KR100460709B1 - 돼지 로타바이러스에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 이를 이용한 면역 측정 방법 및 측정용 킷트 - Google Patents

돼지 로타바이러스에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 이를 이용한 면역 측정 방법 및 측정용 킷트 Download PDF

Info

Publication number
KR100460709B1
KR100460709B1 KR10-2001-0049057A KR20010049057A KR100460709B1 KR 100460709 B1 KR100460709 B1 KR 100460709B1 KR 20010049057 A KR20010049057 A KR 20010049057A KR 100460709 B1 KR100460709 B1 KR 100460709B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rotavirus
hybridoma cell
antibody
produced
kctc
Prior art date
Application number
KR10-2001-0049057A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20030015017A (ko
Inventor
정태화
김영대
송은영
김경아
권두한
곽주원
강지현
서영교
이은영
이정일
Original Assignee
네오바이오다임 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 네오바이오다임 주식회사 filed Critical 네오바이오다임 주식회사
Priority to KR10-2001-0049057A priority Critical patent/KR100460709B1/ko
Publication of KR20030015017A publication Critical patent/KR20030015017A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100460709B1 publication Critical patent/KR100460709B1/ko

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/14—Reoviridae, e.g. rotavirus, bluetongue virus, Colorado tick fever virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이들의 제조 방법, 그리고 이들을 이용하여 시료내 돼지 로타바이러스의 감염 여부를 진단하기 위한 방법으로, 면역 크로마토그래피법 및 효소 면역 측정법에 의한 돼지 로타바이러스 측정 방법 및 이를 위한 킷트에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 돼지의 분비물로부터 돼지 감염시 매우 치명적인 질환을 일으키는 로타바이러스의 감염 여부를 신속, 정확하게 간단히 진단할 수 있어, 로타바이러스의 전파 경로 확인과 조기 발견에 의한 방역 효과를 높일 수 있으며, 본 발명의 단일클론 항체를 사용한 돼지 로타바이러스에 대한 치료제의 제조도 가능하므로, 축산 및 수의학 분야에서 다양한 용도로 폭넓게 본 발명을 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

돼지 로타바이러스에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 이를 이용한 면역 측정 방법 및 측정용 킷트{A monoclonal antibody against a porcine rotavirus, a hybridoma cell line producing it, a method of immunoassay using it and a kit}
본 발명은 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이들의 제조 방법, 그리고 이들을 이용하여 시료내 돼지 로타바이러스를 측정하는 방법 및 이를 위한 킷트에 관한 것이다.
로타바이러스는 사람을 비롯하여 원숭이, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 토끼, 닭 등의 각종 동물에게서 장염을 유발시키는 레오바이러스과(Reoviridae) 병원체로서, 전세계적으로 널리 분포되어 있다.
세계 각지에서 분리된 로타바이러스 균주는 혈청학적인 분류에 의해 A에서 F까지의 6개의 혈청군으로 분리되고, 각 군은 각종의 혈청형으로 나뉘는데, 그중 A군의 로타바이러스가 원숭이, 말, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 쥐, 소, 양 등 가장 광범위한 동물을 감염 대상으로 하여 감염시 심한 설사를 일으키는 것으로 알려져 있다. 이 바이러스는 1963년 말레브(Mahlerbe) 등에 의해 최초로 원숭이의 신장 세포에서 배양 증식이 가능하게 되었다.
사람 로타바이러스는 신생아와 유아에게서 특히 심한 설사를 일으키는 경향이 있으며, 돼지 로타바이러스의 경우는 돼지를 기르는 곳에서는 어디에나 상재하고, 성돈의 항체 보유가 77-100%에 이르는 등 모든 연령의 돼지에게서 발견되고 있다.
돼지 로타바이러스 감염 질환은 태어난 지 5주 이내의 자돈에서 발병될 경우, 심한 설사 및 이에 따른 탈수 증상으로 대부분 2-5일 이내에 환돈의 50-100%가 폐사되고, 5주된 자돈 역시 90% 이상의 치사율을 나타내는 심각한 질병이다.
돼지 로타바이러스 질병은 첫째 자돈의 치사율이 매우 높고, 둘째 감염시 적절한 치료 대책이 없으며, 셋째 환돈의 분변으로부터 사료나 물을 통해 경구 감염되므로 바이러스에 대한 완벽한 방역이 불가능하고, 넷째 현재 개발된 백신들의 예방 및 방제 효과가 극히 낮다는 문제점을 가지고 있다.
따라서 돼지 로타바이러스에 의한 돼지의 장염 및 설사 발생을 감소시키기 위한 가장 효과적인 방법은 돼지 로타바이러스 감염에 대한 조기 진단을 통해 사전방역 대책을 확립하는 것이다. 최근의 바이러스 진단에서는 바이러스에 대한 항체를 제조하고 이 항체를 사용하여 바이러스 감염 여부를 측정하는 방법이 일반적으로 이용되고 있으며, 이 경우 복합클론 항체보다는 특이성이 뛰어난 단일클론 항체를 이용하는 방법이 선호되고 있다. 이러한 추세에도 불구하고 돼지 로타바이러스의 경우는 현재 PCR에 의해 그 존재 유무를 측정하고 있는 실정으로, 따라서 보다 간편하고 신속한, 그러면서도 정확하고 특이성이 높은 새로운 진단 체계가 절실히 요구되고 있으며, 이를 위해서는 돼지 로타바이러스에 대한 특이성이 높은 단일클론 항체의 개발이 필수적이라 할 수 있다.
돼지 로타바이러스는 구조적으로, 외피 단백질과 그 내부에 코어 단백질을 가진 캡시드(capsid) 구조로 되어 있으며, 주요 구조 단백질로서 VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 및 VP7로 구성되어 있다. 이중, VP1과 VP3는 리보핵산을 보호하고 있고, VP2는 코어 단백질의 구성분이며, VP6와 VP7은 외단백질을 구성하는데 VP6은 그중 안쪽에, VP7은 바깥쪽에 위치하고 있다. 또한 VP4는 VP7 단백질의 외부에 위치하여 바이러스의 감염을 촉진시키는 역할을 하며, VP6 단백질은 주요 구조 단백질로서 A군 로타바이러스의 공통적인 항원 구조를 하고 있다.
로타바이러스를 구성하는 단백질은 전술한 바와 같이 외피를 구성하는 단백질과 핵산을 둘러싸고 있는 코어 단백질로 되어 있는데, 이중 코어 단백질은 바이러스 입자 내부에 위치하고 있으므로 코어 단백질에 대한 항체는 살아있는 바이러스 입자를 인지할 수 없고 외피 단백질에 대한 항체만이 바이러스 입자의 인지가 가능하다. 이러한 로타바이러스의 외피를 이루는 단백질로는 VP6, VP7 및 VP4가 있으나, 로타바이러스의 생성 또는 증식 과정에서 가장 많이 나타나는 바이러스 입자는 VP6 단백질이 주 외피 단백질로 된 바이러스 입자이다. 로타바이러스의 VP6 단백질은 로타바이러스 아형에서 매우 보수적인 염기서열을 하고 있어 다른 동물을 감염시키는 다양한 종류의 로타바이러스간에 동질성이 매우 높은 특징을 가지고 있다. 따라서 VP6 단백질에 대한 단일클론 항체의 개발은 로타바이러스의 측정 및 관련 질병의 진단에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
이에, 본 발명은 시료내 돼지 로타바이러스의 감염 여부를 보다 신속, 정확하고 간편하게 진단하기 위한 것으로서, 돼지 로타바이러스 VP6 단백질에 대한 단일클론 항체 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것을 제 1 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 돼지 로타바이러스 VP6 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이를 제조하는 방법을 제공하는데 제 2 목적이 있다.
본 발명은 상기 항체들을 이용하여 효소 면역 측정법과 면역 크로마토그래피(immunochromatography)법에 의해 시료내 돼지 로타바이러스를 측정하는 방법과 이를 위한 킷트를 제공하는 것을 제 3 목적으로 한다.
도 1은 돼지 로타바이러스를 감염시킨 MA104 세포주와 비감염 MA104 세포주의 세포 단백질에 대해 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동을 실시한 결과를 나타내는 사진[레인 A: 표준 분자량 단백질; 레인 B: 돼지 로타바이러스를 감염시킨 MA104 세포; 레인 C: 비감염 MA104 세포].
도 2는 본 발명의 하이브리도마 세포주 RV5 및 RV18이 생산하는 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 대한 단일클론 항체를 확인하는 웨스턴 블랏팅 결과를 나타내는 사진[레인 A: 비감염 MA104 세포; 레인 B: 돼지 로타바이러스를 감염시킨 MA104 세포; 레인 C: 표준 분자량 단백질].
도 3은 본 발명에 따라 생산된 단일클론 항체가 돼지 로타바이러스에만 특이적으로 반응함을 확인하는 효소 면역 화학법에 의한 실험 결과를 나타내는 도표[TGEV(transmissible gastroenteritis virus; 돼지 전염성 위장염 바이러스); PEDV(porcine epidemic diarrhea virus; 돼지 유행성 설사 바이러스)].
도 4는 시료내 로타바이러스의 감염 여부를 측정하기 위한 면역 크로마토그래피(immunochromatography ) 스트립을 개략적으로 나타내는 평면도.
도 5는 도 4의 면역 크로마토그래피 스트립에 대한 측단면도.
도 6은 면역 크로마토그래피 스트립에 의해 돼지 분변내 로타바이러스의 감염 여부를 측정한 결과를 나타내는 사진[A: 시료 처리전의 킷트; B: 양성 시료 반응 결과; C: 음성 시료 반응 결과].
도 7은 효소 면역 측정법에 의한 돼지 로타바이러스와 항체와의 반응성을 나타내는 그래프.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1: 면역 크로마토그래피 스트립 2: 샘플 패드
3: GF 멤브레인 4: NC 멤브레인
5: 판정 라인 6: 대조 라인
7: 흡수 패드 8: 플라스틱 백킹
상기한 목적들을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 돼지 로타바이러스의 입자를 생쥐에 주입하여 면역화시키고, 그 생쥐의 비장 세포를 마이엘로마 세포와 융합하여 하이브리도마 세포주를 생산한 다음, 그중에서 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하여 이를 배양함으로써, 돼지 로타바이러스에 대해 높은 특이성을 나타내는 단일클론 항체를 대량으로 생산, 분리하여 그의 항원 특이성을 확인하는 일련의 실험들을 실시하였다. 또한 높은 특이성과 반응성이 확인된 로타바이러스 VP6 단백질에 대한 단일클론 항체 2종을 이용하여 효소 면역 측정법과 면역 크로마토그래피법에 의해 시료내 돼지 로타바이러스를 측정하는 새로운 로타바이러스 진단 방법과 함께, 이를 위한 킷트를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 돼지 감염시 매우 치명적인 질환을 일으키는 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 RV5와 RV18 및 이들의 제조 방법, 그리고 이들을 이용하여 시료내 돼지 로타바이러스를 측정하는 방법 및 이를 위한 킷트에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
최소 배지에서 배양한 원숭이 유래의 MA104 세포(ECACC No.85102918)에 돼지 로타바이러스를 감염시켜 48시간 동안 증식, 배양한 후, 초고속으로 원심분리하여배양 배지로부터 돼지 로타바이러스를 분리하였다. 분리한 돼지 로타바이러스 입자를 생쥐에 면역화시키고, 이로부터 추출한 비장 세포와 마이엘로마 세포를 융합한 후, 효소 면역 측정법에 의해 돼지 로타바이러스 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포군를 선별하였다.
상기에서 선별된 하이브리도마 세포군이 생산하는 단일클론 항체의소단위형(subclass type)을 면역확산법으로 결정하고, 그중 소단위형이 IgG1인 생쥐 하이브리도마 세포주를 "RV5"와 "RV18"이라 명명하여 이들을 2001년 6월 16일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자 은행에 각각 수탁 번호 KCTC 1034BP(RV5) 및 KCTC 1035BP(RV18)로서 기탁하였다.
수득된 하이브리도마 세포주로부터 돼지 로타바이러스에 대한 단일클론 항체를 대량으로 생산하기 위하여, 상기 하이브리도마 세포를 생쥐에 주사하고, 복강이 부풀어 오른 생쥐로부터 고농도의 하이브리도마 세포를 함유하는 복수액을 채취한 후, 이 복수액을 원심분리하여 돼지 로타바이러스에 대한 다량의 단일클론 항체를 얻었다.
이후, 상기 하이브리도마 세포주로부터 얻은 단일클론 항체의 로타바이러스에 대한 항원 특이성을 알아보기 위하여, 돼지 로타바이러스를 감염시킨 세포의 세포 단백질들을 전기영동하고 상기 과정으로 제조된 단일클론 항체로 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과, 상기 하이브리도마 세포주 RV5 및 RV18로부터 생산된 단일클론 항체 모두 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 대하여 특이적으로 항원 인식 능력을 나타냄이 확인되었다(도 2 참조).
또한, 본 발명에 따라 생산된 단일클론 항체의 돼지 로타바이러스에 대한 특이성 입증 실험 결과, 도 3에 제시된 바와 같이 본 발명의 단일클론 항체는 돼지 로타바이러스에만 결합 반응하고, 돼지 전염성 위장염 바이러스(TGEV)와 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)에는 거의 반응하지 않음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
따라서, 본 발명은 돼지 로타바이러스를 사용하여 생쥐를 면역화시킨 다음, 상기 생쥐의 비장 세포를 마이엘로마 세포와 융합하고, 융합된 하이브리도마 세포중에서 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계를 포함하여, 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제조하는 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된, 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 RV5(KTCC 1034BP)와 RV18(KTCC 1035BP)을 제공한다.
또한 본 발명은 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 생쥐에 주사하고, 복강이 부풀어 오른 상기 생쥐에게서 고농도의 하이브리도마 세포를 함유하는 복수액을 채취한 후, 상기 복수액을 원심분리하여 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 수득하는 단계를 포함하여, 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제조하는 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된, 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.
본 발명자들은 상기에서 수득한 하이브리도마 세포주 RV5와 RV18 및 이로부터 생산된 단일클론 항체들을 이용하여, 시료내 로타바이러스의 감염 여부를 신속, 정확하게 측정할 수 있는 샌드위치형 효소 면역 측정법과 면역 크로마토그래피법을 개발하게 되었다.
따라서, 본 발명은 돼지 로타바이러스에 의한 감염이 의심되는 시료를, 돼지로타바이러스 VP6 단백질에 특이적으로 결합하는 상기 단일클론 항체와 접촉시킨 후, 형성된 로타바이러스-항체 복합체의 존재 여부를 측정하는 단계를 특징으로 하여, 샌드위치형 효소 면역 측정법 및 면역 크로마토그래피법에 의해 시료내 돼지 로타바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법 및 이를 위한 킷트를 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따라, 샌드위치형 효소 면역 측정법에 의해 시료내 돼지 로타바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(1) 돼지 로타바이러스 VP6 단백질에 특이적인 제 1 항체를 고상체에 고정시키는 단계,
(2) 상기 고상체에 검사하고자 하는 시료 용액을 가하여 시료내 로타바이러스가 상기 항체에 결합하도록 반응시키는 단계,
(3) 세척액을 사용하여 미반응 물질을 세척, 제거하는 단계,
(4) 발색 효소에 결합된, 돼지 로타바이러스 VP6 단백질에 특이적인 제 2 항체를 상기 고상체에 가하여 단계 (2)에서 결합된 제 1 항체와 로타바이러스의 복합체에 결합하도록 반응시키는 단계,
(5) 세척액을 사용하여 미반응 물질을 세척, 제거하는 단계,
(6) 세척한 고상체에 효소 기질 용액을 첨가하여 발색 반응이 일어나도록 하는 단계, 및
(7) 반응 결과 나타나는 발색 정도를 측정하여 시료내 로타바이러스의 농도를 측정하는 단계.
또한, 상기한 샌드위치형 효소 면역 측정법에 의해 로타바이러스를 측정하기위한 본 발명의 킷트는 고상체에 고정된 항-로타바이러스 제 1 항체, 효소에 결합된 항-로타바이러스 제 2 항체, 시료 희석 용액, 효소 기질 용액, 세척액 및 로타바이러스 표준 용액을 포함한다.
상기 효소 면역 측정법 및 이를 위한 측정용 킷트에 있어서, 사용된 항-로타바이러스 제 1 항체 및 제 2 항체는 본 발명에 따른 하이브리도마 세포주 RV5 및 RV18로부터 생산된, 돼지 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 동일 또는 상이한 단일클론 항체로서, 상이한 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 예컨대, 제 1 항체가 하이브리도마 세포주 RV5에서 생산된 단일클론 항체인 경우에는 제 2 항체로서 하이브리도마 세포주 RV18에서 생산된 단일클론 항체를 사용하고, 제 1 항체가 하이브리도마 세포주 RV18에서 생산된 단일클론 항체인 경우에는, 제 2 항체로서 하이브리도마 세포주 RV5에서 생산된 단일클론 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
발색 반응에 의해 로타바이러스의 농도를 정량적으로 측정하기 위한 효소로는 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)를 사용하는 것이 바람직하고, 이 경우에 있어 효소의 기질 용액으로는 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 용액을 사용한다.
또한 검사하고자 하는 시료는 돼지 분비물, 예를 들면 돼지 분변을 1:20 정도의 비율로 희석한 용액을 사용하는 것이 바람직하며, 고상체로는 일반적으로 마이크로플레이트의 웰을 사용한다.
전술한 효소 면역 측정법외에, 본 발명에 따른 항-로타바이러스 단일클론 항체를 이용한 면역 측정법으로서, 면역 크로마토그래피법을 이용하여 시료내 로타바이러스의 감염 여부를 측정할 수도 있다.
상기 면역 크로마토그래피에 의한 측정 방법은 착색 미립자에 결합된 항-로타바이러스 항체와 시료를 면역 반응시키고, 모세관 현상에 의해 착색 미립자-항체-바이러스 복합체가 연속 이동하는 과정을 통해 멤브레인상에 미리 고정시킨 별도의 항-로타바이러스 항체 밴드와 상기 복합체가 결합하도록 함으로써, 밴드 위치의 착색 여부에 의해 시료내 로타바이러스의 존재 여부를 검출하는 방법이다.
상기한 방법은 샘플 부재, 착색 미립자에 결합된 항-로타바이러스 제 1 항체가 일시적으로 고정되어 있는 면역 반응 부재, 항-로타바이러스 제 2 항체 밴드(판정 라인)와 대조용 항체 밴드(대조 라인)를 함유하는 결과 표시 부재 및 흡수 부재를 포함하는 면역 크로마토그래피 킷트를 사용하여 실시할 수 있다.
상기 각 부재들은 모세관 현상에 의해 시료 용액이 연속적으로 이동하도록 부분적으로 겹쳐지게 순서대로 일렬 배치되며, 상기 대조 라인은 판정 라인과 일정 간격을 두고 떨어져 위치하도록 한다.
면역 반응 부재에는 착색 미립자에 결합된 항-로타바이러스 제 1 항체가 멤브레인상에 일시적으로 고정되어 있어, 샘플 부재에 의해 흡수된 시료 용액내 로타바이러스와 면역 반응에 의해 복합체를 형성한 후, 모세관 현상에 의해 결과 표시 부재상으로 연속 이동하게 된다.
또한, 결과 표시 부재에는 항-로타바이러스 제 2 항체 밴드와 대조용 항체 밴드로 이루어지는, 총 2개의 항체 밴드가 일정 간격을 두고 표면상에 고착되어 있다.
상기 항-로타바이러스 제 2 항체 밴드는 시료내 로타바이러스의 존재를 나타내는 결과 판정 라인으로, 상기 면역 반응 부재에서 형성된 착색 미립자-항체-바이러스 복합체가 이동중에 이 밴드 지점을 통과하면서 항-로타바이러스 제 2 항체와 특이적으로 반응하여 결합체를 형성하게 되고, 이에 따라 밴드 위치에 착색이 일어나게 된다.
반면, 통상 제 2 항체 밴드로부터 시료 이동 방향으로 하단 0.5 내지 2㎝ 정도의 지점에 위치하는 대조용 항체 밴드는 염소 항-마우스 IgG와 같은 일반적인 항체를 포함하고 있어, 상기 판정 라인을 통과한 미결합 시료 성분들과 면역 반응함으로써, 본 검사가 정상적으로 시행되었는지를 확인해 주는 역할을 한다.
이후, 나머지 시료 성분들은 모세관 현상에 의해 계속 이동되어 흡수 부재에 의해 흡수된다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 킷트에 사용된 항-로타바이러스 제 1 항체 및 제 2 항체는 본 발명에 따른 하이브리도마 세포주 RV5 및 RV18로부터 생산된, 돼지 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 동일 또는 상이한 단일클론 항체로서, 상이한 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 예컨대, 제 1 항체가 하이브리도마 세포주 RV5에서 생산된 단일클론 항체인 경우에는 제 2 항체로서 하이브리도마 세포주 RV18에서 생산된 단일클론 항체를 사용하고, 제 1 항체가 하이브리도마 세포주 RV18에서 생산된 단일클론 항체인 경우에는, 제 2 항체로서 하이브리도마 세포주 RV5에서 생산된 단일클론 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
상기한 면역 크로마토그래피 킷트는 스트립(strip), 카세트(cassette) 또는 막대(stick) 등 다양한 형태로 제조될 수 있다. 그 일례로 스트립 형태의 면역 크로마토그래피 킷트가 도 4 및 도 5에 예시되어 있다.
이 면역 크로마토그래피 스트립(1)은 샘플 패드(2), 면역 반응 부재로서, 착색 미립자-항 로타바이러스 제 1 항체가 일시 고정된 글라스화이버(GF) 멤브레인(3), 결과 표시 부재로서 항-로타바이러스 제 2 항체 밴드(판정 라인, 5)와 대조용 항체 밴드(대조 라인, 6)가 고착된 나이트로셀룰로스(NC) 멤브레인(4) 및 흡수 패드(7)가 접착용 플라스틱 백킹(8)상에 장착된 형태로 되어 있다.
본 발명은 또한, 활성 성분으로서 본 발명에 따른 돼지 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 약학 조성물을, 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 질환을 앓고 있는 동물, 특히 돼지에 적용시켜 로타바이러스 감염 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대한 구체적인 구성을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하고 설명하기 위해 제시된 것으로, 본 발명이 이들 실시예로만 한정되는 것으로 이해해서는 안된다.
[실시예]
실시예 1 : 돼지 로타바이러스의 배양 및 증식
MA104 세포를 롤러 보틀(roller bottle)내 플라스크 바닥의 70-90%가 세포로 채워질 때까지, 5% 소 태아 혈청(fetal bovine serum)이 섞인 최소 배지(minimalessential medium)상에서 배양하였다. 배양된 세포를 생리 식염수로 2회 세척하고, 여기에 3㎖의 돼지 로타바이러스 용액(100 c.f.u.; Gotfried strain)을 넣어 1시간 동안 감염시킨 다음에, 300㎖의 최소 배지(1㎍/㎖ 트립신이 포함된 배지)를 첨가하고 48시간 동안 배양하였다.
실시예 2 : 돼지 로타바이러스의 분리
본 실시예에서는 돼지 로타바이러스를 감염시켜 48시간 동안 배양한 MA104 세포주로부터 바이러스들을 분리하였다.
상기 실시예 1을 통해 수득한 바이러스가 포함된 배지 용액을 25,000 rpm에서 2시간 동안 원심분리하여 침전시킨 후, 바이러스 침전물을 3㎖의 인산 완충액에 녹여 40% 당이 포함된 용액위에 천천히 부은 후에 25,000 rpm으로 원심분리하여 바이러스 밴드를 용리하여 25,000 rpm로 다시 원심분리하여 돼지 로타바이러스를 분리하였다.
이 과정중에, 상기 MA104 세포주가 돼지 로타바이러스에 의해 감염되었는지의 여부를 확인하기 위해, 감염 세포주의 세포 단백질에 대해 SDS-폴리아마이드 전기영동을 실시하였으며, 그 결과 로타바이러스의 존재를 나타내는 밴드를 관찰할 수 있었다(도 1 참조).
실시예 3 : 돼지 로타바이러스에 대한 단일클론 항체의 생산
(1) 생쥐의 면역화
로타바이러스에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 제조에 필요한 면역화된 생쥐를 얻기 위하여, 상기 실시예 2에서 분리한 돼지 로타바이러스 입자를 포함하는 인산 완충액과 동량의 타이터-맥스(Titer-MAX)를 유상화가 될 때까지 잘 혼합하여 생후 6-8주된 Balb/c 마우스의 복강내로 주사하였다. 2주 후, 처음 주사와 같은 양을 타이터-맥스에 혼합하여 동일 부위에 재차 주사하였다. 마찬가지 방식으로 7일 후에 다시 반복 주사하고, 3주 후에 생쥐 꼬리 부위의 혈관에서 소량의 피를 채혈하여 역가를 확인하였다.
(2) 세포 융합
하이브리도마 세포의 제조에 필요한 세포 융합을 실시하기 위하여, 상기 돼지 로타바이러스로 면역화시킨 생쥐로부터 채취한 비장 세포 108개와 마이엘로마(myeloma) 세포(SP2/0) 107개를 충분히 세척하여 혼합한 후, 여기에 1㎖의 PEG 1500을 약 1분에 걸쳐 넣고 1분 동안 약간 흔들어 주었다. 그 후 9㎖의 RPMI를 약 3분에 걸쳐 첨가하고, 총 50㎖가 될 때까지 흔들어 주면서 서서히 RPMI를 첨가하였다. 이 현탁액을 원심분리한 후, 수득된 세포 펠릿(cell pellet)을 HAT 배지에 1∼2×105/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 0.2㎖씩 넣은 후, 37℃의 CO2습도 배양기 안에서 배양하였다.
(3) 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별
상기 실시예 3의 (2)에서 제조한 하이브리도마 세포군중에서 로타바이러스에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위해, 돼지 로타바이러스를 코팅한 마이크로플레이트를 이용한 엘리자(ELISA) 분석방법으로 다음과 같이 스크리닝하였다.
마이크로플레이트에 돼지 로타바이러스 항원을 웰당 각각 100㎕(1㎍/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 각 웰에 하이브리도마 세포의 배양액을 100㎕씩 가하여 2시간 동안 반응시킨 후, 인산 완충 용액-트윈 20(PBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBST 용액으로 충분히 세척하였다. 다음 퍼옥시다제의 기질 용액으로 오르소-페닐렌다이아민(OPD)을 넣어 반응시키고, 효소면역 판독기(ELISA Reader)로 492nm에서 흡광도에 의해 반응 정도를 측정하였다.
그 결과, 돼지 로타바이러스 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 먼저 선별하였다. 이후 여러번의 반복 실험을 통해, 돼지 로타바이러스 항원, 특히 VP6 단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 선별한 후, 단일클론이 되도록 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주들을 선별하여 총 3개의 클론을 얻었다. 이들 클론중 가장 높은 역가를 나타내는 2개의 클론(RV5 및 RV18)을 선별하여 동결 보존한 후, 그 상층액에 대하여 효소 면역 측정법으로 역가를 측정하고 이중 면역 확산법으로 소단위형을 분석한 결과, 이 클론들이 분비하는 항체가 IgG1임을 확인하였다.
상기에서 선별된 하이브리도마 세포주 RV5 및 RV18을 2001년 6월 16일자로 한국 생명공학연구원내 유전자은행에 각각 수탁번호 KCTC 1034BP 및 KCTC 1035BP로서 기탁하였다.
(4) 단일클론 항체의 대량 생산 및 분리 정제
상기 실시예 3의 (3)에서 얻은 하이브리도마 세포로부터 단일클론 항체를 대량 생산하기 위하여, Balb/c 생쥐에 0.5㎖의 프리스테인(pristane)을 복강내로 주사하였다. 1주일 후에 각각의 하이브리도마 세포들을 생쥐 1마리당 5 ×106개씩 주사하고, 복강이 부풀어 오른 생쥐로부터 복수액을 채취하였다. 이 복수액을 1,200rpm에서 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 상층액만을 취하여 다음 실험에 사용할 수 있도록 -20℃에서 보관하였다. 이 상층액을 단백질 G 컬럼(protein G column)에 통과시켜 분리 정제하였다.
(5) 웨스턴 블랏팅에 의한 로타바이러스 VP6 단백질 항체의 특이성 확인
본 실시예에서는 로타바이러스 VP6 단백질에 대한 상기 단일클론 항체의 특이적 항원 반응성을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동과 웨스턴 블랏팅 방법을 사용하여 확인하였다.
돼지 로타바이러스를 감염시킨 MA104 세포로부터 분리된 돼지 로타바이러스 단백질 및 대조군으로 비감염 MA104 세포 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤상에서 전기영동한 다음, 전기적인 방법에 의해 필터막상으로 옮겼다. 막으로 옮겨진 단백질의 비특이적 반응을 줄이기 위해 1% 소 혈청 알부민 용액으로 12-14시간동안 막을 차단시켰다. 본 발명의 단일클론 항체가 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질에 특이적으로 반응함을 확인하기 위하여, 1차 항체로 상기 실시예 3의 (4)에서 생산한 RV5 및 RV18로부터의 단일클론 항체를 각각 상온에서 2시간 동안 막에 반응시켰다. 이 막을 0.05% 트윈이 포함된 인산 완충액으로 3회 세척한 다음, 2차 항체로 호스래디쉬 퍼옥시다제가 결합된 항-마우스 IgG를 사용하여 상온에서 1시간 반응시키고, 다시 0.05% 트윈이 포함된 인산 완충액으로 세척한 후, 0.018%(v/v) 4-클로로-1-나프톨과 0.045%(v/v) H2O2가 인산 완충 용액과 메탄올에 녹아 있는 기질을 이용하여 발색 반응시켰다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 본 발명에서 제조한 하이브리도마 세포주 RV5 및 RV18로부터 생산된 단일클론 항체가 로타바이러스 VP6 단백질에 특이적으로 반응하는 항체임을 확인할 수 있었다.
(6) 효소 면역 화학법에 의한 로타바이러스 항체의 특이성 확인
로타바이러스 및 돼지 질병 바이러스인 TGEV(transmissible gastroenteritis virus; 돼지 전염성 위장염 바이러스)와 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus; 돼지 유행성 설사 바이러스)를 마이크로플레이트에 웰당 각각 100㎕(1㎍/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다.
각 웰에 본 발명에 따른 하이브리도마 세포 RV5 및 RV18의 배양액을 100㎕씩 가하여 2시간 동안 반응시킨 후, 인산 완충 용액-트윈 20(PBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBST 용액으로 충분히 세척하였다. 다음 퍼옥시다제의 기질용액으로 오르소-페닐렌다이아민(OPD)을 넣어 반응시키고, 효소면역 판독기(ELISA Reader)로 492nm에서 흡광도를 측정하여 반응 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 본 발명에서 제조한 하이브리도마 세포주 RV5 및 RV18로부터 생산된 단일클론 항체가 돼지 로타바이러스에만 특이적으로 반응하는 항체임을 확인할 수 있었다.
(7) 로타바이러스 농도 변화에 따른 항체의 반응성
로타바이러스의 농도 변화에 따른 단일클론 항체의 반응성에 대해 조사하기 위하여, 다음과 같은 실험을 실시하였다.
본 발명에 따라 제조한 로타바이러스에 대한 항체 RV18을 마이크로플레이트에 웰(well)당 각각 100㎕(3㎍/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 세척하여 미반응 항체를 제거하였다.
로타바이러스 배양액을 다양한 농도로 희석하여 웰당 100㎕씩 가하고 1시간 동안 반응시킨 후, 인산 완충 용액-트윈 20(PBST) 용액으로 충분히 세척하여 미반응 배양액을 제거하였다. 여기에 로타바이러스에 대한 항체 RV5가 결합된 호스래디쉬 퍼옥시다제 (RV5 IgG-HRP)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이후, 퍼옥시다제의 기질 용액으로 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 용액을 넣어 반응시키고, 효소면역 판독기(ELISA Reader)로 492nm에서 흡광도를 측정하여 반응 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 항체는 로타바이러스의 농도에 따라 비례적으로 반응함을 알 수 있다{A490= 1.307*log[Rota(㎍/㎖)] +1.192. (R2= 0.09814)}. 이 때 반응 민감도는 0.125㎍/㎖이었으며, 다른 돼지 질환 바이러스인 TEGV 및 PEDV와는 반응하지 않는 것으로 나타났다.
실시예 4 : 면역 크로마토그래피법에 의한 돼지 로타바이러스 측정 및 이를 위한 킷트
본 실시예는 본 발명에 의해 생산된 돼지 로타바이러스 VP6 단백질의 단일클론 항체와 돼지 로타바이러스간의 면역 반응을 통해 면역 크로마토그래피법에 의해 시료내 돼지 로타바이러스의 감염 여부를 측정하는 방법 및 이를 위한 킷트로서, 면역 크로마토그래피 스트립의 제조에 관한 것이다.
(1) 면역 크로마토그래피 스트립의 제조
다음의 구성 요소들을 사용하여 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같은 돼지 로타바이러스 측정용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.
A. 샘플 패드
시험하고자 하는 시료를 흡수하기 위한 부분으로서, 셀룰로스 소재로 된 것을 사용하는 것이 바람직하며, 본 실시예에서는 밀리포어(Millipore)사로부터 구입한 제품을 사용하였다.
B. 글라스화이버(GF) 멤브레인
시료내 로타바이러스와 본 발명에 따라 제조된 단일클론 항체간의 면역 반응이 일어나는 부분으로, GF 멤브레인 표면상에 녹색 폴리스타이렌 미립자-RV18 항체가 일시 고정되어 있으며, 그 제조 방법은 다음과 같다.
상기 실시예 3에서 제조된 하이브리도마 세포 RV18로부터 생산된 단일클론 항체를 0.4㎎/㎖이 되도록 글라이신 완충액으로 희석하여 마이크로휴지 튜브에 900㎕ 취하고, 여기에 뱅스 랩(Bangs Lab.)사로 부터 구입한 10% 녹색 폴리스타이렌 미립자 100㎕를 혼합하였다. 8시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 반응액을 10,000rpm에서 2분간 원심분리시켜 녹색 미립자-항체 침전을 얻었다. 이 침전물에 인산 완충 용액-트윈 20(PBST) 용액 1㎖를 가하고 현탁시켜 세척하였다. 이를 2번 반복한 후에 500㎕의 인산 완충 용액(PBS)에 녹였다. 이 때 사용한 착색 미립자는 녹색 폴리스타이렌 미립자로서, 그 직경이 0.43㎛이었다.
GF 멤브레인(Miliipore사 제품, 1.0㎝ x 0.7㎝)을 20mM 붕산 나트륨 완충액에 충분히 적시어 건조시킨 후, 상기에서 제조한 녹색 폴리스타이렌 미립자-RV18 항체를 GF 멤브레인에 고르게 분무하고 37℃에서 건조시켜 표면상에 착색 미립자 고상형 항체가 일시 고정된 면역 반응 패드용 GF 멤브레인을 제조하였다..
C. 나이트로셀룰로스(NC) 멤브레인
밀리포어(Millipore)사로부터 구입한 나이트로셀룰로스 멤브레인을 적당한 크기(0.7㎝ x 5㎝)로 자른 후, 멤브레인 하단에서 약 1.6㎝ 되는 지점에 대조 라인으로서 염소 항-마우스 IgG(goat anti-mouse IgG)를 직선 처리하고, 상기 대조 라인에서 하단 방향으로 0.8㎝ 되는 지점에 로타바이러스 검출 결과 판정 라인으로서 본 발명에 따라 제조된 RV5 항체를 직선 처리한 다음, 37℃에서 건조시켜 표면상에대조 라인과 결과 판정 라인이 처리된 NC 멤브레인을 제조하였다.
D. 흡수(absorbent) 패드
면역 반응후 시료내 미반응 물질들을 흡수하고, 이에 따라 분석 물질을 포함한 시료 용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 하는 역할을 하며, 셀룰로즈 소재로 된 밀리포어(Millipore)사 제품을 구입하여 사용하였다.
E. 접착용 플라스틱 백킹
각 패드들을 지지하기 위한 부분으로, 밀리포어(Millipore)사의 플라스틱 플레이트를 사용하였다.
첨부하는 도 4 및 도 5에 제시된 바와 같이, 접착용 플라스틱 백킹(8)위에 샘플 패드(2), GF 멤브레인(3), NC 멤브레인(4) 및 흡수 패드(7)를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 0.1 ㎝ 가량 부분적으로 겹쳐지도록 배열 조립하여 접착 고정시키고, 멤브레인의 위와 아래에 흡수지(Millipore사 제품)를 부착시켜 로타바이러스 검출용 면역 크로마토그래피 스트립(1)을 제조하였다.
(2) 측정 및 결과 판독
상기에서 제조한 면역 크로마토그래피 스트립의 샘플 패드(2)에 1:20 비율로 희석시킨 돼지 분변 시료 용액 150-200㎕를 가하고, 3-5분 후 대조 라인과 판정 라인의 착색 유무를 관찰하였다.
양성 시료 즉, 시료내에 로타바이러스가 포함되어 있는 경우, 샘플 패드(2)에 흡수된 시료내 로타바이러스가 GF 멤브레인(3)상에 포함된 녹색 폴리스타이렌미립자-RV18 항체와 면역 반응하여 복합체(conjugate)를 형성하고, 이 복합체는 모세관 현상에 의해 NC 멤브레인(4)상으로 이동하면서 NC 멤브레인상의 판정 라인내 RV5 항체와 결합하여 녹색 침착이 일어나게 되므로, 이 검사가 정상적으로 시행되었는지를 확인해 주는 대조 라인과 함께, 총 2개의 녹색선이 나타나게 된다.
그러나, 로타바이러스를 포함하지 않는 음성 시료의 경우에 있어서는, 상기 복합체 형성이 일어나지 않으므로, 대조 라인에서만 녹색의 착색선을 관찰할 수 있게 된다
실제로 돼지의 분변을 시료로 사용하여 시험한 결과가 첨부하는 도 6에 양성 시료는 2개의 선으로, 음성 시료는 1개의 선으로 제시되어 있다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 스트립에 의하면 약 103개까지의 돼지 로타바이러스를 검출할 수 있다. 또한 다른 돼지 질환 바이러스 TEGV 및 PEDV와의 반응성을 조사해 본 결과, 이들과는 교차 반응이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예 5 : 효소 면역 측정법에 의한 돼지 로타바이러스 측정 및 이를 위한 킷트
본 실시예는 본 발명에 의해 생산된 돼지 로타바이러스 VP6 단백질의 단일클론 항체와 돼지 로타바이러스간의 면역 반응을 통해 효소 면역 측정법에 의해 시료내 돼지 로타바이러스의 농도를 측정하는 방법 및 이를 위한 킷트의 제조에 관한 것이다.
(1) 효소 면역 측정용 킷트의 제조
다음의 구성 요소들을 사용하여 효소 면역 측정법에 의한 돼지 로타바이러스측정용 킷트를 제조하였다.
A. 고상체에 고정된 돼지 로타바이러스에 대한 제 1 항체(RV18 항체),
B. 효소에 결합된 돼지 로타바이러스에 대한 제 2 항체(호스래디쉬 퍼옥시다제-RV5 항체),
C. 시료 희석 용액,
D. 효소 기질 용액(OPD),
E. 세척액(PBST)
F. 로타바이러스 표준 용액 및
G. 반응 정지액
(2) 측정 방법
① RV18 항체가 고정된 마이크로플레이트의 각 웰에, 농도를 알고 있는 로타바이러스 표준 용액을 100㎕씩 차례로 분주하고, 검사하고자 하는 분변 시료를 1/100의 비율로 시료 희석 용액에 희석하여 100㎕씩 마이크로플레이트의 각 웰에 차례로 분주한 후, 상온에서 90분 동안 반응시킨다.
② 반응 후, 세척액(PBST)을 웰당 200㎕씩 사용하여 3번 반복 세척한다.
③ 세척한 플레이트의 웰에, 제조법에 따라 희석한 효소-표지 항체액(호스래디쉬 퍼옥시다제-RV5 항체)을 100㎕씩 분주하고 상온에서 60분 동안 반응시킨다.
④ ②의 과정을 반복한다.
⑤ 세척한 플레이트의 각 웰에 효소 기질 용액(OPD)을 100㎕씩 분주하고 10분 동안 반응시킨다.
⑥ 각 반응 웰에 반응 정지액을 25㎕씩 넣어 효소 반응을 정지시킨다.
⑦ 효소면역 판독기(ELISA Reader)를 이용하여 흡수 파장 490nm에서 시료의 흡광도를 측정한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 돼지 로타바이러스 VP6 단백질에 대한 단일클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공할 수 있으며, 이를 축산 및 수의학 분야에 이용하면 면역 크로마토그래피법과 효소 면역 측정법에 의해, 분비물을 간단하고 용이하게 시험 분석함으로써 돼지의 로타바이러스 감염 여부를 신속, 정확하게 진단할 수 있어 로타바이러스의 전파 경로 확인과 조기 발견에 의한 방역 효과를 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 단일클론 항체는 돼지 로타바이러스에 대한 치료제로도 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 백신을 투여한 돼지에서의 항체 형성에 대한 검증 등의 임상적 진단에 광범위하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (24)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. (1) 돼지 로타바이러스 VP6 단백질에 특이적인 하이브리도마 세포주 RV5(KCTC 1034BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체 또는 하이브리도마 세포주 RV18(KCTC 1035BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체를 고상체에 고정시키는 단계,
    (2) 상기 고상체에 검사하고자 하는 시료 용액을 가하여 시료내 로타바이러스가 상기 항체에 결합하도록 반응시키는 단계,
    (3) 세척액을 사용하여 미반응 물질을 세척, 제거하는 단계,
    (4) 발색 효소에 결합된, 돼지 로타바이러스 VP6 단백질에 특이적인 하이브리도마 세포주 RV5(KCTC 1034BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체 또는 하이브리도마 세포주 RV18(KCTC 1035BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체를 상기 고상체에 가하여 단계 (2)에서 결합된 항체와 로타바이러스의 복합체에 결합하도록 반응시키는 단계,
    (5) 세척액을 사용하여 미반응 물질을 세척, 제거하는 단계,
    (6) 세척한 고상체에 효소 기질 용액을 첨가하여 발색 반응이 일어나도록 하는 단계, 및
    (7) 반응 결과 나타나는 발색 정도를 측정하여 시료내 로타바이러스의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 효소 면역 측정법에 의한 시료내 돼지 로타바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 효소가 호스래디쉬 퍼옥시다제이고, 상기 효소 기질 용액이 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 고상체에 고정된 하이브리도마 세포주 RV5(KCTC 1034BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체 또는 하이브리도마 세포주 RV18(KCTC 1035BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체, 효소에 결합된 항-로타바이러스 하이브리도마 세포주 RV5(KCTC 1034BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체 또는 하이브리도마 세포주 RV18(KCTC 1035BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체, 시료 희석 용액, 효소 기질 용액, 세척액 및 로타바이러스 표준 용액을 포함하는, 효소 면역 측정법에 의한 돼지 로타바이러스 농도 측정용 킷트.
  11. 삭제
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 효소가 호스래디쉬 퍼옥시다제이고, 상기 효소 기질 용액이 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 용액인 것을 특징으로 하는 킷트.
  13. 제 10 항 또는 제 12 항에 있어서,
    상기 시료 희석 용액이 돼지 분변의 희석 용액인 것을 특징으로 하는 킷트.
  14. 하이브리도마 세포주 RV5(KCTC 1034BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체 또는 하이브리도마 세포주 RV18(KCTC 1035BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체를 이용한 면역 크로마토그래피법에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 샘플 부재, 착색 미립자에 결합된 하이브리도마 세포주 RV5(KCTC 1034BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체 및 하이브리도마 세포주 RV18(KCTC 1035BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체로부터 선택된 제 1 항체가 일시 고정된 면역 반응 부재, 하이브리도마 세포주 RV5(KCTC 1034BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체 및 하이브리도마 세포주 RV18(KCTC 1035BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체로부터 선택된 제 2 항체 밴드와 대조용 항체 밴드를 함유하는 결과 표시 부재 및 흡수 부재를 포함하는 면역 크로마토그래피법에 의한 돼지 로타바이러스 측정용 킷트.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 각 부재들이 부분적으로 겹쳐지도록 순서대로 일렬 배치되어 있고, 상기 제 2 항체 밴드와 대조용 항체 밴드가 일정 간격을 두고 떨어져 위치하는 것을특징으로 하는 킷트.
  17. 삭제
  18. 제 15 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서,
    스트립(strip)의 형태로 되어 있는 것을 특징으로 하는 킷트.
  19. 제 15 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서,
    카세트(Cassette)의 형태로 되어 있는 것을 특징으로 하는 킷트.
  20. 제 15 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서,
    막대(Stick)의 형태로 되어 있는 것을 특징으로 하는 킷트.
  21. 제 15 항에 있어서,
    상기 착색 미립자가 녹색 폴리스타이렌 미립자이며, 상기 면역반응 부재가 글라스화이버 멤브레인으로 되어 있고, 상기 결과 표시 부재가 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 되어 있는 것을 특징으로 하는 킷트.
  22. 제 15 항에 있어서,
    상기 착색 미립자가 콜로이달 골드 파티클(collidal gold particle)이며, 상기 면역반응 부재가 글라스화이버 멤브레인으로 되어 있고, 상기 결과 표시 부재가 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 되어 있는 것을 특징으로 하는 킷트.
  23. 활성 성분으로서 하이브리도마 세포주 RV5(KCTC 1034BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체 또는 하이브리도마 세포주 RV18(KCTC 1035BP)에 의해 생산되는 IgG1형의 단일클론항체를 포함하는 약학 조성물을, 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 질환을 앓고 있는 인간 이외의 동물에게 적용시켜 로타바이러스 감염 질환을 치료하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 동물이 돼지인 것을 특징으로 하는 방법.
KR10-2001-0049057A 2001-08-14 2001-08-14 돼지 로타바이러스에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 이를 이용한 면역 측정 방법 및 측정용 킷트 KR100460709B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2001-0049057A KR100460709B1 (ko) 2001-08-14 2001-08-14 돼지 로타바이러스에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 이를 이용한 면역 측정 방법 및 측정용 킷트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2001-0049057A KR100460709B1 (ko) 2001-08-14 2001-08-14 돼지 로타바이러스에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 이를 이용한 면역 측정 방법 및 측정용 킷트

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030015017A KR20030015017A (ko) 2003-02-20
KR100460709B1 true KR100460709B1 (ko) 2004-12-09

Family

ID=27719213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2001-0049057A KR100460709B1 (ko) 2001-08-14 2001-08-14 돼지 로타바이러스에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 이를 이용한 면역 측정 방법 및 측정용 킷트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100460709B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100061652A (ko) * 2007-07-27 2010-06-08 얼터너티브 진 엑스프레션 에스.엘.(얼제넥스) 항-브이피6 카멜리드 항체로부터 유래한 단량체 브이에이치에이치 도메인, 이합체 도메인, 면역화 방법, 로타바이러스 검출 방법, 조성물, 로타바이러스 감염의 예방 및 치료 방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180093179A (ko) * 2017-02-10 2018-08-21 인제대학교 산학협력단 천식 또는 알레르기 질환 신속 진단용 키트
CN113817054B (zh) * 2021-10-09 2023-09-01 武汉科前生物股份有限公司 一种特异性结合猪轮状病毒vp6蛋白的鼠单克隆抗体5b11及其应用
CN116355079B (zh) * 2022-08-19 2023-12-26 上海迈科康生物科技有限公司 检测重组人轮状病毒vp8抗原（vp8 p[8]）的单克隆抗体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6165993A (en) * 1992-03-23 2000-12-26 University Of Massachusetts Medical Center DNA vaccines against rotavirus infections
KR20010077206A (ko) * 2000-02-01 2001-08-17 복성해 돼지 로타바이러스의 브이피6 단백질에 대한 단일클론항체와 이를 생산하는 융합 세포주

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6165993A (en) * 1992-03-23 2000-12-26 University Of Massachusetts Medical Center DNA vaccines against rotavirus infections
KR20010077206A (ko) * 2000-02-01 2001-08-17 복성해 돼지 로타바이러스의 브이피6 단백질에 대한 단일클론항체와 이를 생산하는 융합 세포주

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Acta Virol 1992 May;36(3):225-230 *
Comp Immunol Microbiol Infect Dis 1989; 12(4):95-104 *
J. Gen. Virol., Vol.71(6), pp1395-1398 (1990. 6. 30.) *
충북대 수의학 석사학위논문 1996.2 안재문,P:398 ~ 402 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100061652A (ko) * 2007-07-27 2010-06-08 얼터너티브 진 엑스프레션 에스.엘.(얼제넥스) 항-브이피6 카멜리드 항체로부터 유래한 단량체 브이에이치에이치 도메인, 이합체 도메인, 면역화 방법, 로타바이러스 검출 방법, 조성물, 로타바이러스 감염의 예방 및 치료 방법
KR101581184B1 (ko) 2007-07-27 2015-12-31 얼터너티브 진 엑스프레션 에스.엘.(얼제넥스) 항-브이피6 카멜리드 항체로부터 유래한 단량체 브이에이치에이치 도메인, 이합체 도메인, 면역화 방법, 로타바이러스 검출 방법, 조성물, 로타바이러스 감염의 예방 및 치료 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20030015017A (ko) 2003-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Esfandiari et al. A comparative study of a new rapid and one‐step test for the detection of parvovirus in faeces from dogs, cats and mink
JP2717006B2 (ja) 免疫分析
KR102227648B1 (ko) B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법
Tsunemitsu et al. Detection of group C rotavirus antigens and antibodies in animals and humans by enzyme-linked immunosorbent assays
WO2016080591A1 (ko) 중동호흡기증후군 코로나바이러스 뉴클레오캡시드를 인식하는 항체 및 그의 용도
CN105527437A (zh) 一种检测试剂盒及其应用
Birch et al. Use of serotype‐specific monoclonal antibodies to study the epidemiology of rotavirus infection
US20060263837A1 (en) Immunoassay system and method for detection of antigens
JP4554472B2 (ja) パルボウイルス抗原検出用キット
KR101814757B1 (ko) 구제역 바이러스의 3ａｂ 비구조단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트
CN112876559B (zh) 一种特异性结合猪轮状病毒的单克隆抗体及其应用
WO2013043125A1 (en) Enterovirus 71 specific antibodies and uses thereof
US7803567B2 (en) Methods and compositions for detecting trichomonas in a sample contacted with fixative
KR100460709B1 (ko) 돼지 로타바이러스에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 이를 이용한 면역 측정 방법 및 측정용 킷트
US5188942A (en) Method for determining bluetongue virus antibodies in serum
KR20060054333A (ko) 항-인플루엔자 ｂ형 바이러스 모노클로날 항체 및 상기항체를 사용하는 면역 측정 기구
CN112745387B (zh) 抗猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体及其应用
CN105542000A (zh) 一种单克隆抗体及其应用
Yolken et al. Identification of a group-reactive epitope of group B rotaviruses recognized by monoclonal antibody and application to the development of a sensitive immunoassay for viral characterization
CN103983773A (zh) 口腔流体快速免疫层析检测
Al-Yousif et al. Development, characterization, and diagnostic applications of monoclonal antibodies against bovine rotavirus
WO2021117862A1 (ja) 免疫測定方法及び免疫測定器具
EP0485377A4 (en) SOLID-PHASE IMMUNO-ANALYSIS WITH MARKED CONJUGATE.
KR101876535B1 (ko) 소바이러스성 설사병 바이러스의 탐지용 항체, 이를 이용한 항원 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트
KR100369533B1 (ko) 돼지 로타바이러스의 브이피6 단백질에 대한 단일클론항체와 이를 생산하는 융합 세포주

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20081202

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee