EA019768B1 - СОЕДИНЕНИЯ, МОДУЛИРУЮЩИЕ АКТИВНОСТЬ Toll-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к низкомолекулярным конъюгатам, которые являются агонистами или антагонистами одного или более Toll-подобных рецепторов.

Description

Заявка претендует на преимущество даты подачи заявки США под серийным номером 61/151737 от 11 февраля 2009 г., полностью включенной здесь путем отсылки.

Описанное здесь изобретение было сделано при поддержке правительства по грантам с номерами ΑΙ056453 и ΑΙ077989-01, присужденным Национальными институтами здравоохранения. Правительство США обладает определенными правами на изобретение.

Область техники, к которой относится изобретение

Технология частично относится к молекулам, которые модулируют функцию То11-подобного рецептора, и способам лечения заболеваний путем введения таких молекул субъекту, нуждающемуся в этом.

Сведения о предшествующем уровне техники

То11-подобные рецепторы (ТЬК) представляют собой паттерн-распознающие рецепторы, представ ленные на клетках разного типа, которые распознают определенные молекулярные структуры, присутствующие в микробах, таких как бактерии, вирусы или грибы (1). ТЬК распознают липопротеин (ТЬК2), двухцепочечную РНК (ТЬК3), липополисахарид (ЬР8, ТЬК4). флагеллин (ТЬК5). одноцепочечную РНК (ТЬК7/8) и бактериальные или вирусные неметилированные СрС ДНК (ТЬК9). Все ТЬК, за исключением ТЬК.3, передают сигнал через адаптерный белок, называемый МуИ88, приводя к активации ΝΡ-карраВ и генов, кодирующих синтез цитокинов (2).

ТЬК7 и 8, локализованные внутри клеток в эндосомальных компартментах, распознают одноцепочечные молекулы РНК и определенный синтетический гуанозиновый аналог клеток хозяина (3, 4). Богатая гуанином и уридином одноцепочечная РНК была идентифицирована как природный лиганд для ТЬК7 (5). К тому же было идентифицировано несколько низкомолекулярных активаторов ТЬК7, включающих имидазохинолины и пурин-подобные молекулы (3, 6, 7). Из последних, 9-бензил-8-гидрокси-2(2-метоксиэтокси)аденин (8М) был идентифицирован как сильный и специфический агонист ТЬК7 (8).

Производные 8М синтезировали путем введения альдегидной функциональной группы на бензильный фрагмент и промежуточного связывания с разными вспомогательными химическими соединениями посредством бифункциональной линкерной молекулы, содержащей гидразин и Ν-гидроксисукцинимид (9). Конъюгация с белком мышиным сывороточным альбумином (М8А) повышала силу от 10 до 100 раз и улучшала фармакодинамику ίη νίνο по сравнению с лекарственным веществом, не связанным с белками плазмы крови. Конъюгат М8А может доставляться в дыхательную систему путем интраназального или внутритрахеального введения. Доставка лекарственного средства интраназально доказала свою эффективность в двух мышиных моделях инфекционного заболевания, бактериальной инфекции и вирусной инфекции (9). Промежуточное соединение 8М также было конъюгировано с липидом, диолеоилфосфатидилэтаноламином (ΌΟΡΕ), и было определено, что конъюгат проявлял усиленную активность агониста ТЬК7 (например, ΧΥΟ 2008/115319, опубликованный 25 сентября 2008 г. на основе Международной патентной заявки РСТ/И82008/001631, зарегистрированной 7 февраля 2008 г.).

Сущность изобретения

Обеспечены низкомолекулярные конъюгаты, которые могут модулировать активность одного ли более То11-подобных рецепторов (например, конъюгаты являются агонистами, антагонистами или обоими). Термин То11-подобный рецептор (ТЬК) относится к члену семейства рецепторов, которые связываются с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (РАМР) и способствуют иммунному ответу у млекопитающих. Известно 10 ТЬК у млекопитающих, например ТЬК1-10. Термин агонист То11подобного рецептора (агонист ТЬК) относится к молекуле, которая взаимодействует с ТЬК и стимулирует активность рецептора. Синтетические агонисты ТЬК представляют собой химические соединения, которые разработаны для взаимодействия с ТЬК и стимулирования активности рецептора. Примеры агонистов ТЬК включают агонист ТЬК7, агонист ТЬК3 или агонист ТЬК9. Термин антагонист То11подобного рецептора (антагонист ТЬК) относится к молекуле, которая взаимодействует с ТЬК и ингибирует или нейтрализует сигнальную активность рецептора. Синтетические антагонисты ТЬК представляют собой химические соединения, разработанные для взаимодействия с ТЬК и препятствования активности рецептора. Примеры антагонистов ТЬК включают антагонист ТЬК7, антагонист ТЬК3 или антагонист ТЬК9.

Таким образом, в одном варианте обеспечено соединение, имеющее структуру согласно формуле I

(Формула 1) или его фармацевтически приемлемая соль, включая его гидрат,

- 1 019768 где X представляет собой N или СК²;

К представляет собой -ОК¹, -8К¹ или -ΝΚ³Κ⁵;

X¹ представляет собой связь или -О-, -8- или -ΝΚ⁰-;

К^с представляет собой водород, С₁-С₁₀-алкил или замещенный С₁-С₁₀-алкил или К^с и К¹ вместе с атомом азота могут образовывать гетероциклическое кольцо или замещенное гетероциклическое кольцо;

К¹ представляет собой водород, С₁-С₁₀-алкил, замещенный С₁-С₁₀-алкил, С₁-С₁₀-алкокси, замещенный С₁-С₁₀-алкокси, С₁-С₁₀-алкил-С₁-С₁₀-алкокси, замещенный С₁-С₁₀-алкил-С₁-С₁₀-алкокси, С₅-С₁₀-арил, замещенный С₅-С₁₀-арил, С₅-С₉-гетероциклил, замещенный С₅-С₉-гетероциклил, С₃-С₉-карбоцикл или замещенный С₃-С₉-карбоцикл;

каждый К² независимо представляет собой водород, -ОН, С₁-С₆-алкил, замещенный С₁-С₆-алкил, С₁-С₆-алкокси, замещенный С₁-С₆-алкокси, -С(О)-С₁-С₆-алкил (алканоил), замещенный -С(О)-С₁-С₆алкил, -С(О)-С₆-С₁₀-арил (ароил), замещенный -С(О)-С₆-С₁₀-арил, -С(О)ОН (карбоксил), -С(О)О-С₁-С₆алкил (алкоксикарбонил), замещенный -С(О)О-С₁-С₆-алкил, -NК^аК^ь, -С(О)NК^аК^ь (карбамоил), замещенный -С(О^К^аК^ь, гало, нитро или циано;

заместители на алкильных, арильных или гетероциклических группах представляют собой гидрокси, С₁-С₆-алкил, гидрокси-С₁-С₆-алкилен, С₁-С₆-алкокси, С₃-С₆-циклоалкил, С₁-С₆-алкокси-С₁-С₆ алкилен, амино, циано, галоген или арил;

каждый К^а и К^ь независимо представляет собой водород, С₁-С₆-алкил, С₃-С₈-циклоалкил, С₁-С₆алкокси, гало-С₁-С₆-алкил, С₃-С₈-циклоалкил-С₁-С₆-алкил, С₁-С₆-алканоил, гидрокси-С₁-С₆-алкил, арил, арил-С₁-С₆-алкил, Не!, Не!-С₁-С₆-алкил или С₁-С₆-алкоксикарбонил;

каждый К^х независимо представляет собой -Х²-((К³)Г-(К⁴)8)_Р, -С(О)NК^аК^ь или -СН^Н-биотин;

каждый X² независимо представляет собой связь или связующую группу;

каждый К³ независимо представляет собой полиэтиленгликолевый (РЕО) фрагмент;

каждый К⁴ независимо представляет собой Н, -С1-С6-алкил, -С1-С6-алкокси, -ΝΡ''Ρ^Ι:ι. -Ν3, -ОН, -ΟΝ, -СООН, -СООК¹, -С1-С6-алкил-NК^аК^ь, -С1-С₆-алкил-ОН, -С-С₆-алкил-СН -С₁-С₆-алкил-СООН, -С₁-С₆алкил-СООК¹, 5-6-членное кольцо, замещенное 5-6-членное кольцо, -С₁-С₆-алкил 5-6-членное кольцо, -С₁-С₆-алкилзамещенное 5-6-членное кольцо, С₂-С₉-гетероциклил или замещенный С₂-С₉-гетероциклил;

т представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

η представляет собой 0, 1, 2, 3 или 4;

р представляет собой от 1 до 100;

с.| представляет собой 1, 2, 3, 4 или 5;

г представляет собой от 1 до 1,000;

представляет собой от 1 до 1,000;

сумма η и с.| равна 5.

В определенных вариантах также обеспечено соединение, имеющее структуру согласно формуле II

Формула П или его фармацевтически приемлемая соль либо его гидрат, где X, X¹, X², К, К¹, К², К³, К⁴, т, η, р, с.|, г и 8 варианты описаны выше для формулы I.

В некоторых вариантах обеспечено соединение, имеющее структуру согласно формуле III

(СН₂)_га

Формула Ш или его фармацевтически приемлемая соль либо его гидрат, где X, X¹, К, К¹ и К² варианты описаны выше для формулы I;

- 2 019768

Υ представляет собой

-χΉίκΥρί^-ίΧ⁴)^^, -ХЧ^НХУ (КШ или -х^цхЧ-ехЧчкУСкУ^Ф

К³, К⁴, т, п, р, с.|. г и 5 варианты описаны выше для формулы I;

каждый X³ независимо является связью или связующей группой;

каждый X независимо представляет собой макромолекулу;

ΐ равно от 1 до 1,000; и равно от 1 до 1,000.

В некоторых вариантах X представляет собой N. В определенных вариантах X¹ представляет собой кислород и в некоторых вариантах К¹ представляет собой замещенный С1-С1₀-алкил, а именно С₁-С₁₀алкил-С1-С1₀-алкокси-фрагмент (например, -СН₂СН₂ОСН₃). В некоторых вариантах К¹ состоит из шести или менее неводородных атомов. В некоторых вариантах п равно 4 и К² представляет собой водород в каждом случае.

В определенных вариантах X² и/или X³ независимо представляют собой амидосвязующую группу (например, -ί.’(Ο)ΝΗ или -ΝΗ(ϋ)ί.’-); алкиламидосвязующую группу (например, -С1-С6-алкил-С(О)NΗ-, -С1-С6-алкил-NΗ(О)С-, -С(Ο)NΗ-С1-С6-алкил-, NΗ(Ο)С-С1-С6-алкил-, -С1-С6-алкил-NΗ(О)С-С1-С6-алкил-, -С1-С6-алкил-С(Ο)NΗ-С1-С6-алкил- или -С(О)НН-(СН₂)г, где ΐ равно 1, 2, 3 или 4); замещенное 5-6членное кольцо (например, арильное кольцо, гетероарильное кольцо (например, тетразол, пиридил, 2,5пирролидиндион (например, 2,5-пирролидиндион, замещенный замещенной фенильной группой)), карбоциклическое кольцо или гетероциклическое кольцо) или кислородсодержащий фрагмент (например, -О-, -С1-С₆-алкокси).

Фрагмент РЕС может включать одно или более РЕС звеньев. Фрагмент РЕС может включать примерно от 1 до 1,000 РЕС звеньев, включая, без ограничения, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 или 900 звеньев в некоторых вариантах. В определенных вариантах фрагмент РЕС может содержать примерно от 5 до 25 РЕС звеньев, примерно от 10 до 50 РЕС звеньев, примерно от 50 до 150 РЕС звеньев, примерно от 120 до 350 РЕС звеньев, примерно от 250 до 550 РЕС звеньев или примерно от 650 до 950 РЕС звеньев. В определенных вариантах РЕС звено представляет собой -О-СН₂-СН₂- или -СН₂-СН₂О-.

В некоторых вариантах г равно примерно от 5 до 100, иногда г равно примерно от 5 до 50 или примерно от 5 до 25. В определенных вариантах г равно примерно от 5 до 15 и иногда г равно примерно 10. В некоторых вариантах К³ представляет собой РЕС звено и г равно примерно от 2 до 10 (например, г равно примерно от 2 до 4). В определенном варианте К³ представляет собой -О-СН₂-СН₂- или -СН₂-СН₂-О-.

В некоторых вариантах К³ представляет собой -О-СН₂-СН₂- или -СН₂-СН₂-О- и г равно примерно от 1 до 1000 (например, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000). В определенных родственных вариантах г равно примерно от 5 до 25, примерно от 10 до 50, примерно от 50 до 150, примерно от 120 до 350, примерно от 250 до 550 или примерно от 650 до 950.

В некоторых вариантах 5 равно примерно от 5 до 100, иногда 5 равно примерно от 5 до 50 или примерно от 5 до 25. В определенных вариантах 5 равно примерно от 5 до 15, иногда 5 равно примерно 10. В некоторых вариантах 5 равно примерно 5 или меньше (например, 5 равно 1). В некоторых вариантах (К³)г заместитель является линейным, и в определенных вариантах (К³)г заместитель является разветвленным. Для линейных фрагментов 5 иногда меньше, чем г (например, когда К³ представляет собой -О-СН2-СН2- или -СН2-СН2-О-) и иногда 5 равно 1. В некоторых вариантах К³ представляет собой линейный РЕС фрагмент (например, содержащий примерно от 1 до 1000 РЕС звеньев), 5 равно 1 и г равно 1. Для разветвленных фрагментов 5 иногда меньше, больше или равно г (например, когда К³ представляет собой -О-СН2-СН₂- или -СН₂-СН₂-О-), иногда г равно 1, 5 равно 1 и р равно примерно от 1 до 1000 (например, р равно примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000).

В некоторых вариантах ΐ равно примерно от 5 до 100, иногда ΐ равно примерно от 5 до 50 или примерно от 5 до 25. В определенных вариантах ΐ равно примерно от 5 до 15, иногда ΐ равно примерно 10. В некоторых вариантах ΐ равно примерно 5 или меньше (например, ΐ равно 1). В определенных вариантах и равно примерно от 5 до 100, иногда и равно примерно от 5 до 50 или примерно от 5 до 25. В некоторых вариантах и равно примерно от 5 до 15, иногда и равно примерно 10. В определенных вариантах и равно примерно 5 или меньше (например, и равно 1).

В определенных вариантах К⁴ заместитель независимо представляет собой Н, С1-С2-алкил, -С1-С2алкокси (например, -ОСН3), -ΝΕΈ¹/ -ОН, -СН -СООН, -СООК¹, -Ц-Ч-алкил-НКК¹³, С1-С2-алкил-ОН, С|-С₂-алкил-С.’Н С1-С₂-алкил-СООН или С1-С₂-алкил-СООК\ В некоторых вариантах К⁴ является фа

- 3 019768 культативно замещенным 5-6-членным кольцом (например, арильным кольцом, гетероарильным кольцом, карбоциклическим кольцом, гетероциклическим кольцом). В определенных вариантах Я⁴ не является водородом и иногда Я⁴ не является гидроксилом.

В некоторых вариантах, относящихся к соединению, имеющему структуру согласно формуле I, т равно примерно 1, Я² представляет собой водород и η равно 4, с.| равно 1, г равно примерно 10 и 5 равно 1.

Каждый X⁴ может быть одинаковой или различной макромолекулой. В определенных вариантах макромолекула выбрана из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела, антигена, патогенного антигена (например, антиген 8. аигеик), белка (например, человеческий сывороточный альбумин или его фрагмент), глицерина, липида, фосфолипида (например, ΌΘΡΕ), сфинголипида и т.п. В некоторых вариантах макромолекулой является ΌΘΡΕ.

В одном варианте изобретение обеспечивает способ профилактики, ингибирования или лечения воспалительного или аутоиммунного состояния (нарушения или заболевания) (например, ревматоидного артрита) у субъекта, включающий введение соединения, имеющего следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемой соли либо его гидрата человеческому субъекту, нуждающемуся в этом, в количестве, эффективном для профилактики, ингибирования или лечения ревматоидного артрита.

Также обеспечена фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически приемлемую соль соединения, имеющего структуру согласно формулам I, II или III. Также здесь обеспечен способ профилактики, ингибирования или лечения воспалительного состояния у субъекта, который включает введение соединения, имеющего структуру согласно формулам I, II или III, субъекту, нуждающемуся в этом, в количестве, эффективном для профилактики, ингибирования или лечения состояния, например аутоиммунного нарушения или его симптомов. Также здесь обеспечен способ профилактики, ингибирования и лечения аутоиммунного состояния у субъекта, который включает введение соединения, имеющего структуру согласно формулам I, II или III, субъекту, нуждающемуся в этом, в количестве, эффективном для профилактики, ингибирования или лечения состояния или его симптомов, например воспаления.

Таким образом, изобретение обеспечивает соединения для применения в медицинской терапии, а именно агенты, которые предупреждают, ингибируют или лечат воспалительные нарушения или заболевания, например ревматоидный артрит или рак, факультативно в сочетании с другими соединениями. Соответственно, соединения изобретения являются эффективными для профилактики, ингибирования или лечения аутоиммунного нарушения или заболевания, воспалительного нарушения или заболевания, или рака.

Также здесь обеспечено применение соединений для производства медицинских препаратов для профилактики, ингибирования или лечения воспалительных и/или аутоиммунных нарушений или заболеваний, или рака. В одном варианте изобретение обеспечивает способы профилактики, ингибирования или лечения рака у субъекта, который включает введение соединения, имеющего структуру согласно формулам I, II или III, субъекту, нуждающемуся в этом, в количестве, эффективном для профилактики, ингибирования или лечения рака. В одном варианте соединение изобретения вводится субъекту с раковым заболеванием, таким как лимфома Ходжкина, неходжскинская лимфома, лейкемия, множественная миелома или опухоль мозга, при котором показаны кортикостероиды, например дексаметазон, преднизилон, метилпреднизолон или гидрокортизон. В одном варианте соединение изобретения вводится субъекту, имеющему риск ракового заболевания, развитие которого связано с воспалением, например рак кишечника. Таким образом, изобретение обеспечивает соединения, предназначенные для применения в медицинской терапии, а именно агенты, которые предупреждают, ингибируют или лечат раковые заболевания, факультативно в сочетании с другими соединениями. Таким образом, соединения технологии являются эффективными для профилактики, ингибирования или лечения разных аутоиммунных нарушений/заболеваний, воспалительных нарушений/заболевании и злокачественных новообразований.

- 4 019768

Перечень фигур

Чертежи иллюстрируют варианты изобретения и не являются ограничением. Следует отметить, что для ясности и простоты иллюстрации данные чертежи не сделаны в масштабе и что в некоторых случаях разные варианты изобретения могут показаться увеличенными или укрупненными для облегчения понимания конкретных вариантов.

В данном документе используются следующие сокращения. То11-подобный рецептор (ТЬК), липополисахарид (ЬР8), белок первичного ответа миелоидной дифференциации (88) (МуЭ88), мононуклеарные клетки костного мозга (ВМЭМ), мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), полиэтиленгликоль (РЕС), этанол (ЕЮН), тетрагидрофуран (ТНЕ), 1,2-диолеоил-5и-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ΌΟΡΕ), Ν-Ν-диметилметанамид (ЭМЕ), О-(7-азабензотриазол-1-ил)-Х^№,№-тетраметилурония гексафторфосфат (НАТО), дихлорметан (ЭСМ), триэтиламин (ТЕА), плазмацитоидные дендритные клетки (рЭС). овальбумин (ОУА), мышиный сывороточный альбумин (М8А), человеческий сывороточный альбумин (Н8А) и иммуноглобулин (1д).

Фиг. 1 иллюстрирует схему, которую использовали для синтеза липид- (6), РЕС- (8) или липид-РЕС (9) ТЬК7 конъюгатов. (6), (8) и (9) относятся к обозначениям соединений.

Фиг. 2А-2Э отражают результаты иммунологической характеристики ίη νίίτο конъюгатов ТЬК7 в мышиных макрофагах. Фиг. 2Е отражает результаты оценки контаминации эндотоксином с использованием не отвечающих на ЬР8 макрофагов мутантного и дикого типов.

Фиг. 3А, 3В отражают результаты иммунологической характеристики ίη νίίτο конъюгатов ТЬК7 в человеческих РВМС.

Фиг. 4А, 4В иллюстрируют кинетику индукции провоспалительных цитокинов конъюгатами ТЬК7 ίη νίνο.

Фиг. 5А-5С иллюстрируют адъювантные свойства (например, способность инициировать иммунный ответ) конъюгатов ТЬК.7 ίη νίνο.

Фиг. 6А-6С отражают результаты оценки возможных побочных эффектов конъюгатов ТЬК7.

Фиг. 7А, 7В иллюстрируют снижение перитонеальной инфильтрации нейтрофилами путем обработки с помощью 1У136 (свободный фармакофор) и 1У282 (соединение 8).

Фиг. 8 иллюстрирует эффект обработки 1У282 (соединение (8)) на индуцированный экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ).

Фиг. 9А-9Е показывает ίη νίίτο активность конъюгатов агониста ТЬК7 при изменении длин цепей на клетки №кВЬ1а КАА 264.7 и макрофаги костного мозга (ВМЭМ).

Фиг. 10А-10С отражает ίη νίνο фармакодинамику конъюгатов агонист ТЬК7-РЕС, введенных мышам.

Фиг. 11А, 11В иллюстрируют противовоспалительные эффекты 1У282, вводимого ежедневно через зонд (А) или подкожной инъекцией (В), в модели артрита, инициированного переносом сыворотки.

Фиг. 12А, 12В показывают противовоспалительный эффект конъюгатов агонист ТЬК7-РЕС в модели артрита, индуцированного тиогликолятом.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Обеспечены низкомолекулярные конъюгаты, которые являются агонистами или антагонистами одного или более ШИ-подобных рецепторов. Такие конъюгаты могут быть использованы различными способами, включающими, но без ограничения, лечение состояний, таких как, например, аутоиммунные, воспалительные и клеточные пролиферативные нарушения или заболевания.

Соединения.

Известны низкомолекулярные модуляторы ТЬК. Примеры низкомолекулярных соединений описаны в Американском патенте 6329381, выданном 11 декабря 2001 г., вытекающем из заявки на патент 09/555292, поданной 26 мая 2000 г., и в РСТ/Ь82006/032371, поданной 21 августа 2006 г. (опубликованной как АО 2007/024707 1 марта 2007 г.); РСТ/И82008/001631, поданной 7 февраля 2008 г. (опубликована как АО 2008/115319 25 сентября 2008 г.); РСТ/Ь807/009840, поданной 23 апреля 2007 г. (опубликована как АО 2007/142755 13 декабря 2007 г.); и Американской предварительной заявки 61/026999, поданной 7 февраля 2008 г.

Установлено, что определенные низкомолекулярные агонисты ТЬК (например, называемые здесь как низкомолекулярная мишень) могут быть конъюгированы с одним или более фрагментами РЕС, и полученный конъюгат может проявлять активность антагониста ТЬК. Существует несколько известных способов конъюгации низкомолекулярной мишени с одним или более фрагментами РЕС. Например, несколько РЕС реактантов являются коммерчески доступными и пригодными для конъюгации с разными реакционноспособными группами на низкомолекулярных соединениях (например, ΝΟΕ ΟοιροΓαίίοη, Япония (ΑοιΊά А1бе АеЬ ИКЬ ред-ά^ад.сοт/ред_р^οάисί/асί^νаίеά_ред.йίт1)). Использующийся здесь термин РЕС реактант относится к молекуле, которая соединена с низкомолекулярной мишенью в условиях, которые генерируют продукт конъюгации РЕС-низкомолекулярная мишень. Например, определенные РЕС реактанты, имеющие следующую структуру, могут взаимодействовать с разными целевыми группами на низкомолекулярном соединении: СН₃О(СН₂СН₂О)_п-Х, где X представляет собой реакционноспособную группу согласно табл. 1.

- 5 019768

Таблица 1

Реакционноспособная группа	Реакционноспособная группа на низкомолекулярной мишени
-СО-СН2СН2-СОО-18Н8*	-ЫНг, -ОН, -ЗН
-СО-СН2СН2СН2-СОО-ННЗ*	-ΝΗζ, -ОН, -ЗН
-СНг-СОО-ИНЗ*	-ΝΗ2> -ОН, -8Н
-СН2СН2СН2СН2СН2-СОО-1^Н8*	-ЫН2, -ОН. -8Н
-ССЬ-р-СбНд-ГЮг	-ΝΗ2
-СНгСНг-СНО	-νη2
-СНгСНгСНгМБ	-СООН
-С1[2СП2СН(ОС2Н5)2	-νη2
-СН2СН2ЗН-	8Н, -Ν-малеимидил, -СООН
<Η2ίΉ2€Ή2ΝΗα.χ::Η20Η2-Νмалеимидил	-8Н

ΝΗ8* представляет собой Ν-сукцинимидил.

В некоторых вариантах РЕС реактант имеет структуру СН₃О(СН₂СН₂О)_п-Х-МН8*, где X может быть -СОСН₂Сн₂СоО-, -СОСН₂СН₂СН₂СОО-, -СН₂сОо- и -(СН₂)₅СОО-. В определенных вариантах РЕС реактант имеет структуру

О

II

СНэО(СНгСНгОЬСО

ΝΟί

СНэО(СН_гСН?ОЬ-СМ2СН2СНр

СНгО(СН?СН:О)п-С ΗϊΟΗϊΟΗϊΝΗϊ

СНзО(СН2СНгО)п-СНгСНг5Н

О

СНзОССНгСНЮМСНгЫЧНСОССНгк—

О

В некоторых вариантах определенные РЕС реактанты являются бифункциональными. Примеры бифункциональных РЕС реактантов имеют структуру Х-(ОСН₂СН₂)_П-Х, где X представляет собой (Νсукцинимидилоксикарбонил)метил (СНзСОО-ΝΗΞ). сукцинимидилглутарат (-СОСН₂СН₂СН₂СОО-МН§), (№сукцинимидилоксикарбонил)пентил (-(СН^СОО-ΝΗδ), 3-(№малеимидил)пропанамидо, (-МНСОСН₂СН₂-МАЬ), аминопропил (-СН₂СН₂СН₂МН₂) или 2-сульфанилэтил (-СН₂СН₂8Н), в некоторых вариантах.

В определенных вариантах некоторые РЕС реактанты являются гетерофункциональными. Примеры гетерофункциональных РЕС реактантов имеют структуры

НС“О-(СНгСН2О)п-Х

ά*

НС-О-<СНгСИгОЕ-Х

Н^-О-ЮНгСКОБ-Х где X может представлять собой (№сукцинимидилоксикарбонил)метил (СН-СОО-ΝΗδ). сукцини- 6 019768 мидилглутарат (-СОСН_;СН_;СН_;СОО-НН8). (Ы-сукцинимидилоксикарбонил)иентил (-(СН_;)₅СОО-НН8). 3-(М-малеимидил)пропанамидо, (^НСОСН₂СН₂-МАЬ), 3-аминоироиил (-СНгСНгСНгИНг), 2сульфанилэтил (-СН₂СН₂8Н), 5-(Ы-сукцинимидилоксикарбонил)иентил (-(СН₂)₅СОО-№Н§) или рнитрофенилоксикарбонил, (-СО₂-р-С₆Н₄ЫО₂), в некоторых вариантах.

Также могут использоваться определенные разветвленные РЕС реактанты, а именно такие, которые имеют структуру

где X представляет собой спейсер и Υ представляет собой функциональную группу, включающую, но без ограничения, малеимид, амин, глутарил-ΝΉδ, карбонат-ΝΉδ или карбонат-р-нитрофенол, в некоторых вариантах. Преимуществом РЕС реактантов с разветвленной цепью является получение продуктов конъюгации, обладающих свойствами замедленного высвобождения.

Также РЕС реактант в определенных вариантах может быть гетерофункциональным реактантом, таким как

НОССН2СН₂О)„-СН2СН₂СН₂МН₂

НС1 Н₂Н-СН₂СН₂СН₂(ХСН₂СН_гО)₁₁-(СН₂)₅СООН и

НО(СН₂СН₂О)_П-СН₂СН₂СНС).

В некоторых вариантах могут использоваться Вос*-защищенный-амино-РЕС-карбоксил-№Н8 или малеимид-РЕС-карбоксил-№Н8 реактанты.

В определенных вариантах в качестве РЕС реактанта может быть использован гребенчатый полимер для введения некоторого количества РЕС звеньев в конъюгат. Пример гребенчатого полимера показан ниже.

(ДОК -?Ь

В контексте РЕС реактантов, специально показанных в данном разделе под названием Соединения, заместитель п или т, показанный только в РЕС реактантах, равен г, определенному выше для формулы I, II или III, в некоторых вариантах. РЕС реактант и/или продукт конъюгации РЕС, может иметь молекулярную массу, изменяющуюся примерно от 5 до 100,000 грамм на моль. В некоторых вариантах РЕС реактант и/или продукт конъюгации РЕС имеет среднюю или номинальную молекулярную массу, примерно, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000 или 90000 г на 1 моль. В некоторых вариантах РЕС фрагмент в указанном здесь соединении является гомогенным и молекулярная масса РЕС фрагмента является одинаковой для каждой молекулы конкретной партии соединения (например, К³ представляет собой одно из РЕС звеньев и г равно от 2 до 10).

В определенных вариантах один или более К⁴ заместителей заканчивают РЕС фрагмент (например, формула I; линейный или разветвленный РЕС фрагмент). Каждый К⁴ заместитель может быть одинаковым или разным, и в некоторых вариантах независимо может быть выбран из группы, состоящей из -№^№^N4^ -СН₂-СН₂-ОН, -СН₂-СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООК\ Линкером может быть любой пригодный линкер, включая линкер, описанный здесь.

Пригодный линкер может быть использован для образования конъюгатов (например, X², X³), и известно множество линкеров. Неограничивающие примеры линкеров, которые могут использоваться, включают следующие:

- 7 019768

Использующиеся здесь термины алкил, алкенил и алкинил включают моновалентные углеводородные радикалы с прямой цепью, разветвленной цепью и циклические, и их комбинации, которые содержат только С и Н, когда они являются незамещенными. Примеры включают метил, этил, изобутил, циклогексил, циклопентилэтил, 2-пропенил, 3-бутинил и подобные. Общее число атомов углерода в каждой такой группе в некоторых случаях описано здесь, например, когда группа может содержать до десяти атомов углерода, это может быть представлено как 1-10С или С1-Сю или С_1-10. В случаях, когда допускается замена гетероатомами (как правило, Ν, О и 8) атомов углерода, как, например, в гетероалкильных группах, описывающие группу числа, несмотря на написание в виде, например, С₁-С₆, являются суммой числа атомов углерода в группе плюс число таких гетероатомов, которые включены в качестве заменителей атомов углерода в остове описываемого кольца или цепи.

Как правило, алкильные, алкенильные и алкинильные заместители изобретения содержат один 10С (алкил) или два 10С (алкенил или алкинил). Предпочтительно, чтобы они содержали один 8С (алкил) или два 8С (алкенил или алкинил). В некоторых случаях они содержат один 4С (алкил) или два 4С (алкенил или алкинил). Одна группа может включать более одного типа кратной связи или более одной кратной связи; такие группы включены в определение термина алкенил, когда они содержат по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод, и включены в определение термина алкинил, когда они содержат по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод.

Алкильные, алкенильные и алкинильные группы часто являются факультативно замещенными, при условии, что такое замещение химически целесообразно. Типичные заместители включают, но не ограничиваются, гало, =0, =Ν<Ν, =Ν-ΟΚ, =ΝΚ, ОК, ЫК₂, 8К, 8О₂К, 8О₂ЫК₂, ΝΚ8Ο₂Κ, ΝΚ€ΟΝΚ₂, ЫКСООК, ЫКСОК, СН СООК, СОЫК₂, ООСК, СОК и ΝΟ₂, где каждый К независимо представляет собой Н, С₁-С₈алкил, С₂-С₈-гетероалкил, С1-С₈-ацил, С₂-С₈-гетероацил, С₂-С₈-алкенил, С₂-С₈-гетероалкенил, С₂-С₈алкинил, С₂-С₈-гетероалкинил, С₆-С₁₀-арил или С₅-С1₀-гетероарил, каждый К является факультативно замещенным гало, =О, =Ν-0Ν, =К-ОК', =ЫК', ОК', ΝΒ.'₂, 8К', 8О₂К', 8О₂ЫК'₂, №'8О₂К', ИКСОМ’* ЫК'СООК', ЫК'СОК', СК, СООК', СОЫК'₂, ООСК', СОК' и ΝΟ₂, где каждый К' независимо представляет собой Н, С1-С₈-алкил, С₂-С₈-гетероалкил, С1-С₈-ацил, С₂-С₈-гетероацил, С₆-С1₀-арил или С₅-С₁₀гетероарил. Алкильные, алкенильные и алкинильные группы также могут быть замещенными С₁-С₈ацилом, С2-С8-гетероацилом, С6-С10-арилом или С5-С10-гетероарилом, каждый из которых может быть замещенным заместителями, которые пригодны для конкретной группы.

Ацетиленовые заместители представляют собой С₂-С₁₀-алкинильные группы, которые являются факультативно замещенными и имеют формулу -С^С-К1, где К1 представляет собой Н или С1-С₈-алкил, С2-С8-гетероалкил, С2-С8-алкенил, С2-С8-гетероалкенил, С2-С8-алкинил, С2-С8-гетероалкинил, С1-С8-ацил, С₂-С₈-гетероацил, С₆-С1₀-арил, С₅-С1₀-гетероарил, С₇-С1₂-арилалкил или С₆-С1₂-гетероарилалкил, и каждая К1 группа является факультативно замещенной одним или более заместителей, выбранных из гало, =О, =Ν-0Ν, =ЫК', ОК', ЫК'₂, 8К', 8О₂К', 8О₂ЫК'₂, ЫК'8О₂К', Ν^ΟΟΝ^, ЫК'СООК', ЫК'СОК',

0Ν, СООК', ΤΌΝΥ. ООСК', СОК' и ΝΟ₂, в которых каждый К' независимо представляет собой Н, С₁-С₆алкил, С₂-С₆-гетероалкил, С₁-С₆-ацил, С₂-С₆-гетероацил, С₆-С₁₀-арил, С₅-С₁₀-гетероарил, С₇-С₁₂арилалкил или С_6-12гетероарилалкил, каждый из которых является факультативно замещенным одной или более группами, выбранными из гало, С₁-С₄-алкила, С₁-С₄-гетероалкила, С₁-С₆-ацила, С₁-С₆гетероацила, гидрокси, амино и =О; и в которых два К' могут быть связаны для формирования 3-7членного кольца, факультативно содержащего до трех гетероатомов, выбранных из Ν, О и 8. В некоторых вариантах К в -С=С-К1 представляет собой Н или Ме.

Гетероалкил, гетероалкенил и гетероалкинил и т.п. определены аналогично соответствующим гидрокарбильным (алкильным, алкенильным и алкинильным) группам, но настоящие термины относятся к группам, которые содержат от одного до трех О, 8 или Ν гетероатомов или их комбинацию в остатке остова; таким образом, по меньшей мере один атом углерода соответствующей алкильной, алке

- 8 019768 нильной или алкинильной группы заменен одним из указанных гетероатомов для образования гетероалкильной, гетероалкенильной или гетероалкинильной групп. Типичные и предпочтительные размеры гетероатомов алкильной, алкенильной и алкинильной групп в целом являются такими же, как для соответствующих гидрокарбильных групп, и заместители, которые могут присутствовать на гетероформах, являются такими, которые описаны выше для гидрокарбильных групп. Из соображений химической стабильности должно быть понятно, что если не указано иное, такие группы не включают более двух смежных гетероатомов, за исключением, когда оксо группа присутствует на N или 8, как в нитро или сульфонильной группе.

Несмотря на то что использующийся здесь термин алкил включает циклоалкильную и циклоалкилалкильную группы, термин циклоалкил может использоваться здесь для описания карбоциклической неароматической группы, которая соединена посредством кольцевого атома углерода, и циклоалкилалкил может использоваться для описания карбоциклической неароматической группы, которая соединена с молекулой через алкильный линкер. Аналогично, гетероциклил может использоваться для описания неароматической циклической группы, которая содержит по меньшей мере один гетероатом в качестве члена кольца, и которая соединена с молекулой посредством кольцевого атома, которым может являться С или Ν; и гетероциклилалкил может использоваться для описания такой группы, которая соединена с другой молекулой с помощью линкера. Размеры и заместители, которые являются пригодными для циклоалкильной, циклоалкилалкильной, гетероциклильной и гетероциклилалкильной групп являются такими же, которые описаны выше для алкильных групп. Использующиеся здесь данные термины также включают кольца, которые содержат двойную связь или две, при условии, что кольцо не является ароматическим.

Использующийся здесь термин ацил охватывает группы, включающие алкильный, алкенильный, алкинильный, арильный или арилалкильный радикал, присоединенный к одному или двум положениям со свободными валентностями карбонильного атома углерода, и гетероацил относится к соответствующим группам, в которых по меньшей мере один атом углерода, отличный от карбонильного углерода, заменен гетероатомом, выбранным из Ν, О и 8. Таким образом, гетероацил включает, например, -С(=О)ОК и -ί’(=ϋ)ΝΡ_;. а также -С(=О)-гетероарил.

Ацильные и гетероацильные группы присоединены к любой группе или молекуле, к которой они присоединены посредством открытой валентности карбонильного атома углерода. Как правило, они представляют собой С|-С₈-ацильные группы, которые включают формил, ацетил, пивалоил и бензоил, и С₂-С₈-гетероацильные группы, которые включают метоксиацетил, этоксикарбонил и 4-пиридиноил. Гидрокарбильные группы, арильные группы и гетероформы таких групп, которые включают ацильную или гетероацильную группу, могут быть замещенными заместителями, описанными здесь как в целом пригодные заместители для каждого из соответствующих компонентов ацильной или гетероацильной группы.

Ароматический фрагмент или арильный фрагмент относится к моноциклическому или конденсированному бициклическому фрагменту, имеющему хорошо известные характеристики ароматичности; примеры включают фенил и нафтил. Аналогично, гетероароматический и гетероарильный относятся к таким моноциклическим или конденсированным бициклическим кольцевым системам, которые содержат в качестве членов кольца один или более гетероатомов, выбранных из О, 8 и Ν. Включение гетероатома обеспечивает ароматичность в 5-членных кольцах, а также 6-членных кольцах. Типичные гетероароматические системы включают моноциклические С₅-С₆-ароматические группы, такие как пиридил, пиримидил, пиразинил, тиенил, фуранил, пирролил, пиразолил, тиазолил, оксазолил и имидазолил, и конденсированные бициклические фрагменты, образованные слиянием одной из этих моноциклических групп с фенильным кольцом или с любой из гетероароматических моноциклических групп с образованием С₈-С₁о-бициклической группы, такой как индонил, бензимидазолил, индазолил, бензотриазолил, изохинолил, хинолил, бензотиазолил, бензофуранил, пиразолопиридил, хиназолинил, хиноксалинил, циннолинил и т.п. Любая моноциклическая или конденсированная кольцевая бициклическая система, которая имеет характеристики ароматичности на основании распределения электронов по кольцевой системе, является включенной в данное определение. Термин также включает бициклические группы, в которых, по меньшей мере, кольцо, которое напрямую присоединено к остатку молекулы, имеет характеристики ароматичности. Как правило, кольцевые системы содержат 5-12 атомов в гетероцикле. Предпочтительно, чтобы моноциклические гетероарилы содержали 5-6 атомов в гетероцикле и бициклические гетероарилы содержали 8-10 атомов в гетероцикле.

Арильные и гетероарильные фрагменты могут быть замещенными разными заместителями, включающими С₁-С₈-алкил, С₂-С₈-алкенил, С₂-С₈-алкинил, С₅-С₁₂-арил, С₁-С₈-ацил и их гетероатомы, каждый из которых может быть, кроме того, замещенным; другие заместители для арильных и гетероарильных фрагментов включают гало, ОК, ΝΚ₂, 8К, 8О₂К, 8ϋ₂ΝΚ₂, ΝΚ8ϋ₂Β, Ν^ΤΌΝ^^ Ν^ί-ΌΟΗ, Ν^ί-ΌΡ, СН СООР, ^Ν^, СОСК, СОК и NΟ₂, где каждый К независимо представляет собой Н, С₁-С₈-алкил, С₂-С₈гетероалкил, С₂-С₈-алкенил, С₂-С₈-гетероалкенил, С₂-С₈-алкинил, С₂-С₈-гетероалкинил, С₆-С₁₀-арил, С₅С₁₀-гетероарил, С₇-С₁₂-арилалкил или С₆-С₁₂-гетероарилалкил, и каждый К является факультативно замещенным, как описано выше для алкильных групп. Группы заместителей на арильной или гетероариль

- 9 019768 ной группе, как известно, могут быть к тому же замещенным группами, описанными здесь, пригодными для каждого типа таких заместителей или для каждого компонента заместителя. Таким образом, например, арилалкильный заместитель может быть замещенным на арильную часть заместителями, описанными здесь, что характерно для арильных групп, и может быть к тому же замещенным на алкильную часть заместителями, описанными здесь, что характерно или приемлемо для алкильных групп.

Аналогично, арилалкил и гетероарилалкил относятся к ароматическим и гетероароматическим кольцевым системам, которые присоединены к их месту присоединения посредством связующей группы, такой как алкилен, включая замещенные или незамещенные, насыщенные или ненасыщенные, циклические или ациклические линкеры. Как правило, линкером является С|-С₈-алкил или его гетероформа. Данные линкеры могут также включать карбонильную группу, делая их, таким образом, способными обеспечить заместители, как ацильный или гетероацильный фрагмент. Арильное или гетероарильное кольцо в арилалкильной или гетероарилалкильной группе может быть замещенным такими же заместителями, которые описаны выше для арильных групп. Предпочтительно, чтобы арилалкильная группа включала фенильное кольцо, факультативно замещенное группами, определенными выше для арильных групп, и С₁-С₄-алкилен, который является незамещенным или замещенным одной или двумя С₁-С₄алкильными группами или гетероалкильными группами, в которых алкильные или гетероалкильные группы могут быть факультативно циклизированы с образованием кольца, такого как циклопропан, диоксолан или оксациклопентан. Аналогично, гетероарилалкильная группа предпочтительно включает С₅С₆-моноциклическую гетероарильную группу, которая является факультативно замещенной группами, описанными выше в качестве заместителей, как правило, на арильных группах, и С₁-С₄-алкилен, который является незамещенным или замещенным одной или двумя С₁-С₄-алкильными группами или гетероалкильными группами, или включает факультативно замещенное фенильное кольцо или С₅-С₆моноциклический гетероарил и С₁ -С₄-гетероалкилен, который является незамещенным или замещенным одной или двумя С₁-С₄-алкильными или гетероалкильными группами, где алкильные или гетероалкильные группы могут факультативно циклизироваться с образованием кольца, такого как циклопропан, диоксолан или оксациклопентан.

В случае, когда арилалкильная или гетероарилалкильная группа описана как факультативно замещенная, заместители могут быть на алкильной или гетероалкильной части, или на арильной или гетероарильной части группы. Заместители, факультативно присутствующие на алкильной или гетероалкильной части, являются такими, которые в целом описаны выше для алкильных групп; заместители, факультативно присутствующие на арильной или гетероарильной части, являются такими, которые в целом описаны выше для арильных групп.

Использующиеся здесь арилалкильные группы являются гидрокарбильными группами, если они незамещенные, и описаны общим числом атомов углерода в кольце и алкилене или аналогичном линкере. Таким образом, бензильная группа представляет собой С₇-арилалкильную группу и фенилэтил представляет собой С₈-арилалкил.

Описанный выше гетероарилалкил относится к фрагменту, включающему арильную группу, которая присоединена посредством линкерной группы, и отличается от арилалкила тем, что по меньшей мере один атом кольца арильного фрагмента или один атом в линкерной группе является гетероатомом, выбранным из Ν, О и 8. Гетероарилалкильные группы описаны здесь в соответствии с общим числом атомов в кольце и линкере, и включают арильные группы, связанные посредством гетероалкильного линкера; гетероарильные группы, связанные посредством гидрокарбильного линкера, такого как алкилен; и гетероарильные группы, связанные посредством гетероалкильного линкера. Таким образом, например, С₇-гетероарилалкил будет включать пиридилметил, фенокси и Ν-пирролилметокси.

Использующийся здесь алкилен относится к бивалентной гидрокарбильной группе; так как он является бивалентным, он может связывать вместе две другие группы. Как правило, он относится к -(СН₂)_П-, где η равно 1-8 и предпочтительно η равно 1-4, но если специально оговорено, алкилен может быть также замещенным другими группами и иметь другую длину, и не требуется открытых валентностей на противоположных концах цепи. Таким образом, -СН(Ме)- и -С(Ме)₂- могут также называться алкиленами, также как циклическая группа, такая как циклопропан-1,1-диил. В случаях, когда алкиленовая группа является замещенной, заместители включают такие, которые обычно присутствуют на алкильных группах, как описано здесь.

В целом, любая алкильная, алкенильная, алкинильная, ацильная, или арильная, или арилалкильная группа, или любая гетероформа одной из этих групп, которая содержится в заместителе, может сама по себе быть факультативно замещенной дополнительными заместителями. Природа данных заместителей аналогична заместителям, которые перечислены в отношении самих первичных заместителей, если заместители не описаны иначе. Таким образом, в случаях, когда вариантом, например, В² является алкил, данный алкил может быть факультативно замещенным оставшимися заместителями, приведенными в качестве вариантов для В², если это имеет химический смысл и не нарушает предельный размер, предусмотренный для самого алкила; например, алкил, замещенный алкилом или алкенилом, будет только расширять верхний предел числа атомов углерода для этих вариантов, и не является включенным. Однако, алкил, замещенный арилом, амино, алкокси, =О и подобными, будет включен в объем изобретения, и

- 10 019768 атомы этих групп заместителей не учитывают в числе, которое используется для описания алкила, алкенила и других описанных групп. Если не указано число заместителей, то каждая такая алкильная, алкенильная, алкинильная, ацильная или арильная группа может быть замещенной числом заместителей согласно ее свободными валентностями; в частности, любая из этих групп может быть замещенной, например, атомами фтора в любой или во всех ее свободных валентностях.

Использующийся здесь термин гетероформа относится к производному группы, такой как алкил, арил или ацил, в которой по меньшей мере один атом углерода указанной карбоциклической группы заменен гетероатомом, выбранным из Ν, О или 8. Таким образом, гетероформами алкила, алкенила, алкинила, ацила, арила и арилалкила являются соответственно гетероалкил, гетероалкенил, гетероалкинил, гетероацил, гетероарил и гетероарилалкил. Следует понимать, что, как правило, не более чем два атома Ν, О или 8 соединены последовательно, за исключением тех случаев, когда оксо группа присоединена к N или 8 с образованием нитро или сульфонильной группы. Гетероформный фрагмент в отдельных случаях называется здесь как Не!.

Использующийся здесь термин гало или галоген включает фтор, хлор, бром и йод. Чаще всего предпочтительными являются фтор и хлор. Использующийся здесь амино относится к ΝΗ₂, но в случаях, когда амино описан как замещенный или факультативно замещенный, термин включает ΝΚ'Κ, где каждый К' и К независимо представляет собой Н или является алкильной, алкенильной, алкинильной, ацильной, арильной или арилалкильной группой, или гетероформой одной из этих групп, и каждая из алкильной, алкенильной, алкинильной, ацильной, арильной или арилалкильной групп, или гетероформа одной из этих групп является факультативно замещенной заместителями, описанными здесь как пригодные для соответствующей группы. Термин также включает формы, в которых К' и К связаны вместе с образованием 3-8-членного кольца, которое может быть насыщенным, ненасыщенным или ароматическим, и которое содержит 1-3 гетероатомов, независимо выбранных из Ν, О и 8 в качестве членов кольца, и которое является факультативно замещенным заместителями, описанными как пригодные для алкильных групп или, если ΝΚ'Κ является ароматической группой, то эта группа является факультативно замещенной заместителями, описанными как типичные для гетероарильных групп.

Использующийся здесь термин карбоцикл относится к циклическому соединению, содержащему только атомы углерода в кольце, в то время как гетероцикл относится к циклическому соединению, содержащему гетероатом. Карбоциклические и гетероциклические структуры охватывают соединения, имеющие моноциклические, бициклические или множественные кольцевые системы. Использующийся здесь термин гетероатом относится к любому атому, который не является углеродом или водородом, такому как азот, кислород или сера. Иллюстративные примеры гетероциклов включают, но без ограничения, тетрагидрофуран, 1,3-диоксолан, 2,3-дигидрофуран, пиран, тетрагидропиран, бензофуран, изобензофуран, 1,3-дигидроизобензофуран, изоксазол, 4,5-дигидроизоксазол, пиперидин, пирролидин, пирролидин-2-она, пиррол, пиридин, пиримидин, октагидропирроло[3,4-Ь]пиридин, пиперазин, пиразин, морфолин, тиоморфолин, имидазол, имидазолидин-2,4-диона, 1,3-дигидробензимидазол-2-она, индол, тиазол, бензотиазол, тиадиазол, тиофен, тетрагидротиофен-1,1-диоксид, диазепин, триазол, гуанидин, диазабицикло[2.2.1]гептан, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептан, 2,3,4,4а,9,9а-гексагидро-1Н-бета-карболин, оксиран, оксетан, татрагидропиран, диоксан, лактоны, азиридин, азетидин, пиперидин, лактамы и может также охватывать гетероарилы. Другие иллюстративные примеры гетероарилов включают, но без ограничения, фуран, пиррол, пиридин, пиримидин, имидазол, бензимидазол и триазол.

В некоторых случаях описанные здесь соединения содержат один или более хиральных центров. Изобретение включает каждую из изолированных стереоизомерических форм, а также смеси стереоизомеров с изменяющейся степенью хиральной чистоты, включая рацемические смеси. Также охваченными являются разные диастереомеры и таутомеры, которые могут быть образованы. Соединения изобретения могут также существовать в одной или более таутомерных формах. Например, когда К представляет собой -ОН, описанное здесь соединение может существовать в одной или более таутомерных формах.

Использующийся здесь термин факультативно замещенный указывает, что конкретная группа или группы, описанные здесь, могут не содержать неводородные заместители, или группа или группы могут содержать один или более неводородных заместителей. Если не указано иначе, общее число таких заместителей, которые могут присутствовать, равно количеству атомов Н, присутствующих на незамещенной форме описываемой группы. В случаях, когда факультативный заместитель присоединен посредством двойной связи, такой как карбонильный кислород (=0), группа захватывает две свободные валентности, таким образом, общее число заместителей, которое может быть включено, является уменьшенным в соответствии с числом свободных валентностей.

Фармацевтические композиции и составы.

Описанное здесь соединение может быть приготовлено в виде фармацевтически приемлемой соли. Использующийся здесь термин фармацевтически приемлемая соль относится к производному раскрытых соединений, в которых родительское соединение модифицировано путем приготовления их солей с кислотами и основаниями. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но без ограничения, соли минеральных или органических кислот по основным остаткам, таким как амины; соли щелочных металлов или органические соли по кислым остаткам, таким как карбоновые кислоты и т.п. Фармацевти

- 11 019768 чески приемлемые соли включают обычно используемые нетоксичные соли или четвертичные аммониевые соли родительского соединения, образованные, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот.

Например, обычно используемые нетоксичные соли включают такие, которые получены из неогранических кислот, таких как соляная, бромисто-водородная, серная, сульфаминовая, фосфорная, азотная и подобных; и соли, приготовленные из органических кислот, такие как уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, стеариновая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, памовая, малеиновая, гидроксималеиновая, фенилуксусная, глутаминовая, бензойная, салициловая, сульфаниловая, 2ацетоксибензойная, фумаровая, толуолсульфоновая, метансульфоновая, этандисульфоновая, щавелевая, изэтионовая и подобные. В других примерах типичные нетоксичные соли включают такие соли, которые получены из оснований, таких как гидроксид калия, гидроксид натрия, гидроксид аммония, кофеин, разные амины и подобные. Фармацевтически приемлемые соли могут быть синтезированы традиционными химическими способами из родительского соединения, которое содержит основную или кислую группу. В целом, такие соли могут быть приготовлены путем взаимодействия свободных кислых или основных форм этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде, или в органическом растворителе, или в смеси их обоих; в целом, предпочтительной является неводная среда, такая как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Перечень пригодных солей содержится в ЕеттЩоп'б Рйаттасеи11са1 Зеюпесб. 17^4Ь сб.. Маск РиЬйкЫид Сотрапу, ЕаЧоп. РА, р. 1418 (1985), раскрытие которого представлено здесь посредством отсылки.

Использующийся здесь термин фармацевтически приемлемый относится к соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые являются, в пределах объема тщательной медицинской оценки, пригодными для использования в контакте с тканями человека и животных без избыточной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или жалоб, соизмеримых с приемлемым соотношением польза/риск.

Термины стабильное соединение и стабильная структура указывают на соединение, которое является достаточно устойчивым для того, чтобы выдержать выделение до приемлемой степени чистоты из реакционной смеси, и составления в эффективный терапевтический агент. Стабильные соединения предусмотрены здесь для применения в описанных способах терапии.

Описанное здесь соединение может быть составлено в комбинации с одним или более других агентов. Один или более других агентов могут включать, без ограничения, другое описанное здесь соединение, агент против клеточной пролиферации (например, химиотерапевтический), противовоспалительный агент и антиген.

Описанное здесь соединение может быть составлено в виде фармацевтической композиции и вводиться хозяину-млекопитающему, такому как пациент - человек или животное, в разных формах, приспособленных для выбранного режима введения, например орального или парентерального, внутривенного, внутримышечного, местного или подкожного режимов. В определенных вариантах композиция вводится местно, например внутрипузырно. Композиция часто включает разбавитель, а также, в некоторых случаях, адъювант, буфер, консервант и т.п. Соединение может также вводиться в виде липосомальной композиции или, в определенных вариантах, в виде микроэмульсии. Также разработаны разные системы с замедленным высвобождением лекарственных средств, которые могут применяться к описанному здесь соединению. См., например, патент США 5624677, способы которого включены здесь посредством отсылки.

Таким образом, соединения могут вводиться системно, например орально, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как инертный разбавитель или усваиваемый пищевой носитель.

Описанные здесь соединения могут быть заключены в желатиновые капсулы с твердой или мягкой оболочкой, могут быть прессованы в таблетки или введены напрямую с пищей диеты пациента. Для орального терапевтического введения активное соединение может быть объединено с одним или более вспомогательных веществ и применяться в форме таблеток для проглатывания, таблеток для медленного растворения в щечном кармане, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и подобных. Такие композиции и составы должны содержать по меньшей мере 0,1% активного соединения. Процент композиций и составов может, безусловно, изменяться и, как правило, составляет примерно от 2 до 60% массы заданной стандартной лекарственной формы. Количество активного соединения в таких терапевтически эффективных композициях является таким, которое обеспечивает получение эффективного уровня дозы.

Таблетки, пастилки, драже, капсулы и подобные могут также содержать следующее: связующие, такие как трагант, камедь, кукурузный крахмал или желатин; вспомогательные вещества, такие как дикальция фосфат; дезинтеграторы, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновую кислоту и подобные; лубрикант, такой как стеарат магния; и может быть добавлен подсластитель, такой как сахароза, фруктоза, лактоза или аспартам, или ароматизатор, такой как мята перечная, масло грушанки или вишневый ароматизатор. В случае, когда стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать, дополнительно к материалам указанного выше типа, жидкий носитель,

- 12 019768 такой как растительное масло или полиэтиленгликоль. Другие различные материалы могут присутствовать в качестве покрытий или для изменения физической формы твердой стандартной лекарственной формы. Например, таблетки, драже или капсулы могут быть покрыты желатином, воском, шеллаком или сахаром и подобными. Сироп или эликсир может содержать активное соединение, сахарозу или фруктозу в качестве подсластителя, метил и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и ароматизатор, такой как вишневый или апельсиновый ароматизатор. Конечно, любой материал, который используется для приготовления любой стандартной лекарственной формы, должен быть фармацевтически приемлемым и главным образом нетоксичным в применяемых количествах. К тому же, активное соединение может быть внедрено в составы и устройства с замедленным высвобождением.

Активное соединение может вводиться путем инфузии или инъекции. Растворы активного соединения или его фармацевтически приемлемой соли могут быть приготовлены в воде, факультативно смешанной с нетоксичным поверхностно-активным веществом. Дисперсии также могут быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, триацетине и их смесях, а также в маслах. В обычных условиях хранения и применения данные составы содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтическая лекарственная форма может включать стерильный водный раствор или дисперсию, или стерильный порошок, включающий активный компонент, который адаптирован для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий, и факультативно инкапсулирован в липосомы. Готовая лекарственная форма иногда представляет собой стерильную жидкость и является стабильной в условиях производства и хранения. Жидкий носитель или наполнитель может являться растворителем или жидкой дисперсионной средой, включающей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкие полиэтиленгликоли и подобные), растительные масла, нетоксичные эфиры глицерина и их пригодные смеси. Собственная текучесть может поддерживаться, например, с помощью образования липосом, путем сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсий или с помощью использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть осуществлено с помощью разных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Изотонический агент, например сахар, буфер или хлорид натрия, является включенным в некоторые варианты. Пролонгированную абсорбцию инъецируемой композиции можно осуществить путем использования в композиции задерживающих абсорбцию агентов, например моностеарата алюминия и желатина. Стерильные растворы часто готовят путем внедрения активного соединения в требуемом количестве в соответствующий растворитель, иногда с одним или более других ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизацией путем фильтрации. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов, иногда использующимися способами приготовления являются методы вакуумной сушки и лиофилизации, которые позволяют получить порошок активного ингредиента дополнительно к любому дополнительно необходимому ингредиенту, присутствующему в предварительно стерильно отфильтрованных растворах. Для местного введения соединение данного изобретения может применяться в чистой форме, например, когда находится в жидкой форме. Однако, в целом, желательно вводить соединение в виде композиции или состава в комбинации с приемлемым носителем, который может быть твердым веществом или жидкостью. Эффективные твердые носители включают высокодисперсные твердые вещества, такие как тальк, глину, микрокристаллическую целлюлозу, кремнезем, глинозем и т.п. Эффективные жидкие носители включают воду, спирты, или гликоли, или водно-спиртовые/гликольные смеси, в которых соединения настоящего изобретения могут растворяться или диспергироваться на эффективных уровнях, факультативно с добавлением нетоксичных поверхностно-активных веществ. Адъюванты, такие как ароматизаторы и дополнительные антимикробные агенты, могут быть добавлены для оптимизации свойств для заданного применения. Полученные жидкие композиции могут наноситься на гигроскопические прокладки, которые используются для пропитки повязок и других перевязочных материалов, или распыляться на пораженную область с помощью дозирующих или аэрозольных распылителей.

Сгустители, такие как синтетические полимеры, жирные кислоты, соли жирных кислот и эфиров, жирные спирты, модифицированные целлюлозы или модифицированные минеральные материалы также могут использоваться с жидкими носителями для образования легко намазывающихся паст, гелей, мазей, мыла и подобных, для непосредственного нанесения на кожу потребителя. Эффективные дозировки соединений могут быть установлены путем сравнения их ίη νίίτο и ίη νίνο активности в животных моделях. Способы экстраполяции эффективных дозировок у мышей и других животных на человека известны в данной области; например, см. патент США 4938949. Способность соединения настоящего изобретения действовать в качестве агониста ТБВ или антагониста ТБВ может быть определена с помощью известных фармакологических моделей, включая методики, раскрытые Ьее с1 а1., ΡΝΑ8, 100:6646 (2003). Как правило, концентрация соединения(й) в жидкой композиции будет составлять примерно 0,1-25 мас.%, предпочтительно примерно 0,5-10 мас.%. Концентрация в полутвердой или твердой композиции, такой как гель или порошок, будет составлять примерно 0,1-5 мас.%, предпочтительно примерно 0,5-2,5 мас.%.

Количество соединения или его активной соли или производного, требуемое для применения в лечении, будет изменяться не только в зависимости от выбранной конкретной соли, но также от режима

- 13 019768 введения, природы заболевания, подлежащего лечению, возраста и состояния пациента, и будет в конечном итоге находиться на рассмотрении лечащего терапевта или клинициста. Как правило, пригодная доза находится в диапазоне примерно от 0,5 до 100 мг/кг, например от 10 до 75 мг/кг массы тела в день, такая как от 3 до 50 мг на 1 кг массы тела реципиента в день, и часто находится в диапазоне от 6 до 90 мг/кг/день или примерно от 15 до 60 мг/кг/день. Соединение может удобно вводиться в виде стандартной лекарственной формы и содержит, например, от 5 до 1000 мг, или от 10 до 750 мг, или от 50 до 500 мг активного ингредиента на стандартную лекарственную форму. Активный ингредиент может вводиться для достижения пика концентрации в плазме активного соединения, составляющей примерно от 0,01 до 100 пМ, примерно от 0,5 до 75 пМ, примерно от 1 до 50 пМ или примерно от 2 до 30 пМ. Такие концентрации могут быть достигнуты, например, путем внутривенной инъекции от 0,05 до 5% раствора активного ингредиента, факультативно в солевом растворе, или орального введения в виде болюса, содержащего примерно 1-100 мг активного ингредиента. Желательные уровни содержания в крови могут поддерживаться непрерывной инфузией для обеспечения примерно 0,01-5,0 мг/кг/ч или периодическими инфузиями, содержащими примерно 0,4-15 мг/кг активного ингредиента(ов). Требуемая доза может удобно присутствовать в виде однократной дозы или в виде разделенных общих доз, вводимых с соответствующими интервалами, например две, три, четыре или более доз в день. Субдоза может к тому же быть разделена, например, на ряд отдельных введений с небольшими промежутками; такие как множественные ингаляции из инсуффлятора или путем нанесения множества капель в глаза.

Лечение.

Использующиеся здесь термины лечить и лечение относятся к (ί) профилактике патологического состояния от возникновения (например, профилактике); (ίί) ингибированию патологического состояния или прекращению его развития; (ш) обезболиванию патологического состояния; и/или (ίν) улучшению, облегчению, уменьшению и удалению симптомов состояния. Кандидатная молекула или соединение, описанное здесь, может входить в состав или лекарственный препарат в терапевтически эффективном количестве, которое является таким количеством, которое может привести к биологическому эффекту (например, ингибированию воспаления), или привести к улучшению, облегчению, уменьшению и затуханию симптомов состояния, например заболевания. Термины также могут относиться к снижению или остановке скорости пролиферации клеток (т.е. замедлению или остановке роста опухоли) или уменьшению числа пролиферирующих злокачественных клеток (т.е. удаление части или всей опухоли). Данные термины также применимы к снижению титра микроорганизма в системе (т.е. клетки, ткани или субъект), пораженной микроорганизмом, снижению скорости размножения микробов, уменьшению количества симптомов или действию симптома, связанного с микробной инфекцией, и/или удалению заметного количества микробов из системы. Примеры микроорганизмов включают, но без ограничения, вирус, бактерию и грибок.

Использующийся здесь термин терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения, обеспеченного здесь, или количеству комбинации соединений, обеспеченных здесь, для лечения или профилактики заболевания или нарушения, или для лечения симптома заболевания или нарушения у субъекта. Использующиеся здесь термины субъект и пациент относятся к индивидууму, который будет получать или получал лечение (т.е. введение соединения, описанного здесь) согласно описанному здесь способу.

Описанное здесь соединение может вводить субъекту, нуждающемуся в этом, для возможной профилактики, ингибирования или лечения одного или более воспалительных нарушений. Использующиеся здесь термины лечение, терапия и терапевтический эффект могут относиться к уменьшению, ингибированию или остановке (предупреждению) реакции на воспаление (т.е. замедлению или перебоям выработки антитела или количества антител на специфический антиген), снижению количества воспаленной ткани и смягчению, полному или частичному, воспалительного состояния. Условия воспаления включают, без ограничения, аллергию, астму, аутоиммунное нарушение, хроническое воспаление, хроническое воспаление предстательной железы, гломерулонефрит, гиперчувствительность, воспалительные заболевания кишечника, миопатию (т.е. в комбинации с системным склерозом, болезнью Вагнера и/или миозит с тельцами включения), воспаление тазовых органов, реперфузионное повреждение, ревматоидный артрит, отторжение трансплантата, васкулит и нарушения лейкоцитов (т.е. синдром ЧедиакаХигаси, хронический гранулематоз). Определенные аутоиммунные нарушения также являются воспалительными нарушениями (например, ревматоидный артрит). В некоторых вариантах воспалительное нарушение является выбранным из группы, состоящей из хронического воспаления, хронического воспаления предстательной железы, гломерулонефрита, гиперчувствительности, миопатии, воспаления тазовых органов, реперфузионного повреждения, отторжения трансплантата, васкулита и нарушения лейкоцитов. В определенных вариантах воспалительные состояния включают, но без ограничения, бронхоэктаз, бронхиолит, муковисцидоз, острое повреждение легких, синдром острой дыхательной недостаточности (АКЭ8), атеросклероз и септический шок (например, септицемия с множественным поражением органов). В некоторых вариантах воспалительное состояние не является состоянием, выбранным из группы, состоящей из аллергии, астмы, АКЭ8 и аутоиммунного нарушения. В определенных вариантах воспалительное состояние не является состоянием, выбранным из группы, состоящей из воспаления желу- 14 019768 дочно-кишечного тракта, воспаления мозга, воспаления кожи и воспаления суставов. В определенных вариантах воспалительное состояние представляет собой нарушение, опосредованное нейтрофилами.

Описанное здесь соединение может вводиться субъекту, нуждающемуся в этом, для возможного лечения одного или более аутоиммунных нарушений. В таких терапиях термины лечение, терапия и терапевтический эффект могут относиться к снижению, ингибированию или прекращению аутоиммунной реакции (например, замедлению или прерыванию выработки антитела или ряда антител к специфическому антигену), снижению количества воспаленной ткани и облегчению, полному или частичному, аутоиммунного нарушения. Аутоиммунные нарушения включают, но без ограничения, аутоиммунный энцефаломиелит, колит, аутоиммунный инсулинозависимый сахарный диабет (ΙΌΌΜ) и гранулематоз Вегенера и синдром Такаясу. Модели для тестируемых соединений для таких заболеваний включают, без ограничения, (а) (ί) С5ВЬ/6, индуцированные пептидом миелинового гликопротеина олигодендроцитов (ΜΟΟ), (ίί) мыши 81Ь РЬР139-151 или 178-191 ЕАЕ, и (ίίί) модель ЕАЕ с адоптивным переносом, индуцированная ΜΟΟ или РЬР пептидами для аутоиммунного энцефаломиелита; (Ь) экспериментальная модель аутоиммунного диабета (ΝΟΌ) мышей для аутоиммунного ΙΌΌΜ; (с) модель колита, индуцированная декстрана натрия сульфатом (Ό88) и модель колита, индуцированная тринитробензолсульфоновой кислотой (ΤΝΒ8), для колита; и (б) системное поражение мелких кровеносных сосудов в качестве модели для гранулематоза Вегенера и болезни Такаясу. Описанное здесь соединение может вводиться субъекту для возможного лечения одного или более из следующих нарушений: острый рассеянный энцефаломиелит (ΆΌΕΜ); болезнь Аддисона; очаговая алопеция; анкилозирующий спондилоартрит; антифосфолипидный синдром (АР8); аутоиммунная гемолитическая анемия; аутоиммунный гепатит; аутоиммунное заболевание внутреннего уха; буллёзный пемфигоид; целиакия; болезнь Чагаса; хроническая обструктивная болезнь легких; болезнь Крона (один или два типа идиопатического воспалительного заболевания кишечника ΙΒΌ); болезнь Вагнера; инсулинозависимый сахарный диабет; эндометриоз; синдром Гудпасчера; базедова болезнь; острый первичный идиопатический полирадикулоневрит (ОВ8); зоб Хасимото; гнойный гидраденит; идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура; интерстициальный цистит; красная волчанка; синдром Шарпа; очаговая склеродермия, множественный склероз (Μ8); миастения гравис; нарколепсия; нейромиотония; обыкновенная пузырчатка; злокачественная анемия; полимиозит; билиарный первичный цирроз печени; ревматоидный артрит; шизофрения; склеродермия; ксеродерматоз; височный артериит (также известный как синдром Хортона-Магата-Брауна); неспецифический язвенный колит (один из двух типов идиопатического воспалительного заболевания кишечника ΙΒΌ); васкулит; витилиго и некротический неинфекционный гранулематоз. В некоторых вариантах аутоиммунное нарушение или заболевание не является нарушением или заболеванием, выбранным из группы, состоящей из болезни Крона (или заболевания Крона), ревматоидного артрита, волчанки и множественного склероза.

Описанное здесь соединение может вводиться субъекту, нуждающемуся в этом, для индуцирования иммунного ответа у субъекта. В определенных вариантах иммунный ответ может быть генерирован автоматически субъектом против чужеродного антигена (например, патогенная инфекция). В некоторых вариантах антиген вводится совместно с описанным здесь соединением, при этом иммунный ответ возникает у субъекта против антигена. Антиген может быть специфическим для конкретных условий клеточной пролиферации (например, специфический раковый антиген) или конкретного патогена (например, антиген грамположительной бактерии; антиген 8. аитеик), в определенных вариантах.

Описанные здесь соединения могут вводиться субъекту, нуждающемуся в этом, для потенциального лечения одного или более нарушений клеточной пролиферации. В таких терапиях термины терапия, лечение и терапевтический эффект могут относиться к снижению или остановке клеточной пролиферации (например, замедление или прерывание роста опухоли), снижению числа пролиферирующих раковых клеток (например, удаляемая часть или всей опухоли) и уменьшению, полному или частичному, состояния клеточной пролиферации. Состояния клеточной пролиферации включают, но без ограничения, рак ободочной и прямой кишки, молочной железы, легких, печени, предстательной железы, лимфоузлов, толстой кишки, мозга, головы и шеи, кожи, печени, почек и сердца. Примеры рака включают гематопоэтические неопластические нарушения, которые являются заболеваниями, в которые вовлечены гиперпластические/неопластические клетки гематопоэтического происхождения (например, происходящие из миелоидной, лимфоидной или эритроидной клеточных линий или их клеточные предшественники). Заболевания могут возникать из слабо дифференцированной острой лейкемии, например эритробластной лейкемии и острой мегакариобластной лейкемии. Дополнительные миелоидные нарушения включают, но без ограничения, острую промиелоидную лейкемию (ΑРΜ^), острый миелогенный лейкоз (ΆΜΕ) и хроническую миелогенную лейкемию (ΕΜΕ) (рассмотрены в Уаюкик, Сг11. Рет. ίη Онсо1./Нето1о1. 11:267-297 (1991)); лимфолейкоз включает, но без ограничения, острый лимфобластный лейкоз (ЛЬЕ), который включает В-клеточную линию ЛЬЕ и Т-клеточную линию ЛЬЕ, хронический лимфолейкоз (СЬЕ), пролимфоцитарный лейкоз (РЕЬ), волосатоклеточный лейкоз (НЕЕ) и макроглобулинемию Вальденстрёма (ΑΜ). Дополнительные формы злокачественной лимфомы включают, но без ограничения, неходжскинскую лимфому и ее разновидности, периферическую Т-клеточную лимфому, Т-клеточную лейкоз/лимфому взрослых (АТЬ), кожную Т-клеточную лимфому (СТСЬ), лейкоз больших гранулярных

- 15 019768 лейкоцитов (ЬСР), болезнь Ходжкина и болезнь Рид-Штернберга. В конкретном варианте клеточное пролиферативное нарушение представляет собой неэндокринную опухоль или эндокринные опухоли. Иллюстративные примеры неэндокринных опухолей включают, но без ограничения, аденокарциному, карциному ацинарных клеток, желёзисто-плоскоклеточный рак, гигантоклеточные опухоли, внутрипротоковые папиллярные слизистые опухоли, муцинозную цистаденокарциному, панкреатобластому, серозную цистаденому, твердые и псевдопапиллярные опухоли. Эндокринная опухоль может представлять собой инсулиному.

Состояния клеточной пролиферации также включают воспалительные состояния, такие как воспалительные состояния кожи, включающие, например, экзему, дискоидную красную волчанку, лишай Вильсона, склеротический лишай, фунгоидный микоз, фотодерматоз, розовый лишай, псориаз. Также включенными являются клеточные пролиферативные состояния, относящиеся к ожирению, такие как, например, пролиферация адипоцитов.

Состояния клеточной пролиферации также включают вирусные заболевания, включающие, например, синдром приобретенного иммунного дефицита, аденовирусные инфекции, альфавирусные инфекции, арбовирусные инфекции, болезнь Борна, буньявирусные инфекции, калицивирусные инфекции, ветряную оспу, коронавирусные инфекции, инфекции вирусом Коксаки, цитомегаловирусные инфекции, тропическую лихорадку, ДНК-вирусную инфекцию, эктиму, контагиозные, энцефалитные, арбовирусные инфекции, вирус Эпштейна-Барра, инфекционную эритему, хантавирусные инфекции, геморрагическую лихорадку, вирусный гепатит, вирус простого герпеса, опоясывающий герпес, синдром Ханта, инфекции Негрееттбае, мононуклеарные инфекции, грипп, например, у птиц или человека, геморрагическую лихорадку Ласса, корь, контагиозный моллюск, свинку, парамиксовирусные инфекции, флеботомную лихорадку, полиомавирусные инфекции, гидрофобию, респираторно-синцитиальные вирусные инфекции, лихорадку долины Рифт, РНК вирусные инфекции, краснуху, медленные вирусные заболевания, оспу, лейкоэнцефалит Ван-Богарта, онкогенный вирус, бородавки, лихорадку Западного Нила, вирусные заболевания и желтую лихорадку. Например, большой Т-антиген трансформирующего вируса 8У40 действует на ИВР, активирует его и захватывает другие вирусные белки в Ροϊ I комплекс, и тем самым стимулирует клеточную пролиферацию для обеспечения размножения вирусов. Состояния клеточной пролиферации также включают состояния, которые относятся к ангиогенезису (например, раковым заболеваниям) и ожирению, вызванному пролиферацией адипоцитов и других жировых клеток.

Клеточные пролиферативные состояния также включают сердечные состояния, возникающие в результате сердечного стресса, такого как повышенное кровяное давление, баллонная ангиопластика, порок сердца и инфаркт миокарда. Например, кардиомиоциты являются дифференцированными мышечными клетками в сердце, которые составляют большую часть стенки желудочка, и клетками гладкой мускулатуры, выстилающими кровеносные сосуды. Несмотря на то что оба типа относятся к мышечным клеткам, кардиомиоциты и клетки гладкой мускулатуры отличаются по их механизмам сокращения, роста и дифференциации. Кардиомиоциты становятся терминально дифференцированными сразу после формирования сердца и, таким образом, теряют способность к делению, в то время как клетки гладкой мускулатуры сосудов непрерывно подвергаются изменению от сократительного до пролиферативного фенотипа. Под воздействием разных патофизиологических стрессов, таких как, например, повышенное кровяное давление, баллонная ангиопластика, клапанный порок и инфаркт миокарда, сердце и сосуды подвергаются морфологическим изменениям, связанным с ростом, которые могут снижать сердечную функцию и в итоге проявляться в сердечной недостаточности. Таким образом, здесь обеспечены способы лечения сердечных клеточных пролиферативных состояний путем введения описанного здесь соединения в эффективном количестве для лечения сердечного состояния. Соединение может вводиться до или после возникновения, или обнаружения сердечного стресса, и соединение или нуклеиновую кислоту можно вводить после возникновения или обнаружения, например, повышенного давления, баллонной ангиопластики, порока клапанов или инфаркта миокарда. Введение такого соединения может уменьшать пролиферацию васкулярных мышечных клеток и/или клеток гладкой мускулатуры.

Также определенные варианты направлены на лечение симптомов старения и/или лечения состояний, относящихся к старению клеток, путем введения кандидатной молекулы или нуклеиновой кислоты, описанной здесь. Например, преждевременное старение при синдроме Вернера происходит в результате мутаций в гене синдрома Вернера, который кодирует ДНК-геликазу. Без привязки к теории известно, что данный белок локализуется в ядрышко и специфически связывается с С-квадруплексами, и мутации в гене \νΚ.Ν. кодирующем ДНК-геликазы, приводят к старению.

Примеры

Представленные ниже примеры иллюстрируют и не ограничивают изобретение.

Молекулы ТЬЯ могут воздействовать на локализацию рецептора, клеточную активацию и продукцию цитокинов. В случае ТЬЯ4 и 9, локализация ТЬЯ реагирует на значительный профиль индукции цитокинов (10-12). Конъюгация лекарственного средства с липидами может способствовать проникновению лекарственного средства внутрь клеток с помощью полярного липидного носителя, достигая тем самым эффективной внутриклеточной концентрации лекарственного средства более эффективно и с большей специфичностью, чем традиционные системы доставки. Конъюгация лекарственных средств с

- 16 019768 липидом, разработанная с медицинской мазью или кремом, может обеспечить проникновение через кожу для лечения кожных заболеваний. Пегилирование может продлевать циркуляцию в крови лекарственных средств путем увеличения стабильности ίη νίνο, которая, в свою очередь, приводит к понижению токсичности (13). В данном случае, липид и полиэтиленгликоль конъюгировали с агонистом ТЬК7 (8М), и тестировали иммунную активность конъюгатов. Отдельно взятые конъюгаты агониста ТЬК7 показали разные профили иммуностимуляции ίη νίνο и ίη νίΐτο. Конъюгация агонистов ТЬК7 с липидом улучшала способность к стимуляции врожденного иммунитета по сравнению с неконъюгированными агонистами ТЬК7 (8М). Конъюгаты липид-агонист ТЬК7 показали быстрое начало и продолжительное адъювантное действие ίη νίνο. Эти данные предполагают, что конъюгаты липид-агонист ТЬК7 могут найти применение в качестве адъювантов для терапевтической вакцинации. Конъюгирование агониста ТЬК7 с РЕС, однако, изменяло свойства 8М фармакофора, и конъюгат, наоборот, ингибировал активность антагониста ТЬК7.

Пример 1. Синтез и характеристика конъюгатов.

Материалы.

1,2-Диолеоил-8п-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ЭОРЕ) получали от компании ΑναηΙί ΓοΙπγ Ь1р1бк (А1аЬаккг, АЬ). Все другие реагенты, имеющие степень очистки, по меньшей мере, химически чистые, получали от компании δίβΐηα-ΛΙάποΙι (8ΐ. Εοιιίδ МО) и использовали без дальнейшей очистки. Растворители получали от компании Е1кс11ег ЗсКпЕПс (РШкЬигдй, РА) и использовали в том виде, в котором были приобретены, или повторно перегоняли с соответствующим высушивающим агентом. Овальбумин (ОУА, марки V) получали от компании 81дта-А1бгкЬ.

Уровни эндотоксина в реагентах и конъюгатах для исследований иммунологических активностей измеряли с использованием набора ОСЕ1000® ΗηάοροίηΙ сй^οтοдеη^с ЬАЬ аккау, полученного от компании Вю\У1Ш1акег (^а1кегуШе, Магу1апб, США). Реагенты, которые содержали менее чем 1 пикограмм (пг) эндотоксина на микрограмм (мкг) белка или лекарственного средства, использовали на протяжении всех экспериментов. Поскольку ЭОРЕ дал ложноположительные результаты в ЬАЬ-тесте, мононуклеарные клетки костного мозга (ВМЭМ), полученные от не отвечающих на липосахариды мутантных мышей (С3Н/Не1), использовали для проверки контаминирования эндотоксином (см. фиг. 1В). Уровни продукции цитокина ВМЭМ, полученным от мышей С3Н/Не1, были аналогичны уровням в клетках, полученных от дикого типа линии С3Н/НеОи1, что указывало на то, что контаминация эндотоксином была незначительной (см. фиг. 2В). Все конъюгаты хранили при -80°С в форме сухого порошка. Конъюгаты растворяли в ЭМ8О при 100 мМ и далее разбавляли перед иммунологическими анализами.

Аналитическую ТЬС выполняли с использованием предварительно покрытых алюминиевых пластинок ТЬС кШса Се1 60 Е254, полученных от компании ЕМЭ (С1ЬЬкФ^п, N1), и визуализировали с помощью УФ-света. Флэш-хроматографию проводили на ЕМЭ силикагеле 60 (40-63 мкм) с использованием описанной системы растворителей. Хроматографию и масс-спектры (Е8Ц для соединений без липидов записывали на хромато-масс-спектрометре 1100 БС/М8Э (Ад11ей ТесН^кд^^ Шс., ЗагИа С1ага СА) на колонке Зире^ ^^ксονе^у С18 Н8 (81дта-А1бгкЬ) с чистотой выше 98% относительной площади. Масс-спектр (Е8Ц соединений, содержащих липид, записывали на приборе Είηηίβηη ЕСРОЕСА (ТЬетю ПкЬег ЗсКпЕПс Ечс. ^аИйат, МА). ¹Н ЯМР спектр получали на приборе Уилан Мегсигу Р1ик 400 (Уалагг Шс., Рак А1к СА). Химические сдвиги выражали в частях на миллион (ррт) с использованием пригодных дейтерированных растворителей для ЯМР относительно ТМ8 при 0 ррт.

Мышей С57ВБ/6 (В6) получали от компании СЬаг1ек Ккег ^аЬο^аΐο^^ек (\νί1ιηίη£ΐοη, МА). Мышей С3Н/Не1 и С3Н/НеОи1 получали от компании Εκΐ/οη ^аЬο^аΐο^^ек (Ваг На^г, МЕ). ТЬК7-дефицитные мыши (С57ВБ/6 генетический фон) были подарком от Όγ. 8. Акпа (Окака ииуе^ку, Окака, Япония) и были переведены на генетическую основу С57ВБ/6 путем десяти возвратных скрещиваний. Животные были скрещены и содержались в иСЗЭ в комнатах при 22±0,5°С при 12:12-часовом цикле света-темноты с 7 часов утра до 7 часов вечера. Все процедуры и протоколы были утверждены Комитетом Института по содержанию и использованию животных.

Химический синтез.

Описанные здесь схемы химического синтеза используют числа в скобках при ссылке на соединение на фиг. 1, и буквы в скобках при ссылке на стадию реакции (например, добавленное химическое вещество(а) и/или условия реакции). Например, (а) относится к стадии реакции, которая включает добавление реактанта, которое может привести к образованию соединения (2), при соединении и взаимодействии с соединением (1). Условия реакции и добавленные соединения для каждой стадии реакции являются следующими: (а) литий Ν,Ν'-метилэтилендиаминоалюминий гидриды (СЬа, I. еΐ а1. (2002), ЗексЕге отпуегкюн οί аготабс η^ΐ^^Iек ΐο а1бе11убек Ьу Ηΐΐιίιιιη N,N'-б^теΐйу1еΐйу1еηеб^ат^ηοа1ит^ηит кебпбе, Ви11. Κοгеан СНет. 8ο^ 23, 1697-1698), ТНЕ, 0°С; (Ь) №1Е хлортриметилсилан, СН₃СН комн.темп.; (с) РВ8, комн.темп.; (б) №ОН:ЕЮН 1:1, дефлегмация; (е) ЭОРЕ, НАТи, триэтиламин, ЭМЕ/ЭСМ 1:1, комн.темп.; (ί) О-(2-аминоэтил)-О'-(2-азидоэтил)нонаэтиленгликоль, НАТи, триэтиламин, ЭМЕ, комн.темп.; (д) 4-пентиноевая кислота, аскорбат натрия, Си(ОАс)₂, ЕВиОН/Н₂О/ТНЕ 2:2:1, комн.темп.; и (Н) РОРЕ, НАТи, триэтиламин, РМЕ/РСМ 1:1, комн.темп.

- 17 019768

Синтез 4-((6-амино-2-(2-метоксиэтокси)-8-оксо-7Н-пурин-9(8Н)-ил)метил)бензойной кислоты (см. фиг. 1, соединение 5).

мл смеси 1:1 этанол:вода добавляли в 0,10 г (0,28 ммоль) 4-((6-амино-8-метокси-2-(2метоксиэтокси)-9Н-пурин-9-ил)метил)бензонитрила (см. фиг. 1, соединение 1), и комбинацию нагревали с обратным холодильником в течение 8 ч. Реакционную смесь оставляли охлаждаться и подкисляли до рН 2 концентрированной НС1. Водный раствор затем экстрагировали ЭСМ (3x20 мл), высушивали над Мд§О₄ и выпаривали в вакууме для получения смеси 8-оксо-9-бензойной кислоты (соединение 5), 8метокси-9-бензойной кислоты и 8-оксо-9-этилбензоата. После сушки продукты растворяли в СН₃СN (25 мл) и добавляли Να1 (0,14 г, 0,96 ммоль) (фиг. 1, стадия реакции (Ι)). В полученный раствор добавляли 12 мкл (0,96 ммоль) хлортриметилсилана по каплям при перемешивании. Реакционную смесь нагревали при 40°С в течение 4 ч, затем охлаждали, фильтровали и промывали водой (20 мл), и затем диэтиловым эфиром (20 мл) для получения белого твердого вещества с выходом 85%. Анализ методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) выполняли на конечном продукте со следующими результатами.

¹Н ЯМР (400 МГц, 1)\18О-с1.) δ (ррт): 10.33 (8, 1Н), 7.89 (ά, 1=8 Гц, 2Н), 7.37 (ά, 1=8 Гц, 2Н), 6.65 (8, 2Н), 4.92 (8, 2Н), 4.24 (!, 1=4 Гц, 2Н), 3.56 (!, 1=4 Гц, 2Н), 3.25 (8, 3Н).

Время удерживания (К!) на ВЭЖХ=14.3 мин.

Е8РМ8 (режим определения положительных ионов): расчетное для С₁₆Н₁₇^О₅ т/ζ [М+1] 360.34; обнаруженное 360.24.

Синтез 2-(4-((6-амино-2-(2-метоксиэтокси)-8-оксо-7Н-пурин-9(8Н)-ил)метил)бензамидо)этил-2,3бис-(олеоилокси)пропил фосфата (см. фиг. 1, соединение 6).

В раствор, содержащий 0,022 г (0,06 ммоль) соединения 5 в 1 мл безводного Ν,Νдиметилметанамида (ΌΜΡ), добавляли О-(7-азабензотриазол-1-ил)-^^№,№-тетраметилурония гексафторфосфат (НАТИ) (0,026 г, 0,067 ммоль) и безводный триэтиламин (ТЕА) (17.0 мкл, 0,12 ммоль). Готовили раствор 1,2-диолеоил-8п-глицеро-3-фосфоэтаноламина (0,05 г, 0,067 ммоль) в безводной смеси 1:1 дихлорметан (ОСМ):ЭМЕ (1 мл) и медленно добавляли в реакционную смесь (фиг. 1 стадия реакции (е)). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до полного завершения и затем выпаривали в вакууме. Продукт очищали флэш-хроматографией с использованием 15% метанола (МеОН) в ЭСМ для получения 0,038 г белого твердого вещества с выходом 58%. Анализ ЯМР выполняли на конечном продукте со следующими результатами.

¹Н ЯМР (400 МГц, 1)\18О-с1.) δ (ррт): 9.7 (8, 1Н), 7.87 (ά, 1=8.3 Гц, 2Н), 7.32 (ά, 1=8.3 Гц, 2Н), 6.61 (8, 2Н), 5.30 (т, 4Н), 5.05 (т, 1Н), 4.88 (8, 2Н), 4.26 (т, 4Н), 4.06 (т, 1Н), 3.77 (т, 4Н), 3.57 (т, 2Н), 3.35 (т, 2Н), 3.26 (8, 3Н), 2.23 (т, 4Н), 1.95 (т, 8Н), 1.46 (т, 4Н), 1.22 (т, 40Н), 0.83 (т, 6Н).

ΕδΓΜδ (режим определения отрицательных ионов): расчетное для САНузМ-.О^Р т/ζ [М-1] 1083.35; обнаруженное 1083.75.

Синтез 4-((6-амино-8-гидрокси-2-(2-метоксиэтокси)-9Н-пурин-9-ил)метил)-№(32-азидо3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-декаоксадотриаконтил)бензамида (см. фиг. 1, соединение 7).

В раствор соединения 5 (0,100 г, 0,278 ммоль) в безводном ОМЕ (5 мл) добавляли НАТИ (0,117 г, 0,306 ммоль) и безводный ТЕА (77.014 мкл, 0,556 ммоль) (см. фиг. 1, стадия реакции (1)). Готовили раствор О-(2-аминоэтил)-О'-(2-азидоэтил)нонаэтиленгликоль (0,150 г, 0,306 ммоль) в безводном ОМЕ (1 мл) и медленно добавляли в реакционную смесь. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до завершения и затем выпаривали в вакууме. Продукт очищали флэш-хроматографией с использованием 5% МеОН в ЭСМ для получения 0,224 г непрозрачного масла с выходом 93%. Время удерживания на ВЭЖХ=12 мин. ЯМР анализ выполняли на конечном продукте со следующими результатами.

¹Н ЯМР (400 МГц, ОМ8ОА₆) δ (ррт): 10.01 (8, 1Н), 8.45 (!, 1=5.6 Гц, 1Н), 7.78 (ά, 1=8.3 Гц, 2Н), 7.35 (ά, 1=8.3 Гц, 2Н), 6.49 (8, 2Н), 4.90 (8, 2Н), 4.25 (!, 1=4 Гц, 2Н), 3.57 (т, 4Н), 3.5 (т, 36Н), 3.4 (т, 6Н), 3.26 (8, 3Н).

Е8РМ8 (режим определения положительных ионов): расчетное для С₃₈Н₆₁^О₁₄ т/ζ [М+1] 868.94; обнаруженное 868.59.

Синтез 3-(1-(1-(4-((6-амино-8-гидрокси-2-(2-метоксиэтокси)-9Н-пурин-9-ил)метил)фенил)-1-оксо5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-декаокса-2-азатетратриаконтан-34-ил)-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)пропановой кислоты (см. фиг. 1, соединение 8).

Соединение 7 (0,218 г, 0,251 ммоль) и 4-пентиноевую кислоту (0,074 г, 0,753 ммоль) растворяли 1:1 в смеси !-бутанол:Н₂О (3 мл) (см. фиг. 1, стадия реакции (д)). В реакционную смесь медленно добавляли аскорбат натрия (0,02 г, 100 ммоль) и Си(ОАс)₂ (0,009 г, 50 ммоль) в смеси 1:1 !-бутанол:Н₂О (1 мл), и перемешивали при комнатной температуре до тех пор, пока соединение 7 полностью не прореагирует по данным ТЬС. Продукт экстрагировали ЭСМ (10 мл) и Н₂О (10 мл), и органический слой высушивали над Мд§О₄ для получения 0,230 г непрозрачного масла с выходом 95%. Время удерживания на ВЭЖХ=11.5 мин. ЯМР анализ выполняли на конечном продукте со следующими результатами.

Ή ЯМР (400 МГц, ОМ8ОА₆) δ (ррт): 13.48 (8, 1Н), 7.76 (ά, 1=8.29 Гц, 2Н), 7.75 (8, 1Н), 7.23 (ά, 1=8.29, 2Н), 4.88 (8, 2Н), 4.41 (!, 1=5.12 Гц, 2Н), 4.23 (!, 1=4 Гц, 2Н), 3.74 (!, 1=5.12 Гц, 2Н), 3.57 (!, 1=4 Гц, 2Н), 3.51 (т, 8Н), 3.42 (т, 36Н), 3.26 (8, 3Н), 2.79 (!, 1=7.56 Гц, 2Н), 2.24 (!, 1=7.56 Гц, 2Н).

- 18 019768

Е81-М8 (режим определения положительных ионов): расчетное для С₄₃Н₆₇№₉О1₆ т/ζ [М+1] 966.04; обнаруженное 966.67.

Синтез 2-(3 -(1-(1 -(4-((6-амино-8-гидрокси-2-(2-метоксиэтокси)-9Н-пурин-9-ил)метил)фенил)-1 оксо-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-декаокса-2-азатетратриаконтан-34-ил)-1Н-1,2,3-триазол-4ил)пропанамидо)этил-2,3-бис-(олеоилокси)пропил фосфата (см. фиг. 1, соединение 9).

В раствор соединения 8 (96 мг, 0,1 ммоль), НАТи (42 мг, 0,11 ммоль) в безводном ЭМР (1 мл) добавляли безводный ТЕА (2,7 мкл, 0,2 ммоль). В реакционную смесь по каплям добавляли раствор ΌΟΡΕ (81,4 мг, 0,11 ммоль) в 1:1 ЭСМЛМР (1 мл) и перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции (см. фиг. 1, стадия реакции (к)). После завершения реакции продукт изолировали путем выпаривания в вакууме с последующей флэш-хроматографией с использованием 15% МеОН в ЭСМ для получения 155 мг непрозрачного масла с выходом 92%. ЯМР анализ выполняли на конечном продукте со следующими результатами.

Ή ЯМР (400 МГц, ЭМ8О-б₆) δ (ррт): 8.5 (8, 2Н), 8.39 (8, 1Н), 7.79 (т, 3Н), 7.33 (6, 1=6.23 Гц, 2Н), 6.91 (8, 2Н), 5.31 (т, 4Н), 5.05 (т, 1Н), 4.89 (8, 2Н), 4.46 (т, 2Н), 4.23 (т, 4Н), 4.08 (ΐ, 1=8 Гц, 2Н), 3.76 (т, 4Н), 3.63 (ΐ, 1=8 Гц, 2Н), 3.56 (ΐ, 1=8 Гц, 2Н), 3.48 (т, 36Н), 3.26 (т, 5Н), 3.17 (т, 2Н), 2.82 (ΐ, 1=8 Гц, 2Н), 2.39 (ΐ, 1=8 Гц, 2 Н), 2.24 (т, 4Н), 1.96 (т, 8Н), 1.48 (т, 4Н), 1.23 (т, 40Н), 0.84 (т, 6Н).

Е81-М8 (режим определения положительных ионов): расчетное для С₈₄Н₁₄₂№₁₀О₂₃Р т/ζ [М+1] 1691.05; обнаруженное 1692.82.

Другие соединения синтезировали с использованием аналогичных методик (например, соединения, показанные в табл. 2). Например, 4-((6-амино-8-гидрокси-2-(2-метоксиэтокси)-9Н-пурин-9-ил)метил)-№гексадецилбензамин (соединение 1Ζ7) и 4-((6-амино-8-гидрокси-2-(2-метоксиэтокси)-9Н-пурин-9ил)метил)-№,№-дигексадецилбензамин (соединение 1Ζ9) готовили и очищали, как описано выше для приготовления соединения 6 на фиг. 1, за исключением того, что соответствующие моно- и дизамещенные гексадециламины использовали вместо 1,2-диолеоил-8п-глицеро-3-фосфоэтаноламина. Массу, равную 583.7, наблюдали для соединения 1Ζ7 с помощью Е81-М8 (режим определения положительных ионов; расчетная масса для С₃₂Н₅₀№₆О₄ т/ζ [М+1] составила 582.78). Массу, равную 808.2, наблюдали для 1Ζ9 с помощью Е81-М8 (режим определения положительных ионов; расчетная масса для С₄₈Н₈₂№₅О₄ т/ζ [М+1] составила 807.20).

Биотинилированное производное №-(4-(6-амино-8-гидрокси-2-(2-метоксиэтокси)-9Н-пурин-9ил)бензил)-5-((3а8,48,6аК)-2-оксогексагидро-1Н-тиено[3,4-6]имидазол-4-ил)пентанамида (соединение 1Ζ18) готовили из аминометильного производного (1У184) и конъюгировали с биотином с использованием такой же методики, которая описана выше. Массу, равную 571.5, наблюдали с помощью Е81-М8 (режим определения положительных ионов; расчетная масса для С₂₆Н₃₄№₈О₅8 т/ζ [М+1] составила 570.66).

Экспериментальные методы.

Ιη νίΐΐΌ методы.

Измерения ίη уйго индукции цитокинов выполняли с использованием моноцитарной макрофагальной линии клеток лейкоза мышей КА^ 264.7. Мыши КА^ 264.7 были получены от компании Атепсап Туре Сикиге Со11ес11оп (АТСС, КоскуШе, МЭ) и культивированы в ЭМЕМ полной среде |0н1Ьсссо'8 МоШПсб Еад1е Мебшт (1гуте 8с1еп11Г1с, 1гуте, СА), дополненной 10% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ Ь-глутамина и 100 ед./мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина]. ВМЭМ готовили из ТЬК7-дефицитных мышей линии С57ВЬ/6, как описано в \Уи, С.С. еΐ а1. (2007), 1ттнпо1кегарен11с асйуку оГ а соп]нда1е оГ То11-11ке гесерЮг 7 кдапб, Ргос №111 Асаб δα И8А 104, 3990-5.

В целом, клетки КА^264.7 или ВМЭМ инкубировали с разными концентрациями конъюгатов в течение 18 ч при 37°С, 5% СО₂ и собирали супернатанты культур. Уровни цитокинов (1Ь-6, 1Ь-12 или ΊΝΡα) в супернатантах определяли с помощью ЕЫ8А (ΒΌ Вю8аепсе8 Ркагттдеп, Ьа 1о11а, СА) (Ско, Н.1. еΐ а1., 1ттнпо811тн1а1огу Э№А-ка8еб уассте8 тбисе суЮЮхю 1утркοсуΐе асйуку ку а Т-ке1рег се11тберепбей тескаш8т [см. примечание], №11 Вю1ескпо1 18, 509-14 (2000)), и результаты представлены на фиг. 2А-2Э. Данные представлены как среднее значение±станд.откл.средн. с трехкратным повторением и являются иллюстрацией трех независимых экспериментов. Минимальные детектируемые уровни данных цитокинов составили 15 пг/мл.

Уровни Т№Ра измеряли (см. фиг. 2А) путем инкубирования приблизительно 1х10⁶/мл клеток К.А\У 264.7 с разными конъюгатами или контролями, как описано выше. Уровни 1Ь-6 и 1Ь-12 измеряли (см. фиг. 2Β-2Ό) путем инкубирования 0,5х10⁶/мл ВМЭМ с разными конъюгатами или контролями, как описано выше. Конъюгаты готовили в виде базовых растворов (10 мкм для 8М и соединений (6), (8) и (9), 0,1 мкм для соединения (4а)), из которых готовили серийные разведения (1:5).

ВМЭМ также использовали для оценки уровня контаминации эндотоксином конъюгатов ТЬК7, синтезированных с помощью описанных здесь схем синтеза. 0,5х10⁶/мл ВМЭМ, полученных от мышей С3Н/Не1 (не отвечающий на ЬР8 мутант) или С3Н/НеОи1 (дикий тип), инкубировали с конъюгатами ТЬК7 (10 мкМ 8М, 0,1 мкМ соединения 4а, 10 мкМ соединения 6, 10 мкМ соединения 8 или 10 мкМ соединения 9) в течение 18 ч. Уровни 1Ь-6 или 1Ь-12 в супернатантах культур измеряли с помощью ЕЫ8А,

- 19 019768 и результаты представлены на фиг. 2В. Каждый из конъюгатов ТЬК7 индуцировал аналогичные уровни 1Ь-6 в ТЬК4 мутантных и дикого типа мышах, что указывало на то, что контаминация ЬР8 данных конъюгатов является минимальной.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) были изолированы из человеческих лейкоцитарных плёнок, полученных от компании ТЬе 8ан Эхе^ Βίοοά Валк (8ап Эхе^, СА), как описано в НауакЫ, Т. еί а1., Εпйапсетеηί οΓ ^ппаίе ^ттип^ίу аданъ! Му^Ьа^егшт ονίιιιη ίηίεοίίοη Ьу 1тιηιιηοδίίιηιιίαίοπ· ΩΝΛ 15 теб1а!еб Ьу ^ηбο1еат^ηе-2,3-б^οxудеηа8е, 11тГес1 Iттиη 69:6156-64 (2001). РВМС (1х10⁶/мл) инкубировали с разными концентрациями конъюгатов ТЬК7 в течение 18 ч при 37°С, 5% СО₂ и собирали супернатанты культур. Уровни цитокинов (1Ь-6, ΪΝΕ-α или ЕЕ№а1) в супернатантах определяли с помощью анализов на основе микросфер Ьитшех (Ιηνίίτο^η, СапзЬаб, СА), и результаты представлены на фиг. 3А, 3В. Данные представлены как среднее±станд.откл.средн. трехкратного повторения и являются иллюстрацией трех независимых экспериментов. Минимальные детектируемые уровни 1Ь-6, ΪΝΕ-α и ΙΕΝα1 составили 6, 10 и 15 пг/мл соответственно.

Методы ίη νίνο.

Фармакокинетику индукции провоспалительных цитокинов конъюгатами ТЬК7 исследовали с помощью 6-8-недельных мышей С57ВЬ/6. Мышам внутривенно инъецировали агонисты ТЬК7 и их конъюгаты (40 нмоль соединения (4а) или 200 нмоль 8М и соединения (6), (8) или (9) на мышь).

Образцы крови собирали через 2, 4, 6, 24 и 48 ч после инъекций. Сыворотку отделяли и хранили при -20°С до использования. Уровни цитокинов (например, 1Ь-6 и ТЕ’Е-а) в сыворотке измеряли с помощью микроанализа на основе микросфер Ьитшех и результаты представлены на фиг. 4А, 4В. Данные представлены как среднее±станд.откл.средн. пяти мышей и являются иллюстрацией двух независимых экспериментов. Минимальные детектируемые уровни 1Ь-6 и ΪΝΕ-α составили 5 и 10 пг/мл соответственно.

Также исследовали инициацию иммунной реакции (например, адъювантность) конъюгатами ТЬК7. Группы (η=5) из мышей С57ВЬ/6 иммунизировали подкожно 20 мкг овальбумина (ОУА), смешанного примерно с 10 нмоль разных конъюгатов ТЬК7, на 0 и 7 день, при этом 10 нмоль является дозой, заданной для ТЬК7 части конъюгата, и фактическое количество зависит от фактической химической формулы каждого конъюгата. ТЬК9-активирующую иммуностимулирующую олигонуклеотидную последовательность (188-ОЭ№; 1018) использовали в качестве положительного контроля адъюванта, индуцирующего ТЬ1 (Ροιιτιη, М. еί а1., Iттиηο8ί^ти1аίο^у Э№А 5е^иепсе5 ΓιιηοΙίοη а5 Т Ье1ре^-1-р^οтοί^ηд аб^итаий (1997), №11 Меб 3:849-54). Сыворотку собирали на 0, 7, 14, 21, 28, 42 и 56 день. Мыши, иммунизированные солевым раствором или ОУА, смешанным с носителем, служили в качестве контролей. Мышей умерщвляли на 56 день и извлекали селезенки для приготовления спленоцитов и гистологических срезов. Приблизительно 200 мкл 2.5х10⁶/мл исходных клеток селезенки аликвотировали в титрационные микропланшеты с круглым дном для тканевой культуры в трех экземплярах в общем объеме 200 мкл КРМ1 1640 полной среды [КРМ11640 (1туше ЗаейШс, 1туше, СА), с добавлением 10% термоинактивированной ЕС8, 2 мМ Ьглутамина и 100 ед./мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина] и рестимулировали 100 мкг/мл ОУА или только средой. В некоторых экспериментах место инъекции исследовали через 24 ч после иммунизации на признаки воспаления или местной реакции. Наблюдали за активностью мышей как показателем возможного болезненного отклика на иммунизацию и затем взвешивали каждую неделю. Дополнительно к извлечению селезенки на 56 день также собирали легкие, печень, сердце и почки, фиксировали в 10% забуференном формалине (ЕйЬет ЗаейШс, РййЬигдЬ, РА) и заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) и оценивали под микроскопом.

Анти-ОУА антитела подклассов 1дС (и в некоторых вариантах конкретно 1дС1 и 1дС2) измеряли с помощью ЕЬ18А, как описано в Ото, Н.Г еί а1., Iттиηο8ί^ти1аίο^у ЭХА-Ьазеб хасстез тбисе суЮЮ.хю 1утрЬοсуίе асйхбу Ьу Т-Ье1рег сеП-тбереибеги тесЬаткт [см. примечания], №11 ВюЮсН^ 18, 509-14 (2000), и результаты представлены на фиг. 5А и 5В. Каждый планшет ЕЬ18А содержал титр предварительно рассчитанной сыворотки для создания стандартной кривой. Титр этого стандарта был рассчитан как наибольшее разведение сыворотки, при котором значение оптической плотности составляло двойной фон. Разные образцы сыворотки тестировали с разведением 1:100. Результаты выражены в единицах на мл, рассчитаны на основе единицы/мл стандартной сыворотки и представлены как среднее±станд.откл.средн. пяти животных в каждой группе. * и Т обозначают Р<0,05 и Р<0,01 с помощью однофакторного дисперсионного анализа А№ОУА по сравнению с мышами, иммунизированными ОУА, смешанным с носителем соответственно.

Спленоциты готовили из извлеченных селезенок. Культуры спленоцитов (рестимулированные 100 мкг/мл ОУА или только средой) затем инкубировали при 37°С, 5% СО₂ и супернатанты собирали через 72 ч. Уровни 1Е№у в супернатантах культур измеряли с помощью ЕЫ8А (ВЭ Вюзаенсе РЬатМтдец) согласно инструкциям производителя (^ЬлуазЫ, Н. еί а1., Ртерптшд: а ηονе1 арргоасН ίο П№А-Ьа8еб хассЬ ηηΐίοη апб ^ттиηοтοби1аί^οη, 8ргтдег 8етт Iттиηοраίйο1 22:85-96 (2000), и результаты показаны на фиг. 5С. Среднее количество всех клеток селезенки в каждой группе рассчитывали и сравнивали с РВ8иммунизированными группами для контроля пролиферации клеток в селезенке. Данные представлены

- 20 019768 как среднее±станд.откл.средн. пяти мышей и являются иллюстрацией трех независимых экспериментов.

Оценку возможного вредного воздействия конъюгатов ТЬК7 выполняли с помощью трехступенчатого анализа (подсчет общего количества спленоцитов, гистологическое исследование и визуальное наблюдение области инъекции, а также общего состояния здоровья и поведения обработанных мышей). Мышей С57ВБ/6 иммунизировали 20 мкг ОУА, смешанного с конъюгатами ТЬК7, носителем или контрольным агонистом (олигонуклеотидная последовательность Ι88-ΟΌΝ). На 56 день мышей умерщвляли и подсчитывали общее количество спленоцитов, результаты представлены на фиг. 6А. Селезенки собирали и подвергали гистологическому анализу, как показано на фиг. 6В (кратность увеличения=100х). Кожу в местах инъекции проверяли через 24 ч после инъекции, как показано на фиг. 6С. Существенное различие в количестве спленоцитов, подсчитанных у мышей, иммунизированных ОУА плюс конъюгаты ТЬК7, и мышей, иммунизированных только ОУА (см. фиг. 6А), отсутствует. Гистологическое исследование селезенок мышей, иммунизированных ОУА, смешанным с конъюгатами ТЬК7, не показало повреждения белой пульпы селезенки или повышенной насыщенности клетками в красной пульпе (см. фиг. 6В). Кожа в местах инъекций не имела видимого покраснения или глаукоматозной реакции (см. фиг. 6С).

Эффективность терапии соединением (8) оценивали измерением снижения количества нейтрофилов, инвазирующих перитонеальную область обработанных мышей, а также воздействием на индуцированный экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ). Снижение перитонеальной нейтрофильной инфильтрации измеряли путем обработки мышей С57ВЬ/6 внутривенными инъекциями (ί.ν.) 50 нмолей свободного фармакофора (1У136) или соединения (8) в течение 3 дней. 2 мл 3% тиогликолята (ТС) инъецировали внутрибрюшинно (ί.ρ.) через 18 ч после инъекции последнего соединения для индуцирования рекрутинга нейтрофилов. Перитонеальные клетки отбирали через 4 ч после инъекции ТС. Подсчитывали общее количество клеток с использованием гемацитометра и морфологически идентифицировали нейтрофилы. Результаты представлены на фиг. 7А и 7В.

Действие соединения (8) на экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ) определяли с использованием мышей С57ВЬ/6, обработанных миелин-олигодендроцитарным гликопротеином (МОС). МОС представляет собой мембранный белок, который экспрессируется на клеточной поверхности олигодендроцита и наружной поверхности миелиновой оболочки. МОС представляет собой аутоантигенный белок, который при разрушении может привести к заболеванию, характеризующемуся демиелинизацией нейронов, аналогично симптомам, ассоциированным, например, с множественным склерозом. Было показано, что МОС является высокоэнцефалитогенным и может индуцировать сильные Т и В клеточные ответы у грызунов. ЕАЕ представляет собой воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (СХ8) и широко изучено как животная модель человеческих демиелинизирующих заболеваний СЫ8, включающих множественный склероз и острый диссеминированный энцефаломиелит (АЭЕМ), а также является эффективным для изучения воспаления мозга.

Обработка МОС (или пептидами МОС) может применяться для индуцирования ЕАЕ. Мышей обрабатывали белком МОС в течение 6 дней. На 6 день и в последующие дни (см. фиг. 8) ежедневно инъецировали внутривенно (ί.ν.) 50 нмоль соединения (8) или РВ8. Клинические показатели ЕАЕ были использованы в качестве клинической метрики для демиелинизации и были определены визуально. Статистически значимые клинические показатели наблюдали на 11-17 день обработки соединением (8), как указано на фиг. 8 (см. данные, помеченные *).

В некоторых экспериментах статистическую оценку выполняли для определения статистической значимости наблюдаемых результатов. Статистическое программное обеспечение (Рпчп 4.0, СгарйРай, 8ап О|едо СА) использовали для статистического анализа, включая регрессионный анализ. Данные наносили на график и описывали нелинейной регрессией, исходя из распределения Гаусса с нормированными стандартными отклонениями между группами. В экспериментах на адъювантность статистическое различие между группами анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа АЫОУА с послеэкспериментальными исследованиями методом Бонферрони для сравнения контрольных мышей с мышами, которые были иммунизированы ОУА. Величина Р<0,05 считалась статистически значимой.

Результаты и обсуждение.

Химический синтез.

Синтез соединения (4) из соединения (1) позволял достичь устойчивого соотношения конъюгации 5:1 ИС1У150 с белком М8А (\Уи, С.С. е1 а1., 'ТтшипоШегареиНс αοίίνίΐν о£ а сопцщИе о£ а То11-11ке гесер1ог 7 Идапй, Ргос №111 Асай 8с1 И8А 104, 3990-5 (2007)). Щелочной гидролиз (фиг. 1, стадия реакции (й)) 9-бензилнитрила соединения (1) обеспечивал функциональную группу бензойной кислоты широкого назначения (соединение (5)) и сборку конъюгатов (6), (8) и (9).

Бензойная кислота связывалась с ПОРЕ путем активирования НАТи в присутствии ТЕА в безводном ПМР (фиг. 1, стадия реакции (е)) для получения соединения 6 с выходом 58%.

Из-за трудности в растворении соединения (6) в пригодных растворителях для тестирования, РЕС спейсер был присоединен для улучшения растворимости. Легкодоступные амин/азид бифункциональные РЕС присоединяли к бензойной кислоте путем активации при помощи НАТИ в присутствии ТЕА в безводном ПМР (см. фиг. 1, стадия реакции (ί), что приводило к получению соединения (7)). Образование

- 21 019768

1,2,3-триазола с помощью медь (1)-катализируемого циклоприсоединения азидов/алкинов с 4пентаноевой кислотой (фиг. 1, стадия реакции (д)) позволило получить соединение (8) с выходом 95%. В заключение, соединение (9) готовили путем активированного НАТИ образования амида с ЭОРЕ (фиг. 1, стадия реакции (11)) и соединением (8).

Измерения ίη νίΐτο индукции цитокинов конъюгированными с липидами агонистами ТЬК7.

Соединение агониста ТЬК7 (4а) при ковалентном связывании с мышиным сывороточным альбумином проявляет активность 10 или выше в индукции цитокинов ίη νίΐτο и ίη νίνο, по сравнению с неконъюгированным лекарственным средством (8М) (№и, С.С. е! а1., 1ттипоШегареийс αοίίνίΐν οί а соп)нда1с οί а То11-11ке гесер1ог 7 Идапб, Ргос ΝαίΙ Асаб 8с1 И8А 104, 3990-5 (2007)). С помощью аналогичного анализа сравнивали активность ίη νίΐτο конъюгатов липид-агонист ТЬК (фиг. 1, соединение 6), конъюгатов РЕС-агонист ТЬК7 (фиг. 1, соединение 8) и конъюгатов РЕС-липид (фиг. 1, соединение 9) с использованием мышиной макрофагальной клеточной линии КА№264 и первичных макрофагов костного мозга (БМЭМ). Соответствующие клетки стимулировали в течение 18 ч серийно разведенными конъюгатами ТЬК7 и уровни высвобождаемых в среду цитокинов измеряли с помощью ЕЬ18А, и сравнивали с неконъюгированным агонистом ТЬК7 (8М) (см. фиг. 2А, ряд А-Э).

Ранее было показано, что соединение (4а) (например, конъюгат ТЬК7-М8А) является в 100 раз сильнее в качестве индуктора цитокинов по сравнению с неконъюгированным агонистом, в то время как конъюгат липид-ТЬК7 был в 10 раз сильнее при нормализации до молярной доли неконъюгированного агониста. Несмотря на то что конъюгаты РЕС-ТЬК7 (соединение 8) показали меньшую активность по сравнению с неконъюгированным ТЬК7 (8М), конъюгация липида с конъюгатами РЕС-ТЬК7 (липидРЕС-ТЬКТ) (соединение 9) восстанавливала их активность до аналогичного уровня неконъюгированных ТЬК7 (8М). Главным образом аналогичные концентрации М8А, липида или РЕС без ТЬК7 конъюгации, при самых высоких уровнях в конъюгированной форме, использовали в качестве негативного контроля и индуцировали минимальные уровни цитокина или их отсутствие в клетках КА№264.7 и ВМЭМ соответственно (данные не показаны).

Для оценки способности одних лишь конъюгированных форм агонистов ТЬК7 индуцировать стимуляцию макрофагов, в отличие от стимуляции макрофагов без ТЬК7, ВМЭМ, полученные от мышей дикого типа и ТЬК7-дефицитных мышей (ТЬК7-КО или нокаутных мышей), обрабатывали соединениями (4а), (6), (8), (9) и 8М. Соединения (4а), (6), (8), (9) и 8М не индуцировали или индуцировали незначительное количество 1Ь-12 и 1Ь-6, в то время как данные конъюгаты были активными у дикого типа ЭМЭМ, что указывало на то, что агонистическая активность присутствовала благодаря активности ТЬК7 данных конъюгатов (см. фиг. 2С-2Э). Оценка эндотоксина (фиг. 2В и описанная выше), кроме того, подтверждала вывод о том, что активность агониста была благодаря ТЬК7 активности данных конъюгатов (например, отсутствие значительной статистической разницы в уровнях продукции 1Ь-6).

Для дополнительного исследования иммунологических активностей в человеческих клетках человеческие РВМС от трех доноров обрабатывали конъюгатами ТЬК7 и определяли уровни 1Ь-6 и 1Е№1 с помощью анализа Ьиттех (фиг. 3А, 3В). В данном эксперименте человеческий сывороточный альбумин (Н8А), конъюгированный с ТЬК7 (4Ь), использовали вместо М8А-конъюгатов (4а). Порядок активности конъюгатов ТЬК7 был аналогичен порядку, наблюдаемому в мышиных макрофагах ((4а)>(6)>(9)>/=8М>(8)) (фиг. 3А). Устойчивую тенденцию активности соединений наблюдали в РВМС от всех доноров. В отличие от соединения (4а), соединение (4Ь) (например, конъюгат ТЬК7-Н8А) индуцировал минимальные уровни 1Е№1 в человеческих РВМС (наблюдаемые у трех доноров) (фиг. 3В).

Ιη νίνο кинетика индукции провоспалительных цитокинов конъюгатами ТЬК.

Для сравнения ίη νίνο иммунологических свойств конъюгатов ТЬК7 мыши С57ВЬ/5 получали внутривенно конъюгаты агониста ТЬК7, и изучали кинетику провоспалительных цитокинов в сыворотке (фиг. 4А и 4В). На основании более раннего исследования (№и, С.С. е! а1., Ргос ΝηΐΙ Асаб 8с1 И8А 104, 3990-5 (2007)), соединение (4а) использовали при более низкой концентрации (40 нмоль на животное), чем соединения 8М, (6), (8) и (9) (200 нмоль на животное). Максимальную индукцию ΪΝΡζ и 1Ь-6 наблюдали через 2 ч после инъекции для всех конъюгатов ТЬК7 (фиг. 4А, 4В соответственно). Уровни цитокинов, индуцированных неконъюгированным ТЬК7 (8М), быстро уменьшались через 2 ч. Индукция цитокина соединениями (4а), (6) и (9) продолжалась вплоть до 6 ч. Соединение (8) индуцировало только низкий уровень 1Ь-6 (см. фиг. 4В), и значительно не индуцировало Т№а в любой момент времени после инъекции (см. фиг. 4В). Сыворотка от контрольной мыши, которая получала солевой раствор, М8А или ПОРЕ, показала незначительные или не детектируемые уровни цитокина (данные не показаны).

Конъюгаты липид-ТЬК7 способствуют быстрой и продолжительной эндокринной реакции.

Эффективность адъювантных свойств оценивали путем измерения уровней и индуцированных вакциной изотипов антиген-специфических 1дС, в частности 1дС1 и 1дС2 (Мο8таηη, Т.К., аиб ^Втащ К.Ь., ТН1 аг1б ТН2 сс115:61ГГсгсп1 рабетк οί Ινιηρίιοίζίιη; ί^ιτίίοη 1еаб !ο ббТегегИ ίϊιικίίοηηΐ ртретЕе^, ΛηηιιηΙ Реу1е\\· Iттиηο1οду 7:145-73 (1989)). Группы мышей С57ВЬ/6 (η=5 животных на группу) подкожно иммунизировали ОУА (овальбумин), смешанным с конъюгатами ТЬК7. I88-Ο^N использовали в качестве положительного контроля сильного Т11 адъюванта. Мышей, иммунизированных солевым раствором или

- 22 019768

0УЛ плюс носитель (0,1% ΌΜ80), использовали в качестве негативных контролей. Кинетику индукции ОУА-специфических 1дС1 и 1дС2а в сыворотке контролировали с помощью ЕЫ8А на 0, 7, 14, 21, 28, 42 и 56 день (фиг. 5А, 5В). Индукцию антител 1С подкласса наблюдали не ранее 14 дней после иммунизации мышей ОУА, смешанным с соединением (4а) или соединением (6) (см. фиг. 5А). Уровни анти-ОУА 1дС2а непрерывно повышались у мышей, иммунизированных смесями ОУА/соединение (6), в то время как уровни у мышей, иммунизированных смесью ОУА/соединение (4а), последовательно снижались, как показано на фиг. 5А. Эти данные согласуются с усиленной ОУА-специфической секрецией ΙΕΝγ клетками селезенки у мышей, иммунизированных ОУА в комбинации с соединениями (4а) или (6) (см. фиг. 5С).

Оценка ίη νίνο побочных эффектов.

Агонисты ТЬК7 (8Μ) могут индуцировать эффекты анорексии и гипотермии у мышей (НауакЫ, Т. е! а1., Май се11 берепбеп! апотеюа апб Нуробютиа шбисеб Ьу ишсоуй асбуабоп о£ То11 11ке Кесер!от 7, Ат 1. РНу81о1 Кеди1 1йедг Сотр Р11уйо1 295, К123-32 (2008)), вызывая потерю веса. Таким образом, как часть экспериментального протокола, контролировали массу тела и реакцию кожи (в месте инъекции) мышей, иммунизированных конъюгатами липид-агонист ТЬК7. Минимальная доза неконъюгированного агониста ТЬК7 (8М), которая индуцировала аноректическую реакцию у мышей, составила 50 нмолей на мышь при мукозальном введении (НауакЫ, Т. е! а1., Ат ί. РЬуйо1 Кеди1 1йегдг Сотр Р11уйо1 295, К123-32 (2008)). Дозу для экспериментов с адъювантами (10 нмолей на мышь) выбирали таким образом, чтобы избежать болезненной реакции, вызванной агонистами ТЬК7. Значительных различий между средней массой тела мышей, иммунизированных ОУА, смешанным с соединением (6) и мышами, которых инъецировали солевым раствором, не наблюдалось (данные не показаны).

Постоянный прием ТЬК7 может также индуцировать пролиферацию миелоидных клеток (Ваепхщег. 8. е! а1., Тпддегбщ ТЬК7 ίη тюе тбисек 1ттипе асбуабоп апб 1утр1кбб 5уйет бЬгирбоп, гехетЬбпд Н1У-теб1а!еб ра1бо1оду, В1ооб 113:377-388 (2009). Общее количество клеток селезенки были рассчитано в качестве индикатора пролиферации миелоидных клеток селезенки (см. фиг. 6А). Не было значительной разницы в общем количестве спленоцитов между мышами, иммунизированными ОУА, конъюгатами агониста ТЬК7 и контрольным солевым раствором (см. фиг. 6В). Гистологическое исследование селезенок мышей, иммунизированных ОУА, смешанным с агонистами ТЬК7, показало отсутствие структурного нарушения белой пульпы селезёнки (зародышевый центр) и отсутствие увеличения насыщенности клетками в красной пульпе (см. фиг. 6В). К тому же, не наблюдалось значительного различия в гистологическом исследовании образов печени, легких, сердца и почек, собранных от каждой группы (данные не показаны). Также не было макроскопически видимого покраснения или глаукоматозной реакции в месте инъекции или около него при введении конъюгатов липид-ТЬК7 (см. фиг. 6С).

Тиогликолят (ТС) может быть использован как вызывающий агент для рекрутинга лейкоцитов и макрофагов в место воспаления. В ответ на инфекцию или воспаление нейтрофилы обычно являются первым гранулоцитарным типом клеток, которые поступают в место инфекции или воспаления. Таким образом, терапия тиогликолятом вызывает рекрутинг многих типов клеток с иммунным ответом, которые могут быть эффективными для определения возможных побочных эффектов, ассоциированных с введением конъюгатов ТЬК7. Способ, который использовали для этих исследований, состоял в предварительной обработке мышей разными соединениями конъюгатов ТЬК7 в течение 3 дней, с последующей инъекцией 2 мл 3% раствора триогликолята через 18 ч после последней обработки конъюгатом ТЬК7. Через 4 ч после инъекции ТС общее количество перитонеальных клеток собирали и подсчитывали. Нейтрофилы идентифицировали морфологически и подсчитывали. Результаты представлены на фиг. 7А, 7В.

Мышей, обработанных только солевым раствором, использовали в качестве негативного контроля и устанавливали базальный уровень общего количества перитонеальных клеток и общего количества нейтрофилов, рекрутированных для необработанных мышей. Мыши, обработанные ТС (в солевом растворе), но не обработанные предварительно конъюгатом ТЬК7, были использованы в качестве положительного контроля для рекрутинга и показали приблизительно 5х10⁶ всех клеток, рекрутированных в перитонеальную область, из которых приблизительно 90% составляли нейтрофилы (больше чем 4х10⁶ нейтрофилов из 5х10⁶ всех клеток). Мыши, предварительно обработанные ТЬК7 свободным фармакофором (1У136) или конъюгатом ТЬК7 (1У282, соединение (8)), показали снижение общего количества рекрутированных клеток и рекрутированных нейтрофилов, что указывало на то, что обработка свободным фармакофором или соединением (8) может уменьшать уровень воспалительной/инфекционной реакции, на которую реагируют лейкоциты, гранулоциты и макрофаги, но могут иметь небольшой эффект или его отсутствие на распределение рекрутированных типов клеток (например, относительные количества каждого типа клеток). Таким образом, свободный фармакофор и соединение (8) не показали дополнительного вредного воздействия (например, болезненной реакции, как описано выше) по сравнению с ТС и уменьшали рекрутинг лейкоцитов, гранулоцитов и макрофагов.

МОС белок также использовали для оценки возможных вредных эффектов разных конъюгатов ТЬК7, как описано выше. Результаты оценивали наблюдением разных симптомов, ассоциированных с МОС-индуцированной ЕАЕ (например, воспаление мозга, демиелинизирование нейронов и подобные).

- 23 019768

Серьезность симптомов записывали как клинический показатель и производили сравнение между необработанными мышами (РВ8) и мышами, обработанными соединением (8) после первых 6 дней МОС обработки (см. фиг. 8). Статистически значимые различия в клинических показателях указаны * свыше 11-17 дней. Обработка соединением (8) значительно снижала тяжесть симптомов ЕАЕ в период между 11 и 17 днями, а также снижала начальное увеличение тяжести симптомов, как указано различием на графике двух линий, которые начинаются на 8 день и проходят через 11 день. Таким образом, можно сделать вывод о том, что соединение 8 не вызывает дополнительной побочной реакции (например, отсутствует болезненная реакция, как описано выше) и может также снижать тяжесть симптомов, ассоциированных с МОС-индуцированной ЕАЕ.

Выводы.

Неконъюгированный ТЕН7 (8М) является нерастворимым в водном растворе. Растворимость в воде может играть роль в контроле биологической доступности лекарственного средства путем увеличения диффузии лекарственного средства или стимулирования внедрения в клетки. Пегилирование может улучшать растворимость лекарственного средства и уменьшать иммунодефицит (Уегопеке, Е.М. апб Мего, А., Т11е 1трас! о£ РЕСу1а!юп оп Ью1одюа1 !йегар1е8, ВюЭгидк 22, 315-29 (2008)). Пегилирование также может увеличивать стабильность лекарственного средства, время удерживания конъюгатов в крови и может снижать протеолиз, и выведение с мочой (Уегопеке, Е.М. апб Мего, Α. ВюЭгидк 22, 315-29 (2008)). В случае, когда ТЬК.7 конъюгировано с РЕС (например, соединение (8)), растворимость значительно возрастает (данные не показаны). Однако, возможность индукции цитокинов является ослабленной по сравнению с немодифицированным агонистом ТЕН7 ш νίΙΐΌ (фиг. 2А, ряд А и В) и ш νί\Ό (фиг. 4А и 4В). Активность ш мйго и ш νί\Ό может быть восстановлена дальнейшей конъюгацией с ЭОРЕ (соединение (9)). Соединение (9) может индуцировать иммунную реакцию Т112 (указанную уровнями 1дС1), при проявлении минимального ответа Т111 (указанного уровнями 1дС2).

Соединения конъюгатов агониста ТЕН7 (4а) (М8А конъюгат) и (6) (липидный конъюгат) вызывали быстрое повышение титра 1дС2а (фиг. 5А). Уровни 1дС2а у мышей, иммунизированных конъюгатами М8А-ТЬК7 (соединение (4а)), понижались через три недели после последней иммунизации, в то время как мыши, иммунизированные ОУА, смешанным с конъюгатами липид-ТЬК7 (соединение (6)), показали устойчивые и, кроме того, возрастающие уровни антиген-специфического 1дС2а (фиг. 5А). Несмотря на то что соединение (4а) не сохраняло уровни 1дС2а, секреция ОУА-специфического ΙΕΝγ клетками селезенки у мышей, иммунизированных ОУА, смешанным с соединением (4а), сохраняла относительно высокие уровни (фиг. 5С). Такие же агонисты ТЕН7, конъюгированные с разными группами, которые дают отличающиеся иммунные профили, могут быть эффективными в разработке адъювантов для лечения разных категорий заболеваний, таких как, например, инфекция и аутоиммунное заболевание.

Были синтезированы разные конъюгаты агониста ТЕН7, и было обнаружено отличие в их иммунологических профилях 1п νί\Ό и 1п νίΙΐΌ. Различие в физических свойствах предложенных конъюгатов агониста ТЕН7 дает возможность более широкого применения в лечении разных заболеваний. Растворимые в воде конъюгаты могут обеспечить режим для системного введения. Содержащие липиды конъюгаты могут быть пригодными для местного введения, требующего постоянной стимуляции прилегающих иммунных клеток (например, применение адъюванта для инфекционных заболеваний). Липидный фрагмент может способствовать проникновению лекарственного средства через кожный барьер и может быть предпочтительным для лечения кожных заболеваний. Конъюгация агониста ТЕН7 с липидом или РЕС фрагментами может быть обещающей стратегией для расширения клинического лечения инфекции, рака или аутоиммунного заболевания.

На основании представленных здесь данных был сделан вывод о том, что соединение (8) обладает антагонистической активностью при определенных условиях. Фиг. 4А-В показывает, что соединение (8) обладает незначительной или отсутствием 1Ь-6 или ΪΝΕα стимулирующей активности, и может уменьшать определенные аспекты воспаления или реакции на инфекцию, обычно ассоциированные с увеличением активности 1Ь-6 или ΪΝΕα (см. фиг. 7А, 7В и фиг. 8). Данные наблюдения согласуются с антагонистической активностью (например, соединение может связываться, но не стимулировать активацию рецептора).

Активация То11-подобных рецепторов (ТЕН) на клетках врожденной иммунной системы инициирует, усиливает и направляет антиген-специфический приобретенный иммунный ответ. Лиганды, которые стимулируют ТЕН, таким образом, являются потенциальными иммуностимуляторами. В данном исследовании сильный агонист ТЕН был конъюгирован с полиэтиленгликолем (РЕС), липидом или липидРЕС с помощью изменяемой функциональной группы бензойной кислоты. По сравнению с немодифицированным агонистом ТЕН, каждый конъюгат проявил разный иммунологический профиль ш νίΙΐΌ и т νί\Ό. В мышиных макрофагах и мононуклеарных клетках периферической крови человека конъюгаты липид-ТЕН являлись по меньшей мере в 100 раз более сильными, чем свободные лиганды ТЕН, в то время как эффективности РЕС и конъюгатов РЕС-липид были аналогичными свободной форме. При введении конъюгатов системно ш νί\Ό. липидные и липид-РЕС ТЕН7 конъюгаты обеспечивали устойчивые уровни иммуностимулирующих цитокинов в сыворотке по сравнению с немодифицированным активато

- 24 019768 ром ТЬК При использовании конъюгатов в качестве адъювантов во время вакцинации, только конъюгаты липид-ТЬК.7 индуцировали устойчивый ТЫ, а также Т112 антиген-специфические ответы. Представленные данные показали, что иммуностимулирующая активность ТЕК.7 лиганда может распространяться и фокусироваться конъюгацией, возможно расширяя, таким образом, потенциальное терапевтическое применение данных агентов.

Дополнительные соединения и их свойства.

Биологические активности.

Активность ίη νίίτο агониста ТЕК.7, конъюгированного с РЕС с разной длиной цепи, определяли с помощью СепеВ1ахегСе118еп5ог клеточной линии ЫЕкБ-Ыа КА\У 264.7 (ЧпуЦгодеп) и первичных мышиных ВМЭМ. Клетки инкубировали с разными концентрациями конъюгатов липид-РЕС агониста ТЕК.7. Активацию ΝΕ1<Β клеточной линии Се1кеи8ог определяли согласно инструкциям производителя. ВМЭМ инкубировали с конъюгатами в течение ночи, и уровень 1Ь-6 в супернатанте оценивали в помощью ЕЫ8А. Примерную УС50 рассчитывали с использованием РгЬт.

Конъюгаты с 6, 10 и 18 РЕС цепями показали аналогичную активность в обеих ΝΕΙίΒ-Ыа ΡΛ\ν клетках и ΒΜΌΜ (фиг. 9Λ-9Ό). В анализах с использованием клеток ΝΕΙίΒ-Ыа ΡΛ\ν конъюгаты, содержащие более длинные РЕС цепи, были менее активными для активации ΝΕ1<Β (фиг. 9Э-9Е). Напротив, конъюгаты с длинной цепью показали более высокие активности для 1Ь-6 секреции с помощью ΒΜΌΜ (фиг. 9Ό-9Ε). Среди конъюгатов с 6 РЕС цепью конъюгаты с ΝΗ2 терминальной группой показали слегка повышенную активность, чем конъюгаты с СООН или N3 терминальными группами (фиг. 9А).

Мышам С57ВБ/6 инъецировали 200 нмоль разных конъюгатов агониста ТБИ7-РЕС в 100 мкл солевого раствора. Сыворотку собирали в указанное время и уровни цитокинов (Т№-альфа, ЕЬ-6, 1Б-12) определяли с помощью микросфер Битшех (фиг. 10А, 10В). Все соединения, используемые в исследовании, были визуально растворимы в 0,1-0,2% ΌΜδΘ-солевых растворах. В случае, когда свободный агонист ТЕК.7 конъюгировали с 6 РЕС цепью (1Ζ2), активность была уменьшенной (фиг. 10А, 10В). Конъюгаты, содержащие более длинные цепи, такие как 1У303 (18 РЕС цепь) и 1Ζ3 (примерно 8 47 РЕС цепь), индуцировали цитокины на уровне неконъюгированного агониста (1У136). 1Ζ5, который содержит приблизительно 271-РЕС цепь, индуцировал более высокие уровни цитокинов, чем неконъюгированный агонист ТБИ7.

Для сравнения ίη νί\Ό биоактивностей между ΝΗ₂ и СООН терминальными группами использовали 6 РЕС цепь и 10 РЕС цепь, конъюгированные с агонистами ТЬК.7 (фиг. 10С). 1Ζ2 и 1У298, которые содержат ΝΗ₂ терминальную группу, показали относительно высокую индукцию цитокинов, чем их соответствующие конъюгаты, содержащие СООН терминальную группу (фиг. 10С-Э).

Противовоспалительную эффективность конъюгатов агонист ТЕК7-РЕС тестировали на мышиных моделях человеческих воспалительных заболеваний (артрит с переносом сыворотки, экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ) (см. выше) и тиогликолят-индуцированный перитонит). Для артрита с переносом сыворотки (фиг. 11) мышей С57ВБ/6 вводили сыворотку Κ/ΒχΝ в 0 день и обрабатывали ежедневно через зонд (фиг. 11А) или подкожной инъекцией (фиг. 11В) 1У282. Ежедневное введение 1У282 снижало набухание лапы как при подкожной обработке, так и при обработке через зонд.

Для тиогликолят-индуцированного перитонита (фиг. 12) мышам С57ВБ/6 внутривенно или орально вводили 1У282 в течение трех дней. Через день после последней обработки мыши получали интраперитонеально 2 мл тиогликолевой среды. Внутривенное и подкожное введение 1У136 использовали в качестве положительных контролей.

Через 3 ч после введения тиогликолята оценивали инфильтрацию нейтрофилами в перитонеальной области. Системное и оральное введение 1У282 снижало клеточную инфильтрацию, в частности нейтрофильную в перитонеальную область.

Диабеты 1 типа у человека характеризуются специфическим разрушением панкреатических β клеток, обычно ассоциированным с иммуноопосредованным повреждением. Химически индуцированные модели диабета используют для тестирования возможности уменьшения тяжести или начала заболевания при постоянном введении конъюгатов агонист ТЕК.7-РЕС. Использовали множественные маленькие дозы стрептозотоцина (алкилирующего агента) (например, 40 мг/кг на пять последующих дней). У восприимчивых грызунов происходит индуцирование инсулинозависимого диабета, при котором разрушение иммунитета играет некоторую роль, как в человеческом диабете 1 типа. На основании механизма действия, наблюдаемого в других родственных заболеваниях, конъюгаты ТЕК.7-РЕС будут ослаблять течение данного заболевания.

- 25 019768

Таблица 2

Соединение #	Структура	М9/ (мол. масса)	Длин а Цепи	Μϊ¥ цепи	т/Ζ
1УЗО2	с О'	691.33	6	350.42	692.6
1Ζ1	с V О''	789.83	6	350.42	790.6
1Ζ2	Ν. Г г	665.74	6	350.42	666.6
1У279	ήυο/ά·^·'' у-Ν О О'	867.43	10	526.62	868.5
1У298	О НгЫу^0/°1О^”^хС^ХмНг θκ_ ^0	841.95	10	526.62	842.6

- 26 019768

1У282	У > η-''	966.04	10	526.62	966.8
1У303	у-Ν	1238.42	18	897.1	1238.7
1У303 бис	К	1579.74	18	897.1	1579.1
1Ζ3	О н^сСоЛ[Г^^ г	2525.13,	47,	2182	Ь
1Ζ4	\-Н 0^-	5572.13,	114,	5229	ь
1Ζ5	г '^0-	12609.13,	271,	12266	ь

- 27 019768

1Ζ6	у-Ν	21701.13а	472а	21358	Ь
1Ζ7		582.78	16	241.46	583.7
1Ζ9		807.2	2x16	465.88
1Ζ18		570.66

а - приблизительная молекулярная масса благодаря гетерогенности РЕС полимера.

Ь - характеризуется только ЯМР.

Каждый патент, патентная заявка, публикация и документ, на которые делаются здесь ссылки, включены здесь полностью посредством отсылки. Список вышеуказанных патентов, патентных заявок, публикаций и документов не является признанием того, что любой из вышеуказанных относится к предшествующему уровню техники или является признанием содержания или даты данных публикаций или документов.

Изменения вышеперечисленного могут быть сделаны без отступления от основных аспектов изобретения. Хотя изобретение было описано с существенными деталями со ссылкой на один или более конкретных вариантов, специалистам среднего уровня будет понятно, что могут быть внесены изменения в варианты, специально раскрытые в данном патенте, однако эти изменения и улучшения находятся в пределах объема и сущности изобретения.

Изобретение, иллюстративно описанное здесь, может быть пригодно для осуществления на практике в отсутствие любого(ых) элемента(ов), специально здесь не раскрытого. Таким образом, например, в каждом указанном здесь случае любой из терминов включающий, состоящий в основном из и состоящий из может быть заменен любым из двух других терминов. Термины и выражения, которые были использованы, использовали как термины для описания и не ограничения, и использование таких терминов и выражений не включает каких-либо эквивалентов признаков, показанных и описанных, или их частей, и возможны разные изменения в объеме заявленного изобретения. Используемые в описании формы в единственном числе включают также ссылки на них во множественном числе, если контекст не указывает ясно иное. Использующийся здесь термин примерно относится к величине в пределах 10% основного параметра (т.е. ±10%), и использование термина примерно в начале последовательности величин изменяет каждую величину (т.е. примерно 1, 2 или 3 равно примерно 1, примерно 2 и примерно 3). Например, масса примерно 100 г может включать от 90 до 110 г. Таким образом, должно быть понятно, что, несмотря на то что настоящее изобретение было специально раскрыто с помощью иллюстративных вариантов и факультативных признаков, модификация и изменение раскрытых здесь понятий могут быть выбраны опытными в данной области специалистами и такие изменения и модификации рассматриваются как находящиеся в объеме данного изобретения.

Claims (22)

1. Соединение, имеющее структуру согласно формуле I (СНгХп (Формула I) или его фармацевтически приемлемая соль, включая его гидрат, где X представляет собой N или СЯ²;

Я представляет собой -ОЯ¹, -8Я¹ или -ΝΚ/'Κ.¹’,

X¹ представляет собой связь или -О-, -8- или -ΝΕ°-;

Я^с представляет собой водород, С1-Сю-алкил или замещенный С₁-С₁₀-алкил или Я^с и Я¹ вместе с атомом азота могут образовывать гетероциклическое кольцо или замещенное гетероциклическое кольцо;

каждый Я¹ независимо представляет собой водород, С1-Сю-алкил, замещенный С1-Сю-алкил, С₁Сю-алкокси, замещенный С₁-С₁₀-алкокси, С1-Сю-алкил-С1-С1₀-алкокси, замещенный С₁-С₁₀-алкил-С₁-С₁₀алкокси, С₅-С₁₀-арил, замещенный С₅-С₁₀-арил, С₅-С₉-гетероциклил, замещенный С₅-С₉-гетероциклил, С₃-С₉-карбоциклил или замещенный С₃-С₉-карбоциклил;

каждый Я² независимо представляет собой водород, -ОН, С₁-С₆-алкил, замещенный С₁-С₆-алкил, С₁-С₆-алкокси, замещенный С₁-С₆-алкокси, -С(О)-С₁-С₆-алкил (алканоил), замещенный -С(О)-С₁-С₆алкил, -С(О)-С6-С10-арил (ароил), замещенный -С(О)-С6-С10-арил, -С(О)ОН (карбоксил), -С(О)О-С1-С6алкил (алкоксикарбонил), замещенный -С(О)О-С₁-С₆-алкил, -ΝΕΈ¹’, ^^ΝΕΈ^4, (карбамоил), замещенный С(О)NΚ^аЯ^ь, гало, нитро или циано;

заместители на алкильных, алкокси, арильных или гетероциклических группах представляют собой гидрокси, С₁-С₆-алкил, гидрокси-С₁-С₆-алкилен, карбокси-С₁-С₆-алкилен, С₁-С₆-алкокси, С₃-С₆циклоалкил, С₁-С₆-алкокси-С₁-С₆-алкилен, амино, циано, галоген или арил;

каждый Я^а и Я^ь независимо представляет собой водород, С₁-С₂₀-алкил, С₃-С₈-циклоалкил, С₁-С₆алкокси, гало-С₁-С₆-алкил, С₃-С₈-циклоалкил-С₁-С₆-алкил, С₁-С₆-алканоил, гидрокси-С₁-С₆-алкил, арил, арил-С₁-С₆-алкил, Не!, Не!-С₁-С₆-алкил или С₁-С₆-алкоксикарбонил;

Я^х представляет собой -Х²-((Я³)г-(Я⁴)5)_р;

каждый X² независимо представляет собой амидосвязующую группу, алкиламидосвязующую группу, замещенное 5-6-членное кольцо или кислородсодержащий фрагмент;

каждый Я³ независимо представляет собой полиэтиленгликолевый (РЕС) фрагмент, который представляет собой -О-СН₂-СН₂- или -СН₂-СН₂-О-;

каждый Я⁴ независимо представляет собой Н, -С1-С6-алкил, -С1-С6-алкокси, -ΝΕΈ¹’, -Ν3, -ОН, -ΟΝ, -СООН, -СООЯ¹, -Ц-С^алкил^Я'Я¹³, С1-С6-алкил-ОН, С1-С6-алкил-СН С1-С6-алкил-СООН, С1-С6алкил-СООЯ¹, 5-6-членное кольцо, замещенное 5-6-членное кольцо, -С1-С₆-алкил-5-6-членное кольцо, -С₁-С₆-алкилзамещенное 5-6-членное кольцо, С₂-С₉-гетероциклил или замещенный С₂-С₉-гетероциклил;

т представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

η представляет собой 0, 1, 2, 3 или 4;

р представляет собой от 1 до 100;

с.| представляет собой 1, 2, 3, 4 или 5;

г представляет собой от примерно 5 до примерно 100;

5 представляет собой от 1 до 1000;

сумма η и с.| равна 5.

2. Соединение по п.1, в котором X¹ представляет собой кислород.

3. Соединение по п.1 или 2, в котором Я¹ представляет собой замещенный С1-С6-алкил или С1-С10алкил-С1-С10-алкокси-фрагмент, предпочтительно Я¹ представляет собой -СН2СН₂ОСН₃.

4. Соединение по любому из пп.1-3, в котором X² представляет собой -С(О^Н-, ^Н(О)С-, -С₁-С₆алкил-С(О)NН-, -С₁-С₆-алкил-NН(О)С-, -С(О)NН-С₁-С₆-алкил-, -NН(О)С-С₁-С₆-алкил-, -С₁-С₆-алкилNН(О)С-С₁-С₆-алкил-, -С₁-С₆-алкил-С(О)NН-С₁-С₆-алкил или -С(О)NН-(СН₂)₁-, где ΐ равно 1, 2, 3 или 4.

5. Соединение по любому из пп.1-4, в котором η равно 4 и Я² представляет собой водород в каждом случае.

6. Соединение по любому из пп.1-5, в котором каждое РЕС звено представляет собой -О-СН₂-СН₂или СН2-СН2-О-.

7. Соединение по любому из пп.1-6, в котором г равно от примерно 5 до примерно 50, предпочти

- 29 019768 тельно от примерно 5 до примерно 25, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 15 и наиболее предпочтительно г равно примерно 10.

8. Соединение по любому из пп.1-7, в котором 5 равно от примерно 5 до примерно 100, предпочтительно от примерно 5 до примерно 50, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 25, еще более предпочтительно от примерно 5 до примерно 15, наиболее предпочтительно 5 равно примерно 10.

9. Соединение по любому из пп.1-8, в котором один или более РЕС фрагментов являются линейными или в котором один или более РЕС фрагментов являются разветвленными.

10. Соединение по любому из пп.1-9, в котором каждый заместитель К⁴ независимо представляет собой Н, С1-С2-алкил, -С1-С2-алкокси (например, -ОСН3), -ΝΚΈ¹’, -ОН, -ΟΝ, -СООН, -СоОк¹, -С1-С₂алкил^К^аК^Ь, С1-С₂-алкил-ОН, С1-С₂-алкил-СН С1-С₂-алкил-СООН или С1-С₂-алкил-СООК¹.

11. Соединение по любому из пп.1-10, в котором т равно 1.

12. Соединение по п.11, в котором К² представляет собой водород, η равно 4, с.| равно 1, р равно 1, г равно примерно 10 и 5 равно 1.

13. Фармацевтическая композиция для применения в медицинской терапии аутоиммунного нарушения или заболевания или воспалительного нарушения или заболевания, включающая фармацевтически приемлемую соль соединения по любому из пп.1-12.

14. Фармацевтическая композиция по п.13, в которой фармацевтически приемлемая соль является приготовленной с использованием кислоты, выбранной из группы, состоящей из соляной, бромистоводородной, серной, сульфаминовой, фосфорной, азотной кислоты, уксусной, пропионовой, янтарной, гликолевой, стеариновой, молочной, яблочной, винной, лимонной, аскорбиновой, памовой, малеиновой, гидроксималеиновой, фенилуксусной, глутаминовой, бензойной, салициловой, сульфаниловой, 2ацетоксибензойной, фумаровой, толуолсульфоновой, метансульфоновой, этандисульфоновой, щавелевой и изэтионовой кислоты.

15. Фармацевтическая композиция по п.13, в которой фармацевтически приемлемая соль является приготовленной с использованием основания, выбранного из группы, состоящей из гидроксида калия, гидроксида натрия, гидроксида аммония, кофеина и амина.

16. Применение соединения по любому из пп.1-12 или фармацевтической композиции по любому из пп. 13-15 в эффективном количестве для профилактики, ингибирования или лечения аутоиммунного состояния у млекопитающего, предпочтительно человека.

17. Применение соединения по любому из пп.1-12 или фармацевтической композиции по любому из пп.13-15 в эффективном количестве для профилактики, ингибирования или лечения воспалительного состояния у млекопитающего, предпочтительно человека.

18. Применение соединения по любому из пп.1-12 для изготовления лекарственного средства для профилактики, ингибирования или лечения аутоиммунного нарушения или заболевания или воспалительного нарушения или заболевания.

19. Соединение по п.1, в котором замещенное 5-6-членное кольцо представляет собой арильное кольцо или гетероарильное кольцо.

20. Соединение по п.19, в котором гетероарильное кольцо представляет собой тетразол, пиридил, 2,5-пирролидиндион или замещенный 2,5-пирролидиндион.

21. Соединение по п.1, в котором замещенное 5-6-членное кольцо представляет собой карбоциклическое кольцо или гетероциклическое кольцо.

22. Соединение по п.1, в котором кислородсодержащий фрагмент представляет собой -О- или -С₁С₆-алкокси.