JP2010534465A - 抗vp6ラクダ抗体由来の単量体vhhドメイン、二量体ドメイン、免疫法、ロタウイルス検出法、組成物、ロタウイルス感染の予防及び治療方法 - Google Patents
抗vp6ラクダ抗体由来の単量体vhhドメイン、二量体ドメイン、免疫法、ロタウイルス検出法、組成物、ロタウイルス感染の予防及び治療方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
表1
VHHドメインを選択するための定性的評価の結果の要約
1抗ヒスチジン抗体を使用したプレートに結合
配列番号5は配列番号1ドメインをコードする;
配列番号6は配列番号2ドメインをコードする;
配列番号7は配列番号3ドメインをコードする;
配列番号8は配列番号4ドメインをコードする;
表2
特徴
1RV IND及び組換えVP6に対するWBにより測定した。
2各0.5lの6組の培養物に基づき、抗ヒスチジンタグカラムによって精製した。
3RV株SbI、SbII、Sb非I;非IIの検出。
表3
種々の単量体及び二量体VHHドメインの中和力価
1各RV株の100FFU当たりの、発生するフォーカス形成単位の80%超を減少させる最大VHH希釈度の逆数として表した、種々のRV株の中和抗体力価。
表4
泌乳マウスにおけるロタウイルス投与に対する防御
na:該当なし
・ラクダ抗体由来の単量体VHHドメインであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4から形成される群から選択される配列を含み、A群ロタウイルス(RV)のタンパク質VP6に結合することを特徴とするドメイン。
・A群RVのタンパク質VP6に結合する二量体VHHであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4に示す配列から構成される群から選択される少なくとも1つの単量体配列を含むことを特徴とするドメイン。
本発明の単量体及び二量体VHHの入手及び精製
本発明のVHHライブラリーの入手
参照ウシIND RV株をバイオパニングプロセスの抗原として使用して(SbI;P[5]G6)VHHを選択した。種々の動物種由来及びヒト由来のG及びP型の種々の組合せとの種々の亜群反応性を表すRVパネルを得るために、表4に列挙したRV参照株を、VHHを製造するために実施した種々のアッセイに含めた。ウイルスを、サル腎臓細胞(MA−104)中で増殖させた。接種前及びウイルス拡散ピーク時のIND株に感染した初乳未摂取新生仔ウシの糞便試料も含めた。
表5
本発明のVHHの製造及び特徴付けの間に実施した種々の手順で使用した参照ロタウイルス株
ラマの免疫化:ウシRV株由来タンパク質VP6
本発明のVHHの特徴付け
ウェスタンブロット:バキュロウイルス系において発現されたVP6濃縮物及びBRV IND濃縮物をLaemmli試料緩衝液中に再懸濁し、10分間沸騰させた。これらを次いで、12%SDS−PAGEカラムに流し、Immobilon P膜(Millipore、Berdford、MA)に移した。膜を10%スキムミルク含有PBS/Tween(0.05%)で45分間ブロックし、各VHH(4μg/ml)を2時間周囲温度でインキュベートした。次いで膜をPBS/Tween(0.05%)で洗浄し、抗5×ヒスチジン抗体(PBS/Tween(0.05%)、BSA(3%)中に1/500希釈)とともに4℃で一晩インキュベートした。最後に、HRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(1/5000希釈)(Amersham、Pharmacia、Biotech)とともに40分間、周囲温度でインキュベートした。アッセイはECL(Amersham Biosciences)により発色させた。
本発明のVHHを使用したRV免疫検出アッセイ
酵素免疫測定法(ELISA)及びウェスタンブロット:ELISA実験をMaxisorp96ウェルプレート(Nunc)で、RVによる直接感作により、又はRV若しくはノトバイオートブタにおいて産生されたポリクローナル抗体を有する組換えVP6の捕捉によって実施した。陰性対照の抗原として、偽感染MA−104細胞及びバキュロウイルスにおいて発現された非関連タンパク質(ウシ下痢ウイルスのタンパク質E2)を使用した。PBSをブランクとして使用し、非免疫化モルモット血清を陰性捕捉物として使用した。
哺乳動物の予防及び/又は治療のための本発明の単量体及び二量体VHHの使用
新生仔マウスにおけるRV防御アッセイ
100μl中100μgの各抗VP6VHH単量体を、胃内プローブを使用して4日齢のBalb/cマウスに1日1回、0日目から開始して5日間投与した。泌乳マウスに、2×106FFU/mlを含む100μlのBRV C486(SbI;P[1]G6)を1日目に通常のVHH投与の2時間後に、次いで20μlの5%重炭酸溶液を、これもまた胃内経路により投与した。接種は、未処理対照マウスの100%において下痢を引き起こすことが可能であった。実験で使用された対照群は、(i)RVを接種され、抗体で処理されていないマウス(ii)細胞タンパク質に対する同量の非関連VHHで処理されたマウス(iii)同種RVに対するVN力価が2048のモルモットポリクローナル抗血清由来の親和性精製IgG450μgで処理されたマウス(iv)同量の血清陰性対照モルモット由来のIgGで処理したマウス(v)非感染及び未処理マウス、であった。RV起因性の下痢を、試験の5日間、マウス腹部の直接の触診によって臨床的に評価した。下痢の重症度を、VanCott,J.L.ら、J Virol 80:4949〜61、2006年に記載の通り、日常的に便の色及び軟度に基づいて数値を割り当てることによって分析した。フィッシャーの正確確率検定を使用して、下痢のマウスの割合を群間で比較した。クラスカルワリス・ノンパラメトリック検定を使用して、下痢の平均発症、期間及び重症度を処理群間で比較した。
組換えバキュロウイルス作製
VHH3B2完全配列を含むphen6プラスミドから、組換えバキュロウイルスBacMelVHHを作製した。以下のプライマー:配列番号23及び配列番号24を使用して、このタンパク質をphen6プラスミドからPCR増幅した。このアンプリコンを次いで、ミツバチメリチン由来の昆虫シグナル配列により、対応するプライマーに含まれるBamHI及びXbaI制限部位を使用して、pFastMelB2ベクターにインフレームでクローニングした。得られたpFBMelVHHプラスミドを、自動シーケンシングにより特徴付けし、Bac−to−Bac(登録商標)Baculovirusシステム(Invitrogen、USA)を製造業者の使用説明書に従って使用して、組換えバキュロウイルスBacMelVHHを作製するために使用した。組換えバキュロウイルスを増殖させ、sf21昆虫細胞において増幅し、107〜109pfu/mlで感染力価に達し、ストックを日常使用のために4℃に、長期保存のために−80℃に保った。
発現実験のために、約250mg重の5齢の幼虫(蛹化前の終齢幼虫)に、既知の用量pfu/幼虫を使用して、組換えバキュロウイルスを前脚近く(体腔前方)に注射した。感染した幼虫を、28℃でグロースチャンバー中に保ち、所定の時間に収集した。次いで幼虫をただちに凍結し、処理されるまで−20℃に保った。
T.ni幼虫の全可溶性タンパク質(TSP)を、1×PBS中にトリトン0.01%;DTT 25mM及びタンパク質阻害剤カクテル(Complete、Roche、Germany)含有する抽出緩衝液中で凍結幼虫を潰すことによって得た。
TSPに含まれる特異的VHHタンパク質の定量及び検出のために、クマシーブルー染色及び免疫ブロッティング分析を実施した。したがって、レーン当たり20μgのTSPを12%SDS−ポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動後、ゲルをクマシーブルー溶液で染色し、又はニトロセルロース膜(Schleicher&Schuell)に移してウェスタンブロットを実施した。
幼虫を発現する[Ag(+)]VP6(ウシロタウイルスタンパク質)から、又は非挿入組換えバキュロウイルス[Ag(−)]を有する感染幼虫からのTSP抽出物を使用して、ELISAマイクロプレート(Polysorp、Nunc、Denmark)をpH9.6の50mM炭酸/重炭酸緩衝液中に40μg/ウェルから段階希釈して被覆し、4℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをPBSTで4回洗浄した。その後プレートを一定に撹拌しながら1時間、ブロッキング溶液(PBST−2%BSA、100μl/ウェル)とともに30分間、37℃でインキュベートした。次いで、ブロッキング緩衝液中に2.5μg/ウェル希釈でVHH発現幼虫からのTSP抽出物を用いて、1時間。次いでプレートをPBSTで4回洗浄し、再度30分間ブロックした。次いで、ウサギで製造したVHHに対するポリクローナル抗体(1:100希釈)100μl/ウェルを加え、1時間、37℃でインキュベートした。プレートをPBSTで4回洗浄した。最後に、ブロッキング溶液中に1:2000希釈した100μl/ウェルの抗ウサギIgG−HRP標識コンジュゲートを加えた。基質反応では、プレートを4回洗浄し、100μl/ウェルの1mM2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)ABTS(KPL、USA)をプレートに加えた。ペルオキシダーゼ反応は、室温で5〜10分間発色でき、反応をELISAマイクロプレートリーダー(Multiskan EX、Thermo Electron Corp、USA)の405nmで読み取った(図7参照)。
Claims (34)
- ラクダ抗体由来の単量体VHHドメインであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4から構成される群から選択される配列を含み、A群ロタウイルス(RV)のタンパク質VP6に結合することを特徴とするドメイン。
- 前記ラクダが、ラマ(Lama glama)、アルパカ(Lama pacos)、グアナコ(Lama guanicoe)、及びビクーニャ(Vicugna vicugna)から構成される群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載のドメイン。
- 前記ラクダが、ラマ(Lama glama)であることを特徴とする、請求項2に記載のドメイン。
- A群RV中に存在するVP6抗原のリニアエピトープに結合し、配列番号2、配列番号3及び配列番号4から構成される群から選択される前記ドメインが中和性であることを特徴とする、請求項1に記載のドメイン。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4に示す配列から構成される群から選択される少なくとも1つの単量体配列を含むことを特徴とする、A群RVのタンパク質VP6に結合する二量体VHHドメイン。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4から構成される群から選択される2つの同一の単量体配列を含む二量体であることを特徴とする、請求項5に記載のドメイン。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4から構成される群から選択される2つの異なる単量体配列を含む二量体であることを特徴とする、請求項5に記載のドメイン。
- 連結配列をさらに含むことを特徴とする、請求項5に記載のドメイン。
- 配列番号13の配列であることを特徴とする、請求項8に記載のドメイン。
- 前記融合タンパク質が、配列番号9、配列番号10、配列番号11及び配列番号12から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項5に記載のドメイン。
- A群RV中に存在するVP6抗原のリニアエピトープに結合することを特徴とする、請求項5に記載のドメイン。
- a)RV含有試料を、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及びこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列と接触させるステップ、及びb)発色させるステップを含むことを特徴とする、ロタウイルス免疫検出方法。
- 免疫捕捉による試験、ELISA、ELISPOT、競合ELISA、磁気ビーズ及びペンサイドから構成される群から選択されることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 哺乳動物に受動免疫を与えるように設計された組成物であって、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及びこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列、賦形剤及び免疫調節剤を含むことを特徴とする組成物。
- 固体、液体及びゲル形態からなる群から選択される形態であることを特徴とする、請求項14に記載の組成物。
- RVにより引き起こされる感染の予防方法であって、それを必要とする哺乳動物に、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及びこれらの組合せから構成される群から選択される有効量のアミノ酸配列を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
- 前記投与が、経口、胃内、静脈内、腹腔内経路から構成される群から選択される経路を含むことを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ及びウマから構成される群から選択されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- RVにより引き起こされる感染の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及びこれらの組合せから構成される群から選択される有効量のアミノ酸配列を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
- 前記投与が、経口、胃内、静脈内、腹腔内経路から構成される群から選択される経路を含むことを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ及びウマから構成される群から選択されることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 請求項1から11までに記載の単量体又は二量体ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするプラスミドpFBMelVHH。
- 前記コードされているドメインが、配列番号4により特徴付けられる3B2である、請求項22に記載のプラスミドpFBMelVHH。
- 植物又はヒト細胞を含む動物細胞の形質転換に有用な組換え発現ベクターであって、請求項22又は23に記載のプラスミドを含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
- 前記ベクターがウイルス、特にバキュロウイルスであることを特徴とする、請求項24に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項24又は25に記載のベクターにより形質転換、トランスフェクト又は感染されたトランスジェニック細胞であって、請求項22又は23に記載のプラスミドに含まれるDNAを発現することを特徴とするトランスジェニック細胞。
- 請求項1から11までに記載のドメインの製造方法であって、
a)宿主細胞を請求項24又は25に記載の組換えベクターで形質転換、トランスフェクト又は感染させるステップ、
b)適切な条件下で前記細胞の増殖を維持するステップ、
c)前記ドメインを単離及び精製するステップ
を含む方法。 - 前記ステップb)において増殖した宿主細胞が、前記ドメインを単離及び精製するまで凍結保存されることを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 前記宿主細胞が幼虫又は昆虫細胞であることを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 請求項1から11までに記載のドメインのいずれかを含むことを特徴とする抗体。
- 請求項30に記載の有効量の抗体を哺乳動物に接種するステップを含む、受動免疫方法。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及びこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む、RVの免疫検出キット。
- RVにより引き起こされる感染の予防方法において使用するための、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及びこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列。
- RVにより引き起こされる感染の治療方法において使用するための、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及びこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列。
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