KR20240086721A - 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 vhh 항체의 제조방법 - Google Patents

송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 vhh 항체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체를 제조하기 위하여 낙타과 동물을 면역화시키는 단계에서 항원과 함께 플라젤린(flagellin)을 낙타과 동물에 주입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 도메인 VHH 항체의 제조방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다양한 항체들 중 항원특이적인 IgG2 및 IgG3의 생성을 선택적으로 증가시킬 수 있다.

Description

송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체의 제조방법{MANUFACTURING METHOD OF SINGLE DOMAIN VHH ANTIBODY FOR PREVENTING OR TREATING CALF DIGESTIVE DISEASES}
본 발명은 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체의 제조방법에 관한 것으로, 단일 도메인 VHH 항체를 제조하기 위하여 낙타과 동물을 면역화시키는 단계에서 송아지 소화기성 질병의 원인균 또는 바이러스의 외막 단백질과 함께 플라젤린(flagellin)을 낙타과 동물에 주입함으로써 다양한 항체들 중 항원 특이적인 IgG2 및 IgG3의 생성을 선택적으로 증가시킬 수 있는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체의 제조방법에 관한 것이다.
나노바디는 단일 도메인 항체(single domain antibody, SDA)에서 가변영역(variable region of a heavy chain antibody, VHH)으로서, 낙타과 동물로부터 단리된 단일 도메인 항체, 소위 VHH 항체를 일컫는다. VHH 항체는 단일 도메인 분자이기 때문에 4개의 사슬, 즉 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진 항체와는 달리 초분자 조립체 없이 세포에서 발현되며, 일반 항체보다 더 안정적이고 강력하다. 또한, VHH 항체는 약 15kDa의 매우 작은 분자이기 때문에 기존 항체로 접근 할 수 없는 숨겨진 에피토프에 결합가능하며, 더불어 치료용으로 적용할 경우, 작은 분자량에 의해 효율적인 침투 및 빠른 클리어런스(clearance)가 가능하다는 장점이 있다. 게다가, 동일한 세포 내외의 폴딩에 접합할 가능성이 더 높기 때문에 세포 내 프로빙을 위한 후보물질(intrabody)로 대두되고 있다.
VHH 항체는 항원으로 면역화 시킨 낙타과 동물로부터 B 세포를 수득한 다음, 파지 디스플레이(Phage display) 방법으로 항체를 선별하여 제조한다. 이 때, 낙타과 동물을 면역화 시키기 위해 항원을 낙타에 주입하면 낙타의 B 세포에서는 다양한 항체들(IgG, IgA, IgD, IgM, IgE 등)이 생성된다. 특히 낙타는 IgG1, IgG2, IgG3로 구성된 3개의 IgG 동형상(isotype)을 생성하는데, 이 중 IgG2 및 IgG3는 경쇄 및 CH1 도메인이 없는 구조를 갖는 항체이기 때문에 이로부터 VHH 항체를 생산한다. 그러나 면역화된 낙타가 생성하는 다양한 항체들 중, IgG2와 IgG3의 생성량이 현저히 낮아 VHH 항체를 제조하는데 어려움을 겪고 있다. 따라서 IgG2와 IgG3의 생성량을 선택적으로 증가시켜 VHH 항체를 효율적으로 제조하기 위한 방법의 개발이 필요하다.
플라젤린(flagellin)은 세균에 있는 편모 섬유를 구성하고 있는 구형 단백질로서, 분자량은 균종에 따라 크게 다르며(30,000~70,000), 아미노산 조성에 있어 시스테인과 트립토판은 나타나지 않는 것이 특징이다. 이러한 플라젤린은 병원균과 관련된 분자 패턴을 인지하는 수용체인 TLR-5(Toll-like receptor-5)의 수용체에 결합하여 면역 조절 효과를 유도할 수 있음이 알려지면서 백신의 아쥬반트(adjuvant)로서의 가능성이 입증되었으며, 이는 특허 문헌에도 개시되어 있다. 구체적으로, 한국등록특허 제0795839호는 세균의 편모 구성인자 플라젤린을 유효성분으로 함유하는 백신 보조제에 관한 것으로, 플라젤린 구성 단백질이 상피세포에서 인터루킨-8의 생산을 자극하고 수지상 세포의 성숙을 촉진하며 항원-특이적 면역 반응을 증가시키는 것이 개시되어 있다. 그러나, 종래에는 플라젤린이 상기와 같이 백신의 아쥬반트로서의 기능성만 입증되었을 뿐, 플라젤린이 낙타과 동물에서 항원과 함께 주입될 경우, 다양한 항체들 중에서 IgG2 및 IgG3의 생성을 선택적으로 향상시키는 기능은 언급된 바 없다.
한편, 질병에 대한 방어기전으로서 사람뿐만 아니라 여러 포유류 및 조류도 감염성 질병으로부터 자신을 보호하거나 자손을 보호하기 위해 만들어내는 물질에 항체가 포함되어 있다. 포유류는 대부분 사람과 유사하게 약 150kDa의 IgG를 생산한다. 종래에는 여러 병원성 세균의 항체를 제조하기 위해 토끼, 소, 염소 등의 포유동물을 면역 처리하여 얻어진 혈청으로부터 병원성 세균 특이항체를 생산하는 방법이 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나 이러한 방법을 통해 채취된 항체는 약 150kDa의 큰 분자이기 때문에 치료용으로 적용하는 경우에는 침투가 효율적이지 못하고 빠른 클리어런스가 일어나기 어렵다는 단점이 있다. 따라서 질병을 효율적으로 치료하기 위하여 더 작은 항체-유래 분자를 사용하는 것이 필요하다.
한편, 소화기성 질병 중 하나인 설사병은 소화관을 통과한 내용물 중의 수분이 생체 내에서 상호 이동의 이상에 의해 발생되는 것으로서, 송아지에게 치명적일 수 있고 폐사의 원인이 되며 회복되어도 성장장애 등을 일으켜 경제적 손실이 큰 질병으로 알려져 있다. 송아지 설사병의 원인은 감염성 및 비감염성으로 구분할 수 있으며, 비감염성의 원인은 사양관리의 부적절 및 축사의 불청결에 의해 발생되며, 감염성의 원인은 다양한 바이러스, 세균 및 기생충의 감염에 의해 발생한다. 송아지가 감염성 설사병 증상이 나타나게 되면 첫 증상을 보이고 3일 내지 5일 내에 빠르게 진행되며, 대증요법을 실시하지 않으면 송아지는 폐사하게 되므로 신속한 치료가 이루어지도록 하는 것이 바람직하며, 이를 예방하기 위해서는 예방 접종을 하는 것이 중요하다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 송아지 소화기성 질병을 예방 또는 치료하기 위한 VHH 항체를 제조하기 위하여 플라젤린을 이용하는 경우, IgG2 및 IgG3의 생성을 선택적으로 증가시켜 효율적으로 VHH를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
KR 10-0795839 B
따라서, 본 발명의 주된 목적은 항원 특이적인 IgG2 및 IgG3의 생성을 선택적으로 증가시킴으로써 VHH 항체를 효율적으로 제조할 수 있는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체의 제조방법, 이의 제조방법을 통해 제조된 항체 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체를 제조하는 방법에 있어서, 송아지 소화기성 질병의 원인균 또는 바이러스의 외막 단백질과 플라젤린(flagellin)의 혼합물을 낙타과 동물에 주입하여 면역화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 도메인 VHH 항체의 제조 방법을 제공한다.
나노바디는 낙타과 동물로부터 단리된 단일 도메인 항체, 소위 VHH 항체를 일컫는다. VHH 항체는 약 15kDa의 매우 작은 분자이기 때문에 이를 기반으로 한 항체 치료제에 대한 기술들이 개발되고 있다. 일반적으로, VHH 항체는 항원으로 면역화 시킨 낙타과 동물로부터 B 세포를 수득 및 선별하여 제조하는데, 이 때, 면역화된 낙타과 동물의 B 세포에서는 다양한 항체들(IgG, IgA, IgD, IgM, IgE 등) 뿐만 아니라 IgG2 및 IgG3가 생성되며, 이 중에서 IgG2 및 IgG3는 경쇄 및 CH1 도메인이 없는 구조를 갖기 때문에 이로부터 VHH 항체를 생산한다. 그러나, 생성되는 IgG2와 IgG3는 생성량이 현저히 낮아 VHH 항체를 제조하는데 어려움을 겪고 있다. 이에, 본 발명자들은 낙타를 면역화 시킬 때 항원과 함께 플라젤린을 주입할 경우, IgG2와 IgG3의 생성량이 선택적으로 증가되어 송아지 소화기성 질병을 예방 또는 치료하기 위한 VHH 항체를 효율적으로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 단일 도메인 VHH 항체의 제조 방법에 있어서, 상기 송아지 소화기성 질병의 원인균은 대장균(E.coli), 살모넬라균(Salmonella), 클로스트리디움균(Clostridium) 및 요네균(Mycobacterium paratuberculosis)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 균이고, 바이러스는 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 파보바이러스(Parbovirus), 및 엔테로바이러스(Enterovirus)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 단일 도메인 VHH 항체의 제조 방법에 있어서, 상기 플라젤린은 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnficus) 및 리스테리아균(Listeria monocytogenes)으로 이루어진 군에서 선택된 세균에서 유래된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 단일 도메인 VHH 항체의 제조 방법에 있어서, 상기 송아지 소화기성 질병의 원인균의 외막 단백질 또는 바이러스의 외막 단백질과 플라젤린의 혼합 비율은 5~20 : 1일 수 있으며, 바람직하게는 10:1인 것을 특징으로 한다. 예컨대, 상기 송아지 소화기성 질병의 원인균의 외막 단백질 또는 바이러스의 외막 단백질의 함량이 1mg일 때 플라젤린은 0.05~0.2mg 일 수 있다. 상기 혼합 비율에서 플라젤린의 비율이 높아질수록 항원 특이적인 IgG2 및 IgG3의 생성이 선택적으로 이루어지지 않아 단일 도메인 VHH 항체의 제조가 효율적으로 이루어지기 어렵다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 송아지 소화기성 질병의 원인균 또는 바이러스 항원과 플라젤린(flagellin)의 혼합물을 낙타과 동물에 주입하여 면역화 시키는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 송아지 소화기성 질병의 원인균 또는 바이러스 항원과 플라젤린(flagellin)의 혼합물을 낙타과 동물에 주입하여 면역화 시키는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 송아지 소화기성 질병의 원인균 또는 바이러스 항원과 플라젤린(flagellin)의 혼합물을 낙타과 동물에 주입하여 면역화 시키는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 송아지 소화기성 질병의 원인균 또는 바이러스 항원과 플라젤린(flagellin)의 혼합물을 낙타과 동물에 주입하여 면역화 시키는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체를 제공한다.
본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체는 대장균(E.coli), 살모넬라균(Salmonella), 클로스트리디움균(Clostridium) 및 요네균(Mycobacterium paratuberculosis)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 균, 특히 대장균(E. coli) K99에 대하여 특이적 결합능을 가지며, 본 발명의 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체는 로타바이러스(Rotavirus), 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체는 코로나바이러스(Corona Virus), 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체는 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 파보바이러스(Parbovirus), 및 엔테로바이러스(Enterovirus)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스, 특히 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus)에 대하여 특이적 결합능을 가진다.
본 명세서에서 대장균, 살모넬라균, 클로스트리디움균 및 요네균을 언급하면서 사용되는 용어 ‘단일 도메인 VHH 항체’는 대장균, 살모넬라균, 클로스트리디움균 및 요네균에 대한 특이 항체이고, 로타바이러스, 코로나바이러스, 소바이러스성설사병바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스 및 엔테로바이러스를 언급하면서 사용되는 용어 ‘단일 도메인 VHH 항체’는 로타바이러스, 코로나바이러스, 소바이러스성설사병바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스 및 엔테로바이러스에 대한 특이 항체로서, CDR이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 항체이며, 중쇄 항체, 경쇄가 자연적으로 없는 항체, 종래의 4-쇄 항체에서 유래한 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체에서 유래된 것 외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함한다.
단일 도메인 항체는 마우스, 사람, 낙타, 라마, 염소, 토끼 또는 소 등의 종으로부터 유래될 수 있으나, 본 발명에서의 단일 도메인 항체는 낙타과 동물, 예컨대 낙타, 단봉낙타, 라마, 알파카 및 야생 라마 등에서 유래한 것이다. 본 발명에 이용되는 단일 도메인 항체는 경쇄가 없는 중쇄 항체로 알려진 자연 발생 단일 도메인 항체이다. 좀 더 상세하게는 경쇄가 자연적으로 없는 중쇄 항체에서 유래된 이 가변성 영역은 종래의 4-쇄 면역글로불린의 VH와 구별하기 위하여 VHH 또는 나노바디(nanobody)로 불리어 진다.
본 발명의 단일 도메인 VHH 항체는 대장균, 살모넬라균, 클로스트리디움균, 요네균, 로타바이러스, 코로나바이러스, 소바이러스성설사병바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스 및 엔테로바이러스를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선 시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체를 코딩하는 서열번호 4로 표시되는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체를 코딩하는 서열번호 6으로 표시되는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체를 코딩하는 서열번호 8로 표시되는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다.
전술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 단일 도메인 VHH 항체를 코딩하는 핵산분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 6으로 표시되는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 8로 표시되는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터, 파아지미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 단일 도메인 VHH 항체를 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서, 상기 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절 인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 6으로 표시되는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 8로 표시되는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스(Bacillus) 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체, 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 송아지 소화기성 질병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 단일 도메인 VHH 항체는 대장균, 살모넬라균, 클로스트리디움균 및 요네균과 같은 균주, 또는 로타바이러스, 코로나바이러스, 소바이러스성설사병바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스 및 엔테로바이러스와 같은 바이러스에 대한 항원과 특이적으로 결합하므로 단일 도메인 VHH 항체 단독 또는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 상기 항원들에 의해 발병하는 송아지 소화기성 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용가능하다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 알긴산, 젤라틴, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 송아지에 투여하는 방법으로는 송아지에게 투여 가능한 어떠한 방식도 이용가능하며, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체, 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체 중 하나 이상을 사료첨가제 원료 및 부형제를 혼합한 후, 상기 혼합물을 압축 펠렛팅화(extrusion pelleting)하여 사료로 제조하여 경구투여 방식으로 급이할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체, 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 단일 도메인 VHH 항체 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 사료첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 사료첨가제는 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체의 제조 방법은 낙타과 동물에서 생성되는 다양한 항체들 중에서 항원 특이적인 IgG2 및 IgG3의 생성을 선택으로 증가시킬 수 있다. 이에 따라 다양한 항체들보다 선택적으로 증가된 IgG2 및 IgG3를 단일 도메인 VHH 항체 제조에 이용할 수 있으므로, 단일 도메인 VHH 항체를 보다 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1 내지 4는 실험예 1에 따라 IgG2 및 IgG3의 생성량을 확인한 결과이다(도 1; 대장균, 도 2; 로타바이러스, 도 3; 코로나바이러스, 도 4; 소바이러스성설사병바이러스).
도 5 내지 도 8은 실험예 3에 따라 패닝(panning)에 의해 특이적인 항체들을 선별한 결과이다(도 5; 대장균, 도 6; 로타바이러스, 도 7; 코로나바이러스, 도 8; 소바이러스성설사병바이러스).
도 9 내지 도 12는 실험예 6에 따라 단일 도메인 VHH 항체의 특이성을 확인한 결과이다(도 9; 대장균, 도 10; 로타바이러스, 도 11; 코로나바이러스, 도 12; 소바이러스성설사병바이러스).
도 13은 대장균의 성장 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 14 내지 16은 바이러스의 감염 저해 효과를 확인한 결과이다.(도 14; 로타바이러스, 도 15; 코로나바이러스, 도 16; 소바이러스성설사병바이러스).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예: 낙타과 동물 면역화용 혼합물의 제조(1)
낙타과 동물을 면역화 시키기 위한 혼합물을 표 1의 성분 및 함량으로 제조하였으며, 구체적인 실험 방법은 아래와 같다.
1) 세균성 항원 생산
대장균(E. coli)의 외막에 존재하는 외막 단백질 (outer membrane protein, 이하 OMP라 칭함)을 항원으로 이용하기 위해, 대장균(E. coli)에서 OMP를 추출하였다. 대장균(E.coli)는 전용배지(1.5 L)에서 37℃에서 24시간 배양하였다. 집락 형성을 확인 후 배양액을 원심분리(8,000 x g, 4℃, 10 min)하여 균체를 회수한다. 회수한 균체는 35ml lysis buffer(20 mM Tris-HCl, 1 mM PMSF, pH 8)에 재부유시켜 초음파 분해하였다. 초음파 분해 후 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 상층액을 얻는다. 상층액을 초고속원심분리기로 원심(20,000 x g, 4℃, 1 h)하여 펠렛을 얻었다. 펠렛을 2% 사르코실(sarkosyl)을 포함하는 20 mM Tris-HCl (pH 8) 10 ml에 재부유시켜 상온에서 1시간 방치하였고, 초고속원심분리기로 원심 (20,000 x g, 4C, 1 h) 하여 OMP 항원을 회수하였다. OMP 항원은 30 ml PBS로 2회 세척하여 알파카 면역접종 항원으로 이용하였다.
2) 바이러스성 항원 생산
로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus)는 숙주세포를 이용하여 배양하였다. 상기 바이러스를 감염시킨 후 2일경 세포병변이 확인되면 얼린 후 녹이는 과정을 3회 반복하여 바이러스를 분리시키고, 원심분리를 통하여 바이러스가 포함된 상층액을 회수하였다. 회수한 바이러스를 불활화하기 위해 바이러스 배양액을 60℃에서 30분간 열처리하여 불활화 하였고, 동량의 lysis buffer(40 mM Tris-HCl, 2 mM PMSF)에 재부유시켜 초음파 분해하였다. 초음파 분해 후 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 cell debris를 제거한 후 18,000 x g, 1h, 4℃에서 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 펠렛을 2% 소듐라우로일사코시네이트(sodium lauryl sarcosine) 용액에 재부유시켜 상온에서 1시간 방치하였고, 원심분리기로 원심 (18,000 x g, 4C, 1 h) 하여 OMP 항원을 회수하였다. OMP 항원은 PBS로 2회 세척하여 알파카 면역접종 항원으로 이용하였다.
3) 플라젤린 생산
살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)의 표준 균주에서 플라젤린을 분리하였다. 구체적으로 균주를 LB 배지 1.5 L 당 1%씩 접종하여 배양하였다. 37℃에서 24시간 동안 배양하였고, 4℃에서 원심분리 (6,000 x g, 30 min)하여 균주를 회수하였다. 회수된 균주를 300 ml PBS로 부유시킨 후 2회 세척하였고, 균주를 PBS로 재부유 시킨 후 염산으로 pH를 2.0으로 조정하고, 30분간 교반하였다. 교반 후 4℃에서 15분간 원심분리 (14,000 x g)하여 상층액을 회수하고, 1 M 수산화나트륨으로 pH 7.4로 적정한 후 상층액에 65% 암모늄 설페이트가 되도록 가하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 상층액은 다시 원심분리 (20,000 x g, 15 min)하였다. 원심분리 후 침전된 펠렛은 40 ㎖의 PBS로 재부유 시킨 후 투석망 (dialysis tube)에 넣어 PBS 상에서 48시간 투석하여 플라젤린을 생산하였다.
4) 알파카 면역화를 위한 항원 제조
상기 1) 에서 제조한 OMP 항원 및 상기 2) 에서 제조한 OMP 항원 1 mg씩을 항원 용액의 동일량의 adjuvant (Titer Max®)와 혼합 후 초음파 균질화하여 알파카 면역화용 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물에 플라젤린을 혼합하여 알파카 면역화를 위한 항원 제조를 완료하였다.
항원 항원 함량 플라젤린 함량
대장균(E. coli)의 외막 단백질 및 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus) 외막 단백질 각각의 항원당 1 mg 0.2mg
비교예: 낙타과 동물 면역화용 혼합물의 제조(1)
낙타과 동물을 면역화 시키기 위한 혼합물을 표 2의 성분 및 함량으로 포함하도록 제조하였다. 플라젤린을 포함하지 않는 것을 제외하고는 실시예와 제조방법은 동일하다.
항원 항원 함량 플라젤린 함량
대장균(E. coli)의 외막 단백질 및 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus) 외막 단백질 각각의 항원당 1 mg 0.0mg
실험예 1: 낙타에서의 면역반응 유도, 분리된 혈액으로부터 IgG 2 및 IgG 3 의 생성 확인
실시예에서 제조한 혼합물을 낙타에 2 내지 4군데 분산하여 피하투여 하였다. 이후, 2주 간격으로 5차례 같은 양의 혼합물을 같은 방법으로 투여하였다. 최종 투여 2주일 후, 항응고제가 들어있는 수혈팩에 혈액을 채취하였고, 원심분리 (6,000 x g, 30 min)하여 혈장을 분리하였다. 혈장에서 IgG1, IgG2 그리고 IgG3를 분리하기 위해 Protein A와 Protein G column (GE Healthcare)을 이용하였다.
항원 특이적 IgG1, IgG2 그리고 IgG3를 확인하기 위하여, PBS에서 희석된 각각의 바이러스성 항원과 세균성 항원 100 ng을 96-well plate에 하룻밤 4℃에서 코팅하여 ELISA 기반의 항원-항체 반응을 확인하였다. 항원을 코팅한 plate는 PBS-T (0.05% Tween 20)로 3회 세척하였고, 이후 3% BSA로 보충된 PBS로 상온에서 1시간 동안 blocking하였다. BSA blocking 후 plate를 PBS-T로 3회 세척한 이후 각각의 항체를 10 nM씩 가하여 상온에서 1시간 항원-항체 반응을 유도하였다. Plate를 PBS-T로 세척하고, 이후 anti-alpaca IgG (rabbit polycolnal antibody, 1:5,000)를 처리하였다. Plate를 세척하고, anti-rabbit IgG-HRP (goat antibody, 1:10,000)를 상온에서 1시간 반응시켰다. PBS-T로 세척한 plate를 TMB 기질을 첨가 이후 stop solution을 각각 well에 첨가하였다. 흡광도 평판 판독기를 이용하여 450 nm에서 측정하여 항원-항체 반응을 확인하였으며, 그 결과를 도 1 내지 도 4에 나타내었다.
그 결과 도 1 내지 도 4에서 확인할 수 있듯이, 알파카를 면역화 시키기 위하여 항원과 플라젤린을 혼합하여 주입한 경우, 항원만 주입한 경우보다 항원 특이적 IgG2 및 IgG3의 생성이 선택적으로 증가하였다.
실험예 2: 면역화된 낙타로부터 분리한 백혈구를 이용한 cDNA 합성 및 단일 도메인 항체 라이브러리의 제조
알파카 면역화 후 혈액 100 ml를 채취한 다음 피콜 (Ficoll) 용액을 이용하여 말초혈액단핵구 (PBMC)를 분리하였다. 분리한 PBMC는 RNAiso Plus(TAKARA BIO)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 회수한 total RNA를 SuperScriptⅢ (Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 VHH 유전자를 증폭하였다. IgG2 및 IgG3의 Forward primer 서열은 5′-AGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGNGG-3′(서열번호 9)이고, IgG2의 Reverse primer 서열은 5′-GGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′(서열번호 10)이며, IgG3의 Reverse primer는 5′-TTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3′(서열번호 11)이다.
중합효소 연쇄 반응은 구체적으로 합성한 cDNA를 템플릿으로 하여 상기의 primer를 이용하여 진행하였으며, PCR 반응은 95℃에서 2 min, 96℃에서 30 sec, 58℃에서 30 sec, 72℃에서 1 min, 72℃에서 5 min 그리고 30 cycle의 조건에서 알파카 VHH 유전자를 증폭하였다.
PCR 반응으로 증폭한 VHH 유전자는
forward primer(SfiⅠ 제한효소 사이트 추가, 5´-TGCTCCTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGG-3´)(서열번호 12)와 reverse primer(SpeⅠ 제한효소 사이트 추가, 5´-ATGATGATGTGCACTAGTTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3´(서열번호 13) (IgG3), 5´-ATGATGATGTGCACTAGTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3´(서열번호 14) (IgG2)를 이용하여 PCR(95℃에서 2 min, 96℃에서 30 sec, 58℃에서 30 sec, 72℃에서 1 min 그리고 72℃에 5 min을 20 cycle)을 수행하여 제한효소 사이트를 부가하였다. 제한 효소 사이트를 부가한 VHH 유전자 단편을 파지미드벡터 (pKSTV03)에 삽입하였다. VHH 유전자가 삽입된 파지미드벡터는 파지 감염이 가능한 호스트인 E. coli TG-1 cell (Lucigen)에 형질전환 하였다. 상기 형질 전환된 E. coli TG-1의 적당량을 2YT-AG (2YT medium, 100 μg/ml ampicillin 2% glucose) 500 ml에 접종하고 배양 (37℃, 1.5 h) 후 M13KO7 헬퍼 파지 (Invitrogen, m.o.i = 10)에 감염시키고 16시간 배양 하였다. 배양한 배양액을 원심 분리하여 상층에 부유한 파지를 회수하기 위해 PEG (polyethylene glycol)/NaCl 침전법을 이용하여 파지를 침전시키고 회수하였다.
실험예 3: 패닝(panning)에 의한 특이적인 항체들의 선별
상기에서 회수한 파지를 이용하여 패닝(panning) 실험을 진행하여 항원에 특이적으로 결합하는 파지를 증가시켰다. 구체적으로 4 μg의 항원을 2 ml의 PBS에 가한 다음 immunotube(Nunc)에 넣고 4℃에서 하룻밤 방치하였고, 다음날 PBS-T로 3회 세척하고 PBS로 희석한 3% skim milk를 사용하여 상온에서 2시간 동안 blocking하였다. 이후, PBS-T로 3회 세척하였다. 항원에 결합하는 파지를 선별하기 위해 파지가 포함된 용액 3 ml를 가하여 2시간 동안 반응시켰고, 이후 시험관 안의 용액을 버리고 PBS-T로 10회 세척 하였다. 항원에 결합한 파지를 용리하여 수거하기 위해 0.1 M glycine/HCl (pH 2) 1 ml을 넣고 상온에서 10분간 방치하여 파지를 용리시켰다. 이후, 2M Tris-base 50 μl를 넣어 중화시켰다. 이와 같은 패닝 (panning) 과정을 반복함으로써 항원에 특이적으로 결합하는 파지를 획득 및 증가시켰다(도 5 내지 도 8).
실험예 4: 양성 클론(clone)의 선별 및 확인
96-well plate의 well에 각각 200 μl의 2YT-AG 배지을 넣고, VHH 유전자가 포함된 E. coli TG-1 단일 콜로니를 멸균된 이쑤시게를 이용하여 각각의 well에 접종하고 배양 (37 ℃, 4 시간) 후 M13KO7 헬퍼 파지 (m.o.i = 5)를 넣어 감염시켰다. 헬퍼 파지 감염 후 대장균을 원심 분리하여 감염되지 않은 헬퍼 파지를 제거한 후 침전된 대장균을 2YT-AK 250 μl에 현탁하였다. 이후 37℃에서 16 시간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 상층에 부유한 파지 용액을 회수하여 ELISA를 시행하였다.
항원에 결합하는 파지 클론을 확인하기 위해 96-well plate에 항원 100 ng을 4 ℃에서 하룻밤 코팅하였다. 항원을 코팅한 plate는 PBS-T로 3회 세척하였다. 이후 3% BSA로 상온에서 plate를 1시간 동안 blocking하였다. Blocking 이후 plate를 PBS-T로 3회 세척한 다음 파지 용액을 가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Plate를 PBS-T로 3회 세척하고, 파지 특이적 항체를 Blocking를 사용하여 1 : 2000으로 희석한 다음, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Plate를 PBS-T로 3회 세척하고, HRP가 붙은 항체를 1 : 5000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 다음, 5회 세척 후, TMB 기질을 첨가한 후 stop solution을 각각 well에 첨가하였다. 흡광도 평판 판독기를 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하여 평가하였다.
실험예 5: 각 항원에 대한 단일 도메인 VHH 항체 확인
실험예 4에서 선별된 대장균(E. coli)의 외막에 존재하는 외막 단백질에 대한 파지클론 96개 및 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus)에 대한 96개의 파지 클론 중 대장균(E. coli) 1개 및 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus) 각 1개의 파지 클론을 선택하여 양성 파지 클론의 VHH 유전자 서열을 BI 프리즘 3100 유전자 분석기 (Applied Biosystems0)를 이용하여 아미노산 염기서열을 분석하였다. 대장균(E.coli) 양성 파지 클론의 VHH 유전자에 대한 아미노산 염기서열은 서열번호 1에, 각 로타바이러스(Rotavirus), 양성 파지 클론의 VHH 유전자에 대한 아미노산 염기서열은 서열번호 3에, 코로나바이러스(Corona Virus) 양성 파지 클론의 VHH 유전자에 대한 아미노산 염기서열은 서열번호 5에, 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus) 양성 파지 클론의 VHH 유전자에 대한 아미노산 염기서열은 서열번호 7에 나타내었다.
실험예 6: 단일 도메인 VHH 항체의 특이성 확인
선발된 VHH 항체 각각의 대장균(E. coli), 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus) 및 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus)에 대한 반응성을 확인하였다.
구체적으로, 먼저 특정 항원 (대장균(E. coli), 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus) 및 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus))을 coating buffer를 이용해서 희석한 뒤, 100 ng/well이 되도록 분주한 후 4℃에서 Overnight 한다. 그리고 다음날 washing buffer (PBS/T(0.05% Tween-20))로 각 well을 3회 세척한 후, Blocking buffer (0.5% skim milk in PBS)를 200㎕/well 씩 각 웰에 분주한 다음 상온에서 1hr 반응시킨다. Washing buffer (PBS/T(0.05% Tween-20))로 각 well을 3회 세척하고 나서 dilution buffer (0.5% skim milk in PBS/T(0.05% Tween-20))로 측정하고자 하는 VHH 항체를 희석하여 well당 100㎕ 처리한 다음 상온에서 1hr 반응시켰다. 그 다음 3회 washing한 후에 Biotin anti-HA를 dilution buffer에 1:5,000으로 희석하여 100 ㎕/well 분주한 다음 상온에서 1hr 반응시켰다. 반응 종료 후에 3회 washing 후 Streptavidin HRP를 dilution buffer에 1:10,000으로 희석하여 100㎕/well 분주하고 상온에서 30min 반응시킨다. 최종적으로 3회 washing 후에 TMB solution을 100 ㎕/well 분주하여 발색 반응시킨다. 반응 완료 후에 stop solution (1.6N H2SO4)을 100 ㎕/well 분주하여 발색을 중단하고 Microplate reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정한다. 이 결과를 Graphpad prism 프로그램을 이용하여 그린 다음에 감염 최대값과 감염 최소값의 평균값인 EC50은 VHH 항체가 특정 항원 (대장균(E. coli), 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus))에 50% 결합하는 값을 결정하여 VHH 항체의 결합 정도를 파악하였으며, 그 결과를 도 9 내지 도 12에 나타내었다.
도 9에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 대장균(E. coli) VHH 항체의 대장균 외막 단백질에 대한 특이적 결합 EC50 값(effective concentration of drug that causes 50% of the maximum response)이 각각 11591ng/ml로 반응성이 우수하였다. 또한, 도 10 내지 도 12에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 로타바이러스(Rotavirus)(도 10), 코로나바이러스(Corona Virus)(도 11), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus) (도 12) VHH 항체의 각 바이러스 외막 단백질에 특이적 결합 EC50값(effective concentration of drug that causes 50% of the maximum response)이 7.7 ng/ml, 24.2 ng/ml, 2400 ng/ml 로 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus))에 대한 반응성이 우수하였다.
실험예 7: 송아지 소화기성 질병에 대한 억제 효과 확인
본 발명에 따라 제조된 VHH 항체의 송아지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스의 억제 효과를 확인하였다.
송아지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스의 억제 효과인 IC50는 다음과 같이 측정한다. 구체적으로 송아지 소화기성 질병 유발균인 대장균(E. coli)을 각각 TSB agar plate 균주도말 한 후 24시간 동안 28℃ incubation 배양한다. 배양 후 단일 Colony를 취하여 TSB broth 배지에 접종하여 24시간 동안 28℃, Shaking incubation 배양 한다. 균수 농도 약 1 X 109 cfu /mL의 전종 균액을 준비한다. 희석액 (배지)으로 10,000배 희석하여 약 1 X 105 cfu/mL 의 전종 균액을 준비한다. 준비된 균액을 각 Well당 100 ㎕/㎖ 씩 분주 한다(최종 접종 균수는 5 X 104 cfu/mL). 각 Well 마다 VHH 항체 샘플을 넣어 최종 200㎕에 들어가도록 한 다음에 세균 생장율을 측정한다. 28℃ incubation, 150 rpm 24시간 배양하고 나서 ELISA Reader (OD 600nm)로 값을 측정한다. 생장율을 세균 접종 직후와 24시간 배양 후의 OD 600nm 참고하여 Graphpad prism 프로그램을 이용하여 그래프을 그린 다음에 세균 생장을 50% 억제하는 농도에서 IC50 (IC50, inhibitory concentration of drug that causes 50% of the maxium inhibition) 값을 결정한다. 결과를 하기 표 3 및 도 13에 나타내었다.
VHH
농도
(μg/ml)		 0.15 0.29 0.59 1.17 2.34 4.69 9.38 18.7 37.5 75 150
OD600
(균생장율)		 0.59 0.57 0.58 0.59 0.6 0.64 0.67 0.68 0.66 0.92 0.43
표 3 및 도 13에서 확인할 수 있듯이, 대장균(E. coli)의 생장을 1/2 정도 저해하는 농도 (IC50, inhibitory concentration of drug that causes 50% of the maxium inhibition)는 대장균 VHH 항체 농도 67.3 μg/ml에서 대장균의 생장을 50% 억제하였다.
또한, 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus) VHH 항체의 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus) 바이러스의 감염 억제 능력은 각 바이러스를 감염시킨 동물세포에서 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus) VHH를 농도별로 희석하여 첨가한 후에 각 바이러스 감염을 저해하는 농도를 IC50 (IC50, inhibitory concentration of drug that causes 50% of the maxium inhibition) 농도라고 칭한다.
도 14 내지 도 16에서 확인할 수 있듯이, 로타바이러스(Rotavirus)의 감염을 저해하는 농도 (IC50, inhibitory concentration of drug that causes 50% of the maxium inhibition)는 로타바이러스 VHH 항체 농도 약 4.34 μg/ml에서 로타바이러스 감염을 50% 억제하였다. 코로나바이러스(Corona Virus) 및 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus) 의 감염을 저해하는 농도 (IC50, inhibitory concentration of drug that causes 50% of the maxium inhibition)는 코로나바이러스 VHH 항체 농도는 0.68 μg/ml, 소바이러스성설사병바이러스 VHH 항체 농도는 61 μg/ml에서 바이러스 감염을 50% 억제하였다.
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Claims (22)

  1. 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체를 제조하는 방법에 있어서,
    송아지 소화기성 질병의 원인균의 외막 단백질 또는 바이러스의 외막 단백질과 플라젤린(flagellin)의 혼합물을 낙타과 동물에 주입하여 면역화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 도메인 VHH 항체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 소화기성 질병 원인균은 대장균(E.coli), 살모넬라균(Salmonella), 클로스트리디움균(Clostridium) 및 요네균(Mycobacterium paratuberculosis)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 균이고, 바이러스는 로타바이러스(Rotavirus), 코로나바이러스(Corona Virus), 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 파보바이러스(Parbovirus), 및 엔테로바이러스(Enterovirus)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스인 것인, 단일 도메인 VHH 항체의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 플라젤린은 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnficus) 및 리스테리아균(Listeria monocytogenes)으로 이루어진 군에서 선택된 세균에서 유래된 것인, 단일 도메인 VHH 항체의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 송아지 소화기성 질병의 원인균의 외막 단백질 또는 바이러스의 외막 단백질과 플라젤린의 혼합 비율은 5~20 : 1인 것인, 단일 도메인 VHH 항체의 제조방법.
  5. 제1항 제조방법으로 제조된 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체.
  6. 제5항에 따른 단일 도메인 VHH 항체를 코딩하는 서열번호 2으로 표시되는 핵산 분자.
  7. 제6항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  8. 제7항의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포.
  9. 제1항 제조방법으로 제조된 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체.
  10. 제9항에 따른 단일 도메인 VHH 항체를 코딩하는 서열번호 4로 표시되는 핵산 분자.
  11. 제10항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  12. 제11항의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포.
  13. 제1항 제조방법으로 제조된 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체.
  14. 제13항에 따른 단일 도메인 VHH 항체를 코딩하는 서열번호 6으로 표시되는 핵산 분자.
  15. 제14항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  16. 제15항의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포.
  17. 제1항 제조방법으로 제조된 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 단일 도메인 VHH 항체.
  18. 제17항에 따른 단일 도메인 VHH 항체를 코딩하는 서열번호 8로 표시되는 핵산 분자.
  19. 제18항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  20. 제19항의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포.
  21. 제5항, 제9항, 제13항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 단일 도메인 VHH 항체 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. 제5항, 제9항, 제13항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 단일 도메인 VHH 항체 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 송아지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 사료첨가제 조성물.
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