KR101445100B1 - 돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물 - Google Patents

Abstract

돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물 및 돌단풍 추출물을 포함하는 항염 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물이 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은, 돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물을 포함하며, 항염용 조성물은 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제하고, 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS), 시클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 또는 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6)의 활성을 억제시키는 효과가 있다.

Description

돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물{Anti inflammatory composition comprising extract of aceriphyllum rossi}

본 발명은 돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 돌단풍 추출물을 포함하며, 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제하고, 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS), 시클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 또는 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6)의 활성을 억제시키는 항염용 조성물에 관한 것이다.

화장품은 피부를 보호하고 미화 청결을 위해 사용하지만 이와 같은 목적과 달리 화장품의 제조를 위해 사용하는 일부 성분들(계면활성제, 방부제, 향, 색소, 자외선 차단제 등)과 세균감염, 자외선 등과 같은 외부의 유해자극은 피부에 염증이나 뾰루지 등 피부 트러블을 유발하는 것으로 알려져 있다.

염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부 감염원(박테리아, 바이러스, 곰팡이, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화 염증 매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증 반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능 회복을 하지만 항원이 제거되지 않거나 내부 물질이 원인이 되어 염증 반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환에 이른다.

현재까지 염증 완화 목적으로 사용하는 항염제는 비스테로이드계로 이부프로펜(ibuprofen), 플루페나믹산(flufenamic acid) 및 인도메타신(indomethacin) 등이 있고 스테로이드계로는 프레드니솔론(prednisolone) 및 덱사메타손(dexamethasone) 등이 있으며 알란토인, 감초산 및 그 유도체 등이 항염 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 인도메타신 등은 화장품에 사용할 수 없으며 감초산 및 그 유도체는 제형상의 문제로　실제 적용농도에 제한이 있어 충분한 항염 효과를 발휘하기 어렵다. 따라서 소비자가 체감할 정도의 충분한 항염 효과를 갖는 원료 개발이 절실히 요구되고 있다.
KR10-2009-0076466A1 에도 항염효과가 개시되어 있습니다.

한편, 현재까지 염증 완화 목적으로 사용하는 항염제는 비스테로이드계로 이부프로펜(ibuprofen), 플루페나믹산(flufenamic acid) 및 인도메타신(indomethacin) 등이 있고 스테로이드계로는 프레드니솔론(prednisolone) 및 덱사메타손(dexamethasone) 등이 있으며 알란토인, 감초산 및 그 유도체 등이 항염 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 인도메타신 등은 화장품에 사용할 수 없으며 감초산 및 그 유도체는 제형상의 문제로　실제 적용농도에 제한이 있어 충분한 항염 효과를 발휘하기 어렵다. 따라서 소비자가 체감할 정도의 충분한 항염 효과를 갖는 원료 개발이 절실히 요구되고 있다. 특히, 인체에 대한 부작용을 최소화할 수 있는 생약제제로부터 항염 효과를 갖는 원료를 개발하는 것이 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 돌단풍 추출물이 항염 효과가 있음을 확인하고, 돌단풍 추출물을 포함하는 조성물을 제조하게 되었다.

이에, 본 발명이 해결하려는 과제는, 돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 돌단풍 추출물을 포함하는 항염 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 해결하려는 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 해결하려는 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 항염용 조성물은, 돌단풍 추출물을 포함한다.

상기 돌단풍 추출물은 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제한다.

상기 돌단풍 추출물은 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS), 시클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 또는 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6)의 활성을 억제한다.

상기 돌단풍 추출물은 메탄올, 에탄올, 헥산, 물 및 1,3-부틸렌글라이콜로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 사용하여 추출된다.

상기 해결하려는 다른 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 항염 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물은, 돌단풍 추출물을 포함한다.

상기 돌단풍 추출물은 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제한다.

상기 돌단풍 추출물은 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS), 시클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 또는 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6)의 활성을 억제한다.

상기 돌단풍 추출물은 메탄올, 에탄올, 헥산, 물 및 1,3-부틸렌글라이콜로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 사용하여 추출된다.

상기 돌단풍 추출물은 상기 화장료 조성물에 0.0025 내지 0.01 중량%로 함유된다.

상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 에센스 및 영양크림으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 형성된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은, 돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물을 포함하며, 항염용 조성물은 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제하고, 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS), 시클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 또는 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6)의 활성을 억제시키는 효과가 있다.

도 1은 돌단풍 추출물이 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS)의 활성을 억제하는 것을 나타낸 X-ray 필름이다.
도 2는 돌단풍 추출물이 인터류킨 IL-6(InterLeukin-6)의 활성을 억제하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 3은 돌단풍 추출물이 시클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase, COX-2)의 활성을 억제하는 것을 나타낸 그래프이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

이하, 본 발명의 실시예들에 따른 돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물 및 돌단풍 추출물을 포함하는 항염 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물을 설명한다.

먼저, 본 발명의 일 실시에에 따른 항염용 조성물은 돌단풍 추출물을 포함할 수 있다.

돌단풍(Aceriphyllum rossi)은 장미목 범의귀과의 쌍떡잎식물에 속하는 높이가 10~30㎝인 다년생 초본으로 돌나리 또는 장장포라고도 불리운다. 잎이 단풍나무와 비슷하고 돌에서 자란다고 돌단풍이라 명명되었다.

돌단풍의 꽃, 손바닥 모양의 잎은 가장자리가 5~7개로 깊게 갈라지고 톱니가 있으며, 표면은 광택이 난다. 특히 어린잎은 식용한다. 돌단풍은 강심, 이뇨작용의 효능이 있어 심계항진, 소변불리에 하루 10~15 g을 물로 달여서 복용한다. 민간에서는 뿌리를 석창포 대용으로 사용하기도 한다. 돌단풍의 유효성분으로는 트리테르펜 화합물과 플라보노이드 화합물이 들어 있다. 트리테르펜 화합물은 암세포(K562, HL-60)에 대한 세포독성과 ACAT 제해 활성이 알려져 있으며, 플라보노이드계 화합물은 항산화 활성이 보고되어 있다(Han et al., Arch Pharm Res 27:390-395, 2004).

한편, 사람의 신체방어는 면역반응을 통하여 병원체로부터 보호받을 수 있다. 바이러스나 박테리아와 같은 외래 미생물에 대한 생체방어 기작으로는 자연면역(innate immunity)과 특이면역(specific immunity)으로 나뉘어지며, 이는 면역관련 세포에서 주로 분비되는 사이토카인에 의해서 매개된다.

염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상분위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 프로스타글란딘(prostaglandins), HETE (hydroxyicosatetraenoic acid), 류코트린(leukotriene)과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다. 그러나 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 일으킨다.

내독소로 잘 알려진 LPS (lipopolysaccaride)는 그람-음성세균의 세포외막에 존재하며, 대식세포 (macrophage) 또는 단핵세포 (monocyte)로부터 다양한 염증 발병 인자로 알려진 TNF-α, IL-6(InterLeukin-6), IL-1β(InterLeukin-1β)와 같은 염증유발 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

한편, IL-6은 B세포의 항체생산세포로의 최종 분화를 유도하는 B세포자극인자2(BSF-2)로, 분리한 분자량이 210,000인 당단백질. T림프구, B림프구, 대식세포, 섬유아세포 등 여러 세포에서 생산되는 시토카인으로, 인터페론β2(IFN-β2와 동일분자이다. 면역응답, 조혈계와 신경계세포의 증식 및 분화, 급성 반응 등에 관여한다. 사람의 IL-6은 28개의 신호펩티드를 포함한 212개의 아미노산잔기, 마우스 IL-6는 24개의 신호펩티드를 포함한 211개의 아미노산잔기로구성되어 있다. 사람과 마우스 사이에는 아미노산배열에 42%의 상동성이 있다. 그 유전자자리는 사람은 제 7염색체에, 마우스는 제 5염색체에 위치하며 모두 5개의 발현부위로 구성되어있다. IL-6의 과잉 생산은 여러 가지 면역이상증, 염증성 질환, 림프계 종양의 발증과 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

또한, 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제(phospholipase) A2의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)를 프로스타글란딘(prostaglandins, PGs)으로 바뀌는 과정 및 일산화질소(nitric oxide, NO) 형성 과정으로 이어지게 된다. 즉, 염증이 발생될 경우, 일산화질소가 형성될 수 있는데, 본 발명의 일 실시예에 따른 돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물은 돌단풍 추출물에 의해 일산화질소의 생성을 억제할 수 있다. 이에 대해서는 후술할 실험예를 통해 설명한다.

시클로옥시게나아제(cyclooxygenase, COX)는 아라키돈산(arachidonic acid)을 PGs으로 전환시키는 효소로써 시클로옥시게나아제-1(cyclooxygenase, COX-1)과 시클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase, COX-2)로 분류된다. COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장기능의 유지 등 정상적인 생체기능에 작용하지만, COX-2는 염증매개물질인 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2, PGE2)를 형성시킨다. PGE2와 같은 물질은 염증반응, 면역반응, 그리고 신생혈관생성(angiogenesis)을 촉진 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

체내 염증과정에서는 과량의 일산화탄소(NO) 및 PGE2 등의 염증인자가 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS)라는 유도성 또는 상존성 효소에 의하여 생성되는 반응성 라디컬(radical)로서 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장 등의 다양한 생리 기능을 가지고 있다.

즉, 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS)는 생체 내에서 염증 반응에 동반하는 일산화질소(NO) 생성을 담당하는 효소로써, 사이토킨 네트워크(cytokine network)에 의해 제어되며, 이 때 생성되는 일산화탄소(NO)는 염증에서 화학적 매개체(chemical mediator)의 역할로 기능할 수 있다.

유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS)에 의해 일산화탄소(NO)가 생성되어 체내에 누적되면 신체에 고통을 가할 수 있어, 일산화질소(NO)의 누적을 방지하는 것이 필요하다. 이에 의해, 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS)의 활성을 억제시킴으로써 일산화질소(NO)의 생성을 억제하는 것이 필요하다.

NF-κB는 염증반응, 면역 반응 등 다양한 유전자의 발현에 관여하는 전사인자로서 조양형성, 자가면역질환, 염증질환에 주용한 역할을 담당하는 것으로 알려져있다. 세포질 속에서 p65와 p50의 헤테로다이머(heterodimer)와 억제 단백질인 inhibitory-κB (I-κB)와 함께 비활성 상태로 존재하다가 외부로부터 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS) 또는 사이토카인과 같은 염증성 자극이 주어지면 I-κB kinase가 활성화되어 분해되고 헤테로다이머(heterodimer)는 활성화되어 핵안으로 이동하여 염증반응을 유도하는 사이토카인, iNOS, COX-2등의 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물은 돌단풍 추출물에 의해 상술한 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS), 시클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 또는 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6)의 활성을 억제할 수 있다. 이에 대해서는 후술할 실험예를 통해 설명한다

아스피린이 개발된 이래로 오랫동안 비스테로이드성 항염증 약물의 사용은 통증을 완화시켜왔으며, 비마약성 진통제의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 이 약의 장기 사용은 위궤양, 출혈, 천공과 같은 심각한 부작용을 초래하여 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급한 실정이다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

본 연구에서는 돌단풍 추출물에 대해 RAW 264.7 세포에 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)를 처리하여 염증성 사이토킨(cytokine), 일산화탄소(nitric oxide, NO), 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS), 시클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 및 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6) 생성억제 정도를 평가하였다.

돌단풍 추출물은 메탄올, 에탄올, 헥산, 물, 1,3-부틸렌글라이콜 중 어느 하나 이상을 사용하여 추출될 수 있다. 구체적으로, 추출용매로서 메탄올, 에탄올, 헥산, 물, 1,3-부틸렌글라이콜을 포함하는 극성 용매와 이들의 혼합 용매를, 돌단풍의 잎, 줄기 또는 뿌리를 20:1의 비율로 혼합하여 침적 추출하여 여과한 후 여액을 감압 농축한다

본 발명의 일 실시예에 따른 돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물은 예를 들어, 약학 조성물로 활용될 수 있다.

약학 조성물로 사용될 경우, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이러한 고형제제는 상기 돌단풍 추출물 및 이로부터 분리된 아세리필릭산 에이와 3-옥소-12-올레아넨-27-오익산에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 일 실시예 따른 돌단풍 추출물은 항염 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물에 포함될 수 있다.

돌단풍 추출물은 상기 화장료 조성물에 0.0025 내지 0.01 중량%로 함유될 수 있다. 돌단풍 추출물의 함량이 0.0025중량% 미만이면, 돌단풍 추출물에 의한 상기 항염효과가 나타나기 어렵고, 돌단풍 추출물의 함량이 0.01중량%를 초과하면, 돌단풍 추출물의 독성이 나타날 수 있어, 바람직하지 않을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 에센스 및 영양크림으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 형성될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 돌단풍 추출물은, 피부보습용 화장료 제형으로써 용출물, 용출액, 용출물 또는 용출액의 건조분말을 그대로 도포하는 것이 적합하나, 통상의 외용의 제제 또는 화장료 형태로 제형화 할 수 있다.

본 발명의 추출물, 글루코만난을 함유하는 조성물은 피부 보습 효과를 위한 화장품, 세안제 및 샴푸 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 샴퓨, 린스, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

또한, 본 발명의 추출물, 글루코만난을 함유하는 피부보습용 화장료 조성물은 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명에 의한 피부보습용 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 젤, 파우더, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 겔, 패취, 미용액, 클렌징 폼, 클렌징크림, 클렌징 워터, 비누 또는 분무제 등과 같은 제형을 들 수 있다.

각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 추출물, 글루코만난 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의선정하여 배합할 수 있다.

상기한 제제는 보습 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예에 의하여 상세하게 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니며, 실시예는 본 발명의 내용을 용이하게 이해할 수 있도록 제시하는 것일 뿐이다.

실시예 - 돌단풍 추출물의 제조

1-1. 추출물(1)

돌단풍과 95% 메탄올을 1:20 비율로 넣고 3일 간 상온 침지하였다. 이 과정을 3 회 반복하여 추출한 후, 380 메쉬로 여과하고 0.45㎛ 멤브랜 필터로 여과하였다. 이 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40 ℃로 감압 농축한 후 감압 증발하여 농축물을 얻었다.

1-2. 추출물(2)

돌단풍과 70% 에탄올을 1:20 비율로 넣고 3일 간 상온 침지하였다. 이 과정을 3 회 반복하여 추출한 후, 380 메쉬로 여과하고 0.45㎛ 멤브랜 필터로 여과하였다. 이 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40 ℃로 감압 농축한 후 감압 증발하여 농축물을 얻었다.

1-3. 추출물(3)

돌단풍과 헥산(hexane)을 1:20 비율로 넣고 3일 간 상온 침지하였다. 이 과정을 3 회 반복하여 추출한 후, 380 메쉬로 여과하고 0.45㎛ 멤브랜 필터로 여과하였다. 이 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40 ℃로 감압 농축한 후 감압 증발하여 농축물을 얻었다.

1-4. 추출물(4)

돌단풍과 물을 1:20 비율로 넣고 100℃에서 3시간 동안 추출하였다. 추출 후, 380 메쉬로 여과하고 0.45㎛ 멤브랜 필터로 여과하였다. 이 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40 ℃로 감압 농축한 후 감압 증발하여 농축물을 얻었다.

1-5. 추출물(5)

돌단풍과 1,3-부틸렌글라이콜을 1:3 비율로 넣고 3일 간 상온 침지하였다. 추출한 후, 380 메쉬로 여과하고 0.45㎛ 멤브랜 필터로 여과하였다. 이 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40 ℃로 감압 농축한 후 감압 증발하여 농축물을 얻었다.

실험예 1. MTT 분석 방법을 이용한 세포 생존능 측정

마우스 대식세포 Raw 264.7 cell을 5x10⁴ cells/ml 농도로 하여 96well plate에 100㎕씩 분주하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이때 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 배양 한 후 소혈청과 항생제가 배제된 DMEM 배지로 교체한 후, 시료를 농도 별로 첨가한 후, 같은 배양조건에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 5㎎/㎖ MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 시약을 첨가하여 동일 조건에서 3시간 배양한다. 그 후 배양액을 제거하고 DMSO(Dimetyl sulfoxide)을 100㎕씩 넣은 후 10분 동안 쉐이킹 한 다음 마이크로플레이트계수기(Micro plate reader) 570nm 에서 결과값을 측정하였다.

실험결과 모든 시료는 25㎍/㎖ 이하 농도에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

추출물 (1)
시료 (㎍/㎖)	Blank	100	75	50	25	10	5	1	0.5
Cell proliferation (%)	100	65	72.3	75.1	86.2	95.7	102.1	104.6	115.2

추출물 (2)
시료 (㎍/㎖)	Blank	100	75	50	25	10	5	1	0.5
Cell proliferation (%)	100	67.3	78.1	76.5	87.4	95.8	106.9	112.3	106.9

추출물 (3)
시료 (㎍/㎖)	Blank	100	75	50	25	10	5	1	0.5
Cell proliferation (%)	100	75.6	78.1	79.3	87.6	98.1	103.8	106.2	110.9

추출물 (4)
시료 (㎍/㎖)	Blank	100	75	50	25	10	5	1	0.5
Cell proliferation (%)	100	80.2	84.2	86.7	92.1	95.8	105.6	118.2	115.3

추출물 (5)
시료 (㎍/㎖)	Blank	100	75	50	25	10	5	1	0.5
Cell proliferation (%)	100	74.6	78.2	79.2	86.4	98.2	102.6	104.2	111.2

실험예 2. Griess 분석 방법을 이용한 nitrite 측정

마우스 대식세포 Raw 264.7 cell을 5x10⁵ cells/ml 농도로 하여 96well plate에 100㎕씩 분주하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이때 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 배양 한 후 소혈청과 항생제가 배제된 DMEM 배지로 교체한 후, 시료를 농도 별로 첨가한 후, 같은 배양조건에서 10분 배양한 후 1㎍/㎖LPS를 1㎕씩 넣고 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 Griess reagent 시약 Ⅰ과 Ⅱ를 동량 섞은 후 배양한 배지와 50㎕씩 96well plate에 넣은 후 37℃, 인큐베이터에서 10분 반응시킨 후, 마이크로플레이트계수기(Micro plate reader) 540nm 에서 결과값을 측정하였다.

실험 결과 추출물 (1)의 효과가 가장 높게 나타났고, 전반적으로 돌단풍 추출물을 포함하지 않는 대조구에 비하여 일산화질소(NO)의 생성이 억제되었음을 알 수 있었다.

	대조구	추출물 (1)	추출물 (2)	추출물 (3)	추출물 (4)	추출물 (5)
농도 (㎍/㎖)		25
NO 생성량 (%)	100	23.4	49.2	35.1	72.3	60

실험예 3. iNOS 발현 억제 효과

Raw 264.7 cell을 10% FBS-DMEM에 배양한 후, 이를 취하여 세포농도를 5 × 10⁶cell/㎖로 조정한 세포액을 조제한 후, 이를 6well plate에 2㎖씩 분주하고, 이를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 18시간 배양시켰다. 18시간 배양 후, 배지를 제거한 후 배지 1.8㎖과 농도별 시료 200㎕, 1㎍/㎖ LPS 1㎕을 혼합한 뒤 다시 동일 조건에서 24시간 배양시켰다. 이 때 Blank의 경우, 배지만을 넣었다. 24시간 배양한 후, 각 플레이트 내의 세포를 회수하여 이를 microtube에 획득한 뒤 원심분리하여 상등액을 제거했다. 분리된 pellet을 1×PBS(-)로 1회 세척한 뒤 이를 원심분리 한 후, pellet에 PRO-PREP^TM Protein Extract Solution (Intron, Inc.)을 400㎕씩 처리하여 -20℃에서 15분 반응시켰다. 원심분리(13,000rpm, 5분)한 후, supernant를 1.5ml tube로 옮긴 후 -20℃에 보관한다.

정제한 단백질을 8% SDS-PAGE을 이용해 전기영동하고 이를 PVDF membrane (GEhealthcare)으로 이전시켰다. 5% skim milk가 함유된 tris 완충용액에서 1시간 blocking 과정을 거친 후, 1차 항체와 반응시켰다. Horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 2차 항체를 가하고, Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore)를 사용하여 1~3분 동안 반응시킨 후 X-ray 필름으로 현상하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하면, 돌단풍의 추출물 농도가 증가할수록, X-ray 필름에 나타난 iNOS의 양이 줄어듬을 알 수 있었다. 즉, 돌단풍 추출물은 iNOS의 활성을 억제함을 알 수 있었다.

실험예 4. 염증성 인자 ( COX -2, IL -6)의 정량

Raw 264.7 세포를 1.5X10⁵ cell/ml로 18시간 배양하고 시료와 1㎍/㎖ LPS 1㎕를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 12,000rpm, 3분 원심분리하여 얻어진 상층액으로 함량을 측정하였다. 정량은 ELISA kit (R&D system, USA)를 이용하여 정량하였으며, standard에 대한 표준곡선의 r² 값은 0.99 이상 이었다.

실험 결과는 도 2 및 도 3과 같으며, 모두 농도 의존적으로 생성량을 감소시킴을 알 수 있으며, 이 결과를 토대로 돌단풍은 염증 매개 인자에 대한 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.

한편, 본 발명의 돌단풍 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제형예를 하기에서 설명하지만, 본 발명의 조성물이 이 예로만 한정되는 것은 아니다.

제형예 1

상기 실시예의 추출물(1)을 함유한 화장료 중 유연화장수의 제형예는 다음과 같다.

성분	함량(중량%)
추출물 (1)	0.0025
폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.5
글리신	3.0
디포타슘글리시리제이트	0.1
1,3-부틸렌 글리콜	3.0
소듐히아루로네이트	0.1
에탄올	5.0
항산화제	0.1
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
방부제	적량
정제수	잔량

[제조방법]

소듐히아루로네이트는 정제수에 프로펠러믹서 3000rpm으로 분산하여 1% solution 으로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1~8을 프로펠러믹서 500rpm으로 균일화 및 75℃ 가온 하여 완전 용해 한 후, 실온으로 냉각하였다. 별도 용해조에 원료 9~11을 완전 용해 하여 상기 수상 용해조에 투입 한 후, 교반 혼합하였다. 여기에 담나칸탈을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 담나칸탈을 함유한 유연화장수를 제조 하였다.

제형예 2

상기 실시예의 추출물(1)을 함유한 화장료 중 영양화장수의 제형예는 다음과 같다.

성분	함량(중량%)
추출물 (1)	0.0025
글리세린	7.0
소르비탄스테아레이트 슈크로오즈코코에이트	2.0
미네랄 오일	4.0
트리옥타노인	1.0
스테아릭에씨드	1.0
글리세릴 스테아레이트	0.5
소르비탄모노스테아레이트	1.0
디메치콘	0.5
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
카보머	0.2
EDTA	0.1
방부제	적량
정제수	잔량

[제조방법]

카보머는 정제수에 프로펠러믹서 4000rpm으로 분산하여 2% solution으로 준비하였다. 수상용해조에 원료 1~6을 투입하여 호모 2000rpm으로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 7~13을 투입하여 75℃까지 가온 용해하였다. 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/5분) 시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 담나칸탈을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 담나칸탈을 함유한 영양화장수를 제조 하였다.

제형예 3

상기 실시예의 추출물(1)을 함유한 화장료 중 에센스의 제형예는 다음과 같다.

성분	함량(중량%)
추출물 (1)	0.0025
글리세린	5.0
1,3-부틸렌 글리콜	2.0
폴리에칠렌 글리콜	2.0
카보머	1.0
소듐히아루로네이트	0.1
글리신	3.0
폴리아크릴아마이드	2.0
히드록시에칠셀룰로이즈	0.2
에탄올	3.0
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
폴리옥시에칠렌경화피마자유	1.0
EDTA	0.1
방부제	적량
정제수	잔량

[제조방법]

소듐히아루로네이트, 히드록시에칠셀룰로이즈는 각각 정제수에 프로펠러믹서 2000rpm으로 분산하여 1% solution으로 준비하였다. 카보머는 정제수에 프로펠러믹서 4000rpm으로 분산하여 2% solution으로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1~12를 투입하여, 호모 2000rpm으로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 가온 된 수상을 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 13~15를 완전 용해 시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하여 교반 혼합하였다. 여기에 담나칸탈을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 담나칸탈을 함유한 에센스를 제조 하였다.

제형예 4

상기 실시예의 추출물(1)을 함유한 화장료 중 영양크림의 제형예는 다음과 같다.

성분	함량(중량%)
실시예 (1-1)	0.0025
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	3.0
하이드로제네이티드 레시친	1.0
옥틸도데카놀	3.0
트리옥타노인	2.0
스테아릭에씨드	1.5
세토스테아릴알콜	2.0
폴리솔베이트60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	2.0
디메치콘	3.0
항산화제	0.3
산탄검	0.2
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
방부제	적량
정제수	잔량

[제조방법]

수상용해조에 원료 1~8을 투입하여 호모 2000rpm으로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 9~16을 투입하여 80℃까지 가온 용해하였다. 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/10분) 시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 담나칸탈을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 담나칸탈을 함유한 영양크림을 제조 하였다.

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (10)

1. 돌단풍 추출물을 포함하는 항염용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 돌단풍 추출물은 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제하는 항염용 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 돌단풍 추출물은 유발 유도성 일산화질소(nitric oxide synthase, iNOS), 시클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 또는 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6)의 활성을 억제하는 항염용 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 돌단풍 추출물은 메탄올, 에탄올, 헥산, 물 및 1,3-부틸렌글라이콜로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 사용하여 추출된 항염용 조성물.
   
   
   
   
   
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 돌단풍 추출물이 상기 항염용 조성물에 0.0025 내지 0.01 중량%로 함유된 항염용 조성물.
   
   
   
10. 삭제

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