KR101178140B1 - 유전자재조합 옥수수 검출방법 및 검출용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자재조합 옥수수 검출방법 및 검출용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 멀티플렉스 실시간 PCR 방법에 의한 유전자재조합 옥수수의 함유 여부 및 12종의 유전자재조합 옥수수 품종을 동시에 신속 정확하게 검출하는 방법 및 상기 방법을 실시하기 용이한 검출 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유전자재조합 옥수수 검출방법 및 검출용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 멀티플렉스 PCR로 12종의 유전자재조합 옥수수 품종을 신속, 정확하게 검출할 수 있는 방법 및 검출용 조성물에 관한 것이다.
세계의 인구증가 동향을 살펴보면 인류역사 100만 년 중 처음 99만 년 동안의 최대인구는 6백만명(인구증가율 : 0.01%)에 지나지 않았으나, 3000~4000년 전부터 급속한 인구증가가 일어나 현재 세계인구는 60억 이상이며, 인구증가율이 연평균 1.7%로 지난 99만년 동안 증가량의 1700배에 이른다. 이에 따라 세계의 식량 요구량도 증가하여 1980년에 14억 톤이 생산되었으나 2000년에는 21~22억 톤의 식량이 필요하게 되었다.
식량 생산을 기준으로 농민 1인이 부양하는 인구를 살펴보면 원시시대에는 자급자족의 형태였지만 지금은 38명 이상을 담당해야 한다. 이에 따라 인구 증가에 비례하여 필요한 식량의 수요에 부응하기 위해 전통적 육성방법에 의한 우량 품족의 개발 및 재배를 통한 농작물의 획기적인 증산을 다각도로 시도해 왔으나, 경작 면적의 제한, 병충해, 자연재해 등으로 필요 생산량의 절대적 한계가 지적되어 새로운 과학기법에 의한 다수확 신품종 개발이 요구되어 왔다. 여기에 발맞춰 최근 생명공학기술의 발달로 제초제 저항성, 병충해 저항성 또는 저장성 및 영양학적으로 향상된 특성을 갖는 유전자재조합식품(Genetically Modified Organism; 이하 'GMO')이 개발되어 실용화 단계에 이르렀다.
GMO 개발은 상업적인 면에서 종자판매, 농약판매 등에 의한 수익과 농민들에게는 생산비 절감, 농업 생산의 양과 질을 향상시키게 되었고, 소비자 측면에서는 기능성 식품, 영양 강화 등의 장점이 있으며, 사화적으로는 식량문제 해결 등의 이점이 있다. 이러한 이유로 세계적으로 GMO의 소비가 빠르게 증가하고 있다.
그러나 이러한 이점들에도 불구하고 건강상으로는 예기치 못한 유전자 상호작용에 의한 독성물질의 생성, 알레르기 유발, 항생제 내성, 유전자 전이, 살충제 남용에 의한 암발생 증가, 생태계의 유전자 오염 등을 유발할 수 있다는 연구들이 재개되면서 GMO의 안정성 문제가 논란의 대상이 되고 있다. 이에 대부분의 국가에서는 GMO가 포함된 식품에 GMO의 함량을 표시하여 소비자가 선택할 수 있도록 하고 있다.
따라서, 하루가 다르게 늘어가는 GMO의 함량을 표시하기 위해서는 빠르고 정확한 검사법이 필요하다. 하지만, 현재 국내 GMO 검사법에 사용되고 있는 일반 PCR 기법은, 결과를 확인하기 위해서 PCR 반응이 끝난 후 추가 시간이 필요한 젤 전기영동 과정이 필요하고, 젤 전기영동 과정 중 PCR 반응튜브를 열기 때문에 PCR 생성물에 의한 오염이 빈번히 발생한다. 또한, 일반 PCR 기법은 젤 전기영동 결과에 나타나는 벤드의 위치와 두께를 눈으로 보고 판단하는 정성적 실험 기법이다. 이러한 정성적 기법을 이용해서는 식료품내의 GMO 함량을 정확히 측정하는 것은 실질적으로 무리가 있다.
원곡에 한해서는 몇가지 GMO 품종에 대해 RT-PCR을 이용한 정량법이 존재하지만 식료품에 대해서는 가공도중 발생할 수 있는 DNA 파괴 (열, 압력 등)와 GMO 원곡 이외에 사용되는 다양한 종류의 첨가물에 의한 PCR 저해효과 때문에 그 결과를 인정하지 않고 있다.
따라서, GMO 품종을 동시에 신속 정확하게 분석하여, 자동화된 방식으로 그 결과를 산출할 수 있는 보다 효율적인 방법이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 실시간 PCR을 이용하여 다수 종의 GMO 옥수수 품종을 동시에 검출할 수 있는 방법 및 키트에 대하여 다각적 연구를 수행하던 중, 하나의 검사 반응물에서 각각의 GMO를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍, 각 증폭된 산물을 탐지하는 프로브, 상기 3종 이상의 프라이머 쌍 및 프로브가 조합된 상태에서도 서로 다른 고유 타겟을 증폭 및 탐지할 수 있는 프라이머 쌍 및 프로브, 검출 조건, 및 검출 결과를 한번에 파악할 수 있는 방법을 확립하게 되었으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 12종의 GMO 옥수수 품종을 복수개의 마커로 동시에 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 GMO 옥수수 포함 여부 및 포함된 GMO 옥수수 품종을 정확하게 판단할 수 있는 실시간 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 사용이 용이하며, 단시간에 신속 정확하게 GMO 옥수수 품종을 검출할 수 있는 검출 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 (1) 내지 (12)의 마커 세트를 포함하는, 유전자재조합 옥수수를 실시간 PCR로 검출하기 위한 유전자재조합 옥수수 검출용 조성물을 제공한다:
(1) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브;
(2) 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프로브;
(3) 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브;
(4) 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프로브;
(5) 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 프로브;
(6) 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 프로브;
(7) 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 프로브;
(8) 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 프로브;
(9) 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 프로브;
(10) 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 프로브;
(11) 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 33의 염기서열로 이루어진 프로브; 및
(12) 서열번호 34의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 36의 염기서열로 이루어진 프로브.
또한 본 발명은 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 상기 검출용 조성물을 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계; 및
상기 실시간 멀티플렉스 PCR 결과를 확인하여 유전자재조합 옥수수 품종을 판단하는 단계
를 포함하는 유전자재조합 옥수수 검출방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 유전자재조합 옥수수 검출용 조성물을 포함하는, 유전자재조합식품 검출키트를 제공한다.
본 발명의 유전자재조합 옥수수 검출용 조성물 및 검출방법은 실시간 멀티플렉스 PCR 방법에 의해 12종의 GMO 옥수수 품종을 동시에 검출함으로써, 시료 내 GMO 옥수수 함유 여부와 함유된 GMO 옥수수 품종을 신속 정확하게 판단할 수 있다.
도 1은 실험예 1에서 제작한 서열번호 41 및 서열번호 42의 P-35s 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 43의 P-35s 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 1에서 제작한 서열번호 44 및 서열번호 45의 T-NOS 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 46의 T-NOS 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에서 제작한 서열번호 47 및 서열번호 48의 SSIIb 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 49의 SSIIb 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 1에서 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 Mon810 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 Mon810 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 1에서 제작한 서열번호 4 및 서열번호 5의 Bt11 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 Bt11 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 1에서 제작한 서열번호 7 및 서열번호 8의 Bt176 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 Bt176 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 1에서 제작한 서열번호 10 및 서열번호 11의 T25 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 T25 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 1에서 제작한 서열번호 13 및 서열번호 14의 GA21 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 15의 GA21 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 1에서 제작한 서열번호 16 및 서열번호 17의 Mon863 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 18의 Mon863 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 10는 실험예 1에서 제작한 서열번호 19 및 서열번호 20의 TC1507 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 TC1507 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 1에서 제작한 서열번호 22 및 서열번호 23의 NK603 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 NK603 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 1에서 제작한 서열번호 25 및 서열번호 26의 CBH351 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 CBH351 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 1에서 제작한 서열번호 28 및 서열번호 29의 MIR604 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 30의 MIR604 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 1에서 제작한 서열번호 31 및 서열번호 32의 Mon88017 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 33의 Mon88017 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 실험예 1에서 제작한 서열번호 34 및 서열번호 35의 DAS59122-7 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 36의 DAS59122-7 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 실험예 1에서 제작한 서열번호 38 및 서열번호 39의 인간 GAPDH 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 40의 인간 GAPDH 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 실험예 3의 표 8에 기재된 유전자재조합 옥수수 스크리닌용 세트로 GMO 품종 Bt11 인증표준물질 DNA 주형에 대해 외부도입 양성시료로 서열번호 37의 인간 GAPDH DNA를 투입하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 실시예 1의 3종의 GMO 품종인 Bt11, Bt176, 및 Mon810에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 Bt11, Bt176, 및 Mon810 인증표준물질 DNA 주형에 대해 외부도입 양성시료로 서열번호 37의 인간 GAPDH DNA를 투입하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 실시예 2의 3종의 GMO 품종인 Mon863, T25, 및 TC1507에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 Mon863, T25, 및 TC1507 인증표준물질 DNA 주형에 대해 외부도입 양성시료로 서열번호 37의 인간 GAPDH DNA를 투입하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 실시예 3의 3종의 GMO 품종인 NK603, GA21, 및 DAS59122-7에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 NK603, GA21, 및 DAS59122-7 인증표준물질 DNA 주형에 대해 외부도입 양성시료로 서열번호 37의 인간 GAPDH DNA를 투입하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 실시예 4의 3종의 GMO 품종인 MIR604, Mon88017, 및 CBH351에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 MIR604, Mon88017, 및 CBH351 인증표준물질 DNA 주형에 대해 외부도입 양성시료로 서열번호 37의 인간 GAPDH DNA를 투입하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 KoRAS GMO version에서 실시간 PCR 결과 파일을 입력하는 화면의 일예를 보여주는 모식도이다.
도 23은 12종의 GMO 옥수수 품종에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 12종의 GMO 품종 인증표준물질 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 24는 12종의 GMO 옥수수 품종에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 12종의 GMO 옥수수 품종 인증표준물질 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 2는 실험예 1에서 제작한 서열번호 44 및 서열번호 45의 T-NOS 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 46의 T-NOS 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에서 제작한 서열번호 47 및 서열번호 48의 SSIIb 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 49의 SSIIb 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 1에서 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 Mon810 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 Mon810 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 1에서 제작한 서열번호 4 및 서열번호 5의 Bt11 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 Bt11 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 1에서 제작한 서열번호 7 및 서열번호 8의 Bt176 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 Bt176 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 1에서 제작한 서열번호 10 및 서열번호 11의 T25 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 T25 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 1에서 제작한 서열번호 13 및 서열번호 14의 GA21 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 15의 GA21 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 1에서 제작한 서열번호 16 및 서열번호 17의 Mon863 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 18의 Mon863 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 10는 실험예 1에서 제작한 서열번호 19 및 서열번호 20의 TC1507 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 TC1507 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 1에서 제작한 서열번호 22 및 서열번호 23의 NK603 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 NK603 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 1에서 제작한 서열번호 25 및 서열번호 26의 CBH351 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 CBH351 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 1에서 제작한 서열번호 28 및 서열번호 29의 MIR604 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 30의 MIR604 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 1에서 제작한 서열번호 31 및 서열번호 32의 Mon88017 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 33의 Mon88017 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 실험예 1에서 제작한 서열번호 34 및 서열번호 35의 DAS59122-7 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 36의 DAS59122-7 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 실험예 1에서 제작한 서열번호 38 및 서열번호 39의 인간 GAPDH 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 40의 인간 GAPDH 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 실험예 3의 표 8에 기재된 유전자재조합 옥수수 스크리닌용 세트로 GMO 품종 Bt11 인증표준물질 DNA 주형에 대해 외부도입 양성시료로 서열번호 37의 인간 GAPDH DNA를 투입하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 실시예 1의 3종의 GMO 품종인 Bt11, Bt176, 및 Mon810에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 Bt11, Bt176, 및 Mon810 인증표준물질 DNA 주형에 대해 외부도입 양성시료로 서열번호 37의 인간 GAPDH DNA를 투입하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 실시예 2의 3종의 GMO 품종인 Mon863, T25, 및 TC1507에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 Mon863, T25, 및 TC1507 인증표준물질 DNA 주형에 대해 외부도입 양성시료로 서열번호 37의 인간 GAPDH DNA를 투입하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 실시예 3의 3종의 GMO 품종인 NK603, GA21, 및 DAS59122-7에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 NK603, GA21, 및 DAS59122-7 인증표준물질 DNA 주형에 대해 외부도입 양성시료로 서열번호 37의 인간 GAPDH DNA를 투입하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 실시예 4의 3종의 GMO 품종인 MIR604, Mon88017, 및 CBH351에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 MIR604, Mon88017, 및 CBH351 인증표준물질 DNA 주형에 대해 외부도입 양성시료로 서열번호 37의 인간 GAPDH DNA를 투입하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 KoRAS GMO version에서 실시간 PCR 결과 파일을 입력하는 화면의 일예를 보여주는 모식도이다.
도 23은 12종의 GMO 옥수수 품종에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 12종의 GMO 품종 인증표준물질 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 24는 12종의 GMO 옥수수 품종에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 12종의 GMO 옥수수 품종 인증표준물질 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 12종의 GMO 옥수수 품종에 특이적인 표적 유전자를 PCR을 통해 증폭시키고, 동시에 증폭 산물에 혼성가능하며 검출가능한 수단으로 표지된 프로브를 반응시킴으로써, 실시간 PCR 방법을 통해 GMO 옥수수를 검출하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 각 GMO 옥수수 품종에 특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 한 마커 세트로 하여, 3종 이상의 마커 세트를 동시에 이용하는 방법으로, GMO 포함 여부 및 품종 확인에 필요한 과정을 현저하게 단축시킨 신속 정확한 방법이다.
본 발명에서 언급한 실시간 PCR 방법은 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 장치를 이용하여, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 얻고자하는 DNA의 양을 분석하는 방법을 의미한다. 실시간 PCR 방법은 PCR 증폭산물의 확인을 위한 전기영동이 필요 없으며, 증폭이 지수 함수적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물량을 비교하여 더욱 정확한 정량이 가능한, 신속성과 정량성이 뛰어난 방법이다.
본 발명의 바람직한 실험예 1을 참조하면, 각각의 GMO 품종에 특이적인 프라이머를 제작하였고, 이때 실시간 PCR시 적합하도록 60 내지 120 bp 로 증폭산물 크기를 조정하여 제작하였다.
아울러, 각 GMO 옥수수 품종에 특이적인 12종의 프라이머를 여러 세트로 제작한 다음, 비특이적 반응이 일어나지 않는 멀티플렉스 PCR 최적조건을 확립하였다. 이때 모든 프라이머의 Tm 값은 60 ℃, 프로브의 Tm 값은 70 ℃로 하였다. 각각의 프라이머 쌍과 프로브는 염기서열 분석을 통해 멀티플렉스 PCR 반응시 함께 사용되는 다른 프라이머쌍과 프로브의 반응에 간섭을 주지 않는 것을 확인하였다.
이러한 과정으로 제작한, 본 발명의 유전자재조합식품 검출용 조성물의 상세한 사항은 하기와 같다.
1) Mon810
- 몬산토社 유전자재조합 옥수수(병충해 저항성)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GAA GGA CGA AGG ACT CTA ACG TTT AA-3' (서열번호 1)
역방향: 5'-CAC TAT CTT CAC AAT AAA GTG ACA GAT AGC T-3' (서열번호 2)
- 프로브: 5'-ATC CTT TGC CAT TGC C-3' (서열번호 3)
- 증폭산물의 크기 : 113 bp
2) Bt11
- 신젠타종묘社 유전자재조합 옥수수(제초제 내성 및 해충 저항성)
- 프라이머쌍
정방향: 5'-C AAG CCG CGG ATC CTC-3' (서열번호 4)
역방향: 5'-CAT TCG TTG ATG TTT GGG TTG-3' (서열번호 5)
- 프로브 : 5'-GAG TCG ACC ATG GAC AA-3' (서열번호 6)
- 증폭산물의 크기 : 58 bp
3) Bt176
- 신젠타종묘社 유전자재조합 옥수수(병충해 저항성)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-CGG TCC TGC CCG TCA C-3' (서열번호 7)
역방향 : 5'-CAA GGC CAT TGA TGG CGT GCA TCA A-3' (서열번호 8)
- 프로브: 5'-AGA TCT GAT GTT CTC TCC T-3' (서열번호 9)
- 증폭산물의 크기: 73 bp
4) T25
- 바이엘社 유전자재조합 옥수수(제초제 내성)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-ACA GCG ACA ATG GCG GAA CGA C-3' (서열번호 10)
역방향 : 5'-TGC CCT TTG GTC TTC TGA GAC TGT A-3' (서열번호 11)
- 프로브: 5'-CAA TGA CAA GAA ATA TCA AAG-3' (서열번호 12)
- 증폭산물의 크기: 149 bp
5) GA21
- 몬산토社 유전자재조합 옥수수(제초제 내성)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-CGG AGC TTT TTT GTA GGT AGA CG-3' (서열번호 13)
역방향 : 5'-GCG ATA ATC TTT GTC TTT CGG AA-3' (서열번호 14)
- 프로브: 5'-TAA GCT GGG CTG CAG GA-3' (서열번호 15)
- 증폭산물의 크기 : 65 bp
6) Mon863
- 몬산토社 유전자재조합 옥수수(해충 저항성)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GTG TGT TTT TTG GAT CCC CG-3' (서열번호 16)
역방향 : 5'-CCA TAT CTA AAT GGA ACT TTT GTC ACT ATG-3' (서열번호 17)
- 프로브: 5'-AAT TCG GTC TCC CTA TAG AG-3' (서열번호 18)
- 증폭산물의 크기 : 89 bp
7) TC1507
- 듀폰社 유전자재조합 옥수수(제초제 내성 및 해충 저항성)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-CTT CGG CCA GAA TGG CCT A-3' (서열번호 19)
역방향 : 5'-TCA AAT ATC TTT GCC AAG ATC AAG C-3' (서열번호 20)
- 프로브: 5'-CTC AAG GCC CTC ACT C-3' (서열번호 21)
- 증폭산물의 크기 : 58 bp
8) NK603
- 몬산토社 유전자재조합 옥수수(제초제 내성)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-CTC GGC CAG CAA GCC TT-3' (서열번호 22)
역방향 : 5'-CCT AGG GAT ATC AAG CTT GGT ACC-3' (서열번호 23)
- 프로브: 5'-TAG CGG CCC ACG CG-3' (서열번호 24)
- 증폭산물의 크기 : 108 bp
9) CBH351
- 아벤티스社 유전자재조합 옥수수(해충 저항성)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GCG CGG TGT CAT CTA TGT TAC TAG-3' (서열번호 25)
역방향 : 5'-CCT TGC ATG CCT GCA GG-3' (서열번호 26)
- 프로브: 5'-TCG CAG ATC CTC TAG AGT C-3' (서열번호 27)
- 증폭산물의 크기 : 63 bp
10) MIR604
- 신젠타종묘社 유전자재조합 옥수수(해충저항성)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-CAG CAT GGC CGT ATC CG-3' (서열번호 28)
역방향 : 5'-CGA CAC ACC TCG TTA GTT AAA GTA CC-3' (서열번호 29)
- 프로브: 5'-AAT GTG TTA TTA AGA GTT GGT GGT AC-3' (서열번호 30)
- 증폭산물의 크기 : 91 bp
11) Mon88017
- 몬산토社 유전자재조합 옥수수(제초제 내성 및 해충 저항성)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-AGC ACC TTT TTT GCC GGA GTA T-3' (서열번호 31)
역방향 : 5'-CCG GAC ATG AAG CCA TTT ACA-3' (서열번호 32)
- 프로브 : 5'-ACG GTG ACG ATA TAT T-3'(서열번호 33)
- 증폭산물의 크기 : 64 bp
12) DAS59122-7
- 듀폰社 유전자재조합 옥수수(제초제 내성)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GAA GAA AGA GTG AAG GGA TAA GCA A-3' (서열번호 34)
역방향 : 5'-TTT CCC GCC TTC AGT TTA AAC TAT-3' (서열번호 35)
- 프로브: 5'-TAA AAG CGC TCA AAC ACT-3'(서열번호 36)
- 증폭산물의 크기 : 86 bp
상기 GMO 옥수수 검출용 조성물은 식료품에서의 GMO 옥수수 분석시 문제가 되는 PCR 저해효과를 보정하기 위해 외부에서 일정량의 양성시료를 PCR 반응시 추가적으로 투입한다. 이러한 외부도입 양성시료(External Interanl Positive Control: EPC)를 특이적으로 검출하는 양성 대조군 마커세트를 사용하여, PCR 산물의 증폭차이를 이용해 시료 마다 다르게 나타나는 PCR 저해효과를 보정할 수 있다. 상기 외부도입 양성시료로 작물 또는 식품과 연관되지 않은 서열번호 37의 인간 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 바람직하게 사용한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 제작된 양성 대조군 마커세트의 상세한 사항은 하기와 같다.
13) 양성 대조군 마커세트
- 표적 유전자 : 인간 GAPDH
5'-CCT CCC GCT TCG CTC TCT GCT CTC CTG TTC GAC AGT CAG CCG CAT CTT CTT TTG CGT CGC CAG C-3' (서열번호 37)
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-CCT CCC GCT TCG CTC TCT-3' (서열번호 38)
역방향 : 5'-GCT GGC GAC GCA AAA GA-3' (서열번호 39)
- 프로브 : 5'-CCT CCT GTT CGA CAG TCA GCC GC-3'(서열번호 40)
- 증폭산물의 크기 : 65 bp
본 발명의 GMO 옥수수 검출방법에서는 상기 GMO 옥수수 검출용 세트를 사용하여 GMO 옥수수 품종을 검출하기에 앞서 GMO 옥수수 함유 여부를 스크리닝하기 위해 하기 유전자재조합 옥수수 스크리닌용 세트를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 제작된 옥수수 스크리닌용 세트의 상세한 사항은 하기와 같다.
14) P-35S
- 표적 유전자: 유전형질 도입시 사용되는 Cauliflower mosaic virus의 35s 프로모터
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GGA TGA CGC ACA ATC CCA CTA T-3' (서열번호 41)
역방향 : 5'-CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC TTA TAT AGA-3' (서열번호 42)
- 프로브: 5'-CTT CGC AAG ACC CTT C-3'(서열번호 43)
- 증폭산물의 크기 : 70 bp
15) T-NOS
- 표적 유전자: 유전형질 도입시 사용되는 Agrobacterium tumefaciens의 NOS (nopaline synthase) 터미네이터
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3' (서열번호 44)
역방향 : 5'-AAA GAC CAA GAT AAC CTG CAT GTG-3' (서열번호 45)
- 프로브: 5'-ATA ACG TCA TGC ATT ACA TGT-3'(서열번호 46)
- 증폭산물의 크기 : 126 bp
16) SSIIb
- 표적 유전자: 옥수수가 기본적으로 가지고 있는 옥수수 특이적 유전자
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-CGG ACC CAA AGC TGA TCA TC-3' (서열번호 47)
역방향 : 5'-GCG GGC TCT GGC TTC AC-3' (서열번호 48)
- 프로브 : 5'-CTC CTG TCA CCA AGA GAG AAA TCG ATG CC-3' (서열번호 49)
- 증폭산물의 크기 : 78 bp
상기 유전자재조합 옥수수 스크리닌용 세트에는 P-35S, T-NOS, 및 SSIIb 검출을 위한 3종의 마커 세트가 포함되며, 이를 사용한 실시간 PCR 수행시 GMO 옥수수 검출용 세트를 사용한 PCR 수행과 동일하게 외부도입 양성시료 및 양성 시료 검출을 위한 양성 대조군 마커세트가 사용될 수 있다.
본 발명의 GMO 검출용 세트 총 12종 중 이들의 3종 이상의 조합을 동시에 사용하여 실시간 PCR을 수행할 수 있다. 이들 총 12종의 GMO 검출용 세트의 조합은 프로브의 3' 및 5' 말단에 검출가능한 수단을 포함하거나, 예컨대 표지되어 있을 수 있다.
이때, 하나의 PCR 반응물에 동시에 사용하는 GMO 검출용 세트의 종류에 따라, 각각의 프로브는 서로 상이한 검출가능한 수단으로 표지된다. 상기 검출가능한 수단은 프로브에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 모방체 등을 의미한다. 그 예로, 통상적으로 사용되는 형광 표지인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 예로, 형광 표지 인자가 가장 바람직하다. 형광 표지 인자는 현재 시중에 다수 종이 시판되고 있으므로, 용이하게 입수가능하다. 형광 표지 인자의 예로는, FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX, TET, SYBR Green, Cy3, Texas Red, RED610, RED670, Cy5™ 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형광 표지 인자는 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르면 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지 인자는 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 인자에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본원 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.
일 예로, 형광 표지 인자는 통상의 방법으로 본 발명에 따른 GMO 옥수수 검출용 세트에 포함된 프라이머, 또는 프로브에 표지된다. 표지 방법은 인터컬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자 비콘(Molecualr beacon) 방법들이 있다. 인터컬레이팅 방법은 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(inter-chelator: SYBR Green I, EtBr 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5'말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3'말단을 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 분자 비콘 방법은 양 말단을 형광 표지인자(FAM, TAMRA 등)과 quencher 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다. 분자 비콘 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하며 형광 표지인자와 quencher 물질에 근접해 있어 형광발생이 억제되지만, 어닐링 단계에서 주형 DNA와 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화할때 형광 표지인자와 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소됨으로써 프로브상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. 그러나, 혼성화되지 않은 분자 비콘 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않게 된다.
이러한 방법을 본 발명의 GMO 옥수수를 검출하기 위한 실시간 멀티플렉스 PCR 방법에 적용할 수 있다. 상기한 방법들은 당업계에 공지된 것이므로, 반응 효율, 시간, 형광 표지인자 타입 등을 적절히 고려하여, 특정 방법을 선택할 수 있을 것이다. 본 발명에서는 일 예로, TaqMan™ 프로브 방법을 사용할 수 있다. 이때 상기 프로브는 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된다.
본 발명의 GMO를 검출하는 방법에 있어, 멀티플렉스 실시간 PCR 반응 조건은 통상적인 조건을 취할 수 있다. 단일 실시간 PCR과 멀티플렉스 실시간 PCR 반응은 동일한 조건으로 수행될 수 있으며, 일예로 UDG 활성을 위하여 50℃에서 2분간 처리하고, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 15초), 결합 및 연장(annealing & extension, 60℃에서 1분)을 총 40회 실시하는 조건을 취할 수 있다. 실시간 PCR 중 결합 및 연장단계에서 프로브에 의해 생성된 형광을 측정한다.
또한, 본 발명의 GMO 옥수수 검출용 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여, 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭산물을 비 특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.
본 발명에 사용가능한 실시간 PCR 기기로는 AB 사의 Real-time PCR 기기 7900, 7500, 7300, Roche 사의 LightCycler 480, Stratagene 사의 Mx3000p, 및 BioRad 사의 Chromo 4 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. PCR 종료시 이러한 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지인자를 감지하여 도 22 내지 24와 같은 피크를 구현한다. 이에, 전기영동과정없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다.
본 발명에서는 일 예로, 자동화 프로그램으로 KoRAS TM(코젠바이오텍)을 사용할 수 있다. 상기 자동화 프로그램을 사용하는 경우 분석된 결과를 O/X 타입 또는 Ct 타입으로 나타낼 수 있어 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다.
본 발명의 GMO 옥수수 검출용 세트 및 이를 이용한 GMO 옥수수 검출방법에 의해, 기존의 GMO를 식별하기 위한 PCR 과정을 현저하게 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다. 이러한 방법은 전기영동법으로는 분별하기 어려웠던 적은 농도의 DNA 절편의 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, PCR 산물에 의한 오염에 대한 우려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
또한, 본 발명은 상기 GMO 옥수수 검출용 조성물을 포함하는 GMO 옥수수 검출키트를 제공한다. 이때 GMO 옥수수 검출용 조성물의 프로브는 5' 말단이 서로 다른 색상의 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된다. 또한, 이때 검출용 조성물의 프라이머 쌍 및 프로브는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징된다.
본 발명의 키트는 텍 중합효소(Taq polymerase), MgCl2를 포함한 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당업계에 공지된 다른 시약, 예컨대 실시간 PCR용 마스터 믹스를 추가적으로 포함할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: GMO 특이적 프라이머 및 프로브 제조
1-1. GMO 옥수수 스크리닝용 프라이머 및 프로브 제조
GMO 옥수수의 품종을 확인하기 이전에, 1차적으로 시료 내에 GMO가 함유되었는지를 확인하는 스크리닌용 프라이머 및 프로브를 제조하였다. 이를 위해, 유전자 재조합시 사용되는 프로모터, 터미네이터 및 옥수수-내재유전자를 타깃으로 하였다.
이때 RT-PCR 효율의 극대화를 위해 생성되는 PCR 산물의 크기는 60~120bp 이내로 하였다. 프라이머는 Tm 60 ℃, 프로브는 Tm 70 ℃가 되도록 개발하였다. 또한 프로브의 5' 말단은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, TAMRA, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED370 및 NED로 이루어진 군에서 선택된 1종의 형광물질로 표지되며, 3' 말단은 MGBNFQ(molecular grove binding non-folorescene quncher)로 표지되도록 하였다.
제작된 GMO 옥수수 스크리닝용 프라이머 및 프로브의 상세한 사항은 아래 표 1에 나타내었다.
| 서열 번호 |
명명 | 염기서열 (5'→3') |
표적 유전자 |
|
| 41 | P-35S-F | GGA TGA CGC ACA ATC CCA CTA T | 유전형질 도입시 사용되는 Cauliflower mosaic virus의 35s 프로모터 | |
| 42 | P-35S-R | CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC TTA TAT AGA | ||
| 43 | P-35S | CTT CGC AAG ACC CTT C | ||
| 44 | T-NOS-F | GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG | 유전형질 도입시 사용되는 Agrobacterium tumefaciens의 NOS 터미네이터 | |
| 45 | T-NOS-R | TGC GGG ACT CTA ATC ATA AAA ACC | ||
| 46 | T-NOS | ATA ACG TCA TGC ATT ACA TGT | ||
| 47 | SSIIb-F | GAT TGG CAT ACC GCA CTT CTG | 옥수수 내재 유전자 | |
| 48 | SSIIb-R | ATC AAA CCA TTG TCC CGG TAA T | ||
| 49 | SSIIb | CTG TCT ATC TAA AGG CC | ||
1-2. GMO 옥수수 품종 확인용 프라이머 및 프로브 제조
GMO 옥수수 품종별 도입 유전자의 구조는 아래 표 2와 같다.
상기 표 2의 GMO 옥수수 품종별로 도입된 유전자 구성을 파악하여 각각에 특이적인 프라이머 및 프로브를 개발하였다.
이때 RT-PCR 효율의 극대화를 위해 생성되는 PCR 산물의 크기는 60~120bp 이내로 하였다. 프라이머는 Tm 60 ℃, 프로브는 Tm 70 ℃가 되도록 개발하였다. 프로브의 5' 말단은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, TAMRA, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED370 및 NED로 이루어진 군에서 선택된 1종의 형광물질로 표지되며, 3' 말단은 MGBNFQ(molecular grove binding non-folorescene quncher)로 표지되도록 하였다.
제작된 GMO 옥수수 품종별 프라이머 및 프로브의 상세한 사항은 아래 표 3에 나타내었다.
| 서열번호 | 명명 | 염기서열 (5'→3') |
품종 |
| 1 | Mon810-F | GAA GGA CGA AGG ACT CTA ACG TTT AA | Mon810 |
| 2 | Mon810-R | CAC TAT CTT CAC AAT AAA GTG ACA GAT AGC T | |
| 3 | Mon810 | ATC CTT TGC CAT TGC C | |
| 4 | Bt11-F | C AAG CCG CGG ATC CTC | Bt11 |
| 5 | Bt11-R | CAT TCG TTG ATG TTT GGG TTG | |
| 6 | Bt11 | GAG TCG ACC ATG GAC AA | |
| 7 | Bt176-F | CGG TCC TGC CCG TCA C | Bt176 |
| 8 | Bt176-R | CAA GGC CAT TGA TGG CGT GCA TCA A | |
| 9 | Bt176 | AGA TCT GAT GTT CTC TCC T | |
| 10 | T25-F | ACA GCG ACA ATG GCG GAA CGA C | T25 |
| 11 | T25-R | TGC CCT TTG GTC TTC TGA GAC TGT A | |
| 12 | T25 | CAA TGA CAA GAA ATA TCA AAG | |
| 13 | GA21-F | CGG AGC TTT TTT GTA GGT AGA CG | GA21 |
| 14 | GA21-R | GCG ATA ATC TTT GTC TTT CGG AA | |
| 15 | GA21 | TAA GCT GGG CTG CAG GA | |
| 16 | Mon863-F | GTG TGT TTT TTG GAT CCC CG | Mon863 |
| 17 | Mon863-R | CCA TAT CTA AAT GGA ACT TTT GTC ACT ATG | |
| 18 | Mon863 | AAT TCG GTC TCC CTA TAG AG | |
| 19 | TC1507-F | CTT CGG CCA GAA TGG CCT A | TC1507 |
| 20 | TC1507-R | TCA AAT ATC TTT GCC AAG ATC AAG C | |
| 21 | TC1507 | CTC AAG GCC CTC ACT C | |
| 22 | NK603-F | CTC GGC CAG CAA GCC TT | NK603 |
| 23 | NK603-R | CCT AGG GAT ATC AAG CTT GGT ACC | |
| 24 | NK603 | TAG CGG CCC ACG CG | |
| 25 | CBH351-F | GCG CGG TGT CAT CTA TGT TAC TAG | CBH351 |
| 26 | CBH351-R | CCT TGC ATG CCT GCA GG | |
| 27 | CBH351 | TCG CAG ATC CTC TAG AGT C | |
| 28 | MIR604-F | CAG CAT GGC CGT ATC CG | MIR604 |
| 29 | MIR604-R | CGA CAC ACC TCG TTA GTT AAA GTA CC | |
| 30 | MIR604 | AAT GTG TTA TTA AGA GTT GGT GGT AC | |
| 31 | Mon88017-F | AGC ACC TTT TTT GCC GGA GTA T | Mon88017 |
| 32 | Mon88017-R | CCG GAC ATG AAG CCA TTT ACA | |
| 33 | Mon88017 | ACG GTG ACG ATA TAT T | |
| 34 | DAS59122-F | GAA GAA AGA GTG AAG GGA TAA GCA A | DAS59122-7 |
| 35 | DAS59122-R | TTT CCC GCC TTC AGT TTA AAC TAT | |
| 36 | DAS59122 | TAA AAG CGC TCA AAC ACT |
1-3. 양성대조군 마커세트용 프라이머 및 프로브 제작
검사의 신뢰도를 높이고, 실시간 PCR 반응의 정상적 진행 및 저해요소 여부를 확인하기 위한 목적으로, 외부도입 양성시료(EPC)로 작물 또는 식품과 연관되지 않는 인간 GAPDH 유전자를 사용하고, 양성시료 검출을 위한 인간 GAPDH 특이적 프라이머 및 프로브를 제작하였다.
이때 RT-PCR 효율의 극대화를 위해 생성되는 PCR 산물의 크기는 60~120bp 이내로 하였다. 프라이머는 Tm 60 ℃, 프로브는 Tm 70 ℃가 되도록 개발하였다. 프로브의 5' 말단은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, TAMRA, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED370 및 NED로 이루어진 군에서 선택된 1종의 형광물질로 표지되며, 3' 말단은 MGBNFQ(molecular grove binding non-folorescene quncher)로 표지되도록 하였다.
제작된 인간 GAPDH 특이적 프라이머 및 프로브의 상세한 사항은 아래 표 4에 나타내었다.
| 서열번호 | 명명 | 염기서열 (5'→3') |
표적유전자 | |
| 38 | EPC-F | CCT CCC GCT TCG CTC TCT | 인간 GAPDH 유전자 (서얼변호 40) |
|
| 39 | EPC-R | GCT GGC GAC GCA AAA GA | ||
| 40 | EPC | CCT CCT GTT CGA CAG TCA GCC GC | ||
실험예 2: GMO 옥수수 품종 특이 프라이머 및 프로브의 특이도 검증
2-1. 프라이머 및 프로브의 특이도
실시예 1에서 제작한 각각의 프라이머 쌍 및 프로브의 특이도 확인을 위해, 실험적인 방법으로 실시간 PCR을 실시하였다. 실시간 PCR 기종은 AB-7500-Real time PCR system을 사용하였다.
GMO 옥수수 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(Certified Reference Material: CRM)을 IRMM, Fluka, AOCS에서 구매, 확보하여 실시간 PCR 의 주형 DNA로 사용하였으며, 실시간 PCR 의 반응 조성과 조건은 표 5 및 표 6과 같다.
단일 RT-PCR 수행 결과 각 품종별 특이성이 확인된 프라이머 및 프로브를 선별하여 스크리닝 및 품종별, 그리고 양성대조군 세트로 확정하였다. PCR 증폭 유무는 KoRAS TM(코젠바이오텍) 프로그램을 이용하여 실시간 관찰하였다.
| 시약 | 최종 농도 | 부피/샘플(㎕) |
| 주형 DNA | 3 | |
| 2x 마스터 믹스 (반응 완충액, dUTP, UDG, 텍 중합효소) |
1x | 5 |
| 정방향 프라이머 | 10 pmol | 0.5 |
| 역방향 프라이머 | 10 pmol | 0.5 |
| 프로브 | 2 pmol | 1 |
| 총 | 10 |
| 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| UDG 활성 | 50℃ | 2 분 | 1 |
| 초기 변성 | 95℃ | 10 분 | 1 |
| 변성 어닐링 및 연장 |
95℃ 60℃ |
15 초 1 분 |
40 |
| 작물 | 품종 | 구입처 |
| 옥수수 | Mon810 | IRMM |
| Bt11 | IRMM | |
| Bt176 | IRMM | |
| T25 | AOCS | |
| GA21 | IRMM | |
| Mon863 | IRMM | |
| TC1507 | IRMM | |
| NK603 | IRMM | |
| CBH351 | Fluka | |
| MIR604 | IRMM | |
| Mon88017 | AOCS | |
| DAS59122-7 | IRMM |
2-1-1. P-35S 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 옥수수 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 41 및 서열번호 42의 P-35s 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 43의 P-35s 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 유전자 도입 시 사용된 35S 프로모터가 사용되는 Mon810, T25, Bt176, TC1507, Bt11, NK603, Mon863, CBH351, 그리고 Mon88017에서만 PCR 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-2. T-NOS 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 44 및 서열번호 45의 T-NOS 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 46의 T-NOS 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, 유전자 도입 시 사용된 NOS 터미네이터가 포함된 T25, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351, 그리고 Mon88017에서만 PCR 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-3. 옥수수 내재 유전자 SSIIb 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 47 및 서열번호 48의 옥수수 내재유전자인 SSIIb 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 49의 SSIIb 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 유전자재조합 옥수수 작물인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017에서만 PCR 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-4. Mon810 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 Mon810 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 Mon810 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, Mon810 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-5. Bt11 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 4 및 서열번호 5의 Bt11 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 Bt11 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하면, Bt11 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-6. Bt176 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 서열번호 8의 Bt176 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 Bt176 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 참조하면, Bt176 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-7. T25 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 10 및 서열번호 11의 T25 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 T25 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7을 참조하면, T25 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-8. GA21 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 13 및 서열번호 14의 GA21 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 15의 GA21 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8을 참조하면, GA2 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-9. Mon863 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 16 및 서열번호 17의 Mon863 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 18의 Mon863 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9를 참조하면, Mon863 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-10. TC1507 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 19 및 서열번호 20의 TC1507 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 TC1507 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10을 참조하면, TC1507 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-11. NK603 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 22 및 서열번호 23의 NK603 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 NK603 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11을 참조하면, NK603 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-12. CBH351 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 25 및 서열번호 26의 CBH351 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 CBH351 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12를 참조하면, CBH351 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-13. MIR604 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 28 및 서열번호 29의 MIR604 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 30의 MIR604 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13을 참조하면, MIR604 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-14. Mon88017 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 31 및 서열번호 32의 Mon88017 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 33의 Mon88017 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14를 참조하면, Mon88017 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-15. DAS59122-7 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 34 및 서열번호 35의 DAS59122-7 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 36의 DAS59122-7 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15를 참조하면, DAS59122-7 시료에만 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-16. 인간 GAPDH 특이적 프라이머 및 프로브의 특이도
GMO 품종인 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 그리고 Mon88017의 인증표준물질(CRM) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 38 및 서열번호 39의 인간 GAPDH 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 40의 인간 GAPDH 탐지용 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하였으나, 전혀 증폭 산물이 검출되지 않았다.
추가로 소, 돼지, 닭, 말, 양, 염소, 고등어 그리고 참치 등의 DNA를 추가로 실험을 수행하고 그 결과를 도 16에 나타내었고, 도 16에 나타낸 바와 같이 서열번호 37의 인간 GAPDH DNA에서만 증폭이 되는 것을 확인할 수 있었다(Ct value 24.1).
실험예 3: 프라이머 쌍 및 프로브를 이용한 실시간 멀티플렉스 PCR 방법
3-1. 유전자재조합 옥수수 품종을 위한 다중 검출용 조성물
실험예 1에서 제작한 마커세트를 실시간 PCR 방법으로 단일 용기에서 동시에 수행하였다. 이에 앞서, 유전자재조합 옥수수 스크린을 위한 마커 세트를 아래 표 8과 같이 구성하였다. 또한 총 4개의 반응튜브에, 각 튜브당 3종류의 GMO 품종을 확인할 수 있도록 프라이머 쌍 및 프로브 세트를 구성하고, 모든 세트에는 양성대조군 검출세트가 포함되었다. 프로브의 3' 말단은 MGBNFQ(molecular grove binding non-folorescene quncher)로 표지되도록 하였다. 제작된 다중 검출용 세트의 상세한 사항은 아래 표 9에 나타내었다. 실시간 PCR 반응 조성 및 반응 조건은 표 8 및 표 9와 동일하게 사용하였다.
| 구분 | 프라이머 | 프로브 |
|
| 유전자재조합 옥수수 스크리닌용 세트 | 서열번호 41 및 42 | 서열번호 43 | FAM |
| 서열번호 44 및 45 | 서열번호 46 | VIC | |
| 서열번호 53 및 54 | 서열번호 55 | NED | |
| 서열번호 38 및 39 | 서열번호 40 | Cy5 | |
| 구분 | 프라이머 | 프로브 | 품종 | |
| 실시예 1 |
서열번호 4 및 5 | 서열번호 6 | FAM | Bt11 |
| 서열번호 7 및 8 |
서열번호 9 | VIC | Bt176 | |
| 서열번호 1 및 2 |
서열번호 3 | NED | Mon810 | |
| 서열번호 38 및 39 |
서열번호 40 | Cy5 | EPC | |
| 실시예 2 |
서열번호 16 및 17 |
서열번호 18 | FAM | Mon863 |
| 서열번호 10 및 11 |
서열번호 12 | VIC | T25 | |
| 서열번호 19 및 20 |
서열번호 21 | NED | TC1507 | |
| 서열번호 38 및 39 | 서열번호 40 | Cy5 | EPC | |
| 실시예 3 |
서열번호 22 및 23 |
서열번호 24 | FAM | NK603 |
| 서열번호 13 및 14 |
서열번호 15 | VIC | GA21 | |
| 서열번호 34 및 35 |
서열번호 36 | NED | DAS59122-7 | |
| 서열번호 38 및 39 | 서열번호 40 | Cy5 | EPC | |
| 실시예 4 |
서열번호 28 및 29 |
서열번호 30 | FAM | MIR604 |
| 서열번호 31 및 32 |
서열번호 33 | VIC | Mon88017 | |
| 서열번호 25 및 26 |
서열번호 27 | NED | CBH351 | |
| 서열번호 38 및 39 | 서열번호 40 | Cy5 | EPC | |
GMO 옥수수 품종 Bt11의 인증표준물질 DNA 주형으로 하고, 서열번호 37의 인간 GAPDH을 외부도입 양성시료로 사용하여, 상기 표 8에 기재된 유전자재조합 옥수수 스크리닌용 세트를 이용하여 상기 기재된 방법으로 멀티플렉스 RT-PCR을 수행하고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17을 참조하면, GMO 옥수수 품종인 Bt11의 시료에 대해 P-35S, T-NOS, SSIIb 및 EPC에 해당하는 정확한 PCR 산물이 생성되었음을 알 수 있다.
도 18은 실시예 1의 3종의 GMO 옥수수 품종인 Bt11, Bt176, 및 Mon810에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 Bt11, Bt176, 및 Mon810 인증표준물질 DNA 주형에 대해 서열번호 37의 인간 GAPDH을 외부도입 양성시료로 사용하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 19는 실시예 2의 3종의 GMO 옥수수 품종인 Mon863, T25, 및 TC1507에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 Mon863, T25, 및 TC1507 인증표준물질 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 20은 실시예 3의 3종의 GMO 옥수수 품종인 NK603, GA21, 및 DAS59122-7에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 NK603, GA21, 및 DAS59122-7 인증표준물질 DNA 주형에 대해 서열번호 37의 인간 GAPDH을 외부도입 양성시료로 사용하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 21은 실시예 4의 3종의 GMO 옥수수 품종인 MIR604, Mon88017, 및 CBH351에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 MIR604, Mon88017, 및 CBH351 인증표준물질 DNA 주형에 대해 서열번호 37의 인간 GAPDH을 외부도입 양성시료로 사용하여 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 18 내지 21를 참조하면, 모든 GMO 옥수수 품종 시료에 대하여 각각에 해당하는 정확한 PCR 산물이 생성되었음을 알 수 있다.
상기 결과로, 본 발명의 GMO 옥수수 검출용 조성물을 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하여 GMO 품종을 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
3-2. 자동화 프로그램을 이용한 GMO 옥수수 품종 검출
상기 3-1과 동일하게 멀티플렉스 RT-PCR을 수행하였다. 이때 실시간 PCR 을 통해 실험된 결과를 분석하기 위한 자동화 프로그램인 KoRAS(Kogene Real-time Analysis System) GMO version을 이용하였다. 도 22는 상기 KoRAS GMO version에 실시간 PCR 결과 파일을 입력하는 화면의 일예를 보여주는 모식도이다. 상기 프로그램을 통해 실시간 PCR 결과를 CSV 확장자 파일로 추출하고, 이렇게 추출된 파일에는 실험에 사용된 모든 시료의 Ct 밸류가 기록된다. 또한 결과를 Ct 타입 또는 O/X 타입으로 표시하는 것이 가능하다.
도 23은 12종의 GMO 옥수수 품종에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 12종의 GMO 품종 인증표준물질 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 24는 12종의 GMO 품종에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출용 조성물로 12종의 GMO 품종 인증표준물질 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
상기 결과로, 본 발명의 GMO 유형 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하여 GMO 유형을 간단하고 신속하게 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (13)
- 하기 (1) 내지 (12)의 마커 세트를 포함하는, 유전자재조합식품을 실시간 PCR로 검출하기 위한 유전자재조합 옥수수 검출용 조성물:
(1) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브;
(2) 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프로브;
(3) 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브;
(4) 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프로브;
(5) 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 프로브;
(6) 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 프로브;
(7) 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 프로브;
(8) 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 프로브;
(9) 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 프로브;
(10) 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 프로브;
(11) 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 33의 염기서열로 이루어진 프로브; 및
(12) 서열번호 34의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 36의 염기서열로 이루어진 프로브. - 제1항에 있어서,
상기 검출용 조성물은 서열번호 38, 서열번호 39의 염기서열로 이루어진 인간 GAPDH 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어진 인간 GAPDH 탐지용 프로브로 구성된 양성 대조군 마커세트를 더욱 포함하는 것인 검출용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 프로브는 프로브 종류에 따라 별개의 검출가능한 수단으로 표지되며, 상기 검출가능한 수단은 특이적인 PCR 산물이 증폭된 경우에 검출되는 것인 검출용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 검출가능한 수단은 형광물질인 것인 검출용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 프로브는 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, TAMRA, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED370 및 NED로 이루어진 군에서 선택된 1종의 형광물질로 표지되며, 3' 말단은 MGBNFQ(molecular grove binding non-folorescene quncher)로 표지된 것인 검출용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 마커 조합 조성물은 Mon810, T25, Bt176, TC1507, DAS59122-7, GA21, MIR604, Bt11, NK603, Mon863, CBH351 및 Mon88017으로 이루어진 군에서 선택된 유전자재조합 옥수수 품종을 식별하는데 사용되는 것인 검출용 조성물. - 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 제1항의 검출용 조성물을 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계; 및
상기 실시간 멀티플렉스 PCR 결과를 확인하여 유전자재조합 옥수수 품종을 판단하는 단계
를 포함하는 유전자재조합 옥수수 검출방법. - 제7항에 있어서,
상기 PCR은 서열번호 37의 염기서열로 이루어진 인간 GAPDH DNA를 외부도입 양성 시료로 사용하고, 서열번호 38, 서열번호 39의 염기서열로 이루어진 인간 GAPDH 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어진 인간 GAPDH 탐지용 프로브로 구성된 양성 대조군 마커세트를 추가적으로 사용하는 것인 검출방법. - 제7항에 있어서, 상기 검출방법은
시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 유전자재조합 옥수수 스크리닌용 세트를 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계; 및
상기 실시간 멀티플렉스 PCR 결과를 확인하여 유전자재조합 옥수수 함유 여부를 판단하는 단계를 더욱 포함하는 것인 검출방법:
(a) 서열번호 41의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 43의 염기서열로 이루어진 프로브;
(b) 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 46의 염기서열로 이루어진 프로브; 및
(c) 서열번호 47의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 48의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 49의 염기서열로 이루어진 프로브. - 제9항에 있어서,
상기 PCR은 서열번호 37의 염기서열로 이루어진 인간 GAPDH DNA를 외부도입 양성 시료로 사용하고, 서열번호 38, 서열번호 39의 염기서열로 이루어진 인간 GAPDH 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어진 인간 GAPDH 탐지용 프로브로 구성된 양성 대조군 마커세트를 추가적으로 사용하는 것인 검출방법. - 제1항 또는 제2항에 따른 유전자재조합 옥수수 검출용 조성물을 포함하는 유전자재조합 옥수수 검출키트.
- 제11항에 있어서, 상기 검출용 조성물은 하나의 반응 용기, 스트립(strip) 또는 마이크로플레이트에 패키징 되는 것인 검출키트.
- 제11항에 있어서,
상기 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, TAMRA, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED370 및 NED로 이루어진 군에서 선택된 1종의 형광물질로 표지되며, 3' 말단은 MGBNFQ(molecular grove binding non-folorescene quncher)로 표지된 것인 검출키트.
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|---|---|---|---|
| KR1020100058720A KR101178140B1 (ko) | 2010-06-21 | 2010-06-21 | 유전자재조합 옥수수 검출방법 및 검출용 조성물 |
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-
2010
- 2010-06-21 KR KR1020100058720A patent/KR101178140B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Anal Bioanal Chem, Vol. 392, No. 3, pp 369-384 (2008.10.) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| US11060126B2 (en) | 2016-02-19 | 2021-07-13 | Nutrasource Pharmaceutical And Nutraceutical Services Inc. | Methods for detecting genetically modified organisms (GMO) |
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| Publication number | Publication date |
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| KR20110138688A (ko) | 2011-12-28 |
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