BRPI0815763B1 - Domínio vhh monomérico ou dimérico derivado de anticorpos anti-vp6 de camelídeo, método de produção do mesmo, método de imunodetecção de rotavírus, composição, plasmídeo, vetor de expressão recombinante, células transgênicas de microrganismos, anticorpos, kit para imunodetecção de rotavírus, e sequência de aminoácidos - Google Patents

Abstract

domínio vhh monomérico derivado de anticorpos anti-vp6 de camelídeo, domínio dimérico, método de imunização, método de detecção de rotavírus, composição, métodos de prevenção e tratamento de infecções por rotavírus. a presente invenção refere-se a um domínio vhh monomérico derivado de anticorpos de camelídeo anti-vp6, domínio dimérico, método de imunização, método de detecção de rotavírus, composição de vacina, métodos de prevenção e tratamento para infecções por rotavírus, em que o referido domínio pode ser qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas nas seq id n°: 1, seq id n°: 2, seq id n°: 3 ou seq id n°: 4, e em que os referidos domínios se ligam à proteína vp6 do rotavírus do grupo a.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um domínio VHHmonomérico derivado de anticorpos de camelídeo anti-VP6, domínio dimérico, método de imunização, método de detecção de rotavírus, composições, métodos de prevenção e tratamento para infecções por rotavírus. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um domínio monomérico (VHH) derivado de anticorpos de camelídeo, em que o referido domínio pode ser qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, e em que os referidos domínios se ligam à proteína VP6 do rotavírus do Grupo A.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O rotavírus do Grupo A (RV) é a causa principal de diarreiasevera em crianças e N° jovem de muitas espécies animais de interesse econômico (bovinos, suínos, equinos, camelídeos da América do Sul etc.). Como problema de saúde pública, o RV é a terceira causa mais comum de morte associada à diarreia severa em países em desenvolvimento (2 milhões de mortes por ano). Por outro lado, a diarreia induzida pelo RV em animais destinados ao consumo, por exemplo, bezerros jovens, causa altos custos relacionados à prevenção ou ao tratamento.

[0003] O RV do Grupo A consiste em partículas compostas por umcapsídeo de proteína triplo. A superfície externa do capsídeo é composta por proteínas VP4 e VP7, ambas antígenos altamente variáveis; até o momento, foram descritas pelo menos 27 variantes de VP4 (tipos P) e 16 variantes de VP7 (tipos G). Cada combinação tipo G- P induz anticorpos neutralizantes que possuem baixa reatividade cruzada com outros tipos G-P; por essa razão, é necessário incluir as diferentes cepas que circulam nas espécies-alvo nas vacinas.

[0004] O capsídeo intermediário é composto por proteína triméricaVP6, que representa 51% da massa do vírion. Dependendo da presença ou ausência de dois epitopos diferentes na proteína VP6 (reconhecidos por anticorpos monoclonais mAb 255/60 e 631/9), as cepas de RV do Grupo A são adicionalmente classificadas como subgrupos (Sb) I, II, I+II e noI noII. Os RVs humanos são normalmente Sb II, enquanto os RVs de animais são primariamente Sb I. A proteína VP6 é altamente imunogênica; seres humanos e animais infectados naturalmente desenvolvem uma forte resposta humoral contra epitopos de VP6. Independentemente dos subgrupos mencionados acima, VP6 é uma proteína altamente conservada em todos os RV do Grupo A (>90% de homologia de aminoácidos), e os antígenos comuns compartilhados podem ser detectados por antissoros policlonais amplamente reativos ou anticorpos monoclonais. Portanto, VP6 é o antígeno-alvo na maioria dos testes imunodiagnósticos projetados para detectar RV do Grupo A. Os anticorpos dirigidos contra essa proteína não possuem atividade neutralizante in vitro. N° entanto, anticorpos monoclonais IgA conseguem bloquear a replicação viral intracelularmente em camundongos.

[0005] Atualmente, a prevenção da diarreia induzida pelo RV emanimais se baseia na imunização passiva, enquanto a imunização ativa é usada em seres humanos. Em animais, vacinas parenterais de vírus inativado são aplicadas em fêmeas prenhas, a fim de proteger os neonatos por meio da transferência de anticorpos maternais através do colostro e do leite. Essa estratégia é altamente eficaz na prevenção dos sintomas de diarreia severa e na redução da morbidade e mortalidade nos estoques afetados, mas não é capaz de evitar a infecção por RV, pois não reduz significativamente a quantidade de vírus excretada pelos animais infectados (Parreno, V.C. e outros, Vet. Immunol. Immunopathol. 100: 7-24, 2004). Apenas a presença contínua detitulações elevadas de anticorpos anti-RV passivos N° lúmen intestinal (naturalmente produzidos ou artificialmente adicionados ao leite) protege completamente contra diarreia e reduz significativamente a excreção viral (Fernandez, F.M. e outros, Vaccine 16: 507-16, 1998; Saif, L.J. e outros, Infect. Immun. 41: 1.118-31, 1983, e Saif, L.J. e outros, Adv. Exp. Med. Biol. 216B: 1.815-23, 987).

[0006] Em crianças, foram aprovadas duas vacinas de vírus vivoatenuado por reassociação genética. Ambos os produtos mostraram boa eficácia contra diarreia severa induzida pelo RV. N° entanto, considerando a história de intussuscepção associada a uma vacina usada previamente em seres humanos (Murphy, T.V. e outros, J. Infect. Dis. 187: 1.309-13, 2003) e a descoberta recente de viremia de RV em crianças infectadas naturalmente (Ray, P. e outros, J. Infect. Dis. 194: 588-93, 2006, e Blutt, S.E. e outros, Lancet 362: 1.445-9, 2003), a inocuidade das referidas vacinas foi colocada em questão, especialmente em crianças prematuras, imunossuprimidas e mal nutridas. Portanto, são necessárias estratégias alternativas, complementares, para a prevenção e o tratamento de diarreia induzida pelo RV.

[0007] Estratégias de imunidade passiva, por exemplo, aleitamentomaterno, a administração de anticorpos anti-RV purificados de colostro bovino ou ovos (IgG anti-RV humana e bovina e IgY de gema de ovo de galinha), mostraram que reduzem a doença diarreica tanto em seres humanos quanto em animais. Entretanto, a possibilidade de produção de grandes quantidades de anticorpos de uma forma economicamente viável, e com propriedades reprodutíveis, é baixa. Portanto, é necessário gerar anticorpos projetados para imunização anti-RV passiva em animais e seres humanos, particularmente anticorpos que possam ser produzidos em escala industrial, que não causem reações imunológicas, que sejam suficientemente pequenos para acessar eficientemente os epitopos de proteínas internas conservadas, e que sejam capazes de reconhecer e inibir a replicação de cepas de diferentes genótipos (polirreativos).

[0008] O domínio VHH da cadeia pesada de anticorpo de camelídeoé, com um peso de 15 kDa, o menor domínio natural conhecido com capacidade completa de ligação de antígeno, é ideal para gerar bibliotecas de DNA codificador para fragmentos de cadeia única com uma capacidade natural de reconhecimento de antígeno. Além disso, estratégias para a imunização de lhamas podem ser usadas para enriquecer a biblioteca de VHHs naquelas dirigidas contra um antígeno de interesse. Em função de suas propriedades particulares, os domínios VHH derivados de cadeias pesadas de anticorpo de lhama são ferramentas muito versáteis para o desenvolvimento de reagentes diagnósticos e produtos projetados para evitar ou tratar a diarreia induzida pelo RV. Por exemplo, foi relatado recentemente que um VHH dirigido contra uma cepa de RV do tipo G G3, produzido em leveduras, exibe atividade neutralizante in vitro, e o VHH purificado foi capaz de reduzir a ocorrência e a duração da diarreia induzida pelo RV em camundongos lactantes (Pant, N. e outros, J. Infect. Dis. 194: 1.580-8, 2006, e van der Vaart J.M. e outros, Vaccine, Maio 8, 24(19): 4.130-7, 2006). N° entanto, esses autores não foram capazes de identificar contra qual proteína viral os VHHs obtidos são dirigidos, e eles presumem que eles seriam dirigidos contra epitopos conformacionais de proteínas externas.

[0009] O documento de Patente WO 2006/056306 descreve aprodução e o uso de domínios VHH ou fragmentos dos mesmos como uma terapia para infecções produzidas por micro-organismos enteropatogênicos, por exemplo, RV. Ele mostra a produção do referido VHH ou o uso do mesmo em um sistema de liberação a um local específico. Por exemplo, ele descreve a liberação do VHH específico N° sistema gastrointestinal por encapsulação em alginato. Além disso, como método de liberação, ele propõe o uso de micro-organismos probióticos transgênicos que liberam os anticorpos de VHH específicos e em que os referidos micro-organismos podem colonizar o intestino humano. Ele propõe estratégias diferentes para a preparação de fármacos ou alimentos com a utilização de anticorpos de VHH que são encapsulados ou expressos por micro-organismos probióticos. Os VHHs produzidos não se ligam à VP6, não seriam neutralizantes e não seriam usados isoladamente, mas dentro de um sistema de liberação controlada.

[00010] O documento de Patente US 20050054001, por Muyldermans Serge, descreve anticorpos de cadeia pesada, domínios funcionais de anticorpos de cadeia pesada, domínios VH funcionais ou fragmentos destes que compreendem algumas sequências de aminoácidos modificadas ou mutadas. Ele não descreve sequências que correspondem aos domínios VHH que se ligam à VP6 de RV.

[00011] O documento de Patente WO 00/65057 descreve proteínas monovalentes que compreendem um domínio variável único que se liga aos antígenos virais, particularmente bacteriófago P2 de Lactococcus. Ele descreve apenas sequências de VHH que inibem o referido bacteriófago.

[00012] O documento de Patente US 2007/0009512, por Hamers e outros, e documentos prévios dos mesmos inventores, descrevem fragmentos de cadeia pesada de imunoglobulinas e o uso destes para tratamentos veterinários, por exemplo, imunoterapia ou soroterapia passiva. Os VHHs descritos reconhecem apenas a toxina tetânica. O método usado para se obter o VHH é de mRNA de camelídeos imunizados.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[00013] Um objeto desta invenção é o fornecimento de um domínio monomérico (VHH) derivado de anticorpos de camelídeo, em que o referido domínio pode ser uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, e em que os referidos domínios se ligam à proteína VP6 do RV do Grupo A.

[00014] Outro objeto desta invenção é o fornecimento de um domínio dimérico que se liga à proteína VP6 do RV do Grupo A, em que a referida proteína de fusão compreende pelo menos uma sequência de monômero mostrada nas SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4. Em uma modalidade preferida, a proteína de fusão compreende a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12.

[00015] Outro objeto desta invenção é o fornecimento de um método de imunodetecção de rotavírus que compreende a colocação em contato de uma amostra que contém RV com uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9 ou combinações dos mesmos; e em desenvolvimento.

[00016] O referido método de imunodetecção pode ser realizado por qualquer uma das metodologias conhecidas na técnica estabelecida, por exemplo: testes ELISA, ELISPOT baseados em imunocaptura, ELISA por competição, glóbulos magnéticos ou "pen-side".

[00017] Outro objeto desta invenção é o fornecimento de uma composição que confere imunidade passiva a um mamífero, que compreende qualquer uma das sequências mostradas nas SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8 ou SEQ ID N°: 9, excipiente e imunomoduladores.

[00018] Outro objeto desta invenção é o fornecimento de um método de prevenção contra infecções produzidas por RV que compreende a administração de uma quantidade eficaz de qualquer uma das sequências mostradas N° SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12 ou combinações destes, a um mamífero que dela necessita, em que as referidas sequências são administradas isoladamente ou combinadas com substâncias que as encapsulam e protegem da degradação N° trato gastrointestinal.

[00019] Outro objeto desta invenção é o fornecimento de um método de tratamento para infecções produzidas por RV, em que o referido método compreende a administração de uma quantidade eficaz de qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12 e combinações das mesmas a um mamífero que dela necessita, isoladamente ou combinadas com substâncias que encapsulam e protegem os anticorpos contra degradação N° trato gastrointestinal.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00020] Figura 1. Imunização de lhama. Esquema para imunização, coleta de amostra, sangramento final e avaliação de resposta de anticorpo para rotavirus N° soro durante o período de imunização: titulações de anticorpo medidas por (i) ELISA usando VP6 recombinante, (ii) ELISA usando rotavírus (IND; Sb I P[5]G6), (iii) neutralização viral e (iv) ELISPOT usando o mesmo rotavírus (IND; Sb I P[5]G6). Os pontos do tempo de vacinação estão representados por setas.

[00021] Figura 2. Detecção de proteína VP6 nativa e recombinante por análise Western blot. BRV IND (A) ou VP6 recombinante (B) processados sob condições redutoras; ou sob condições não redutoras e detectados com: Raias 1 e 8 - Anti-RV do Grupo A sérico policlonal bovino; 2 e 9 - Mab anti-VP6 (RG25A10); 3 e 10 - VHH anti-VP6 2KA4; 4 e 11 - VHH anti-VP6 2KD1; 5 e 12 - VHH anti-VP6 3B2; 6 e 13 - VHH anti-VP6 3A6; 7 e 14 - VHH não-relacionado.

[00022] Figura 3. VHH-ELISA: Detecção de cepas de rotavírus com diferentes especificidades de reatividade de subgrupo e tipo G/P de diferentes espécies animais.A) VHH monomérico 2KA4, 2KD1, 3A6 capturado poranticorpo (2 μg/poço).B) Revestimento direto com VHH bivalente biv2KA4, biv2KD1, biv3A6 (1 μg/poço). Sobrenadante de cultura de tecido de rotavírus bovino IND (SbI; P[5]G6), C486 (SbI; P[1]G6) e B223 (SbI; P[11]G10); rotavírus humano Wa (SbII; P[8]G1) e rotavírus equino H2 (Sb N° I, N° II; P[12]G3); fezes positivas: amostra fecal que corresponde ao pico de disseminação de vírus de um bezerro infectado experimentalmente com rotavírus bovino IND; MA-104: sobrenadante de células não-infectadas. PBS: (ausência de reação), fezes negativas: amostra fecal de bezerro negativa para rotavírus.

[00023] As barras de erro indicam desvio padrão de duas medidas independentes.

[00024] Figura 4. Ensaio in vitro de redução de foco fluorescente de rotavírus. Uma diluição de quatro vezes de cada VHH monovalente 2KA4, 2KD1, 3A6 e 3B2 foi misturada com o mesmo volume de rotavírus contendo 100 FFU. A concentração de VHH que gera >80% de redução da taxa de infecção é considerada protetora.A. Rotavírus bovino C486 (homólogo ao Ag usado em vacinação e ataque aos camundongos); B. Rotavírus bovino IND (homólogo ao Ag usado na seleção de ligante);C. Rotavírus bovino B223;D. Rotavírus humano Wa;E. Rotavírus equino H2.

[00025] Os gráficos representam os resultados sumarizados de dois ensaios independentes.

[00026] Figura 5. Taxa de proteção contra diarreia obtida por VHH monovalente 2KA4, 2KD1, 3A6 e 3B2 em camundongos neonatos atacados com rotavirus. Os filhotes foram alimentados com 100 μg (100 μl) de cada VHH do dia 0 ao 5° dia, uma vez ao dia por via intragástrica. N° 1° dia os filhotes foram atacados por via intragástrica com RV 2 horas após alimentação de rotina. A diarreia foi acompanhada diariamente até 96 horas pós-ataque.A. Ataque: 30 DD50 (6 x 105 FFU) de rotavírus bovino C486. O experimento foi realizado em três ensaios independentes de 5 camundongos por grupo.B. Ataque: 316 DD50 de rotavírus murídeo ECw. O experimento foi realizado em dois ensaios independentes de 5 camundongos por grupo.C. Disseminação do vírus quantificada por ELISA nos homogeneizados 10% p/v do intestino delgado.

[00027] O símbolo # significa a percentagem de animais afetados que difere significativamente do grupo não-tratado/atacado, Teste Exato de Fisher, p < 0,05.

[00028] As barras representam a média das absorbâncias de ELISA a 405 nm por grupo. As barras de erro indicam ± Desvio Padrão. Valor de corte do ELISA: 0,200.

[00029] Figura 6 A. Mostra a expressão de VHH em larvas T. ni. Os níveis de expressão são suficientemente altos para detectar duas bandas do peso molecular esperado na coloração com coomassie. B. Mostra uma quantificação do VHH expresso N° sistema de larvas.

[00030] Figura 7 Mostra a técnica de ELISA usando VHH de larvas. Extratos de proteínas solúveis totais (TSP) de larvas que expressam VP6 [Ag(+)] ou de larvas infectadas com um baculovírus recombinante não inserto [Ag(-)] foram usados para revestir microplacas de ELISA (Polysorp, Nunc, Dinamarca) com diluições seriais começando a 40 μg/poço em tampão de carbonato/bicarbonato a 50 mM, pH 9,6, e incubados de um dia para o outro a 4°C.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00031] Para os objetivos deste pedido, o termo "domínio" é uma parte de uma sequência e estrutura de proteína (anticorpo) que pode se desenvolver, funcionar e existir independentemente do resto da cadeia da proteína. Cada domínio forma uma estrutura tridimensional compacta e frequentemente pode ser estável e dobrado independentemente. Muitas proteínas consistem em vários domínios estruturais. Um domínio pode aparecer em diversas proteínas evolutivamente relacionadas. Os domínios variam em termos de comprimento desde entre cerca de 25 aminoácidos até 500 aminoácidos de comprimento. Os domínios são capazes de se ligar aos epitopos. Os domínios do presente pedido se ligam à proteína VP6 do RV do Grupo A.

[00032] Para os objetivos deste pedido, os termos "VHH", "domínio VHH", "VHH monomérico" e "monômero de VHH" são considerados como tendo o mesmo significado e como sendo intercambiáveis.

[00033] Para os objetivos deste pedido, os termos "proteína VP6", "antígeno VP6" e "VP6" são considerados como tendo o mesmo significado e como sendo intercambiáveis.

[00034] Para os objetivos deste pedido, os termos "domíniodimérico", "dímeros de VHH" e "VHH dimérico" são considerados como tendo o mesmo significado e como sendo intercambiáveis.

[00035] O termo "homodímero" é definido como uma proteína ou um polipeptídeo formado por dois domínios monoméricos idênticos, com ou sem uma sequência de ligação.

[00036] O termo "heterodímero" é definido como uma proteína ou polipeptídeo formado por dois domínios monoméricos diferentes, com ou sem uma sequência de ligação.

[00037] A expressão "condições de crescimento apropriadas" refere- se ao ambiente adequado estabelecido a fim de aumentar o crescimento das células transgênicas (transformadas, transfectadas ou infectadas pelo vetor definido na invenção). Por exemplo, as larvas infectadas são mantidas em câmaras de crescimento a 28°C e coletadas nos tempos indicados.

[00038] Para os objetivos da presente invenção, "vacina" é uma preparação que é usada para importar imunidade a uma doença em particular. Uma composição projetada para conferir imunidade passiva a um mamífero, caracterizada pelo fato de que ela compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado pelas SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, e combinações das mesmas; excipiente e imunomoduladores.

[00039] A expressão "quantidade eficaz de uma sequência de aminoácidos (polipeptídeos)" a ser administrada em um mamífero para evitar a infecção produzida por RV refere-se a uma quantidade pré- estimada da sequência de aminoácidos (polipeptídeos) necessária para se ligar ao epitopo e bloquear a ação do patógeno (vírus) que eventualmente irá infectar o organismo hospedeiro.

[00040] A expressão "quantidade eficaz de uma sequência de aminoácidos (polipeptídeos)" a ser administrada em um mamífero para o tratamento da infecção produzida por RV refere-se à quantidade da sequência de aminoácidos (polipeptídeos) necessária para se ligar ao epitopo e bloquear a ação do patógeno que já infectou o organismo hospedeiro.

[00041] Para os objetivos da presente invenção, o termo "mamífero" refere-se, em geral, aos membros da Classe Mammalia, por exemplo: seres humanos, bovinos, caprinos, ovinos, suínos e equinos.

[00042] Uma sequência de ligação é definida como sendo uma sequência de aminoácidos que liga dois domínios monoméricos.

[00043] A seleção, obtenção e caracterização de anticorpos de VHH dirigidos à proteína intermediária do capsídeo do RV do Grupo A, VP6, são descritas. Foi demonstrado que os VHHs da invenção são proteínas amplamente reativas que podem ser manipuladas para serem usadas em um ensaio imunodiagnóstico universal para a detecção do RV do Grupo A. Além disso, foi demonstrado que alguns dos VHHs anti-VP6 selecionados possuem ampla atividade neutralizante in vitro, e alguns dos referidos VHHs protegem contra ataque viral in vivo. Com base N° seu conhecimento, os inventores acreditam que os VHHs da invenção são as primeiras moléculas descritas que se ligam à proteína VP6 e possuem atividade neutralizante.

[00044] A fim de se obter os domínios VHH da invenção, foi efetuado o esquema de imunização animal mostrado na Figura 1. A fim de avaliar a resposta imune da lhama, as titulações de anticorpos anti-RV e anti- VP6 foram analisadas por ELISA, ensaios de neutralização viral (VN), e as células secretoras de anticorpos específicos que circulam N° sangue periférico foram analisadas por ELISPOT. Como esperado, N° dia 0 pós- inoculação (DPI), as lhamas eram positivas para anticorpos anti-RV, indicando contato prévio com o antígeno. N° entanto, não havia células secretoras de anticorpos circulando N° sangue. N° 7° dia pós-injeção, a titulação de anticorpo anti-IND-RV ou anti-VP6 determinada por ELISA estava elevada, e um pico de células secretoras de anticorpos específicos para RV foi detectado N° sangue periférico (16 células que produzem IgG anti-RV/5 x 105 células mononucleares). A resposta humoral alcançou um platô a partir do 14° dia pós-injeção, com titulações de anticorpo elevadas tanto para o vírus inteiro quanto para a proteína VP6. Por outro lado, as titulações do anticorpo neutralizante permaneceram similares e muito baixas para todos os diferentes RVs estudados (IND, B223, Wa e H2). Embora tenham sido obtidas titulações de anticorpo muito elevadas N° soro, a quantidade de células secretoras de anticorpo anti-RV detectadas N° sangue diminuía com cada reforço (Figura 1). Por essa razão, e a fim de dar tempo suficiente para favorecer a maturação da afinidade do anticorpo, a lhama não recebeu a dose final de VP6 até bem mais tarde, N° 246° dia pós-injeção (aproximadamente 7 meses após a 4a dose). Finalmente, a lhama foi sangrada 4 dias após o último reforço, alcançando valores de 26,8 células secretoras de IgG anti-RV/5 x 105 células mononucleares. 6 x 108 células mononucleares foram extraídas de 900 ml de sangue (que continha pelo menos 32.160 células secretoras de anticorpos IgG específicos para RV, de acordo com os resultados de ELISPOT). Do RNA processado (210 μg), foi gerada uma biblioteca de fago de VHH que continha 6 x 107 clones. O esquema de vacinação usado mostrou que, a fim de se obter o VHH da invenção, é mais importante se obter valores elevados de células secretoras de anticorpos específicos, em vez de altas titulações de anticorpo dirigido contra os antígenos de interesse. N° esquema de vacinação usado, foi possível obter quantidades suficientes de células secretoras de anticorpos específicos. Os resultados obtidos durante a imunização nos permitem ressaltar que o melhor método para acompanhar a resposta imune de uma lhama imunizada a fim de construir uma biblioteca de VHHs é selecionar uma técnica que avalie a quantidade de células secretoras de anticorpos específicos que circulam N° sangue periférico, em vez das titulações séricas de anticorpo contra o antígeno de interesse. De acordo com o padrão de células secretoras de anticorpos obtido, foi demonstrado que um esquema de vacinação com um intervalo longo entre as últimas duas doses promove a circulação de uma quantidade maior de células secretoras de anticorpos específicos N° sangue periférico. Também foi demonstrado que, com 4 dias pós-inoculação, há um grande número de células secretoras de anticorpos circulantes contra o antígeno de interesse do que com 7 dias pós-inoculação. O esquema de imunização deve ser realizado de tal forma que a dose de reforço seja aplicada às lhamas pelo menos 5 meses após a última dose, e as colônias de fago são geradas quando uma quantidade de cerca de 20 células secretoras de anticorpos IgG anti-antígeno-alvo é obtida N° sangue periférico. De preferência, para VHH anti-VP6, a quantidade de células secretoras de anticorpos IgG N° sangue periférico deve ser de cerca de 30 células secretoras de anticorpos IgG anti-RT completo. Aqueles versados na técnica sabem que podem ser usados outros esquemas de imunização para se obter VHHs adequados para os métodos e as composições desta invenção.

[00045] A fim de selecionar os fagos que expressavam VHH anti-RV, foram realizadas três rodadas de seleção in vitro usando RV IND como o antígeno. Foram selecionados 192 clones. Foram feitas análises de restrição para todos os clones que apresentaram uma grande diversidade de ligação de VP6 na biblioteca de VHHs; essa foi determinada por ELISA do fago. Os clones também foram testados por ELISA para determinar sua capacidade para se ligar a um RV e à VP6. De 14 clones com sequências diferentes, foram selecionados 10 clones que mostraram ligação específica mais forte ao RV e à VP6, e eles foram subclonados em um vetor de expressão que fornece um tag de hexa-histidina N° terminal carbóxi para facilitar a purificação do mesmo (Tabela 1).

[00046] Foram selecionados quatro clones que se ligaram mais fortemente às cepas de RV que correspondiam aos diferentes subgrupos; esses clones foram denominados 2KA4 (SEQ ID N°: 1), 2KD1 (SEQ ID N°: 2), 3A6 (SEQ ID N°: 3) e 3B2 (SEQ ID N°: 4), que reconheciam um VP6 recombinante e sua contraparte nativa de RV IND avaliada por Western Blot, o que indica que o referido VHH se liga aos epitopos conformacionais dessa proteína VP6 (Figura 2). Daqui por diante, os VHH denominados 2KA4, 2KD1, 3A6 e 3B2 são os domínios VHH da invenção.

[00047] As sequências de DNA que codificavam cada um dos domínios VHH foram as seguintes:SEQ ID N°: 5 codifica o domínio do SEQ ID N°: 1;SEQ ID N°: 6 codifica o domínio do SEQ ID N°: 2;SEQ ID N°: 7 codifica o domínio do SEQ ID N°: 3;SEQ ID N°: 8 codifica o domínio do SEQ ID N°: 4;

[00048] Aqueles versados na técnica sabem que qualquer sequência de DNA que codifica os referidos domínios se enquadra N° escopo desta invenção. Por exemplo, a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 1 pode ser codificada pela sequência de DNA SEQ ID N°: 5 ou por outra sequência de DNA que difere do SEQ ID N°: 5 em função dadegeneração do código genético. O mesmo exemplo é válido para cada uma das sequências de aminoácidos (SEQ ID N°: 2, 3 e 4) codificada pelas respectiva sequências de DNA (SEQ ID N°: 6, 7 e 8).

[00049] O VHH anti-VP6 específico da invenção foi muito eficiente como reagente para o diagnóstico imunológico de RV. As formas monoméricas do VHH da invenção foram testadas em ELISA como anticorpos de captura, como anticorpos secundários, ou imobilizadas por meio de anticorpos anti-His. O VHH da invenção foi capaz de detectar cepas de RV de origem humana ou animal com diferentes subgrupos específicos e diferentes tipos G e P (Figura 3A).

[00050] Por outro lado, foram construídos vetores de expressão para a produção do VHH dimérico da invenção que se liga especificamente à VP6, que constituem genes de VHH idênticos ligados a uma sequência de ligação similar à sequência de dobradiça (hinge) de IgA humana. O VHH dimérico da invenção também foi avaliado em ELISA como captura direta, mostrando sinais nítidos e reprodutíveis para todas as cepas de RV estudadas (Figura 3B). O VHH dimérico da invenção pode ser usado para sensibilização da placa de ELISA, eliminando, dessa forma, a necessidade de usar anticorpos de captura de VHH, e exibe melhores resultados para a detecção de RV do que sua contraparte monomérica.

[00051] Vale ressaltar que os rendimentos de VHH monomérico expresso N° periplasma de E. coli foram comparáveis com aqueles relatados por outros autores em E. coli e leveduras.

[00052] O VHH monomérico e o dimérico desta invenção provaram ser muito úteis para o diagnóstico de RV e, portanto, podem ser usados como anticorpos monoclonais recombinantes em qualquer diagnóstico imunológico conhecido por aqueles versados na técnica. É evidente para aqueles versados na técnica que os domínios VHH monoméricos e diméricos da invenção podem ser usados para qualquer tipo de ensaio diagnóstico imunológico para detectar RV, e que os referidos ensaios estão incluídos N° escopo desta invenção.

[00053] Os domínios anti-VP6 da invenção podem ser usados para a construção de dímeros como aqueles aqui descritos, por exemplo, homodímeros, ou podem ser fundidos para formar heterodímeros, por exemplo, por fusão do domínio 3B2 com o domínio 3A6, ou por fusão de dois dos monômeros de VHH da invenção. Além disso, três ou mais monômeros de VHH da invenção também podem ser fundidos ou combinados para gerar homotrímeros ou heterotrímeros. Todas as formas multiméricas que surgem da combinação de monômeros de VHH da invenção, contenham eles ou não uma sequência de ligação, estão incluídas N° escopo desta invenção. Em uma modalidade preferida, os dímeros de VHH da invenção possuem as sequências descritas como SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, ou SEQ ID N°: 11, ou SEQ ID N°: 12. Por exemplo, os dímeros podem compreender uma sequência de ligação de aminoácido como, por exemplo, aquela mostrada na SEQ ID N°: 13, ou qualquer outra sequência que atue como uma sequência de dobradiça.

[00054] A Tabela a seguir mostra algumas características do VHH dimérico e monomérico da invenção.

1 Determinado por WB contra RV IND e VP6 recombinante.2 Baseado em um conjunto de 6 culturas de 0,5 l cada, purificado por meio de uma coluna tag anti-histidina.3 Detecção de cepas de RV Sb I, Sb II, Sb N° I; N° II.

[00055] Os domínios anti-VP6 VHH da invenção foram capazes de neutralizar diferentes cepas de RV in vitro. Três de quatro monômeros da invenção (2KD1, 3A6 e 3B2) mostraram atividade amplamente neutralizante in vitro. A capacidade neutralizante de cada VHH foi homogênea para todas as cepas de RV avaliadas. Concentrações de monômero de 3,9 μg/ml foram capazes de neutralizar completamente a infectividade gerada por 100 FFU de cepas de RV C486 (P[1]G6), IND (P[5]G6), B223 (P[11]G10), Wa P[8]G1 e H2 (P[12]G3), in vitro. A Tabela 3 lista a titulação de neutralização contra diferentes cepas de RV de uma solução com uma concentração de 2 mg/ml para cada monômero. Tabela 3Titulação de neutralização dos diferentes domínios VHH monoméricos e diméricos

1 Titulações neutralizantes de anticorpo para diferentes cepas de RV, expressas como o inverso da maior diluição de VHH que reduz >80% das unidades formadoras de foco geradas por 100 FFU de cada cepa de RV.

[00056] Portanto, os monômeros de VHH foram capazes de neutralizar cepas de RV que pertencem a diferentes combinações de tipos G/P que normalmente não induzem neutralização cruzada. O monômero de VHH com a maior capacidade de neutralização foi o monômero 2KD1. Por outro lado, embora o monômero 2KA4 fosse capaz de reconhecer adequadamente todos os RVs em ELISA, ele não neutralizou qualquer uma das cepas estudadas. A capacidade dos VHHs da invenção para neutralizar titulações elevadas de cepas de RV antigenicamente diferentes é de grande importância e os tornam moléculas polineutralizantes; essa propriedade faz com que sejam ferramentas potenciais na prevenção ou tratamento para diarreia induzida pelo RV, independentemente do sorotipo (27 tipos P e 16 tipos G).

[00057] O VHH dimérico mostrou menos atividade de neutralização do que suas contrapartes monoméricas.

[00058] Foi avaliada a capacidade dos monômeros de VHH da invenção para tratar e evitar a diarreia produzida por infecção por RV. Para essa finalidade, camundongos neonatais receberam a administração de uma dose intragástrica diária de VHH por 5 dias (dia 0 a 4). Os camundongos foram atacados N° 1° dia com a cepa viral C486, também pela via intragástrica (Fig. 5). Sessenta por cento dos camundongos tratados com VHH monomérico da invenção 3B2 foram protegidos contra diarreia induzida pelo RV. Essa proteção foi significativamente maior quando era feita uma comparação entre os camundongos tratados e os camundongos não-tratados ou com aqueles tratados com VHH não relacionado (p = 0,0108), em que todos os camundongos sofriam de diarreia (Tabela 4 e Figura 5). Além disso, a gravidade e a duração da diarreia nos animais tratados com o VHH da invenção foram significativamente reduzidas, quando comparadas com os grupos de controle. Proteção contra o ataque com Rotavirus em camundongos lactantes

[00059] Os valores médios das mesmas colunas com letras diferentes diferem significativamente (Kruskal Wallis, p < 0,05).

[00060] As percentagens de animais afetados com letras diferentes diferem significativamente (Teste Exato de Fisher, p < 0,05).

[00061] Deve-se observar que a maior titulação de neutralização foi obtida contra a cepa de RV heteróloga humana (Wa, SbII, P[8]G1), que é considerada como sendo a cepa mais comumente associada à gastrenterite em crianças em todo o mundo.

[00062] A produção e a purificação desses fragmentos de anticorpo podem ser efetuadas com rendimentos elevados, levando a um menor custo de produção. Isso é particularmente relevante em países em desenvolvimento, onde a magnitude da infecção e a morbidade/mortalidade causada pelo RV são enormes, e os custos de tratamento e prevenção são fatores limitantes cruciais.

[00063] Aqueles versados na técnica sabem que, com base N° que é aqui descrito, os domínios VHH da invenção podem ser produzidos por síntese da sequência de nucleotídeos correspondente e pela expressão desta em qualquer célula hospedeira, sem a necessidade de criar uma biblioteca de fago.

[00064] É evidente para aqueles versados na técnica que diferentes combinações e misturas dos monômeros de VHH, dímeros de VHH ou multímeros de VHH da invenção podem ser usadas para o diagnóstico imunológico, prevenção de infecções por RV e tratamento de mamíferos infectados por RV, sem alterar o espírito desta invenção, e em que todas as combinações e misturas possíveis estão incluídas N° escopo desta invenção.

[00065] Como foi mencionado anteriormente, foram selecionados quatro clones que se ligaram mais fortemente às cepas de RV que correspondem aos diferentes subgrupos. Esses clones foram denominados 2KA4 (SEQ ID N°: 1), 2KD1 (SEQ ID N°: 2), 3A6 (SEQ ID N°: 3) e 3B2 (SEQ ID N°: 4), que reconheceram uma VP6 recombinante e sua contraparte nativa de RV IND avaliado por Western Blot, que indica que o referido VHH se liga aos epitopos lineares dessa proteína VP6.

[00066] Os referidos domínios da invenção (SEQ ID N°: 1 a 4) ou as sequências de nucleotídeos que os codificam (SEQ ID N°: 5 a 8) podem ser inseridos em um vetor recombinante apropriado, por exemplo, um vetor de expressão. Portanto, a presente invenção ainda se refere a um vetor de expressão que compreende as referidas sequências. A seleção do vetor é uma função do tipo de célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. Ilustrativamente, o vetor pode ser um plasmídeo ou um vetor que, uma vez introduzido na célula hospedeira, é integrado ou não N° genoma da referida célula hospedeira. O referido vetor pode ser obtido com a utilização de qualquer método conhecido existente na técnica [Sambrok e outros 1989]. Em uma modalidade preferida, o vetor da invenção pode ser usado para ser inserido N° genoma de células de plantas ou de animais. Dessa forma, o vetor da invenção pode ser, por exemplo, um vetor de Agrobacterium tumefaciens ou um vetor viral capaz de ser expresso em células de plantas ou de animais. Em uma modalidade em particular, o vetor viral usado na presente invenção é Baculovírus (vide o Exemplo 5).

[00067] O vetor pode ser usado para transformação, transfecção ou infecção de células de plantas, algas ou animais, de preferência células de insetos ou larvas. Portanto, a presente invenção ainda se refere às células transformadas, transfectadas ou infectadas pelo vetor da invenção.

[00068] Em uma modalidade preferida da invenção, a célula transgênica é uma célula animal, de preferência uma célula de inseto e, mais preferivelmente, larvas da referida célula de inseto. Portanto, a invenção ainda se refere a um animal transgênico não humano como, por exemplo, um inseto transgênico ou larvas transgênicas que expressam o peptídeo caracterizado pelo SEQ ID N°: 1 a 4 em um rendimento elevado.

[00069] Portanto, o vetor da invenção pode ser usado para produzir e/ou armazenar os domínios da invenção caracterizados pelo SEQ ID N°: 1 a 4 e/ou 9 a 12. Consequentemente, a presente invenção ainda se refere a um método para a produção de domínios da invenção que compreende o crescimento da célula ou do organismo transfectado, transformado ou infectado com o vetor da invenção sob condições que permitem a produção dos referidos domínios. As condições para a otimização da cultura da célula ou organismo transgênico dependerão do tipo de célula ou organismo usado. Se desejado, o método para a produção dos domínios da invenção ainda compreende seu isolamento e purificação de acordo com qualquer um dos métodos conhecidos na técnica.

[00070] Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere aos anticorpos caracterizados por compreenderem qualquer um dos domínios da invenção:- um domínio VHH monomérico derivado de anticorpos de camelídeo, caracterizado pelo fato de compreender as sequências selecionadas do grupo formado pelo SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4, em que os referidos domínios se ligam à proteína VP6 do rotavírus (RV) do grupo A.- um domínio VHH dimérico que se liga à proteína VP6 do RV do Grupo A, caracterizado pelo fato de que compreender pelo menos uma sequência de monômero selecionada do grupo formado pelas sequências mostradas N° SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4.

[00071] Outro aspecto da presente invenção se refere a um kit para imunodetecção de RV que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado pelo SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, e combinações dos mesmos.

[00072] A invenção ainda se refere a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado pelo SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, e combinações dos mesmos, para uso em um método para a prevenção de infecções produzidas por RV. Em outras palavras, a invenção se refere ao uso de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado pelo SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, e combinações dos mesmos, para a fabricação de uma composição para a prevenção de infecções produzidas por RV.

[00073] Além disso, a invenção ainda se refere a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado pelo SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, e combinações dos mesmos, para uso em um método para o tratamento de infecções produzidas por RV. Em outras palavras, a invenção se refere ao uso de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado pelo SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, e combinações dos mesmos, para a fabricação de uma composição para o tratamento de infecções produzidas por RV.

[00074] Finalmente, a presente invenção se refere a um método para imunização passiva que compreende a inoculação de uma quantidade eficaz dos anticorpos definidos acima N° corpo de um ser humano ou de um animal.

DEPÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS DE ACORDO COM O TRATADO DE BUDAPESTE

[00075] O plasmídeo pFBMelVHH (vide o Exemplo 5) foi depositado na "Spanish Type Culture Collection" (CECT); Universidade de Valência, Espanha, com o número de acesso CECT7431, N° dia 02 de julho de 2008.EXEMPLOS

[00076] Esta invenção é mais bem ilustrada pelos exemplos a seguir, que não devem ser interpretados como sendo uma limitação imposta ao escopo da mesma. Pelo contrário, deve-se entender claramente que podem ser usadas modalidades, modificações e equivalentes destes que essa descrição possa sugerir àqueles versados na técnica, sem se afastar do espírito desta invenção e/ou do escopo das reivindicações em anexo.Exemplo 1: Obtenção e purificação do VHH monomérico e dimérico da invençãoObtenção da biblioteca de VHHs da invenção:

[00077] A cepa de RV IND bovino de referência foi usada (SbI; P[5]G6) como um antígeno N° processo de seleção ("biopanning') para a seleção do VHH. A fim de ter um painel de RV que represente diferentes reatividades dos subgrupos com diferentes combinações de tipos G e P de diferentes espécies animais e de seres humanos, as cepas de RV de referência listadas na Tabela 4 foram incluídas nos diferentes ensaios realizados para produzir o VHH. Os vírus foram propagados em células de rim de macaco (MA-104). Também foi incluída uma amostra fecal de um bezerro neonatal que não recebeu colostro com a cepa IND N° momento da pré-inoculação e N° pico da disseminação do vírus.Tabela 5Cepas de rotavirus de referência usadas nos diferentes procedimentos realizados durante a produção e caracterização do VHH da invenção

Imunização das lhamas: Proteína VP6 derivada da cepa de RV bovino

[00078] C486 (SbIP[1]G6) foi produzido em células Sf9 infectadascom um baculovírus recombinante. Uma lhama macho com 1 ano de idade recebeu cinco doses de extrato celular bruto contendo 500 μg de VP6 misturados com adjuvante de óleo INTA(Marcol:Arcel:Span:Tween) nos dias 0, 21, 28, 35 e 246. Amostras de soro e de sangue foram coletadas nos dias 0, 4 e 7 após cada inoculação. A resposta humoral foi avaliada por ELISA e neutralização viral (VN) (vide abaixo). A fim de avaliar a resposta de célula B efetora, foi adaptado um ensaio ELISPOT que determina o número de células secretoras de anticorpos específicos para RV N° sangue periférico na lhama inoculada, com base em ensaios ELISPOT prévios realizados em porcos e bezerros (Parreno, V.C. e outros, Vet. Immunol. Immunopathol. 100: 7-24, 2004, e Parreno, V.V. e outros, J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public. Health. 48: 713-20, 2001, aqui incorporado unicamente como referência). Resumidamente, células MA-104 infectadas com BRV IND (com mais de 80% de infecção detectada por imunofluorescência) foram fixadas, cresceram em placas de 96 poços, com acetona 70%, secas ao ar e armazenadas a -20°C até que fossem usadas. As suspensões de células mononucleares (MNC) derivadas do sangue periférico (PB) da lhama inoculada foram adicionadas aos poços (1 x 106; 5 x 105; 2,5 x 105 e 1,25 x 105 células/poço). Após centrifugação a 500 g por 5 minutos, as placas foram incubadas por 12 a 14 horas a 37°C em CO2 5%. As placas foram lavadas com PBS com Tween 20 0,05% a fim de remover as células aderentes, e os spots foram gerados por adição do mesmo conjugado usado em ELISA em uma diluição de 1/1.500 por 2 horas a 37°C, seguida por 50 μl do sistema de substrato de peroxidase TMB (KLP, Maryland, USA).

[00079] A manipulação, a inoculação e a coleta de amostras de lhama foram feitas por pessoal treinado sob a supervisão de um veterinário, de acordo com protocolos aprovados pelo comitê de ética para o bem-estar animal do INTA.

Produção da biblioteca de VHHs e seleção do VHH de ligação de VP6 da invenção:

[00080] De um total de 900 ml de sangue coletado 4 dias após a última injeção, 6 x 108 células mononucleares foram extraídas por centrifugação por gradiente Ficoll Paque; elas foram então centrifugadas, congeladas em nitrogênio líquido e subsequentemente mantidas a -80°C. O RNA total foi extraído usando um equipamento de extração de RNA (Macherey Nagel; Nucleospin RNA II), obtendo 250 μg de RNA. Subsequentemente, a primeira cadeia de cDNA foi sintetizada usando o equipamento de Transcriptase Reversa Superscript III (Invitrogen), com iniciadores OligodT (12-18) (Invitrogen) ou iniciadores aleatórios (Invitrogen). Em uma mistura de reação de 20 μl, 0,2, 1 ou 5 μg de RNA total foram usados. O cDNA que codifica VHH e VH foi amplificado especificamente por PCR usando iniciadores CALL01 (SEQ ID N°: 14) e CALL02 (SEQ ID N°: 15), que anelam com as sequências líderes e CH2. O fragmento de 600 pb (éxons VHH-CH2 sem o éxon CH1) foi eluído de um gel de agarose 1,6%, após sua separação do fragmento de 900 pb (éxons VH-CH1-CH2). O VHH foi então amplificado por uma PCR abrigada adicional com iniciadores que anelam na região ' framework" 1 (SEQ ID N°: 16) e região "framework" 4 (SEQ ID N°: 17), e com iniciadores que contêm sítios de restrição para as etapas de clonagem subsequentes: VHHfor2: (SEQ ID N°: 18), com sítios de restrição para NcoI e PstI, e VHHrev2 (SEQ ID N°: 19), com um sítio de restrição para NotI. Os fragmentos de PCR finais foram ligados usando sítios de restrição NcoI ou PstI montante e um sítio de restrição NotI jusante, em vetor de fagomídeo pAO-Lib, uma versão modificada de pHEN4 (Arbabi Ghahroudi M., Desmyter A., Wyns L., Hamers R., Muyldermans S. "Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies". FEBS Lett. Setembro 1997 15; 414(3): 521-6), que contém uma sequência longa irrelevante que é removida após a inserção de VHH, de modo a retardar a propagação potencial do vetor, sem o inserto de VHH. Células de Escherichia coli (TG1) foram transformadas com o material ligado e as células foram semeadas. As colônias foram raspadas das placas, lavadas e mantidas a -80°C em meio LB suplementado com glicerol (concentração final de 50%).

[00081] O VHH específico foi selecionado da biblioteca usando a tecnologia de apresentação em fago. A biblioteca de VHHs foi infectada com fagos auxiliares ("helper") M13 (Invitrogen), e as partículas de fago que expressam o repertório de VHHs foram resgatadas e precipitadas com PEG, como descrito por Marks, J.D., Hoogenboom, H.R., Bonnert, T.P., McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. JMB, 1991. O enriquecimento em VHH específico foi realizado por duas a três rodadas de seleção in vitro, ou seja, pela técnica conhecida como ("biopanning"). Os imunotubos foram revestidos de um dia para o outro a 4°C com uma diluição de 1/50 de BRV IND semipurificado (SbI; P[5]G6) ou com uma diluição de 1/5.000 de um antissoro policlonal anti-RV de porquinho-da- índia em tampão de carbonato em pH 9,6, seguida por uma etapa de bloqueio, e uma diluição de 1/50 do mesmo BRV IND foi capturada. Os fagos resgatados foram incubados com o BRV IND, diretamente ou com aquele capturado previamente, lavados, e as partículas de fago ligadas foram eluídas com 100 mM de trietilamina em pH 10,0, e imediatamente neutralizados com Tris pH 7,4. Os fagos eluídos foram usados para infectar exponencialmente células em crescimento TG1. Após a segunda ou terceira rodada de ("biopanning"), as colônias individuais foram desenvolvidas e os clones de VHH correspondentes foram analisados por ELISA de fago.Expressão e purificação do VHH monomérico e dimérico da invenção:

[00082] O cDNA de VHH dos clones que eram positivos em ELISA foi reclonado usando enzimas de restrição NcoI e NotI N° vetor de expressão pHEN6 (Conrath, K.E.M. e outros Antimicrob. Agents Chemother. 45: 2.807-12, 2001, aqui incorporado unicamente como referência), que fornece uma sequência de direcionamento pelB para o periplasma e um tag de seis histidinas do terminal carbóxi. O VHH bivalente foi construído por amplificação por PCR da sequência de VHH usando os iniciadores Bivfor2 (SEQ ID N°: 20) e Bivrev2 (SEQ ID N°: 21) (SEQ ID N°: 22), que codificam um vinculador relacionado àdobradiça de IgA humana. O produto de PCR e o vetor pHEN6 que contém o modelo de VHH foram digeridos com NcoI e PstI, e ligados para produzir o vetor pAO-biv, que contém o VHH bivalente. A fim de produzir o VHH monovalente ou bivalente, células de E. coli XL1 Blue foram transformadas com as diferentes constructo de plasmídeo. A expressão de VHH foi induzida com 1 mM de isopropil-D- tiogalactopiranosídeo por 16 horas a 27 °C (Sambrook, J., e Russell, D.W., 2001, "Molecular Cloning"). Após centrifugação das células, as proteínas periplasmáticas foram extraídas por choque osmótico. O VHH foi purificado do extrato periplasmático com o uso de uma coluna quelante N-High-Trap HP (Amersham Biosciences).Exemplo 2: Caracterização do VHH da invenção

[00083] Western blot: concentrados de VP6 expressos em um sistema de baculovírus e concentrados de BRV IND foram ressuspensos em um tampão de amostra de Laemmli, fervidos por 10 minutos. Eles foram então processados através de uma coluna de SDS- PAGE 12% e transferidos para uma membrana Immobilon P (Millipore, Berdford, MA). A membrana foi bloqueada por 45 min com PBS/Tween (0,05%), contendo leite desnatado 10%, e cada um dos VHHs (4 μg/ml) foi incubado por 2 h em temperatura ambiente. A membrana foi então lavada com PBS/Tween (0,05%) e incubada de um dia para o outro a 4°C com o anticorpo anti-penta-histidina (diluição de 1/500 em PBS/Tween (0,05%) BSA (3%). Finalmente, foram incubados com IgG de cabra anticamundongo conjugada à HRP (diluição de 1/5.000) (Amersham, Pharmacia, Biotech) por 40 min em temperatura ambiente. Os ensaios foram desenvolvidos com ECL (Amersham Biosciences).

[00084] Sequenciamento do VHH da invenção: a fim de sequenciar o VHH, foram usados os oligonucleotídeos "M13 direto" e "M13 reverso", seguindo esse método: "Big Die Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Applied Biosystem) em um sequenciador automático ABI-Prism 377 DNA (Perkin Elmer, Applied Biosystems).Exemplo 3: Ensaios de imunodetecção RV usando o VHH da invenção

[00085] Imunoensaio de enzima (ELISA) e Western blot: os experimentos de ELISA foram realizados em placas de 96 poços Maxisorp (Nunc), por sensibilização direta com RV ou por captura de RV ou de VP6 recombinante com um anticorpo policlonal produzido em um porco gnotobiótico. Como antígenos para o controle negativo, foram usadas células MA-104 pseudoinfectadas e uma proteína não relacionada expressa em baculovírus (proteína E2 do vírus da diarreia bovina). PBS foi usado como blank, e soro de porquinho-da-índia não imunizado foi usado como captura negativa.

[00086] A presença de anticorpos anti-RV N° soro de lhama foianalisada como descrito em Parreno, V.C. e outros, Vet. Immunol. Immunopathol. 100: 7-24, 2004, e a de anticorpos anti-VP6 foi analisada com um protocolo adaptado de Fernández e outros (Fernandez, F.M. e outros, Vaccine 16: 507-16, 1998). As IgGs de lhama foram detectadas usando uma IgG de cabra anti-lhama (H+L) marcada com peroxidase (Bethyl, lab inc, Montgomery, CA, USA), em uma diluição de 1/2.000.

[00087] Os fagos derivados dos clones individuais obtidos por "biopanning" foram analisados por ELISA de fago. Resumidamente, clones individuais de E. coli crescimento em exponencial TG1, contendo os diferentes genes de VHH N° vetor phen4, foram infectados com fagos auxiliares M13 a fim de produzir partículas de fago que expressam VHH fundido à proteína de superfície, e o sobrenadante da cultura que contém a prole do fago foi avaliado em placas de ELISA sensibilizadas com BRV IND ou VP6. Os fagos ligados foram detectados usando uma diluição de 1/5.000 de um anticorpo anti-M13p8 conjugado à HRP (Amersham, Pharmacia, Biotech) por 40 minutos em temperatura ambiente. Os ensaios foram desenvolvidos com o uso de H2O2/ABTS (Zymed).

[00088] Primeiro, o VHH monovalente ou bivalente purificado com o tag 6-His do terminal carbóxi foi estudado como reagente para detectar RV ou VP6 por ELISA, como descrito acima, desenvolvido por um anticorpo monoclonal anti-penta-histidina (Qiagen, 1/5.000) e um anticorpo de cabra anticamundongo conjugado à HRP. Em segundo lugar, esses foram analisados como um reagente de captura de RV, tanto por sensibilização da placa de ELISA direta de 10 μg/ml de VHH quanto por captura por 10 μg/ml de anticorpo monoclonal anti-histidina e, subsequentemente, 20 μg/ml de VHH. Os ensaios foram desenvolvidos com o uso de um antissoro policlonal de RV de um bezerro que não recebeu colostro hiperimunizado com BRV IND (diluição de 1/2.000) e a IgG antibovina (H+L) marcada com peroxidase (KPL, Gaitherburg, Maryland, USA) em uma diluição de 1/5.000.

[00089] O VHH dimérico foi testado por ELISA como um reagente de captura de RV a 10 μg/ml.

[00090] O VHH monomérico também foi avaliado como anticorpo secundário, e a ELISA foi desenvolvida com anticorpos monoclonais anti-penta-histidina e anticorpos de cabra anticamundongo conjugados à HRP (diluição de 1:1.000) (Amersham, Pharmacia, Biotech).

[00091] Ensaios de neutralização viral: as titulações do anticorponeutralizante para vírus IND, C486, B223, Wa e H2 em amostras de soro de lhama e VHH purificado foram determinadas por neutralização fluorescente de foco (FFN), como descrito em To, T.L. e outros (J. Gen. Virol. 79 (Pt 11): 2.661-72, 1998). Resumidamente, 100 μl de diluições seriais de soro de lhama, monômeros ou dímeros de VHH purificado selecionados foram misturados com volumes iguais de vírus a fim de obter 100 unidades formadoras de foco (FFU)/100 μl de mistura, e incubados por uma hora a 37°C. 100 μl da mistura de anticorpo-vírus foram plaqueados em monocamadas de MA-104 (4 réplicas) eincubados por 48 horas a 37°C. As placas foram fixadas com acetona 70% e o ensaio foi desenvolvido com o uso de um anticorpo anti-RV marcado com FITC de um bezerro que não recebeu colostro hiperimunizado com RV. A titulação de VN foi expressa como a recíproca da maior diluição da amostra que leva a >80% de redução N° número de focos fluorescentes.Exemplo 4: Uso do VHH monomérico e dimérico da invenção para prevenção e/ou tratamento de mamíferosEnsaios de proteção de RV em camundongos neonatais:

[00092] 100 μg de cada monômero de VHH anti-VP6 em 100 μl foramadministrados a camundongos Balb/c com quatro dias de idade, usando uma sonda intragástrica, uma vez ao dia, começando N° dia 0 e por 5 dias. Os camundongos lactantes foram atacados com 100 μl de BRV C486 (SbI; P[1]G6), contendo 2 x 106 FFU/ml, N° 1° dia, 2 horas após a dose de VHH habitual, e depois com 20 μl de uma solução de bicarbonato 5%, também por via intragástrica. O inoculado foi capaz de produzir diarreia em 100% dos camundongos não-tratados de controle. Os grupos de controle usados N° experimento foram: (i) camundongos inoculados com RV e não-tratados com anticorpos; ii) camundongos tratados com a mesma quantidade de VHH não relacionado, dirigidos contra uma proteína celular; iii) camundongos tratados com 450 μg de IgG purificada por afinidade derivada de um antissoro policlonal de porquinho-da-índia com uma titulação de VN de 2.048 contra o RV homólogo; iv) camundongos tratados com a mesma quantidade de IgG de um porquinho-da-índia soro-negativo de controle; v) camundongos não-infectados e tratados. A diarreia induzida pelo RV foi avaliada clinicamente por palpação direta do abdome dos camundongos durante os 5 dias do estudo. A gravidade da diarreia foi analisada diariamente, atribuindo-se um valor numérico com base na cor e consistência das fezes, como descrito por Van Cott, J.L. e outros, J. Virol. 80: 4.949-61, 2006. O teste exato de Fisher foi usado para comparar as proporções de camundongos com diarreia entre os grupos. O teste não paramétrico de Kruskal Wallis foi usado para comparar o surgimento, a duração e a gravidade médias da diarreia entre os grupos tratados.Exemplo 5: Geração de baculovírus recombinante

[00093] O baculovírus recombinante BacMelVHH foi gerado pelo plasmídeo phen 6 que contém a sequência completa de VHH 3B2. A proteína foi amplificada por PCR pelo plasmídeo phen 6 usando os seguintes iniciadores: SEQ ID N°: 23 e SEQ ID N°: 24. Esse amplicon foi então clonado N° vetor pFastMelB2 estruturado com uma sequência sinalizadora de inseto derivada da melitina de cera de abelha, usando os sítios de restrição BamHI e XbaI incluídos nos iniciadores correspondentes. O plasmídeo pFBMelVHH resultante era caracterizado por sequenciamento automatizado e usado para gerar o baculovírus recombinante BacMelVHH usando o sistema de Baculovírus Bac-to-Bac® (Invitrogen, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O baculovírus recombinante foi propagado e amplificado em células de insetos sf21 até alcançar titulações infecciosas entre 107 e 109 pfu/ml, e os estoques foram mantidos a 4°C para uso diário e a -80°C para armazenamento de longo prazo.Condições de crescimento e inoculação de inseto

[00094] Para experimentos de expressão, larvas de quinto instar (larvas de último instar antes da pupação) com peso de cerca de 250 mg foram injetadas com os baculovírus recombinantes próximo à falsa- perna ("proleg") (a frente da cavidade corporal) usando doses conhecidas de pfu/larva. As larvas infectadas foram mantidas em câmaras de crescimento a 28°C e coletadas nos tempos indicados. As larvas foram então imediatamente congeladas e mantidas a -20°C até processadas.

[00095] As culturas de células de inseto também foram infectadas usando doses conhecidas. As células infectadas foram mantidas a 28°C por 72 h. Finalmente, as culturas infectadas foram coletadas e os péletes celulares também foram imediatamente congelados e mantidos a -20°C até processados.Preparação de extratos de proteína

[00096] As proteínas solúveis totais (TSP) de larvas de T. ni foram obtidas flexionando-se as larvas congeladas em um tampão de extração contendo triton 0,01%; 25 mM de DTT e um coquetel inibidor de proteína (Completo, Roche, Alemanha) em PBS 1X.Análise de extratos de proteína

[00097] Uma coloração de azul de Coomassie e uma análise por "imunoblotting" foram feitas para a quantificação e detecção da proteína de VHH específica contida nos TSPs. Dessa forma, 20 μg de TSP por raia foram carregados em géis de SDS-poliacrilamida 12%. Após eletroforese, os géis foram corados com uma solução de azul de Coomassie ou transferidos para membranas de nitrocelulose (Schleicher & Schuell,) para a realização de um "western blot".

[00098] Para ensaios de "Western blot", SDS-PAGE (12%) foi transferido para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, USA). A membrana foi bloqueada de um dia para o outro a 4°C com PBS 0,05% Tween 20 (PBST) e leite desnatado 4% (tampão de bloqueio, BF) e depois incubada em temperatura ambiente (RT) por 1 hora usando um soro de coelho anti-VHH (1:100 em BF). A membrana foi lavada 3 vezes com PBST e finalmente anti-IgG de coelho marcado com HRP conjugado (1:2.000 em BF, Sigma, USA) foi adicionado por 1 hora como anticorpo secundário. Após lavagem intensa com PBST, as bandas de proteína foram detectadas usando o sistema de detecção "Western blotting" ECL em películas Hyperfilm ECL (Amersham, USA) (vide a Figura 6A).Análise funcional

[00099] Os extratos TSP de VP6 (uma proteína de rotavírus bovino) que expressam larvas [Ag(+)] ou de larvas infectadas com um baculovírus recombinante não inseto [Ag(-)] foram usados para revestir as microplacas de ELISA (Polysorp, Nunc, Dinamarca) com diluições seriais começando a 40 μg/poço em 50 mM de tampão de carbonato/bicarbonato, pH 9,6, e incubados de um dia para o outro a 4°C. N° dia seguinte, as placas foram lavadas com PBST quatro vezes. As placas foram sequencialmente incubadas por 1 hora a 37°C sob agitação constante, com solução de bloqueio (PBST-BSA 2%, 100μl/poço) por 30 minutos. A seguir, com extratos de VHH TSP que expressam larvas a uma diluição de 2,5 μg/poço em tampão de bloqueio por 1 hora. As placas foram então lavadas 4 vezes com PBST e bloqueadas novamente por 30 minutos. A seguir, 100 μl/poço de um anticorpo policlonal (diluído a 1:100) contra o VHH feito em coelho foram adicionados e incubados por 1 hora a 37°C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBST. Finalmente, foram adicionados 100 μl/poço de anti- IgG de coelho marcado com HRP conjugado diluído a 1:2.000 em solução de bloqueio. Para a reação de substrato, as placas foram lavadas quatro vezes, e 100 μl/poço de 1 mM de ácido 2,2'-azino-bis(3- etilbenzotiazolina-6-sulfônico) ABTS, (KPL, USA) foram adicionados às placas. Permitiu-se o desenvolvimento da reação de peroxidase por 510 minutos em temperatura ambiente, e as reações foram lidas a 405 nm em uma leitora de microplacas de ELISA (Multiskan EX, Thermo Electron Corp, USA) (vide a Figura 7).

Claims (16)

1. Domínio de VHH dimérico ou monomérico, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência capaz de se ligar à proteína VP6 de rotavírus selecionada do grupo: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

2. Domínio de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ele deriva de anticorpos de camelídeos selecionados do grupo: Lama glama, Lama pacos, Lama guanicoe e Vicugna vicugna.

3. Domínio de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ele se liga a um epitopo linear do antígeno VP6 presente no grupo A de rotavírus.

4. Domínio dimérico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende duas sequências, idênticas ou diferentes, selecionadas do grupo: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

5. Domínio dimérico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que ele ainda compreende uma sequência de ligação de aminoácidos SEQ ID NO: 13.

6. Domínio dimérico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência selecionada do grupo: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.

7. Método de imunodetecção de rotavírus, caracterizado pelo fato de que compreende: a) a colocação em contato de uma amostra que contém rotavírus com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, ou combinações dos mesmos; e b) o desenvolvimento.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo: testes baseado em imunocaptura de ELISA, ELISPOT, ELISA por competição, contas magnéticas e “pen side”.

9. Composição projetada para conferir imunidade passiva a um mamífero, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, ou combinações dos mesmos; excipiente e imunomoduladores.

10. Plasmídeo pFBMelVHH depositado sob o número de acesso CECT7431 em 02.07.08, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer um dos domínios monoméricos ou diméricos, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

11. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o plasmídeo como definido na reivindicação 10.

12. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido vetor é um vírus, particularmente um Baculovírus.

13. Células transgênicas de microrganismos, transformadas ou transfectadas ou infectadas com o vetor como definido na reivindicação 11 ou 12, caracterizadas pelo fato de que expressam o DNA incluído no plasmídeo como definido na reivindicação 10.

14. Método para a produção dos domínios como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:a) transformação ou transfecção ou infecção de células hospedeiras em cultura ou em larvas de inseto com o vetor recombinante como definido na reivindicação 11 ou 12;b) manutenção do crescimento das células sob condições adequadas;c) isolamento e purificação dos domínios.

15. Anticorpos, caracterizados pelo fato de que compreendem qualquer um dos domínios como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

16. Kit para imunodetecção de rotavírus, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, ou combinações dos mesmos.

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