CN110050064A

CN110050064A - 登革热类病毒颗粒、登革热病毒抗体、及含其的组合物

Info

Publication number: CN110050064A
Application number: CN201780067143.6A
Authority: CN
Inventors: 赵黛瑜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-10-27
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2019-07-23
Anticipated expiration: 2037-10-26
Also published as: EP3535398A1; WO2018077208A9; EP3535398A4; CN110050064B; US20190315839A1; US11046754B2; TW201829772A; TWI769185B; WO2018077208A1

Abstract

本发明是有关登革热类病毒颗粒。所述登革热类病毒颗粒呈现几乎切割的pr‑M接位，且具体而言适于制成辨识所有四种登革热病毒的抗体。本发明亦提供利用所述类病毒颗粒所取得的抗体及含其的组合物。

Description

登革热类病毒颗粒、登革热病毒抗体、及含其的组合物

技术领域

本发明是有关登革热的治疗，尤其是针对此目的的抗体与组合物，及其制备方法。

背景技术

登革热病毒(DENV)，一黄病毒科(Flaviviridae)家族一员，为蚊子传播的病原体，其具有四个不同的血清型，包括DENV-1至DENV-4(1)。现今，据估计，DENV每年全球感染约三亿九千万个案例，造成轻度发热到登革出血热(DHF)或危及生命的登革热休克症候群(DSS)等九千六百万个临床表现案例(2)。尽管黄热病四价登革热疫苗(YFTD)近来得到少数国家的批准，但此类疫苗对九岁以上先前受登革热感染的族群在使用上有局限且疫苗功效较低，迫切需要开发第二代登革热疫苗(3,4)。

发明内容

本发明目的之一为提供登革热病毒的类病毒颗粒。所述类病毒颗粒是用于生产能中和至少二种登革热病毒血清型的抗血清或抗体。

本发明的另一目的为提供能中和至少一种、至少二种、至少三或四种登革热病毒血清型的抗体。

为达成上述目的，本发明提供一表达载体，其编码具有膜蛋白的类病毒颗粒；其中所述膜蛋白在其切割前型态(pre-cleaved form)含有pr-M接位RUXRKKVVMT；其中所述U为K或R，且所述X为S或A。

本发明亦提供一类病毒颗粒，其含有膜蛋白；其中所述膜蛋白在其切割前型态含有pr-M接位RUXRKKVVMT；其中所述U为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，且所述X为丝氨酸(S)或丙氨酸(A)。

本发明更提供一组合物，其含有前述的类病毒颗粒及医药上可接受载体或医药上可接受佐剂。

本发明进一步提供一分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，其包含：至少一含有GYTFTEYT(SEQ ID NO:19)的重链互补决定区1(H-CDR1)、至少一含有INPNNGGTT(SEQID NO:20)的重链互补决定区2(H-CDR2)、至少一含有VRYGGYYVFDY(SEQ ID NO:21)的重链互补决定区3(H-CDR3)、至少一含有KSVSTSGYSY(SEQ ID NO:22)的轻链互补决定区1(L-CDR1)、至少一含有LVS(SEQ ID NO:23)的轻链互补决定区2(L-CDR2)、及至少一含有QHIRELTRR(SEQ ID NO:24)的轻链互补决定区3(L-CDR3)。

本发明进一步提供一分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，其包含：至少一含有GYSITSDY(SEQ ID NO:27)的重链互补决定区1(H-CDR1)、至少一含有ISYSGST(SEQID NO:28)的重链互补决定区2(H-CDR2)、至少一含有ARSLLPNWYFD(SEQ ID NO:29)的重链互补决定区3(H-CDR3)、至少一含有KSVSTSGYSY(SEQ ID NO:30)的轻链互补决定区1(L-CDR1)、至少一含有LVS(SEQ ID NO:31)的轻链互补决定区2(L-CDR2)、及至少一含有QHIRELTRS(SEQ ID NO:32)的轻链互补决定区3(L-CDR3)。

本发明亦提供一组合物，其包含前述分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分及医药上可接受载体。

本发明更提供一用于生产抗血清的方法，其包含：施予一动物前述的类病毒颗粒及收集所述动物的血清。

本发明接着提供一抗血清，其是利用前述的方法生产；其中所述抗血清能以稀释比例1:60中和至少二种50％FRμNT效价的登革热病毒血清型；其中二种以上的血清型是选自于登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型、及登革热病毒第4型。

本发明更提供一用于生产抗体的方法，其包含：施予一动物前述的类病毒颗粒；以及自所述动物分离一抗体。

本发明接着提供一抗体，其是利用如权利要求31的方法生产；其中所述抗体能以0.24至0.58μg/mL中和50％FRμNT效价的登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型、及登革热病毒第4型。

附图说明

图1显示在不同VLPs中pr-M接位切割效率的比较。(A)prM蛋白示意图；P1至P10意指pr-M接位。(B)以ELISA结果计算prM切割的百分比。数据以平均值±标准差(SD)表示，其取自三次代表性ELISA实验且各二重复。

图2显示(A)在以电穿孔法运送个别质粒后，培养基上清液中pucD2VLPs与pacD2VLPs的西方墨点法结果。pacD2VLP的prM蛋白减少是因pr肽的切割增加所致，可观察到M蛋白的显著条带。pucD2VLP则未观察到M蛋白，是因利用弗林蛋白酶(furin)辨识序列上的突变以抵抗弗林蛋白酶切割。(B)利用MAb3H5(特异于DENV-2结构域III)与155-49(特异于DENV prM)测定E与prM蛋白相对量的ELISA结果。接着，对照prM未切割的VLP，亦即pucD2VLP，且假设其为100％未切割，计算prM切割百分比。数据以平均值±标准差(SD)表示，其取自三次代表性ELISA实验且各二重复。

图3显示二组小鼠间的总抗原特异性IgG、中和效价、及抗prM抗体比例，其分别以颗粒表面上所有pr-肽未切割或几乎所有pr-肽切割的pucD2VLP或pacD2VLP免疫接种所述小鼠。四周大小鼠在第0与4周时以4ug的D2VLP免疫接种(i.m.)。(A)显示二不同组小鼠在同源抗原免疫接种后12周的终点IgG效价。(B)用于所述实验的D2VLPs标准曲线。(C)显示免疫接种后12周的小鼠血清的终点IgG效价，所述小鼠接受的pucD2VLP或pacD2VLP是使用同源与异源D2VLP抗原。于此使用的两等量抗原是依据经纯化的VLPs所绘制的标准曲线。除非另有说明，所述者为几何平均值与95％信赖区间。所有终点效价是经log10转换，并以Mann-Whitney U检定确定统计显著性，以解决一些转换数据的非常态性。(D)显示所有DENV血清型的50％抗原焦点减少微中和效价(FRμNT50)。于此利用student’s t检定，是因两数据组为常态分布。(E)二不同D2VLP免疫接种组的抗prM抗体比例是进一步以表位阻断ELISA确认。利用疫苗接种不同D2VLP与pucD2VLP的小鼠血清的HRP标记的抗prM Mab(2H2)的阻断百分比是以公式100*[(OD450pucD2VLP-以2H2阻断的OD450pucD2VLP)/OD450pucD2VLP]决定，其中小鼠血清稀释1000倍。(F)系列稀释pucD2VLP与突变体pucD2VLP(pucΔ2H2)，其于Mab2H2结合表位含有突变(K26P、K21D、F1A)，其是利用Mab 2H2(左图)与对照组抗体3H5(右图)的ELISA结合试验进行结合测试。(G)条形图显示来自抗原捕获ELISA的结果，显示基于利用Mab 3H5(左图)辨识E蛋白(envelope protein)，加入可比较的量的WT与突变体VLPs。来自经pucD2VLP(中间图)与pacD2VLP(右图)免疫接种小鼠的以系列稀释的血清，进行野生型与突变体pucD2VLP的ELISA结合试验。(H)二不同D2VLP免疫接种组的抗prM抗体比例，依据公式100*[(OD450pucD2VLP-OD450pucΔ2H2)/OD450pucD2VLP]计算，且小鼠血清稀释1000倍(左图)。*,p<0.05。**,p<0.01。***,p<0.001。****,p<0.0001。

图4显示pacD2VLP免疫接种小鼠脾细胞所生产鼠科单株抗体的确认。(A)利用ELISA结合试验测定DM8-6与25-3对DENV-1至4的结合活性。(B)利用焦点减少微中和测试(FRμNT)测定DM8-6与25-3对DENV-1至4的中和活性。(C)进行DM8-6(顶图)、DM25-3(由上数来第二图)与MHIAF(由上数来第三图)对pucD2VLP与pacD2VLP的ELISA结合试验。抗原采用单一标准化浓度，所生产的光密度(OD)为0.8，选择所述浓度是基于抗原捕捉ELISA的标准曲线使所有三抗原标准化至等量。将两MAbs的结合活性的最大差异转换成条形图(底图)。(D)以二剂量的pucD2VLP(左图)或pacD2VLP(中央图)免疫接种的小鼠血清进行针对pucD2VLP与pacD2VLP的ELISA结合试验。将两MAbs的结合活性差异转换成条形图，其中小鼠血清以1:1000倍稀释(右图)。(E)利用ELISA结合试验，测试DENV-2小鼠超免疫腹水(MHIAF)(左图)、DM 25-3(中间图)、及DM8-6(右图)对含有突变的第101个氨基酸(W101G)与第311个氨基酸(E311R)的等量pacD2VLP与突变体pucD2VLP的结合作用。尽管MHIAF显示等量结合至所有三个VLPs，但是DM25-3丧失结合至W101G突变体VLP的能力，且DM8-6显示明显丧失结合E311R的活性。数据以平均值±标准差(SD)显示，其是由三次代表性ELISA实验以二重复方式进行。*,p<0.05。**,p<0.01。(F)由pacD2VLP与pucD2VLP免疫接种小鼠所得的脾细胞的DENV特异性B细胞特性。生产编码相同IgH与IgL基因座的重链与轻链的B细胞以相同颜色分组。在所有IgH或IgL基因的比例中，若各疫苗接种组的B细胞群频率大于10％，则k链以颜色表示。其余以白色显示。

图5显示MAb 25-3与8-6的中和表位辨别。条形图显示以所列残基取代时，在pacD2VLPsELISA结合试验中MAb反应性减少。利用电穿孔各质粒DNAs，将各DENV-2类病毒颗粒(VLP)突变体表达于COS-1细胞。转染三天后收取组织培养基，并自其中纯化类病毒颗粒以进行抗原捕捉ELISA。(顶图)相较于以ori表示的野生型D2VLP，E311R的取代导致中和MAbDM8-6的结合活性明显减少。(底图)相较于ori，W101G的取代导致MAb DM25-3结合活性完全丧失。所示数据为三次独立实验的一代表性实验。

图6显示利用结构域III取代的DENV-2重组型病毒，确认DM25-3结合至四元表位。(A)以一致结构域III(PL046cEDIII)替代结构域III，生产重组型DENV-2，并比较两亲代DENV-2病毒株PL046与PL046cEDIII的ELISA结合试验结果。DENV-2MHIAF显示结合至两病毒的活性类似(左图)。当移除结构域III时，结合至DM 25-3的DENV-2的活性明显丧失(中间图)。由于DM8-6辨识位于结构域III的表位，当移除结构域III时，DM8-6结合至PL046cEDIII的活性丧失可视为阳性对照组(右图)。(B)显示免疫接种后小鼠血清对PL046与PL046cEDIII DENV-2病毒的50％抗原焦点减少微中和效价(FRμNT50)，所述小鼠是以pacD2VLP与pucD2VLP免疫接种。将pacD2VLP与pucD2VLP免疫接种组的FRμNT50差异转换成条形图，其中小鼠血清稀释倍率为1:1000。数据以平均值±标准差(SD)表示，并取自三次独立实验。*,p<0.05。

图7显示实验设计总览。利用FACS，将疫苗接种小鼠脾脏单一DENV(+)、B220(+)、及IgG1(+)特异性B细胞分选至96孔培养盘。利用如前述基因特异性引物的RT-PCR与巢式PCR，放大各单一B细胞的IgH与IgL基因转录子(T.Tiller et al.,J Immunol Methods350,183(2009))。

图8显示(A)纯化的DENV VLPs成熟型态的cryoEM影像，显示不规则或不完整颗粒(箭头)中存在球形颗粒(加框)。在球形颗粒族群中，取三族群进行类别分析：较小颗粒以“S”表示、“中间”颗粒以“M”表示、及“较大”颗粒以“L”表示。其分别以蓝色、黑色、及红色加框。利用肉眼检查尽可能移除不规则颗粒，并以球形颗粒进行进一步影像分析。(B)球形颗粒是于二维下分类及平均，其亦显示所选的球形颗粒具有尺寸变异。其亦显示，双层并非完美球形，且密度会在数据处理期间抹去。

图9显示免疫金标记的DENV VLPs的透视EM影像图。E蛋白的构域III是经抗体标记，且所述抗体是共轭连接至6-nm金颗粒。

图10显示登革热病毒血清型2的成熟型类病毒颗粒(pacD2VLP)结构。(A)DENVVLPs的cryoEM重建图。以二十面体框架(cage)表示二十面体的2-、3-、及5-对称轴(2-,3-and 5-fold axes)。(B)将sE(PDB:3J05)蛋白拟合(fitting)至cryoEM密度图。密度图以透明体积显示，其中呈现拟合的sE蛋白骨架结构。结构域I、II、III分别以黄色、红色、蓝色表示。值得注意的是，E1结构遵循T＝1的二十面体对称晶格，其表面具有30E二聚体次单元，以及抗体的可接触性。(C)以5对称轴观察sE拟合至VLPs(上图)与原生病毒(下图)。原生病毒的5对称轴开口(5-fold opening)比VLPs的窄，其局限单株抗体(MAb)DM25-3与DM8-6抗体的可接触性。于氨基酸101与311的抗体辨识位点以橘色与蓝色球形表示，其位于靠近E二聚体5对称轴的孔周围。由球形相连结的线代表氨基酸间的距离，且显示相同抗体两Fab结合的可能性。距离皆小于其为IgG二Fabs间的最大距离。(D)MAb 1A1D-2、2D22、及EDE1与2代表抗体，其代表登革热复合体、血清型特异性、及黄病毒群反应性中和抗体。先前研究显示，其结合至四元隐藏表位(quaternary hidden epitope)，且在28℃的中性pH下不会露在病毒颗粒上。其结合足迹分析显示，MAb 1A1D-2、2D22、及EDE1与2上的两个Fab能无空间位阻地结合VLPs上的所有E二聚体。重要的是，所有三种抗体的结合足迹都是高度重迭的，并在VLPs上形成中和抗体的敏感性区域(patch)。以球形显示与抗体相互作用的残基。黑色三角形代表VLP的不对称单元。

图11显示(A)DENV VLPs的cryoEM重建图。以二十面体框架表示二十面体的2-、3-、及5-对称轴。右图删除近半的密度图，以呈现空心结构。(B)DENV VLP最终的傅立叶壳相关性(Fourier shell correlation，fsc)绘图。使用0.5fsc截止值判定最终重建的解析度为

图12显示登革热病毒血清型2类病毒颗粒的套膜(envelope)蛋白胞外结构域(ectodomain)氨基酸残基1-396的溶剂可接触性。(A)登革热E的结构域定义。分别指出结构域I、II、III。(B)利用POPS程式计算pacD2VLP上个别氨基酸分子的溶剂可接触表面积(SASA)。红线(箭头)代表溶剂可接触性>0.3。(C)VLP与DENV-2病毒颗粒(PDB:3J27)间的溶剂可接触性的差异。正值代表VLP的溶剂可接触性高于病毒颗粒，且负值代表相反方向。最高的正值聚焦于三个肽区，包括氨基酸残基范围100-110，融合环肽；309-317，结构域III的A股；342-348，结构域III的DE环。

图13显示VLP与病毒颗粒上抗体1A1D-2、2D22、及EDE1与2的Fabs足迹。足迹分析显示，抗体1A1D-2、2D22、及EDE1&2上的两个Fabs能无空间位阻地结合VLPs上的所有E二聚体。(A)在37℃下结合至病毒(17)的M的Fab片段，被预期可较好地结合至VLPs，很可能是因5对称轴周围有较大的孔洞。(B)人类抗体(2D22)可阻断三分之二或所有二聚体在病毒表面上的能力，其取决于病毒株(18)，而在VLPs，2D22可无空间干扰地阻断几乎所有二聚体，很可能是因5对称轴的开口比原生病毒的大。(C)“E二聚体依赖性表位”，其可受广泛中和抗体EDE1与2辨识(19)，在VLPs亦良好显露。以球形显示与抗体相互作用的残基。结构域的颜色如前面所示。

具体实施方式

暴露于感染性成熟病毒颗粒表面的套膜(E)蛋白为中和抗体的唯一靶标。在病毒复制期间，新合成的未成熟DENV在中性pH下，于内质网中组装，且作为机械性屏障的前驱膜(prM)蛋白的pr部分(请见图1(A))会定位以覆盖肽的融合环(FL)，其位于早期融合的三聚体每个E蛋白远端(5,6)。为了完全具有感染性，在释出过程(egress process)中必须以细胞蛋白酶的弗林蛋白酶(furin)将pr部分除去(即切割)。然而，DENV的成熟过程被认为是低效率的，且DENV颗粒作为异源性群体自感染的细胞中释放出，取决于膜(M)蛋白由prM切割为M蛋白的切割程度：未成熟的颗粒仅由未切割prM蛋白所组成，部分未成熟的颗粒包含prM与M蛋白二者，而完全成熟颗粒仅包含M蛋白(7,8)。功能分析显示，完全未成熟的黄病毒缺乏感染细胞的能力，除非在抗prM抗体存在下，通过抗体依赖性增强感染(ADE)机制(9,10)。ADE在登革热发病机制中扮演重要角色，受到抗体浓度与病毒颗粒成熟状态的调控，如西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)所示(11)。

黄病毒属类病毒颗粒(VLP)已被证明是潜在的候选疫苗，因为其有序结构与病毒颗粒套膜中者类似，且亦经历低pH-诱导的重组与膜融合作为病毒颗粒(12-14)。因此，发明人推测VLP成熟的过程可能类似于DENV病毒体颗粒的过程，从而VLP可能取决于prM的切割程度而类似地以异源性群体分泌。为此，发明人构建了具有prM氨基酸序列的登革热VLP，其最易于被切割或最抵抗被切割，且发明人使用抗原性与结构来鉴定此二种颗粒。由于氨基酸序列除了弗林蛋白酶切割位点上的突变之外完全相同，发明人假设抗体结合或中和活性的差异为高度结构依赖性的。在本报告中，发明人提供了VLP分类为融合前病毒颗粒结构，且具有诱发交叉反应中和抗体的能力的证据。

以下所述术语“E蛋白”是指病毒或其类病毒颗粒的套膜蛋白。在某些特定段落中，所述“E蛋白”是指登革热病毒或其类病毒颗粒的套膜蛋白。

以下所述术语“M蛋白”是指病毒或其类病毒颗粒的膜蛋白。在某些特定段落中，所述“M蛋白”是指登革热病毒或其类病毒颗粒的膜蛋白。

以下所述术语“prM蛋白”或“pr-M蛋白”是指病毒或其类病毒颗粒的前膜蛋白。换言之，prM蛋白指称M蛋白的切割前型态。在某些特定段落中，所述“prM蛋白”或“pr-M蛋白”是指登革热病毒或其类病毒颗粒的前膜蛋白。

术语“切割前型态”是指描述上述M蛋白质的pr部分未被切割，而pr部分保留的的状态。具体地说，例如，如上所述，pr部分在释出过程中被切割。因此，pr部分在释出过程中被切割之前，M蛋白处于其切割前型态。

以下所述术语“pr-M接位”或“prM接位”是指prM蛋白的一区域或肽，其为细胞蛋白酶所辨识并切割以除去prM蛋白的pr部分，并使其成为成熟的M蛋白。术语“pr部分”为在释出过程期间被移除、切下或切割的prM蛋白质的多肽片段。具体而言，“pr-M接位”参照图1(A)所示的P1至P10。

以下所述术语“prM/E比率”是指所讨论的类病毒颗粒群的prM蛋白量与E蛋白量的比率。较佳地，所述prM/E比率可以本说明书中揭示的方法，经由ELISA或西方墨点法测定。

以下所述术语“M/E比率”是指所讨论的类病毒颗粒群的M蛋白量与E蛋白量的比率。较佳地，所述M/E比率可以本说明书中揭示的方法，经由ELISA或西方墨点法测定。或者，所述M/E比率可由所讨论的相同类病毒颗粒群所测定的prM/E比率计算，例如通过下式计算：1-(prM/E比率)。

“50％FRμNT效价”是指当进行焦点-减少微中和测试(即FRμNT)时，本领域中众所周知的含义。叙述“可于稀释比率1:60中和……”或类似叙述，是指去描述可于稀释比率1:60或其更低稀释比率如1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:5或1:1时达到中和。类似地，“可于稀释比率1:100中和……”或类似叙述，是指去描述可于稀释比率1:100或其更低稀释比率如1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:5或1:1时达到中和；“可于稀释比率1:70中和……”或类似叙述，是指去描述可于稀释比率1:70或其更低稀释比率如1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:5或1:1时达到中和。描述“可于0.24至0.58μg/mL中和……”或类似描述，是指去描述在FRμNT试验中，可于指定浓度下达到中和。

本发明的一态样为提供一种类病毒颗粒、编码其的表达载体与包含其的组合物。所述类病毒颗粒包含具有切割前型态的RUXRKKVVMT的pr-M接位的膜蛋白；其中所述U为K或R，且所述X为S或A。在一个较佳具体实施例中，所述pr-M接位包含SEQ ID NO：05、SEQ IDNO：09或SEQ ID NO：13。在另一较佳具体实施例中，所述表达载体包含SEQ ID NO：16。

通常一类病毒颗粒含有多于一个的膜蛋白，且多于一个以其切割前型态存在的pr部分。在一个较佳具体实施例中，本发明的类病毒颗粒可进行其大部分pr部分的切割。在另一个具体实施例中，所述大部分切割是指至少70％的切割效率。在较佳具体实施例中，pr部分的切割效率为至少70％、80％或90％。在更佳具体实施例中，pr部分的切割效率为100％。

在另一具体实施例中，包含本发明类病毒颗粒的所述组合物可进一步包含医药上可接受的载体或医药上可接受的佐剂。所述组合物可用于制备抗血清或抗体，其能中和受试者的登革热病毒。在一较佳具体实施例中，所述组合物可用于诱导受试者中的交叉反应中和抗体。在一较佳具体实施例中，所述组合物可用于预防登革热。

如本文所用，术语“医药上可接受载体”旨在包括与医药施予相容的任一与所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂与抗真菌剂、等渗剂与吸收延迟剂等。例如，所述医药上可接受载体可包括但不局限于水、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁，或其组合。

如本文所用，术语“医药上可接受佐剂”旨在包括任一与所有能够增强由活性成分(例如，本发明的类病毒颗粒)所诱发的免疫反应的试剂。例如，所述医药上可接受的佐剂可包括但不限于含有角鲨烯的铝佐剂或水包油型悬浮佐剂(AS03、MF59或类似物)、类铎受体(Toll-like receptor)的配体如CpG与3-O-脱乙酰基-4'-单磷酰基脂质A(MPL)、皂苷类佐剂、聚合物系佐剂如聚-γ-谷氨酸，以及多糖如几丁质与菊糖。

本发明的另一态样是有关一种制造抗血清或抗体的方法、由该方法制造的抗血清或抗体，以及包含其的组合物。

制造抗血清的方法包含施予动物本发明的所述类病毒颗粒；并收集所述动物的血清。在另一具体实施例中，所述施予可通过肌内注射来完成。在一较佳具体实施例中，所述类病毒颗粒在使用前配制成组合物。在一更佳具体实施例中，所述类病毒颗粒配制为具有医药上可接受载体或医药上可接受佐剂的所述本发明组合物。在另一具体实施例中，所述收集可藉由本领域习知且已常用的任何手段来完成。

在另一具体实施例中，所述抗血清是以酶联免疫吸附试验(ELSIA)或FRμNT进行评估。在一较佳具体实施例中，所述抗血清能以1:60的稀释比率，中和至少两种50％FRμNT效价的登革热病毒血清型；其中所述多于两种的血清型是选自于登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型与登革热病毒第4型。

在另一较佳具体实施例中，所述抗血清能以1:100的稀释比率，中和至少两种50％FRμNT效价的登革热病毒血清型；其中所述多于两种的血清型是选自于登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型与登革热病毒第4型。在另一较佳具体实施例中，所述抗血清可以1:70的稀释比率，中和50％FRμNT效价的登革热病毒第1型、登革热病毒第2型与登革热病毒第4型。在一更佳具体实施例中，所述抗血清可以1:60的稀释比率，中和50％FRμNT效价的登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型与登革热病毒第4型。

制造抗体的方法包含施予动物本发明的类病毒颗粒；并自所述动物分离抗体。在另一具体实施例中，所述抗体从所述动物的血液或脾脏中分离出。在另一具体实施例中，收取所述动物的脾细胞并与骨髓瘤细胞融合。在一较佳具体实施例中，所述抗体于0.24至0.58μg/mL能中和50％FRμNT效价的登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型与登革热病毒第4型。

在另一具体实施例中，所述施予可经由肌内注射来完成。在一较佳具体实施例中，所述类病毒颗粒在使用前配制成组合物。在一更佳具体实施例中，所述类病毒颗粒配制为具有医药上可接受载体或医药上可接受佐剂的所述本发明组合物。在另一具体实施例中，所述分离可藉由本领域众所周知且已常用的任何手段来完成。

在一较佳具体实施例中，本发明提供一种经分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，其包含：至少一含有GYTFTEYT(SEQ ID NO:19)的重链互补决定区1(H-CDR1)、至少一含有INPNNGGTT(SEQ ID NO:20)的重链互补决定区2(H-CDR2)、至少一含有VRYGGYYVFDY(SEQ ID NO:21)的重链互补决定区3(H-CDR3)、至少一含有KSVSTSGYSY(SEQ ID NO:22)的轻链互补决定区1(L-CDR1)、至少一含有LVS(SEQ ID NO:23)的轻链互补决定区2(L-CDR2)，以及至少一含有QHIRELTRR(SEQ ID NO:24)的轻链互补决定区3(L-CDR3)。在一较佳具体实施例中，所述经分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，包含至少一含有SEQ ID NO:17的重链，以及至少一含有SEQ ID NO:18的轻链。在另一较佳具体实施例中，所述抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分可结合至登革热病毒的E蛋白结构域2。在另一较佳具体实施例中，所述抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分可结合至所述结构域2的W101。术语“W101”是指所述结构域2的第101个氨基酸的色氨酸。

在一较佳具体实施例中，本发明提供一种分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，其包含：至少一含有GYSITSDY(SEQ ID NO:27)的重链互补决定区1(H-CDR1)、至少一含有ISYSGST(SEQ ID NO:28)的重链互补决定区2(H-CDR2)、至少一含有ARSLLPNWYFD(SEQID NO:29)的重链互补决定区3(H-CDR3)、至少一含有KSVSTSGYSY(SEQ ID NO:30)的轻链互补决定区1(L-CDR1)、至少一含有LVS(SEQ ID NO:31)的轻链互补决定区2(L-CDR2)，以及至少一含有QHIRELTRS(SEQ ID NO:32)的轻链互补决定区3(L-CDR3)。在一较佳具体实施例中，所述分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，其包含至少一包含SEQ ID NO:25的重链，以及至少一包含SEQ ID NO:26的轻链。在另一较佳具体实施例中，所述抗登革热病毒抗体与其抗原结合部分可结合至登革热病毒的E蛋白结构域3。在另一较佳具体实施例中，所述抗-登革热病毒抗体或其抗原结合部分可结合至所述结构域3的E311。术语“E311”指称所述结构域3的第311个氨基酸的谷氨酸。

本发明亦提供包含有效量的上述抗体或抗血清的组合物。组合物可进一步包含医药上可接受载体。所述医药上可接受载体的定义如前文所述。所述“有效量”是在施予条件下，足以中和登革热病毒的量。

下面实施例叙述本发明的试验和实验，以进一步解释本发明的特征和优点。应当指出的是，以下实施例为示范性，且不应被用于限制本发明的申请专利范围。

实验1：利用ELISA与西方墨点法进行切割预测及决定prM/E比率

prM蛋白C端主干区含有α-螺旋结构域(MH)，随后为二个跨膜结构域(MT1与MT2)。请见图1A，向下箭头代表prM切割位点。数字代表聚蛋白中氨基酸位置，始于prM的第一个氨基酸，其是依据DENV-2(GenBank登录号：NP_056776；RKERRHEGMTTCTG；SEQ ID NO 01)。

欲决定DENV-2类病毒颗粒(VLP)的prM蛋白切割功效，构筑13个具有不同pr-M接位的VLPs，其是依据DENV-2pr-M接位(GenBank登录号：NP_056776；RKERRHEGMTTCTG；SEQ IDNO 01)。进行ELISA试验，以决定具有前述pr-M接位的VLPs的prM/E比率。prM/E比率愈低，则切割功效愈高。

以ELISA测定的prM/E比率结果标记在图1(B)。依据结果，CFAVp18-E3S、CFAVp18-E3A、及CFAVp18-SR为VLPs中三个切割功效最高者。

欲进一步确认prM的切割，从转染的组织培养液中收取DENV-2VLP，并进一步纯化以用于西方墨点法。其结果与ELISA的一致(图1B)，即prM几乎切割的VLP(pacD2VLP；以CFAVp18-E3S标示于图1B)在颗粒表面上仅保留约10％的pr肽，相较于prM未切割的VLP(pucD2VLP具有pr-M接位(P1-P10)TSERRHEGMT；SEQ ID NO 15)，其prM假设为100％未切割(图2A及表1)。

利用MAb 3H5(具有DENV-2结构域III特异性)与155-49(具有DENV prM特异性)进行进一步ELISA，以显示pacD2VLP与pucD2VLP的E与prM蛋白相对量。结果证实，相较于pucD2VLP，pacD2VLP有极高的切割功效。

表1

将puc D2 VLP的E与prM当作100

将pac D2 VLP的M当作100

鉴于前述，选择表达本发明四种VLP样本的四个质粒(请见SEQ ID NO：16，其为pacD2VLP质粒的全部序列)用于后续实验。本发明四种样本质粒的pr-M接位氨基酸序列显示于下表2。

表2

*数字是指相对于pr-M切割位点的近端方向的氨基酸位置。

实验2：本发明VLPs的免疫原性

欲确认prM切割程度对D2VLP免疫原性的影响，发明人于第0与4周以每只小鼠4μgVLP免疫接种4周大BALB/c小鼠组。本实验中使用的D2VLPs(样本1与样本4)是浓缩与纯化自提纯的上清液。

在第二次免疫接种后4与8周，收集血液样本，并利用ELISA分析个别血清的抗体反应。首先以Bradford试验测定纯化的pucD2VLP与pacD2VLP的总蛋白浓度，接着在2倍系列稀释后进行抗原捕捉ELISA。所有免疫接种pucD2VLP(样本4)与pacD2VLP(样本1)的小鼠对于同源性抗原明显诱发高的抗DENV-2特异性抗体而无统计性差异(图3A)。欲精准量化登革热特异性抗体的量，以个别制备的纯VLPs作为抗原捕捉ELISA的标准品(图3B)。以pacD2VLP疫苗接种的小鼠，在疫苗接种8周后血清的IgG反应显示，对于同源性pacD2VLP抗原的效价(1:15346)，明显比异源性pucD2VLP抗原的更大(1:6381)(图3C，中间图与右图)。

欲严格分析prM切割程度对D2VLP免疫原性的影响，使用个别的小鼠血清进行针对DENV的四种血清型的FRμNT。接受pacD2VLP免疫接种的小鼠血清对于所有DENV血清型(针对DENV-1的50％FRμNT:331，DENV-2:597及DENV-4:141)，可诱发比pucD2VLP疫苗接种组(针对DENV-1的50％FRμNT:100，DENV-2:207及DENV-4:76)更高的中和效价，除了DENV-3以外，其针对pucD2VLP与pacD2VLP疫苗接种组的50％FRμNT效价分别为1:70与1:64(图3D)。

未受限于理论或任何存在的假设，发明人认为由pacD2VLP所诱发的较高中和活性，部分是因抗prM抗体的减少。欲比较不同免疫接种组间的疫苗接种小鼠血清的抗prM抗体比率，发明人首先使用表位阻断ELISA，并比较接受pucD2VLP或pacD2VLP的疫苗接种小鼠血清的抗prM单株抗体(MAb 2H2)阻断抗prM抗体的百分比。结果显示，相较于pucD2VLP疫苗接种组的35.26％，pacD2VLP免疫接种小鼠血清中仅有7.59％的类155-49抗体(图3E)。

此外，欲避免Mab结合时的空间位阻，发明人利用突变三个氨基酸(K26P+K21D+F1A)，进一步生产突变体pucD2VLP(图3F)。接着，测试免疫接种小鼠血清结合至野生型与突变体pucD2VLP的能力。结果亦显示，相较于pucD2VLP疫苗接种组的52.12％，pacD2VLP免疫接种小鼠诱发明显较低比例的类2H2抗体(35.68％)(图3G与图3H)。

实验3：本发明pacD2VLP所生产抗体的纯化

发明人进行融合并由pacD2VLP疫苗接种小鼠的脾细胞生产融合瘤(hybridoma)。在所有筛选的72个融合瘤中，定序二个被选出的MAbs，并分别命名为DM25-3与DM8-6。依据定序结果，DM25-3的重链为：

GEPGTSLKISCKTSGYTFTEYTMYWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGGTTYNQKFKGKATLTVNKSSSIAYMEVRNLTSEDSAVYYCVRYGGYYVFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:17)，且其互补决定区为GYTFTEYT(SEQ ID NO:19)、INPNNGGTT(SEQ ID NO:20)、及VRYGGYYVFDY(SEQ ID NO:21)；以及

轻链为：

TLWKTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRRRGPSSR(SEQ ID NO:18)，且其互补决定区为KSVSTSGYSY(SEQ ID NO:22)、LVS(SEQ ID NO:23)、及QHIRELTRR(SEQ ID NO:24)。

依据定序结果，DM8-6的重链为：

VPELVSFISLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSLLPNWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:25)，且其互补决定区为GYSITSDY(SEQ ID NO:27)、ISYSGST(SEQ ID NO:28)、及ARSLLPNWYFD(SEQ ID NO:29)；以及

轻链为：

DIVMTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK(SEQ ID NO:26)，且其互补决定区为KSVSTSGYSY(SEQ ID NO:30)、LVS(SEQ ID NO:31)、及QHIRELTRS(SEQ ID NO:32)。

利用ELISA结合试验评估二个选出的MAbs对所有四种DENV血清型的反应性如图4A所示。结果显示，DM8-6为血清型特异性MAb，反之DM25-3辨识所有四种DENV血清型。接着，发明人测试所述二个MAbs对所有四种DENV血清型的中和活性。DM8-6于50％FRμNT的浓度0.037μg/mL对DENV-2显示有良好中和活性，但中和其他血清型的能力较差。与ELISA结合试验结果一致的是，DM25-3分别于浓度0.32、0.38、0.24、0.58μg/mL针对DENV-1至DENV-4中和所有四种血清型(图4B)。有趣的是，DM25-3可良好辨识pacD2VLP，但pucD2VLP的辨识较差(图4C)。比较pacD2VLP与pucD2VLP免疫接种后小鼠血清结合活性，观察到pacD2VLP免疫接种小鼠的结合曲线明显不同，其转换为48.5％的类DM25-3抗体(图4D)。然而，分别观察到pacD2VLP与pucD2VLP的抗原结合曲线差异不大，其在pucD2VLP免疫接种小鼠可转换为16％的类DM25-3抗体。

实验4：鉴定DM25-3与DM8-6的表位

欲鉴定DM25-3的表位，进行位点导向式突变反应。发明人不进行枪式随机突变(shot-gun random mutagenesis)，而是聚焦在结构域II上的融合环肽与结构域III上的A股，其被视为是交叉反应性基团/复合体中和抗体的重要结合区。针对此目的，个别的突变体质粒，包括取代基K310E、E311R、Q316P、H317E、F392A、及W101G，可分泌到细胞外，可进一步利用结合ELISA生产表位指纹图(epitope mapping)。结果显示，DM25-3可辨识结构域II融合环肽上的残基101(图5，图4E)。相反地，结构域III上的突变会影响DM8-6结合作用，具体而言为AB环上的残基311。

突变体VLPs的完整性，包括W101G、K310E、及E311R，是进一步以一组DENV-2MAbs确认，包括基团交叉--反应性抗体(4G2、4A1B-9、6B3B-3、6B6C-1、DM25-3、T5-1、DM8-6)，其辨识所有四种主要病源性黄病毒血清型复合物(flavivirus serocomplexes)；复合体交叉反应性抗体(T5-1)辨识所有四种DENV复合体病毒，类型特异性抗体(DM8-6)仅辨识DENV-2。MAbs相对结合能力的决定，是以突变体D2VLPs的OD450除以原始pacD2VLP(表3)。

表3

将pac D2 VLP当作100％，且计算如下：突变体/ori*100

欲进一步确认全病毒颗粒的DM25-3四元结构依赖性表位，生产一重组DENV-2，其是以一致结构域III(PL046cEDIII)替代结构域III，并比较亲代DENV-2病毒株PL046与PL046cEDIII的ELISA结合试验结果。与表位指纹图结果一致的是，当移除结构域III时，观察到DM8-6明显丧失结合DENV-2的能力。令人惊讶的是，亦发现到DM25-3丧失结合PL046cEDIII的能力(图6A)，表示融合环辨识型DM25-3为一E结构域间二聚体抗体。进一步比较PL046与PL046cEDIII的免疫接种后小鼠血清50％FRμNT，观察到pacD2VLP免疫接种小鼠血清有89.1％的结构域间抗体，对比pucD2VLP小鼠的51.1％具有统计显著性(图6B)。

欲更好地理解免疫接种pacD2VLP与pucD2VLP后的B细胞库(repertoires)情况，将取自pacD2VLP或pucD2VLP疫苗接种小鼠脾脏且能结合至DENV-2病毒的脾B细胞分选至十盘96孔培养盘，且每孔仅放入单一个细胞(图7)。藉由分析来自二组别的Ig重链(IgH)与Ig轻链(IgL)基因可变区RT-PCR产物氨基酸序列，源自pacD2VLP免疫接种组的B细胞反应比源自pucD2VLP组的更复杂，特别是IgH的基因座(图4F)。亦分析源自DM25-3的IgH与IgL基因，发现其含有IgHV1-22*01与IgKV3-12*01，将其选殖扩大，如图4F所示。

实验5：本发明VLP的结构分析

DENV VLPs(pacD2VLP)的Cryo-EM分析证实，VLPs具有各种尺寸分布(图8与表4)。以免疫金标记(immunogold labeling)检测VLPs，其颗粒直径为～31nm(图9)，其亦为族群的主波峰。

表4

颗粒尺寸	S-27nm	M-30-32nm	L-35-37nm
				族群(％)	31	43	26

Cryo-EM与3D重建方法显示，VLPs在时具有中空结构与平滑表面(图10与图11)。以原子可溶性E蛋白拟合至cryoEM密度图显示，VLPs依循T＝1的二十面体对称性，且表面具有30个E二聚体次单元(图10B)，亦可在TBEV VLPs发现类似的排列(14)。VLPs结构相较于原生颗粒(6,25)，其明显特征在于，3对称轴处的E蛋白组织模拟病毒颗粒准备融合的融合原状态(fusogenic state)(26)。相较于病毒颗粒的177个氨基酸(44.7％)，VLP的融合原状态模拟显露出更加可接触表位(48.2％；191个氨基酸，其中396个完整E蛋白具有30％溶剂可接触性)，具体而言位于结构域III的融合环区与AB环(图12)。与本研究结果一致的是，DM25-3能中和DENV的所有四种血清型，并可辨识融合环残基101，其位于E二聚体5对称轴附近孔洞周围的突起边缘，其仅可在当病毒颗粒于低pH环境下发生构形改变时显露(图10C)。

近来研究指出，可从登革热病患诱发具有登革热血清复合体广泛反应性的有效中和人类单株抗体，特别是在续发性感染之后(22,23,27)。发明人的发现于此表明，pacD2VLP在结构上模拟其病毒融合原对应体，能诱发具有广泛中和活性的交叉反应性抗体，其在小鼠疫苗接种血清中主要占48％。与病毒颗粒不同的是，VLP的E二聚体堆积可提供一独特开放空间结构，其特征为增加表位可接触性，这先前在28℃与中性pH环境下的成熟病毒颗粒中被认为是隐蔽的。藉由将那些E二聚体依赖性四元表位迭加至VLP(23,28,29)，那些抗体的结合足迹是高度重迭，且在VLPs上形成“中和作用感应位点”(图10D、图13)。pacD2VLP在诱发更高与更广泛免疫反应的机制上是至少通过：(1)表位可接触性控制中和抗体的诱发；(2)移除位于含prM结构上的诱骗表位(decoy epitope)如pucD2VLP，其易诱发辨识prM的抗体。总结，作为疫苗候选的另一选择，VLP疫苗的优势在于高度免疫原性、非感染性、及易于品质控制与大量生产。pacD2VLP的独特性质使其成为探索通用型登革热旅游疫苗及第二代登革热疫苗的可能的极佳模式系统。

材料及方法

病毒、细胞与抗体

本文所使用的DENV血清型1-4分别包括Hawaii、16681、H87与H241。COS-1(ATCCCRL 1650；ATCC)与C6/36细胞是培养于Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM,Gibco,LifeTechnologies,Grand Island,NY)，其补充10％热失活胎牛血清蛋白(FBS，Hyclone,ThermoFisher,MA)、0.1mM非必需氨基酸(Gibco,Life Technologies,Grand Island,NY)、7.5％NaHCO₃、100U/ml青霉素与100ug/ml链霉素。5％FBS是用于vero细胞。除了C6/36细胞是维持在无CO₂的28℃以外，其他细胞维持在5％CO₂的37℃。由感染性殖株生产的亲代DENV-2病毒株PL046，与结构域III交换的PL046，其中DENV-2的结构域III经前述的共有序列替代(H.Chen等人，ArchVirol158,1523(2013))，是由中国台湾中央研究院的YL Lin博士提供。

可辨识DENV-2prM的鼠类单株抗体(Mab)2H2、仅辨识DENV-2的血清型特异性单株抗体3H5-1抗体、DENV-1至4的兔血清与小鼠高度免疫腹水(MHIAF)，是由其中一位作者GJChang提供(DVBD,CDC,Fort Collins,CO)。一组DENV-2鼠类单株抗体，包括辨识所有四种主要致病性黄病毒血清型复合体的基团-交叉-反应抗体(4G2、4A1B-9、6B3B-3、6B6C-1、DM25-3、T5-1、DM8-6)；辨识所有四种DENV复合病毒的复杂交叉反应抗体(T5-1)，以及如前述的仅辨识DENV-2的类型特异性抗体(DM8-6)(参考文献#20)，亦由其中一位作者GJ Chang提供。辨识DENV-2prM的MAb 155-49取自HY Lei(中国台湾国立成功大学)。依据制造商的说明，利用EZ-Link^TMSulfo-NHS-Biotin套组(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rockford,IL)，亦将MAbs 155-49标记生物素。为了增加对M蛋白的辨识，抗M抗体的生产是如分子选殖手册所述，藉由将完整M蛋白序列选殖至pET21a(Novagen,Germany)上，并在变性条件下进行纯化。具有完全弗氏佐剂(complete Freud’s adjuvant)的10μg经纯化M蛋白，是用于以腹腔注射途径于2周间隔进行五次免疫接种小鼠，并收集最终的血清。抗B220抗体与IgG是购自AbCam。

先前构筑与鉴定的表达DENV-2亚洲1基因型16681病毒株的prM与80％套膜蛋白的重组质粒pVD2i(H.Hughes et al.,Virol J9,115(2012))，是使用于本试验中，并称作pVD2。依据制造商流程藉由使用定点突变技术将prM的菊糖切割位点于pVD2上进行突变，以生产未切割的prM质粒，如前述或图1所示(Stratagene,La Jolla,CA)。表5提供用于选殖与定点突变的引物。所有质粒皆经定序完整转录子，以确认不含指定之外的其他突变。

表5

黄病毒pr/M位点的序列分析

黄病毒prM蛋白序列比对是以ClustalX 2.1软体进行，其具下列序列：登革热病毒血清型2(NP_056776)、登革热病毒血清型1(AIU47321)、登革热病毒血清型3(YP_001621843)、登革热病毒血清型4(NP_073286)、日本脑炎病毒(NP_775664)、圣路易斯脑炎病毒(AIW82235)、西尼罗病毒(AIO10814)、蜱传脑炎病毒(NP_775501)、黄热病毒(NP_041726)、细胞融合剂病毒(NP_041725)、兹卡病毒(BAP47441.1)。以PiTou 2.0软体组(2)针对pr/M连接区的序列进行评分，预测其可被弗林蛋白酶(furin)切割的程度(www.nuolan.net/reference.html)。负分表示预测不被弗林蛋白酶切割的序列，而正分表示弗林蛋白酶可切割性的预测。

抗原制造与VLP纯化

欲制造VLP抗原，密度1.5×10⁷个细胞/mL的COS-1细胞是以30μg的各pVD2质粒进行电穿孔，其是依据先前描述流程进行(G.Chang et al.,J Virol74,4244(2000))。在电穿孔后，将细胞接种到含有15mL生长培养基的75-cm²培养瓶(Corning Inc.,Corning,NY,USA)中，并使其在37℃下恢复隔夜。生长培养基于隔日置换，使用含有补充NEAA、GlutaMAX、丙酮酸钠与胆固醇(Gibco,Life Technologies,Grand Island,NY)的无血清培养基(SFM4MegaVirTM,SH30587.01,Hyclone,ThermoFisher)，细胞于28℃的5％CO₂下持续培养，以分泌VLP。转染后3天收取组织培养基，并在具有AF-5004CA转子的Kubota 3740离心机(Kubota，Tokyo，Japan)中，于8,000×g、4℃下离心30分钟使其澄清。所得的培养基首先以100K Amicon超离心过滤器(Merck Millpore，CA)浓缩20倍，之后于20％蔗糖中缓冲，在Beckman SW28转子中，以4℃、28,000rpm超高速离心16小时，之后将每1公升收取的培养基于4℃下重新悬浮于250μl TNE缓冲液(50mM Tris-HCl、100mM NaCl、0.1mM EDTA，以及pH7.4)中隔夜。藉由在4℃的5至25％蔗糖梯度中，以25,000rpm进行速率区带离心3小时，进一步纯化VLPs。所有梯度均使用TNE缓冲液制备，并于Beckman SW41转子中进行离心。经由向上置换收集0.5ml分液，并进行抗原捕获ELISA试验。对于需要高度纯化材料的实验而言，在抗原捕获ELISA试验中具有最高OD前6名的VLPs，在Beckman SW41转子中，于4℃以40,000rpm的转速沉淀4小时，并重新悬浮于总共250μl的TNE缓冲液中。蛋白质浓度藉由Bradford测定法(BioRad,Hercules,CA)测量，其是依据市售流程，以牛血清白蛋白(BSA，New England Biolabs,MA)作为标准品测量。按照制造商流程，经纯化的VLPs亦以萤光标记，用于进行抗原特异性B细胞分选(S.Zhang et al.,J Virol Methods167,172(2010))。

ELISA

prM相对于E蛋白的比例是经由将VLP捕获至涂布DENV-2免疫兔血清的培养盘上来测量，且DENV-2E蛋白以MAb3H5(具有DENV-2结构域III特异性)，以及prM蛋白以mAb 155-49(具有DENV prM特异性)，通过ELISA测量。所述比例以prM吸光值/E蛋白吸光值计算。prM未切割的VLP(pucD2VLP)，其包含在P1与P2位点处有氨基酸突变，分别为氨基酸残基R/K突变为T/S(L.Li et al.,Science319,1830(2008))，是使用作为计算prM切割百分比的标准。之后参考pucD2VLP计算prM的切割百分比，如前述假定pucD2VLP为100％未切割(W.Dejnirattisai et al.,Nat Immunol16,170(2015))。

进行抗原捕获ELISA以定量不同VLP抗原的量。简言之，将平底96孔MaxiSorp^TMNUNC-免疫培养盘(NUNC^TM,Roskilde,Denmark)涂布50μL兔抗DENV-2VLP血清，其以1:500的比率溶于碳酸盐缓冲液(0.015M Na₂CO₃，0.035NaHCO₃，pH 9.6)中，在4℃培养隔夜，且各孔在37℃下以200μL的溶于PBS的1％BSA溶液(1％PBSB)阻断1小时。收取的澄清抗原在PBSB中滴定2倍量，并以50μL两次添加至各孔中，在37℃培养2小时，并使用200μL含有0.1％Tween-20的PBS溶液(0.1％PBST)清洗五次。使用正常的COS-1组织培养液与细胞沉淀物作为对照组抗原。捕获的抗原藉由加入以1：2,000的比率溶于阻断缓冲溶液中的50μL抗DENV-2MHIAF、在37℃培养1小时，并洗涤5次以侦测。将以1:5,000溶于阻断缓冲溶液的50μL HRP-共轭山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch,Westgrove,PA,USA)加入各孔中，并在37℃下培养1小时，以侦测MHIAF。随后，将培养盘洗涤10次。结合的共轭物以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺受质(EnhancedTMB,Corp.,Lexington,KY,USA)，在室温下培养10分钟，并以2N H₂SO₄终止反应而侦测。反应于A₄₅₀，使用Sunrise^TMTECAN微盘读取仪(Tecan,Austria)测量。侦测pucD2VLP或pacD2VLP的捕捉抗原能力ELISA试验，是针对经纯化的D2VLP滴定，且在已知各制备物的总蛋白浓度条件下进行。

使用总IgG ELISA，采用与上述相同的抗原捕获ELISA流程并进行些许修改，以测定接种后小鼠血清中抗原特异性总IgG的存在。以等量的抗原，配合纯抗原的标准曲线进行测定，并采用S形剂量-反应方程式，所使用的软体为GraphPad Prism version 6.0(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA,USA)。将来自具有相同免疫接种排程，初始稀释比率为1：1,000的小鼠汇集血清滴定2倍，并二重复加入各孔中，并在37℃下培养1小时。涵盖预接种小鼠血清以作为阴性对照组。共轭物与受质的培养依据上述标准Ag-捕获ELISA进行。OD₄₅₀值以log 10血清稀释度的非线性函数模拟，使用来自两个独立实验的S形剂量-反应(可变斜率)方程式与终点抗体效价，以其OD值为阴性对照组平均OD值的两倍时进行测定。

进行表位-阻断ELISA，以测定疫苗接种小鼠对prM蛋白的反应。此设定类似于总IgG ELISA，其中将盘以兔抗DENV-2VLP血清涂覆，并以含1％BSA的PBS进行阻断。洗涤后，将汇集的血清以1:40的比率稀释于阻断缓冲液中，并与pucD2VLP抗原(预先滴定至OD 1.0)，于37℃下培养1小时。在血清培养与洗涤之后，于各孔中加入经由EZ-Link Sulfo-NHS-生物素(ThermoFisher，CA)而与生物素结合的Mab 155-49的1:4,000稀释液，在37℃下培养1小时，以与来自免疫小鼠血清的已结合抗体竞争DENV-2VLP抗原。以1：1000HRP-结合的链霉亲和素蛋白(016-030-084,Jackson ImmunoResearch)侦测结合的共轭物，并在37℃培养1小时。以PBS彻底清洗10次后，将TMB受质加入孔中，将培养盘培养10分钟，并以2N H₂SO₄终止。反应是于A₄₅₀测量。阻断百分比是以比较重复孔的生物素-共轭MAb竞争吸收前的原始小鼠血清，使用公式：％阻断＝[1-(免疫血清的OD–免疫前血清OD)/(生物素共轭MAb的OD–免疫前血清的OD)]×100来测定。

ELISA结合试验是用于评估MAbs或小鼠免疫化血清对于D2VLP与突变抗原的结合活性，使用与上述抗原捕获ELISA流程相同的设定，除了以特异性MAb或免疫小鼠血清的两倍稀释物取代抗DENV-2 MHIAF之外。利用纯的D2VLP，将两种D2VLP抗原标准化为等量。测定抗体终点反应性，以确定终点抗原分泌效价。

SDS-PAGE与西方墨点法

将经纯化VLPs的5μg蛋白与5μl样本缓冲液混合，并于12％Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶体电泳(Tricine-SDS-PAGE)分离(H.Nat Protoc1,16(2006))。在免疫侦测方面，使用2胶体转移装置(IB21001，ThermoFisher Scientific)，将蛋白质自胶体上转印至NC膜上(IB23002,2NC mini stacks,ThermoFisherScientific)。于室温下含有5％脱脂牛奶(Cat No.232100,BD biosciences,CA)的磷酸缓冲生理食盐水(pH 7.4)中培养1小时，以阻断非特异性结合，之后将膜于蛋白质标记物(26616，ThermoFisher Scientific)40kDa与5kDa处切成三片，用于个别染色E、prM与P蛋白，分别使用以1:2000稀释的抗DENV2 MHIAF、0.5μg/ml的抗DENV prM MAb 155-49，以及以1:25稀释的小鼠抗M血清，于4℃进行隔夜。之后膜每次15分钟洗涤三次，特异性结合的免疫球蛋白以HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG(Cat No:115-035-146,Jackson ImmunoReasearch,PA)辨识，并以ECL(Cat No:RPN2235，GE Healthcare,UK)依据制造商流程显色。讯号是以ImageQuant^TM LAS4000 mini(GE Healthcare)侦测。然而，M蛋白是以TMB膜过氧化酶受质(Cat No:50-77-03，KPL,MD)显色，以避免ECL的高背景值。

小鼠实验

本研究依循中国台湾国家实验动物中心实验动物照护与使用指南进行。动物使用方案是经国立中兴大学动物照护与使用委员会(IACUC)审核通过(批准文号：101-58)。尽一切努力减少小鼠痛苦。在第0与4周，将每组四只4周大雌性BALB/c小鼠肌肉注射pucD2VLP与pacD2VLP，剂量为4μg/100μLPBS，并区分左右四头肌。在免疫接种前及第二次注射后4、8、12周，从小鼠眼眶后静脉采血，并利用ELISA与FRμNT评估个别小鼠血清的DENV-2特异性抗体，如下节所述。因小鼠血清体积有限，故将各组小鼠血清汇集，用于prM特异性与E二聚体特异性抗体检测。

病毒中和作用

利用前述焦点减少微中和测试(FRμNT)测定免疫接种小鼠血清对多个代表性DENV-2基因型病毒株的中和能力。简言之，将每孔2.475×10⁴个Vero细胞种于平底96孔细胞培养盘(Corning Inc.,Corning,NY,USA)，并于5％CO₂下以37℃隔夜培养16h。汇集的血清初步以1:10稀释，在56℃下加热失活30min，滴定二倍量至40μL体积，并将320pfu/40μL的DENV-1至4加入各稀释液。混合物随后在37℃下培养1h。在培养后，将25μL的免疫复合物以二重复方式接种于含有Vero细胞单层的培养盘中。培养盘在5％CO₂下以37℃培养1h，且每10分钟摇动使其感染。将含有1％甲基纤维素(Sigma-Aldrich Inc.,St.Louis,MO,USA)与2％FBS的DMEM覆盖培养基加入，且培养盘在5％CO₂下以37℃培养。在48小时后清洗培养盘，以溶于PBS的75％丙酮固定，并干燥。进行免疫染色，是以1:600比率将血清型特异性MHIAF加入溶于0.1％PBST的5％牛奶中，并于37℃下培养60min，清洗及以1:100比率加入含有山羊抗小鼠IgG-HRP且溶于0.1％PBST的5％牛奶中，且在37℃下培养45min。依据制造商说明以过氧化酶受质套组VIP SK-4600(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA,USA)观察感染位点(foci)。计算各病毒相对于仅病毒对照组反滴定(back-titration)的FRμNT效价。以S型剂量反应(可变斜率)公式模拟准确50％感染位点减少(FRμNT50)的效价。所有数值皆取自二独立实验的平均值。标靶病毒为：DENV-1，病毒株Hawaii；DENV-2，病毒株16681；DENV-3，病毒株H87；以及DENV-4，病毒株H241。在计算几何平均效价(GMT)以图形显示与统计分析中，FRμNT50效价<10者是分别以1与5等数值表示。

生产融合瘤及Mab筛选

由pacD2VLP免疫接种小鼠所生产的融合瘤筛选抗DENV抗体，其是依据标准程序进行(Kohler et al,1975)且稍微调整(Chen et al,2007)。首先，在牺牲前，另以4ug的pacD2VLP加强pacD2VLP免疫接种小鼠。在最终加强后第4天，从免疫接种小鼠脾脏收取脾细胞，并融合NSI/I-Ag4-1骨髓瘤细胞，是使用抗体传输套组(GenomONETM-CF HVJ EnvelopeCell Fusion Kit,Gosmo Bio Co,ISK10MA17)。将融合细胞团块再悬浮于DMEM，其中补充15％FBS、次黄嘌呤-胺基蝶呤-胸苷培养基、及融合瘤选殖因子(ICN,Aurora,OH)。如前述，利用抗原捕捉ELISA，筛选分泌MAbs的融合瘤植株。DENV-2病毒的C6/36培养基上清液的使用浓度为标准化OD 1.0，并以各融合瘤植株培养基上清液替代MHIAF。以有限稀释方式次选殖所选的阳性植株。以异十八烷(pristane)引发的BALB/c小鼠可生产腹水。融合瘤细胞株生长于含有10％热失活FBS的DMEM。MAbs是以亲和性蛋白质G Sepharose 4B胶体纯化，并比对标准IgG的量以ELISA定量纯化的MAbs。

分析单一B细胞的prM/E特异性Ig基因

将单一B细胞的Ig基因分离，其基本上依循先前报告所建立的方法，且些许调整。简言之，从免疫接种的BALB/c小鼠脾脏收集单一细胞悬液，所述小鼠于第4周时分别肌肉注射pucD2VLP与pacD2VLP两次。利用流式细胞术(FACSAria II)分离D2VLP(+)、B220(+)、及IgG1(+)脾脏B细胞，并将单一B细胞分选至96孔PCR培养盘，其含有每孔4ul的冰冷无RNase水并补充10mM DTT与3U RNase抑制剂(Promega)。进行RT-PCR反应，是使用Qiagen OneStepRT-PCR套组(Qiagen)，条件为50℃30min，之后95℃15min，接着为40次循环的95℃1min、55℃1min与72℃1min，最后在72℃下培养5min，其中引物如前述。以2ul未纯化的第一回PCR产物进行巢式PCR，条件为95℃1min，接着为40次循环的95℃30sec、57℃(IgH)或45℃(Igk)或55℃(Igλ)30sec、72℃45sec，并在72℃下培养10min，如前述。将巢式PCR产物分液定序，并以IMGT/V-Quest(http://www.imgt.org)分析，以确认胚是V、D、及J基因的最高同源基因座。随后，将Ig基因转译，并以CLUSTALW比对，以界定选殖放大的Ig基因。

CryoEM与3D重建

将新鲜制备的登革热病毒样本(～3μl)置于辉光放电型Quatifoil 2/2格(Quatifoil GmbH,Germany)中，以滤纸转染，并以Gatan CP3浸入以液态氮冷却的液态乙烷中。以JEOL2100F场发射枪透视电子显微镜纪录CryoEM影像，并使用加速电压200kV与放大倍率15,000x的直流电子检测器(DE-12Camera System-Direct Electron，LP)，其中像素尺寸为6μm(其对应的样本程度为)。彼等影像所测得的散焦值范围为-2μm至-4.5μm。造影电子剂量为以EMAN2进行影像处理{Tang,2007#3}。重建过程在无法取得改进时结束(图6)。以EMAN2评估最终重建解析度，其是藉由傅立叶壳相关曲线(Fourier shell correlation curve)，并比较随机选取的“奇数”与“偶数”颗粒的两重组数据。使用fsc曲线降至0.5者于评估解析度(图6)。利用UCSF Chimera将DENV2(PDB code:3J27)的cryoEM结构手动拟合至DENV2VLP密度图。以POPS程式计算pacD2VLP上个别氨基酸分子的溶剂可及表面积(SASA)(A.Fornili et al.,Methods Mol Biol819,375(2012))。

统计分析

所有数据皆以平均值±标准误差表示，并以GraphPad Prism 6.0版分析。利用未配对t检定进行二组间数据组分析。亦采用Mann-Whitney U检定解释一些转换数据的非常态性。P值<0.05视为具有显著性。

参考文献

1.B.D.Lindenbach,C.M.Rice,Flaviviridae:The viruses and theirreplication,p.991-1110.In D.M.Knipe and P.M.Howley(ed.)Fields'Virology,4thed.Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.,(2001).

2.S.Bhatt et al.,The global distribution and burden of dengue.Nature496,504(2013).

3.B.Guy,N.Jackson,Dengue vaccine:hypotheses to understand CYD-TDV-induced protection.Nat Rev Microbiol 14,45(2016).

4.A.Wilder-Smith,D.Gubler,PUBLIC HEALTH.Dengue vaccines at acrossroad.Science 350,626(2015).

5.L.Li et al.,The flavivirus precursor membrane-envelope proteincomplex:structure and maturation.Science 319,1830(2008).

6.V.Kostyuchenko,Q.Zhang,J.Tan,T.Ng,S.Lok,Immature and mature dengueserotype 1virus structures provide insight into the maturation process.JVirol 87,7700(2013).

7.T.Pierson,M.Diamond,Degrees of maturity:the complex structure andbiology of flaviviruses.Curr Opin Virol 2,168(2012).

8.J.Junjhon et al.,Influence of pr-M cleavage on the heterogeneity ofextracellular dengue virus particles.J Virol 84,8353(2010).

9.W.Dejnirattisai et al.,Cross-reacting antibodies enhance denguevirus infection in humans.Science 328,745(2010).

10.I.Rodenhuis-Zybert et al.,Immature dengue virus:a veiled pathogen？PLoS Pathog 6,e1000718(2010).

11.S.Nelson et al.,Maturation of West Nile virus modulatessensitivity to antibody-mediated neutralization.PLoS Pathog 4,e1000060(2008).

12.S.Allison,K.Stadler,C.Mandl,C.Kunz,F.Heinz,Synthesis and secretionof recombinant tick-borne encephalitis virus protein E in soluble andparticulate form.J Virol 69,5816(1995).

13.J.Schalich et al.,Recombinant subviral particles from tick-borneencephalitis virus are fusogenic and provide a model system for studyingflavivirus envelope glycoprotein functions.J Virol 70,4549(1996).

14.I.Ferlenghi et al.,Molecular organization of a recombinantsubviral particle from tick-borne encephalitis virus.Mol Cell 7,593(2001).

15.T.Chambers,D.McCourt,C.Rice,Production of yellow fever virusproteins in infected cells:identification of discrete polyprotein species andanalysis of cleavage kinetics using region-specific polyclonalantisera.Virology 177,159(1990).

16.M.Crabtree,R.Sang,V.Stollar,L.Dunster,B.Miller,Genetic andphenotypic characterization of the newly described insect flavivirus,KamitiRiver virus.Arch Virol148,1095(2003).

17.J.Junjhon et al.,Differential modulation of prM cleavage,extracellular particle distribution,and virus infectivity by conservedresidues at nonfurin consensus positions of the dengue virus pr-M junction.JVirol 82,10776(2008).

18.P.Keelapang et al.,Alterations of pr-M cleavage and virus exportin pr-M junction chimeric dengue viruses.J Virol 78,2367(2004).

19.S.Tian,W.Huajun,J.Wu,Computational prediction of furin cleavagesites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases.SciRep 2,261(2012).

20.W.Crill,H.Hughes,M.Delorey,G.Chang,Humoral immune responses ofdengue fever patients using epitope-specific serotype-2 virus-like particleantigens.PLoS One 4,e4991(2009).

21.Z.Wang et al.,Obstruction of dengue virus maturation by Fabfragments of the 2H2 antibody.J Virol 87,8909(2013).

22.W.Dejnirattisai et al.,A new class of highly potent,broadlyneutralizing antibodies isolated from viremic patients infected with denguevirus.Nat Immunol 16,170(2015).

23.A.Rouvinski et al.,Recognition determinants of broadlyneutralizing human antibodies against dengue viruses.Nature 520,109(2015).

24.J.Aaskov,H.Geysen,M.TJ,Serologically defined linear epitopes inthe envelope protein of dengue 2(Jamaica strain 1409).Arch Virol 105,209(1989).

25.X.Zhang et al.,Cryo-EM structure of the mature dengue virus atresolution.Nat Struct Mol Biol 20,105(2013).

26.R.J.Kuhn et al.,Structure of dengue virus:implications forflavivirus organization,maturation,and fusion.Cell 108,717(2002).

27.W.Tsai et al.,High-avidity and potently neutralizing cross-reactive human monoclonal antibodies derived from secondary dengue virusinfection.J Virol 87,12562(2013).

28.S.M.Lok et al.,Binding of a neutralizing antibody to dengue virusalters the arrangement of surface glycoproteins.Nat Struct Mol Biol 15,312(2008).

29.G.Fibriansah et al.,DENGUE VIRUS.Cryo-EM structure of an antibodythat neutralizes dengue virus type 2 by locking E protein dimers.Science 349,88(2015).

序列表

<110> 海乐源有限公司

<120> 登革热类病毒颗粒、登革热病毒抗体、及含其的组合物

<130> WPI17TW0661-CN

<150> US 62/413,597

<151> 2016-10-27

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> Dengue virus

<400> 1

Arg Lys Glu Arg Arg His Glu Gly Met Thr Thr Cys Thr Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 2

Arg Lys Ser Arg Arg His Glu Gly Met Thr

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 3

Arg Lys Ser Arg Arg Arg Glu Gly Met Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 4

Arg Lys Ser Arg Lys Lys Glu Gly Met Thr

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 5

Arg Lys Ser Arg Lys Lys Val Val Met Thr

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 6

Arg Lys Ala Arg Arg His Glu Gly Met Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 7

Arg Lys Ala Arg Arg Arg Glu Gly Met Thr

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 8

Arg Lys Ala Arg Lys Lys Glu Gly Met Thr

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 9

Arg Lys Ala Arg Lys Lys Val Val Met Thr

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 10

Arg Arg Ser Arg Arg His Glu Gly Met Thr

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 11

Arg Arg Ser Arg Arg Arg Glu Gly Met Thr

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 12

Arg Arg Ser Arg Lys Lys Glu Gly Met Thr

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 13

Arg Arg Ser Arg Lys Lys Val Val Met Thr

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 14

Arg Arg Ala Arg Arg His Glu Gly Met Thr

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 15

Thr Ser Glu Arg Arg His Glu Gly Met Thr

1 5 10

<210> 16

<211> 5020

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> plasmid

<400> 16

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accgccgccg ccatgggcaa gaggtccgcc ggctcaatca tgtggctcgc gagcttggca 780

gttgtcatag cttgtgcagg cgccttccat ttaaccacac gtaacggaga accacacatg 840

atcgtcagca gacaagagaa agggaaaagt cttctgttta aaacagagga tggcgtgaac 900

atgtgtaccc tcatggccat ggaccttggt gaattgtgtg aagacacaat cacgtacaag 960

tgtccccttc tcaggcagaa tgagccagaa gacatagact gttggtgcaa ctctacgtcc 1020

acgtgggtaa cttatgggac gtgtaccacc atggtagtaa aaaaaagatc aaaaagatca 1080

gtggcactcg ttccacatgt gggaatggga ctggagacac gaactgaaac atggatgtca 1140

tcagaagggg cctggaaaca tgtccagaga attgaaactt ggatcttgag acatccaggc 1200

ttcaccatga tggcagcaat cctggcatac accataggaa cgacacattt ccaaagagcc 1260

ctgattttca tcttactgac agctgtcact ccttcaatga caatgcgttg cataggaatg 1320

tcaaatagag actttgtgga aggggtttca ggaggaagct gggttgacat agtcttagaa 1380

catgggagct gtgtgacgac gatggcaaaa aacaaaccaa cattggattt tgaactgata 1440

aaaacagaag ccaaacagcc tgccacccta aggaagtact gtatagaggc aaagctaacc 1500

aacacaacaa cagaatctcg ctgcccaaca caaggggaac ccagcctaaa tgaagagcag 1560

gacaaaaggt tcgtctgcaa acactccatg gtagacagag gatggggaaa tggatgtgga 1620

ctatttggaa agggaggcat tgtgacctgt gctatgttca gatgcaaaaa gaacatggaa 1680

ggaaaagttg tgcaaccaga aaacttggaa tacaccattg tgataacacc tcactcaggg 1740

gaagagcatg cagtcggaaa tgacacagga aaacatggca aggaaatcaa aataacacca 1800

cagagttcca tcacagaagc agaattgaca ggttatggca ctgtcacaat ggagtgctct 1860

ccaagaacgg gcctcgactt caatgagatg gtgttgttgc agatggaaaa taaagcttgg 1920

ctggtgcaca ggcaatggtt cctagacctg ccgttaccat ggttgcccgg agcggacaca 1980

caagggtcaa attggataca gaaagagaca ttggtcactt tcaaaaatcc ccatgcgaag 2040

aaacaggatg ttgttgtttt aggatcccaa gaaggggcca tgcacacagc acttacaggg 2100

gccacagaaa tccaaatgtc atcaggaaac ttactcttca caggacatct caagtgcagg 2160

ctgagaatgg acaagctaca gctcaaagga atgtcatact ctatgtgcac aggaaagttt 2220

aaagttgtga aggaaatagc agaaacacaa catggaacaa tagttatcag agtgcaatat 2280

gaaggggacg gctctccatg caagatccct tttgagataa tggatttgga aaaaagacat 2340

gtcttaggtc gcctgattac agtcaaccca attgtgacag aaaaagatag cccagtcaac 2400

atagaagcag aacctccatt cggagacagc tacatcatca taggagtaga gccgggacaa 2460

ctgaagctca actggtttaa gaaaggaagc acgctgggca aggccttttc aacaactttg 2520

aagggagctc aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga 2580

ggggtcttca actccatagg aaaagccgtt caccaagtgt ttggtggtgc cttcagaaca 2640

ctctttgggg gaatgtcttg gatcacacaa gggctaatgg gtgccctact gctctggatg 2700

ggcgtcaacg cacgagaccg atcaattgct ttggccttct tagccacagg gggtgtgctc 2760

gtgttcttag cgaccaatgt gcatgcttaa ttagtttgag cggccgctcg agtctagagg 2820

gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt 2880

ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta 2940

ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg 3000

ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc 3060

ggtgggctct atggcttcta ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca 3120

gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttctcg 3180

ccgccaagga tctgatggcg caggggatca agctctgatc aagagacagg atgaggatcg 3240

tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg 3300

ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg 3360

ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat 3420

gaactgcaag acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca 3480

gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg 3540

gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat 3600

gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa 3660

catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg 3720

gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg 3780

cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg 3840

gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat 3900

caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac 3960

cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc 4020

cttcttgacg agttcttctg aattattaac gcttacaatt tcctgatgcg gtattttctc 4080

cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 4140

gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 4200

aataaccctg ataaatgctt caataatagc acgtgctaaa acttcatttt taatttaaaa 4260

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 4320

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 4380

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 4440

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 4500

taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 4560

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 4620

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 4680

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 4740

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 4800

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 4860

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 4920

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 4980

ggttcctggg cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 5020

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody

<400> 17

Gly Glu Pro Gly Thr Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr

1 5 10 15

Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys

20 25 30

Ser Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr

35 40 45

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asn Lys Ser

50 55 60

Ser Ser Ile Ala Tyr Met Glu Val Arg Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser

65 70 75 80

Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Gly Gly Tyr Tyr Val Phe Asp Tyr

85 90 95

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody

<400> 18

Thr Leu Trp Lys Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Thr Arg Arg Arg Gly Pro Ser Ser Arg

100 105

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 19

Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 20

Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr

1 5

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 21

Val Arg Tyr Gly Gly Tyr Tyr Val Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 22

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 23

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 23

Leu Val Ser

1

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 24

Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Arg

1 5

<210> 25

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody

<400> 25

Val Pro Glu Leu Val Ser Phe Ile Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val

1 5 10 15

Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln

20 25 30

Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly

35 40 45

Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg

50 55 60

Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr

65 70 75 80

Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Leu Pro Asn Trp

85 90 95

Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 26

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody

<400> 26

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys

100 105

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 27

Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr

1 5

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 28

Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 29

Ala Arg Ser Leu Leu Pro Asn Trp Tyr Phe Asp

1 5 10

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 30

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 31

Leu Val Ser

1

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 32

Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser

1 5

<210> 33

<211> 131

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 33

acgtgtacca ccatgggaga aaaaaaaaga gaaaaaagat cagtgtggga cgtgtaccac 60

catggtagta aaaaaaagag aaaaaagatc catggtagta aaaaaaagat caaaaagatc 120

agtggcactc g 131

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 34

agaacataga agagaatcaa catcagtggc actcg 35

<210> 35

<211> 121

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 35

agggaaaagt cttctgtttc caacagagga tggcgtgaac cagcagacaa gagaaagggg 60

acagtcttct gtttccaaca gcatagcttg tgcaggcgcc gcccatttaa ccacacgtaa 120

c 121

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 36

tccatggtag acagaggagg gggaaatgga tgtggacta 39

<210> 37

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 37

gacagaggat ggggaaaagg atgtggacta tttgga 36

<210> 38

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 38

agacagagga tggggaaatc aatgtggact atttggaaag g 41

<210> 39

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 39

tctatgtgca caggaaagtt tgaagttgtg aaggaaatag cagaa 45

<210> 40

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 40

acaggaaagt ttaaagttgt ggaggaaata gcagaaacac 40

<210> 41

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 41

caggaaagtt taaagttgtg aagcgaatag cagaaacaca acatgg 46

<210> 42

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 42

aaagttgtga aggaaatagc acgaacacaa catggaacaa tagtt 45

<210> 43

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 43

ttgtgaagga aatagcagaa caccaacatg gaacaatagt tat 43

<210> 44

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 44

gtgaaggaaa tagcagaaac accacatgga acaatagtta tcaga 45

<210> 45

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 45

aaggaaatag cagaaacaca agaaggaaca atagttatca gagtg 45

<210> 46

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 46

gacagaaaaa gatagccggg tcaacataga agcagaacct 40

<210> 47

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 47

ggacaactga agctcaacgg gtttaagaaa ggaagcac 38

<210> 48

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 48

acaactgaag ctcaactggg ctaagaaagg aagcacgctg 40

Claims

1.一种编码具有膜蛋白的类病毒颗粒的表达载体，其中所述膜蛋白在其切割前型态含有一pr-M接位(pr-M junction)RUXRKKVVMT，其中所述U为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，且所述X为丝氨酸(S)或丙氨酸(A)。

2.如权利要求1的表达载体，其中所述pr-M接位包含SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:09、或SEQ ID NO:13。

3.如权利要求1的表达载体，其中该表达载体包含SEQ ID NO:16。

4.一种含有膜蛋白的类病毒颗粒，其中所述膜蛋白在其切割前型态含有一pr-M接位RUXRKKVVMT，其中所述U为K或R，且所述X为S或A。

5.如权利要求4的类病毒颗粒，其中所述pr-M接位包含SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:09、或SEQ ID NO:13。

6.一种组合物，其包含如权利要求4的所述类病毒颗粒及医药上可接受载体或医药上可接受佐剂。

7.如权利要求6的组合物，其中所述pr-M接位包含SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:09、或SEQID NO:13。

8.如权利要求6的组合物，其中所述医药上可接受载体包含水、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、或其组合。

9.如权利要求6的组合物，其中所述医药上可接受佐剂包含铝佐剂、含鲨烯的水包油型悬浮佐剂、类铎受体的配体、皂苷系佐剂、聚合物系佐剂、或其组合。

10.一种分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，其包含：

至少一含有GYTFTEYT(SEQ ID NO:19)的重链互补决定区1(H-CDR1)，

至少一含有INPNNGGTT(SEQ ID NO:20)的重链互补决定区2(H-CDR2)，

至少一含有VRYGGYYVFDY(SEQ ID NO:21)的重链互补决定区3(H-CDR3)，

至少一含有KSVSTSGYSY(SEQ ID NO:22)的轻链互补决定区1(L-CDR1)，

至少一含有LVS(SEQ ID NO:23)的轻链互补决定区2(L-CDR2)，以及

至少一含有QHIRELTRR(SEQ ID NO:24)的轻链互补决定区3(L-CDR3)。

11.如权利要求10的分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，其包含至少一含有SEQ ID NO:17的重链及至少一含有SEQ ID NO:18的轻链。

12.如权利要求10的分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，所述抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分能结合至登革热病毒E蛋白的结构域2。

13.如权利要求12的分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，所述抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分能结合至所述结构域2的W101。

14.一种分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，其包含：

至少一含有GYSITSDY(SEQ ID NO:27)的重链互补决定区1(H-CDR1)，

至少一含有ISYSGST(SEQ ID NO:28)的重链互补决定区2(H-CDR2)，

至少一含有ARSLLPNWYFD(SEQ ID NO:29)的重链互补决定区3(H-CDR3)，

至少一含有KSVSTSGYSY(SEQ ID NO:30)的轻链互补决定区1(L-CDR1)，

至少一含有LVS(SEQ ID NO:31)的轻链互补决定区2(L-CDR2)，以及

至少一含有QHIRELTRS(SEQ ID NO:32)的轻链互补决定区3(L-CDR3)。

15.如权利要求14的分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，其包含至少一含有SEQ ID NO:25的重链及至少一含有SEQ ID NO:26的轻链。

16.如权利要求14的分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，所述抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分能结合至登革热病毒E蛋白的结构域3。

17.如权利要求16的分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分，所述抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分能结合至所述结构域3的E311。

18.一种用于生产抗血清的方法，其包含：施予一动物如权利要求4的类病毒颗粒；以及收集所述动物的血清。

19.如权利要求18的方法，其中所述类病毒颗粒的所述pr-M接位包含SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:09、或SEQ ID NO:13。

20.如权利要求18的方法，其中所述抗血清能以稀释比率1:60中和至少二种50％FRμNT效价的登革热病毒血清型；其中二种以上的血清型是选自于登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型、及登革热病毒第4型。

21.如权利要求20的方法，其中所述抗血清能以稀释比率1:60中和50％FRμNT效价的登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型、及登革热病毒第4型。

22.一种利用如权利要求18的方法生产的抗血清，其中所述抗血清能以稀释比率1:60中和至少二种50％FRμNT效价的登革热病毒血清型；其中二种以上的血清型是选自于登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型、及登革热病毒第4型。

23.如权利要求22的抗血清，其中所述抗血清能以稀释比率1:100中和至少二种50％FRμNT效价的登革热病毒血清型；其中二种以上的血清型是选自于登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型、及登革热病毒第4型。

24.如权利要求22的抗血清，其中所述抗血清能以稀释比率1:70中和50％FRμNT效价的登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、及登革热病毒第4型。

25.如权利要求22的抗血清，其中所述抗血清能以稀释比率1:60中和50％FRμNT效价的登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型、及登革热病毒第4型。

26.一种用于生产抗体的方法，其包含：施予一动物如权利要求4的类病毒颗粒；以及自所述动物分离一抗体。

27.如权利要求26的方法，其中所述类病毒颗粒的所述pr-M接位包含SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:09、或SEQ ID NO:13。

28.如权利要求26的方法，其中所述抗体是分离自所述动物的血液或脾脏。

29.一种利用如权利要求26的方法生产的抗体，其中所述抗体能以0.24至0.58μg/mL中和50％FRμNT效价的登革热病毒第1型、登革热病毒第2型、登革热病毒第3型、及登革热病毒第4型。

30.一种用于治疗登革热病毒的组合物，其包含：

一有效量的如权利要求10的分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分；如权利要求11的分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分；如权利要求14的分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分；如权利要求15的分离的抗登革热病毒抗体或其抗原结合部分；如权利要求22的抗血清、或如权利要求29的抗体；以及

一医药上可接受载体。

31.如权利要求30的组合物，其中所述医药上可接受载体包含水、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、或其组合。