때문에 RV 감염을 방지할 수 없다(Parreno, V.C. 외, Vet Immunol lmmunopathol 100:7-24, 2004). 높은 역가의 수동 항-RV 항체를 소장강(intestinal lumen)에 지속적으로 존재시키는 것(자연 생성되거나 또는 젖에 인위적으로 첨가됨)만이 설사에 대하여 완전히 보호하고 바이러스 배설을 인위적으로 감소시킨다(Fernandez, F.M. 외, Vaccine 16:507-16, 1998; Saif, LJ. 외, Infect lmmun 41:1118-31, 1983, and Saif, L.J. 외, Adv Exp Med Biol 216B:1815-23, 987).
어린이의 경우, 유전자 재회합에 의해 약독화한 두 가지의 생 바이러스 백신이 승인되었다. 두 제품은 심한 RV 유발 설사에 대하여 입증된 우수한 효능을 갖는다. 그러나, 인간에서 예전에 사용된 백신과 관련된 섭취의 이력(Murphy, T. V. 외, J Infect Dis 187:1309-13, 2003) 및 자연 감염된 어린이에서 RV 바이러스 혈증의 최근의 발견(Ray, P. 외, J Infect Dis 194:588-93, 2006, 및 Blutt, S.E. 외, Lancet 362:1445-9, 2003)을 고려할 때, 상기 백신의 무독성이 의심을 받아왔는데, 조숙하고 면역억제되고 영양실조인 어린이의 경우 특히 그러하다. 따라서, RV 유발 설사를 예방 및 치료하기 위한 대안의 보완적인 방법이 필요하다.
모유수유, 소의 초유 또는 계란으로부터 정제한 항-RV 항체(인간 및 소의 항- RV JgG 및 계란 노른자 IgY)의 투여와 같은 수동 면역 방법은 인간 및 동물 모두에서 설사병을 감소시키는 것으로 확인되었다. 그러나, 다량의 항체를 경제적인 방법으로 재현가능하게 생성할 가능성은 낮다. 따라서, 동물 및 인간에서 수동 항-RV 면역을 위해 디자인된 항체, 특히 공업적 규모로 생성될 수 있고, 면역 반응을 일으키지 않고, 보존된 내부 단백질의 에피토프에 효율적으로 접근하기에 충분히 작고, 상이한 에피토프(다중 반응성)로부터 균주의 복제를 인식 및 억제할 수 있는 항체를 발생시킬 필요가 있다.
카멜리드 항체 중쇄의 VHH 도메인은 15 kDa의 중량을 갖는 것으로, 완전 항원 결합능을 갖는 가장 작은 알려진 자연 도메인이다. 이는 자연 항원 결합능을 갖는 단일 사슬 단편을 암호화하는 DNA 라이브러리를 발생시키기에 이상적인 것이다. 또한, 라마(llama)를 면역하는 방법을 이용하여, 중요 항원에 대한 것들에서 VHH 라이브러리를 강화시킬 수 있다. 이의 특별한 특징으로 인해, 라마 항체의 중쇄로부터 유래된 VHH 도메인은 RV 유발 설사를 예방 또는 치료하도록 디자인된 진단 시약 및 제품의 개발을 위한 아주 유용한 도구가 된다. 예를 들어, 효모에서 생성된 것으로 G3 G-타입 RV 균주에 대한 VHH는 시험관내에서 중화 활성을 나타내는 것으로 최근에 보고되었으며, 정제된 VHH는 젖을 분비하는 마우스에서 RV 유발 설사의 발생 및 기간을 감소시킬 수 있었다{Pant, N. 외, J Infect Dis 194:1580-8, 2006, 및 van der Vaart J. M. 외, Vaccine, May 8, 24(19):4130-7, 2006). 그러나, 이들 저자는 얻어진 VHH가 어느 바이러스 단백질에 대한 것인지 확인할 수 없었고, 이 VHH가 외부 단백질의 입체적 에피토프에 대한 것으로 판단하고 있다.
국제 특허공보 WO 2006/056306호는 VHH 도메인 및 이의 단편의 제조, 및 RV와 같은 장병원성 미생물에 의한 감염에 대한 치료제로서 상기 도메인의 용도를 개시하고 있다. 상기 특허 문헌은 상기 VHH의 제조 또는 특이 부위 방출계에서 그의 용도를 나타내고 있다. 예를 들어, 알긴산염으로 캡슐화하여 위장관계에서 특이 VHH를 방출하는 것을 개시하고 있다. 또한, 방출 방법으로서, 상기 특허 문헌은 특이 VHH 항체를 방출하는 형질전환 프로바이오틱 미생물의 사용을 제안하고 있는데, 상기 미생물은 인간의 장에서 서식한다. 또한, 상기 특허 문헌은 프로바이오틱 미생물에 의해 캡슐화 또는 발현되는 VHH 항체를 이용하여 약물 또는 식품을 제조하기 위한 상이한 방법들을 제안하고 있다. 상기 제조된 VHH는 VP6에 결합하지 않으며, 중화되지 않으며, 제어 방출계에서 단독으로 사용되지 않는다.
Muyldermans Serge가 발명자인 미국 특허 공보 2005/054001호는 특정의 변형 또는 변이된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 항체, 중쇄 항체의 기능적 도메인, 기능적 VH 도메인 또는 이의 단편을 개시하고 있다. 이는 RV VP6에 결합하는 VHH 도메인에 해당하는 서열은 개시하지 않고 있다.
국제 특허 공보 WO 00/65057호는 바이러스 항원, 특히 락토코커스(Lactococcus)의 박테리오파지 P2에 결합하는 단일 가변 도메인을 포함하는 일가 단백질을 개시하고 있다. 이는 상기 박테리오파지를 억제하는 VHH 서열만을 개시하고 있다.
Hamers 등이 발명자인 미국 특허 공보 2007/0009512호 상기 발명자들이 발표한 예전의 문헌은 면역글로불린의 중쇄 단편, 및 수의학적 치료, 예를 들어 수동 면역치료 및 혈청치료를 위한 상기 단편의 용도를 개시하고 있다. 상기 기재된 VHH는 파상풍 독소만은 인식한다. 상기 VHH를 얻기 위해 이용되는 방법은 면역화된 카멜리드의 mRNA로부터 출발한다.
본 발명의 목적은 카멜리드 항체로부터 유래한 단량체 도메인(VHH)으로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 또는 SEQ ID No. 4에서 나타낸 아미노산 서열들중 어느 하나일 수 있고 A군 RV의 VP6 단백질에 결합하는 단량체 도메인을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 A군 RV의 VP6 단백질에 결합하는 이합체 도메인으로서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 또는 SEQ ID No. 4에서 나타낸 하나 이상의 단량체 서열을 포함하는 것인 이합체 도메인을 제공함에 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11 및 SEQ ID No. 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 발명의 목적은 RV 함유 시료를 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9 또는 이들의 조합에서 나타낸 아미노산 서열들중 어느 하나와 접촉시키고 발색시키는 것을 포함하는 로타바이러스 면역검출 방법을 제공함에 있다.
상기 면역검출 방법은 면역포획(immunocapture) 기반 실험법인 ELISA, ELISPOT, 경쟁 ELISA, 자성 비드 및 펜-사이드(pen-side)와 같은 당업계에 알려진 방법들중 어느 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 포유동물에게 수동 면역을 부여하는 조성물로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 또는 SEQ ID No. 9에 나타낸 서열들중 어느 하나와, 부형제와, 면역조절제를 포함하는 조성물을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 RV에 의해 유발되는 감염의 예방 방법으로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 또는 이들의 조합에서 나타낸 서열들중 어느 하나의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는데, 상기 서열은 단독으로 사용되거나 또는 상기 서열을 캡슐화하여 위장관에서 상기 서열이 분해되는 것을 방지하는 물질과 조합으로 사용되는 것인 예방 방법을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 RV에 의해 발생된 감염의 치료 방법으로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 또는 이들의 조합에서 나타낸 서열들중 어느 하나의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는데, 상기 서열은 단독으로 사용되거나 또는 상기 서열을 캡슐화하여 위장관에서 상기 서열이 분해되는 것을 방지하는 물질과 조합으로 사용되는 것인 치료 방법을 제공함에 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "도메인"(domain)은 단백질 사슬의 나머지 부분과 독립적으로 진화, 작용 및 존재할 수 있는 상기 단백질(항체) 서열의 일부를 말한다. 각각의 도메인은 치밀한 삼차원 구조를 형성할 수 있고, 흔히 독립적으로 안정하고 접혀질 수 있다. 많은 단백질들은 몇 개의 구조적 도메인들로 이루어진다. 하나의 도메인이 여러 가지 진화론적으로 관련있는 단백질들에서 나타날 수 있다. 도메인들은 길이가 약 25개 아미노산에서 500 개 아미노산에 이르기까지 다양하다. 상기 도메인들은 에피토프에 결합할 수 있다. 본 발명의 도메인은 A군 RV의 VP6 단백질에 결합할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "VHH", "VHH 도메인", "단량체 VHH" 및 "VHH 단량체"는 동일한 의미를 가지며 상호교환 가능한 것으로 간주된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "VP6 단백질", "VP6 항원" 및 "VP6"은 동일한 의미를 가지며 상호교환 가능한 것으로 간주된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "이합체 도메인"(dimeric domain), "VHH 이합체"(VHH dimers)" 및 "이합체 VHH"는 동일한 의미를 가지며 상호교환 가능한 것으로 간주된다.
용어 "동종이합체"(homodimer)는 연결 서열을 이용하거나 이용함이 없이 두 개의 동일한 단량체 도메인으로 형성된 단백질 또는 폴리펩티드로서 정의된다.
용어 "이종이합체"(heterodimer)는 연결 서열을 이용하거나 이용함이 없이 두 개의 상이한 단량체 도메인으로 형성된 단백질 또는 폴리펩티드로서 정의된다.
표현 "적절한 성장 조건"은 형질전환 세포(본 발명에서 정의한 벡터에 의해 형질전환, 형질감염 또는 감염됨)의 성장을 개선하기 위하여 설정된 안정한 조건을 말한다. 예를 들어, 감염된 유충(larva)이 28 ℃의 성장 챔버에서 유지되고 지정된 시기에 수집된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "백신"은 특정 질병에 대한 면역성을 도입하기 위하여 사용되는 제형을 말한다. 포유동물에게 수동 면역을 부여하도록 디자인된 조성물은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 부형제 및 면역 조절제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
표현 "RV에 의해 유발된 감염을 예방하기 위해 포유동물에게 투여되는 아미노산 서열(폴리펩티드)의 유효량"은 에피토프에 결합되어, 숙주 유기체를 실질적으로 감염시키게 되는 병원체(바이러스)의 작용을 차단하는데 필요한 아미노산 서열(폴리펩티드)의 추정된 양을 말한다.
표현 ""RV에 의해 유발된 감염을 치료하기 위해 포유동물에게 투여되는 아미노산 서열(폴리펩티드)의 유효량"은 에피토프에 결합되어, 숙주 유기체를 이미 감염시킨 되는 병원체(바이러스)의 작용을 차단하는데 필요한 아미노산 서열(폴리펩티드)의 양을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "포유동물"은 일반적으로 인간, 소, 염소, 양, 돼지 및 말과 같이 포유류에 속하는 것들을 말한다.
연결 서열(linkage sequence)은 두 개의 단량체 서열을 연결하는 아미노산 서열로서 정의된다.
A군 RV의 중간 캡시드 단백질인 VP6에 대한 VHH 항체의 선택, 획득 및 특성화를 기재한다. 본 발명의 VHH는 A군 RV의 검출을 위한 일반적인 면역진단 분석에서 사용되도록 조작될 수 있는 광범위한 반응성의 단백질인 것으로 확인된다. 또한, 선택된 항-VP6 VHH중 일부는 광범위한 중화 활성을 가지며, 상기 VHH중 일부는 생체내에서 바이러스 공격으로부터 보호한다. 이론에 기초하여, 본 발명자들은 본 발명의 VHH는 VP6 단백질에 결합하고 중화 활성을 갖는 최초로 기재되는 분자인 것으로 판단한다.
본 발명의 VHH 도메인을 얻기 위하여, 도 1에서 도시한 동물 면역화 스케쥴을 수행했다. 라마(llama)의 면역 반응을 평가하기 위하여, 항-RV 및 항-VP6 항체 역가를 ELISA, 바이러스 중화 (VN) 방법으로 분석하고, 말초 혈액에서 순환하는 특이 항체 분비 세포를 ELISPOT로 분석했다. 예상한 바와 같이, 접종후 0일째 (DPI)에, 라마는 항-RV 항체에 대하여 양성이므로, 항체와 사전에 접촉하였음을 알 수 있다. 그러나, 혈액에서 순환하는 항체 분비 세포는 없었다. 주사후 7일째에는, ELISA로 확인한 항-IND-RV 또는 항-VP6 항체 역가는 높았고, RV-특이 항체 분비 세포의 피크가 말초 혈액에서 검출되었다(항-RV lgG를 생성하는 16개의 세포/5x105 단핵 세포). 체액 반응은 주사후 14 일째부터 평탄역(plateau)에 도달하였는데, 전체 바이러스 및 VP6 단백질에 모두에 대한 항체 역가는 높았다. 반대로, 중화 항체 역가는 연구된 모든 서로 다른 RV((IND, B223, Wa 및 H2)의 경우 유사하고 매우 낮은 수준으로 유지되었다. 매우 높은 항체 역가가 혈청에서 얻어졌지만, 혈액에서 검출된 항-RV 항체 분비 세포의 양은 각각의 추가접종(booster)마다 감소되었다(도 1). 따라서, 항체 친화력의 성숙을 부여하기에 충분한 시간을 제공하기 위하여, 라마에는 아주 늦게까지, 즉 주사후 246일(4번째 투여후 약 7개월)까지 최종 VP6를 투여하지 않았다. 최종 추가접종후 4일째에 라마를 출혈시켜서, 5x105 단핵 세포당 26.8개의 항-RV IgG 분비 세포의 값에 도달하도록 하였다. 6x108 단핵 세포를 900 ml의 혈액(ELISPOT 결과에 따라, 32,160개 이상의 FtV-특이 IgG 항체 분비 세포를 함유함)로부터 추출했다. 처리된 RNA(210 μg)로부터, VHH 파지 라이브러리를 생성했는데, 이는 6 x 107개의 클론을 함유했다. 상기 사용된 백신접종 프로그램의 결과, 본 발명의 VHH를 얻기 위하여, 관련 항원에 대한 높은 항체 역가보다는 특이 항체-분비 세포의 높은 값을 달성하는 것이 더욱 중요한 것으로 확인되었다. 상기 사용된 백신접종 프로그램에서, 충분한 양의 특이 항체 분비 세포를 얻는 것이 가능했다. 백신접종 동안에 얻어진 결과, VHH 라이브러리를 구축하기 위하여, 면역화된 라마의 면역 반응을 추적하기 위한 최상의 방법은 관련 항원에 대한 혈청 항체 역가 대신에, 말초 혈액에서 순환하는 특이 항체 분비 세포의 양을 평가하는 방법을 선택하는 것이라는 것을 확인할 수 있었다. 얻어지는 항체 분비 세포의 형태에 따라, 마지막 두 개의 투여 사이의 간격이 긴 백신접종 프로그램이 말초혈액에서 더욱 다량의 특이 항체 분비 세포의 순환을 촉진하는 것으로 확인되었다. 접종후 4일째에, 관련 항원에 대한 순환 항체 분비 세포의 수는 접종후 7일째보다 더욱 많았다. 상기 면역 프로그램은 추가 접종이 최종 접종후 최소한 5개월 이후에 수행되고, 다량의 약 20개의 항-표적 항원 IgG 항체 분비 세포가 말초 혈액에서 달성되는 때 파지 콜로니가 생성되도록 하는 방식으로 수행되어야 한다. 바람직하게, 항-VP6 VHH의 경우, 말초 혈액에서 IgG 항체 분비 세포의 양은 약 30개의 항-완전-rt IgG 항체 분피 세포이어야 한다. 당업자는 본 발명의 방법 및 조성물에 적당한 VHH를 얻기 위하여 다른 면역접종 프로그램이 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다.
항-RV VHH를 발현하는 파지를 선택하기 위하여, 항원으로 RV IND를 이용하여 시험관내에서 세 개의 선별 라운드를 수행했다. 192개의 클론을 선택했다. VHH 라이브러리에서 넓은 VP6-결합 다양성을 나타낸 모든 클론에 대하여 제한 분석을 실시했는데, 상기 결합 다양성은 파지 ELISA로 확인했다. 또한, 상기 클론을 ELISA 로 분석하여 RV 및 VP6에 결합하려는 상기 클론의 능력을 측정했다. 상이한 서열을 갖는 14 개의 클론으로부터, 10 개의 클론을 선택하였는데, 이 클론들은 RV 및 VP6에 대하여 더욱 강한 특이 결합을 나타냈고, 상기 선택된 클론들을 이의 정제가 용이하도록 카르복시-말단 헥사히스티딘 태그를 제공하는 발현 벡터에 서브 클로닝했다(표 1).
VHH 단량체 바이오패닝 라운드
 RV 파지 ELISA
 VP6 파지 ELISA
 발현 실험 ELISA에 의한 RV 검출
배지 외관 발현 수준 포획제로서 VHH1 2차 항체로서 VHH
2RE4 2nd A ++ + 정상 +++ ++ +++
2KA4 2nd B +++ +++ 정상 +++ ++ +++
2KA4 2nd B +++ - 용해 + ++ +++
2KA10 2nd B +++ +++ 용해 비정제 ++ +++
2KD1 2nd B +++ +++ 정상 +++ ++ +++
3A6 3rd B ++ + 정상 +++ ++ +++
3B2 3rd B +++ ++ 정상 ++ ++ +++
3C10 3rd B +++ - 정상 ++ ++ +++
3D9 3rd B +++ +++ 정상 +++ ++ 배경
3H1 3rd B +++ - 용해 비정제 ++ +++
1: 항-히스티딘 항체를 이용하여 플레이트에 결합됨.
서로 다른 아군들에 해당하는 RV 균주들에 더욱 강하게 결합한 4 개의 클론을 선택하였는데, 이들 클론은 2KA4 (SEQ ID No. 1), 2KD1 (SEQ ID No. 2), 3A6 (SEQ ID No. 3) 및 3B2 (SEQ ID No. 4)로 명명하였으며, 이들은 상기 VHH가 VP6 단백질의 입체적 에피토프에 결합한다는 것을 나타내는 웨스턴 블럿에 의해 평가한 바와 같이 RV IND의 재조합 VP6 및 이의 천연 상대물을 인식했다(도 2). 이하, 2KA4, 2KD1, 3A6 및 3B2로 명명한 VHH는 본 발명의 VHH 도메인이다.
상기 VHH 도메인 각각을 암호화한 DNA 서열은 아래와 같다:
SEQ ID No. 5 는 SEQ ID No. 1의 도메인을 암호화하고,
SEQ ID No. 6은 SEQ ID No. 2의 도메인을 암호화하고,
SEQ ID No. 7은 SEQ ID No. 3의 도메인을 암호화하고,
SEQ ID No. 8은 SEQ ID No. 4의 도메인을 암호화한다.
당업자는 상기 도메인들을 암호화하는 어느 DNA 서열이 본 발명의 범위에 속한다는 것을 알 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID No. 1은 DNA 서열 SEQ ID No. 5 또는 유전 암호의 변성으로 인해 SEQ ID No. 5와 다른 또 다른 DNA 서열에 의해 암호화될 수 있다. 이와 동일한 예가 각각의 DNA 서열(SEQ ID No. 6, 7 및 8)에 의해 암호화되는 아미노산 서열(SEQ ID No. 2, 3 및 4)에 동일하게 적용된다.
본 발명의 항-VP6 특이 VHH는 RV의 면역진단을 위한 시약으로서 아주 효과적이었다. 본 발명의 VHH의 단량체 형태는 포획 항체 또는 이차 항체로서 ELISA에서 분석하거나 또는 항-His 항체에 의하여 고정하였다. 본 발명의 VHH는 서로 다른 특이 아군 및 서로 다른 G 및 P 타입을 갖는 인간 또는 동물 유래의 RV 균주를 검출할 수 있었다(도 3A).
한편, 인간 IgA 힌지 서열과 유사한 연결 서열에 결합된 동일한 VHH 유전자를 구성하며 VP6에 특이적으로 결합하는 본 발명의 이합체 VHH를 제조하기 위해 발현 벡터를 제작했다. 또한, 본 발명의 이합체 VHH를 직접 포획물로서 ELISA에서 평가한 결과, 연구된 모든 RV 균주에 대하여 명백하고 재현가능한 신호가 확인되었다(도 3B). 본 발명의 이합체 VHH는 ELISA 플레이트 감작에 사용될 수 있기 때문에, VHH 포획 항체를 사용할 필요성이 배제시키고, 이의 단량체 상대물보다 더욱 우수한 RV 검출 결과를 나타낸다.
대장균의 원형질막 공간에서 발현된 단량체 VHH의 수율은 대장균 및 효모에서 발현된 다른 저자들이 보고한 것들과 동등하였다는 것은 아주 흥미로운 것이다.
본 발명의 단량체 및 이합체 VHH는 RV의 진단에 아주 유용한 것으로 입증되었으므로, 당업자에게 알려진 어느 면역진단에서 재조합 단클론 항체로 사용될 수 있다. 본 발명의 단량체 및 이합체 VHH 도메인이 RV를 검출하기 위한 어느 유형의 면역진단 분석에 사용될 수 있고 상기 분석이 본 발명의 범위에 속한다는 것은 당업자에게 명백하다.
본 발명의 항-VP6 도메인은 본 발명에서 기재한 바와 같은 이합체, 예를 들어 동종이합체를 작제하기 위하여 사용될 수 있거나, 또는 예를 들어 3B2 도메인 및 3A6 도메인을 융합하거나 본 발명의 VHH 단량체들중 어느 두 개를 융합함으로써 이종이합체를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 세 개 이상의 VHH 단량체를 융합 또는 결합시켜 동종삼합체 또는 이종삼합체를 생성할 수도 있다.
연결 서열을 함유하건 함유하지 않던 상관없이 본 발명의 VHH 단량체들의 조합으로부터 발생하는 단량체 형태는 모두 본 발명의 범위에 속한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 VHH는 SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11 또는 SEQ ID No. 12에 기재된 서열을 갖는다. 예를 들어, 상기 이합체는 SEQ ID No. 13에서 나타낸 것과 같은 아미노산 연결 서열, 또는 힌지 서열로서 작용하는 다른 어떤 서열을 포함할 수 있다.
하기의 표는 본 발명의 이합체 또는 단량체 VHH의 일부 특성을 나타낸다.
특성
단량체 단백질 특이성1 대규모 제조 수율(mg/l)2 RV에 대한 다중반응성(ELISA)3 시험관내에서 RV 감염성의 중화(□g/100 FFU RV)
2KA4 VP6 52.1 있음 없음
2KD1 VP6 21.3 있음 높음
3A6 VP6 18.6 있음 중간
3B23 VP6 16.9 있음 높음
관련없는 VHH 세포 단백질 7.2 없음
이합체 없음*
Biv2A4 NA 0.90 있음 낮음
Biv2KD1 NA 0.50 있음 낮음
Biv3A6 NA 1.72 있음 낮고 균주 의존적임
1RV IND 및 재조합 VP6에 대하여 WB에 의해 측정됨.
2항-히스티딘 태그 항체에 의하여 각각 정제된 0.5 L의 6개 배지의 세트에 기조함.
3RV 균주인 Sb I1 Sb II, Sb no I 및 no II의 검출.
본 발명의 항-VP6 VHH 도메인은 시험관내에서 서로 다른 RV 균주들을 중화할 수 있었다. 본 발명의 네 개의 단량체들중 세 개(2KD1, 3A6 및 3B2)는 시험관내에서 광범위한 중화 활성을 나타냈다. 각각의 VHH의 중화능은 평가된 RV 균주 모두에 대하여 균일하였다. 3.9 μg/ml의 단량체 농도는 시험관내에서 100 FFU의 RV 균주 C486 (P[1]G6), IND (P[5]G6), B223 (P[11]G10), Wa P[8]G1 및 H2 (P[12]G3)에 의해 발생된 감염력을 완전히 중화할 수 있었다. 하기 표 3은 각 단량체마다 2 mg/ml 농도 용액의 상이한 RV 균주에 대한 중화 역가를 나타낸다.
서로 다른 단량체 및 이합체 VHH 도메인의 중화 역가

VHH 도메인
분석된 VHH 농도

 VN 항체 역가1
IND
Sb1
P[5]G6		 C486
Sb1
P[1]G6		 B223
Sb1
P[11]G10		 Wa
Sbll
P[8]G1		 H2
Sb nol, noll, P[12]G3

noll
P[12]G3
도메인
2KA4 2 mg/ml


 <8 <8 <8 <8 <8
2KD1 2048 2048 2048 8192 512
3A6 1024 1024 256 2048 128
3B2 1024 1024 2048 8192 512
관련없는 VHH 0.4 mg/ml <8 <8 <8 <8 <8
이합체
Biv2KA4 0.5 mg/ml <8 <8 <8 32 <8
Biv2KD1 0.5 mg/ml 32 128 8 128 32
Biv3A6 2 mg/ml 128 512 8 512 128
1100 FFU의 각 RV 균주당 발생된 포커스 형성 유니트의 80% 이상을 감소시키는 최대 VHH 희석 배수의 역수로 나타낸 것으로, 상이한 RV 균주들에 대한 중화 항체 역가.
따라서, VHH 단량체들은 교차 중화를 정상적으로 유도하지 않는 G/P 타입들의 서로 다른 조합들에 속하는 RV 균주들을 중화할 수 있었다. 최대 중화능을 갖는 VHH 단량체는 2KD1 단량체였다. 한편, 2KA4 단량체는 ELISA에서 모든 RV를 적절히 인식할 수 있었으나, 연구된 균주들중 그 어느 것도 중화시키지 못했다. 높은 역가의 항원적으로 서로 다른 RV 균주들을 중화하기 위한 본 발명의 VHH의 능력은 아주 중요하고, 이러한 능력으로 인해, 상기 VHH는 다중 중화 분자가 된다. 이러한 특성으로 인해, 상기 VHH는 혈청형(27개의 P 타입 및 16 개의 G 타입)에 대한 가능한 예방 및 치료 도구가 된다.
상기 이합체 VHH는 이들의 단량체 상대물보다 낮은 중화 활성을 나타냈다.
RV 감염에 의해 유발된 설사를 치료 및 예방하기 위한 본 발명의 VHH 단량체의 능력을 평가했다. 이를 위하여, 신생 마우스에게 VHH를 5 일간(0 째날 내지 4 째날) 매일 위내 투여했다. 상기 마우스에는 위내 경로를 통해 바이러스 균주 C486을 1일째에 공격접종했다(도 5). 본 발명의 단량체 VHH로 처리한 마우스중 60%는 RV 유발 설사로부터 보호되었다. 이러한 보호는 처리한 마우스와 무처리 마우스 또는 관련없는 VHH (p=0.0108)로 처리한 마우스를 비교한 때 유의적으로 높았는데, 모든 마우스는 설사를 경험했다(표 4 및 도 5). 또한, 본 발명의 VHH로 처리한 동물에서 설사의 심각성 및 기간은 대조군과 비교하여 유의적으로 감소되었다.
처리(4일간 하루에 한번 100 μg의 I.G. VHH); 1 일째에 공격접종: C486 (2 x 105 FFU)


n
 설사
군에서의 평균 기간 군에서의 평균 심각성 감염된 동물% 발병 감염된 동물에서 설사의 평균 기간 감염된 동물에서 설사의 평균 기간
2KA4 10 2 AB 3.7 B 80 AB 1.25 A 2.5 AB 4.12 B
2KD1 10 1.4 B 3.25 B 70 AB 1.28 A 2.0 B 3.78 B
3A6 10 2.2 AB 4.15 AB 90 AB 1.22 A 2.4 AB 4.39 AB
3B2 10 0.8 B 2.65 AB 40 B 1.25 A 2.0 B 3.62 B
관련없는 VHH 5 2.4 AB 4.4 100 A 1.2 A 2.4 AB 4.4 AB
양성 다클론 혈청 5 0 B 2.1 B 0 B na na na
정상 다클론 혈청 5 2.4 AB 4.25 AB 100 A 1.2 A 2.4 AB 4.25 AB
무처리/공격 접종 15 3 A 5.3 A 100 A 1.05 A 3.3 A 5.31 A
무처리/공격접종없음 5 0 B na 0 B na na na
na: 적용 불가
상기 표에서 서로 다른 문자들로 나타낸 동일 컬럼의 평균 값들은 유의적으로 차이가 있다(Kruskal Wallis, p<0.05).
서로 다른 문자들로 나타낸 감염 동물의 %는 유의적으로 차이가 있다(Fisher Exact Test, p<0.05).
전세계적으로 위장염과 가장 일반적으로 관련이 있는 것으로 판단되는 인간 이종 RV 균주(Wa, SbIl, P[8]G1 )에 대하여 최고 중화 역가가 얻어졌다는 것은 아주 흥미롭다.
이들 항체 단편의 제조 및 정제는 높은 수율로 수행될 수 있으므로, 제조 비용이 더욱 감소된다. 이는 감염 정도 및 치사율/사망율이 대단히 높고 치료 및 예방 비용이 중요한 제한 인자가 되는 개발 도상국에서 적절하다.
당업자는 본 발명의 개시 내용에 기초하여, 본 발명의 VHH 도메인이 파지 라이브러리를 창작할 필요없이 대응 뉴클레오티드 서열을 합성하고 어느 숙주 세포에서 상기 서열을 발현시킴으로써 제조될 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 VHH 단량체, VHH 이합체 또는 VHH 삼합체의 상이한 조합들 및 혼합물들은 본 발명의 정신을 변경함이 없이 면역진단, RV 감염의 예방 및 RV로 감염된 포유동물의 치료에 사용될 수 있으며, 상기 가능한 조합 및 혼합물은 모두 본 발명의 범위에 속한다는 것이 당업자에게 명백하다.
위에서 언급한 바와 같이, 서로 다른 아군에 해당하는 RV 균주에 강하게 결합한 4 개의 클론이 선택되었다. 이러한 클론들은 2KA4 (SEQ ID NO: 1 ), 2KD1 (SEQ ID NO: 2), 3A6 (SEQ ID NO: 3) 및 3B2 (SEQ ID NO: 4)로 명명되었는데, 이러한 서열들은, 상기 VHH가 VP6 단백질의 선형 에피토프에 결합한다는 것을 나타내는 웨스턴 블럿에 의해 평가한 바와 같이 RV IND의 재조합 V6 및 이의 천연 상대물을 인식했다.
상기 본 발명의 도메인 (SEQ ID NO: 1 내지 4) 또는 이들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터와 같은 적절한 재조합 벡터에 삽입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터의 선정은 상기 벡터가 도입될 숙주 세포의 형태에 의존한다. 예시로서, 상기 벡터는, 숙주 세포에 도입되는 때 통합되거나 또는 상기 숙주 세포의 게놈에 존재하지 않는 플라스미드 또는 벡터이다. 상기 벡터는 당업계에 알려진 어느 방법을 이용하여 얻을 수 있다[Sambrok 외, 1989]. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 식물 또는 동물 세포의 게놈내로 삽입되도록 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 벡터는 식물이나 동물 세포에서 발현될 수 있는 아그로박테리움 튜메파시엔스 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 특별한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 바이러스 벡터는 바큘로바이러스이다(실시예 5 참조).
상기 벡터는 식물, 조류 또는 동물 세포, 바람직하게는 곤충 또는 유충 세포를 형질전환, 형질감염 또는 감염시키기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 감염된 세포에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 상기 형질 전환 세포는 동물 세포, 바람직하게는 곤충 세포, 더욱 바람직하게는 상기 곤충 세포의 유충이다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID: 1 내지 4에 의해 특징지워지는 펩티드를 고수율로 발현하는 형질전환 곤충 또는 형질전환 유충과 같은 형질전환 비인간 동물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 벡터를 이용하여, SEQ ID NO: 1 내지 4 및/또는 9 내지 12로 특징지워지는 본 발명의 도메인을 제조 및/또는 보관할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 도메인의 제조를 가능하게 하는 조건하에서 본 발명의 벡터로 형질감염, 형질전환 또는 감염된 세포 또는 유기체를 성장시키는 것을 포함하는 본 발명의 도메인의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 형질전환 세포 또는 유기체의 배양을 최적화하기 위한 조건은 사용되는 세포 또는 유기체의 유형에 의존하게 되고, 필요한 경우, 상기 본 발명의 도메인을 제조하는 방법은 당업계에 알려진 방법에 따라 상기 도메인을 분리 및 정제하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기의 본 발명의 도메인들중 어느 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체를 제공한다.
- 카멜리드(camelid) 항체로부터 유래한 단량체 VHH 도메인으로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하고 A군 로타바이러스(RV)의 VP6 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 단량체 VHH 도메인.
- A군 로타바이러스(RV)의 VP6 단백질에 결합하는 이합체 VHH 도메인으로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4에 나타낸 서열들로 이루어진 군에서 선택되는 한 종 이상의 단량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 이합체 VHH 도메인.
본 발명의 또 다른 측면은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 RV의 면역검출을 위한 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 RV에 의해 유발되는 감염의 예방 방법에 사용하기 위한 것으로, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을, RV에 의해 유발되는 감염의 예방을 위한 조성물의 제조에 사용하는 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 RV에 의해 유발된 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 것으로, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을, RV에 의해 유발된 감염을 치료하기 위한 조성물의 제조에 사용하는 용도에 관한 것이다.
끝으로, 본 발명은 유효량의 상기 정의한 항체를 인간 또는 동물 신체에 접종하는 것을 포함하는 수동 면역 방법에 관한 것이다.
부다페스트 조약에 따른 미생물의 기탁
플라스미드 pFBMelVHH (실시예 5 참조)는 2008년 7월 2일에 스페인 발렌시아 대학의 스페인 생물 자원 센터(CECT)에 기탁번호 CECT7431호로서 기탁되었다.
본 발명은 카멜리드 항체로부터 유래한 단량체 도메인(VHH)으로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 또는 SEQ ID No. 4에서 나타낸 아미노산 서열들중 어느 하나일 수 있고 A군 RV의 VP6 단백질에 결합하는 단량체 도메인, A군 RV의 VP6 단백질에 결합하는 이합체 도메인으로서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 또는 SEQ ID No. 4에서 나타낸 하나 이상의 단량체 서열을 포함하는 것인 이합체 도메인, RV 함유 시료를 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9 또는 이들의 조합에서 나타낸 아미노산 서열들중 어느 하나와 접촉시키고 발색시키는 것을 포함하는 로타바이러스 면역검출 방법, 포유동물에게 수동 면역을 부여하는 조성물로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 또는 SEQ ID No. 9에 나타낸 서열들중 어느 하나와, 부형제와, 면역조절제를 포함하는 조성물, RV에 의해 유발되는 감염의 예방 방법으로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 또는 이들의 조합에서 나타낸 서열들중 어느 하나의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는데, 상기 서열은 단독으로 사용되거나 또는 상기 서열을 캡슐화하여 위장관에서 상기 서열이 분해되는 것을 방지하는 물질과 조합으로 사용되는 것인 예방 방법, 및 RV에 의해 발생된 감염의 치료 방법으로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 또는 이들의 조합에서 나타낸 서열들중 어느 하나의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는데, 상기 서열은 단독으로 사용되거나 또는 상기 서열을 캡슐화하여 위장관에서 상기 서열이 분해되는 것을 방지하는 물질과 조합으로 사용되는 것인 치료 방법을 제공한다.
도 1은 라마 면역화(llama immunization)를 나타낸다. 면역화, 시료 수집, 최종 출혈, 및 면역화 과정 동안 혈청내 로타바이러스 항체 반응의 평가를 위한 스케쥴: (i) 재조합 VP6를 이용한 ELISA, (ii) 로타바이러스 (IND; Sb I P[5]G6)를 이용한 ELISA, (iii) 바이러스 중화 및 (iv) 동일한 로타바이러스 (IND; Sb I P[5]G6)를 이용한 ELISPOT에 의해 측정한 항체 역가. 백신접종 시간은 화살표로 나타낸다.
도 2는 웨스턴 블럿 분석에 의한 천연 및 재조합 VP6 단백질의 검출을 나타낸다. 감소 조건 또는 비감소 조건하에서 BRV IND (A) 또는 재조합 VP6 (B)는 하기의 것을 이용하여 검출되었다: 레인 1 및 8: 소의 다클론 혈청 항-A군 RV; 레인 2 및 9: 항-VP6 Mab (RG25A10); 레인 3 및 10: VHH 2KA4 항 VP6; 레인 4 및 11: VHH 2KD1 항 VP6; 레인 5 및 12: VHH 3B2 항 VP6; 레인 6 및 13: VHH 3A6 항 VP6; 레인 7 및 14: 관련없는 VHH.
도 3은 VHH-ELISA를 나타낸다. 즉, 상이한 동물 종들로부터의 상이한 아군 반응성 및 G/P 타입 특이성을 이용한 로타바이러스 균주의 검출을 나타낸다.
A) 항체-포획 단량체 VHH 2KA4, 2KD1, 3A6 (2 μg/well).
B) 이가 VHH biv2KA4, biv2KD1, biv3A6 (1 μg/well)를 이용하여 직접 코팅. 소의 로타바이러스 IND (SbI; P[5]G6), C486 (SbI; P[1]G6) 및 B223 (SbI; P[11]G10)의 조직 배양 상징액; 인간 로타바이러스 Wa (SbII; P[8]G1 ) 및 말의 로타바이러스 H2 (Sb no I, no II; P[12]G3); 양성 배설물: 소의 로타바이러스 IND로 실험적으로 감염된 송아지의 바이러스 발산의 피크에 해당하는 배설 시료; MA-104: 모의 감염 세포의 상징액. PBS: (반응 블랭크), 음성 배설물: 로타바이러스에 음성인 송아지 배설 시료.
오차 막대는 두 개의 독립적인 측정값의 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 시험관내 로타바이러스 형광 포커스 감소 분석을 나타낸다. 일가 VHH 2KA4, 2KD1, 3A6 및 3B2의 각각의 4배 희석액이 100 FFU를 함유하는 동일 체적의 로타바이러스와 혼합되었다. 감염력의 80% 이상의 감소를 나타내는 VHH 농도가 보호를 제공하는 것으로 간주된다.
A. 소의 로타바이러스 C486 (백신접종 및 마우스의 공격접종에서 사용된 Ag에 상동임);
B. 소의 로타바이러스 IND (바인더 선별에서 사용된 Ag에 상동임);
C. 소의 로타바이러스 B223;
D. 인간 로타바이러스 Wa;
E. 말의 로타바이러스 H2.
그래프는 두 개의 독립적인 분석의 요약 결과를 나타낸다.
도 5는 로타바이러스가 공격접종된 신생 마우스에서 일가 VHH 2KA4, 2KD1, 3A6 및 3B2에 의해 달성된 설사에 대한 예방율을 나타낸다. 새끼들에게, 100 μg (100 μl)의 각각의 VHH가 0일째부터 5일째까지 하루에 한번 위내 경로로 공급되었다. 1 일째에, 새끼들에게는 정규 공급후 2 시간후에 RV가 위내로 공격접종되었다. 공격접종후 96 시간까지 매일 설사를 추적조사했다.
A. 공격접종: 30 DD50 (6x 105 FFU)의 소의 로타바이러스 C486. 실험은 군당 5 마리의 마우스를 이용하여 세 개의 독립적은 분석으로 수행되었다.
B. 공격접종; 316 DD50의 쥐의 로타바이러스 ECw. 실험은 실험은 군당 5 마리의 마우스를 이용하여 두 개의 독립적은 분석으로 수행되었다.
C. 10% w/v 소장 균질물에서 ELISA로 정량한 바이러스 발산.
기호 #는 무처리/공격접종 군과 유의적으로 차이가 있는 감염 동물의 %를 나타낸다(Fisher Exact Test, p<0.05).
막대는 군당 405 nm에서 ELISA 흡광도의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 ± 표준 편차를 나타낸다. ELISA 컷 오프 값: 0.200.
도 6A는 T.ni 유충에서 VHH의 발현을 나타낸다. 상기 발현 수준은 쿠마시에 염색에서 예상 분자량의 두 밴드를 검출하기에 충분히 높다. 도 6B는 유충계에서 발현된 VHH의 정량분석을 나타낸다.
도 7은 유충으로부터의 VHH를 이용한 ELISA 기법을 나타내다. VP6 발현 유충[Ag{+)] 또는 비삽입 재조합 바큘로바이러스[Ag(-)]로 감염된 유충으로부터 추출한 전체 가용성 단백질(TSP) 추출물을 이용하여, 50 mM 탄산염/중탄산염 완충액(pH 9.6)에 40 μg/well에서 출발하여 연속적으로 희석되는 희석액으로 ELISA 마이크로플레이트(Polysorp, Nunc, Denmark)를 코팅하고, 40 ℃에서 밤새 배양했다.
본 발명은 본 발명의 범위를 제한하는 의미로 해석되지 않는 하기의 실시예에 의해 최상으로 설명된다. 그러나, 본 발명의 범위 및/또는 첨부한 청구의 범위를 벗어나지 않고 다른 구현예, 변형물 및 균등물이 사용될 수 있으며, 이러한 설명은 당업자에게 제안하기 위한 것임이 명백히 이해하여야 한다.
실시예 1: 본 발명의 단량체 및 이합체 VHH의 획득 및 정제
본 발명의 VHH 라이브러리의 획득:
기준으로서 소의 IND RV 균주(SbI; P[5]G6)를 바이오패닝 공정에서 항원으로 사용하여 VHH를 선별했다. 상이한 동물 종들 및 인간으로부터의 G 및 P 타입들의 상이한 조합들과 함께 서로 다른 반응성을 나타내는 RV 패널을 얻기 위하여, 표 4에서 나타낸 기준 RV 균주를, VHH를 제조하기 위하여 수행된 상이한 분석에 포함시켰다. 상기 바이러스를 원숭이의 신장 세포(MA-104)에서 증식시켰다. 또한, 접종 전의 시기 및 바이러스 확산의 피이크에서 IND 균주로 감염시킨 초유 무공급 신생 송아지로부터 얻은 배설 시료를 포함시켰다.
본 발명의 VHH의 제조 및 특성화 동안에 수행된 상이한 과정에서 사용된 기준 로타바이러스 균주
RV 균주 유래 종 아군 G-P 타입 과정
C486 소 I P[1]G6 백신접종 및 특이 ELISA에 대하여 사용된 재조합 VP6 항원
라마 항체 반응(VN)
바인더 특성화(VN, ELISA)
마우스에서의 공격 접종
IND 소 I P[5]G6 바인더 선별(Biopanning; Phage-ELISA)
바인더 특성화(VN, ELISA)
라마 항체 반응(VN, ELISA, ELISPOT)
B223 소 I P[11]G10 라마 항체 반응(VN)
바인더 특성화(VN, ELISA)
Wa 인간 II P[8]G1 라마 항체 반응(VN)
바인더 특성화(VN, ELISA)
H2 말 no I;
no II		 P[12]G3 라마 항체 반응(VN)
바인더 특성화(VN, ELISA)
라마의 면역화: 소의 RV 균주로부터 유래한 VP6 단백질
재조합 바큘로바이러스로 감염시킨 Sf9 세포에서 C486 (SbIP[1]G6)를 제조했다. 생후 1 년된 수컷 라마에게, INTA 오일 아쥬반트(Marcol:Arcel:Span:Tween)와 혼합된 500 μg의 VP6를 함유하는 추출액을 0일, 21일, 28일, 35일 및 246일째에 투여하여 총 5회 투여했다. 각 접종후 0일, 4일 및 7일째에 혈청 및 혈액 시료를 취했다. 체액 반응을 ELISA 및 바이러스 중화(VN)를 통해 평가했다(하기 참조). 작동 B-세포 반응을 평가하기 위하여, 돼지 및 소에서 실시된 예전의 ELISPOT 분석에 근거하여, 접종된 라마의 말초 혈액에서 RV-특이 항체 분비 세포의 수를 측정하도록 ELISA 분석을 변경했다(Parreno, V. C. 외, Vet Immunol lmmunopathol 100:7-24, 2004, 및 Parreno, V.V. 외, J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 48:713-20, 2001; 이 문헌들의 개시내용은 본 발명에 참조로 통합됨). 간략히 말해서, BRV IND로 감염시킨 MA-104 세포(면역형광으로 검출하는때 80% 이상의 감염율을 가짐)를 70% 아세톤을 이용하여 고정하고, 96-웰 플레이트에서 성장시키고, 공기 건조하고, 사용에 앞서 -20 ℃에서 보관했다. 상기 접종된 라마의 말초 혈액(PB)으로부터 유래한 단핵 세포(MNC)의 현탁액을 상기 웰에 첨가했다(1 x 106; 5 x 105; 2.5 x 105 및 1.25 x 105 cells/well). 500g에서 5 분간 원심분리한 후, 상기 플레이트를 5% CO2에서 37 ℃로 12 내지 14 시간 동안 배양했다. 상기 플레이트를 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS로 세척하여 부착성 세포를 제거하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 1/1,500 희석액에 ELISA에서 사용된 것과 동일한 복합체(conjugate)를 첨가한 다음, 50 μl의 TMB 퍼옥시다제 기질계(KLP1 Maryland, USA)를 첨가하여 스팟(spot)을 발생시켰다.
라마 시료의 취급, 접종 및 수집은 INTA의 동물 복지 윤리 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수의사의 감독하에 훈련된 사람에 의해 수행되었다.
VHH 라이브러리의 제조 및 본 발명의 VP6-결합 VHH의 선별:
마지막 주사후 4일째에 수집한 총 900 ml의 혈액으로부터, 6x108 단핵 세포를 Ficoll Paque 기울기 원심분리로 추출한 다음, 이들 세포를 원심분리하고, 액체 질소에서 동결시킨 후, -80 ℃에서 유지했다. 전체 RNA를 RNA 추출 장비(Macherey Nagel; Nucleospin RNA II)를 이용하여 추출하여, 250 μg의 RNA를 얻었다. 다음에, Superscript III 역전사효소 장비(Invitrogen)와 함께 OligodT (12-18) 프라이머 (Invitrogen) 또는 랜덤 프라이머(Invitrogen)를 이용하여 첫번째 cDNA 사슬을 합성했다. 20 μl 반응 혼합물에서, 0.2 μg, 1 μg 또는 5 μg 의 전체 RNA를 사용했다. 리더 서열 및 CH2 서열로서 어닐링되는 프라이머 (SEQ ID No. 14) 및 CALL02 (SEQ ID No. 15)를 이용한 PCR을 통해 VHH-암호화 및 VH-암호화 cDNA를 특이적으로 증폭시켰다. 900-pb 단편(엑손 VH-CH1- CH2)을 분리한 다음, 600-pb 단편(엑손 VHH-CH2, 엑손 CH1 없음)을 1.6% 아가로스 겔로부터 용리시켰다. 다음에, 골격 부위 1(SEQ ID No. 16) 및 골격 부위 4 (SEQ ID No. 17)에서 어닐링되는 프라이머, 차후의 콜로닝 단계를 위한 하기의 제한 부위들을 함유하는 프라이머를 이용한 추가의 nested PCR을 통해 상기 VHH를 증폭시켰다: NcoI 및 PstI에 대한 제한 부위를 갖는 VHHfor2 (SEQ ID No. 18); 및 NotI에 대한 제한 부위를 갖는 VHHrev2 (SEQ ID No. 19). 최종 PCR 단편을, 상류측 제한 부위인 NcoI 또는 PstI 및 하류측 제한 부위인 NotI을 이용하여, VHH의 삽입후 제거되는 무관한 긴 서열을 함유하는 pHEN4의 변형물인 파지미드 벡터 pAO-Lib(Arbabi Ghahroudi M, Desmyter A, Wyns L, Hamers R, Muyldermans S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 1997 Sep 15;414(3):521-6)에 라이게이션하여, VHH 삽입물이 없이 상기 벡터의 가능한 번식이 지연되도록 하였다. 상기 라이게이션된 물질을 이용하여 대장균(TG 1) 세포를 형질전환하고, 그 세포를 분주했다. 상기 플레이트로부터 콜로니를 긁어내고, 세척하고, 글리세롤(50% 최종 농도)이 첨가된 LB 배지에서 -80 ℃로 유지했다.
파지 발현 기술을 이용하여 상기 라이브러리로부터 특이 VHH를 선별했다. 상기 VHH 라이브러리를 M13 헬퍼 파지(Invitrogen)로 감염시키고, VHH를 발현하는 파지 입자를 다음문헌[Marks, J. D., Hoogenboom, H. R., Bonnert, T.P., McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. JMB, 1991]에 기재한 바와 같이 구출하고 PEG로 침전시켰다. 시험관내에서 두 개 또는 세 개 선별 라운드, 즉, 바이오패닝(biopanning)으로 알려진 기법을 이용하여 특이 VHH의 농도 강화를 수행했다. 반정제된 BRV IND (SbI; P[5]G6)의 1/50 희석액 또는 기니 피그의 항-RV 다클론 항혈청을 탄산염 완충액(pH 9.6)에 희석한 1/5,000 희석액으로 면역튜브를 4 ℃에서 밤새 코팅한 다음, 블로킹하고, 동일 BRV IND의 1/50 희석액을 포획했다. 구출한 파지를 BRV IND 또는 이미 포획한 BRV IND와 함께 배양 및 세척하고, 결합한 파지 입자를 pH 10.0의 100 mM 트리에틸아민을 이용하여 용리시킨 다음 즉시, pH 7.4의 Tris로 중화시켰다. 상기 용리된 파지를 이용하여, 지수적으로 성장하는 TG1 세포를 감염시켰다. 두 번째 및 세 번째 바이오패닝 라운드후, 개개의 콜로니를 성장시키고, 해당하는 VHH 클론을 파지 ELlSA로 분석했다.
본 발명의 단량체 및 이합체 VHH의 발현 및 정제:
ELISA에서 양성 반응을 나타낸 클론의 VHH cDNA를, 원형질막 공간에 대한 pelB 표적 서열 및 카르복시 말단 헥사히스티딘 태그를 제공하는 발현 벡터 pHEN6 (Conrath, K. E. M. 외, Antimicrob Agents Chemother 45:2807-12, 2001; 이 문헌은 참조로 본 발명에 통합됨)에 제한 효소 NcoI 및 NotI를 이용하여 다시 클로닝했다. 인간 IgA 힌지와 관련된 링커를 암호화하는 프라이머 Bivfor2 (SEQ ID No. 20) 및 Bivrev2 (SEQ ID No. 21)를 이용하여 VHH 서열을 PCR 증폭시켜 이가 VHH를 제작했다. 상기 PCR 생성물, 및 VHH 주형을 함유하는 pHEN6 벡터를 NcoI and PstI를 이용하여 절단하고, 라이게이션하여 상기 이가 VHH를 함유하는 벡터 pAO-biv를 제작했다. 대장균의 XL1 Blue 세포를 상이한 플라스미드 작제물들을 이용하여 형질전환했다. 27 ℃에서 16 시간 동안 1 mM 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드를 이용하여 VHH의 발현을 유도했다(Sambrook, J., 및 Russell, D.W., 2001, Molecular Cloning). 상기 세포를 원심분리한 후, 원형질막 공간 단백질을 삼투 충격을 통해 추출했다. N-High-Trap HP 킬레이트 컬럼(Amersham Biosciences)을 이용하여 상기 원형질막 공간 추출물로부터 VHH를 정제했다.
실시예 2: 본 발명의 VHH의 특성화
웨스턴 블럿:
바큘로바이러스 계에서 발현된 VP6 농축물 및 BRV IND 농축물을 Laemmli 시료 완충액에 다시 현탁하고, 10 분간 끓였다. 다음에, 12% SDS-PAGE 컬럼에 통과시키고 Immobilon P 막(Millipore, Berdford, MA)에 옮겼다. 상기 막을 10% 탈지 분유를 함유하는 PBS/Tween (0.05%)를 이용하여 45 분간 블로킹하고, 각각의 VHH (4 μg/ml)를 상온에서 2 시간 배양했다. 다음에, 상기 막을 PBS/Tween (0.05%)로 세척하고 항-펜타히스티딘 항체(PBS/Tween (0.05%) BSA (3%))에 희석된 1/500 희석액)과 함께 배양했다. 끝으로, 상기 VHH를 HRP-결합 염소 항-마우스 IgG (1/5,000 희석액)(Amersham, Pharmacia, Biotech)과 함께 상온에서 40 분간 배양했다. 상기 분석물을 ECL (Amersham Biosciences)로 발색시켰다.
본 발명의 VHH의 서열분석:
상기 VHH를 서열분석하기 위하여, ABl-Prism 377 DNA 자동 서열분석기(Perkin Elmer, Applied Biosystems)에서 다음 방법[Big Die Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystem)]에 따라 "M13 정방향" 및 "M13 역방향" 올리고뉴클레오티드를 이용했다.
실시예 3: 본 발명의 VHH를 이용한 RV 면역검출 분석
효소 면역분석(ELISA) 및 웨스턴 블럿:
RV에 의해 직접 감작시키거나, RV를 포획하거나, 무균 돼지에서 생성한 다클론 항체를 이용하여 VP6를 재조합함으로써 Maxisorp 96-웰 플레이트(Nunc)에서 ELISA 실험을 수행했다. 음성 대조군에 대한 항원으로서, 유사 감염된 MA-104 세포 및 바큘로바이러스에서 발현된 관련없는 단백질(소의 설사 바이러스의 E2 단백질)을 이용했다. 블랭크(blank)로는 PBS를 사용했고, 비면역화 기니 피그 혈청을 음성 포획물로 사용했다.
라마 혈청에서 항-RV 항체의 존재 여부를 다음문헌[Parreno, V.C. 외, Vet Immunol lmmunopathol 100:7-24, 2004]에 기재된 바와 같이 분석하였고, 항-VP6 항체의 존재 여부는 다음문헌[Fernandez, F.M. 외, Vaccine 16:507-16, 1998]의 방법을 변형시킨 프로토콜에 따라 분석하였다. 퍼옥시다제-표지된 염소 항-라마 IgG (H+L)(Bethyl, Lab Inc, Montgomery, CA, USA)를 1/2,000 희석액으로 이용하여 라마 IgG를 검출했다. 바이오패닝에 의해 얻은 개개 클론으로부터 유래한 파지를 파지 ELISA로 분석했다. 간략히 말해서, 벡터 phen4에서 상이한 VHH 유전자들을 함유하는 것으로 개개의 지수적으로 성장하는 대장균의 TG1 클론을 M13 헬퍼 파지로 감염시켜서, 표면 항원에 융합된 VHH를 발현하는 파지 입자를 생성하고, 상기 파지의 자손을 함유하는 배지 상징액을 BRV IND 또는 VP6에 의해 감작된 ELISA 플레이트에서 분석했다. 상온에서 40 분간 HRP-결합 항-M13p8 항체(Amersham, Pharmacia, Biotech)의 1/5,000 희석액을 이용하여, 결합된 파지를 검출했다. 상기 분석물을 H2O2/ABTS (Zymed)를 이용하여 발색시켰다.
첫째, 카르복시-말단 6-His 태그를 이용하여 정제한 일가 또는 이가 VHH를, 전술한 바와 같이 ELISA에 의해 RV 또는 VP6를 검출하기 위한 시약으로 연구하고, 항-펜타히스티딘 단클론 항체(Qiagen, 1/5,000) 및 HRP-결합 염소 항-마우스 항체를 이용하여 발색시켰다. 둘째, 10 μg/ml of VHH에 의해 ELISA 플레이트를 직접 감작시키고 10 μg/ml의 항-히스티딘 단클론 항체로 포획한 다음, 20 μg/ml의 VHH로 감작함으로써 상기 VHH를 RV 포획 시약으로 분석했다. BRV IND (1/2,000 희석액) 및 퍼옥시다제-표지 항-소 IgG (H+L)(KPL, Gaitherburg, Maryland, USA)의 1/5,000 희석액으로 과면역화시킨 초유 무공급 송아지로부터 유래한 RV 항혈청을 이용하여 상기 분석물을 발색시켰다.
이합체 VHH를 10 μg/ml의 농도로 RV 포획 시약으로서 ELISA에 의해 테스트했다.
또한, 단량체 VHH를 2차 항체로서 분석하고, 그 ELISA를 항-펜타히스티딘 단클론 항체 및 HRP-결합 염소 항-마우스 항체(1:1,000 희석액)(Amersham, Pharmacia, Biotech)를 이용하여 발색시켰다.
바이러스 중화 분석:
정제된 VHH 및 라마 혈청 시료에서 바이러스 IND, C486, B223, Wa 및 H2에 대한 중화 항체 역가를, 다음문헌[To, T.L. 외, J Gen Virol 79 (Pt 11):2661-72, 1998)에 기재된 바와 같이 형광 포커스 중화에 의해 측정했다. 간략히 말해서, 선별 및 정제된 VHH 단량체 또는 이합체의 계단 희석액 100 μl를 동일 체적의 바이러스와 혼합하여 혼합물 100 μl 당 100개의 포커스-형성 단위를 얻은 다음, 37 ℃에서 1 시간동안 배양했다. 100 μl의 상기 항체-바이러스 혼합물을 MA-104 단일층(4 복제물)에 도말하고 37 ℃에서 48 시간동안 배양했다. 상기 플레이트를 70% 아세톤을 이용하여 고정하고, 그 분석물을 RV로 과면역화한 초유 무공급 송아지로부터 얻은 FITC-표지 항-RV 항체를 이용하여 발색시켰다. VN 역가는 형광 초점의 수를 80% 이상 감소시키는 시료의 최대 희석 배수의 역수로 나타냈다.
실시예 4: 포유동물에서 RV 유발 설사의 예방 및/또는 치료를 위한 본 발명의 단량체 및 이합체 VHH의 용도
신생 마우스에서 RV 보호 분석
100 μg의 각각의 항-VP6 VHH 단량체를, 0일에서 시작하여 5일간 하루에 한번씩 위내 프로브를 이용하여 생후 4일된 Balb/c 마우스에 투여했다. 1 일째에 VHH 투여후 2 시간 후에, 젖 분비 마우스에게, 2 x 106 FFU/ml을 함유하는 100 μl의 BRV C486 (SbI; P[1]G6)를 위내 경로로 공격접종한 다음, 20 μl의 5% 중탄산염 용액을 위내 경로로 공격접종했다. 상기 접종물은 무처리 대조군 마우스 모두에서 설사를 일으킬 수 있었다. 실험에서 사용한 대조군은 다음과 같았다: i) 항체로 처리되지 않고 RV로 접종된 마우스; ii) 세포 단백질에 대한 동일량의 관련없는 단백질로 처리한 마우스; iii) 상동성 RV에 대한 2048의 VN 역가를 갖는 기니 피그 다클론 항체로부터 유래한 450 μg의 친화성 정제된 IgG로 처리한 마우스; iv) 혈청 음성 대조군 기니 피그로부터 얻은 동일량의 IgG로 처리한 마우스; v) 감염 및 처리되지 않은 마우스. 5 일간의 연구 기간 동안 마우스의 복부를 직접 촉진(palpation)하여 RV 유발 설사를 임상학적으로 평가했다. 다음문헌[VanCott, J. L. 외, J Virol 80:4949-61, 2006]에 기재된 바와 같이, 변통(stool)의 색상 및 점조도에 근거하여 수치를 지정함으로써 설사의 심각성을 하루 단위로 분석했다. 피셔의 정확 검정(Fisher's exact test)을 이용하여 각 군들 사이의 설사 마우스들의 비율을 비교했다. 크루스칼-왈리스 비모수 검정(Kruskal Wallis non-parametric test)을 이용하여, 처리된 군들 사이의 설사의 평균 발병, 기간 및 심각성을 비교했다.
실시예 5: 재조합 바큘로바이러스 발생
VHH 3B2 완전 서열을 함유하는 phen 6 플라스미드로부터 재조합 바큘로바이러스 BacMelVHH를 발생시켰다. SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 24의 프라이머를 이용하여 phen 6 플라스미드로부터 상기 단백질을 PCR 증폭했다. 다음에, 얻어진 증폭산물을, 대응하는 프라이머에 포함된 Bam HI and XbaI 제한 부위를 이용하여, 꿀벌 멜리틴으로부터 유래한 곤충 신호 서열을 포함하는 pFastMelB2에 클로닝하였다. 얻어지는 pFBMelVHH 플라스미드를 자동화 서열분석으로 특성화하고, Bac-to- Bac® Baculovirus 시스템(Invitrogen, USA)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 재조합 바큘로바이러스 BacMelVHH를 발생시켰다. 재조합 바큘로바이러스를 107 내지 109 pfu/ml의 감염 역가에 도달하도록 sf21 곤충 세포에서 번식 및 증폭시키고, 그 스톡(stock)을 매일 사용의 경우 40 ℃에서 유지하고 장기 보관의 경우 -80 ℃에서 유지했다.
곤충 성장 조건 및 접종
발현 실험을 위하여, 중량이 약 250 mg인 5령 유충(번데기가 되기전 마지막 령의 유충)의 복각(체강의 전방) 근처에, 유충 투여량당 알려진 pfu를 이용하여 상기 재조합 바큘로바이러스를 주사했다. 감염된 유충을 28 ℃의 성장 챔버에서 유지하고 지정된 시기에 수집했다. 다음에, 유충을 즉시 동결하고 가공시까지 -20 ℃로 유지했다.
또한, 곤충 세포 배지를 알려진 투여량을 이용하여 감염시켰다. 감염된 세포를 28 ℃로 72 시간 유지했다. 끝으로, 감염된 세포를 수확하고, 그 세포 펠릿을 즉시 동결하고 가공시까지 -20 ℃로 유지했다.
단백질 추출물의 제조
PBS 1X에서 triton 0,01 %, DTT 25 mM 및 단백질 억제제 칵테일(Complete, Roche, Germany)을 함유하는 추출 완충액에 상기 동결 유충을 배합함으로써 T. ni 유충으로부터 전체 가용성 단백질(TSP)을 얻었다.
단백질 추출물의 분석
상기 TSP에 함유된 특이 VHH 단백질의 정량 및 검출을 위하여 쿠마시에 블루 염색 및 면역 블럿 분석을 수행했다. 따라서, 레인당 20 μg의 TSP를 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩했다. 전기영동후, 겔을 쿠마시에 블루 용액으로 염색하거나 또는 니트로셀룰로오스 막(Schleicher & Schuell)에 옮겨서 웨스턴 블럿을 수행했다.
웨스턴 블럿 분석을 위하여, SDS-PAGE (12%)를 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad, USA)으로 옮겼다. 막을 PBS-0.05% Tween 20 (PBST) 4% 탈지 분유(블로킹 버퍼, BF)를 이용하여 40 ℃에서 밤새 블로킹한 다음, 토끼 항-VHH 혈청(BF에서 1:100)을 이용하여 실온에서 1 시간 배양했다. 상기 막을 PBST로 3회 세척하고, 항-토끼 IgG-HRP가 표지 및 결합된 항체(BF에서 1 :2000; Sigma, USA)를 2차 항체로서 1 시간 동안 첨가했다. PBST로 세척한 후, ECL 웨스턴 블럿 검출 시스템을 이용하여 Hyperfilm ECL 필름(Amersham, USA)상에 단백질 밴드를 검출했다(도 6A 참조).
기능 분석
VP6(소의 로타바이러스 단백질) 발현 유충[Ag(+)]으로부터 얻거나 또는 삽입물이 없는 재조합 로타바이러스[Ag(-)]로 감염된 유충으로부터 얻은 TSP 추출물을, 50 mM 탄산염/중탄산염 완충액(pH 9.6)에 40 μg/well에서 출발하여 연속적으로 희석된 계단 희석액을 이용하여 ELISA 마이크로플레이트(Polysorp, Nunc, Denmark)에 코팅하고, 4 ℃에서 밤새 배양했다. 다음날, 플레이트를 PBST로 4회 세척했다. 다음에, 플레이트를 일정 교반하에서 37 ℃로 1 시간 배양한 후, 블로킹 용액(PBST-2% BSA, 100 μl/well)과 함께 30 분간 배양했다. 다음에, 블로킹 용액에서 2,5 μg/well의 농도로 VHH 발현 유충에서 얻은 TSP 추출물과 함께 1 사간 동안 배양했다. 다음에, 플레이트를 PBST로 4회 세척하고, 30 분간 다시 블로킹했다. 다음에, 토끼에서 만들어진 VHH에 대한 100 μl/well의 다클론 항체(1:100 희석)를 첨가하고 37 ℃로 1 시간동안 배양했다. 플레이트를 PBST로 4회 세척했다. 끝으로, 블로킹 용액에 1:2000으로 희석한 100 μl/well의 항-토끼 IgG-HRP가 표지 결합된 항체를 첨가했다. 기질 반응을 위하여, 플레이트를 4회 세척하고, 100 μl/well의 1 mM 2,2'-아지노- 비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산 (ABTS; KPL, USA)를 플레이트에 첨가했다. 퍼옥시다제 반응시켜서 실온에서 5 내지 10 분간 발색시키고, 그 반응을 ELISA 마이크로플레이트 판독기(Multiskan EX, Thermo Electron Corp, USA)에서 405 nm로 판독했다.
<110> ALTERNATIVE GENE EXPRESSION, S.L. (ALGENEX) INSTITUTO NACIONAL E TECNOLOGIA AGROPECUARIA (INTA) <120> Monomeric VHH domain derived from anti-VP6 camelid antibodies, dimeric domain, immunisation method, rotavirus detection method, composition, prevention and treatment methods for rotavirus infections <130> ARP070103331 <150> AR P070103331 <151> 2007-07-27 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 129 <212> PRT <213> Lama glama <400> 1 Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gln Ser Gly Pro Gly Arg Tyr 20 25 30 Gly Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Val Ser Gly Ser Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Arg Arg Thr Tyr Ser Gly Ser Asn Leu Trp His Arg Ser Asp 100 105 110 Glu Tyr Asp Ser Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 115 120 125 Arg <210> 2 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 2 Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Asp Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ala Thr Ile Ser Ser Ser Asp Ser Pro Trp Tyr Gly Glu Pro 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ala Arg Val Asn Ala Lys Asn Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu His Leu Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Gly Ser Val Gln His Met Ala Asn Glu Asn Glu Tyr Val 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Arg 115 120 125 <210> 3 <211> 127 <212> PRT <213> Lama glama <400> 3 Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Ser Phe Gly 20 25 30 Asp Asp Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ser Ala Ile Arg Phe Arg Ser Asn Ser Pro Phe Tyr Gly Asp 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Ser Ala Lys Asp Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu His Met Tyr Arg Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Val Gly Asp Gly Ala Leu Val Asn Arg Ala Ser Asp Tyr 100 105 110 Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Arg 115 120 125 <210> 4 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <400> 4 Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ala 1 5 10 15 Gly Asp Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 Gly Tyr Val Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Ala Glu Arg Glu 35 40 45 Phe Val Gly Ala Ile Arg Trp Ser Glu Asp Ser Thr Trp Tyr Gly Asp 50 55 60 Ser Met Lys Gly Arg Ile Leu Ile Ser Arg Asn Asn Ile Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Asn Leu Gln Met Phe Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Val Cys Ala Ala Gly Ala Gly Asp Ile Val Thr Thr Glu Thr Ser Tyr 100 105 110 Asn Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Arg Gly Arg 115 120 125 <210> 5 <211> 411 <212> DNA <213> Lama glama <400> 5 atggctgatg tgcagctgca ggcgtctggg ggaggattgg tgcaggctgg ggactctctg 60 agactctcct gtgtacaatc tggaccgggc aggtatggcg tgggctggtt ccgccaggct 120 ccagggaaag agcgtgaatt tgtggcagct gtgagcggga gtggtggttc gaaatattat 180 ggagactccg tacagggccg attcaccatc tccaaagacg acgccaagaa cacggtgtat 240 ctgcaaatga acaacctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agtccggaga 300 acctatagtg gtagtaacct ttggcacaga tcggatgagt atgactcctg gggcccgggg 360 acccaggtca ccgtctccag cggccgccac caccatcacc atcactaata g 411 <210> 6 <211> 402 <212> DNA <213> Lama glama <400> 6 atggctgatg tgcagctgca ggcgtctggg ggaggatttg tgcagcctgg agattctctg 60 agtctctcct gtgcagcctc tggaggcacc tttagtagct attccattgg ctggttccgc 120 cagggtccag ggaaggagcg tgagttcgtg gctactatca gttcgagtga tagtccgtgg 180 tatggagagc ccgcgaaggg ccgattcacc gtcgccagag ttaacgccaa gaatacggcg 240 tatctgcact tgaacaggtt gaaacctgag gacacggcca cttattattg tgcagccggt 300 agtgtacaac acatggcgaa tgagaatgag tatgtctatt ggggccaggg gacccaggtc 360 accgtctcca gcggccgcca ccaccatcac catcactaat ag 402 <210> 7 <211> 405 <212> DNA <213> Lama glama <400> 7 atggctgagg tccagctgca ggcgtctggg ggaggatttg ttcaacctgg gggctctctg 60 agtctctcct gtgccgtctc tggacgcagc ttcggtgacg atgtcatggg ctggttccgc 120 caggctccag ggaaggagcg tgaatttgta tcagctatta ggttcaggag taacagccca 180 ttttatggcg accccgggaa gggccgattc accatcgcca gagacagcgc caaggacacg 240 gtgtatctgc acatgtaccg cctgagacct gacgacacgg ccgtatatta ctgtgccgta 300 ggagatggtg cccttgtgaa tcgcgcgtcc gactatacgt actggggcca ggggacccag 360 gtcaccgtct ccagcggccg ccaccaccat caccatcact aatag 405 <210> 8 <211> 408 <212> DNA <213> Lama glama <400> 8 atggctgatg tgcagctgca ggcgtctggg ggaggtttgg cgcaggctgg ggactctctg 60 acactctcct gtgcagcctc tggacgcacc ttcagtggtt atgtcgtggg ctggttccgc 120 caggctccag gggcggagcg tgagtttgta ggagctatta gatggtcaga agatagcaca 180 tggtatggag actccatgaa gggccgaatt ctcatctcca gaaacaatat caagaacacg 240 gtgaatctgc aaatgttcaa tctaaaacct gaagacacgg ccgtgtacgt ctgtgcagca 300 ggggccgggg atatagtgac tactgagact tcttataatt actggggccg ggggacccag 360 gtcaccgtct cctcacgcgg ccgccaccac catcaccatc actaatag 408 <210> 9 <211> 266 <212> PRT <213> Lama glama <400> 9 Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Ser Phe Gly 20 25 30 Asp Asp Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ser Ala Ile Arg Phe Arg Ser Asn Ser Pro Phe Tyr Gly Asp 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Ser Ala Lys Asp Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu His Met Tyr Arg Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Val Gly Asp Gly Ala Leu Val Asn Arg Ala Ser Asp Tyr 100 105 110 Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Pro 115 120 125 Ser Thr Pro Pro Arg Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Ser Asp Val Gln 130 135 140 Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Ser 145 150 155 160 Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Ser Phe Gly Asp Asp Val Met Gly 165 170 175 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Ala Ile 180 185 190 Arg Phe Arg Ser Asn Ser Pro Phe Tyr Gly Asp Pro Gly Lys Gly Arg 195 200 205 Phe Thr Ile Ala Arg Asp Ser Ala Lys Asp Thr Val Tyr Leu His Met 210 215 220 Tyr Arg Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Gly 225 230 235 240 Asp Gly Ala Leu Val Asn Arg Ala Ser Asp Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln 245 250 255 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Arg 260 265 <210> 10 <211> 264 <212> PRT <213> Lama glama <400> 10 Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Asp Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ala Thr Ile Ser Ser Ser Asp Ser Pro Trp Tyr Gly Glu Pro 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ala Arg Val Asn Ala Lys Asn Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu His Leu Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Gly Ser Val Gln His Met Ala Asn Glu Asn Glu Tyr Val 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Pro Ser 115 120 125 Thr Pro Pro Arg Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Ser Asp Val Gln Leu 130 135 140 Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Asp Ser Leu Ser Leu 145 150 155 160 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Ile Gly Trp 165 170 175 Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Ser 180 185 190 Ser Ser Asp Ser Pro Trp Tyr Gly Glu Pro Ala Lys Gly Arg Phe Thr 195 200 205 Val Ala Arg Val Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu His Leu Asn Arg 210 215 220 Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ser Val 225 230 235 240 Gln His Met Ala Asn Glu Asn Glu Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 245 250 255 Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Arg 260 <210> 11 <211> 267 <212> PRT <213> Lama glama <400> 11 Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ala 1 5 10 15 Gly Asp Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 Gly Tyr Val Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Ala Glu Arg Glu 35 40 45 Phe Val Gly Ala Ile Arg Trp Ser Glu Asp Ser Thr Trp Tyr Gly Asp 50 55 60 Ser Met Lys Gly Arg Ile Leu Ile Ser Arg Asn Asn Ile Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Asn Leu Gln Met Phe Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Val Cys Ala Ala Gly Ala Gly Asp Ile Val Thr Thr Glu Thr Ser Tyr 100 105 110 Asn Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Pro 115 120 125 Ser Thr Pro Pro Arg Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Ser Asp Val Gln 130 135 140 Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ala Gly Asp Ser Leu Thr 145 150 155 160 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Gly Tyr Val Val Gly 165 170 175 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Ala Glu Arg Glu Phe Val Gly Ala Ile 180 185 190 Arg Trp Ser Glu Asp Ser Thr Trp Tyr Gly Asp Ser Met Lys Gly Arg 195 200 205 Ile Leu Ile Ser Arg Asn Asn Ile Lys Asn Thr Val Asn Leu Gln Met 210 215 220 Phe Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys Ala Ala Gly 225 230 235 240 Ala Gly Asp Ile Val Thr Thr Glu Thr Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Arg 245 250 255 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Arg Gly Arg 260 265 <210> 12 <211> 270 <212> PRT <213> Lama glama <400> 12 Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gln Ser Gly Pro Gly Arg Tyr 20 25 30 Gly Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Val Ser Gly Ser Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Arg Arg Thr Tyr Ser Gly Ser Asn Leu Trp His Arg Ser Asp 100 105 110 Glu Tyr Asp Ser Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser 115 120 125 Gly Pro Ser Thr Pro Pro Arg Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser 145 150 155 160 Leu Arg Leu Ser Cys Val Gln Ser Gly Pro Gly Arg Tyr Gly Val Gly 165 170 175 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Val 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Gln Gly Arg 195 200 205 Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 210 215 220 Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Arg 225 230 235 240 Arg Thr Tyr Ser Gly Ser Asn Leu Trp His Arg Ser Asp Glu Tyr Asp 245 250 255 Ser Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Arg 260 265 270 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Gly Pro Ser Thr Pro Pro Arg Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH amplification primer <400> 14 gtcctggctg ctcttctaca agg 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer to amplify VHH <400> 15 ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23 <210> 16 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer to amplify VHH <400> 16 aacatgccat gactcgcggc tcaaccggcc atggctgakg tbcagctgca ggcgtctggr 60 ggagg 65 <210> 17 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer to amplify VHH <400> 17 attattattc agattattag tgcggccgcg tgaggagacg gtgaccwggg tcc 53 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer to incorporate restriction sites <400> 18 ggctgakgtb cagctgcagg cgtctggrgg agg 33 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer to incorporate restriction sites <400> 19 gttattatta ttcagattat tagtgcggcc gctggagagt gaccwgggtc c 51 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer to amplify dimer sequences <400> 20 ctcgcggccc agccggccat ggcggatgtg cagcttcagg cgtctggg 48 <210> 21 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer to amplify dimer sequences <400> 21 gcattggttc tgcagttgca catctgacgg cggggtggac ggagac 46 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gccgcggcgg ggtagacggg cccgatgagg agacggtgac ctg 43 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer to amplify VHH 3B2 protein <400> 23 gcttggatcc tatggctgat gtgcagctgc 30 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer to amplify VHH3B2 protein <400> 24 cgtatctaga gcggccgcgt gaggagacg 29

Claims (34)

  1. SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이합체 또는 단량체 VHH 도메인.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 도메인은 라마(Lama glama), 알파카((Lama pacos), 구아나코 라마(Lama guanicoe) 및 비쿠냐 비쿠냐(Vicugna vicugna)로 이루어진 군에서 선택되는 카멜리드의 항체로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 도메인.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 도메인은 A군의 로타바이러스에 존재하는 VP6 항원의 선형 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 도메인.
  4. 제 1 항에 있어서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4로 이루어진 군에서 선택되는 두 개의 동일 또는 상이한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이합체 도메인.
  5. 제 4 항에 있어서, SEQ ID No. 13의 연결 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 이합체 도메인.
  6. 제 4 항에 있어서, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11 및 SEQ ID No. 12로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 이합체 도메인.
  7. a) 로타바이러스 함유 시료를 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드와 접촉시키고;
    b) 발색시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 로타바이러스 면역검출 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 면역포획 기반 실험인 ELISA, ELISPOT, 경쟁 ELISA, 자성 비드 또는 면역크로마토그래피 분석 기술로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 포유동물에 수동 면역을 부여하기 위해 디자인된 조성물로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 부형제 및 면역조절제로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 단량체 또는 이합체 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pFBMelVHH.
  11. 제 10 항의 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  16. SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 로타바이러스의 면역검출을 위한 키트.
  17. 로타바이러스에 의해 유발되는 감염의 예방 또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것으로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이합체 또는 단량체 VHH 도메인.
  18. 제 12항에 있어서, 상기 벡터는 바큘로바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
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