TW201829772A - 登革熱類病毒顆粒、抗登革熱病毒抗體、及含其之組合物 - Google Patents

登革熱類病毒顆粒、抗登革熱病毒抗體、及含其之組合物 Download PDF

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Abstract

本發明係有關登革熱類病毒顆粒。該登革熱類病毒顆粒呈現幾乎切割的pr-M接位，且具體而言適於製成辨識所有四種登革熱病毒的抗體。本發明亦提供利用該類病毒顆粒所取得的抗體及含其之組合物。

Description

登革熱類病毒顆粒、登革熱病毒抗體、及含其之組合物
本發明係有關登革熱之治療，尤其是針對此目的之抗體與組合物，及其製備方法。
登革熱病毒（DENV），一黃病毒科（Flaviviridae ）家族一員，為蚊子傳播之病原體，其具有四個不同的血清型，包括DENV-1至DENV-4 （1 ）。現今，據估計，DENV每年全球感染約三億九千萬個案例，造成輕度發熱到登革出血熱（DHF）或危及生命之登革熱休克症候群（DSS）等九千六百萬個臨床表現案例（2 ）。儘管黃熱病四價登革熱疫苗（YFTD）近來得到少數國家的批准，但此類疫苗對九歲以上先前受登革熱感染的族群在使用上有侷限且疫苗功效較低，迫切需要開發第二代登革熱疫苗（3 , 4 ）。
本發明目的之一為提供登革熱病毒的類病毒顆粒。該類病毒顆粒係用於生產能中和至少二種登革熱病毒血清型的抗血清或抗體。
本發明之另一目的為提供能中和至少一種、至少二種、至少三或四種登革熱病毒血清型的抗體。
為達成上述目的，本發明提供一表現載體，其編碼具有膜蛋白的類病毒顆粒；其中該膜蛋白在其切割前型態（pre-cleaved form）含有pr-M接位 RUXRKKVVMT；其中該U為K或R，且該X為S或A。
本發明亦提供一類病毒顆粒，其含有膜蛋白；其中該膜蛋白在其切割前型態含有pr-M接位RUXRKKVVMT；其中該U為賴胺酸（K）或精胺酸（R），且該X為絲胺酸（S）或丙胺酸（A）。
本發明更提供一組合物，其含有前述之類病毒顆粒及醫藥上可接受載體或醫藥上可接受佐劑。
本發明進一步提供一分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，其包含：至少一含有GYTFTEYT （SEQ ID NO: 19）之重鏈互補決定區1 （H-CDR1）、至少一含有INPNNGGTT （SEQ ID NO: 20）之重鏈互補決定區2 （H-CDR2）、至少一含有VRYGGYYVFDY （SEQ ID NO: 21）之重鏈互補決定區3 （H-CDR3）、至少一含有KSVSTSGYSY （SEQ ID NO: 22）之輕鏈互補決定區1 （L-CDR1）、至少一含有LVS （SEQ ID NO: 23）之輕鏈互補決定區2 （L-CDR2）、及至少一含有QHIRELTRR （SEQ ID NO: 24）之輕鏈互補決定區3 （L-CDR3）。
本發明進一步提供一分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，其包含：至少一含有GYSITSDY （SEQ ID NO: 27）之重鏈互補決定區1 （H-CDR1）、至少一含有ISYSGST （SEQ ID NO: 28）之重鏈互補決定區2 （H-CDR2）、至少一含有ARSLLPNWYFD （SEQ ID NO: 29）之重鏈互補決定區3 （H-CDR3）、至少一含有KSVSTSGYSY （SEQ ID NO: 30）之輕鏈互補決定區1 （L-CDR1）、至少一含有LVS （SEQ ID NO: 31）之輕鏈互補決定區2 （L-CDR2）、及至少一含有QHIRELTRS （SEQ ID NO: 32）之輕鏈互補決定區3 （L-CDR3）。
本發明亦提供一組合物，其包含前述分離的抗登革熱病毒 抗體或其抗原結合部分及醫藥上可接受載體。
本發明更提供一用於生產抗血清之方法，其包含：施予一動物前述之類病毒顆粒及收集該動物之血清。
本發明接著提供一抗血清，其係利用前述之方法生產；其中該抗血清能以稀釋比例1:60中和至少二種50% FRμNT效價之登革熱病毒血清型；其中該二者以上之血清型係選自於登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型、及登革熱病毒第4型。
本發明更提供一用於生產抗體之方法，其包含：施予一動物前述之類病毒顆粒；以及自該動物分離一抗體。
本發明接著提供一抗體，其係利用如申請專利範圍第31項之方法生產；其中該抗體能以0.24至0.58 μg/mL中和50% FRμNT效價之登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型、及登革熱病毒第4型。
暴露於感染性成熟病毒顆粒表面的套膜（E）蛋白為中和抗體的唯一靶標。在病毒複製期間，新合成的未成熟DENV在中性pH下，於內質網中組裝，且作為機械性屏障之前驅膜（prM）蛋白的pr部分（請見第一（A）圖）會定位以覆蓋胜肽之融合環（FL），其位於早期融合的三聚體每個E蛋白遠端（5，6）。為了完全具有感染性，在釋出過程（egress process）中必須以細胞蛋白酶的弗林蛋白酶（furin）將pr部分除去（即切割）。然而，DENV的成熟過程被認為是低效率的，且DENV顆粒作為異源性群體自感染的細胞中釋放出，取決於膜（M）蛋白由prM切割為M蛋白的切割程度：未成熟 的顆粒僅由未切割prM蛋白所組成，部分未成熟 的顆粒包含prM與M蛋白二者，而完全成熟顆粒僅包含M蛋白（7, 8）。功能分析顯示，完全未成熟的黃病毒缺乏感染細胞的能力，除非在抗prM抗體存在下，通過抗體依賴性增強感染（ADE）機制（9,10）。ADE在登革熱發病機制中扮演重要角色，受到抗體濃度與病毒顆粒成熟狀態的調控，如西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）所示（11 ）。
黃病毒屬類病毒顆粒（VLP）已被證明是潛在的候選疫苗，因為其有序結構與病毒顆粒套膜中者類似，且亦經歷低pH-誘導的重組與膜融合作為病毒顆粒（12-14 ）。因此，發明人推測VLP成熟的過程可能類似於DENV病毒體顆粒的過程，從而VLP可能取決於prM的切割程度而類似地以異源性群體分泌。為此，發明人構建了具有prM胺基酸序列的登革熱VLP，其最易於被切割或最抵抗被切割，且發明人使用抗原性與結構來鑑定此二種顆粒。由於胺基酸序列除了弗林蛋白酶切割位點上的突變之外完全相同，發明人假設抗體結合或中和活性之差異為高度結構依賴性的。在本報告中，發明人提供了VLP分類為融合前病毒顆粒結構，且具有誘發交叉反應中和抗體之能力的證據。
以下所述術語「E蛋白」是指病毒或其類病毒顆粒的套膜蛋白。在某些特定段落中，所述「E蛋白」是指登革熱病毒或其類病毒顆粒的套膜蛋白。
以下所述術語「M蛋白」是指病毒或其類病毒顆粒的膜蛋白。在某些特定段落中，所述「M蛋白」是指登革熱病毒或其類病毒顆粒的膜蛋白。
以下所述術語「prM蛋白」或「pr-M蛋白」是指病毒或其類病毒顆粒的前膜蛋白。換言之，prM蛋白指稱M蛋白之切割前型態。在某些特定段落中，所述「prM蛋白」或「pr-M蛋白」是指登革熱病毒或其類病毒顆粒的前膜蛋白。
術語「切割前型態」是指描述上述M蛋白質的pr部分未被切割，而pr部分保留的的狀態。具體地說，例如，如上所述，pr部分在釋出過程中被切割。因此，pr部分在釋出過程中被切割之前，M蛋白處於其切割前型態。
以下所述術語「pr-M接位」或「prM接位」是指prM蛋白之一區域或胜肽，其為細胞蛋白酶所辨識並切割以除去prM蛋白的pr部分，並使其成為成熟的M蛋白。術語「pr部分」為在釋出過程期間被移除、切下或切割的prM蛋白質之多胜肽片段。具體而言，「pr-M接位」參照第一（A）圖所示的P1至P10。
以下所述術語「prM/E比率」是指所討論的類病毒顆粒群的prM蛋白量與E蛋白量的比率。較佳地，所述prM/E比率可以本說明書中揭示的方法，經由ELISA或西方墨點法測定。
以下所述術語「M/E比率」是指所討論的類病毒顆粒群的M蛋白量與E蛋白量的比率。較佳地，所述M/E比率可以本說明書中揭示的方法，經由ELISA或西方墨點法測定。或者，所述M/E比率可由所討論的相同類病毒顆粒群所測定的prM/E比率計算，例如通過下式計算：1-（prM / E比率）。
「50% FRμNT效價」是指當進行焦點-減少微中和測試（即FRμNT）時，本領域中眾所周知的含義。敘述「可於稀釋比率1:60中和……」 或類似敘述，是指去描述可於稀釋比率1:60或其更低稀釋比率如1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:5或1:1時達到中和。類似地，「可於稀釋比率1:100中和……」 或類似敘述，是指去描述可於稀釋比率1:100或其更低稀釋比率如1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:5或1:1時達到中和；「可於稀釋比率1:70中和……」 或類似敘述，是指去描述可於稀釋比率1:70或其更低稀釋比率如1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:5或1:1時達到中和。描述「可於0.24至0.58 μg/mL中和……」 或類似描述，是指去描述在FRμNT試驗中，可於指定濃度下達到中和。
本發明之一態樣為提供一種類病毒顆粒、編碼其之表現載體與包含其之組合物。所述類病毒顆粒包含具有切割前型態之RUXRKKVVMT的pr-M接位之膜蛋白；其中該U為K或R，且所述X為S或A。在一個較佳具體實施例中，所述pr-M接位包含SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：09或SEQ ID NO：13。在另一較佳具體實施例中，所述表現載體包含SEQ ID NO：16。
通常一類病毒顆粒含有多於一個的膜蛋白，且多於一個以其切割前型態存在的pr部分。在一個較佳具體實施例中，本發明的類病毒顆粒可進行其大部分pr部分之切割。在另一個具體實施例中，所述大部分切割是指至少70%的切割效率。在較佳具體實施例中，pr部分的切割效率為至少70%、80%或90%。在更佳具體實施例中，pr部分的切割效率為100%。
在另一具體實施例中，包含本發明類病毒顆粒的所述組合物可進一步包含醫藥上可接受之載體或醫藥上可接受之佐劑。所述組合物可用於製備抗血清或抗體，其能中和受試者的登革熱病毒。在一較佳具體實施例中，所述組合物可用於誘導受試者中的交叉反應中和抗體。在一較佳具體實施例中，所述組合物可用於預防登革熱。
如本文所用，術語「醫藥上可接受載體」旨在包括與醫藥施予相容的任一與所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑與抗真菌劑、等滲劑與吸收延遲劑等。例如，所述醫藥上可接受載體可包括但不侷限於水、甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂，或其組合。
如本文所用，術語「醫藥上可接受佐劑」旨在包括任一與所有能夠增強由活性成分（例如，本發明的類病毒顆粒）所誘發的免疫反應之試劑。例如，所述醫藥上可接受之佐劑可包括但不限於含有角鯊烯的鋁佐劑或水包油型懸浮佐劑（AS03、MF59或類似物）、類鐸受體（Toll-like receptor）的配體如CpG與3-O-脫乙醯基-4'-單磷醯基脂質A （MPL）、皂苷類佐劑、聚合物系佐劑如聚-γ-穀胺酸，以及多醣如幾丁質與菊糖。
本發明之另一態樣係有關一種製造抗血清或抗體之方法、由該方法製造之抗血清或抗體，以及包含其之組合物。
製造抗血清的方法包含施予動物本發明之該類病毒顆粒； 並收集所述動物的血清。在另一具體實施例中，所述施予可通過肌內注射來完成。在一較佳具體實施例中，所述類病毒顆粒在使用前配製成組合物。在一更佳具體實施例中，所述類病毒顆粒配製為具有醫藥上可接受載體或醫藥上可接受佐劑之所述本發明組合物。在另一具體實施例中，所述收集可藉由本領域習知且已常用的任何手段來完成。
在另一具體實施例中，所述抗血清係以酶聯免疫吸附試驗（ELSIA）或FRμNT進行評估。在一較佳具體實施例中，所述抗血清能以1:60的稀釋比率，中和至少兩種50% FRμNT效價的登革熱病毒血清型；其中所述多於兩種的血清型係選自於登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型與登革熱病毒第4型。
在另一較佳具體實施例中，所述抗血清能以1:100的稀釋比率，中和至少兩種50% FRμNT效價的登革熱病毒血清型；其中所述多於兩種的血清型係選自於登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型與登革熱病毒第4型。在另一較佳具體實施例中，所述抗血清可以1:70的稀釋比率，中和50% FRμNT效價的登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型與登革熱病毒第4型。在一更佳具體實施例中，所述抗血清可以1:60的稀釋比率，中和50% FRμNT效價的登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型與登革熱病毒第4型。
製造抗體的方法包含施予動物本發明之類病毒顆粒；並自所述動物分離抗體。在另一具體實施例中，所述抗體從所述動物的血液或脾臟中分離出。在另一具體實施例中，收取所述動物的脾細胞並與骨髓瘤細胞融合。在一較佳具體實施例中，所述抗體於0.24至0.58 μg/mL能中和50% FRμNT效價之登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型與登革熱病毒第4型。
在另一具體實施例中，所述施予可經由肌內注射來完成。在一較佳具體實施例中，所述類病毒顆粒在使用前配製成組合物。在一更佳具體實施例中，所述類病毒顆粒配製為具有醫藥上可接受載體或醫藥上可接受佐劑之所述本發明組合物。在另一具體實施例中，所述分離可藉由本領域眾所周知且已常用的任何手段來完成。
在一較佳具體實施例中，本發明提供一種經分離之抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，其包含：至少一含有GYTFTEYT （SEQ ID NO: 19）之重鏈互補決定區1 （H-CDR1）、至少一含有INPNNGGTT （SEQ ID NO: 20）之重鏈互補決定區2 （H-CDR2）、至少一含有VRYGGYYVFDY （SEQ ID NO: 21）之重鏈互補決定區3 （H-CDR3）、至少一含有KSVSTSGYSY （SEQ ID NO: 22）之輕鏈互補決定區1 （L-CDR1）、至少一含有LVS （SEQ ID NO: 23）之輕鏈互補決定區2 （L-CDR2），以及至少一含有QHIRELTRR （SEQ ID NO: 24）之輕鏈互補決定區3 （L-CDR3）。在一較佳具體實施例中，所述經分離之抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，包含至少一含有SEQ ID NO: 17之重鏈，以及至少一含有SEQ ID NO: 18之輕鏈。在另一較佳具體實施例中，所述抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分可結合至登革熱病毒之E蛋白結構域2。在另一較佳具體實施例中，所述抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分可結合至所述結構域2之W101。術語「W101」係指所述結構域2之第101個胺基酸的色胺酸。
在一較佳具體實施例中，本發明提供一種分離之抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，其包含：至少一含有GYSITSDY （SEQ ID NO: 27）之重鏈互補決定區1 （H-CDR1）、至少一含有ISYSGST （SEQ ID NO: 28）之重鏈互補決定區2 （H-CDR2）、至少一含有ARSLLPNWYFD （SEQ ID NO: 29）之重鏈互補決定區3 （H-CDR3）、至少一含有KSVSTSGYSY （SEQ ID NO: 30）之輕鏈互補決定區1 （L-CDR1）、至少一含有LVS （SEQ ID NO: 31）之輕鏈互補決定區2 （L-CDR2），以及至少一含有QHIRELTRS （SEQ ID NO: 32）之輕鏈互補決定區3 （L-CDR3）。在一較佳具體實施例中，所述分離之抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，其包含至少一包含SEQ ID NO: 25之重鏈，以及至少一包含SEQ ID NO: 26之輕鏈。在另一較佳具體實施例中，所述抗登革熱病毒抗體與其抗原結合部分可結合至登革熱病毒之E蛋白結構域3。在另一較佳具體實施例中，所述抗-登革熱病毒抗體或其抗原結合部分可結合至所述結構域3之E311。術語「E311」指稱所述結構域3之第311個胺基酸的穀胺酸。
本發明亦提供包含有效量的上述抗體或抗血清的組合物。組合物可進一步包含醫藥上可接受載體。所述醫藥上可接受載體的定義如前文所述。所述「有效量」是在施予條件下，足以中和登革熱病毒的量。
下面實施例敘述本發明的試驗和實驗，以進一步解釋本發明的特徵和優點。應當指出的是，以下實施例為示範性，且不應被用於限制本發明的申請專利範圍。實驗 1 ：利用 ELISA 與西方墨點法進行切割預測及決定 prM/E 比率
prM蛋白C端主幹區含有α-螺旋結構域（MH），隨後為二個跨膜結構域（MT1與MT2）。請見第一A圖，向下箭頭代表prM切割位點。數字代表聚蛋白中胺基酸位置，始於prM的第一個胺基酸，其係依據DENV-2 （GenBank登錄號：NP_056776；RKERRHEGMTTCTG；SEQ ID NO 01）。
欲決定DENV-2類病毒顆粒（VLP）的prM蛋白切割功效，構築13個具有不同pr-M接位的VLPs，其係依據DENV-2 pr-M接位（GenBank登錄號：NP_056776；RKERRHEGMTTCTG；SEQ ID NO 01）。進行ELISA試驗，以決定具有前述pr-M接位之VLPs的prM/E比率。prM/E比率愈低，則切割功效愈高。
以ELISA測定的prM/E比率結果標記在第一（B）圖。依據結果，CFAVp18-E3S、CFAVp18-E3A、及CFAVp18-SR為VLPs中三個切割功效最高者。
欲進一步確認prM的切割，從轉染的組織培養液中收取DENV-2 VLP，並進一步純化以用於西方墨點法。其結果與ELISA的一致（第一B圖），即prM幾乎切割之VLP （pacD2VLP ；以CFAVp18-E3S標示於第一B圖）在顆粒表面上僅保留約10%的pr胜肽，相較於prM未切割之VLP （pucD2VLP 具有pr-M接位（P1-P10） TSERRHEGMT；SEQ ID NO 15），其prM假設為100%未切割（第二A圖及表1）。
利用MAb 3H5 （具有DENV-2結構域III特異性）與155-49 （具有DENV prM特異性）進行進一步ELISA，以顯示pacD2VLP與pucD2VLP的E與prM蛋白相對量。結果證實，相較於pucD2VLP，pacD2VLP有極高的切割功效。
鑑於前述，選擇表現本發明四種VLP樣本的四個質體（請見SEQ ID NO：16，其為pacD2VLP質體的全部序列）用於後續實驗。本發明四種樣本質體的pr-M接位胺基酸序列顯示於下表2。 表2 實驗 2 ：本發明 VLPs 之免疫原性
欲確認prM切割程度對D2VLP免疫原性的影響，發明人於第0與4週以每隻小鼠4 μg VLP免疫接種4週大BALB/c小鼠組。本實驗中使用的D2VLPs （樣本1與樣本4）係濃縮與純化自提純的上清液。
在第二次免疫接種後4與8週，收集血液樣本，並利用ELISA 分析個別血清的抗體反應。首先以Bradford試驗測定純化之pucD2VLP與pacD2VLP的總蛋白濃度，接著在2倍系列稀釋後進行抗原捕捉ELISA。所有免疫接種pucD2VLP （樣本4）與pacD2VLP （樣本1）的小鼠對於同源性抗原明顯誘發高的抗DENV-2特異性抗體而無統計性差異（第三A圖）。欲精準量化登革熱特異性抗體的量，以個別製備之純VLPs作為抗原捕捉ELISA的標準品（第三B圖）。以pacD2VLP疫苗接種的小鼠，在疫苗接種8週後血清的IgG反應顯示，對於同源性pacD2VLP抗原的效價（1:15346），明顯比異源性pucD2VLP抗原的更大（1:6381） （第三C圖，中間圖與右圖）。
欲嚴格分析prM切割程度對D2VLP免疫原性的影響，使用個別的小鼠血清進行針對DENV之四種血清型的FRmNT。接受pacD2VLP免疫接種的小鼠血清對於所有DENV血清型（針對DENV-1的50% FRmNT: 331，DENV-2: 597及DENV-4: 141），可誘發比pucD2VLP疫苗接種組（針對DENV-1的50% FRmNT: 100，DENV-2: 207及DENV-4: 76）更高的中和效價，除了DENV-3以外，其針對pucD2VLP與pacD2VLP疫苗接種組的50% FRmNT效價分別為1:70與1: 64 （第三D圖）。
未受限於理論或任何存在的假設，發明人認為由pacD2VLP 所誘發的較高中和活性，部分係因抗prM抗體的減少。欲比較不同免疫接種組間之疫苗接種小鼠血清的抗prM抗體比率，發明人首先使用表位阻斷ELISA，並比較接受pucD2VLP或pacD2VLP之疫苗接種小鼠血清的抗prM單株抗體（MAb 2H2）阻斷抗prM抗體的百分比。結果顯示，相較於pucD2VLP疫苗接種組的35.26%，pacD2VLP免疫接種小鼠血清中僅有7.59%的類155-49抗體（第三E圖）。
此外，欲避免Mab結合時的空間位阻，發明人利用突變三個胺基酸（K26P+K21D+F1A），進一步生產突變體pucD2VLP （第三F圖）。接著，測試免疫接種小鼠血清結合至野生型與突變體pucD2VLP的能力。結果亦顯示，相較於pucD2VLP疫苗接種組的52.12%，pacD2VLP免疫接種小鼠誘發明顯較低比例的類2H2抗體（35.68%）（第三G圖與第三H圖）。實驗 3 ：本發明 pacD2VLP 所生產抗體的純化
發明人進行融合並由pacD2VLP疫苗接種小鼠之脾細胞生產融合瘤（hybridoma）。在所有篩選的72個融合瘤中，定序二個被選出的MAbs，並分別命名為DM25-3與DM8-6。依據定序結果，DM25-3之重鏈為： GEPGTSLKISCKTSGYTFTEYTMYWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGGTTYNQKFKGKATLTVNKSSSIAYMEVRNLTSEDSAVYYCVRYGGYYVFDYWGQGTTLTVSS （SEQ ID NO: 17），且其互補決定區為GYTFTEYT （SEQ ID NO: 19）、INPNNGGTT （SEQ ID NO: 20）、及VRYGGYYVFDY （SEQ ID NO: 21）；以及 輕鏈為： TLWKTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRRRGPSSR （SEQ ID NO: 18），且其互補決定區為KSVSTSGYSY （SEQ ID NO: 22）、LVS （SEQ ID NO: 23）、及QHIRELTRR （SEQ ID NO: 24）。 依據定序結果，DM8-6之重鏈為： VPELVSFISLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSLLPNWYFDVWGAGTTVTVSS （SEQ ID NO: 25），且其互補決定區為GYSITSDY （SEQ ID NO: 27）、ISYSGST （SEQ ID NO: 28）、及ARSLLPNWYFD （SEQ ID NO: 29）；以及 輕鏈為： DIVMTQSPASLA VSLGQRATISYR ASKSVSTSGYSY MHWNQQKPGQP PRLLIYLVSNLES GVPARFSGSGSG TDFTLNIHPVEE EDAATYYCQH IRELTRSEGGPSWK （SEQ ID NO: 26），且其互補決定區為KSVSTSGYSY （SEQ ID NO: 30）、LVS （SEQ ID NO: 31）、及QHIRELTRS （SEQ ID NO: 32）。
利用ELISA結合試驗評估二個選出之MAbs對所有四種DENV血清型的反應性如第四A圖所示。結果顯示，DM8-6為血清型特異性MAb，反之DM25-3辨識所有四種DENV血清型。接著，發明人測試該等二個MAbs對所有四種DENV血清型的中和活性。DM8-6於50% FRmNT之濃度0.037 mg/mL對DENV-2顯示有良好中和活性，但中和其他血清型的能力較差。與ELISA結合試驗結果一致的是，DM25-3分別於濃度0.32、0.38、0.24、0.58 mg/mL針對DENV-1至DENV-4中和所有四種血清型（第四B圖）。有趣的是，DM25-3可良好辨識pacD2VLP，但pucD2VLP的辨識較差（第四C圖）。比較pacD2VLP與pucD2VLP免疫接種後小鼠血清結合活性，觀察到pacD2VLP免疫接種小鼠的結合曲線明顯不同，其轉換為48.5%的類DM25-3抗體（第四D圖）。然而，分別觀察到pacD2VLP與pucD2VLP的抗原結合曲線差異不大，其在pucD2VLP免疫接種小鼠可轉換為16%的類DM25-3抗體。實驗 4 ：鑑定 DM25-3 與 DM8-6 之表位
欲鑑定DM25-3之表位，進行位點導向式突變反應。發明人不進行槍式隨機突變（shot-gun random mutagenesis），而是聚焦在結構域II上的融合環胜肽與結構域III上的A股，其被視為是交叉反應性基團/複合體中和抗體的重要結合區。針對此目的，個別的突變體質體，包括取代基K310E、E311R、Q316P、H317E、F392A、及W101G，可分泌到細胞外，可進一步利用結合ELISA生產表位指紋圖（epitope mapping）。結果顯示，DM25-3可辨識結構域II融合環胜肽上的殘基101 （圖5，圖4E）。相反地，結構域III上的突變會影響DM8-6結合作用，具體而言為AB環上的殘基311。
突變體VLPs的完整性，包括W101G、K310E、及E311R，係進一步以一組DENV-2 MAbs確認，包括基團交叉--反應性抗體（4G2、4A1B-9、6B3B-3、6B6C-1、DM25-3、T5-1、DM8-6），其辨識所有四種主要病源性黃病毒血清型複合物（flavivirus serocomplexes）；複合體交叉反應性抗體（T5-1）辨識所有四種DENV複合體病毒，類型特異性抗體（DM8-6）僅辨識DENV-2。MAbs相對結合能力的決定，係以突變體D2VLPs的OD450除以原始pacD2VLP （表3）。 表3
欲進一步確認全病毒顆粒之DM25-3四元結構依賴性表位，生產一重組DENV-2，其係以一致結構域III （PL046cEDIII）替代結構域III，並比較親代DENV-2病毒株PL046與PL046cEDIII的ELISA結合試驗結果。與表位指紋圖結果一致的是，當移除結構域III時，觀察到DM8-6明顯喪失結合DENV-2的能力。令人驚訝的是，亦發現到DM25-3喪失結合PL046cEDIII的能力（第六A圖），表示融合環辨識型DM25-3為一E結構域間二聚體抗體。進一步比較PL046與PL046cEDIII的免疫接種後小鼠血清50%FRmNT，觀察到pacD2VLP免疫接種小鼠血清有89.1%的結構域間抗體，對比pucD2VLP小鼠的51.1%具有統計顯著性（第六B圖）。
欲更好地理解免疫接種pacD2VLP與pucD2VLP後的B細胞庫（repertoires）情況，將取自pacD2VLP或pucD2VLP疫苗接種小鼠脾臟且能結合至DENV-2病毒的脾B細胞分選至十盤96孔培養盤，且每孔僅放入單一個細胞（圖7）。藉由分析來自二組別的Ig重鏈（IgH）與Ig輕鏈（IgL）基因可變區RT-PCR產物胺基酸序列，源自pacD2VLP免疫接種組的B細胞反應比源自pucD2VLP組的更複雜，特別是IgH的基因座（第四F圖）。亦分析源自DM25-3的IgH與IgL基因，發現其含有IgHV1-22*01與IgKV3-12*01，將其選殖擴大，如第四F圖所示。實驗 5 ：本發明 VLP 之結構分析
DENV VLPs （pacD2VLP）的Cryo-EM分析證實，VLPs具有各種尺寸分佈（圖8與表4）。以免疫金標記（immunogold labeling）檢測VLPs，其顆粒直徑為~31nm （圖9），其亦為族群的主波峰。 表4
Cryo-EM與3D重建方法顯示，VLPs在23Å時具有中空結構與平滑表面（圖10與圖11）。以原子可溶性E蛋白擬合至cryoEM密度圖顯示，VLPs依循T=1的二十面體對稱性，且表面具有30個E二聚體次單元（第十B圖），亦可在TBEV VLPs發現類似的排列（14 ）。VLPs結構相較於原生顆粒（6 , 25 ），其明顯特徵在於，3對稱軸處的E蛋白組織模擬病毒顆粒準備融合的融合原狀態（fusogenic state）（26 ）。相較於病毒顆粒的177個胺基酸（44.7%），VLP的融合原狀態模擬顯露出更加可接觸表位（48.2%；191個胺基酸，其中396個完整E蛋白具有30%溶劑可接觸性），具體而言位於結構域III的融合環區與AB環（圖12）。與本研究結果一致的是，DM25-3能中和DENV的所有四種血清型，並可辨識融合環殘基101，其位於E二聚體5對稱軸附近孔洞周圍的突起邊緣，其僅可在當病毒顆粒於低pH環境下發生構形改變時顯露（第十C圖）。
近來研究指出，可從登革熱病患誘發具有登革熱血清複合體廣泛反應性的有效中和人類單株抗體，特別是在續發性感染之後（22 , 23 , 27 ）。發明人的發現於此表明，pacD2VLP在結構上模擬其病毒融合原對應體，能誘發具有廣泛中和活性的交叉反應性抗體，其在小鼠疫苗接種血清中主要佔48%。與病毒顆粒不同的是，VLP的E二聚體堆積可提供一獨特開放空間結構，其特徵為增加表位可接觸性，這先前在28o C與中性pH環境下的成熟病毒顆粒中被認為是隱蔽的。藉由將彼等E二聚體依賴性四元表位疊加至VLP （23 , 28 , 29 ），彼等抗體的結合足跡係高度重疊，且在VLPs上形成「中和作用感應位點」 （第十D圖、圖13）。pacD2VLP在誘發更高與更廣泛免疫反應的機制上係至少通過：（1）表位可接觸性控制中和抗體的誘發；（2）移除位於含prM結構上的誘騙表位（decoy epitope）如pucD2VLP，其易誘發辨識prM的抗體。總結，作為疫苗候選的另一選擇，VLP疫苗的優勢在於高度免疫原性、非感染性、及易於品質控制與大量生產。pacD2VLP的獨特性質使其成為探索通用型登革熱旅遊疫苗及第二代登革熱疫苗之可能的極佳模式系統。材料及方法 病毒、細胞與抗體
本文所使用的DENV血清型1-4分別包括Hawaii、16681、H87與H241。COS-1 （ATCC CRL 1650；ATCC）與C6/36細胞係培養於Dulbecco改良的Eagle培養基（DMEM, Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY），其補充10%熱失活胎牛血清蛋白（FBS，Hyclone, ThermoFisher, MA）、0.1mM非必需胺基酸（Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY）、7.5% NaHCO3 、100U/ml青黴素與100ug/ml鏈黴素。5% FBS係用於vero細胞。除了C6/36細胞是維持在無CO2 的28℃以外，其他細胞維持在5% CO2 的37o C。由感染性殖株生產的親代DENV-2病毒株PL046，與結構域III交換的PL046，其中DENV-2的結構域III經前述之共有序列替代（H.Chen等人，ArchVirol158 ,1523 （2013）），係由台灣中央研究院的YL Lin博士提供。
可辨識DENV-2 prM之鼠類單株抗體（Mab） 2H2、僅辨識DENV-2之血清型特異性單株抗體3H5-1抗體、DENV-1至4之兔血清與小鼠高度免疫腹水（MHIAF），係由其中一位作者GJ Chang提供（DVBD, CDC, Fort Collins, CO）。一組DENV-2鼠類單株抗體，包括辨識所有四種主要致病性黃病毒血清型複合體的基團-交叉-反應抗體（4G2、4A1B-9、6B3B-3、6B6C-1、DM25-3、T5-1、DM8-6）；辨識所有四種DENV複合病毒的複雜交叉反應抗體（T5-1），以及如前述之僅辨識DENV-2的類型特異性抗體（DM8-6）（參考文獻#20），係亦由其中一位作者GJ Chang提供。辨識DENV-2 prM之MAb 155-49取自HY Lei （台灣國立成功大學）。依據製造商的說明，利用EZ-Link™ Sulfo-NHS-Biotin套組（Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL），亦將MAbs 155-49標記生物素。為了增加對M蛋白的辨識，抗M抗體的生產係如分子選殖手冊所述，藉由將完整M蛋白序列選殖至pET21a（Novagen, Germany）上，並在變性條件下進行純化。具有完全弗氏佐劑（complete Freud’s adjuvant）之10 μg經純化M蛋白，係用於以腹腔注射途徑於2週間隔進行五次免疫接種小鼠，並收集最終的血清。抗B220抗體與IgG係購自AbCam。
先前構築與鑑定之表現DENV-2亞洲1基因型16681病毒株的prM與80%套膜蛋白之重組質體pVD2i （H. Hughes et al.,Virol J 9 , 115 （2012）），係使用於本試驗中，並稱作pVD2。依據製造商流程藉由使用定點突變技術將prM之菊糖切割位點於pVD2上進行突變，以生產未切割之prM質體，如前述或圖1所示（Stratagene, La Jolla, CA）。表5提供用於選殖與定點突變的引子。所有質體皆經定序完整轉錄子，以確認不含指定之外的其他突變。 表5 黃病毒 pr/M 位點之序列分析
黃病毒prM蛋白序列比對係以ClustalX 2.1軟體進行，其具下列序列：登革熱病毒血清型2 （NP_056776）、登革熱病毒血清型1 （AIU47321）、登革熱病毒血清型3 （YP_001621843）、登革熱病毒血清型4 （NP_073286）、日本腦炎病毒（NP_775664）、聖路易斯腦炎病毒（AIW82235）、西尼羅病毒（AIO10814）、蜱傳腦炎病毒（NP_775501）、黃熱病毒（NP_041726）、細胞融合劑病毒（NP_041725）、茲卡病毒（BAP47441.1）。以PiTou 2.0軟體組（2）針對pr/M連接區的序列進行評分，預測其可被弗林蛋白酶（furin）切割的程度（www.nuolan.net/reference.html）。負分表示預測不被弗林蛋白酶切割的序列，而正分表示弗林蛋白酶可切割性的預測。抗原製造與 VLP 純化
欲製造VLP抗原，密度1.5 × 107 個細胞/mL的COS-1細胞係以30 μg之各pVD2質體進行電穿孔，其係依據先前描述流程進行（G. Chang et al.,J Virol 74 , 4244 （2000））。在電穿孔後，將細胞接種到含有15mL生長培養基的75-cm2 培養瓶（Corning Inc., Corning, NY, USA）中，並使其在37°C下恢復隔夜。生長培養基於隔日置換，使用含有補充NEAA、GlutaMAX、丙酮酸鈉與膽固醇（Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY）的無血清培養基（SFM4MegaVirTM, SH30587.01, Hyclone, ThermoFisher），細胞於28°C的5% CO2 下持續培養，以分泌VLP。轉染後3天收取組織培養基，並在具有AF-5004CA轉子的Kubota 3740離心機（Kubota，Tokyo，Japan）中，於8,000´g 、4°C下離心30分鐘使其澄清。所得之培養基首先以100K Amicon超離心過濾器（Merck Millpore，CA）濃縮20倍，之後於20%蔗糖中緩衝，在Beckman SW28轉子中，以4℃、28,000 rpm超高速離心16小時，之後將每1公升收取的培養基於4℃下重新懸浮於250ml TNE緩衝液（50mM Tris-HCl、100mM NaCl、0.1mM EDTA，以及pH7.4）中隔夜。藉由在4℃之5至25%蔗糖梯度中，以25,000rpm進行速率區帶離心3小時，進一步純化VLPs。所有梯度均使用TNE緩衝液製備，並於Beckman SW41轉子中進行離心。經由向上置換收集0.5ml分液，並進行抗原捕獲ELISA試驗。對於需要高度純化材料的實驗而言，在抗原捕獲ELISA試驗中具有最高OD前6名的VLPs，在Beckman SW41轉子中，於4℃以40,000rpm的轉速沉澱4小時，並重新懸浮於總共250ml的TNE緩衝液中。蛋白質濃度藉由Bradford測定法（BioRad, Hercules, CA）測量，其係依據市售流程，以牛血清白蛋白（BSA，New England Biolabs, MA）作為標準品測量。按照製造商流程，經純化的VLPs亦以螢光標記，用於進行抗原特異性B細胞分選（S. Zhang et al.,J Virol Methods 167 , 172 （2010））。ELISA
prM相對於E蛋白的比例係經由將VLP捕獲至塗佈DENV-2免疫兔血清的培養盤上來測量，且DENV-2E蛋白以MAb3H5 （具有DENV-2結構域III特異性），以及prM蛋白以mAb 155-49 （具有DENV prM特異性），通過ELISA測量。該比例以prM吸光值/E蛋白吸光值計算。prM未切割的VLP （pucD2VLP），其包含在P1與P2位點處有胺基酸突變，分別為胺基酸殘基R/K突變為T/S（L. Li et al.,Science 319 , 1830 （2008）），係使用作為計算prM切割百分比的標準。之後參考pucD2VLP計算prM的切割百分比，如前述假定pucD2VLP為100%未切割（W. Dejnirattisaiet al., Nat Immunol 16 , 170 （2015））。
進行抗原捕獲ELISA以定量不同VLP抗原的量。簡言之，將平底96孔MaxiSorp™ NUNC-免疫培養盤（NUNC™ , Roskilde, Denmark）塗佈50 μL兔抗DENV-2VLP血清，其以1:500之比率溶於碳酸鹽緩衝液（0.015 M Na2 CO3 ，0.035 NaHCO3 ，pH 9.6）中，在4℃培養隔夜，且各孔在37℃下以200 μL之溶於PBS的1% BSA溶液（1% PBSB）阻斷1小時。收取的澄清抗原在PBSB中滴定2倍量，並以50 μL兩次添加至各孔中，在37℃培養2小時，並使用200 μL含有0.1% Tween-20的PBS溶液（0.1% PBST）清洗五次。使用正常的COS-1組織培養液與細胞沉澱物作為對照組抗原。捕獲的抗原藉由加入以1：2,000之比率溶於阻斷緩衝溶液中的50 μL抗DENV-2 MHIAF、在37°C培養1小時，並洗滌5次以偵測。將以1:5,000溶於阻斷緩衝溶液的50 μL HRP-共軛山羊抗小鼠IgG （Jackson ImmunoResearch, Westgrove, PA, USA）加入各孔中，並在37℃下培養1小時，以偵測MHIAF。隨後，將培養盤洗滌10次。結合之共軛物以3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺受質（Enhanced K-Blue® TMB, NEOGEN® Corp., Lexington, KY, USA），在室溫下培養10分鐘，並以2N H2 SO4 終止反應而偵測。反應於A 450 ，使用Sunrise™ TECAN微盤讀取儀（Tecan, Grödig, Austria）測量。偵測pucD2VLP或pacD2VLP之捕捉抗原能力ELISA試驗，係針對經純化之D2VLP滴定，且在已知各製備物之總蛋白濃度條件下進行。
使用總IgG ELISA，採用與上述相同的抗原捕獲ELISA流程並進行些許修改，以測定接種後小鼠血清中抗原特異性總IgG之存在。以等量的抗原，配合純抗原的標準曲線進行測定，並採用S形劑量-反應方程式，所使用的軟體為GraphPad Prism version 6.0 （GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA）。將來自具有相同免疫接種排程，初始稀釋比率為1：1,000的小鼠匯集血清滴定2倍，並二重複加入各孔中，並在37℃下培養1小時。涵蓋預接種小鼠血清以作為陰性對照組。共軛物與受質之培養依據上述標準Ag-捕獲ELISA進行。OD450 值以log 10血清稀釋度的非線性函數模擬，使用來自兩個獨立實驗的S形劑量-反應（可變斜率）方程式與終點抗體效價，以其OD值為陰性對照組平均OD值的兩倍時進行測定。
進行表位-阻斷ELISA，以測定疫苗接種小鼠對prM蛋白的反應。此設定類似於總IgG ELISA，其中將盤以兔抗DENV-2 VLP血清塗覆，並以含1%BSA之PBS進行阻斷。洗滌後，將匯集的血清以1:40之比率稀釋於阻斷緩衝液中，並與pucD2VLP抗原（預先滴定至OD 1.0），於37℃下培養1小時。在血清培養與洗滌之後，於各孔中加入經由EZ-Link Sulfo-NHS-生物素（ThermoFisher，CA）而與生物素結合的Mab 155-49的1:4,000稀釋液，在37℃下培養1小時，以與來自免疫小鼠血清的已結合抗體競爭DENV-2VLP抗原。以1：1000 HRP-結合的鏈黴親和素蛋白（016-030-084, Jackson ImmunoResearch）偵測結合的共軛物，並在37℃培養1小時。以PBS徹底清洗10次後，將TMB受質加入孔中，將培養盤培養10分鐘，並以2N H2 SO4 終止。反應係於A 450 測量。阻斷百分比係以比較重複孔之生物素-共軛MAb競爭吸收前之原始小鼠血清，使用公式：%阻斷= [1-（免疫血清之OD –免疫前血清OD） / （生物素共軛MAb之OD –免疫前血清之OD）]×100來測定。
ELISA結合試驗係用於評估MAbs或小鼠免疫化血清對於D2VLP與突變抗原之結合活性，使用與上述抗原捕獲ELISA流程相同的設定，除了以特異性MAb或免疫小鼠血清的兩倍稀釋物取代抗DENV-2 MHIAF之外。利用純的D2VLP，將兩種D2VLP抗原標準化為等量。測定抗體終點反應性，以確定終點抗原分泌效價。SDS-PAGE 與西方墨點法
將經純化VLPs的5mg蛋白與5ml樣本緩衝液混合，並於12% Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳（Tricine-SDS-PAGE）分離（H. Schägger,Nat Protoc 1 , 16 （2006））。在免疫偵測方面，使用iBlot® 2膠體轉移裝置（IB21001，ThermoFisher Scientific），將蛋白質自膠體上轉印至NC膜上（IB23002, iBlot®2NC mini stacks, ThermoFisher Scientific）。於室溫下含有5%脫脂牛奶（Cat No. 232100, BD biosciences, CA）的磷酸緩衝生理食鹽水（pH 7.4）中培養1小時，以阻斷非特異性結合，之後將膜於蛋白質標記物（26616，ThermoFisher Scientific） 40kDa與5kDa處切成三片，用於個別染色E、prM與P蛋白，分別使用以1:2000稀釋之抗DENV2 MHIAF、0.5mg/ml之抗DENV prM MAb 155-49，以及以1:25稀釋之小鼠抗M血清，於4o C進行隔夜。之後膜每次15分鐘洗滌三次，特異性結合之免疫球蛋白以HRP-標記之山羊抗-小鼠IgG （Cat No: 115-035-146, Jackson ImmunoReasearch, PA）辨識，並以ECL （Cat No: RPN2235，GE Healthcare, UK）依據製造商流程顯色。訊號係以ImageQuantTM LAS 4000 mini （GE Healthcare）偵測。然而， M 蛋白係以TMB膜過氧化酶受質（Cat No: 50-77-03，KPL, MD）顯色，以避免ECL之高背景值。小鼠實驗
本研究依循台灣國家實驗動物中心實驗動物照護與使用指南進行。動物使用方案係經國立中興大學動物照護與使用委員會（IACUC）審核通過（批准文號：101-58）。盡一切努力減少小鼠痛苦。在第0與4週，將每組四隻4週大雌性BALB/c小鼠肌肉注射pucD2VLP與pacD2VLP，劑量為4 μg/100 μLPBS，並區分左右四頭肌。在免疫接種前及第二次注射後4、8、12週，從小鼠眼眶後靜脈採血，並利用ELISA與FRµNT評估個別小鼠血清的DENV-2特異性抗體，如下節所述。因小鼠血清體積有限，故將各組小鼠血清匯集，用於prM特異性與E二聚體特異性抗體檢測。病毒中和作用
利用前述焦點減少微中和測試（FRμNT）測定免疫接種小鼠血清對多個代表性DENV-2基因型病毒株的中和能力。簡言之，將每孔2.475× 104 個Vero細胞種於平底96孔Costar® 細胞培養盤（Corning Inc., Corning, NY, USA），並於5% CO2 下以37°C隔夜培養16 h。匯集的血清初步以1:10稀釋，在56°C下加熱失活30 min，滴定二倍量至40 μL體積，並將320 pfu/40 μL的DENV-1至4加入各稀釋液。混合物隨後在37°C下培養1 h。在培養後，將25 μL的免疫複合物以二重複方式接種於含有Vero細胞單層的培養盤中。培養盤在5% CO2 下以37°C培養1 h，且每10分鐘搖動使其感染。將含有1%甲基纖維素（Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA）與2% FBS的DMEM覆蓋培養基加入，且培養盤在5% CO2 下以37°C培養。在48小時後清洗培養盤，以溶於PBS的75%丙酮固定，並乾燥。進行免疫染色，係以1:600比率將血清型特異性MHIAF加入溶於0.1% PBST的5%牛奶中，並於37°C下培養60 min，清洗及以1:100比率加入含有山羊抗小鼠IgG-HRP且溶於0.1% PBST的5%牛奶中，且在37°C下培養45 min。依據製造商說明以過氧化酶受質套組Vector® VIP SK-4600 （Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA）觀察感染位點（foci）。計算各病毒相對於僅病毒對照組反滴定（back-titration）的FRμNT效價。以S型劑量反應（可變斜率）公式模擬準確50%感染位點減少（FRμNT50）的效價。所有數值皆取自二獨立實驗的平均值。標靶病毒為：DENV-1，病毒株Hawaii；DENV-2，病毒株16681；DENV-3，病毒株H87；以及DENV-4，病毒株H241。在計算幾何平均效價（GMT）以圖形顯示與統計分析中，FRμNT50效價＜10者係分別以1與5等數值表示。生產融合瘤及 Mab 篩選
由pacD2VLP免疫接種小鼠所生產的融合瘤篩選抗DENV抗體，其係依據標準程序進行（Kohler et al, 1975）且稍微調整（Chen et al, 2007）。首先，在犧牲前，另以4ug的pacD2VLP加強pacD2VLP免疫接種小鼠。在最終加強後第4天，從免疫接種小鼠脾臟收取脾細胞，並融合NSI/I-Ag4-1骨髓瘤細胞，係使用抗體傳輸套組（GenomONETM-CF HVJ Envelope Cell Fusion Kit, Gosmo Bio Co, ISK10 MA17）。將融合細胞團塊再懸浮於DMEM，其中補充15% FBS、次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷培養基、及融合瘤選殖因子（ICN, Aurora, OH）。如前述，利用抗原捕捉ELISA，篩選分泌MAbs的融合瘤植株。DENV-2病毒的C6/36培養基上清液的使用濃度為標準化OD 1.0，並以各融合瘤植株培養基上清液替代MHIAF。以有限稀釋方式次選殖所選的陽性植株。以異十八烷（pristane）引發的BALB/c小鼠可生產腹水。融合瘤細胞株生長於含有10%熱失活FBS的DMEM。MAbs係以親和性蛋白質G Sepharose 4B膠體純化，並比對標準IgG的量以ELISA定量純化的MAbs。分析單一 B 細胞之 prM/E 特異性 Ig 基因
將單一B細胞的Ig基因分離，其基本上依循先前報告所建立的方法，且些許調整。簡言之，從免疫接種的BALB/c小鼠脾臟收集單一細胞懸液，該小鼠於第4週時分別肌肉注射pucD2VLP與pacD2VLP兩次。利用流式細胞術（FACSAria II）分離D2VLP（+）、B220 （+）、及IgG1（+）脾臟B細胞，並將單一B細胞分選至96孔PCR培養盤，其含有每孔4ul的冰冷無RNase水並補充10mM DTT與3U RNase抑制劑（Promega）。進行RT-PCR反應，係使用Qiagen OneStep RT-PCR套組（Qiagen），條件為50°C 30 min，之後95°C 15 min，接著為40次循環的95°C 1 min、55°C 1 min與72°C 1 min，最後在72°C下培養5 min，其中引子如前述。以2 ul未純化的第一回PCR產物進行巢式PCR，條件為95°C 1 min，接著為40次循環的95°C 30sec、57°C （IgH）或45°C （Igk）或55°C （Igl） 30sec、72°C 45sec，並在72°C下培養10 min，如前述。將巢式PCR產物分液定序，並以IMGT/V-Quest （http://www.imgt.org）分析，以確認胚系V、D、及J基因的最高同源基因座。隨後，將Ig基因轉譯，並以CLUSTALW比對，以界定選殖放大的Ig基因。CryoEM 與 3D 重建
將新鮮製備的登革熱病毒樣本（~3 μl）置於輝光放電型Quatifoil 2/2格（Quatifoil GmbH, Germany）中，以濾紙轉染，並以Gatan CP3浸入以液態氮冷卻的液態乙烷中。以JEOL2100F場發射槍透視電子顯微鏡紀錄CryoEM影像，並使用加速電壓200kV與放大倍率15,000x的直流電子檢測器（DE-12 Camera System - Direct Electron，LP），其中像素尺寸為6 µm （其對應的樣本程度為~4 Å）。4 Å/像素。彼等影像所測得之散焦值範圍為−2μm至−4.5μm。造影電子劑量為~ 10 e- /Å2 。以EMAN2進行影像處理{Tang, 2007 #3}。重建過程在無法取得改進時結束（圖6）。以EMAN2評估最終重建解析度，其係藉由傅立葉殼相關曲線（Fourier shell correlation curve），並比較隨機選取之「奇數」與「偶數」顆粒的兩重組數據。使用fsc曲線降至0.5者於評估解析度（圖6）。利用UCSF Chimera 將DENV2 （PDB code: 3J27）的cryoEM結構手動擬合至DENV2 VLP密度圖。以POPS程式計算pacD2VLP上個別胺基酸分子的溶劑可及表面積（SASA） （A. Fornili et al.,Methods Mol Biol 819 , 375 （2012））。統計分析
所有數據皆以平均值±標準誤差表示，並以GraphPad Prism 6.0版分析。利用未配對t 檢定進行二組間數據組分析。亦採用Mann-WhitneyU 檢定解釋一些轉換數據的非常態性。P 值＜0.05視為具有顯著性。
無
圖1顯示在不同VLPs中pr-M接位切割效率之比較。（ A ） prM蛋白示意圖；P1至P10意指pr-M接位。（ B ） 以ELISA結果計算prM切割之百分比。數據以平均值±標準差（SD）表示，其取自三次代表性ELISA實驗且各二重複。 圖2顯示（ A ） 在以電穿孔法運送個別質體後，培養基上清液中pucD2VLPs與pacD2VLPs之西方墨點法結果。pacD2VLP之prM蛋白減少係因pr胜肽之切割增加所致，可觀察到M蛋白的顯著條帶。pucD2VLP則未觀察到M蛋白，係因利用弗林蛋白酶（furin）辨識序列上的突變以抵抗弗林蛋白酶切割。（ B ） 利用MAb3H5 （特異於DENV-2結構域III）與155-49 （特異於DENV prM）測定E與prM蛋白相對量的ELISA結果。接著，對照prM未切割之VLP，亦即pucD2VLP，且假設其為100%未切割，計算prM切割百分比。數據以平均值±標準差（SD）表示，其取自三次代表性ELISA實驗且各二重複。 圖3顯示二組小鼠間之總抗原特異性IgG、中和效價、及抗prM抗體比例，其分別以顆粒表面上所有pr-胜肽未切割或幾乎所有pr-胜肽切割之pucD2VLP或pacD2VLP免疫接種該小鼠。四週大小鼠在第0與4週時以4 ug的D2VLP免疫接種（i.m.）。（ A ） 顯示二不同組小鼠在同源抗原免疫接種後12週的終點IgG效價。（ B ） 用於該等實驗之D2VLPs標準曲線。（ C ） 顯示免疫接種後12週的小鼠血清的終點IgG效價，該小鼠接受的pucD2VLP或pacD2VLP係使用同源與異源D2VLP抗原。於此使用之兩等量抗原係依據經純化之VLPs所繪製的標準曲線。除非另有說明，所述者為幾何平均值與95%信賴區間。所有終點效價係經log10轉換，並以Mann-WhitneyU 檢定確定統計顯著性，以解決一些轉換數據的非常態性。（ D ） 顯示所有DENV血清型的50%抗原焦點減少微中和效價（FRμNT50）。於此利用student’s t檢定，係因兩數據組為常態分佈。（ E ） 二不同D2VLP免疫接種組之抗prM抗體比例係進一步以表位阻斷ELISA確認。利用疫苗接種不同D2VLP與pucD2VLP之小鼠血清的HRP標記之抗prM Mab（2H2）的阻斷百分比係以公式100*[（OD450pucD2VLP-以2H2阻斷的OD450pucD2VLP）/OD450pucD2VLP]決定，其中小鼠血清稀釋1000倍。（ F ） 系列稀釋pucD2VLP與突變體pucD2VLP （puc ∆2H2），其於Mab 2H2結合表位含有突變（K26P、K21D、F1A），其係利用Mab 2H2 （左圖）與對照組抗體3H5 （右圖）之ELISA結合試驗進行結合測試。（ G ） 條形圖顯示來自抗原捕獲ELISA的結果，顯示基於利用Mab 3H5 （左圖）辨識E蛋白（envelope protein），加入可比較之量的WT與突變體VLPs。來自經pucD2VLP （中間圖）與pacD2VLP （右圖）免疫接種小鼠之以系列稀釋的血清，進行野生型與突變體pucD2VLP的ELISA結合試驗。（ H ） 二不同D2VLP免疫接種組的抗prM抗體比例，依據公式100*[（OD450pucD2VLP-OD450puc∆2H2） /OD450pucD2VLP]計算，且小鼠血清稀釋1000倍（左圖）。*, p＜0.05。**, p＜0.01。***, p＜0.001。****, p＜0.0001。 圖4顯示pacD2VLP免疫接種小鼠脾細胞所生產鼠科單株抗體之確認。（ A ） 利用ELISA結合試驗測定DM8-6與25-3對DENV-1至4的結合活性。（ B ） 利用焦點減少微中和測試（FRμNT）測定DM8-6與25-3對DENV-1至4的中和活性。（ C ） 進行DM8-6 （頂圖）、DM25-3 （由上數來第二圖）與MHIAF （由上數來第三圖）對pucD2VLP與pacD2VLP的ELISA結合試驗。抗原採用單一標準化濃度，所生產的光密度（OD）為0.8，選擇該濃度係基於抗原捕捉ELISA之標準曲線使所有三抗原標準化至等量。將兩MAbs的結合活性的最大差異轉換成條形圖（底圖）。（ D ） 以二劑量之pucD2VLP （左圖）或pacD2VLP （中央圖）免疫接種的小鼠血清進行針對pucD2VLP與pacD2VLP的ELISA結合試驗。將兩MAbs的結合活性差異轉換成條形圖，其中小鼠血清以1:1000倍稀釋（右圖）。（ E ） 利用ELISA結合試驗，測試DENV-2小鼠超免疫腹水（MHIAF）（左圖）、DM 25-3 （中間圖）、及DM8-6 （右圖）對含有突變之第101個胺基酸（W101G）與第311個胺基酸（E311R）之等量pacD2VLP與突變體pucD2VLP的結合作用。儘管MHIAF顯示等量結合至所有三個VLPs，但是DM25-3喪失結合至W101G突變體VLP的能力，且DM8-6顯示明顯喪失結合E311R的活性。數據以平均值+ 標準差（SD）顯示，其係由三次代表性ELISA實驗以二重複方式進行。*, p＜0.05。**, p＜0.01。（ F ） 由pacD2VLP與pucD2VLP免疫接種小鼠所得之脾細胞的DENV特異性B細胞特性。生產編碼相同IgH與IgL基因座的重鏈與輕鏈的B細胞以相同顏色分組。在所有IgH或IgL基因的比例中，若各疫苗接種組之B細胞群頻率大於10%，則k鏈以顏色表示。其餘以白色顯示。 圖5顯示MAb 25-3與8-6之中和表位辨別。條形圖顯示以所列殘基取代時，在pacD2VLPs ELISA結合試驗中MAb反應性減少。利用電穿孔各質體DNAs，將各DENV-2類病毒顆粒（VLP）突變體表現於COS-1細胞。轉染三天後收取組織培養基，並自其中純化類病毒顆粒以進行抗原捕捉ELISA。（頂圖）相較於以ori表示的野生型D2VLP，E311R之取代導致中和MAb DM8-6的結合活性明顯減少。（底圖）相較於ori，W101G之取代導致MAb DM25-3結合活性完全喪失。所示數據為三次獨立實驗之一代表性實驗。 圖6顯示利用結構域III取代的DENV-2重組型病毒，確認DM25-3結合至四元表位。（A）以一致結構域III （PL046cEDIII）替代結構域III，生產重組型DENV-2，並比較兩親代DENV-2病毒株PL046與PL046cEDIII的ELISA結合試驗結果。DENV-2 MHIAF顯示結合至兩病毒的活性類似（左圖）。當移除結構域III時，結合至DM 25-3之DENV-2的活性明顯喪失（中間圖）。由於DM8-6辨識位於結構域III的表位，當移除結構域III時，DM8-6結合至PL046cEDIII的活性喪失可視為陽性對照組（右圖）。（B）顯示免疫接種後小鼠血清對PL046與PL046cEDIII DENV-2病毒的50%抗原焦點減少微中和效價（FRμNT50），該小鼠係以pacD2VLP與pucD2VLP免疫接種。將pacD2VLP與pucD2VLP免疫接種組的FRμNT50差異轉換成條形圖，其中小鼠血清稀釋倍率為1:1000。數據以平均值±標準差（SD）表示，並取自三次獨立實驗。*, p＜0.05。 圖7顯示實驗設計總覽。利用FACS，將疫苗接種小鼠脾臟單一DENV（+）、B220（+）、及IgG1（+）特異性B細胞分選至96孔培養盤。利用如前述基因特異性引子的RT-PCR與巢式PCR，放大各單一B細胞的IgH與IgL基因轉錄子（T. Tiller et al.,J Immunol Methods 350 , 183 （2009））。 圖8顯示（A）純化之DENV VLPs成熟型態的cryoEM影像，顯示不規則或不完整顆粒（箭頭）中存在球形顆粒（加框）。在球形顆粒族群中，取三族群進行類別分析：較小顆粒以「S」表示、「中間」顆粒以「M」表示、及「較大」顆粒以「L」表示。其分別以藍色、黑色、及紅色加框。利用肉眼檢查盡可能移除不規則顆粒，並以球形顆粒進行進一步影像分析。（B）球形顆粒係於二維下分類及平均，其亦顯示所選之球形顆粒具有尺寸變異。其亦顯示，雙層並非完美球形，且密度會在數據處理期間抹去。 圖9顯示免疫金標記之DENV VLPs的透視EM影像圖。E蛋白的構域III係經抗體標記，且該抗體係共軛連接至6-nm金顆粒。 圖10顯示登革熱病毒血清型2之成熟型類病毒顆粒（pacD2VLP）結構。（ A ） DENV VLPs之cryoEM重建圖。以二十面體框架（cage）表示二十面體的2-、3-、及5-對稱軸（ 2-, 3- and 5-fold axes）。（ B ） 將sE （PDB: 3J05）蛋白擬合（fitting）至cryoEM密度圖。密度圖以透明體積顯示，其中呈現擬合的sE蛋白骨架結構。結構域I、II、III分別以黃色、紅色、藍色表示。值得注意的是，E1結構遵循T=1的二十面體對稱晶格，其表面具有30E二聚體次單元，以及抗體的可接觸性。（ C ） 以5對稱軸觀察sE擬合至VLPs （上圖）與原生病毒（下圖）。原生病毒的5對稱軸開口（5-fold opening）比VLPs的窄，其侷限單株抗體（MAb） DM25-3與DM8-6抗體的可接觸性。於胺基酸101與311的抗體辨識位點以橘色與藍色球形表示，其位於靠近E二聚體5對稱軸的孔周圍。由球形相連結的線代表胺基酸間之距離，且顯示相同抗體兩Fab結合的可能性。距離皆小於87Å，其為IgG二Fabs間之最大距離。（ D ） MAb 1A1D-2、2D22、及EDE1與2代表抗體，其代表登革熱複合體、血清型特異性、及黃病毒群反應性中和抗體。先前研究顯示，其結合至四元隱藏表位（quaternary hidden epitope），且在28o C之中性pH下不會露在病毒顆粒上。其結合足跡分析顯示，MAb 1A1D-2、2D22、及EDE1與2上的兩個Fab能無空間位阻地結合VLPs上的所有E二聚體。重要的是，所有三種抗體的結合足跡都是高度重疊的，並在VLPs上形成中和抗體的敏感性區域（patch）。以球形顯示與抗體相互作用的殘基。黑色三角形代表VLP的不對稱單元。 圖11顯示（A） DENV VLPs的cryoEM重建圖。以二十面體框架表示二十面體的2-、3-、及5-對稱軸。右圖刪除近半的密度圖，以呈現空心結構。（B） DENV VLP最終的傅立葉殼相關性（Fourier shell correlation，fsc）繪圖。使用0.5 fsc截止值判定最終重建的解析度為23Å。 圖12顯示登革熱病毒血清型2類病毒顆粒的套膜（envelope）蛋白胞外結構域（ectodomain）胺基酸殘基1-396的溶劑可接觸性。（A）登革熱E之結構域定義。分別指出結構域I、II、III。（B）利用POPS程式計算pacD2VLP上個別胺基酸分子的溶劑可接觸表面積（SASA）。紅線（箭頭）代表溶劑可接觸性＞ 0.3。（B） VLP與DENV-2病毒顆粒（PDB: 3J27）間之溶劑可接觸性的差異。正值代表VLP之溶劑可接觸性高於病毒顆粒，且負值代表相反方向。最高之正值聚焦於三個胜肽區，包括胺基酸殘基範圍100-110，融合環胜肽；309-317，結構域III之A股；342-348，結構域III之DE環。 圖13顯示VLP與病毒顆粒上抗體1A1D-2、2D22、及EDE1與2之Fabs足跡。足跡分析顯示，抗體1A1D-2、2D22、及EDE1 &2上的兩個Fabs能無空間位阻地結合VLPs上的所有E二聚體。（ A ） 在37℃下結合至病毒（17）之M之Fab片段，被預期可較好地結合至VLPs，很可能係因5對稱軸周圍有較大的孔洞。（ B ） 人類抗體（2D22）可阻斷三分之二或所有二聚體在病毒表面上的能力，其取決於病毒株（18），而在VLPs，2D22可無空間干擾地阻斷幾乎所有二聚體，很可能係因5對稱軸的開口比原生病毒的大。（ C ） 「E二聚體依賴性表位」，其可受廣泛中和抗體EDE1與2辨識（19），在VLPs亦良好顯露。以球形顯示與抗體相互作用的殘基。結構域的顏色如前面所示。
無

Claims (31)

  1. 一種編碼具有膜蛋白之類病毒顆粒的表現載體，其中該膜蛋白在其切割前型態含有一pr-M接位（pr-M junction） RUXRKKVVMT，其中該U為賴胺酸（K）或精胺酸（R），且該X為絲胺酸（S）或丙胺酸（A）。
  2. 如申請專利範圍第1項之表現載體，其中該pr-M接位包含SEQ ID NO: 05、SEQ ID NO: 09、或SEQ ID NO: 13。
  3. 如申請專利範圍第1項之表現載體，其中該表現載體包含SEQ ID NO: 16。
  4. 一種含有膜蛋白之類病毒顆粒，其中該膜蛋白在其切割前型態含有一pr-M接位RUXRKKVVMT，其中該U為K或R，且該X為S或A。
  5. 如申請專利範圍第4項之類病毒顆粒，其中該pr-M接位包含SEQ ID NO: 05、SEQ ID NO: 09、或SEQ ID NO: 13。
  6. 一種組合物，其包含如申請專利範圍第4項之該類病毒顆粒及醫藥上可接受載體或醫藥上可接受佐劑。
  7. 如申請專利範圍第6項之組合物，其中該pr-M接位包含SEQ ID NO: 05、SEQ ID NO: 09、或SEQ ID NO: 13。
  8. 如申請專利範圍第6項之組合物，其中該醫藥上可接受載體包含水、甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、或其組合。
  9. 如申請專利範圍第6項之組合物，其中該醫藥上可接受佐劑包含鋁佐劑、含鯊烯之水包油型懸浮佐劑、類鐸受體之配體、皂苷系佐劑、聚合物系佐劑、或其組合。
  10. 一種分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，其包含： 至少一含有GYTFTEYT （SEQ ID NO: 19）之重鏈互補決定區1 （H-CDR1）， 至少一含有INPNNGGTT （SEQ ID NO: 20）之重鏈互補決定區2 （H-CDR2）， 至少一含有VRYGGYYVFDY （SEQ ID NO: 21）之重鏈互補決定區3 （H-CDR3）， 至少一含有KSVSTSGYSY （SEQ ID NO: 22）之輕鏈互補決定區1 （L-CDR1）， 至少一含有LVS （SEQ ID NO: 23）之輕鏈互補決定區2 （L-CDR2），以及 至少一含有QHIRELTRR （SEQ ID NO: 24）之輕鏈互補決定區3 （L-CDR3）。
  11. 如申請專利範圍第10項之分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，其包含至少一含有SEQ ID NO: 17的重鏈及至少一含有SEQ ID NO: 18的輕鏈。
  12. 如申請專利範圍第10項之分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，該抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分能結合至登革熱病毒E蛋白之結構域2。
  13. 如申請專利範圍第12項之分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，該抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分能結合至該結構域2之W101。
  14. 一種分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，其包含： 至少一含有GYSITSDY （SEQ ID NO: 27）之重鏈互補決定區1 （H-CDR1）， 至少一含有ISYSGST （SEQ ID NO: 28）之重鏈互補決定區2 （H-CDR2）， 至少一含有ARSLLPNWYFD （SEQ ID NO: 29）之重鏈互補決定區3 （H-CDR3）， 至少一含有KSVSTSGYSY （SEQ ID NO: 30）之輕鏈互補決定區1 （L-CDR1）， 至少一含有LVS （SEQ ID NO: 31）之輕鏈互補決定區2 （L-CDR2），以及 至少一含有QHIRELTRS （SEQ ID NO: 32）之輕鏈互補決定區3 （L-CDR3）。
  15. 如申請專利範圍第14項之分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，其包含至少一含有SEQ ID NO: 25的重鏈及至少一含有SEQ ID NO: 26的輕鏈。
  16. 如申請專利範圍第14項之分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，該抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分能結合至登革熱病毒E蛋白之結構域3。
  17. 如申請專利範圍第16項之分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分，該抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分能結合至該結構域3之E311。
  18. 一種用於生產抗血清的方法，其包含：施予一動物如申請專利範圍第4項之類病毒顆粒；以及收集該動物之血清。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該類病毒顆粒之該pr-M接位包含SEQ ID NO: 05、SEQ ID NO: 09、或SEQ ID NO: 13。
  20. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該抗血清能以稀釋比率1:60中和至少二種50% FRμNT效價之登革熱病毒血清型；其中該二者以上之血清型係選自於登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型、及登革熱病毒第4型。
  21. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該抗血清能以稀釋比率1:60中和50% FRμNT效價之登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型、及登革熱病毒第4型。
  22. 一種利用如申請專利範圍第18項之方法生產的抗血清，其中該抗血清能以稀釋比率1:60中和至少二種50% FRμNT效價之登革熱病毒血清型；其中該二者以上之血清型係選自於登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型、及登革熱病毒第4型。
  23. 如申請專利範圍第22項之抗血清，其中該抗血清能以稀釋比率1:100中和至少二種50% FRμNT效價之登革熱病毒血清型；其中該二者以上之血清型係選自於登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型、及登革熱病毒第4型。
  24. 如申請專利範圍第22項之抗血清，其中該抗血清能以稀釋比率1:70中和50% FRμNT效價之登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、及登革熱病毒第4型。
  25. 如申請專利範圍第22項之抗血清，其中該抗血清能以稀釋比率1:60中和50% FRμNT效價之登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型、及登革熱病毒第4型。
  26. 一種用於生產抗體之方法，其包含：施予一動物如申請專利範圍第4項之類病毒顆粒；以及自該動物分離一抗體。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該類病毒顆粒之該pr-M接位包含SEQ ID NO: 05、SEQ ID NO: 09、或SEQ ID NO: 13。
  28. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該抗體係分離自該動物之血液或脾臟。
  29. 一種利用如申請專利範圍第26項之方法生產的抗體，其中該抗體能以0.24至0.58 μg/mL中和50% FRμNT效價之登革熱病毒第1型、登革熱病毒第2型、登革熱病毒第3型、及登革熱病毒第4型。
  30. 一種用於治療登革熱病毒之組合物，其包含： 一有效量之如申請專利範圍第10項之分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分；如申請專利範圍第11項之分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分；如申請專利範圍第14項之分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分；如申請專利範圍第15項之分離的抗登革熱病毒抗體或其抗原結合部分；如申請專利範圍第22項之抗血清、或如申請專利範圍第29項之抗體；以及 一醫藥上可接受載體。
  31. 如申請專利範圍第30項之組合物，其中該醫藥上可接受載體包含水、甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、或其組合。
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