KR101505215B1 - 트리아진 유도체, 상기 유도체를 함유하는 조성물, 및 상기 유도체를 사용한 암 및 자가면역 질환의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 개시한다. 하기 화합물은 특정 암 및 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
<화학식 I>
Figure 112009073096479-pct00036
식 중,
X는 불소 또는 염소이고;
Y는 산소, 황, 또는 이미노 기이고;
R은 아미노, 히드록실, 술폰아미드 또는 카르복스아미드 기, 또는 그의 N-모노메틸 또는 N-디메틸 유사체이고;
m은 2 내지 6의 정수이고;
n은 0 내지 2의 정수이다.
트리아진 유도체, 암, 자가면역 질환

Description

트리아진 유도체, 상기 유도체를 함유하는 조성물, 및 상기 유도체를 사용한 암 및 자가면역 질환의 치료 방법{TRIAZINE DERIVATIVES, COMPOSITIONS CONTAINING SUCH DERIVATIVES, AND METHODS OF TREATMENT OF CANCER AND AUTOIMMUNE DISEASES USING SUCH DERIVATIVES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2007년 4월 30일에 출원된 가출원 제60/924,111호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 하기 화학식의 화합물에 관한 것이다.
Figure 112009073096479-pct00001
식 중,
X는 불소 또는 염소이고;
Y는 산소, 황, 또는 이미노 기이고;
R은 아미노, 히드록실, 술폰아미드 또는 카르복스아미드 기, 또는 그의 N-모노메틸 또는 N-디메틸 유사체이고;
m은 2 내지 6의 정수이고;
n은 0 내지 2의 정수이다.
상기 화합물은 특정 암 및 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
암은 100종이 넘는 임상적으로 구별되는 형태의 질환을 나타낸다. 신체의 거의 모든 조직에서 암이 발생할 수 있고, 일부는 심지어 여러 유형의 암에 걸릴 수 있다. 암은, 기원 조직을 침범하거나 다른 부위로 확산될 수 있는 세포의 비정상적 성장을 특징으로 한다. 실제로, 특정 암의 심각성 또는 그의 악성도는 인접 조직을 침범하고 확산하는 암 세포의 성향에 기반한다. 즉, 다양한 인간 암 (예를 들어, 암종)은 원발성 부위 또는 종양으로부터 확산하는 능력, 및 신체 전반에 걸쳐 전이하는 능력에 따라 분명하게 달라진다. 실제로, 이는 암 환자의 장기간 생존에 불리한 종양 전이의 과정이다. 외과의는 원발성 종양을 제거할 수는 있지만, 전이된 암은 종종 너무 많은 장소에 도달해 외과적 치료가 불가능하게 만든다. 성공적으로 전이하기 위해, 암 세포는 그의 기원 위치로부터 분리되고, 혈관 또는 림프관으로 침범하여, 새로운 부위로 순환 이동하여, 그곳의 종양을 형성하여야만 한다.
12종의 주요 암은 전립선암, 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 비-호지킨(Hodgkin) 림프종, 자궁암, 흑색종, 신장암, 백혈병, 난소암 및 췌장암이다. 흑색종은 주요 암이고, 림프절, 폐, 간, 뇌 및 골을 포함하는 신체내 대부분의 기관에 전이되는 능력으로 인해 떠오르는 전세계적인 보건 과제이다. 원격 부위로의 전이를 수반하는 환자에 대한 임상 결과는 국부 림프절 전이에서 보여진 것보다 유의적으로 좋지 않았다. 폐 전이를 수반하는 환자에 대한 중간 생존 시간은 11개월이었고, 반면 간, 뇌 및 골 전이를 수반한 환자에 대해서는 4개월이었다. 다음 4가지 유형의 치료가 원격 흑색종 전이에 대해 사용되어 왔다: 수술, 방사선요법, 화학요법 및 면역요법. 수술은 환자의 삶의 질을 향상시키기 위해 가장 흔하게 사용되었고, 위장관을 폐색시키는 전이를 제거하는 것 등이 있다. 방사선요법은 전이의 국소적 조절에 있어 어느 정도의 효능을 갖지만, 피부 및/또는 림프절 전이에 주로 제한된다. 수많은 화학요법제가 전이성 흑색종의 치료를 위해 평가되어 왔다. 그러나, 오직 2가지 세포독성 약물이 10％ 이상의 반응률을 달성할 수 있었다. 이들 약물은 데카르바진 (DTIC) 및 니트로소우레아이다. 오직 DTIC 만이 대부분의 국가에서 흑색종의 치료에 승인되었다. 후속적으로, 전이성 흑색종의 치료를 위한 수술, 방사선요법 및 화학요법의 임상적으로 유의적인, 유익한, 장기간 효과의 결핍으로 인해 면역요법의 사용이 생겨났다. 이제까지, 대부분의 관심이 사이토킨인 인터류킨-2 및 인터페론-α에 주어졌다. 임상 시험은 인터류킨-2를 사용한 결과가 보다 양호하게 얻어졌으나, 평균적으로 전이성 흑색종을 갖는 환자의 15％만이 인터류킨-2에 대한 반응에 있어서 종양 양의 유의적인 감소를 나타내었다.
흑색종과 유사하게, 여타 암도 일단 전이가 일어나면 심각하게 삶을 위협하게 된다. 췌장암은 전이 (예를 들어, 첫번째 진단)가 일어난 후 1년을 넘게 생존할 기회는 3％이다. 이는 세포독성 약물인 겜시타빈으로 치료시 18％, 그리고 겜시타빈, 타르세바 및 EGFr 키나제 억제제로 치료시 24％로 증가될 뿐이다. 전립선 암은 암이 전립선에 한정되어 있는 한 수술 또는 방사선에 의해 성공적으로 제어될 수 있다. 그러나, 특히 안드로겐-제한 요법이 실패한 경우, 일단 전이가 일어나면 이용가능한 치료는 거의 효과가 없다.
여타 암은 흑색종, 췌장암 또는 전립선암에 비해 화학요법제를 사용하여 보다 효과적으로 치료될 수 있다. 그러나, 화학요법제는 2가지 주요 제한을 받는다. 첫번째는, 화학요법제는 암 세포에 특이적이지 않고, 특히 고용량에서는, 정상적으로 빠르게 분할하는 세포에도 독성이 있다는 것이다. 두번째는, 머지 않아 암 세포에 화학요법제에 대한 내성이 발달하여, 환자에 대해 더이상의 이점을 제공해주지 못한다는 것이다. 흑색종에 대해 언급한 바와 같이, 여타 치료 기법이 화학요법제의 사용으로 인한 제한들을 대처하기 위해 조사되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 이들 추가적인 치료는 여타 암의 치료에 대해 제한적인 성공만을 보여왔다. 추가적인 암 치료 및 그들의 제한에 대한 예에는 수술 (광범위한 전이를 완전히 제거하는 것이 불가능), 방사선요법 (암 세포로 방사선을 선택적으로 전달하는 것이 불가능) 및 면역요법 (제한된 효능을 갖는 독성 사이토킨의 사용)이 포함된다. 이러한 이유로 인해, 여타 보다 신규한 치료적 접근법들이 조사중에 있으나 (예를 들어, 항맥관형성 제제, 아팝토시스 제제, 유전자 요법), 이들 치료는 상대적으로 초기 수준이다. 이에 따라, 효능있거나 (예를 들어, 종양 크기 또는 전이의 확산의 감소), 암 치료에 대해 제한된 독성을 갖거나, 약물 내성이 발달하는 시간을 연장시키거나, 또는 이들의 임의의 조합 특성을 갖는 신규한 화학요법제로 예시되는 신규한 접근법의 요구가 여전히 존재한다.
<발명의 개요>
한 실시양태에서, 화합물, 상기 화합물을 함유하는 조성물, 및 의약의 제조 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 이들은 적어도 일부 암의 치료에 대해 감소된 독성을 갖는 유용한 작용 메카니즘을 통해 작용할 수 있다. 이들은 암 치료에 단독으로 사용될 수 있지만, 보다 효능적인 치료는 여타 항암 약물 또는 요법과 함께 화합물을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 화학요법제와 함께 화합물을 사용하는 것은, 화학요법의 사용으로 인한 상기 언급된 제한 (약물 독성 및 약물 내성)에 대처하기 위한 잠재적인 방법을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 화합물은 세포독성 및 동물 데이터에 의해 입증된 바와 같이 여타 화학요법제보다 상대적으로 덜 독성일 수 있고, 특히 화학요법제의 용량이 본 발명의 화합물과 함께 사용되어 보다 낮아질 수 있는 경우, 그들의 다양한 작용 메카니즘은 화학요법 약물 내성을 저하시킬 것이다. 상기 화합물은 암 치료용 의약의 제조에 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이들은 적어도 일부의 자가면역 질환의 치료에 대해 감소된 독성을 갖는 유용한 작용 메카니즘을 통해 작용할 수 있다. 이들은 자가면역 질환을 치료하는데 단독으로 사용될 수 있지만, 보다 효능적인 치료는 여타 항염증성 약물 또는 요법과 함께 화합물을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 상기 화합물은 자가면역 질환 치료용 의약의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면들은 하기 설명 및 특허청구범위 및 그의 일반화로부터 당업자에게 명백할 것이다.
도 1은 다양한 기질: (A) 라미닌, (B) 마트리겔(MATRIGEL™) 기저막 매트릭스 또는 (C) 콜라겐 상의 PC-3 세포 부착에 대한 화합물 V의 효과를 나타낸다.
도 2는 다양한 화합물의 B16F10 원발성 흑색종에 대한 항종양 효과를 나타낸다. 화합물 I, 화합물 II 또는 독소루비신의 효과를 도 2A에 비교하였다. 화합물 V 또는 사이톡산(cytoxan)의 효과를 도 2B에 비교하였다.
도 3은 DA-3 유방 종양에 대한 화합물 II, 화합물 IV, 화합물 V 또는 시클로포스파미드의 정맥내 투여의 항종양 효과를 나타낸다.
도 4는 DA-3 유방 종양에 대한 화합물들의 조합물의 정맥내 투여의 항종양 효과를 나타낸다. 화합물 II, 시클로포스파미드, 및 시클로포스파미드 + 화합물 II의 효과를 도 4A에 비교하였다. 화합물 I, 시클로포스파미드, 및 시클로포스파미드 + 화합물 I의 효과를 도 4B에 비교하였다. 화합물 V, 시클로포스파미드, 및 시클로포스파미드 + 화합물 V의 효과를 도 4C에 비교하였다.
도 5는 DA-3 유방 종양에 대한 화합물 VII 및 시스플라틴의 조합물과 비교한 시스플라틴 단독의 경구 투여의 항종양 효능을 나타낸다.
도 6은 P815 비만세포종에 대한 화합물 I, 화합물 II, 화합물 V 또는 아세틸살리실산의 항종양 효능을 나타낸다.
도 7은 LL/2 폐 종양에 대한 화합물 II의 항종양 효능을 나타낸다. 화합물 II 및 시스플라틴의 효과를 도 7A에 비교하였다. 화합물 II 단독, 시클로포스파미드 단독, 및 시클로포스파미드 + 화합물 II의 조합물의 효과를 도 7B에 비교하였 다.
도 8은 LL/2 폐 종양에 대한 화합물 II, 화합물 III, 화합물 VII 또는 시클로포스파미드의 항종양 효능을 나타낸다.
도 9는 PAN02 췌장 종양에 대한 화합물 I, 화합물 V 또는 겜시타빈의 항종양 효능을 나타낸다.
도 10은 PC-3 전립선 종양에 대한 화합물의 항종양 효능을 나타낸다: 화합물 II 단독 (도 10A), 시클로포스파미드 + 화합물 II의 조합물 (도 10B), 및 화합물 V와 시클로포스파미드 + 화합물 V의 조합물의 비교 (도 10C).
도 11은 J774A.1 세포로부터의 LPS 유도에 의해 방출된 PGE2의 억제에 대한 화합물 V의 효과를 나타낸다.
도 12는 NZB x NZW 마우스의 사망율에 대한 화합물 I의 효과를 나타낸다.
도 13은 지연형 과민증 (DTH)의 발달에 대한 화합물 I의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다: 1차 투여 (도 13A) 및 2차 투여 (도 13B).
도 14는 지연형 과민증 (DTH)의 발달에 대한 화합물 II의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다: 1차 투여 (도 14A) 및 2차 투여 (도 14B).
도 15는 DTH 후의 귀 두께에 의해 측정된 바와 같은 염증에 대한 화합물 IV 또는 화합물 V의 경구 투여의 효과를 나타낸다.
도 16은 지연형 과민증 (DTH)의 발달에 대한 화합물 III의 경구 투여의 효과를 나타낸다: 1차 투여 (도 16A) 및 2차 투여 (도 16B).
도 17은 DTH 후의 귀 두께에 의해 측정된 바와 같은 염증에 대한 화합물 X 또는 화합물 XI의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다.
도 18은 아쥬반트(adjuvant)-유도성 관절염 (AIA)에 대한 화합물 I, 화합물 IV 또는 화합물 V의 경구 투여의 효과를 나타낸다. 도 19는 지질다당류 (LPS)에 의해 유도된 백혈구 개수에 대한 화합물 II 또는 화합물 V의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다.
도 20은 지질다당류 (LPS)에 의한 유도 2시간 후의 에어-파우치(air-pouch) 래트 모델에서의 다양한 가용성 매개자의 생성에 대한 화합물 II 또는 화합물 V의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다: TNFα (도 20A), PGE2 (도 20B), LTB4 (도 20C) 또는 MCP-1 (도 20D).
도 21은 지질다당류 (LPS)에 의한 유도 12시간 후의 에어-파우치 래트 모델에서의 다양한 가용성 매개자의 생성에 대한 화합물 II 또는 화합물 V의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다: TNFα (도 21A) 또는 PGE2 (도 21B).
도 22는 화합물 V에 의한 원위부 결장 육안 손상의 억제를 나타낸다.
도 23은 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)의 임상적 징후에 대한 화합물 V의 효과를 나타낸다.
<발명의 특정 실시양태들의 설명>
본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 유도체는 하기 화학식으로 기재한다.
Figure 112009073096479-pct00002
식 중,
X는 F 또는 Cl이고;
Y는 NH, O 또는 S이고;
R은 NH2, OH, SO2NH2, SO2N(CH3)H, SO2N(CH3)2 또는 CONH2이고;
m은 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
n은 O, 1 또는 2이고, n = 2인 경우에 2개의 탄소 단편은
Figure 112013031367255-pct00003
(Z = H 또는 OH)로 나타낼 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 적용할 수 있다:
X = F; 및/또는
Y = NH 또는 O; 및/또는
R = NH2, OH, SO2NH2 또는 SO2N(CH3)2; 및/또는
m = 4, 5 또는 6; 및/또는
n = 2.
특히 바람직한 것은 하기 구조를 갖는 화합물 I 내지 XII이다.
Figure 112009073096479-pct00004
일부 화합물이 상기 일반 화학식으로 기재되어 있지만, 화학식 외에 놓여있으나 그럼에도 불구하고 명백한 특정 구조적 변형이 본 발명의 범주 내에 있다는 것을 당업자들은 알 것이다. 예를 들어, 페닐 고리 상의 할로겐 치환을 함유하지 않는 상기 화학식으로 기재된 화합물을 합성하는 것이 가능하다. 그러한 화합물들이 제조되지만, 이들은 모노클로로- 또는 플루오로페닐-치환된 트리아진 화합물보다 일반적으로 보다 독성인 것이 관찰된다. 유사하게, 디할로페닐 치환된 트리아진 화합물은 본 발명의 범주 내에 있다. 추가적으로, 상기 일반 화학식이 파라-치환된 (아미노, 히드록실, 술폰아미드 등) 페네틸 화합물을 기재하고 있지만, 상기 치환체는 페네틸 잔기의 벤젠 고리 부분의 오르토- 또는 메타-위치에서도 또한 생성될 수 있다. 마지막으로, 치환된 페네틸 잔기의 에틸렌 부분은 불포화 에틸렌 단편 또는 벤젠 고리를 갖는 융합 시클릭 (5 또는 6원 고리) 구조에 의해 대체되어, 페네틸 잔기 또는 보다 경질화된(rigidified) 대체물보다 낮은 자유도를 갖는 구조가 도입될 수 있다.
암의 치료를 위한 한가지 신규한 접근법은, 종양 크기 및/또는 전이의 확산을 감소시키는데 효능이 있고, 또한 염증을 감소시킬 수 있는 신규 화합물을 발견하는데 있다. 본 발명의 화합물은 암의 치료에 유용한 신규 부류의 화합물에 대한 이러한 요건을 만족시킬 수 있다. 즉, 유의적인 항암 및 항염증성 특성을 동시에 나타내는 화합물은, 염증 조직에 존재하는 유전적으로 불안정한 종양 세포 (높은 돌연변이율 및 화학요법에 대한 후속적 내성) 및 유전적으로 정상인 세포 모두를 표적으로 하는 잠재적인 두갈래의 접근법을 제공한다.
암의 치료를 위한 이러한 두갈래의 접근법은 만성 염증과 암의 후속적 발달 간의 연결점이 존재한다는 지각이 증가하면서 보다 강력해진다. 이러한 만성 염증은, 또한, 종종 지속적이고 생명을 위협하지는 않는 (당시에) 바이러스성 또는 박테리아성 감염의 결과이다. 실제로, 수많은 특정 암의 병인은 특정 병원체와 직접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 인간 유두종 바이러스, B형 또는 C형 간염 바이러스, 및 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스는 각각 자궁경부암, 간세포 암종, 및 림프세포증식성 장애에 대한 위험 인자이다. 에이치. 파일로리(H. pylori)는 위암에 대한 주요 기여자 중 하나이다. 보다 최근에, 치주 (잇몸) 질환, 입 안의 많은 수의 박테리아의 존재와 연관된 만성 염증성 증상이 췌장암을 발달시키는 유의하게 높은 위험과 연결되어 있다는 것이 밝혀졌다.
암과 염증 간의 연결점은 분자 수준에서 그의 근원을 갖는 것으로 보인다. 염증, 또는 전구염증성 면역 반응과 연관된 분자는 암의 진행과 연결되어 있다. 예를 들어, 종양 괴사 인자 (TNFα)는 가장 중요한 전구염증성 사이토킨으로 간주될 수 있는데, 왜냐하면 이는 여타 전구염증성 사이토킨 (예를 들어, IL-I, IL-6, IL-8 및 GM-CSF)의 생성을 조절하기 때문이다. 흥미롭게도, 종양-함유 동물에 투여된 고용량의 TNFα가 항암 활성을 나타낸다. 그러나, 이는 재조합 TNFα를 사용한 I 상 임상 시험에 의해 입증된 바와 같이, 인간에서의 유의적인 항암 활성으로 해석되지 않는다. 보다 중요하게는, TNFα는 다양한 인간 종양에서 발현하고, 그의 존재는 일반적으로 불량한 예후와 관련된다. 실제로, 종양 미세환경(microenvironment)에서 만성적으로 생성된 상대적으로 낮은 농도의 내재성 TNFα가 종양 발달 및 확산을 증진시키는 것으로 보인다. 즉, TNFα의 항암 활성은 단지 이러한 사이토킨의 보다 높은 생리학적 농도에서만 관찰된다. 암과 염증 간의 연결점을 제공하는 것으로 최근에 가정된 또다른 분자, 또는 단백질 분자 세트는 전사 인자 NFκB이다. DNA 결합 단백질 군인 NFκB는 포유동물 세포에서 가장 강력한 전사 활성화제일 수 있다. 이 전사 인자는 여러 전구염증성 사이토킨 (TNFα 포함) 및 케모킨을 포함하는 수많은 단백질의 생합성을 활성화시킨다. TNFα에 대해 상기 언급한 바와 같이, 수많은 암은 상승된 NFκB 활성을 갖는다. 수많은 마우스 모델에서의 작업은, NFκB의 지속적 활성화가 염증과 종양 촉진 및 진행을 연결시킬 수 있게 하는 메카니즘을 명백히 하였다. 이 작업은 최근에 Karin 및 Greten에 의해 검토되었다 (문헌 [Nature Immunology, 5:749-759, 2005]). 치료될 수 있는 자가면역 질환의 예에는 관절염 (예를 들어, 류마티스성 또는 건선 관절염), 건선, 크론(Crohn) 질환, 염증성 장 질환, 강직성 척추염, 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 스틸(Still) 질환 (대식세포 활성화 증후군), 다발성 경화증, 포도막염, 경피증, 근육염, 라이터(Reiter) 증후군, 베게너(Wegener) 증후군, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 면역 혈소판감소성 자색반 (ITP), 사구체신염 및 맥관염이 포함된다.
암과 염증 간의 상기 기재된 하나 이상의 분자적 연결점에 대처하기 위한 본 발명의 화합물의 능력에 대한 한가지 표지인 TNFα를 실시예 21 및 22에 나타내었다. 이들 실시예에서, 세포 기반 분석 (WEHI-13VAR 및 J774A.1 세포)에서 본 발명의 화합물이 TNFα의 전구염증성 활성을 길항 작용시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 즉, 이들 화합물은, WEHI-13VAR 세포주에서 TNFα-유도성 아팝토시스 또는 세포독성을 억제하고, J774A.1 세포주에서 TNFα의 LPS-유도성 생성을 억제하는 능력에 의해 확인된 바와 같이, TNFα의 효과를 억제할 수 있다.
암과 염증 간의 상기 기재된 다른 분자적 연결점에 대처하기 위한 본 발명의 화합물의 능력에 대한 또다른 표지인 아라키돈산 대사물질을 실시예 28에 나타내었다. 이 실시예에서, LPS-유도성, 에어-파우치 모델에서 본 발명의 화합물이 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 및 류코트리엔 B4 (LTB4) 생성의 억제를 유도한다는 것이 밝혀졌다. 이들의 전구염증성 특성과 더불어, 에이코사노이드 경로가 전립선암, 유방암 및 결장암에서 활성화된다는 것도 잘 증명되었다. 시클로옥시게나제 (COX; 프로스타글란딘) 및 리폭시게나제 (LOX; 류코트리엔) 대사물질은 세포 증식, 운동, 침입, 및 맥관형성의 촉진을 통해 질환의 진행에 기여한다. 즉, 이들 화합물은 에어-파우치 모델에서 LPS-유도성 염증을 억제하는 능력에 의해 확인된 바와 같이, PGE2 및 LTB4의 생성에 대한 억제 효과에 의해 암 및 염증성 질환을 억제할 수 있다.
본 발명의 화합물은 그의 모든 제약상 허용되는 유도체, 예컨대 그의 염 및 전구약물 형태, 및 유사체, 및 임의의 기하 이성질체 또는 거울상이성질체를 포함한다. 활성 화합물의 제형은 소화관내, 점막 (예를 들어, 설하, 폐 및 직장내), 비경구 (예를 들어, 근육내, 동맥내, 피부내, 피하 및 정맥내), 또는 국소 (예를 들어, 연고, 크림 및 로션) 투여에 적합한 형태의 제약 조성물을 제공하도록 제조될 수 있다. 특히, 본 발명의 화합물은 알콜 또는 폴리올 용매 (예를 들어, 12-히드록시스테아르산의 솔루톨(SOLUTOL®) HS 15 폴리옥시에틸렌 에스테르 (바스프(BASF)), 글리세롤, 에탄올 등), 모노- 또는 디사카라이드의 수용액, 또는 임의의 여타 생체적합성 용매, 예컨대 디메틸 술폭시드 (DMSO) 또는 크레모포어 이엘(CREMOPHOR EL®) 폴리에톡실화 피마자 오일 (바스프) 중에 가용화될 수 있다. 제형은 적절한 경우, 개별 단위 투여형으로 편리하게 존재할 수 있고, 제약 제형 분야에 잘 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 모든 방법들은 활성 제약 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 필요시 둘 모두와 함께 합하는 단계를 포함한다. 적절한 경우, 상기 기재된 제형들은 활성 제약 성분의 지속 방출을 제공하도록 적합화될 수 있다. 당업계에 잘 공지된 지속 방출 제형은 볼루스(bolus) 주사, 연속 주사, 생체적합성 폴리머, 또는 리포좀의 사용을 포함한다.
투여량 및 투여 시기, 제형 및 투여 경로의 적합한 선택이, 포유동물에서 바람직한 반응을 달성하고 (즉, 효능), 과도한 독성 또는 그에 따른 여타 해로움을 회피하는 (즉, 안전성) 목표로 인해 달성될 수 있다. 이에 따라, "효과적인"은 하기의 원하는 효과를 달성하기 위한 조건의 일반적 조작을 수반하는 선택을 나타낸다: 예를 들어, 암 또는 자가면역 질환을 갖는 환자의 이환율 또는 사망율 감소; 암 세포 성장 또는 전이의 감소; 세포 주기 또는 아팝토시스의 변경; 신체 구성요소 (기관 및 조직, 예컨대 부신, 눈, 신장, 간, 폐, 췌장, 신경계, 피부, 윤활 관절, 갑상선 등)에 대한 면역 반응과 연관된 조직 손상을 감소시키거나 달리 완화시키는 것; 면역학적 상태의 회복 또는 포유동물의 병리학적 장애/증상의 정상화 (항체 타이터, 면역 세포 하위군, 사이토킨 또는 케모킨에 의한 신호전달, 항체-항원 면역 복합체 등); 순환으로부터 유리 항체 및/또는 항체-항원 면역 복합체의 제거; 자가면역 질환의 실험적 표지 (염증의 가용성 매개자의 농도 또는 절대량, 자가항체의 존재, 세포 증식 등)의 개선; 통상적인 화학요법 또는 항염증성 약물 요법의 효능 증가; 및 이들의 조합. 특히, 통상적인 화학요법 또는 항-TNFα 치료의 유해 효과가 회피될 수 있다. 포유동물은 동물 또는 인간 환자일 수 있다.
투여되는 화합물의 양은, 예를 들어 화합물의 생체활성 및 생체이용률 (예를 들어, 체내 반감기, 안정성 및 대사성); 화합물의 화학적 특성 (예를 들어, 분자량, 소수성 및 가용성); 투여 경로 및 스케줄 등과 같은 인자들에 따라 달라진다. 또한, 임의의 특정 환자에 대해 달성되는 특정 용량 수준도 연령, 건강상태, 의학적 병력, 체중, 하나 이상의 여타 화합물과의 조합, 및 질환의 중증도를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
용어 "치료"는 특히 암 또는 자가면역 질환의 하나 이상의 증후를 감소시키거나 완화시키는 것을 나타낸다. 주어진 환자에 대해, 증후, 그의 악화, 퇴행 또는 진행의 개선은 객관적 또는 주관적 척도에 의해 결정될 수 있다.
마지막으로, 본원에서 치료에 대한 언급은 확립된 암 또는 자가면역 질환의 예방 및 요법까지 확대된다는 것을 당업자는 알 것이다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 화합물은 원발성 종양의 수술적 제거 후, 또는 수술 또는 공격적 화학요법 전, 또는 심지어 환자가 완화 중에 있을 때도 사용될 수 있다. 표준 암 요법과 비교시 생체내 마우스 연구에서 관찰되는 화합물 독성의 상대적 결핍 (예를 들어, 첨부된 실시예에서 관찰되는 바와 같이)은, 통상적인 요법으로 권장되는 것보다 바람직한 예방적 사용을 제공한다. 유사하게, 본 발명의 화합물은, 암 또는 자가면역 질환의 치료에 대한 여타 존재하는 방식 또는 암의 치료를 위해 사용되는 제제 (예를 들어, 세포독성 약물, 맥관형성 억제제, 면역자극제, 단백질 키나제 억제제) 또는 자가면역 질환의 치료를 위해 사용되는 제제 (예를 들어, 항-염증성 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 항염증성 약물, 메토트렉세이트, DMARD, 생물학적 물질, 예컨대 재조합 단백질 또는 모노클로날 항체)와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 화합물과 사용될 수 있는 화학요법제의 예로는 데카르바진, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 토포테칸, 이리노테칸, 탁소테르, 탁솔, 5-플루오로우라실, 겜시타빈, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴 및 클로람부실이 포함된다. 본 발명의 하나 이상의 화합물과 사용될 수 있는 치료제의 예로는, 그의 수용체에의 TNFα의 결합 또는 후속적 신호 전달을 차단하는 것들 (예를 들어, TNFα에 특이적으로 결합하는 제조합 단백질, 항-TNFα 항체, 가용성 TNFα 수용체, 1000 MW 미만인 비-단백질성 화합물)이 포함된다. 투여되는 화합물의 용량은 종양학자, 류머티즘학자 또는 여타 내과의의 판단에 최종적으로 달려있다. 그러나, 일반적으로 용량은 1일 당 약 1 내지 약 75 mg/kg의 범위일 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 범위는 1일 당 약 2 내지 약 50 mg/kg일 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 실시를 추가로 예시하지만, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
본 발명에 유용한 화합물의 제조에 대한 일반적인 합성 순서를 경로 1 또는 경로 2로 나타내었다 (반응식 1). 경로 1은 시아누르산 클로라이드를 할로아닐린과 반응시켜 디클로로-트리아진 중간체를 생성하는 것을 나타낸다. 이어서, 아릴 또는 아랄킬아민을 첨가한 후에, 알킬아민을 첨가한다. 경로 2는 먼저 알킬아민과 반응시킨 후에, 이어서 아릴 또는 아랄킬아민을 첨가하여, 경로 1에서와 같은 디클로로-트리아진 중간체의 제조를 설명한다. 마지막 단계는 보호기를 제거하는 것이다.
Figure 112009073096479-pct00005
시약: (a) 할로아닐린, 아세톤/물, -1O℃ → r.t.; (b) 알킬디아민 또는 알칸올아민 또는 티오알킬아민, NaHCO3/H2O/THF/아세톤, r.t.; (c)
Figure 112009073096479-pct00006
, NaHCO3, 아세톤/H2O; (d) 알킬디아민 또는 알칸올아민 또는 티오알킬아민, THF/MeOH, 130℃/10분, 마이크로웨이브; (e)
Figure 112009073096479-pct00007
, Et3N, THF, 65℃; (f) (적용가능한 경우) 보호기의 제거.
기구
모든 HPLC 크로마토그램 및 질량 스펙트럼을 다이오드 어레이 검출기를 사용 하여 HP 1100 LC-MS 아질런트(Agilent) 기구 상에서 기록하였다. 1％에서 40％로의 아세토니트릴-물 (0.01％ TFA 함유) 구배 (6분 및 2 ml/분의 유속)를 갖는 분석용 C18 컬럼 (75 x 4.6 mm, 5 ㎛) (방법 1), 15에서 99％로의 아세토니트릴-물 (0.01％ TFA 함유) 구배 (6분 및 2 ml/분의 유속)를 갖는 분석용 C18 컬럼 (75 x 4.6 mm, 5 ㎛) (방법 2), 0.1％에서 20％로의 아세토니트릴-물 (0.01％ TFA 함유) 구배 (5분 및 1 ml/분의 유속)를 갖는 분석용 C18 컬럼 (75 x 4.6 mm, 5 ㎛) (방법 3), 또는 1％에서 50％로의 아세토니트릴-물 (0.01％ TFA 함유) 구배 (5분 및 1 ml/분의 유속)를 갖는 분석용 C18 컬럼 (75 x 4.6 mm, 5 ㎛) (방법 4)을 사용하였다.
실시예 1: 화합물 I의 합성 (경로 1의 대표적 실시예).
Figure 112009073096479-pct00008
시아누르산 클로라이드 (10.0 g, 54.2 mmol)를 물 (50 ml) 및 아세톤 (50 ml)의 냉각된 (-10℃) 혼합물에 조금씩 첨가하였다. 아세톤 (50 ml) 중 3-플루오로아닐린 (5.2 ml, 54.2 mmol)의 용액을 -5℃ 미만으로 반응 온도를 유지하면서 50분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 이어서, 반응물을 1시간 동안 상온에서 교반하였 다. 반응물의 pH를 포화 수성 나트륨 비카르보네이트 (200 ml)를 사용하여 2 내지 8로 조정하고, 추가 30분 동안 교반을 계속하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 진공에서 건조시켰다. 이로서 2,4-디클로로-3-플루오로페닐아미노-1,3,5-트리아진을 백색 고체로서 수득하였다: 13.3 g, 94％ 수율;
Figure 112009073096479-pct00009
생성물을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 이 디클로로-트리아진 유도체 (6.4 g, 24.7 mmol)를 실온에서 THF (70 ml) 중에 용해시키고, 아세톤 (50 ml) 및 물 (50 ml)의 혼합물 중 5-(tert-부톡시카르보닐아미노)펜틸아민 (7.5 g, 37.0 mmol)의 용액으로 처리하였다. 이어서, 생성된 용액을 포화 수성 나트륨 비카르보네이트 (70 ml)로 처리하였다. 반응물을 2.5시간 내지 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 혼합물을 진공에서 농축시키고, 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 포화 수성 나트륨 클로라이드, 2 M 수성 HCl, 포화 나트륨 클로라이드, 포화 나트륨 비카르보네이트, 및 포화 나트륨 클로라이드로 세척한 후에, 건조시키고 (마그네슘 술페이트-목탄), 셀라이트(CELITE) 규조토를 통해 여과시키고, 진공에서 200 ml로 농축시켰다. 이 용액을 교반하면서 헥산 1.2 L에 붓고, 침전물을 여과에 의해 수집하고, 헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 모노클로로-[1,3,5]트리아진 유도체를 백색 고체로서 수득하였다: 6.6 g, 63％ 수율;
Figure 112009073096479-pct00010
THF (300 ml) 중 모노클로로-트리아진 (6.6 g, 15.6 mmol)의 용액을 티라민 (6.4 g, 46.7 mmol) 및 트리에틸아민 (77.7 mmol, 10.9 ml)으로 처리하였다. 반응물을 16시간 내지 60시간 동안 65 내지 70℃에서 가열한 후에, 상온으로 냉각시키고, 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 여과시켰다. 여액을 1 M 수성 HCl, 포화 나트륨 클로라이드, 포화 수성 나트륨 비카르보네이트, 및 포화 나트륨 클로라이드로 세척한 후에, 건조시키고 (마그네슘 술페이트-목탄), 셀라이트 규조토를 통해 여과시키고, 진공에서 농축시켰다. 이어서, 잔류물을 에테르 (150 ml) 중에 용해시키고, 이 용액을 강력하게 교반하면서 헥산 1.4 L에 적가하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공에서 건조시켜 트리(아미노-치환된)-[1,3,5]트리아진 유도체를 회백색 고체로서 수득하였다: 6.5 g, 80％ 수율;
Figure 112009073096479-pct00011
4 M HCl/1,4-디옥산 (100 ml) 및 물 (10 ml) 중 Boc-보호된 화합물 (6.5 g, 12.4 mmol)의 용액을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매 및 과량의 산을 진공 에서 증발시키고, 미량의 물을 이소프로판올 (25 ml)을 사용하여 공동-증발 (x 2)에 의해 제거하였다. 건조된 잔류물을 이소프로판올 (25 ml) 중에 용해시키고, 용액을 강력하게 교반하면서 에테르 (450 ml)에 적가하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공에서 건조시킨 후에, 무-발열원 물 (800 ml) 중에 용해시키고, 여과시키고 (0.22 μm), 동결건조시켜 탈보호된 화합물 I을 회백색 고체로서 수득하였다: 5.5 g, 89％ 수율;
Figure 112009073096479-pct00012
실시예 2: 화합물 V의 합성 (경로 2의 대표적 실시예).
Figure 112009073096479-pct00013
2,4-디클로로-4-플루오로페닐아미노-1,3,5-트리아진을 3-플루오로아닐린을 대체한 4-플루오로아닐린 (18 ml, 190 mmol)을 사용하여 실시예 1에 따라 제조하여 백색 고체를 수득하였다: 44.3 g, 90％ 수율;
Figure 112009073096479-pct00014
디클로로-트리아진 (44.2 g, 0.2 mol)을 5-{tert-부톡시카르보닐아미노)펜틸아민을 대체한 티라민을 사용하여 실시예 1에 따라 티라민 (35.1 g, 0.3 mol)과 커플링시켜 백색 고체를 수득하였다: 56.1 g, 91％ 수율; LRMS (ESI): m/z 360 (MH+), 382 (MH+Na); HPLC (방법 2): 3.7분. 테트라히드로푸란 (125 ml) 및 메탄올 (60 ml) 중 모노클로로트리아진 (15.0 g, 41.8 mmol) 및 1,5-디아미노펜탄 (24.5 ml, 209 mmol)의 용액을 아홉 부분으로 분할하였다. 각 부분을 10분 동안 130℃에서 화학 마이크로웨이브 장치 중에서 가열하였다. 이어서, 부분들을 다시 합하고, 진공에서 농축시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시켰다. 에틸 아세테이트 용액을 물 및 포화 나트륨 클로라이드로 세척한 후에, 2 M 수성 HCl로 추출하였다. 수성 추출물을 에틸 아세테이트로 세척한 후에, 포화 수성 나트륨 비카르보네이트로 염기성화시켰다. 침전물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 추출물을 포화 나트륨 클로라이드로 세척한 후에, 건조시키고 (마그네슘 술페이트-목탄), 셀라이트 규조토를 통해 여과시키고, 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 메탄올 (300 ml) 중에 용해시키고, 용액을 에테르 (60 ml) 중 HCl 1 M 용액으로 처리하고, 용액을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 고온의 이소프로판올 (150 ml) 중에 용해시키고, 이 용액을 강력하게 교반하면서 에테르 (1.5 L)에 적가하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공에서 건조시킨 후에, 무-발열원 물 (1.6 L) 중에 용해시키고, 여과시키고 (0.22 μm), 동결건조시켜 화합물 V를 그의 히드로클로라이드 염으로 수득하였다: 14.9 g, 72％ 수율; mp 130 내지 133℃;
Figure 112009073096479-pct00015
실시예 3 : 화합물 II
상기 화합물을 티라민 대신에 4-[2-아미노에틸]벤젠-술폰아미드를 사용하여 실시예 1에 따라 제조하였다. 백색 고체, 77％ 수율; mp 145 내지 147℃;
Figure 112009073096479-pct00016
실시예 4: 화합물 III
상기 화합물을 티라민 대신에 N,N-디메틸-4-[2-아미노에틸]벤젠술폰아미드를 사용하여 실시예 2에 따라 제조하였다. N,N-디메틸-4-(2-아미노에틸)벤젠-술폰아미드는 하기와 같이 합성하였다: 무수 DMF (120 ml) 중 4-[2-아미노에틸]벤젠-술폰아미드 (26.5 g, 0.1 mol)의 용액을 프탈산 무수물 (23.5 g, 0.2 mol)로 처리하고, 반응물을 4시간 동안 70℃에서 가열하였다. 반응물을 상온으로 냉각시키고, 1,1'-카르보닐디이미다졸 (21.5 g, 0.1 mol)을 조금씩 첨가하고, 반응물을 밤새 상온에서 교반하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔류물을 물로 세척하고, 건조시키고, 에틸 아세테이트로 분쇄하여 프탈로일-보호된 화합물을 백색 고체로서 수득하였다: 38.1 g, 89％ 수율;
Figure 112009073096479-pct00017
0℃에서 N2 하에 무수 DMF (120 ml) 중 프탈로일-보호된 화합물 (12.7 g, 38.6 mmol)의 용액을 NaH (오일 중 60％ 분산액; 3.5 g, 88.8 mmol)를 사용하여 조금씩 15분에 걸쳐 처리하고, 반응물을 1시간 동안 0℃에서 N2 하에 교반하였다. 이어서, 요오도메탄 (4.8 ml, 77.2 mmol)을 15분에 걸쳐 적가하고, 반응물을 밤새 0℃ 내지 실온에서 N2 하에 교반하였다. 생성된 황색 현탁액을 얼음/물 (1.4 L) 상에 붓고, 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 후속적으로 물, 헥산 및 에테르로 세척한 후에, 진공에서 건조시켜 N,N-디메틸-벤젠술폰아미드 유도체를 백색 고체로서 수득하였다: 11.3 g, 81％ 수율; LRMS (ESI): m/z 359(MH+), 381 (MH+Na); HPLC (방법 2): 3.7분. 95％ 에탄올 (125 ml) 중 프탈로일-보호된 화합물 (11.3 g, 31.5 mmol) 및 히드라진 수화물 (4.6 ml, 44.6 mmol)의 용액을 2시간 동안 환류 온도에서 가열하였다. 형성된 백색 고체를 여과에 의해 제거하고, 에탄올로 세척하였다. 합한 여액 및 세척액을 진공에서 농축시키고, 형성된 고체를 여과에 의해 제거하고, 에탄올로 세척하였다. 이 절차를 3회 반복하고, 최종 여액을 진공에서 증발 건조시켰다. 고체를 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 진공에서 농축시켜 유리 아민을 황색 오일로서 수득하였다: 4.8 g, 67％ 수율;
Figure 112009073096479-pct00018
이 화합물을 디클로로트리아진, 이어서 알킬 아민과 반응시킨 후에, 탈보호시켜 최종 생성물을 수득하였다. 백색 고체 (2.2 g, 92％); mp 143 내지 146℃;
Figure 112009073096479-pct00019
실시예 5: 화합물 IV
상기 화합물을 티라민 대신에 2-[4-아미노페닐]-에틸아민을 사용하여 실시예 1에 따라 제조하였다. 황색 고체, 97％ 수율; mp 155 내지 158℃;
Figure 112009073096479-pct00020
실시예 6: 화합물 VI
상기 화합물을 티라민 및 4-플루오로아닐린 대신에 각각 4-[2-아미노에틸]벤즈아미드 및 3-플루오로아닐린을 사용하여 실시예 2에 따라 제조하였다. 4-[2-아미노에틸]-벤즈아미드는 하기와 같이 제조하였다: 메탄올 (200 ml) 중 4-[2-아미노에틸]벤조산 히드로클로라이드 (5.0 g, 24.8 mmol)의 현탁액을 1,4-디옥산 (10 ml, 40 mmol) 중 HCl 4 M 용액으로 처리하고, 반응물을 밤새 환류 온도에서 가열하였다. 용매 및 과량의 산을 진공에서 제거하였다. 잔류물을 에테르로 분쇄하고, 진 공에서 건조시켜 에스테르를 백색 고체로서 수득하였다: (5.5 g, 정량적 수율);
Figure 112009073096479-pct00021
테트라히드로푸란 (60 ml) 및 메탄올 (30 ml) 중 상기 히드로클로라이드 염 (5.4 g, 24.8 mmol)의 현탁액을 디이소프로필에틸아민 (4.8 ml, 27.3 mmol) 및 디-tert-부틸 디카르보네이트 (8.1 g, 37.2 mmol)로 처리하였다. 반응물을 5시간 동안 N2 하에 상온에서 교반하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시켰다. 용액을 물 및 포화 나트륨 클로라이드로 세척한 후에, 건조시키고 (마그네슘 술페이트), 여과시키고, 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 차가운 에테르로 분쇄하고, 진공에서 건조시켜 보호된 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (5.6 g, 81％); LRMS (ESI): m/z 192 (MH+), 302 (MH+Na); HPLC (방법 2): 3.9분. 1,4-디옥산 (36 ml) 중 에스테르 (5.6 g, 20.0 mmol)의 용액을 포화 수성 암모니아 (36 ml)로 처리하였다. 반응물을 밤새 100℃에서 밀봉 튜브 중에 가열하였다. 냉각시킨 후에, 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 진공에서 건조시켜 아미드를 백색 고체로서 수득하였다 (4.4 g, 82％); LRMS (ESI): m/z 287 (MH+Na); HPLC (방법 2): 2.6분. tert-부톡시카르보닐 화합물 (4.4 g, 16.5 mmol)의 탈보호를 실시예 2의 절차의 변형 (물 공용매를 생략하고, 고체를 동결건조보다는 진공에서 건조시킴)에 의해 수행하여 백색 고체를 수득하였다 (3.3 g, 정량적 수율); LRMS (ESI): m/z 165 (MH+), 187 (MH+Na); HPLC (방법 2): 0.3분. 이 화합물을 디클로로-트리아진, 이어서 알킬 아민과 반응시킨 후에, 탈보호시켜 최종 생성물을 수득하였다. 백색 고체, 1.0 g, 20％ 수율; mp 190 내지 192℃;
Figure 112009073096479-pct00022
실시예 7: 화합물 VII
Boc-보호된 화합물 (4.8 mmol)을 실시예 1에 사용된 절차의 변형에 의해 탈보호시켰다. 이 경우, 메틸렌 클로라이드 (30 ml) 중 4 M HCl/1,4-디옥산 (36 ml)을 0℃ 내지 상온에서 사용하여 저밀도 백색 고체를 수득하였다. 87％ 수율; mp 165 내지 168℃;
Figure 112009073096479-pct00023
실시예 8: 화합물 VIII
상기 화합물을 티라민 및 4-플루오로아닐린 대신에 각각 4-아미노벤젠 술폰아미드 및 3-플루오로아닐린을 사용하여 실시예 2에 따라 제조하였다. 옅은 베이지색 고체, 95％ 수율; mp 162 내지 163℃;
Figure 112009073096479-pct00024
실시예 9: 화합물 IX
상기 화합물을 티라민 및 5-아미노펜틸아민 대신에 각각 4-[2-아미노에틸]벤젠 술폰아미드 및 4-아미노부틸아민을 사용하여 실시예 2에 따라 제조하였다. 백색 고체, 74％ 수율; mp 181 내지 184℃;
Figure 112009073096479-pct00025
실시예 10: 화합물 X
상기 화합물을 티라민 대신에 N,N-디메틸-4-(2-아미노에틸)벤젠-술폰아미드를 사용하여 실시예 2에 따라 제조하였다. 옅은 베이지색 고체, 57％ 수율; mp 290 내지 295℃ (분해);
Figure 112009073096479-pct00026
실시예 11: 화합물 XI
상기 화합물을 티라민 대신에 [±]-옥토파민을 사용하여 실시예 2에 따라 제조하였다. 백색 고체, 36％ 수율; mp 122 내지 125℃;
Figure 112009073096479-pct00027
항암 활성
실시예 12: 정상 및 암 세포에 대해 분석한 화합물의 시험관내 세포독성.
세포독성에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 측정하기 위해 이 분석을 수행하였다. 세포를 화합물의 존재 또는 부재하에 그들 각각의 조건화 배지 중에서 인큐베이션하였다. 배양 24시간 또는 72시간 후에, 3-(4,5-디메틸-2-티아질)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드 (MTT; 2 mg/ml) 50 μl를 첨가하고, 4시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 상층액을 버리고, 디메틸술폭시드 (DMSO) 100 μl를 첨가하였다. 흡광도를 테칸선라이즈(TecanSunrise) ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 570 nm에서 판독하였다. 대조군은 화합물을 갖지 않는 세포로 구성하였고, 100％의 생존가능 세포를 나타낸다. IC5O을 프리즘(Prism) 소프트웨어를 이용하여 측정하였다.
표 1은 24시간 또는 72시간의 세포 배양에서의 정상 (NHDF 또는 정상 인간 피부 섬유모세포; HUVEC 또는 인간 탯줄 정맥 내피 세포) 및 암 (PC-3 인간 전립선 암종 세포; P815 뮤린 비만세포종 세포) 세포주에 대한 화합물의 효과 (IC50)를 나타낸다. 모든 화합물이 세포독성에 대해 약한 효과를 가졌다. 선별된 암 세포주를 사용한 화합물의 잠재적인 생체내 항암 활성을 평가하기 위한 세포 기반 세포독성 분석의 예상 유용성은 당업계에 잘 확립되어 있고, 단리된 단백질 수용체 또는 효소를 대신한 전세포(whole cell)의 사용은 보다 신뢰성 있는 활성의 측정을 제공한다. 예를 들어, 문헌 [Paull et al. (J. Nat'l Cancer Inst. 81:1088-1092, 1989)]; [Monks et al. (J Nat'l Cancer Inst. 83:757-766, 1991)]; [Bandes et al. (J. Nat'l Cancer Inst. 86:770-775, 1994)]; 및 [Kamate et al. (Int'l J. Cancer 100:571-579, 2002)]를 참조한다.
Figure 112009073096479-pct00028
실시예 13: PC-3 세포 이동 또는 침입에 대한 화합물의 시험관내 효과.
시험관내 이동 분석을 이용하여 2차원으로 세포 이동성을 평가하였다. PC-3 세포를 12-웰 플레이트 상에 플레이팅하고, RPMI + 10％ FBS에서 성장시켜 전면 배양하였다. 고무 폴리스맨(rubber policeman)을 사용하여 노출(denuded) 영역을 생성하였다. 전면 배양 세포를 세포 증식 및 단백질 합성의 교란 이슈를 예방하기 위해 사용된 농도에서 미토마이신 C 처리 (0.5 μM)에 의해 정지시켰다. 이들 세포를 또한 24시간 동안 내피 성장 인자 (EGF) 및 화합물의 존재 또는 부재하에 인큐베이션한 후에, 이들을 촬영하였다.
시험관내 이동 분석에서 PC-3 세포 이동 또는 침입에 대한 EGF 및 화합물 V의 효과를 측정하였다. EGF는 대조군 (즉, EGF 무첨가)과 비교하여 미토마이신으로 처리된 PC-3 세포의 이동 또는 침입을 촉진하였다. 다양한 농도 (즉, 1 μM 내지 10 μM)의 화합물 V를 세포 배양 배지에 첨가하는 것은 EGF-유도성 PC-3 이동 또는 침입의 억제를 생성하였다. 유사한 결과가 화합물 I을 사용하여 관찰되었다. 다양한 농도 (즉, 1 μM 내지 20 μM)의 화합물 I을 세포 배양물에 첨가하는 것은 배양 24시간 후에 EGF-유도성 PC-3 이동 또는 침입의 억제를 생성하였다.
실시예 14: 세포외 매트릭스 성분에의 PC-3 세포 부착에 대한 화합물의 시험관내 효과.
시험관내 세포 부착 분석을 이용하여 암 세포 부착에 대한 화합물의 효과를 평가하였다. 마이크로타이터 96-웰 플레이트를 사전에 PBS 중에 5 μg/ml (라미닌), 10 μg/ml (마트리겔™ 기저막 매트릭스) 또는 10 μg/ml (콜라겐)로 희석된 부착성 리간드 50 μl/ml로 실온에서 1시간 동안 코팅하였다. 웰을 37℃에서 1시간 동안 PBS (100 μl/웰) 중 1％ BSA의 용액으로 블로킹하였다. PC-3 세포의 전면 배양 이하(subconfluent)의 배양물을 칼세인(calcein)-AM 5 μM 용액과 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후에, 칼세인-AM을 갖지 않는 배지 중에 PC-3 세포를 인큐베이션함으로써 무(free) 칼세인-AM을 씻어내었다(wash out) (30분). 칼세인-AM-표지된 세포를 트립신 처리하고, 세척하고, 부착 완충액 (RPMI-1640, 1 mM의 MgCl2로 보강된 10％ FBS) 중에 재현탁시켰다. 표지된 PC-3 세포를 30분 동안 화합물의 부재 또는 존재하에 사전 인큐베이션한 후에, 최종 부피 100 μl의 사전 인큐베이션된 세포를 37℃에서 15분, 30분 또는 60분 동안 가습 인큐베이터 중에 부착시켰다. 부착되지 않은 세포를 PBS로 2회 세척하여 제거하고, PBS 중 1％ 트리톤(Triton) X-100 용액 100 μl로 용해시켰다. 플레이트를 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 530 nm을 갖는 테칸 지니오스 플러스(Tecan GENios Plus) 형광 판독기 상에서 판독하였다. 부착된 세포의 개수를 표준 곡선을 기준으로 계산하였다. 비특이적 세포 부착 (BSA로 코팅된 웰에의 부착)은 항상 5％ 미만이었다.
상기 기재된 시험관내 세포 부착 분석에서의 다양한 농도의 화합물 V의 첨가는 다양한 기질: 라미닌 (도 1A), 마트리겔™ 기저막 매트릭스 (도 1B) 또는 콜라겐 (도 1C)에 대해 용량 의존적 방식으로 PC-3 세포 부착을 억제하였다.
실시예 15: 원발성 B16F10 흑색종 종양에 대한 화합물의 항종양 효과.
암컷 6 내지 8주령 C57BL/6 마우스에 ATCC로부터의 3.75 x 104개의 생존가능 B16F10 흑색종 세포 50 μl (세포 배양물 공급자 (I.J. Fidler 박사))를 0일차에 피부내 주사하였다. 14일차에, 종양이 80 mm에 도달하였고, 동물을 처치를 위해 무작위화하였다. 이어서, 동물에 염수 (음성 대조군) 또는 화합물 (5 mg/kg, 25 mg/kg 또는 50 mg/kg)를 14일차, 16일차 및 18일차, 또는 10 mg/kg의 독소루비신 (양성 대조군)을 14일차에 IV 주사하였다. 마우스를 29일차에 희생시켰다. 체중 및 종양 부피를 기록하였다. 일련의 종양 부피를 식 0.4 (a x b2) (여기서, "a"는 주(major) 종양 직경이고, "b"는 부(minor) 수직 직경임)을 이용하여, 캘리퍼스를 사용한 2차원(bi-dimension) 직경 측정에 의해 얻었다. 항종양 효과를 (처치된 종양 부피 / 대조군 종양 부피) x 100％으로 계산한 T/C에 의해 정량화할 수 있다.
도 2A는 원발성 종양 B16F10 세포에 대한 화합물 I 또는 II의 항종양 효능을 나타낸다. 두 화합물 모두 대조군과 비교하여 종양 부피의 약한 감소 (T/C 약 80％)를 유도하였다. 도 2B는 원발성 종양 B16F10 세포에 대한 화합물 V의 항종양 효능을 나타낸다. 화합물 V는 대조군과 비교하여 종양 부피의 유의적인 감소 (T/C < 40％, p = 0.001)를 유도하였다.
실시예 16: 원발성 DA-3 유방 종양에 대한 화합물의 항종양 효과.
유전적 동계(syngeneic) DMBA3 (DA-3, 유방 암종 모델) 세포주는 암컷 BALB/c 마우스에서 7,12-디메틸벤즈안트라센으로 처치된 발암전(preneoplastic) 병변으로부터 기인한다. DA-3 세포를 플라스틱 플라스크에서 0.1 mM 비-필수 아미노산, 0.1 μM 나트륨 피루베이트, 2 mM L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640 중에 단층 배양으로 성장시켰다. 여기에 50 μM 2-머캅토에탄올 및 10％ 소 태아 혈청을 추가로 보충하였다. DA-3 종양을 5 x 105개의 생존가능 종양 세포 50 μl의 피부내 접종에 의해 생체내 연속 전달하여 6 내지 8주령 BALB/c 마우스에서 국소화된 종양을 생성하였다. 이어서, 종양의 징후에 대한 수동 촉진(palpation)에 의해 동물을 연속적으로 모니터링하였다. 마우스를 11, 18 및 25일차에 시클로포스파미드 (100 mg/kg, IV 주사)로 처치하고, 11, 12, 13, 15, 18, 20, 22 및 25일차에 화합물로 정맥내 처치하였다. 마우스를 27일차 내지 55일차에 희생시켰다. 일련의 종양 부피를 식 0.4 (a x b2) (여기서, "a"는 주 종양 직경이고, "b"는 부 수직 직경임)을 이용하여, 캘리퍼스를 사용한 2차원 직경 측정에 의해 얻었다. 일반적으로, 접종 후 7일차 내지 10일차에 종양을 촉진할 수 있었다. 국립 암 연구소 (USA)에서는 T/C가 40％ 이하인 경우 제품이 유효한 것으로 정의한다.
도 3은 화합물 II, 화합물 IV, 화합물 V 또는 시클로포스파미드의 정맥내 투여 (5 mg/kg)의 항종양 효능을 나타낸다. 모든 화합물은 25％ 내지 70％의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 (p < 0.05) 억제를 유도하였다. 또한, 24％ 내지 50％의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 (p < 0.04) 억제를 유도하는 시클로포스파미드와 비교하여, 모든 화합물은 20일차까지 시클로포스파미드와 유사하였다. 화합물 및 사이톡산(CYTOXAN) 시클로포스파미드의 조합물의 항종양 효능 또한 DA-3 종양에 대해 측정하였다.
도 4A는 화합물 II 단독 대 화합물 II 및 시클로포스파미드의 조합물의 정맥내 투여 (50 mg/kg)의 항종양 효능을 비교한다. 화합물 II는 40％ 내지 70％의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 (p < 0.05) 억제를 유도하였다. 또한, 24％ 내지 50％의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 (p < 0.05) 억제를 유도하는 시클로포스파미드와 비교하여, 시클로포스파미드 및 화합물 II의 조합물로 처치된 마우스는 또한 퇴행 및 10％ 미만의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 (p < 0.0001) 억제를 나타내었다. 퇴행 및 세포증식억제 효과 (비-성장)는 조합 요법에서 관찰되었다.
도 4B는 화합물 I 단독 대 화합물 I 및 시클로포스파미드의 조합물의 정맥내 투여 (50 mg/kg)의 항종양 효능을 비교한다. 화합물 I은 DA-3 종양 성장에 대한 약한 억제 효과를 가졌다. 시클로포스파미드는 20％ 내지 50％의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 (p < 0.01) 억제를 유도하였고, 시클로포스파미드 및 화합물 I의 조합물로 처치된 마우스는 또한 10％ 내지 40％의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 (p < 0.05) 억제를 나타내었다. 세포증식억제 효과 (비-성장)는 조합 요법에서 35일차까지 관찰되었다. 모든 처치를 35일차에서 중지하였다. 시클로포스파미드-처치된 마우스 및 CY + 화합물 I의 조합물-처치된 마우스를 방치하여 종양의 재성장을 관찰하였다. 종양의 재성장은 두 군이 유사하였으나, 조합 요법 군이 덜 현저하거나 또는 지연되었다.
도 4C는 화합물 V 단독 대 화합물 V 및 시클로포스파미드의 조합물의 정맥내 투여 (12.5 mg/kg)의 항종양 효능을 비교한다. 모든 요법은 20일차까지 종양 부피의 유의적인 억제 (p < 0.04)를 유도하였다. 화합물 V로 처치된 마우스는 36％ 내지 74％의 T/C를 갖는 종양 부피의 감소를 나타내었다. 그러나, 30％ 내지 45％의 T/C를 갖는 종양 부피의 억제를 유도하는 시클로포스파미드와 비교하여, 시클로포스파미드 및 화합물 V의 조합물로 처치된 마우스는 1％ 내지 20％의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 억제를 나타내었다.
도 5는 시스플라틴 단독 대 화합물 VII 및 시스플라틴의 조합물의 경구 투여 (50 mg/kg)의 항종양 효능을 비교한다. 시스플라틴은 40 내지 77일차에 40％ 내지 77％의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 (p < 0.01) 억제를 유도하였다. 시스플라틴 및 화합물 VII의 조합물로 처치된 마우스는 또한 34 내지 71차에 34％ 내지 71％의 T/C를 갖는 중양 부피의 유의적인 (p < 0.01) 억제를 나타내었다.
실시예 17: 원발성 P815 비만세포종 종양에 대한 화합물의 항종양 효과.
유전적 동계 P815는 ATCC로부터 얻은 DBA/2 (H-2d)-유래 비만세포종 (TIB64)이다. P815 세포를 10％ 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 중에서 성장시켰다. 0일차에, 5 x 105개의 생존가능 P815 세포 50 μl를 피부내 주사하여 6 내지 8주령 DBA/2 마우스에서 국소화된 종양을 생성하였다. 이어서, 동물을 종양의 징후에 대한 수동 촉진에 의해 연속적으로 모니터링하였다. 이어서, 마우스를 매일 비히클 (음성 대조군), 아세틸살리실산 (양성 대조군, 50 mg/kg) 또는 화합물 (50 mg/kg)의 경구 투여로 처치하였다. 마우스를 23일차에 희생시켰다. 일련의 종양 부피를 식 0.4 (a x b2) (여기서, "a"는 주 종양 직경이고, "b"는 부 수직 직경임)을 이용하여, 캘리퍼스를 사용한 2차원 직경 측정에 의해 얻었다. 일반적으로, 접종 후 3일차 내지 5일차에 종양을 촉진할 수 있었다.
도 6은 원발성 종양 P815 세포에 대한 화합물 I, 화합물 II, 화합물 V 또는 아세틸살리실산 (양성 대조군)의 경구 투여의 효과를 나타낸다. 모든 화합물은 종양 성장의 유의적인 감소 (T/C 40％ 내지 50％)를 유도하였다. 또한, 모든 화합물의 효과는 골드 스탠다드(gold standard)인 가용성 아세틸살리실산에 필적하였다.
실시예 18: 원발성 루이스(Lewis) 폐 LL/2 암종 종양에 대한 화합물의 항종양 효과.
유전적 동계 LL/2는 ATCC로부터 얻은 폐 종양 세포주 (CRL-1642)이다. LL/2 세포를 10％ 소 태아 혈청을 함유한 DMEM 중에서 성장시켰다. 0일차에, 3 x 105개의 생존가능 LL/2 세포 50 μl를 피부내 주사하여 6 내지 8주령 마우스에서 국소화된 종양을 생성하였다. 이어서, 동물을 종양의 징후에 대한 수동 촉진에 의해 연속적으로 모니터링하였다. 이어서, 마우스를 매일 비히클 (음성 대조군) 또는 화합물 (50 mg/kg)의 경구 투여, 그리고 6일차 및 13일차에 시스플라틴 (5 mg/kg)의 정맥내 주사로 처치하였다. 마우스를 16일차에 희생시켰다. 일련의 종양 부피를 식 0.4 (a x b2) (여기서, "a"는 주 종양 직경이고, "b"는 부 수직 직경임)을 이용하여, 캘리퍼스를 사용한 2차원 직경 측정에 의해 얻었다. 일반적으로, 접종 후 3일차 내지 5일차에 종양을 촉진할 수 있었다.
도 7A는 원발성 종양 LL/2 세포에 대한 화합물 II 또는 시스플라틴 (양성 대조군)의 경구 투여의 효과를 나타낸다. 화합물 II는 7일차 내지 16일차에 종양 성장의 유의적인 감소 (T/C 36％ 내지 60％, p < 0.04)를 유도하였다. 시스플라틴은 7일차 및 8일차에 종양 성장의 유의적인 감소 (T/C 42％ 내지 84％, p < 0.04)를 유도하였다. 다른 실험에서, 시클로포스파미드 (100 mg/kg)를 양성 대조군으로 사용하였고, 9일차 및 15일차에 주사하였다. 마우스를 20일차에 희생시켰다. 도 7B는 시클로포스파미드 및 화합물 II의 조합 요법의 효과를 나타낸다. 이 조합 요법에서 원발성 종양 LL/2 세포의 감소에서의 상승적(synergistic) 활성이 달성되었다.
도 8은 원발성 종양 LL/2 세포에 대한 화합물 II, 화합물 III, 화합물 VII 또는 시클로포스파미드 (양성 대조군)의 경구 투여의 효과를 나타낸다. 화합물 II는 종양 성장의 감소 (T/C 53％ 내지 74％)를 유도하였다. 화합물 III은 종양 성장의 감소 (T/C 67％ 내지 96％)를 유도하였다. 화합물 VII은 종양 성장의 감소 (T/C 72％ 내지 85％)를 유도하였다. 시클로포스파미드는 종양 성장의 감소 (T/C 50％ 내지 67％)를 유도하였다.
실시예 19: PAN02 췌장 종양에 대한 화합물의 항종양 효과.
유전적 동계 PAN02는 NCI로부터 얻은 췌장 종양 세포주 (0507232)이다. PAN02 세포를 10％ 소 태아 혈청을 함유한 RPMI-1640 중에서 성장시켰다. 0일차에, 7.5 x 105개의 생존가능 PAN02 세포 50 μl를 피부내 주사하여 6 내지 8주령 C57BL/6 마우스에서 국소화된 종양을 생성하였다. 이어서, 동물을 종양의 징후에 대한 수동 촉진에 의해 연속적으로 모니터링하였다. 이어서, 마우스를 매일 비히클 (음성 대조군) 또는 화합물 (50 mg/kg)의 경구 투여, 그리고 6일차 및 12일차에 겜시타빈 (50 mg/kg)의 복강내 주사로 처치하였다. 마우스를 40일차에 희생시켰다. 일련의 종양 부피를 식 0.4 (a x b2) (여기서, "a"는 주 종양 직경이고, "b"는 부 수직 직경임)을 이용하여, 캘리퍼스를 사용한 2차원 직경 측정에 의해 얻었다. 일반적으로, 접종 후 3일차 내지 5일차에 종양을 촉진할 수 있었다.
도 9는 원발성 종양 PAN02 세포에 대한 화합물 I, 화합물 V 또는 겜시타빈 (양성 대조군)의 경구 투여의 효과를 나타낸다. 두 화합물 I 및 V는 모두 종양 성장의 약한 감소 (각각 T/C 17％ 내지 67％ 및 40％ 내지 84％)를 유도하였다. 또한, 모든 화합물의 효과는 췌장암의 요법에 사용되는 골드 스탠타드인 겜시타빈 (T/C 52％ 내지 77％)에 필적하였다.
실시예 20: 이종이식 인간 전립선 PC-3 종양에 대한 화합물의 항종양 효과.
이종발생성(xenogenic) 인간 전립선 종양 PC-3을 ATCC로부터 얻었다 (CRL1435). PC-3 세포를 10％ 소 태아 혈청을 함유한 RPMI-1640 중에서 성장시켰다. 0일차에, 생존가능 PC-3 (1.5 내지 2 X 106) 세포 50 μl를 피부내 주사하여 6 내지 8주령 수컷 CD1 nu/nu 마우스에서 국소화된 종양을 생성하였다. 이어서, 동물을 종양의 징후에 대한 수동 촉진에 의해 연속적으로 모니터링하였다. 종양이 만족할만한 부피에 도달했을 때, 마우스를 무작위화하고, 이어서 첫째주, 둘재주 및 셋째주에 각각 주 당 4회, 3회 및 3회로 비히클 (음성 대조군), 시클로포스파미드 (양성 대조군, 100 mg/kg) 또는 화합물 (5 mg/kg)의 정맥내 주사로 처치하였다. 마우스를 56 내지 65일차에 희생시켰다. 일련의 종양 부피를 식 0.4 (a x b2) (여기서, "a"는 주 종양 직경이고, "b"는 부 수직 직경임)을 이용하여, 캘리퍼스를 사용한 2차원 직경 측정에 의해 얻었다.
도 10A는 이종이식 인간 전립선 PC-3 종양에 대한 화합물 II 또는 시클로포스파미드의 효과를 나타낸다. 화합물 II는 종양 성장의 유의적인 감소 (T/C 29％ 내지 75％)를 유도하였다. 시클로포스파미드는 종양 성장의 유의적인 감소 (T/C 1％ 내지 52％)를 유도하였다. 또한, 화합물 II는 42일차까지 세포증식억제 (비-성장) 효과를 나타내었다.
도 10B는 이종이식 인간 전립선 PC-3 종양에 대한 화합물 II, 시클로포스파미드, 또는 화합물 II 및 시클로포스파미드의 조합물의 효과를 나타낸다. 시클로포스파미드는 종양 성장의 유의적인 감소 (T/C 8％ 내지 31％)를 유도하였다. 화합물 II 및 시클로포스파미드의 조합물로의 처치에 의해 유의적인 감소 (T/C 1％ 내지 23％) 이후에 종양 퇴행을 유도하였다. 종양의 재성장은 48일차에서 처치의 종결 이후에 시클로포스파미드-처치 군에서 보다 빨랐다.
도 10C는 이종이식 인간 전립선 PC-3 종양에 대한 시클로포스파미드를 수반하거나 수반하지 않은 화합물 V의 경구 투여의 항종양 효능을 나타낸다. 화합물 V의 경구 투여는 14％ 내지 40％의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 (p < 0.05) 억제를 유도하였다. 시클로포스파미드는 1％ 내지 39％의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 억제 (p < 0.05)를 유도하였다. 시클로포스파미드 및 화합물 V의 조합물의 경구 투여로 처치된 마우스는 종양 퇴행을 수반하면서 1％ 내지 40％의 T/C를 갖는 종양 부피의 유의적인 (p < 0.01) 억제를 나타내었다.
항-염증성 활성
실시예 21: WEHI-13VAR 세포주에서 TNFα-유도성 아팝토시스에 대한 화합물의 효과.
TNFα-유도성 아팝토시스에 대한 화합물의 효과를 WEHI-13VAR 세포를 사용하여 표준 생물학적 분석으로 측정하였다. 이들 세포는 TNFα 및 악티노마이신 D의 존재하에 인큐베이션할 때 아팝토시스를 겪는다. 2 x 104개의 WEHI-13VAR 세포를 1％ 나트륨 피루베이트 및 10％ FBS로 보강된 RPMI 중에서 세포 부착을 위해 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 1 μg/ml의 악티노마이신 D (단백질 합성을 억제하기 위해) 및 0.04 nM TNFα의 존재하에 37℃에서 화합물을 수반하거나 수반하지 않고 배양하였다. 16시간 내지 24시간 후에, 2 mg/ml의 MTT 용액 50 μl를 각 웰에 첨가한 후에, 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 단지 생존가능 세포만이 MTT를 대사시켜 포르마잔 염을 형성하였고, 이는 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써 검출가능하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 반전시켜 배지 및 죽은 세포를 제거하였다. 150 μL의 DMSO를 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, 포르마잔 염을 가용화시켰다. 광학 밀도(optical density)를 바이오-텍(Bio-Tek) EL 800 UV 마이크로플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 광학 밀도의 감소는 TNFα에 의해 유도된 세포 아팝토시스의 직접적 증거이다. 화합물을 또한 항-TNFα 중화 항체의 활성과 비교하였다.
표 2는 세포-기반 TNFα 민감성 WEHI-13VAR 세포 증식 분석에서 시험된 화합물의 TNFα 억제 (아팝토시스) 백분율을 나타낸다. 화합물은 40 내지 80％ 범위의 TNFα 억제 활성을 나타내었다. 비교하면, TNFα 항체는 90 내지 95％의 TNFα 억제 활성을 나타내었다. 이 데이터는 TNFα 민감성 WEHI-13VAR 세포에 대한 TNFα의 아팝토시스 활성을 억제하는 본 발명의 화합물의 능력을 설명한다.
Figure 112009073096479-pct00029
실시예 22: 마우스 J774A.1 세포주에서 LPS-유도성 TNFα 생성에 대한 화합물의 효과.
TNFα 생성에 대한 화합물의 효과를 LPS에 의해 자극된 J774A.1 세포를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다. J774A.1 세포를 LPS 및 화합물의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양한 후에, 제조자 (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))에 의해 추천된 바와 같이 ELISA에 의한 TNFα의 농도 측정을 위해 상층액을 수집하였다. 데이터를 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel) 소프트웨어로 분석하였고, TNFα 생성의 50％를 억제하는 화합물의 농도 (IC50)를 프리즘 소프트웨어를 이용하여 계산하였다.
표 3은 J774A.1 세포 상에서 LPS에 의해 유도된 TNFα 생성에 대한 화합물의 효과를 요약한다.
Figure 112009073096479-pct00030
실시예 23: 마우스 J774A.1 세포주에서 LPS-유도성 PGE2 생성에 대한 화합물의 효과.
PGE2 생성에 대한 화합물의 효과를 LPS에 의해 자극된 J774A.1 세포를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다. J774A.1 세포를 LPS 및 화합물의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양한 후에, 제조자 (지이 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 추천된 바와 같이 ELISA에 의한 PGE2의 농도 측정을 위해 상층액을 수집하였다. 데이터를 마이크로 엑셀 소프트웨어로 분석하였고, PGE2 생성의 50％를 억제하는 화합물의 농도 (IC50)를 프리즘 소프트웨어를 이용하여 계산하였다.
도 11은 LPS-자극된 J774A.1에서 PGE2의 생성에 대한 화합물 V의 효과를 나타낸다. 화합물 V는 2 μM의 IC50으로 PGE2의 생성을 억제하였다.
실시예 24: 말초 혈액 단핵 백혈구 (PBML)의 세포독성, DNA, RNA 및 단백질 합성에 대한 화합물의 효과.
PBML을 건강한 자원자의 말초 혈액으로부터 얻었다. 혈액을 림폴라이트-폴리(Lympholyte-Poly) 배지 (세달란(Cedarlane; 캐나다 혼비 소재))를 사용하여 구배 원심분리시켰다. 단핵 백혈구를 함유한 층을 수집하고, 세포를 PBS 중에서 3회 세척하였다. 이어서, 세포를 10％ FBS (하이클론(Hyclone; 미국 로건 소재))로 보강된 RPMI (깁코(Gibco; 캐나다 벌링톤 소재)) 중에서 현탁시켰다. 생존율은 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)에 의해 측정된 바와 같이 99％ 초과였다.
PBML를 2 x 106 세포/ml에서 재현탁시켰다. PBML (2 x 105개의 세포) 100 μL를 화합물의 존재 또는 부재하에 48시간 동안 96-웰 마이크로타이터 플레이트 중에 인큐베이션하였다. 세포를 정지시키거나(quiescent), 또는 콘카나발린(concanavalin) A (con A; T-세포) 또는 포크위드(pokeweed) 미토겐 (PWM; B-세포)으로 자극하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 MTT (세포독성)으로 처치하거나, 또는 1 μCi의 [3H]-티미딘 (DNA 합성), [3H]-우리딘 (RNA 합성), 또는 [3H]-류신 (단백질 합성)으로 6시간 동안 펄스하였다. 플레이트를 톰텍(Tomteck) 상에서 수확하고, 마이크로베타(Microbeta) β-계수기 상에서 계수하였다.
표 4는 인간 말초 혈액 단핵 백혈구 (PBML) 상의 세포독성, DNA, RNA 및 단백질 합성에 대한 화합물의 효과를 요약한다. 세포독성은 관찰되지 않았다. 그러나, 모든 화합물은, PBML이 con A (T-세포 증식을 자극하는 미토겐) 및 PWM (B-세포 증식을 자극하는 미토겐)으로 자극되었을 때 DNA를 억제하였다. RNA 합성은 휴지상태 및 자극된 (con A 및 PWM) PBML 모두에서 억제되었다. 그러나, 단지 화합물 I 및 II만이 자극된 PBML에서 단백질 합성을 억제하였다. 이들 결과는 T 및 B 세포 모두의 억제를 시사한다. 이들 세포는 자가면역 질환과 같은 염증성 질환에 강력하게 관여한다.
Figure 112009073096479-pct00031
실시예 25: 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)에 대한 화합물의 효과.
F1 하이브리드 크로스 NZB x NZW의 뉴질랜드 마우스는 인간 SLE에서 보여지는 대부분의 자가면역 이상(abnormality)이 발달하고, SLE-유사 면역 복합체(IC)-매개된 사구체신염으로 사망한다. 마우스에 항-DNA (이중가닥 및 단일가닥) 및 핵 추출 (NE) 항체의 높은 타이터, 및 백혈구감소증, 혈소판감소증, 단백뇨 및 사구체신염을 비롯한 SLE-관련 임상 증상을 발달시켰다. 이들 마우스는 3개월령 후에 항-DNA 항체가 발달하였고, 7개월차에 최대 항-DNA 항체 반응이 일어났다. 후속적으로, 항-DNA 항체의 혈청 농도가 아마도 진행성 요독증의 결과로 감소하였다. 질환의 첫번째 혈청학적 증상이 약 150일차 (즉, 5개월)에 발생하였다. 그들의 생존율을 대략 250일차에 평가하였다.
도 12는 NZB x NZW 마우스의 사망율에 대한 화합물 I의 효과를 나타낸다. 화합물 또는 비히클의 정맥내 투여를 10주 내지 46주에 주 당 1회 수행하였다. 결과치는 화합물 I이 NZB x NZW 마우스의 사망율을 감소시킨다는 것을 나타내었다.
실시예 26: 지연형 과민증 (DTH)에 대한 화합물의 효과.
화합물을 마우스에서 옥사졸론-유도성 지연형 과민증 (DTH)을 치료하는 능력에 대해 시험하였다. 0일차에, 마우스를 5％ 아세톤 중 옥사졸론 100 μL로 감작화시켰다. 0일차, 1일차 및 2일차에, 마우스를 비히클 (대조군) 또는 메토트렉세이트 (MTX; 양성 대조군/IV) 또는 히드로코르티손 (양성 대조군/PO), 또는 50 mg/kg, 50 mg/kg 미만 또는 구체화된 바와 같은 농도의 화합물의 정맥내 (IV) 또는 경구 (PO) 투여로 처치하였다. 마우스에 우측 귀의 표면 상에 옥사졸론 50 μl를 도포하여 투여하였다 (첫번째 투여, 3일차; 두번째 투여, 10일차). 귀 두께를 4 내지 7일차, 및 11 내지 14일차에 측정하였다. 붉어짐(redness) 및 딱지 형성 또한 관찰하였다. 마우스를 14일차에 희생시켰다. TDTH (CD4) 세포는 DTH 반응의 강도를 조절하는데 중요한 역할을 하였다. 화합물은, T-세포 활성화 및 DNA, RNA 및/또는 단백질 합성의 억제를 통해 DTH 반응에 대한 억제 작용을 유발할 수 있다.
도 13 A에 나타난 바와 같이, 화합물 I의 정맥내 투여 (25 mg/kg)는 귀 두께의 감소에서 보여진 바와 같이 옥사졸론의 첫번째 투여 후에 유도된 염증의 유의적인 감소를 유도하였다. 또한, 화합물 I에 의해 유도된 염증의 억제는 면역억제 용량의 메토트렉세이트에 의해 얻어진 결과에 필적하였다. 화합물 I의 정맥내 투여 (25 mg/kg)는 귀 두께의 감소에 의해 보여진 바와 같이 옥사졸론의 두번째 투여 후에 유도된 염증의 유의적인 감소를 유도하였다 (도 13B). 또한, 화합물 I에 의해 유도된 염증의 억제는 면역억제 용량의 메토트렉세이트에 의해 얻어진 결과에 필적하였다.
도 14A에 나타난 바와 같이, 화합물 II의 정맥내 투여 (5 mg/kg)는 귀 두께의 감소에 의해 보여진 바와 같이 옥사졸론의 첫번째 투여 후에 유도된 염증의 유의적인 감소를 유도하였다. 또한, 화합물 II에 의해 유도된 염증의 억제는 면역억제 용량의 메토트렉세이트에 의해 얻어진 결과에 필적하였다. 화합물 II의 정맥내 투여 (5 mg/kg)는 귀 두께의 감소에 의해 보여진 바와 같이 옥사졸론의 두번째 투여 후에 유도된 염증의 유의적인 감소를 유도하였다 (도 14B). 또한, 화합물 II에 의해 유도된 염증의 억제는 면역억제 용량의 메토트렉세이트에 의해 얻어진 결과에 필적하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, 화합물 IV 또는 화합물 V의 경구 투여 (50 mg/kg)는 귀 두께의 감소에 의해 보여진 바와 같이 염증의 유의적인 감소를 유도하였다. 또한, 화합물 IV 또는 화합물 V에 의해 유도된 염증의 억제는 치료 용량 (50 mg/kg)의 히드로코르티손에 의해 얻어진 결과에 필적하였다.
도 16은 옥사졸론의 첫번째 (도 16A) 및 두번째 (도 16B) 투여 후의 화합물 III의 50 mg/kg 경구 투여의 효과를 나타낸다. 화합물 III은 두가지 투여 모두에서 귀 두께의 감소에서 보여진 바와 같이 유의적인 감소를 유도하였다.
도 17은 옥사졸론의 첫번째 투여 후에 각각 화합물 X 또는 화합물 XI의 5 mg/kg 또는 25 mg/kg 정맥내 투여의 효과를 나타낸다. 화합물 X 및 XI은 귀 두께의 감소에서 보여진 바와 같이 염증의 유의적인 감소를 유도하였다. 또한, 화합물 X 또는 XI에 의해 유도된 염증의 억제는 면역억제 용량의 메토트렉세이트에 의해 얻어진 결과에 필적하였다.
실시예 27: 프로이트(Freund) 아쥬반트-유도성 관절염 (AIA)에 대한 화합물의 효과.
미네랄 오일 중 현탁된 동결건조된 미코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)을 발바닥에 주사하여 AIA를 암컷 루이스 래트에 유도하였다. 관절염의 발달을 아쥬반트 주사 후 3주 간에 걸쳐 모니터링하였다. 염증은 아쥬반트 투여 후 3일차에 최대였다. 면역 활성화는 약 10일차 내지 16일차에 보였다. 화합물을 -3일차에서 21일차까지 경구 투여하였다. 체중을 기록하였다. 염증 (부종), 붉어짐, 및 관절의 경직도의 척도인 관절염 지수를 사용하여 질환의 발달을 모니터링하였다. 캘리퍼를 사용하여 내외측(mediolateral) 및 등배측(dorsoventral) 면에서 발목의 두 수직 직경을 측정함으로써 관절염의 정도를 결정하였다. 이어서, 관절 원주(circumference)를 mm 단위로 기하식을 이용하여 계산하였다.
도 18에 나타난 바와 같이, 100％의 동물에서 윤활막염이 빠르게 발달하였다. 관절염의 중증도 (염증성 지수)의 유의적인 감소가 인도메타신 (양성 대조군)의 경구 투여에 의해 1 내지 5일차 및 8일차 이후까지 관찰되었다. 염증성 지수의 유사한 감소가 또한 1 내지 4일차 및 8 내지 16일차에서의 화합물에서 관찰되었다.
실시예 28: 염증의 에어-파우치 모델에 대한 화합물의 효과.
래트 에어-파우치 모델에서의 LPS-유도성 염증은 관절염과 같은 관절 질환에서 발생하는 병리학적 과정을 모방하는 것으로 여겨진다. 이는 왜냐하면 에어 파우치를 통해 형성된 연결 조직이 만성 관절 질환에서 발견된 것과 유사하기 때문이다. LPS-유도성 염증 및 만성 관절 질환은 현저하게 상승된 PGE2, 호중구 침투, 사이토킨 형성, 및 조직 손상을 비롯한 여러 특징들을 공유한다.
수컷 루이스 래트 (175 내지 200 g)의 등의 내견갑(intrascapular) 영역에 20 ml의 멸균 에어를 피하 주사하여 -6일차에 에어 공동(air cavity)을 생성하였다. 추가 10 ml의 에어를 -3일차에 상기 공동에 주사하여 공간을 개방상태로 유지하였다. 0일차에, 화합물을 정맥내 투여하고, 1시간 후에 지질다당류 (LPS: PBS 중 2 μg/ml의 2.5 ml)를 파우치에 주사하여 염증성 반응을 생성하였다. LPS 처치 2시간, 4시간 또는 18시간 후에, 동물을 CO2 질식에 의해 안락사하고, 5 ml의 PBS/헤파린 (10 U/ml)/인도메타신 (36 μg/ml)을 파우치에 주사하였다. 파우치 액을 수집하였다. 분비물의 부피를 측정하고, 분비물에 존재하는 백혈구의 개수를 콜터(Coulter) 계수기로 측정하였다. 차등(differential) 개수를 라이트-기엠사(Wright-Giemsa) 염색에 의해 측정하였다. PGE2, LTB4, MCP 및 TNFα를 특이적 ELISA에 의해 파우치 분비물에서 측정하였다.
도 19에 나타난 바와 같이, 화합물 II 또는 화합물 V의 정맥내 투여는 LPS 유도 2시간 후에 백혈구 개수의 유의적인 억제를 유도하였다. 이들 백혈구 세포의 차등 개수는 라이트-기엠사 염색에 의해 보여진 바와 같이 90％ 초과의 호중구를 나타내었다. 화합물 II 또는 V에 의해 달성된 억제는 양성 대조군 인도메타신으로부터 얻어진 것과 유사하였다.
도 20A는 에어-파우치 래트 모델에서 LPS (유도 2시간 후)에 의해 유도된 TNFα 생성에 대한 화합물 II 또는 화합물 V의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다. 화합물 V는 LPS에 의해 유도된 TNFα 생성의 유의적인 억제를 유도하였다. 그러나, 화합물 II 또는 인도메타신은 LPS 유도 후 2시간 후에 TNFα의 농도를 증가시켰다.
도 20B는 에어-파우치 래트 모델에서 LPS (유도 2시간 후)에 의해 유도된 PGE2 생성에 대한 화합물 II 또는 화합물 V의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다. 화합물 V 및 인도메타신은 LPS에 의해 유도된 PGE2 생성의 유의적인 억제를 유도하였다. 그러나, PGE2의 약한 그리고 유의적이지 않은 억제가 화합물 II에서 관찰되었다.
도 20C는 에어-파우치 래트 모델에서 LPS (유도 2시간 후)에 의해 유도된 LTB4 생성에 대한 화합물 II 또는 화합물 V의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다. 화합물 II 및 V는 LPS에 의해 유도된 LTB4 생성의 약한 억제를 유도하였다. 그러나, 인도메타신은 LTB4의 생성에 영향을 미치지 않았다.
도 20D는 에어-파우치 래트 모델에서 LPS (유도 2시간 후)에 의해 유도된 MCP-1 생성에 대한 화합물 II 또는 화합물 V의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다. 화합물 V는 LPS에 의해 유도된 MCP-1 생성의 약한 억제를 유도하였다. 그러나, 인도메타신은 유의적인 증가를 유도한 반면, 화합물 II는 LPS 유도 후 2시간 후에 분비물에 존재하는 MCP-1에 대해 아무런 영향을 미치지 않았다.
다른 실험 세트에서, 분비물을 LPS 유도 후 12시간 후에 수집하였다. 도 21A는 LPS에 의해 유도된 TNFα 생성에 대한 화합물 II 또는 화합물 V의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다. 화합물 V는 LPS에 의해 유도된 TNFα 생성의 유의적인 억제를 유도하였다. 그러나, 화합물 II는 LPS 유도 후 12시간 후에 분비물 중의 TNFα의 농도에 대해 아무런 효과를 갖지 않았다. 인도메타신은 LPS 유도 후 12시간 후에 분비물 중에 TNFα의 약한 억제를 유도하였다.
도 21B는 에어-파우치 래트 모델에서 LPS (유도 12시간 후)에 의해 유도된 PGE2 생성에 대한 화합물 II 또는 화합물 V의 정맥내 투여의 효과를 나타낸다. 화합물 V 또는 인도메타신은 LPS에 의해 유도된 PGE2 생성의 유의적인 억제를 유도하였다. 그러나, PGE2의 약한 그리고 유의적이지 않은 증가가 화합물 II에서 관찰되었다.
실시예 29: DNBS-유도성 대장염에 대한 화합물 V의 효과.
2,4-디니트로벤젠 술폰산 (DNBS) 유도된 실험적 대장염 마우스 모델을 염증성 장 질환의 모델로서 수행하였다. 0일차에, CD1 마우스를 DNBS (40 mg/ml)의 에탄올 용액 (30％) 0.1 ml의 결장내(intra-colinic) 점적에 의해 DNBS로 감작화하였다. 화합물 V를, DNBS로의 감작화 1시간 후에 출발하여, 25 mg/kg 및 50 mg/kg에서 4 연속일 동안 1일 당 1회 경구 투여하였다. 4일차에, 마우스를 희생시키고, 8 cm의 원위부 결장을 수집하고, 육안 평가를 위해 종방향으로 개방하였다.
화합물 V는 음성 대조군 (비히클)과 비교하여 체중의 약하지만 유의적인 증가 (p = 0.049 (25 mg/kg) 및 p = 0.038 (50 mg/kg))를 유도하였고, 이는 처치된 마우스가 보다 양호한 건강상태를 갖는다는 것을 시사한다. 실제로, 사망율이 대조군에서 관찰되었고, 반면에 화합물 V로 처치된 군에서는 관찰되지 않았다.
도 22에 나타난 바와 같이, 화합물 V는 음성 대조군 (비히클)과 비교하여 결장 점막 조직의 DNBS-유도성 육안 손상 영역의 강력하고 유의적인 감소 (p = 0.003 (25 mg/kg) 및 p = 0.012 (50 mg/kg))를 유도하였다.
실시예 30: 실험적 자가면역 뇌척수염에 대한 화합물 V의 효과.
PLP-유도성 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 마우스 모델을 다발성 경화증의 모델로서 수행하였다. 0일차에, SJL 마우스를 프로이트 완전(complete) 아쥬반트 (마우스 당 200 μl 에멀션; 4개 부위로 분할된 s.c.) 중에 유화된 PLP (139-151) 75 μg 및 백일해 독소 (200 ng, i.p.)로 면역화시켰다. 백일해 독소의 i.p. 주사는 2일차에 반복하였다. 화합물 V를 면역화 후 0일차에 시작하여 30일까지 1주일 당 6회씩, 25 mg/kg 및 50 mg/kg에서 1일 당 1회 경구 투여하였다.
마우스를 면역화 후 30일까지 EAE의 임상적 징후를 관찰하였다. 증후의 임상적 단계를 하기 스케일에 따라 수행하였다: 0 = 질병 없음, 1 = 꼬리 이완(flaccid tail), 2 = 중등도 하반신마비, 3 = 중증 하반신마비, 4 = 거의 사망 상태, 5 = 사망. 도 23에 나타난 바와 같이, 화합물 V는 EAE의 징후의 외관을 용량 의존성 방식으로 감소시켰다. 50 mg/kg에서, 화합물 V는 음성 대조군 (비히클)과 비교하여 유의적인 활성 (p = 0.048)을 나타내었다.
본원에 인용된 특허, 특허 출원 및 여타 문헌들은 그 전체가 참고문헌으로 포함된다.
특허청구범위 및 그들의 법적 등가물의 범위의 의미 내에 있는 모든 변형 및 치환은 그들의 범주 내에 포함된다. 연결어(transition) "포함하는"을 사용한 청구항은 그 청구항의 범주 내에 여타 요소들을 포괄하도록 하고; 본 발명은 또한, "포함하는"이란 용어 대신에 연결어 "필수적으로 이루어진"을 사용한 청구항으로도 기재되고 (즉, 실질적으로 본 발명의 수행에 영향을 미치지 않는다면 청구항의 범주 내에 있을 여타 요소들의 포괄을 허용함), 연결어 "이루어진"을 사용한 청구항으로도 기재된다 (즉, 본 발명과 통상적으로 관련된 불순물 또는 하찮은(inconsequential) 활성체들을 제외하고 청구항에 수록된 요소들만 허용함). 이러한 세 연결어 중 어느 하나는 본 발명을 청구하기 위해 사용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 요소는 특허청구범위에 명백히 언급되어 있지 않는 한 청구된 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 특허청구범위는, 특허청구범위로 해석되는 명세서로부터의 제한 대신에 허여된 법적 보호 범주를 결정하기 위한 근간이다. 대비하여, 선행 기술은, 청구된 발명을 예상하거나 신규성을 파괴하는 특정 실시양태의 정도에서는 본 발명으로부터 명백하게 제외된다.
더욱이, 청구항의 제한들 간의 관계는 그러한 관계가 청구항에 명백히 언급되어 있지 않는 한 아무런 특정 관계도 없다 (예를 들어, 제조물 청구항에서의 성분들의 배열 또는 방법 청구항에서의 단계 순서는, 그렇게 한다고 명백하게 언급되지 않는 한 청구항의 제한이 아니다). 본원에 개시된 개별 요소들의 모든 가능한 조합 및 변경(permutation)은 본 발명의 측면으로 고려되어야 하고; 유사하게, 본 발명의 기재의 일반화는 본 발명의 일부로서 고려되어야 한다.
상기로부터, 본 발명이 그의 범주 또는 필수적 특징을 벗어나지 않고서 여타 특정 형태들로 구현될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 기재된 실시양태들은 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하고, 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는데, 왜냐하면 본 발명에 대해 제공된 법적 보호 범주는 본 명세서에 의해서라기 보다는 첨부한 특허청구범위에 의해서 나타내질 것이기 때문이다.

Claims (25)

  1. 하기 화학식의 화합물.
    Figure 112013031367255-pct00075
    식 중,
    X는 F 또는 Cl이고;
    Y는 NH, O 또는 S이고;
    R은 NH2, OH, SO2NH2, SO2N(CH3)H, SO2N(CH3)2 또는 CONH2이고;
    m은 2 내지 6의 정수이고;
    n은 0 내지 2의 정수이고, n = 2인 경우에 2개의 탄소 단편은
    Figure 112013031367255-pct00076
    (Z = H 또는 OH)를 포함한다.
  2. 제1항에 있어서,
    X가 F이고;
    Y가 NH이고;
    R이 NH2, OH, SO2NH2, SO2N(CH3)2 또는 CONH2이고;
    m이 4 또는 5이며;
    n이 0이거나, 또는 n이 2이고 Z가 OH인 화합물.
  3. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
    Figure 112013031367255-pct00077
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 하나 이상의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 암 또는 자가면역 질환을 치료하거나, 또는 염증을 감소시키기 위한 제약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 알콜, 폴리올 용매, 및 모노사카라이드 또는 디사카라이드의 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 화학요법제를 더 포함하는 제약 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 화학요법제가 데카르바진, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 토포테칸, 이리노테칸, 탁소테르, 탁솔, 5-플루오로우라실, 겜시타빈, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴 및 클로람부실로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  8. 제4항에 있어서, TNFα와 그의 수용체의 결합 또는 이것의 후속적 신호 전달을 차단하는 치료제를 더 포함하는 제약 조성물.
  9. 제4항에 있어서, 메토트렉세이트, 항염증성 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 항염증성 약물 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 제제를 더 포함하는 제약 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 하나 이상의 화합물을 포함하는, 암 치료용 의약.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 하나 이상의 화합물을 포함하는, 자가면역 질환 치료용 의약.
  12. 제11항에 있어서, 자가면역 질환이 크론(Crohn) 질환, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증인 의약.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, 포유동물에서 염증을 감소시키기 위한 제약 조성물.
  14. 하기 화학식의 화합물을 포함하는, 암의 치료가 필요한 인간 환자에서 암을 치료하거나 자가면역 질환의 치료가 필요한 인간 환자에서 자가면역 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
    Figure 112013031367255-pct00078
    식 중,
    X는 F 또는 Cl이고;
    Y는 NH, O 또는 S이고;
    R은 NH2, OH, F 또는 Cl이고;
    m은 2 내지 6의 정수이고;
    n은 0 내지 2의 정수이다.
  15. 제14항에 있어서, 상기 화합물이
    Figure 112013031367255-pct00079
    인 제약 조성물.
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