BRPI1006641A2 - domÍnio monomÉrico vhh derivado de anticorpos anti-vp6 de camelÍdeos, domÍnio dimÉrico, mÉtodo de imunizaÇço, mÉtodo de detecÇço de rotavÍrus, composiÇço, mÉtodos de prevenÇço e tratamento para infecÇÕes por rotavÍrus - Google Patents

Abstract

DOMÍNIO MONOMÉRICO VHH DERIVADO DE ANTICORPOS ANTI-VP6 DE CAMELÍDEOS, DOMÍNIO DIMÉRICO, MÉTODO DE IMUNIZAÇçO, MÉTODO DE DETECÇçO DE ROTAVÍRUS, COMPOSIÇçO, MÉTODOS DE PREVENÇçO E TRATAMENTO PARA INFECÇÕES POR ROTAVÍRUS. A presente invenção refere-se a domínio VHH monomérico derivado de anticorpos de camelídeo anti-VP6, domínio dimérico, método de imunização, método de detecção de rotavírus, composição de vacina, métodos de prevenção e tratamento para infecções por rotavírus, em que o referido domínio pode ser qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas no SEQ ID Nº: 1, SEQ lD Nº: 2, SEQ lD Nº: 3 ou SEO lD Nº: 4, e em que os referidos domínios se ligam à proteína VP6 do rotavírus do Grupo A.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DOMÍNIO MONOMÉRICO VHH DERIVADO DE ANTICORPOS ANTI-VP6 DE CAME- LÍDEOS, DOMÍNIO DIMÉRICO, MÉTODO DE IMUNIZAÇÃO, MÉTODO DE DETECÇÃO DE ROTAVÍRUS, COMPOSIÇÃO, MÉTODOS DE PREVEN- ÇÃO E TRATAMENTO PARA INFECÇÕES POR ROTAVÍRUS".

Esta invenção refere-se a um domínio VHH monomérico deriva- do de anticorpos de camelídeo anti-VP6, domínio dimérico, método de imu- nização, método de detecção de rotavírus, composições, métodos de pre- venção e tratamento para infecções por rotavírus. Mais especificamente, ela refere-se a um domínio monomérico (VHH) derivado de anticorpos de came- lídeo, em que o referido domínio pode ser qualquer uma das seqüências de aminoácidos mostradas no SEQ ID N0: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, e em que os referidos domínios se ligam à proteína VP6 do rotavírus do Grupo A. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O rotavírus do Grupo A (RV) é a causa principal de diarréia se- vera em crianças e no jovem de muitas espécies animais de interesse eco- nômico (bovinos, suínos, eqüinos, camelídeos da América do Sul etc.). Co- mo problema de saúde pública, o RV é a terceira causa mais comum de morte associada à diarréia severa em países em desenvolvimento (2 mi- lhões de mortes por ano). Por outro lado, a diarréia induzida pelo RV em a- nimais destinados ao consumo, por exemplo, bezerros jovens, causa altos custos relacionados à prevenção ou ao tratamento.

O RV do Grupo A consiste em partículas compostas por um capsídeo de proteína triplo. A superfície externa do capsídeo é composta por proteínas VP4 e VP7, ambos antígenos altamente variáveis; até o momento, foram descritos pelo menos 27 variantes de VP4 (tipos P) e 16 variantes de VP7 (tipos G). Cada combinação tipo G-P induz anticorpos neutralizantes que possuem baixa reatividade cruzada com outros tipos G-P; por essa ra- zão, é necessário incluir as diferentes cepas que circulam nas espécies- alvos nas vacinas.

Q capsídeo intermediário é composto por proteína trimérica VP6, que representa 51% da massa do vírion. Dependendo da presença ou au- sência de dois epitopos diferentes na proteína VP6 (reconhecidos por anti- corpos monoclonais mAb 255/60 e 631/9), as cepas de RV do Grupo A são adicionalmente classificadas como subgrupos (Sb) I, II, l+ll e nol noll. Os RVs humanos são normalmente Sb II, enquanto os RVs de animais são pri- mariamente Sb I. A proteína VP6 é altamente imunogênica; seres humanos e animais infectados naturalmente desenvolvem uma forte resposta humoral contra epitopos de VP6. Independentemente dos subgrupos mencionados acima, VP6 é uma proteína altamente conservada em todos os RV do Grupo A (>90% de homologia de aminoácidos), e os antígenos comuns comparti- lhados podem ser detectados por antissoros policlonais amplamente reativos ou anticorpos monoclonais. Portanto, VP6 é o antígeno-alvo na maioria dos testes imunodiagnósticos projetados para detectar RV do Grupo A. Os anti- corpos dirigidos contra essa proteína não possuem atividade neutralizante in vitro. No entanto, anticorpos monoclonais IgA conseguem bloquear a repli- cação viral intracelularmente em camundongos.

Atualmente, a prevenção da diarréia induzida pelo RV em ani- mais se baseia na imunização passiva, enquanto a imunização ativa é usada em seres humanos. Em animais, vacinas parenterais de vírus inativado são aplicadas em fêmeas prenhas, a fim de proteger os neonatos por meio da transferência de anticorpos maternais através do colostro e do leite. Essa estratégia é altamente eficaz na prevenção dos sintomas de diarréia severa e na redução da morbidade e mortalidade nos estoques afetados, mas não é capaz de evitar a infecção por RV, pois não reduz significativamente a quan- tidade de vírus excretada pelos animais infectados (Parreno, V.C. et al., I/et. Immunol. Immunopathol. 100: 7-24, 2004). Apenas a presença contínua de titulações elevadas de anticorpos anti-RV passivos no lúmen intestinal (natu- ralmente produzidos ou artificialmente adicionados ao leite) protege comple- tamente contra diarréia e reduz significativamente a excreção viral (Fernan- dez, F.M. etal., Vaccine 16: 507-16, 1998; Saif, L.J. et ai, Infect. Immun. 41: 1.118-31, 1983, e Saif, L.J. etal., Adv. Exp. Med. Biol. 216B: 1.815-23, 987).

Em crianças, foram aprovadas duas vacinas de vírus vivo atenu- ado por re-associação genética. Ambos os produtos mostraram boa eficácia contra diarréia severa induzida pelo RV. No entanto, considerando a história de intussuscepção associada a uma vacina usada previamente em seres humanos (Murphy, T.V. et aí., J. Infect. Dis. 187: 1.309-13, 2003) e a desco- berta recente de viremia de RV em crianças infectadas naturalmente (Ray, P. et a!., J. Infect. Dis. 194: 588-93, 2006, e Blutt, S.E. et ai, Lancet 362: 1.445-9, 2003), a inocuidade das referidas vacinas foi colocada em questão, especialmente em crianças prematuras, imunossuprimidas e mal-nutridas. Portanto, são necessárias estratégias alternativas, complementares, para a prevenção e o tratamento de diarréia induzida pelo RV.

Estratégias de imunidade passiva, por exemplo, aleitamento ma- terno, a administração de anticorpos anti-RV purificados de colostro bovino ou ovos (IgG anti-RV humana e bovina e IgY de gema de ovo de galinha), mostraram que reduzem a doença diarréica tanto em seres humanos quanto em animais. Entretanto, a possibilidade de produção de grandes quantida- des de anticorpos de uma forma economicamente viável, e com proprieda- des reprodutíveis, é baixa. Portanto, é necessário gerar anticorpos projeta- dos para imunização anti-RV passiva em animais e seres humanos, particu- larmente anticorpos que possam ser produzidos em escala industrial, que não causem reações imunológicas, que sejam suficientemente pequenos para acessar eficientemente os epitopos de proteínas internas conservadas, e que sejam capazes de reconhecer e inibir a replicação de cepas de dife- rentes genótipos (polirreativos).

O domínio VHH da cadeia pesada de anticorpo de camelídeo é, com um peso de 15 kDa, o menor domínio natural conhecido com capacida- de completa de ligação de antígeno, é ideal para gerar bibliotecas de DNA codificador para fragmentos de cadeia única com uma capacidade natural de reconhecimento de antígeno. Além disso, estratégias para a imunização de Ihamas podem ser usadas para enriquecer a biblioteca de VHHs naquelas dirigidas contra um antígeno de interesse. Em função de suas propriedades particulares, os domínios VHH derivados de cadeias pesadas de anticorpo de Ihama são ferramentas muito versáteis para o desenvolvimento de rea- gentes diagnósticos e produtos projetados para evitar ou tratar a diarréia induzida pelo RV. Por exemplo, foi relatado recentemente que um VHH diri- gido contra uma cepa de RV do tipo G G3, produzido em leveduras, exibe atividade neutralizante in vitro, e o VHH purificado foi capaz de reduzir a o- corrência e a duração da diarréia induzida pelo RV em camundongos Iactan- tes (Pant, N. etal., J. Infect. Dis. 194: 1.580-8, 2006, e van der Vaart J.M. et ai, Vaccine, Maio 8, 24(19): 4.130-7, 2006). No entanto, esses autores não foram capazes de identificar contra qual proteína viral os VHHs obtidos são dirigidos, e eles presumem que eles seriam dirigidos contra epitopos con- formacionais de proteínas externas.

O documento de Patente WO 2006/056306 revela a produção e o uso de domínios VHH ou fragmentos destes como uma terapia para infec- ções produzidas por micro-organismos enteropatogênicos, por exemplo, RV. Ele mostra a produção do referido VHH ou o uso deste em um sistema de liberação a um local específico. Por exemplo, ele revela a liberação do VHH específico no sistema gastrintestinal por encapsulação em alginato. Além disso, como método de liberação, ele propõe o uso de micro-organismos probióticos transgênicos que liberam os anticorpos de VHH específicos e em que os referidos micro-organismos podem colonizar o intestino humano. Ele propõe estratégias diferentes para a preparação de fármacos ou alimentos com a utilização de anticorpos de VHH que são encapsulados ou expressos por micro-organismos probióticos. Os VHHs produzidos não se ligam à VP6, não seriam neutralizantes e não seriam usados isoladamente, mas dentro de um sistema de liberação controlada. O documento de Patente US 20050054001, por Muyldermans

Serge, revela anticorpos de cadeia pesada, domínios funcionais de anticor- pos de cadeia pesada, domínios VH funcionais ou fragmentos destes que compreendem algumas seqüências de aminoácidos modificadas ou muta- das. Ele não revela seqüências que correspondem aos domínios VHH que se ligam à VP6 de RV.

O documento de Patente WO 00/65057 revela proteínas mono- valentes que compreendem um domínio variável único que se liga aos anti- genos virais, particularmente bacteriófago P2 de Lactococcus. Ele revela apenas seqüências de VHH que inibem o referido bacteriófago.

O documento de Patente US 2007/0009512, por Hamers etal., e documentos prévios dos mesmos inventores, revelam fragmentos de cadeia pesada de imunoglobulinas e o uso destes para tratamentos veterinários, por exemplo, imunoterapia ou soroterapia passiva. Os VHHs descritos reconhe- cem apenas a toxina tetânica. O método usado para se obter o VHH é de mRNA de camelídeos imunizados. BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Um objetivo desta invenção é o fornecimento de um domínio

monomérico (VHH) derivado de anticorpos de camelídeo, em que o referido domínio pode ser uma das seqüências de aminoácidos mostradas no SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, e em que os referi- dos domínios se ligam à proteína VP6 do RV do Grupo A. Outro objetivo desta invenção é o fornecimento de um domínio

dimérico que se liga à proteína VP6 do RV do Grupo A, em que a referida proteína de fusão compreende pelo menos uma seqüência de monômero mostrada no SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4. Em uma modalidade preferida, a proteína de fusão compreende a seqüência de aminoácidos mostrada no SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12.

Outro objetivo desta invenção é o fornecimento de um método de imunodetecção de rotavírus que compreende a colocação em contato de uma amostra que contém RV com uma das seqüências de aminoácidos mostradas no SEQ ID N°: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N0: 9 ou combinações destes; e em desenvolvimento.

O referido método de imunodetecção pode ser realizado por qualquer uma das metodologias conhecidas na técnica estabelecida, por exemplo: testes ELISA, ELISPOT baseados em imunocaptura, ELISA por competição, glóbulos magnéticos ou pen-side.

Outro objetivo desta invenção é o fornecimento de uma compo- sição que confere imunidade passiva a um mamífero, que compreende qual- quer uma das seqüências mostradas no SEQ ID N0: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8 ou SEQ ID N°: 9, excipiente e imunomoduladores.

Outro objetivo desta invenção é o fornecimento de um método

de prevenção contra infecções produzidas por RV que compreende a admi- nistração de uma quantidade eficaz de qualquer uma das seqüências mos- tradas no SEQ ID N0: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12 ou combinações destes, a um mamífero que dela necessita, em que as referidas seqüências são administradas isoladamente ou combinadas com substâncias que as encapsulam e protegem da degradação no trato gastrintestinal.

Outro objetivo desta invenção é o fornecimento de um método de tratamento para infecções produzidas por RV, em que o referido método compreende a administração de uma quantidade eficaz de qualquer uma das seqüências de aminoácidos mostradas no SEQ ID N°: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12 e combinações destes a um mamífero que dela necessi- ta, isoladamente ou combinadas com substâncias que encapsulam e prote- gem os anticorpos contra degradação no trato gastrintestinal. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Imunização de lhama. Esquema para imunização, coleta de amos- tra, sangramento final e avaliação de resposta de anticorpo para rotavírus no soro durante o período de imunização: titulações de anticorpo medidas por (i) ELISA usando VP6 recombinante, (ii) ELISA usando rotavírus (IND; Sb I P[5]G6), (iii) neutralização viral e (iv) ELISPOT usando o mesmo rotavírus (IND; Sb I P[5]G6). Os pontos do tempo de vacinação estão representados por setas.

Figura 2. Detecção de proteína VP6 nativa e recombinante por análise Wes- tem blot. BRV IND (A) ou VP6 recombinante (B) processados sob condições redutoras; ou sob condições não redutoras e detectados com: Raias 1 e 8 - Anti-RV do Grupo A sérico policlonal bovino; 2 e 9 - Mab anti-VP6 (RG25A10); 3 e 10 - VHH anti-VP6 2KA4; 4 e 11 - VHH anti-VP6 2KD1; 5 e 12 - VHH anti-VP6 3B2; 6 e 13 - VHH anti-VP6 3A6; 7 e 14 - VHH não rela- cionado.

Figura 3. VHH-ELISA: Detecção de cepas de rotavírus com diferentes espe- cificidades de reatividade de subgrupo e tipo G/P de diferentes espécies a - nimais.

A) VHH monomérico 2KA4, 2KD1, 3A6 capturado por anticorpo (2 pg/poço).

B) Revestimento direto com VHH bivalente biv2KA4, biv2KD1, biv3A6 (1 Mg/poço). Sobrenadante de cultura de tecido de rotavírus bovino IND (Sbl;

P[5]G6), C486 (Sbl; P[1]G6) e B223 (Sbl; P[11]G10); rotavírus humano Wa (Sbll; P[8]G1) e rotavírus eqüino H2 (Sb no I, no II; P[12]G3); fezes positivas: amostra fecal que corresponde ao pico de disseminação de vírus de um be- zerro infectado experimentalmente com rotavírus bovino IND; MA-104: so- brenadante de células não infectadas. PBS: (ausência de reação), fezes ne- gativas: amostra fecal de bezerro negativa para rotavírus.

As barras de erro indicam desvio padrão de duas medidas inde- pendentes.

Figura 4. Ensaio in vitro de redução de foco fluorescente de rotavírus. Uma diluição de quatro vezes de cada VHH monovalente 2KA4, 2KD1, 3A6 e 3B2 foi misturada com o mesmo volume de rotavírus contendo 100 FFU. A con- centração de VHH que gera >80% de redução da taxa de infecção é consi- derada protetora.

A. Rotavírus bovino C486 (homólogo ao Ag usado em vacinação e ataque aos camundongos); B. Rotavírus bovino IND (homólogo ao Ag usado na seleção de ligante);

C. Rotavírus bovino B223;

D. Rotavírus humano Wa;

E. Rotavírus eqüino H2.

Os gráficos representam os resultados resumidos de dois ensai- os independentes.

Figura 5. Taxa de proteção contra diarréia obtida por VHH monovalente 2KA4, 2KD1, 3A6 e 3B2 em camundongos neonatos atacados com rotaví- rus. Os filhotes foram alimentados com 100 pg (100 μΙ) de cada VHH do dia 0 ao 5o dia, uma vez ao dia por via intragástrica. No 1o dia os filhotes foram atacados por via intragástrica com RV 2 horas após alimentação de rotina. A diarréia foi acompanhada diariamente até 96 horas pós-ataque. A. Ataque: 30 DD50 (6 χ 105 FFU) de rotavírus bovino C486. O experimento foi realizado em três ensaios independentes de 5 camundongos por grupo.

B. Ataque: 316 DD50 de rotavírus murídeo ECw. O experimento foi realizado em dois ensaios independentes de 5 camundongos por grupo.

C. Disseminação do vírus quantificada por ELISA nos homogeneizados 10% p/v do intestino delgado.

O símbolo # significa a percentagem de animais afetados que difere significativamente do grupo não tratado/atacado, Teste Exato de Fi- sher, ρ < 0,05.

As barras representam a média das absorbâncias de ELISA a 405 nm por grupo. As barras de erro indicam ± Desvio Padrão. Valor de cor- te do ELISA: 0,200.

Figura 6 A. Mostra a expressão de VHH em larvas T. ni. Os níveis de ex- pressão são suficientemente altos para detectar duas bandas do peso mole- cular esperado na coloração com coomassie. B. Mostra uma quantificação do VHH expresso no sistema de larvas.

Figura 7 Mostra a técnica de ELISA usando VHH de larvas. Extratos de pro- teínas solúveis totais (TSP) de larvas que expressam VP6 [Ag(+)] ou de lar- vas infectadas com um baculovírus recombinante não inserto [Ag(-)] foram usados para revestir microplacas de ELISA (Polysorp, Nunc, Dinamarca) com diluições seriais começando a 40 pg/poço em 50 mM de tampão de carbonato/bicarbonato, pH 9,6, e incubados de um dia para o outro a 4°C. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para os objetivos deste pedido, o termo "domínio" é uma parte de uma seqüência e estrutura de proteína (anticorpo) que pode se desenvol- ver, funcionar e existir independentemente do resto da cadeia da proteína. Cada domínio forma uma estrutura tridimensional compacta e freqüentemen- te pode ser estável e dobrado independentemente. Muitas proteínas consis- tem em vários domínios estruturais. Um domínio pode aparecer em diversas proteínas evolutivamente relacionadas. Os domínios variam em termos de comprimento desde entre cerca de 25 aminoácidos até 500 aminoácidos de comprimento. Os domínios são capazes de se ligar aos epitopos. Os domí- nios do presente pedido se ligam à proteína VP6 do RV do Grupo A.

Para os objetivos deste pedido, os termos "VHH", "domínio V- HH", "VHH monomérico" e "monômero de VHH" são considerados como tendo o mesmo significado e como sendo intercambiáveis.

Para os objetivos deste pedido, os termos "proteína VP6", "antí- geno VP6" e "VP6" são considerados como tendo o mesmo significado e como sendo intercambiáveis.

Para os objetivos deste pedido, os termos "domínio dimérico", "dímeros de VHH" e "VHH dimérico" são considerados como tendo o mesmo significado e como sendo intercambiáveis. O termo "homodímero" é definido como uma proteína ou um po-

lipeptídeo formado por dois domínios monoméricos idênticos, com ou sem uma seqüência de ligação.

O termo "heterodímero" é definido como uma proteína ou poli- peptídeo formado por dois domínios monoméricos diferentes, com ou sem uma seqüência de ligação.

A expressão "condições de crescimento apropriadas" refere-se ao ambiente adequado estabelecido a fim de aumentar o crescimento das células transgênicas (transformadas, transfectadas ou infectadas pelo vetor definido na invenção). Por exemplo, as larvas infectadas são mantidas em câmaras de crescimento a 28°C e coletadas nos tempos indicados.

Para os objetivos da presente invenção, "vacina" é uma prepa- ração que é usada para importar imunidade a uma doença em particular. Uma composição projetada para conferir imunidade passiva a um mamífero, caracterizada pelo fato de que ela compreende uma seqüência de aminoáci- dos selecionada do grupo formado pelo SEQ ID N0: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 4, SEQ ID N0: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, e combinações destes; excipiente e imunomoduladores. A expressão "quantidade eficaz de uma seqüência de aminoáci- dos (polipeptídeos)" a ser administrada em um mamífero para evitar a infec- ção produzida por RV refere-se a uma quantidade pré-estimada da seqüên- cia de aminoácidos (polipeptídeos) necessária para se ligar ao epitopo e bloquear a ação do patógeno (vírus) que eventualmente irá infectar o orga- nismo hospedeiro.

A expressão "quantidade eficaz de uma seqüência de aminoáci- dos (polipeptídeos)" a ser administrada em um mamífero para o tratamento da infecção produzida por RV refere-se à quantidade da seqüência de ami- noácidos (polipeptídeos) necessária para se ligar ao epitopo e bloquear a ação do patógeno que já infectou o organismo hospedeiro.

Para os objetivos da presente invenção, o termo "mamífero" re- fere-se, em geral, aos membros da Classe Mammalia, por exemplo: seres humanos, bovinos, caprinos, ovinos, suínos e eqüinos. Uma seqüência de ligação é definida como sendo uma seqüên-

cia de aminoácidos que liga dois domínios monoméricos.

A seleção, obtenção e caracterização de anticorpos de VHH diri- gidos à proteína intermediária do capsídeo do RV do Grupo A, VP6, são descritas. Foi demonstrado que os VHHs da invenção são proteínas ampla- mente reativas que podem ser manipuladas para serem usadas em um en- saio imunodiagnóstico universal para a detecção do RV do Grupo A. Além disso, foi demonstrado que alguns dos VHHs anti-VP6 selecionados possu- em ampla atividade neutralizante in vitro, e alguns dos referidos VHHs pro- tegem contra ataque viral in vivo. Com base no seu conhecimento, os inven- tores acreditam que os VHHs da invenção são as primeiras moléculas des- critas que se ligam à proteína VP6 e possuem atividade neutralizante.

A fim de se obter os domínios VHH da invenção, foi efetuado o esquema de imunização animal mostrado na Figura 1. A fim de avaliar a res- posta imune da lhama, as titulações de anticorpos anti-RV e anti-VP6 foram analisadas por ELISA, ensaios de neutralização viral (VN), e as células se- cretoras de anticorpos específicos que circulam no sangue periférico foram analisadas por ELISPOT. Como esperado, no dia 0 pós-inoculação (DPI), as Ihamas eram positivas para anticorpos anti-RV, indicando contato prévio com o antígeno. No entanto, não havia células secretoras de anticorpos cir- culando no sangue. No 7o dia pós-injeção, a titulação de anticorpo anti-IND- RV ou anti-VP6 determinada por ELISA estava elevada, e um pico de células secretoras de anticorpos específicos para RV foi detectado no sangue perifé- rico (16 células que produzem IgG anti-RV/5 χ 105 células mononucleares). A resposta humoral alcançou um platô a partir do 14° dia pós-injeção, com titulações de anticorpo elevadas tanto para o vírus inteiro quanto para a pro- teína VP6. Por outro lado, as titulações do anticorpo neutralizante permane- ceram similares e muito baixas para todos os diferentes RVs estudados (IND, B223, Wa e H2). Embora tenham sido obtidas titulações de anticorpo muito elevadas no soro, a quantidade de células secretoras de anticorpo an- ti-RV detectadas no sangue diminuía com cada reforço (Figura 1). Por essa razão, e a fim de dar tempo suficiente para favorecer a maturação da afini- dade do anticorpo, a Ihama não recebeu a dose final de VP6 até bem mais tarde, no 246° dia pós-injeção (aproximadamente 7 meses após a 4a dose). Finalmente, a Ihama foi sangrada 4 dias após o último reforço, alcançando valores de 26,8 células secretoras de IgG anti-RV/5 χ 105 células mononu- cleares. 6 χ 108 células mononucleares foram extraídas de 900 ml de sangue (que continha pelo menos 32.160 células secretoras de anticorpos IgG es- pecíficos para RV, de acordo com os resultados de ELISPOT). Do RNA pro- cessado (210 pg), foi gerada uma biblioteca de fago de VHH que continha 6 χ 107 clones. O esquema de vacinação usado mostrou que, a fim de se obter o VHH da invenção, é mais importante se obter valores elevados de células secretoras de anticorpos específicos, em vez de altas titulações de anticorpo dirigido contra os antígenos de interesse. No esquema de vacinação usado, foi possível obter quantidades suficientes de células secretoras de anticor- pos específicos. Os resultados obtidos durante a imunização nos permitem ressaltar que o melhor método para acompanhar a resposta imune de uma Ihama imunizada a fim de construir uma biblioteca de VHHs é selecionar uma técnica que avalie a quantidade de células secretoras de anticorpos específicos que circulam no sangue periférico, em vez das titulações séricas de anticorpo contra o antígeno de interesse. De acordo com o padrão de células secretoras de anticorpos obtidos, foi demonstrado que um esquema de vacinação com um intervalo longo entre as últimas duas doses promove a circulação de uma quantidade maior de células secretoras de anticorpos es- pecíficos no sangue periférico. Também foi demonstrado que, com 4 dias pós-inoculação, há um grande número de células secretoras de anticorpos circulantes contra o antígeno de interesse do que com 7 dias pós- inoculação. O esquema de imunização deve ser realizado de tal forma que a dose de reforço seja aplicada às Ihamas pelo menos 5 meses após a última dose, e as colônias de fago são geradas quando uma quantidade de cerca de 20 células secretoras de anticorpos IgG anti-antígeno-alvo é obtida no sangue periférico. De preferência, para VHH anti-VP6, a quantidade de célu- las secretoras de anticorpos IgG no sangue periférico deve ser de cerca de células secretoras de anticorpos IgG anti-RT completo. Aqueles habilita- dos na técnica sabem que podem ser usados outros esquemas de imuniza- ção para se obter VHHs adequados para os métodos e as composições des- ta invenção.

A fim de selecionar os fagos que expressavam VHH anti-RV, foram realizadas três rodadas de seleção in vitro usando RV IND como o antígeno. Foram selecionados 192 clones. Foram feitas análises de restrição para todos os clones que apresentaram uma grande diversidade de ligação de VP6 na biblioteca de VHHs; essa foi determinada por ELISA do fago. Os clones também foram testados por ELISA para determinar sua capacidade para se ligar a um RV e à VP6. De 14 clones com seqüências diferentes, foram selecionados 10 clones que mostraram ligação específica mais forte ao RV e à VP6, e eles foram subclonados em um vetor de expressão que fornece um tag de hexahistidina no terminal carbóxi para facilitar a purifica- ção deste (Tabela 1). Tabela 1

Sumário dos resultados da avaliação qualitativa para selecionar os domínios VHH Rodada/ Fago RV ELISA Fago VP6 ELISA Teste de expressão Detecção de RV por ELISA Monômeros de VHH condição de bio- panning Aparência da cultura Nível de expressão VHH como captura 1 VHH como anticorpo secundário 2RE4 2a A ++ + normal +++ ++ +++ 2KA4 2a B +++ +++ normal +++ ++ +++ 2KA5 2a B +++ - Lise + ++ +++ 2KA10 2a B +++ +++ Lise Não puri- ficado ++ +++ 2KD1 2a B +++ +++ normal +++ ++ +++ 3A6 3a B ++ + normal +++ ++ +++ 3B2 3a B +++ ++ normal ++ ++ +++ 3C10 3a B +++ - normal ++ ++ +++ 3D9 3a B +++ +++ normal +++ ++ basal 3H1 3a B +++ - Lise Não puri- ficado ++ +++

1 Ligado à placa usando anticorpo anti-histidina.

Foram selecionados quatro clones que se ligaram mais forte- mente às cepas de RV que correspondiam aos diferentes subgrupos; esses clones foram denominados 2KA4 (SEQ ID N°: 1), 2KD1 (SEQ ID N°: 2), 3A6 (SEQ ID N0: 3) e 3B2 (SEQ ID N°: 4), que reconheciam um VP6 re- combinante e sua contraparte nativa de RV IND avaliada por Western Blot, o que indica que o referido VHH se liga aos epitopos conformacionais dessa proteína VP6 (Figura 2). Daqui por diante, os VHH denominados 2KA4, 2KD1, 3A6 e 3B2 são os domínios VHH da invenção. As seqüências de DNA que codificavam cada um dos domínios

VHH foram as seguintes:

SEQ ID N°: 5 codifica o domínio do SEQ ID N°: 1; SEQID N°: 6 codifica o domínio do SEQ ID N0: 2; SEQ ID N°: 7 codifica o domínio do SEQ ID N°: 3; SEQID Ν°: 8 codifica o domínio do SEQ ID N0: 4;

Aqueles habilitados na técnica sabem que qualquer seqüência de DNA que codifica os referidos domínios se enquadra no escopo desta invenção. Por exemplo, a seqüência de aminoácidos SEQ ID N°: 1 pode ser codificada pela seqüência de DNA SEQ ID N0: 5 ou por outra seqüência de DNA que difere do SEQ ID N°: 5 em função da degeneração do código ge- nético. O mesmo exemplo é válido para cada uma das seqüências de ami- noácidos (SEQ ID N0: 2, 3 e 4) codificada pelas respectiva seqüências de DNA (SEQ ID N°: 6, 7 e 8). O VHH anti-VP6 específico da invenção foi muito eficiente como

reagente para o diagnóstico imunológico de RV. As formas monoméricas do VHH da invenção foram testadas em ELISA como anticorpos de captura, como anticorpos secundários, ou imobilizados por meio de anticorpos anti- His. O VHH da invenção foi capaz de detectar cepas de RV de origem hu- mana ou animal com diferentes subgrupos específicos e diferentes tipos G e P (Figura 3A).

Por outro lado, foram construídos vetores de expressão para a produção do VHH dimérico da invenção que se liga especificamente à VP6, que constituem genes de VHH idênticos ligados a uma seqüência de ligação similar à seqüência de dobradiça (hinge) de IgA humana. O VHH dimérico da invenção também foi avaliado em ELISA como captura direta, mostrando sinais nítidos e reprodutíveis para todas as cepas de RV estudadas (Figura 3B). O VHH dimérico da invenção pode ser usado para sensibilização da placa de ELISA, eliminando, dessa forma, a necessidade de usar anticorpos de captura de VHH1 e exibe melhores resultados para a detecção de RV do que sua contraparte monomérica.

Vale ressaltar que os rendimentos de VHH monomérico expres- so no periplasma de E. coli foram comparáveis com aqueles relatados por outros autores em E. coli e leveduras. O VHH monomérico e o dimérico desta invenção provaram ser

muito úteis para o diagnóstico de RV e, portanto, podem ser usados como anticorpos monoclonais recombinantes em qualquer diagnóstico imunológico conhecido por aqueles habilitados na técnica. É evidente para aqueles habili- tados na técnica que os domínios VHH monoméricos e diméricos da inven- ção podem ser usados para qualquer tipo de ensaio diagnóstico imunológico para detectar RV, e que os referidos ensaios estão incluídos no escopo des- ta invenção.

Os domínios anti-VP6 da invenção podem ser usados para a construção de dímeros como aqueles aqui descritos, por exemplo, homodí- meros, ou podem ser fundidos para formar heterodímeros, por exemplo, por fusão do domínio 3B2 com o domínio 3A6, ou por fusão de dois dos monô- meros de VHH da invenção. Além disso, três ou mais monômeros de VHH da invenção também podem ser fundidos ou combinados para gerar homo- trímeros ou heterotrímeros. Todas as formas multiméricas que surgem da combinação de monômeros de VHH da invenção, contenham eles ou não uma seqüência de ligação, estão incluídas no escopo desta invenção. Em uma modalidade preferida, os dímeros de VHH da invenção possuem as seqüências reveladas como SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, ou SEQ ID N0: 11, ou SEQ ID N0: 12. Por exemplo, os dímeros podem compreender uma seqüência de ligação de aminoácido como, por exemplo, aquela mos- trada no SEQ ID N°: 13, ou qualquer outra seqüência que atue como uma seqüência de dobradiça.

A Tabela a seguir mostra algumas características do VHH dimé- rico e monomérico da invenção. Tabela 2 Características

Monômeros Especificidade de Rendimento Polir- Neutralização proteína 1 da produção reativo da infectivida- em larga es- para RV de de RV in cala (mg/l)2 (ELISA)3 vitro ^g/100 FFU RV) 2KA4 VP6 52,1 sim NO 2KD1 VP6 21,3 sim High 3A6 VP6 18,6 sim Média 3B23 VP6 16,9 sim Alta VHH não re- lacionado Proteína celular 7,2 NÃO NÃO Dimers Biv2A4 NA 0,90 sim NÃO* Biv2KD1 NA 0,50 sim Baixa Biv3A6 NA 1,72 sim Baixa e cepa- dependente

1 Determinado por WB contra RV IND e VP6 recombinante.

2 Baseado em um conjunto de 6 culturas de 0,5 I cada, purificado por meio de uma coluna tag anti-histidina.

3 Detecção de cepas de RV Sb I, Sb II, Sb no I; no II.

Os domínios anti-VP6 VHH da invenção foram capazes de neu- tralizar diferentes cepas de RV in vitro. Três de quatro monômeros da inven- ção (2KD1, 3A6 e 3B2) mostraram atividade amplamente neutralizante in vitro. A capacidade neutralizante de cada VHH foi homogênea para todas as cepas de RV avaliadas. Concentrações de monômero de 3,9 μς/ml foram capazes de neutralizar completamente a infectividade gerada por 100 FFU de cepas de RV C486 (P[1]G6), IND (P[5]G6), B223 (P[11]G10), Wa P[8]G1 e H2 (P[12]G3), in vitro. A Tabela 3 lista a titulação de neutralização contra diferentes cepas de RV de uma solução com uma concentração de 2 mg/ml para cada monômero. Tabela 3

Titulação de neutralização dos diferentes domínios VHH monoméricos e di- méricos

Titulação de anticorpo VN 1

Domínio VHH Cone. de VHH avali- ada IND Sbl P[5]G6 C486 Sbl P[1]G6 B223 Sbl P[11]G1 0 Wa Sbll P[8]G1 H2 Sb nol, noll P[12]G3 Domínio ViSffllt •'-Vi·- '· '■ 2KA4 <8 <8 <8 <8 <8 2KD1 3A6 2 mg/ml 2048 1024 2048 1024 2048 256 8192 2048 512 128 3B2 1024 1024 2048 8192 512 VHH não rela- cionado 0,4 mg/ml <8 <8 <8 <8 <8 Dímeros Biv2KA4 0,5 mg/ ml <8 <8 <8 32 <8 Biv2KD1 0,5 mg/ ml 32 128 8 128 32 Biv3A6 2 mg/ml 128 512 8 512 128

1 Titulações neutralizantes de anticorpo para diferentes cepas de RV1 ex- pressas como o inverso da maior diluição de VHH que reduz >80% das uni- dades formadoras de foco geradas por 100 FFU de cada cepa de RV.

Portanto, os monômeros de VHH foram capazes de neutralizar cepas de RV que pertencem a diferentes combinações de tipos G/P que normalmente não induzem neutralização cruzada. O monômero de VHH com a maior capacidade de neutralização foi o monômero 2KD1. Por outro lado, embora o monômero 2KA4 fósse capaz de reconhecer adequadamente to- dos os RVs em ELISA, ele não neutralizou qualquer uma das cepas estuda- das. A capacidade dos VHHs da invenção para neutralizar titulações eleva- das de cepas de RV antigenicamente diferentes é de grande importância e os tornam moléculas polineutralizantes; essa propriedade faz com que sejam ferramentas potenciais na prevenção ou tratamento para diarréia induzida pelo RV, independentemente do sorotipo (27 tipos P e 16 tipos G).

O VHH dimérico mostrou menos atividade de neutralização do que suas contrapartes monoméricas.

Foi avaliada a capacidade dos monômeros de VHH da invenção para tratar e evitar a diarréia produzida por infecção por RV. Para essa fina- lidade, camundongos neonatais receberam a administração de uma dose intragástrica diária de VHH por 5 dias (dia 0 a 4). Os camundongos foram atacados no 1o dia com a cepa viral C486, também pela via intragástrica (Fig. 5). Sessenta por cento dos camundongos tratados com VHH monomé- rico da invenção 3B2 foram protegidos contra diarréia induzida pelo RV. Es- sa proteção foi significativamente maior quando era feita uma comparação entre os camundongos tratados e os camundongos não tratados ou com a- queles tratados com VHH não relacionado (p = 0,0108), em que todos os camundongos sofriam de diarréia (Tabela 4 e Figura 5). Além disso, a gravi- dade e a duração da diarréia nos animais tratados com o VHH da invenção foram significativamente reduzidas, quando comparadas com os grupos de controle. Tabela 4

Proteção contra o ataque com Rotavírus em camundongos Iactantes

Tratamento η Diarréia (100 pg de Duração Gravidade % de a- Início Duração Gravi- VHH I.G. uma média no média no nimais média da dade da vez ao dia grupo grupo afetados diarréia diarréia por 4 dias:0- em ani- em ani- 5) Ataque no mais afe- mais 1° dia: C486 tados afetados (2x10Λ5 FFU) 2KA4 10 2AB 3,7 B 80 AB 1,25 A 2,5 AB 4,12 B 2KD1 10 1,4 B 3,25 B 70 AB 1,28 A 2,0 B 3,78 B 3A6 10 2,2 AB 4,15 AB 90 AB 1,22 A 2,4 AB 4,39 AB 3B2 10 0,8 B 2,65 B 40 B 1,25 A 2,0 B 3,62 B VHH não rela- 5 2,4 AB 4,4 100 A 1,2 A 2,4 AB 4,4 AB cionado Soro policlo- 5 0 B 2,1 B 0 B na na na nal positivo Soro policlo- 5 2,4 AB 4,25 AB 100 A 1,2 A 2,4 AB 4,25 AB nal normal Não tratado/ 15 3 A 5,3 A 100 A 1,05 A 3,3 A 5,31 A atacado Não tratado/ 5 0 B na OB na na na não atacado

na: não aplicável

Os valores médios das mesmas colunas com letras diferentes diferem significativamente (Kruskal Wallis, ρ < 0,05).

As percentagens de animais afetados com letras diferentes dife- rem significativamente (Teste Exato de Fisher, ρ < 0,05). Deve-se observar que a maior titulação de neutralização foi obti- da contra a cepa de RV heteróloga humana (Wa, Sbll, P[8]G1), que é consi- derada como sendo a cepa mais comumente associada à gastroenterite em crianças em todo o mundo.

A produção e a purificação desses fragmentos de anticorpo po-

dem ser efetuadas com rendimentos elevados, levando a um menor custo de produção. Isso é particularmente relevante em países em desenvolvimento, onde a magnitude da infecção e a morbidade/mortalidade causada pelo RV são enormes, e os custos de tratamento e prevenção são fatores Iimitantes cruciais.

Aqueles habilitados na técnica sabem que, com base no que é aqui revelado, os domínios VHH da invenção podem ser produzidos por sín- tese da seqüência de nucleotídeos correspondente e pela expressão desta em qualquer célula hospedeira, sem a necessidade de criar uma biblioteca de fago.

É evidente para aqueles habilitados na técnica que diferentes combinações e misturas dos monômeros de VHH, dímeros de VHH ou mul- tímeros de VHH da invenção podem ser usadas para o diagnóstico imunoló- gico, prevenção de infecções por RV e tratamento de mamíferos infectados por RV, sem alterar o espírito desta invenção, e em que todas as combina- ções e misturas possíveis estão incluídas no escopo desta invenção.

Como foi mencionado anteriormente, foram selecionados quatro clones que se ligaram mais fortemente às cepas de RV que correspondem aos diferentes subgrupos. Esses clones foram denominados 2KA4 (SEQ ID N°: 1), 2KD1 (SEQ ID N°: 2), 3A6 (SEQ ID N0: 3) e 3B2 (SEQ ID N°: 4), que reconheceram uma VP6 recombinante e sua contraparte nativa de RV IND avaliado por Western Blof, que indica que o referido VHH se liga aos epitopos lineares dessa proteína VP6.

Os referidos domínios da invenção (SEQ ID N°: 1 a 4) ou as seqüências de nucleotídeos que os codificam (SEQ ID N°: 5 a 8) podem ser inseridos em um vetor recombinante apropriado, por exemplo, um vetor de expressão. Portanto, a presente invenção ainda se refere a um vetor de ex- pressão que compreende as referidas seqüências. A seleção do vetor é uma função do tipo de célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. Ilustra- tjvàmente, o vetor pode ser um plasmídeo ou um vetor que, uma vez intro- duzido na célula hospedeira, é integrado ou não no genoma da referida célu- Ia hospedeira. O referido vetor pode ser obtido com a utilização de qualquer método conhecido existente na técnica [Sambrok et al. 1989]. Em uma mo- dalidade preferida, o vetor da invenção pode ser usado para ser inserido no genoma de células de plantas ou de animais. Dessa forma, o vetor da inven- ção pode ser, por exemplo, um vetor de Agrobacterium tumefaciens ou um vetor viral capaz de ser expresso em células de plantas ou de animais. Em uma modalidade em particular, o vetor viral usado na presente invenção é Baculovírus (veja o Exemplo 5).

O vetor pode ser usado para transformação, transfecção ou in- fecção de células de plantas, algas ou animais, de preferência células de insetos ou larvas. Portanto, a presente invenção ainda se refere às células transformadas, transfectadas ou infectadas pelo vetor da invenção.

Em uma modalidade preferida da invenção, a célula transgênica é uma célula animal, de preferência uma célula de inseto e, mais preferivel- mente, larvas da referida célula de inseto. Portanto, a invenção ainda se re- fere a um animal transgênico não humano como, por exemplo, um inseto transgênico ou larvas transgênicas que expressam o peptídeo caracterizado pelo SEQ ID N°: 1 a 4 em um rendimento elevado.

Portanto, o vetor da invenção pode ser usado para produzir e/ou armazenar os domínios da invenção caracterizados pelo SEQ ID N0: 1 a 4 e/ou 9 a 12. Consequentemente, a presente invenção ainda se refere a um método para a produção de domínios da invenção que compreende o cres- cimento da célula ou do organismo transfectado, transformado ou infectado com o vetor da invenção sob condições que permitem a produção dos referi- dos domínios. As condições para a otimização da cultura da célula ou orga- nismo transgênico dependerão do tipo de célula ou organismo usado. Se desejado, o método para a produção dos domínios da invenção ainda com- preende seu isolamento e purificação de acordo com qualquer um dos mé- todos conhecidos na técnica.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere aos anticorpos caracterizados por compreenderem qualquer um dos domí- nios da invenção:

- um domínio VHH monomérico derivado de anticorpos de camelídeo, carac- terizado pelo fato de compreender as seqüências selecionadas do grupo formado pelo SEQ ID N0: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4, em que os referidos domínios se ligam à proteína VP6 do rotavírus (RV) do grupo A.

- um domínio VHH dimérico que se liga à proteína VP6 do RV do Grupo A, caracterizado pelo fato de que compreender pelo menos uma seqüência de monômero selecionada do grupo formado pelas seqüências mostradas no SEQ ID N°: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4.

Outro aspecto da presente invenção se refere a um kit para imu- nodetecção de RV que compreende uma seqüência de aminoácidos sele- cionada do grupo formado pelo SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, e combinações destes.

A invenção ainda se refere a uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo formado pelo SEQ ID N0: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N0: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, e combinações destes, para uso em um método para a prevenção de infecções produzidas por RV. Em outras palavras, a invenção se refere ao uso de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo formado pelo SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, e combinações destes, pa- ra a fabricação de uma composição para a prevenção de infecções produzi- das por RV.

Além disso, a invenção ainda se refere a uma seqüência de a- minoácidos selecionada do grupo formado pelo SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, e combinações destes, para uso em um método para o tratamento de infecções produzidas por RV. Em outras palavras, a invenção se refere ao uso de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo formado pelo SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N0: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N0: 11, SEQ ID N°: 12, e combina- ções destes, para a fabricação de uma composição para o tratamento de infecções produzidas por RV.

Finalmente, a presente invenção se refere a um método para imunização passiva que compreende a inoculação de uma quantidade eficaz dos anticorpos definidos acima no corpo de um ser humano ou de um ani- mal.

DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS DE ACORDO COM O TRATADO DE BUDAPESTE

O plasmídeo pFBMelVHH (veja o Exemplo 5) foi depositado na "Spanish Type Culture Collection" (CECT); Universidade de Valência, Espa- nha, com o número de acesso CECT7431, no dia 02 de julho de 2008. EXEMPLOS

Esta invenção é mais bem ilustrada pelos exemplos a seguir, que não devem ser interpretados como sendo uma limitação imposta ao es- copo desta. Pelo contrário, deve-se entender claramente que podem ser u- sadas modalidades, modificações e equivalentes destes que essa descrição possa sugerir àqueles habilitados na técnica, sem se afastar do espírito des- ta invenção e/ou do escopo das reivindicações em anexo. Exemplo 1: Obtenção e purificação do VHH monomérico e dimérico da in- venção

Obtenção da biblioteca de VHHs da invenção:

a cepa de RV IND bovino de referência foi usada (Sbl; P[5]G6) como um antígeno no processo de biopanning para a seleção do VHH. A fim de ter um painel de RV que represente diferentes reatividades dos subgru- pos com diferentes combinações de tipos G e P de diferentes espécies ani- mais e de seres humanos, as cepas de RV de referência listadas na Tabela 4 foram incluídas nos diferentes ensaios realizados para produzir o VHH. Os vírus foram propagados em células de rim de macaco (MA-104). Também foi incluída uma amostra fecal de um bezerro neonatal que não recebeu colos- tro com a cepa IND no momento da pré-inoculação e no pico da dissemina- ção do vírus. Tabela 5

Cepas de rotavírus de referência usadas nos diferentes procedimentos reali-

zados durante a produção e caracterização do VHH da invenção_

Cepa de Espécie de Subgrupo Tipo G-P Procedimento

RV _origem __

C486 Bovina I P[1]G6 Antígeno VP6 recombinan-

te usado para vacinação e para ELISA específica Resposta de anticorpo de Ihama (VN)

Caracterização do Iigante (VN, ELISA)

_Ataque em camundongos

IND Bovina I P[5]G6 Seleção do Iigante (Bio-

panning-, Fago-ELISA Caracterização do Iigante (VN, ELISA)

Resposta de anticorpo de Ihama (VN, ELISA, ELIS-

_POT)_

B223 Bovina I P[11]G10 Resposta de anticorpo de

Ihama (VN)

Caracterização do Iigante

_(VN, ELISA)_

Wa Humana Il P[8]G1 Resposta de anticorpo de

Ihama (VN)

Caracterização do Iigante _(VN, ELISA)_ Η2 Eqüina no I; P[12]G3 Resposta de anticorpo de

no Il Ihama (VN)

Caracterização do Iigante

_(VN, ELISA)_

Imunização das lhamas: Proteína VP6 derivada da cepa de RV bovino

C486 (SblP[1]G6) foi produzido em células Sf9 infectadas com um baculovírus recombinante. Uma Ihama macho com 1 ano de idade rece- beu cinco doses de extrato celular bruto contendo 500 pg de VP6 misturados

com adjuvante de óleo INTA (Marcol:Arcel:Span:Tween) nos dias 0, 21, 28,

e 246. Amostras de soro e de sangue foram coletadas nos dias 0, 4 e 7

após cada inoculação. A resposta humoral foi avaliada por ELISA e neutrali-

zação viral (VN) (veja abaixo). A fim de avaliar a resposta de célula B efeto-

ra, foi adaptado um ensaio ELISPOT que determina o número de células

secretoras de anticorpos específicos para RV no sangue periférico na Ihama

inoculada, com base em ensaios ELISPOT prévios realizados em porcos e

bezerros (Parreno, V.C. etal., Vet. Immunol. Immunopathol. 100: 7-24, 2004,

e Parreno, V.V. etal., J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public. Health. 48: 713-

20, 2001, aqui incorporado unicamente como referência). Resumidamente,

células MA-104 infectadas com BRV IND (com mais de 80% de infecção de-

tectada por imunofluorescência) foram fixadas, cresceram em placas de 96

poços, com acetona 70%, secas ao ar e armazenadas a -20°C até que fos-

sem usadas. As suspensões de células mononucleares (MNC) derivadas do

sangue periférico (PB) da Ihama inoculada foram adicionadas aos poços (1 χ

1 06; 5 χ 105; 2,5 χ 105 e 1,25 χ 105 células/poço). Após centrifugação a 500 g

por 5 minutos, as placas foram incubadas por 12 a 14 horas a 37°C em CO2

5%. As placas foram lavadas com PBS com Tween 20 0,05% a fim de remo-

ver as células aderentes, e os spots foram gerados por adição do mesmo

conjugado usado em ELISA em uma diluição de 1/1.500 por 2 horas a 37°C,

seguida por 50 μΙ do sistema de substrato de peroxidase TMB (KLP, Mar- yland, EUA).

A manipulação, a inoculação e a coleta de amostras de Ihama foram feitas por pessoal treinado sob a supervisão de um veterinário, de a- cordo com protocolos aprovados pelo comitê de ética para o bem-estar ani- mal do INTA.

Produção da biblioteca de VHHs e seleção do VHH de ligação de VP6 da invenção: de um total de 900 ml de sangue coletado 4 dias após a última injeção, 6 χ 108 células mononucleares foram extraídas por centrifu- gação por gradiente Ficoll Paque; elas foram então centrifugadas, congela- das em nitrogênio líquido e subseqüentemente mantidas a -80°C. O RNA total foi extraído usando um equipamento de extração de RNA (Macherey Nagel; Nucleospin RNA II), obtendo 250 pg de RNA. Subseqüentemente, a primeira cadeia de cDNA foi sintetizada usando o equipamento de Transcrip- tase Reversa Superscript Ill (Invitrogen), com iniciadores OIigodT (12-18) (Invitrogen) ou iniciadores aleatórios (Invitrogen). Em uma mistura de reação de 20 μΙ, 0,2, 1 ou 5 pg de RNA total foram usados. O cDNA que codifica VHH e VH foi amplificado especificamente por PCR usando iniciadores CALL01 (SEQ ID N0: 14) e CALL02 (SEQ ID N°: 15), que anelam com as seqüências líderes e CH2. O fragmento de 600 pb (éxons VHH-CH2 sem o éxon CH1) foi eluído de um gel de agarose 1,6%, após sua separação do fragmento de 900 pb (éxons VH-CH1-CH2). O VHH foi então amplificado por uma PCR abrigada adicional com iniciadores que anelam na região estrutura 1 (SEQ ID N°: 16) e região estrutura 4 (SEQ ID N°: 17), e com iniciadores que contêm sítios de restrição para as etapas de clonagem subsequentes: VHHfor2: (SEQ ID N°: 18), com sítios de restrição para Ncol e Pstl, e VH- Hrev2 (SEQ ID N°: 19), com um sítio de restrição para Notl. Os fragmentos de PCR finais foram ligados usando sítios de restrição Ncol ou Pstl a jusante e um sítio de restrição Notl a montante, em vetor de fagomídeo pAO-Lib, uma versão modificada de pHEN4 (Arbabi Ghahroudi M., Desmyter A., Wyns L., Hamers R., Muyldermans S. "Selection and Identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies". FEBS Lett. Setem- bro 1997 15; 414(3): 521-6), que contém uma seqüência longa irrelevante que é removida após a inserção de VHH, de modo a retardar a propagação potencial do vetor, sem o inserto de VHH. Células de Escherichia coli (TGI) foram transformadas com o material ligado e as células foram semeadas. As colônias foram raspadas das placas, lavadas e mantidas a -80°C em meio LB suplementado com glicerol (concentração final de 50%).

O VHH específico foi selecionado da biblioteca usando a tecno- logia de apresentação em fago. A biblioteca de VHHs foi infectada com fa- gos auxiliares (ΙηβΙρβή M13 (Invitrogen), e as partículas de fago que expres- sam o repertório de VHHs foram resgatadas e precipitadas com PEG, como descrito por Marks, J.D., Hoogenboom, H.R., Bonnert, T.P., McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. JMB, 1991. O enriquecimento em VHH específico foi realizado por duas a três rodadas de seleção in vitro, ou seja, pela técnica conhecida como biopanning. Os imunotubos foram revestidos de um dia pa- ra o outro a 4°C com uma diluição de 1/50 de BRV IND semipurificado (Sbl; P[5]G6) ou com uma diluição de 1/5.000 de um antissoro policlonal anti-RV de porquinho-da-índia em tampão de carbonato em pH 9,6, seguida por uma etapa de bloqueio, e uma diluição de 1/50 do mesmo BRV IND foi capturada. Os fagos resgatados foram incubados com o BRV IND, diretamente ou com aquele capturado previamente, lavados, e as partículas de fago ligadas fo- ram eluídas com 100 mM de trietilamina em pH 10,0, e imediatamente neu- tralizados com Tris pH 7,4. Os fagos eluídos foram usados para infectar ex- ponencialmente células em crescimento TG1. Após a segunda ou terceira rodada de biopanning, as colônias individuais foram desenvolvidas e os clo- nes de VHH correspondentes foram analisados por ELISA de fago.

Expressão e purificação do VHH monomérico e dimérico da in- venção: o cDNA de VHH dos clones que eram positivos em ELISA foi reclo- nado usando enzimas de restrição Ncol e Notl no vetor de expressão pHEN6 (Conrath, K.E.M. et ai. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 2.807-12, 2001, aqui incorporado unicamente como referência), que fornece uma seqüência de direcionamento pelB para o periplasma e um tag de seis histidinas do terminal carbóxi. O VHH bivalente foi construído por amplificação por PCR da seqüência de VHH usando os iniciadores Bivfor2 (SEQ ID N0: 20) e Bi- vrev2 (SEQ ID N°: 21) (SEQ ID N°: 22), que codificam um vinculador rela- cionado à dobradiça de IgA humana. O produto de PCR e o vetor pHEN6 que contém o modelo de VHH foram digeridos com Ncol e Pstl, e ligados para produzir o vetor pAO-biv, que contém o VHH bivalente. A fim de produ- zir o VHH monovalente ou bivalente, células de E. coliXL1 Blue foram trans- formadas com as diferentes construtos de plasmídeo. A expressão de VHH foi induzida com 1 mM de isopropil-D-tiogalactopiranosídeo por 16 horas a 27 0C (Sambrook, J., e Russell, D.W., 2001, "Molecular Cloning"). Após cen- trifugação das células, as proteínas periplasmáticas foram extraídas por choque osmótico. O VHH foi purificado do extrato periplasmático com o uso de uma coluna quelante N-High-Trap HP (Amersham Biosciences). Exemplo 2: Caracterização do VHH da invenção Western blot: concentrados de VP6 expressos em um sistema

de baculovírus e concentrados de BRV IND foram ressuspensos em um tampão de amostra de Laemmli, fervidos por 10 minutos. Eles foram então processados através de uma coluna de SDS-PAGE 12% e transferidos para uma membrana Immobilon P (Millipore, Berdford, MA). A membrana foi blo- queada por 45 min com PBS/Tween (0,05%), contendo leite desnatado 10%, e cada um dos VHHs (4 pg/ml) foi incubado por 2 h em temperatura ambien- te. A membrana foi então lavada com PBS/Tween (0,05%) e incubada de um dia para o outro a 4°C com o anticorpo anti-penta-histidina (diluição de 1/500 em PBS/Tween (0,05%) BSA (3%). Finalmente, foram incubados com IgG de cabra anticamundongo conjugada à HRP (peroxidase de rábano silvestre) (diluição de 1/5.000) (Amersham, Pharmacia, Biotech) por 40 min em tempe- ratura ambiente. Os ensaios foram desenvolvidos com ECL (Amersham Bi- osciences).

Sequenciamento do VHH da invenção: a fim de sequenciar o VHH, foram usados os oligonucleotídeos "M13 direto" e "M13 reverso", se- guindo esse método: "Big Die Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Applied Biosystem) em um sequenciador automático ABI-Prism 377 DNA (Perkin Elmer, Applied Biosystems).

Exemplo 3: Ensaios de imunodetecção RV usando o VHH da invenção Imunoensaio de enzima (ELISA) e Western blot: os experimen-

tos de ELISA foram realizados em placas de 96 poços Maxisorp (Nunc), por sensibilização direta com RV ou por captura de RV ou de VP6 recombinante com um anticorpo policlonal produzido em um porco gnotobiótico. Como an- tígenos para o controle negativo, foram usadas células MA-104 pseudoinfec- tadas e uma proteína não relacionada expressa em baculovírus (proteína E2 do vírus da diarréia bovina). PBS foi usado como espaço em branco, e soro de porquinho-da-índia não imunizado foi usado como captura negativa.

A presença de anticorpos anti-RV no soro de Ihama foi analisada como descrito em Parreno, V.C. et ai, Vet. Immunol. Immunopathol. 100: 7- 24, 2004, e a de anticorpos anti-VP6 foi analisada com um protocolo adapta- do de Fernández et al. (Fernandez, F.M. et al., Vaccine 16: 507-16, 1998). As IgGs de Ihama foram detectadas usando uma IgG de cabra antilhama (H+L) marcada com peroxidase (Betil, Iab inc, Montgomery, CA, USA), em uma diluição de 1/2.000.

Os fagos derivados dos clones individuais obtidos por biopan- ning foram analisados por ELISA de fago. Resumidamente, clones individu- ais de E. coli crescimento em exponencial TG1, contendo os diferentes ge- nes de VHH no vetor phen4, foram infectados com fagos auxiliares M13 a fim de produzir partículas de fago que expressam VHH fundido à proteína de superfície, e o sobrenadante da cultura que contém a prole do fago foi avali- ado em placas de ELISA sensibilizadas com BRV IND ou VP6. Os fagos Ii- gados foram detectados usando uma diluição de 1/5.000 de um anticorpo anti-M13p8 conjugado à HRP (Amersham, Pharmacia, Biotech) por 40 minu- tos em temperatura ambiente. Os ensaios foram desenvolvidos com o uso de H202/ABTS (Zymed).

Primeiro, o VHH monovalente ou bivalente purificado com o tag 6-His do terminal carbóxi foi estudado como reagente para detectar RV ou VP6 por ELISA, como descrito acima, desenvolvido por um anticorpo mono- clonal anti-penta-histidina (Qiagen, 1/5.000) e um anticorpo de cabra antica- mundongo conjugado à HRP. Em segundo lugar, esses foram analisados como um reagente de captura de RV, tanto por sensibilização da placa de ELISA direta de 10 pg/ml de VHH quanto por captura por 10 pg/ml de anti- corpo monoclonal anti-histidina e, subseqüentemente, 20 pg/ml de VHH. Os ensaios foram desenvolvidos com o uso de um antissoro policlonal de RV de um bezerro que não recebeu colostro hiperimunizado com BRV IND (diluição de 1/2.000) e a IgG anti-bovina (H+L) marcada com peroxidase (KPL, Gai- therburg, Maryland, EUA) em uma diluição de 1/5.000.

O VHH dimérico foi testado por ELISA como um reagente de captura de RV a 10 pg/ml.

O VHH monomérico também foi avaliado como anticorpo secun- dário, e a ELISA foi desenvolvida com anticorpos monoclonais anti-penta- histidina e anticorpos de cabra anticamundongo conjugados à HRP (diluição de 1:1.000) (Amersham, Pharmacia, Biotech). Ensaios de neutralização viral: as titulações do anticorpo neutra-

Iizante para vírus IND, C486, B223, Wa e H2 em amostras de soro de Ihama e VHH purificado foram determinadas por neutralização fluorescente de foco (FFN), como descrito em To, T.L. et ai. (J. Gen. Viroi 79 (Pt 11): 2.661-72, 1998). Resumidamente, 100 μΙ de diluições seriais de soro de lhama, mo- nômeros ou dímeros de VHH purificado selecionados foram misturados com volumes iguais de vírus a fim de obter 100 unidades formadoras de foco (FFU)/100 μΙ de mistura, e incubados por uma hora a 37°C. Cem μΙ da mistu- ra de anticorpo-vírus foram plaqueados em monocamadas de MA-104 (4 réplicas) e incubados por 48 horas a 37°C. As placas foram fixadas com ace- tona 70% e o ensaio foi desenvolvido com o uso de um anticorpo anti-RV marcado com FITC de um bezerro que não recebeu colostro hiperimunizado com RV. A titulação de VN foi expressa como a recíproca da maior diluição da amostra que leva a >80% de redução no número de focos fluorescentes. Exemplo 4: Uso do VHH monomérico e dimérico da invenção para preven- ção e/ou tratamento de mamíferos

Ensaios de proteção de RV em camundongos neonatais:

Cem μg de cada monômero de VHH anti-VP6 em 100 μΙ foram administrados a camundongos Balb/c com quatro dias de idade, usando uma sonda intragástrica, uma vez ao dia, começando no dia 0 e por 5 dias. Os camundongos Iactantes foram atacados com 100 μΙ de BRV C486 (Sbl; P[1]G6), contendo 2 χ 106 FFU/ml, no 1o dia, 2 horas após a dose de VHH habitual, e depois com 20 μΙ de uma solução de bicarbonato 5%, também por via intragástrica. O inoculado foi capaz de produzir diarréia em 100% dos camundongos não tratados de controle. Os grupos de controle usados no experimento foram: (i) camundongos inoculados com RV e não tratados com anticorpos; ii) camundongos tratados com a mesma quantidade de VHH não relacionado, dirigidos contra uma proteína celular; iii) camundongos tratados com 450 pg de IgG purificada por afinidade derivada de um anti-soro policlo- nal de porquinho-da-índia com uma titulação de VN de 2.048 contra o RV homólogo; iv) camundongos tratados com a mesma quantidade de IgG de um porquinho-da-índia soro-negativo de controle; v) camundongos não infec- tados e tratados. A diarréia induzida pelo RV foi avaliada clinicamente por palpação direta do abdome dos camundongos durante os 5 dias do estudo. A gravidade da diarréia foi analisada diariamente, atribuindo-se um valor numérico com base na cor e consistência das fezes, como descrito por Van Cott, J.L. et ai, J. Viroi 80: 4.949-61, 2006. O teste exato de Fisher foi usa- do para comparar as proporções de camundongos com diarréia entre os grupos. O teste não paramétrico de Kruskal Wallis foi usado para comparar o surgimento, a duração e a gravidade médias da diarréia entre os grupos tra- tados.

Exemplo 5: Geração de baculovírus recombinante O baculovírus recombinante BacMeIVHH foi gerado pelo plasmí-

deo phen 6 que contém a seqüência completa de VHH 3B2. A proteína foi amplificada por PCR pelo plasmídeo phen 6 usando os seguintes iniciado- res: SEQ ID N°: 23 e SEQ ID N°: 24. Esse amplicon foi então clonado no vetor pFastMelB2 em estrutura com uma seqüência sinalizadora de inseto derivada da melitina de cera de abelha, usando os sítios de restrição BamHI e Xbal incluídos nos iniciadores correspondentes. O plasmídeo pFBMelVHH resultante era caracterizado por sequenciamento automatizado e usado para gerar o baculovírus recombinante BacMeIVHH usando o sistema de Baculo- vírus Bac-to-Bac® (Invitrogen, USA) de acordo com as instruções do fabri- cante. O baculovírus recombinante foi propagado e amplificado em células de insetos sf21 até alcançar titulações infecciosas entre 107 e 109 pfu/ml, e os estoques foram mantidos a 4°C para uso diário e a -80°C para armaze- namento de longo prazo.

Condições de crescimento e inoculação de inseto

Para experimentos de expressão, larvas de quinto instar (larvas de ultimo instar antes da pupação) com peso de cerca de 250 mg foram inje- tadas com os baculovírus recombinantes próximo à falsa-perna (proleg) (a frente da cavidade corporal) usando doses conhecidas de pfu/larva. As lar- vas infectadas foram mantidas em câmaras de crescimento a 28°C e coleta- das nos tempos indicados. As larvas foram então imediatamente congeladas e mantidas a -20°C até processadas. As culturas de células de inseto também foram infectadas usan-

do doses conhecidas. As células infectadas foram mantidas a 28°C por 72 h. Finalmente, as culturas infectadas foram coletadas e os péletes celulares também foram imediatamente congelados e mantidos a -20°C até processa- dos.

Preparação de extratos de proteína

As proteínas solúveis totais (TSP) de larvas de T. ni foram obti- das flexionando-se as larvas congeladas em um tampão de extração con- tendo triton 0,01%; 25 mM de DTT e um coquetel inibidor de proteína (Com- pleto, Roche, Alemanha) em PBS 1X. Análise de extratos de proteína

Uma coloração de azul de Coomassie e uma análise por imu- noblotting foram feitas para a quantificação e detecção da proteína de VHH específica contida nos TSPs. Dessa forma, 20 pg de TSP por raia foram car- regados em géis de SDS-poliacrilamida 12%. Após eletroforese, os géis fo- ram corados com uma solução de azul de Coomassie ou transferidos para membranas de nitrocelulose (Schleicher & Schuell,) para a realização de um western blot.

Para ensaios de Western blot, SDS-PAGE (12%) foi transferido para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, EUA). A membrana foi blo- queada de um dia para o outro a 4°C com PBS 0,05% Tween 20 (PBST) e leite desnatado 4% (tampão de bloqueio, BF) e depois incubada em tempe- ratura ambiente (RT) por 1 hora usando um soro de coelho anti-VHH (1:100 em BF). A membrana foi lavada 3 vezes com PBST e finalmente anti-lgG de coelho marcado com HRP conjugado (1:2.000 em BF, Sigma, EUA) foi adi- cionado por 1 hora como anticorpo secundário. Após lavagem intensa com PBST, as bandas de proteína foram detectadas usando o sistema de detec- ção Western blotting ECL em películas Hyperfilm ECL (Amersham, USA) (veja a Figura 6A). Análise funcional

Os extratos TSP de VP6 (uma proteína de rotavírus bovino) que expressam larvas [Ag(+)] ou de larvas infectadas com um baculovírus re- combinante não inseto [Ag(-)] foram usados para revestir as microplacas de ELISA (Polysorp, Nunc, Dinamarca) com diluições seriais começando a 40 Mg/poço em 50 mM de tampão de carbonato/bicarbonato, pH 9,6, e incuba- dos de um dia para o outro a 4°C. No dia seguinte, as placas foram lavadas com PBST quatro vezes. As placas foram seqüencialmente incubadas por 1 hora a 37°C sob agitação constante, com solução de bloqueio (PBST-BSA 2%, 100 μΙ/poço) por 30 minutos. A seguir, com extratos de VHH TSP que expressam larvas a uma diluição de 2,5 pg/poço em tampão de bloqueio por 1 hora. As placas foram então lavadas 4 vezes com PBST e bloqueadas no- vamente por 30 minutos. A seguir, 100 μΙ/poço de um anticorpo policlonal (diluído a 1:100) contra o VHH feito em coelho foram adicionados e incuba- dos por 1 hora a 37°C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBST. Final- mente, foram adicionados 100 μΙ/poço de anti-lgG de coelho marcado com HRP conjugado diluído a 1:2.000 em solução de bloqueio. Para a reação de substrato, as placas foram lavadas quatro vezes, e 100 μΙ/poço de 1 mM de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) ABTS, (KPL, EUA) fo- ram adicionados às placas. Permitiu-se o desenvolvimento da reação de pe- roxidase por 5-10 minutos em temperatura ambiente, e as reações foram lidas a 405 nm em uma leitora de microplacas de ELISA (Multiskan EX, Thermo Electron Corp, EUA) (veja a Figura 7).

Claims (17)

1. Domínio de VHH dimérico ou monomérico caracterizado pelo fato de compreender pelo menos uma seqüência selecionada do grupo: SEQ ID N0: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N0: 3 e SEQ ID N°: 4.

2. Domínio de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ele deriva de anticorpos de camelídeos selecionados do grupo: Lama glama, Lama paços, Lama guanicoe e Vicugna vicugna.

3. Domínio de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ele se liga a um epitopo linear do antígeno VP6 presente no gru- po A de rotavírus.

4. Domínio dimérico de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado por compreender duas seqüências, idênticas ou diferentes, seleciona- das do grupo: SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4.

5. Domínio dimérico de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zado pelo fato de que ele ainda compreende uma ligação do SEQ ID N°: 13.

6. Domínio dimérico de acordo com a reivindicação 4, compre- endendo ainda uma seqüência selecionada do grupo: SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N0: 12.

7. Método de imunodetecção de rotavírus caracterizado pelo fato de que ele compreende: a) a colocação em contato de uma amostra que contém rotavírus com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo: SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N0: 11, SEQ ID N°: 12, ou combinações destes; e b) o desenvolvimento.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser selecionado do grupo: testes baseado sem imunocaptura de ELISA, E- LISPOT, ELISA por competição, glóbulos magnéticos ou qualquer outra tec- nologia de imunoensaio cromatográfico.

9. Composição projetada para conferir imunidade passiva a um mamífero, caracterizada por compreender uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo: SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N0: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, ou combinações destes; excipiente e imunomoduladores.

10. Plasmídeo pFBMelVHH caracterizado por compreender uma seqüência de nucleotídeos que codifica qualquer um dos domínios monomé- ricos ou diméricos como definidos nas reivindicações 1 a 6.

11. Vetor de expressão recombinante caracterizado por compre- ender o plasmídeo como definido na reivindicação 10.

12. Vetor de expressão recombinante de acordo com a reivindi- cação 11, caracterizado pelo fato de que o referido vetor é um vírus, particu- larmente um Baculovírus.

13. Células transgênicas transformadas ou transfectadas ou in- fectadas com o vetor como definido nas reivindicações 11 ou 12, caracteri- zadas pelo fato de que elas expressam o DNA incluído nos plasmídeo como definido na reivindicação 10.

14. Método para a produção dos domínios como definido nas reivindicações 1 a 6, que compreende as seguintes etapas: a) Transformação ou transfecção ou infecção de células hospe- deiras em cultura ou em larvas de inseto com o vetor recombinante como definido na reivindicação 11 ou 12. b) Manutenção do crescimento das células sob condições ade- quadas. c) Isolamento e purificação dos domínios.

15. Anticorpos caracterizados por compreender qualquer um dos domínios das reivindicações 1 a 6.

16. Kit para imunodetecção de rotavírus que compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada de: SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, ou combinações destes.

17. Seqüência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ ID N°: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, ou combinações destes, para uso em um método para a prevenção ou tratamento de infecções pro- duzidas por rotavírus.