KR101087834B1 - 갈조류의 세포의 냉동 건조된 산물, 이를 획득하는 방법 및이의 용도 - Google Patents

갈조류의 세포의 냉동 건조된 산물, 이를 획득하는 방법 및이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 갈조류(brown algae)의 세포의 냉동 건조된 산물, 이를 획득하는 방법, 이를 함유하는 미용 조성물, 이를 함유하는 식품 보조제, 이의 용도에 관계한다.
갈조류(brown algae)

Description

갈조류의 세포의 냉동 건조된 산물, 이를 획득하는 방법 및 이의 용도{FREEZE-DRIED PRODUCT OF CELLS OF BROWN ALGAE, PROCESS FOR OBTAINING AND USE THEREOF}
본 발명은 갈조류(brown algae)의 세포의 냉동 건조된 산물, 이를 획득하는 방법, 이를 함유하는 미용 조성물, 이를 함유하는 식품 보조제, 이의 용도에 관계한다.
갈조강(Fucophycae 또는 Phaeophyceae)으로 불리는 갈조류(brown algae)의 강(class)은 황갈조식물문(Chrysophyta)으로 불리는 유색 식물문(Division Chromophya) 또는 “유색 조류(colored algae)”에 속한다. 이러한 식물문 조류의 세포는 클로로필(chlorophyll) 색소: 클로로필 a와 c 이외에, “보조” 카로티노이드(carotenoid) 색소를 보유한다.
갈조류의 강(class)에는 아스코세이라목(Ascoseirales), 민가지말목(Chordariales), 쿠틀레리아목(Cutlerials), 산말목(Desmarestiales), 바위수염목(Dictyosiphonales), 그물바탕말목(Dictyotales), 두르빌레아목(Durvilleales), 솜털목(Ectocarpales), 모자반목(Fucales), 다시마목(Laminariales), 노테이아목(Notheiales), 고리매목(Scytosiphonales), 스파셀라리아목(Sphacelariales), 털 비말목(Sporochnales), 시린고데르마타목(Syringodermatales), 틸로프테리다목(Tilopteridales)의 목(order)이 포함된다.
모든 광합성 생물체는 광 에너지를 회수하기 위하여 색소, 일반적으로, 클로로필 형태를 이용한다. 표준 클로로필은 클로로필 a이고, 포획된 광 에너지를 이러한 에너지가 이용되는 분자로 전달하는데 필수적이다. 대부분의 클로로필 생물체는 더욱 많은 광을 흡수하는 다른 색소를 보유하는데, 수집된 에너지는 항상, 클로로필 a의 분자에 전달된다.
갈조류는 클로로필 c 및 카로티노이드와 같은 여러 “보조” 색소를 이용한다. 갈조강(Phaeophyceae)은 그들의 색소체(plastid) 내에서 다량의 카로티노이드를 보이는데, 이들 카로티노이드는 그들에게 특징적인 갈색을 부여하는 갈색과 황색 색소이다. 갈조류의 가장 중요한 카로티노이드 색소는 푸곡산틴(fucoxanthin)인데, 이의 명칭은 푸쿠스속(fucus)으로부터 기원한다. 푸곡산틴은 500 내지 580 nm의 파장을 흡수한다.
카로티노이드 색소는 지방족 또는 지방족고리(alicyclic) 구조를 보유한다. 이들은 지방에 용해되고, 따라서 특정 막 내에 직접적으로 통합된다. 이런 이유로, 물 내에서 이들의 용해도는 이들이 다른 분자에 결합되는 경우에만 증가될 수 있다. 이는 또한, 이들의 대사가 지질의 대사와 매우 빈번하게, 직접적으로 관련되는 이유이다.
카로티노이드는 보조 색소(accessory pigment)라고 불리는데, 그 이유는 이들이 결합되면 클로로필 a에 의해 수집된 에너지가 전달되기 때문이다. 일반적으 로, 이들 색소는 이런 색소 집단에 이름을 부여하는 카로틴(carotene)을 통하여 알려져 있다.
카로티노이드, 특히, 동물과 인간에 대한 카로티노이드의 유일한 공급원은 그들의 식품이다. 카로티노이드는 인간 혈장 내에서, 특히, 순환 지질에 대하여 항산화 기능(anti-oxidant function)을 나타낸다. 이러한 기능은 이들이 통합되는 세포막 수준에서도 나타난다.
카로티노이드는 자연적인 황갈색(natural tan)을 모방하는 피부의 색소 형성(yellow-orange)에 직접적으로 참여한다.
선행 기술
카로틴은 황갈색을 가속화시키기 위하여 일광에 노출 수일 전에 또는 노출 동안 섭취하는 식품 보조제로서 사용된다. 베타-카로틴은 비타민 A의 전구물질이다. 베타-카로틴의 섭취는 일광 홍반(solar erythema)의 발생을 지연시킨다. 비타민 A는 청광(blue light)의 작용 하에 생산된 멜라닌의 양을 증가시킨다. 더 나아가, 비타민 A는 항-산화 보호 역할을 수행한다. 비타민 A와 E는 UV-광의 작용 하에 멜라닌의 산화 변성(oxidative denaturation)을 피한다.
공지된 식품 보조제에서, 카로틴은 비타민 C, 비타민 E 또는 플라보노이드에 연관된다.
피부에 색소를 형성하기 위한 카로틴의 이용에서 단점은 결과적인 색채가 자연적인 황갈색보다는 오렌지색에 더욱 가깝다는 점이다. 게다가, 이는 비타민 A로 급속하게 분해된다.
아스타크산틴(astaxanthin)은 강력한 항-산화제인 것으로 밝혀졌다. 특허 출원 US 6,433,025에서는 일광을 예방하고 지연시키기 위한 이의 경구 용도를 기술한다.
다른 카로티노이드 색소인 칸타산틴(canthaxanthin)은 피부에 색소를 형성하고 UV 광으로부터 피부를 보호하기 위한 식품 보조제로서 사용되었다(GB 1 323 800). 그럼에도 불구하고, 칸타산틴은 실명의 위험으로 인하여 프랑스에서 이의 사용이 금지된 반면, 미국에서는 현재 시판되고 있다(Canthorex, DELTALaboratories).
피부암 또는 흑색종(melanoma)은 프랑스에서, 장래에 가장 빈번하게 발생할 것으로 예상되고, 미국에서는 이미, 연간 800,000건이 발생하고 있다. 가장 빈번하게는, 이는 자외선(UV)에 의해 유발된 DNA 돌연변이에 기인하는 피부 세포의 과도한 증식의 결과이다.
더욱 많은 사람들이 이러한 위험을 인식하고 일광으로부터 자신을 보호할 준비가 되어 있다. 그럼에도 불구하고, 햇볕에 태운 피부는 현재의 심미적 기준을 충족하는 유익하고 요망되는 용모(feature)이다.
이런 이유로, 화장품과 약제 제제의 제조업체들은 피부에 색소를 형성하고 UV의 유해 효과로부터 피부를 보호하기 위한 활성 물질을 여전히 연구하고 있다.
본 발명의 요약
본 출원인은 놀랍게도, 푸곡산틴(fucoxanthin)으로 보강된 갈조류(brown algae)의 세포, 특히, 배우체 세포(gametophyte cell)의 냉동 건조된 산물이 요망 되는 효과의 이러한 조합을 달성할 수 있다는 것을 발견하였다: 이는 UV 조사가 없음에도 불구하고 멜라닌생성(melanogenesis)을 촉진함으로써 완전하게 무해한 방식으로 표피(epidermis)에 색소를 형성하면서 항-라디칼 활성(anti-radical activity)으로 이를 보호하고 이의 재생을 촉진한다.
실제, 갈조류는 복잡한 이생 주기(digenetic cycle)를 보유한다. 다시마목(Laminariales)(도 1 참조)의 경우, 거시적 엽상체(thalle) 및 미시적 수컷 배우체와 암컷 반수체(haploid)에서 발생된 이배체 포자체(diploid sporophyte) 사이에 변화가 관찰될 수 있다. 이 경우에, 배우체는 포자의 상이한 유사분열(mitosis)로부터 생성되는 일단의 세포이다.
상기 배우체는 일시적이고, 생식체(gamete) 생산의 한 단계일 뿐이다. 이는 진정한 엽상체로 발달하지 못하기 때문에, 광합성이 약하고 진정한 광합성 색소인 클로로필에 비하여 최대량의 보호 색소: 푸곡산틴을 보유한다.
따라서, 본 출원인은 연중 무제한의 양으로 가용한 생물자원(biomass)으로부터, 푸곡산틴으로 극히 보강된 갈조류의 세포의 냉동-건조된 산물을 푸곡산틴의 고전적인 추출에 비하여 편의하고 저렴하게 획득하기 위하여 이 단계의 배우체를 선별하였다.
이런 이유로, 본 발명의 첫 번째 요부(subject-matter)는 푸곡산틴(fucoxanthin)으로 보강된, 특히, 적어도 1%의 푸곡산틴을 함유하는 갈조류(brown algae)의 세포의 냉동 건조된 산물이다. 적절하게는, 갈조류의 세포는 포자(spore) 또는 배우체(gametophyte), 특히 바람직하게는, 배우체이다.
본 발명의 두 번째 요부는 갈조류의 세포의 배우체의 냉동 건조된 산물을 획득하는 방법인데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
- 성숙 포자체(sporophyte)의 수거;
- 시험관내에서 포자의 방출(emission);
- 시험관내에서 포자의 발아(germination);
- 배우체 세포의 수거;
- 획득된 배우체 세포의 냉동 건조.
“성숙 포자체”는 특정한 저장소, 예를 들면, 포자낭군 내에 포자를 포함하는 포자체를 의미한다.
본 발명의 세 번째 요부는 바람직하게는, 중량으로 0.2 내지 5%, 더욱 바람직하게는, 1 내지 2%의 범위에서 활성 성분으로서, 본 발명에 따른 냉동 건조된 산물을 함유하는 국소용 미용 제제이다.
본 발명의 네 번째 요부는 활성 성분으로서, 본 발명에 따른 냉동 건조된 산물을 함유하는 식품 보조제이다.
본 발명에 따른 미용 제제는 피부에 색소를 형성하고, 피부가 UV 광에 노출되는 것을 대비하고, UV 광에 의해 유발되는 산화 스트레스(oxidative stress)로부터 피부를 보호하고 및/또는 세포 노화로부터 피부를 보호하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 식품 보조제는 피부가 UV 광에 노출되는 것을 대비하는데 사용될 수 있다.
도 1: 다시마목(Laminariales) 재생 주기(reproduction cycle).
도 2: HES(헤마톡실린/에오신/사프란)으로 색소 형성된 치료된/치료되지 않은 표피 단편.
실시예 1: 다시마목 갈조류의 배우체의 획득
아래의 종(species)에 대한 배우체 세포를 획득하였다: 라미나리아 사카리나(Laminaria saccharina), 라미나리아 하이퍼보레아(Laminaria hyperborea), 알라리아 에스쿨렌타(Alaria esculenta), 미역(Undaria pinnatifida).
10월과 2월 사이에 프랑스 브리타니(Brittany) 지방의 해안에서 J0에 포자낭군을 보이는 생식 능력이 있는 성숙 포자체의 엽상체를 수거하였다(도 1 참조).
이들은 여과된 염수로 씻어내고 5 내지 10 ㎠의 조각으로 절단하며, 이들 조각은 여과된 염수에 연속적으로 담그고, 여과된 염수를 보유하는 2개 탱크 내에서 20초 내지 30초 동안 0.2% 표백하였다.
이후, 이들 엽상체의 조각은 흡수성 페이퍼 상에서 건조시키고 흡수성 페이퍼의 시트 상에서 30개로 분할하며, 흡수성 페이퍼의 이들 시트는 동그랗게 말았다.
엽상체 조각을 보유하는 동그랗게 말려진 흡수성 페이퍼의 시트는 15℃에서 12시간동안 항온처리하였다. 이후, 이들은 여과된 담수 내로 위치시키고, 포자를 방출시켰다.
이들 포자는 가볍게 교반하면서 광(1800-2000 lux, 24h/24)의 존재에서 플라스크 내에서 0.1% Provasoli 용액을 포함하는 규정된 배양 배지에 배양하였다.
온도는 22℃까지 하루에 0.5℃씩 증가시켰다. 배지는 2주일마다 교체하였다.
포자는 6 내지 20일의 배양후 발아시키고, 이들 배우체는 발아후 10-12일 시점에 수거하였다(표 2 참조).
1 ℓ Provasoli 용액의 조성
EDTA 3 g
Fe(Cl) 0.08 g
Mn(Cl) 0.12 g
Zn(Cl) 0.015 g
Co(Cl) 0.003 g
Ca(SO4) 0.0012 g
B(H3BO3) 0.6 g
Mo(Na2MoO4) 0.05 g
종 발아 기간(day) 배우체의 획득
라미나리아 사카리나
(Laminaria saccharina), 		9 J19-J21
라미나리아 하이퍼보레아
(Laminaria hyperborea), 		11-20 J21-J32
알라리아 에스쿨렌타
(Alaria esculenta), 		6-7 J16-J19
미역(Undaria pinnatifida) 7 J17-J19
실시예 2: 갈조류의 배우체 세포의 냉동-건조된 산물의 획득
모종(plantlet)의 발아를 예방하기 위한 카나마이신-황산염과 이산화게르마늄(germanium dioxide)-없는 배지로 배우체의 저해
배양액은 여과기(sieve) 상에서 여과하고, 세포는 염수로 씻어내고 평판-냉동-건조기에서 냉동 건조시켰다.
HPLC로 푸곡산틴을 적정하기 위하여, 10 ㎖의 70% 에탄올에 0.05%의 냉동-건조된 산물의 비율로 에탄올 추출을 수행하고, 어둠 속에서 6시간동안 교반하며, 이후 여과하였다.
HPLC 분석은 아래의 용매/구배(gradient)를 갖는 Absorbsphere 상에서 수행하였다:
A = 아세트산암모늄/메탄올 (20:80)
B = 아세토니트릴 90%
C = 에틸 아세테이트
실시예 3: BB 산물의 제조
미역(Undaria pinnatifida)(Laminariaciae)의 배우체의 냉동-건조된 산물은 실시예 2에 따라 제조하였다.
적절한 방식으로 피부 배양액에 이러한 냉동-거조된 산물을 이용하기 위하여, 상기 냉동-건조된 산물은 배우체의 배양 배지 내로 집어넣었다. 혼합물은 초음파처리하고, 이후 여과하였다. 이러한 여과된 산물의 결과는 <<BB>>라고 한다.
실시예 4: 재구성된 각막 SKINETHIC에 대한 세포독성 연구에서 갈조류의 배우체 세포의 냉동-건조된 산물의 점막 내성(mucous tolerance)의 평가
1. - 실험 프로토콜
규정되고 변형된 MCDB 153 배지 내에서 세포 배양에 의해 자발적으로 형질전환되고 증폭된 TR 146 세포주의 각화세포를 이용하였다.
이들 인간 각화세포는 규정된 배지 내에서 공기/액체 계면 상에서 배양되는 경우에, 인간 각막(cornea)과 유사한 각막 층(cornea layer)이 없는 다층 표피를 형성한다.
조사 산물(본 발명의 경우에, 실시예 3에 따른 BB 산물)은 마이크로-피펫을 이용하여 30 ㎕의 비율로 8개의 동등한 배양액의 표면 상에 적용하였다. 이후, 이들 배양액은 37℃, 5%의 CO2에서 10분, 1시간, 3시간, 24시간동안 배양 기간별로 2개씩 배양하였다.
음성(완충된 염수 용액)과 양성(SDS 0.5%와 1%) 대조(control)는 무균 상태로 제조하고, 각각 2개의 배양액에 동일한 방식으로 적용하였다.
그 다음, 이들 배양액은 37℃, 5%의 CO2에서 1시간과 24시간동안 배양 기간별로 2개씩 배양하였다.
2 - 세포 생존능(cellular viability)의 평가
세포 생존능은 생체 염료(vital dye)로 표지이후 정량적으로 측정하였다. MTT 시스템으로 생존 세포의 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase) 활성을 측정한다. 핵심 구성요소는 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물 또는 MTT이다.
페놀 레드(phenol red)의 부재에서, MTT로 완충된 염 용액은 황색을 띤다. 생존 세포의 미토콘드리아 탈수소효소는 테트라졸리움 주기(tetrazolium cycle)를 단축하고, 따라서 수용액에 불용성인 보라색 포르마잔(formazan) 결정의 형성을 유도한다.
이들 생존 세포에 의해 형성된 결정은 표피 배양액에 서포트(support)로서 기능하는 폴리카보네이트 필터 내에 갇힌다. 배양액은 이들 세포가 생존하는 동안에는 균일하고 강렬한 청색/보라색을 나타내는 반면, 사멸하는 경우에는 백색/황색으로 나타난다.
이들 결과는 음성과 양성 대조 물질과 비교한다.
10% vol/vol의 MTT 용액을 포함하는 0.15 ㎖의 배양 배지는 각 필터/배양 서포트 하에서 피펫으로 이전한다. 실온에서 30분의 배양이후, 이들 상이한 배양액의 색채를 관찰한다.
음성 대조 배양액은 24시간동안 접촉이후 강력한 청색/보라색을 나타내는데, 이는 점막의 생존능을 입증한다.
양성 대조 배양액은 1시간의 접촉이후 백색을 나타내는데, 이는 세포 사멸을 입증한다.
3 - 결과
산물 양쪽 배양액의 색채 독성
10분 1h 3h 24h
BB 청색 청색 청색 백색 NI
음성 대조 청색 청색 청색 청색 NI
SDS 0.5% 청색 백색 백색 / I
SDS 1% 백색 백색 / / VI
NI = 자극 없음
I = 자극
VI = 강한 자극
4 - 결론
적용된 실험 조건 하에, 실시예 3에 따른 순수한 BB 산물은 시험관내 재구성된 점막의 모형 SKINETHIC을 형성하는 세포를 자극하지 않는다.
실시예 5: 재구성된 표피 피부 SKINETHIC에 대한 세포독성 연구에서 갈조류의 배우체 세포의 냉동-건조된 산물의 피부 내성(mucous tolerance)의 평가
1. - 실험 프로토콜
인간 기원의 각화세포는 규정되고 보충된 배지(변형된 MCDB 153) 내에서 0.63 ㎠의 폴리카보네이트 필터 상에 도말한다. 이들 세포는 공기/액체 계면 상에서 10일동안 배양하고, 배양 배지는 격일로 교체한다.
이렇게 형성된 표피는 배양후 14일 시점부터 본 연구를 수행하는데 이용하였다.
검사는 상기 산물의 24시간 배양이후, 표피당 2 ㎕의 비율로 삼중으로 수행하였다.
대조 표피에는 상기 산물이 전혀 제공되지 않았다.
10% 포름알데히드 용액 내에 고정된 표피는 파라핀 블록 내로 포매(embedding)하였다. 4 마이크론의 축방향 절편은 HES(헤마톡실린/에오신/사프란)으로 염색하고, 광 현미경 하에 사진을 촬영하였다.
상기 산물이 독성을 나타내지 않으면, 배양액이 기저의 가시모양 과립 세포층 및 손상되지 않은 오르토각화성(orthokeratosic) 각막을 나타내고, 피부 성층(skin stratification)이 규칙적이고 정상적이다. 기저 층 세포가 축방향으로 분열된다. 다수의 각화유리질(karatohyalin) 알갱이가 각질층(stratum corneum) 바로 아래 과립층(stratum granulosum) 내에서 관찰된다.
2 - 결과
도 2를 참조한다.
3 - 결론
적용된 실험 조건 하에, 실시예 3에 따른 순수한 BB 산물은 재구성된 피부 SKINETHIC에 대한 세포독성을 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 6: 색소 형성 검사
1 - 재료와 방법
BB 산물은 에탄올에 희석하고, 이후 미용 제제 내로 통합한다.
검사된 산물은 아래와 같다:
a - 0.05%에서 제제 내로 통합된 BB 산물
b - 0.15%에서 제제 내로 통합된 BB 산물
c - 0.30%에서 제제 내로 통합된 BB 산물
이들은 사용 때까지 4℃에서 보관한다.
2 - 생화학적 평가
배양의 종결 시점에서, 세포 용해질(lysate)에 내포된 멜라닌은 분광광도법(spectrophometrical method)으로 정량하였다. 멜라닌의 범위 역시 상기 검사로 결정하였다.
결과는 세포 카펫(cell carpet)의 용해질 ㎖당 멜라닌 ㎍으로 표시된다(평균 +/- 표준 편차 SD).
<<처리된 조건>>과 <<대조 조건>> 사이에서 관찰된 차이의 통계학적 유의성은 일원배치 분산분석(one way ANOVA) 및 Bonferroni t-검증을 순차적으로 수행하여 평가하였다(*: p<0.05; **: p<0.01).
표 4, 5, 6: 처리되거나 처리되지 않은 재구성되고 멜라닌화된 인간 표피 내에서 멜라닌 함량의 생화학적 정량
UV 없음 배지
단독		 α-MSH
100 nM		 ETOH BB
0.05 0.15 0.3 재-적용없이 0.15
멜라닌(㎍/㎖) 47.3 70.3 56.6 59.9 69.1 70.3
67.3 86.9 58.7 60.5 77.2 69.0
75.8 85 56.1 66.1 56 58.5
평균 57.3 80.7 57.1 62.2* 73.1** 69.6*
S.D. 14.1 9.1 1.3 3.4 5.7 0.9
배지 단독% 100 141 100 108 128 122
ETOH BB 0.05% 100 108.8 128 121.9
+UVA 배지
단독		 α-MSH
100 nM		 ETOH BB
0.05 0.15 0.3 재-적용없이 0.15
멜라닌(㎍/㎖) 57.4 95.6 69.7 63.5 64.7 61.2
73.9 84.7 66.3 64.1 66.3 66.3
73.4 107.9 57.3 65.7
평균 68.2 96.1 64.5 64.4 65.5 62.6
S.D. 9.4 11.6 6.4 1.2 1.2 3.3
배지 단독% 100 141 94 94 96 92
+UVB 배지
단독		 α-MSH
100 nM		 ETOH BB
0.05 0.15 0.3 재-적용없이 0.15
멜라닌(㎍/㎖) 82.6 99.5 60.7 64.6 40.1 44.8
91.4 115.5 65.8 66.1 30.9 65.3
75.3 104.6 67.1 70.5 38.7 64.5
평균 83.1 106.5 64.5 67.1 36.6 58.2
S.D. 8 8.2 3.4 3.1 5 11.6
배지 단독% 100 128 78 81 44 70
3 - 조직학적 평가
표피 피부는 배양의 종결 시점으로부터 포름알데히드 내에 고정시키고, 파라핀 블록 내로 포매(embedding)하였다. 이후, 4 ㎛ 두께의 절편을 절단하였다.
이들 피부 절편 내에 존재하는 멜라닌은 <<Fontana Masson>>이라고 하는 독특한 염색으로 노출시켰다. 조건별로 슬라이드는 배율(magnification) x400으로 관찰하였다. 이들 슬라이드 상에서 관찰되는 멜라닌은 ImageJ 프로그램을 이용한 이미지 분석으로 정량하였다.
결과는 각 슬라이드 내에서 멜라닌에 의해 점유되는 표면(0 내지 100 사이의 계조(grey scale) 픽셀(pixel)의 개수; 0 = 흑색/255 = 백색)의 형태로 표시된다(평균 +/- 표준 편차 SD).
처리된 조건과 대조 조건 사이에서 관찰된 차이의 통계학적 유의성은 스튜던트 검증(Student's test)으로 평가하였다(*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001).
이미지 분석에 의한, 처리된/처리되지 않은 재구성되고 멜라닌화된 인간 표피 피부의 멜라닌 함량의 정량
UV 없음 배지
단독		 α-MSH
100 nM		 ETOH BB
0.05 0.15 0.3 재-적용없이
0.15
멜라닌에 의해
점유되는 표면
(픽셀)		 24131 38565 22754 29849 22821 22036
17119 25757 16628 15245 15368 19500
30306 42233 16392 36248 20144 25949
13966 55615 12954 7678 19722 16277
9673 51363 22308 6990 21260 11746
19100 43652 7362 10329 18916 19408
13226 44188 4473 10212 20203 42503
20874 44053 17132 22152 25844 19002
26733 22738 17195 25753 17680 30479
18715 34614 9717 15909 17895 14747
평균 19384.3 40277.8 14691.5 18036.5 19985.3* 22164.7*
S.D. 6370.9 10308.4 6034.9 10055.1 2911.3 8944.6
배지 단독% 100 208 76 93 103 114
ETOH BB 0.05% - - 100 122.8 136 150.9
3 - 결과
제제 “ETOH BB 0.15”는 재-적용(re-application)없이, UVA 또는 UVB에 노출되지 않은 재구성되고 멜라닌화된 인간 표피 피부의 멜라닌 함량을 현저하게 증가시킨다(생화학적 분석에서 +22%, 이미지 분석에서 +51%).
제제 “ETOH BB 0.3”은 UVA 또는 UVB에 노출되지 않은 재구성되고 멜라닌화된 인간 표피 피부의 멜라닌 함량을 현저하게 증가시킨다(생화학적 분석에서 +28%, 이미지 분석에서 +36%).
실시예 7: 거대분자(macromolecule)의 수송에 대한 효과
7.1 - 분리된 마이크로솜(microsome)의 시스템 내에서 거대분자(당질(glucide), 지질, 단백질)의 수송 속도의 평가
인간 각화세포의 마이크로솜은 세포 파쇄액(homogenate)의 고속 분별 원심분리(high-speed differential centrifugation)에 의해 획득되는 막 분획(fraction)을 형성한다. 이러한 마이크로솜 제제는 NADPH와 같은 외인성 보조인자(cofactor)의 추가를 필요로 한다.
7.1.1 - 당질(글루코오스)의 수송
본 검사는 마이크로솜의 직접 처리이후 삼중으로 수행하였다.
차지(charge) 1: 산물이 전혀 존재하지 않는 음성 대조(negative control).
차지 2: 양성 대조(0.25 mM 플로레틴(phloretin))
차지 3-5: 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
차지 6-8: 0.25 mM 플로레틴과 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
배양중인 인간 각화세포로부터 획득된 마이크로솜은 글루코오스가 없는 PBS 완충액으로 3회 씻어내고, 37℃에서 30분간 1 ㎖의 동일 완충액 내에서 미리 배양하였다. 이후, 상기 용액은 버리고, 마이크로솜은 37℃에서 수조 내에서 교반하면서 3-O-메틸 글루코오스(MG)와 [3H] 3-O-MG를 함유하는 글루코오스-없는 PBS 완충액 내에 위치시켰다. 3-O-MG 포획은 사이토칼라신(cytochalasin) B를 함유하는 1 ㎖의 차가운 PBS의 추가로 중단시켰다. 배양의 동역학은 30초 내지 120초간 수행하였다. 마이크로솜은 PBS로 2회 추가로 씻어내고, 4℃에서 하룻밤동안 NaOH(1M)에 용해시켰다. 신틸레이션 계수기로 방사능을 측정하였다.
단독으로 또는 플로레틴의 존재에서 BB 산물로 마이크로솜의 처리는 배양 배지 내로 [3H] 3-O-MG의 도입과 동일한 시점에 수행하였다.
단백질 검사는 BRADFORD 방법에 따라 수행하였다. 595 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 측정된 흡광도(absorbance)의 증가는 단백질 농도에 비례한다.
결과: [3H] 3-O-MG(nmol/㎎ 단백질) 포획
30초 60초 90초 120초
음성 대조 9 15 19 21
BB 1/10 10 14 20 22
BB 1/5 9 15 20 22
BB 1/2 11 16 21 21
플로레틴(0.25 mM) 4 6 8 8
BB(1/10)+플로레틴 5 11 17 19
BB(1/5)+플로레틴 6 12 18 21
BB(1/2)+플로레틴 7 14 18 22
지정된 농도에서 BB 산물로 각화세포의 마이크로솜의 직접적인 처리이후, 획득된 결과는 글루코오스의 수송 속도의 저해를 나타내지 않는다. 생리 조건 하에 글루코오스 포획의 동역학은 대조 마이크로솜 및 지정된 3가지 농도에서 BB 산물로 처리된 마이크로솜 내에서 거의 동일하다.
이들 결과는 플로레틴으로 마이크로솜의 직접적인 처리가 글루코오스의 수송 속도를 강하게 저해한다는 것을 입증한다. 플로레틴과 동시에 3가지 농도에서 BB 산물로 마이크로솜의 처리는 글루코오스의 수송 속도를 현저하게 복원한다. 저해 농도 하에 글루코오스 포획의 동역학은 지정된 3가지 농도에서 BB 산물에 의해 완벽하게 복원된다.
7.1.2 - 지질의 수송
본 검사는 마이크로솜의 직접 처리이후 삼중으로 수행하였다.
차지 1: 산물이 전혀 존재하지 않는 음성 대조.
차지 2: 양성 대조(1 mM 디펜히드라민(diphenhydramine))
차지 3-5: 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
차지 6-8: 1 mM 디펜히드라민과 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
배양중인 인간 각화세포로부터 획득된 마이크로솜은 25 mM Tris 완충액으로 3회 씻어내고, 37℃에서 30분간 1 ㎖의 동일 완충액 내에서 미리 배양하였다. 이후, 상기 용액은 버리고, 마이크로솜은 37℃에서 수조 내에서 교반하면서 [3H] 콜린(choline)을 함유하는 25 mM Tris 완충액 내에 위치시켰다. 콜린 포획은 용해 완충액(lysis buffer)(50 mM Tris, 140 mM NaCl, 1.5 mM MgSO4, 0.5% Igepal-Ca-630, 0.2% SDS)의 추가로 중단시켰다. 배양의 동역학은 30초 내지 120초간 수행하였다. 마이크로솜은 PBS로 2회 씻어내고, 4℃에서 하룻밤동안 NaOH(1M)에 용해시켰다. 신틸레이션 계수기로 방사능을 측정하였다.
단독으로 또는 디펜히드라민(DPA)의 존재에서 BB 산물로 마이크로솜의 처리는 배양 배지 내로 [3H] 콜린의 도입과 동일한 시점에 수행하였다.
단백질 검사는 BRADFORD 방법에 따라 수행하였다. 595 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 측정된 흡광도(absorbance)의 증가는 단백질 농도에 비례한다.
결과: [3H] 콜린(pmol/㎎ 단백질) 포획
30초 60초 90초 120초
음성 대조 155 201 261 301
BB 1/10 175 212 268 310
BB 1/5 163 210 277 321
BB 1/2 194 240 289 312
DPA(1 mM) 74 105 132 142
BB(1/10)+DPA 100 121 153 183
BB(1/5)+DPA 113 131 168 199
BB(1/2)+DPA 125 140 189 223
지정된 농도에서 BB 산물로 각화세포의 마이크로솜의 직접적인 처리이후, 획득된 결과는 지질의 수송 속도의 저해를 나타내지 않는다. 생리 조건 하에 콜린 포획의 동역학은 대조 마이크로솜 및 지정된 3가지 농도에서 BB 산물로 처리된 마이크로솜 내에서 거의 동일하다.
이들 결과는 디펜히드라민으로 마이크로솜의 직접적인 처리가 지질의 수송 속도를 강하게 저해한다는 것을 입증한다. 디펜히드라민과 동시에 3가지 농도에서 BB 산물로 마이크로솜의 처리는 지질의 수송 속도를 복원한다. 저해 농도 하에 콜린 포획의 동역학은 지정된 3가지 농도에서 BB 산물로 중간 정도로 복원된다.
7.1.3 - 단백질(알부민)의 수송
본 검사는 마이크로솜의 직접 처리이후 삼중으로 수행하였다.
차지 1: 산물이 전혀 존재하지 않는 음성 대조.
차지 2: 양성 대조(노코다졸(nocodazole), 6 ㎎/㎖)
차지 3-5: 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
차지 6-8: 노코다졸 6 ㎎/㎖와 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
배양중인 인간 각화세포로부터 획득된 마이크로솜은 완충액으로 3회 씻어내고, 37℃에서 30분간 1 ㎖의 동일 완충액 내에서 미리 배양하였다. 이후, 상기 용액은 버리고, 마이크로솜은 37℃에서 수조 내에서 교반하면서 알부민-FITC를 함유하는 HBSS 완충액 내에 위치시켰다. 알부민 포획은 122.5 mM NaCl; 5.4 mM KCl; 1.2 mM CaCl2; 0.8 mM MgCl2; 0.8 Na2HPO4; 0.2 NaHPO4; 5.5 mM 글루코오스; 10 mM HEPES, pH 7.4를 함유하는 링거액의 추가로 중단시켰다. 이후, 마이크로솜은 Triton X-100(3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산 20 mM, pH 7.4에서 0.1% v/v)으로 처리하였다. 분광광도계(여기 480 nm; 방출 520 nm)로 형광을 정량하였다. 배양의 동역학은 30초 내지 120초간 수행하였다.
단독으로 또는 노코다졸(ND)의 존재에서 BB 산물로 마이크로솜의 처리는 배양 배지 내로 알부민-FITC의 도입과 동일한 시점에 수행하였다.
단백질 검사는 BRADFORD 방법에 따라 수행하였다. 595 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 측정된 흡광도(absorance)의 증가는 단백질 농도에 비례한다.
결과: 알부민-FITC(㎍/㎎ 단백질) 포획
30초 60초 90초 120초
음성 대조 0.32 0.45 0.55 0.75
BB 1/10 0.3 0.47 0.59 0.74
BB 1/5 0.37 0.5 0.62 0.76
BB 1/2 0.4 0.55 0.67 0.8
ND(6 ㎎/㎖) 0.11 0.29 0.34 0.43
BB(1/10)+ND 0.12 0.3 0.33 0.41
BB(1/5)+ND 0.19 0.33 0.38 0.49
BB(1/2)+ND 0.23 0.38 0.44 0.57
지정된 농도에서 BB 산물로 각화세포의 마이크로솜의 직접적인 처리이후, 획득된 결과는 단백질의 수송 속도의 저해를 나타내지 않는다. 생리 조건 하에 알부민 포획의 동역학은 대조 마이크로솜 및 지정된 3가지 농도에서 BB 산물로 처리된 마이크로솜 내에서 거의 동일하다.
이들 결과는 노코다졸로 마이크로솜의 직접적인 처리가 단백질의 수송 속도를 강하게 저해한다는 것을 입증한다. 노코다졸과 동시에 1/5와 1/2 농도에서 BB 산물로 마이크로솜의 처리는 단백질의 수송 속도를 중간 정도로 복원한다. 1/10 농도에서는 어떤 효과도 관찰되지 않았다.
7.2 - 정상 인간 각화세포의 수준에서 거대분자의 수송 속도의 평가
적용된 방법은 인간 피부의 생검으로부터, 일차 배양액 내에 각화세포를 획득할 수 있는 외식(explantation) 방법이다. 이들 검사는 상이한 경험 사이에 재현성(reproducibility)을 담보하기 위하여 2회 계대배양 내지 4회 계대배양된 각화세포 상에서 수행하였다.
이들 각화세포는 인슐린과 하이드로코르티손(hydrocortisone)으로 보충된 1 ㎖의 배양 배지 SKINETHIC 내에서 웰당 105개 세포의 비율로 다중웰 평판(6개 웰)으로 분할하였다.
7.2.1 - 당질(글루코오스)의 수송
본 검사는 배양중인 정상 인간 각화세포 상에서 삼중으로 수행하였다.
차지 1: 산물이 전혀 존재하지 않는 음성 대조.
차지 2: 양성 대조(0.25 mM 플로레틴)
차지 3-5: 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
차지 6-8: 0.25 mM 플로레틴과 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
0.25 mM 플로레틴의 존재와 부재에서 BB 산물로 각화세포의 처리는 37℃에서 20분간 수행하였다. 막 마이크로솜은 분별 원심분리로 분리하였다.
글루코오스의 수송 속도를 측정하기 위하여 [3H] 3-O-메틸 글루코오스 포획의 동일한 프로토콜을 이용하였다(6.1.1 참조).
결과: [3H] 3-O-MG(nmol/㎎ 단백질) 포획
30초 60초 90초 120초
음성 대조 6 12 15 19
BB 1/10 7 10 16 17
BB 1/5 8 13 17 18
BB 1/2 10 14 18 20
플로레틴(0.25 mM) 6 8 9 10
BB(1/10)+플로레틴 6 10 15 18
BB(1/5)+플로레틴 7 13 16 19
BB(1/2)+플로레틴 8 13 17 18
마이크로솜의 분리에 앞서, BB 산물로 정상 각화세포의 처리이후, 획득된 결과는 글루코오스의 수송 속도의 저해를 나타내지 않는다. 생리 조건 하에 글루코오스 포획의 동역학은 각화세포의 대조 마이크로솜 및 지정된 3가지 농도에서 BB 산물로 처리된 각화세포의 마이크로솜 내에서 거의 동일하다.
이들 결과는 마이크로솜의 분리에 앞서, 플로레틴으로 정상 각화세포의 처리가 글루코오스의 수송 속도를 강하게 저해한다는 것을 입증한다. 플로레틴과 동시에 3가지 농도에서 BB 산물로 정상 각화세포의 처리는 글루코오스의 수송 속도를 현저하게 복원한다. 저해 농도 하에 글루코오스 포획의 동역학은 지정된 3가지 농도에서 BB 산물에 의해 완벽하게 복원된다.
7.2.2 - 지질의 수송
본 검사는 배양중인 정상 인간 각화세포 상에서 삼중으로 수행하였다.
차지 1: 산물이 전혀 존재하지 않는 음성 대조.
차지 2: 양성 대조(1 mM 디펜히드라민)
차지 3-5: 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
차지 6-8: 1 mM 디펜히드라민과 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
1 mM 디펜히드라민의 존재와 부재에서 BB 산물로 각화세포의 처리는 37℃에서 120분간 수행하였다. 막 마이크로솜은 분별 원심분리로 분리하였다.
콜린의 수송 속도를 측정하기 위하여 [3H] 콜린 포획의 동일한 프로토콜을 이용하였다(6.1.2 참조).
결과: [3H] 콜린(pmol/㎎ 단백질) 포획
30초 60초 90초 120초
음성 대조 142 173 202 215
BB 1/10 151 163 198 223
BB 1/5 162 178 207 227
BB 1/2 174 191 218 231
DPA(1 mM) 92 115 143 156
BB(1/10)+DPA 112 128 159 174
BB(1/5)+DPA 119 132 165 179
BB(1/2)+DPA 127 139 174 191
마이크로솜의 분리에 앞서, BB 산물로 정상 각화세포의 처리이후, 획득된 결과는 지질의 수송 속도의 저해를 나타내지 않는다. 생리 조건 하에 콜린 포획의 동역학은 각화세포의 대조 마이크로솜 및 지정된 3가지 농도에서 BB 산물로 처리된 각화세포의 마이크로솜 내에서 거의 동일하다.
이들 결과는 마이크로솜의 분리에 앞서, 디펜히드라민으로 정상 각화세포의 처리가 지질의 수송 속도를 중간 정도로 저해한다는 것을 입증한다. 디펜히드라민과 동시에 3가지 농도에서 BB 산물로 정상 각화세포의 처리는 지질의 수송 속도를 복원한다. 저해 농도 하에 콜린 포획의 동역학은 지정된 3가지 농도에서 BB 산물로 중간 정도로 복원된다.
7.2.3 - 단백질(알부민)의 수송
본 검사는 배양중인 정상 인간 각화세포 상에서 삼중으로 수행하였다.
차지 1: 산물이 전혀 존재하지 않는 음성 대조.
차지 2: 양성 대조(노코다졸, 6 ㎎/㎖)
차지 3-5: 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
차지 6-8: 노코다졸 6 ㎎/㎖와 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
노코다졸 6 ㎎/㎖의 존재와 부재에서 BB 산물로 각화세포의 처리는 37℃에서 120분간 수행하였다. 막 마이크로솜은 분별 원심분리로 분리하였다.
알부민의 수송 속도를 측정하기 위하여 알부민-FITC 포획의 동일한 프로토콜을 이용하였다(6.1.3 참조).
결과: 알부민-FITC(㎍/㎎ 단백질) 포획
30초 60초 90초 120초
음성 대조 0.25 0.39 0.45 0.61
BB 1/10 0.24 0.40 0.48 0.63
BB 1/5 0.28 0.44 0.52 0.67
BB 1/2 0.31 0.46 0.54 0.73
ND(6 ㎎/㎖) 0.09 0.22 0.26 0.37
BB(1/10)+ND 0.1 0.24 0.26 0.39
BB(1/5)+ND 0.12 0.27 0.30 0.41
BB(1/2)+ND 0.16 0.29 0.36 0.47
마이크로솜의 분리에 앞서, BB 산물로 정상 각화세포의 처리이후, 획득된 결과는 단백질의 수송 속도의 저해를 나타내지 않는다. 생리 조건 하에 알부민 포획의 동역학은 각화세포의 대조 마이크로솜 및 1/10 농도에서 BB 산물로 처리된 각화세포의 마이크로솜 내에서 동일하다. 1/2와 1/5 농도에서 단백질의 수송 속도의 근소한 증가가 관찰된다.
이들 결과는 마이크로솜의 분리에 앞서, 노코다졸로 정상 각화세포의 처리가 단백질의 수송 속도를 저해한다는 것을 입증한다. 노코다졸과 동시에 2가지 농도에서 BB 산물로 정상 각화세포의 처리는 단백질의 수송 속도를 중간 정도로 복원한다. 1/10 농도에서는 어떤 효과도 관찰되지 않았다.
7.3 - 노쇠한 인간 각화세포의 수준에서 거대분자의 수송 속도의 평가
노쇠(senescence)는 세포 노화(cell aging)의 한 현상으로, 이 시점에 세포는 세포 주기(cell cycle)의 G1 단계에서 중지되고, 세포 분열(cell division)을 유도하는 합성 단계(synthetic phase) 단계로 들어가지 못한다. 노쇠 세포는 거대분자의 합성과 수송 수준에서 느려진 대사로 특성화된다.
혈청이 제거된 배양액 내에서 세포는 그들의 성장을 중단하지만, G1 단계에 도달할 때까지 세포 주기를 계속 진행한다.
적용된 방법은 인간 피부의 생검으로부터, 각화세포의 일차 배양액을 획득할 수 있는 외식(explantation) 방법이다. 이들 검사는 대조 세포 수준에서 노쇠 세포의 존재를 담보하기 위하여 8회 계대배양 내지 10회 계대배양된 각화세포 상에서 수행하였다.
이들 각화세포는 EGF, 하이드로코르티손, 인슐린, 젠타마이신으로 보충된 3 ㎖의 배양 배지 SKINETHIC 내에서 웰당 105개 세포의 비율로 다중웰 평판(6개 웰)에 접종하였다. 이후, 이들은 CO2 하에 배양기 내에서 5일동안 유지시켰다.
7.3.1 - 당질(글루코오스)의 수송
본 검사는 노쇠된 정상 인간 각화세포 상에서 삼중으로 수행하였다.
차지 1: 산물이 전혀 존재하지 않는 음성 대조.
차지 2: 양성 대조(0.25 mM 플로레틴)
차지 3-5: 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
차지 6-8: 0.25 mM 플로레틴과 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
0.25 mM 플로레틴의 존재와 부재에서 BB 산물로 각화세포의 처리는 37℃에서 20분간 수행하였다. 막 마이크로솜은 분별 원심분리로 분리하였다.
글루코오스의 수송 속도를 측정하기 위하여 [3H] 3-O-메틸 글루코오스 포획의 동일한 프로토콜을 이용하였다(6.1.1 참조).
결과: [3H] 3-O-MG(nmol/㎎ 단백질) 포획
30초 60초 90초 120초
음성 대조 3 5 10 11
BB 1/10 4 8 12 12
BB 1/5 6 8 13 13
BB 1/2 7 10 14 15
플로레틴(0.25 mM) 1 3 5 7
BB(1/10)+플로레틴 3 5 7 8
BB(1/5)+플로레틴 5 8 9 11
BB(1/2)+플로레틴 6 10 12 13
획득된 결과는 글루코오스의 수송 속도가 정상 각화세포에 비하여 노쇠 수준의 각화세포에서 현저하게 낮다는 것을 입증한다.
마이크로솜의 분리에 앞서, BB 산물로 노쇠 각화세포의 처리는 처리되지 않은 대조 세포에 비하여 글루코오스의 수송 속도의 증가를 나타낸다. 생리 조건 하에 글루코오스 포획의 동역학은 각화세포의 대조 마이크로솜에 비하여 BB 산물로 처리된 각화세포의 마이크로솜의 수준에서 더욱 높다. 이러한 결과는 상이한 배양 기간(30초, 60초, 90초, 120초)에서 획득된다.
이들 결과는 마이크로솜의 분리에 앞서, 플로레틴으로 노쇠 각화세포의 처리가 글루코오스의 수송 속도를 강하게 저해한다는 것을 입증한다. 플로레틴과 동시에 2가지 농도(1/5와 1/2)에서 BB 산물로 노쇠 각화세포의 처리는 글루코오스의 수송 속도를 현저하게 복원한다. 1/10 농도에서는 경미한 효과가 관찰되었다.
7.3.2 - 지질의 수송
본 검사는 노쇠한 인간 각화세포 상에서 삼중으로 수행하였다.
차지 1: 산물이 전혀 존재하지 않는 음성 대조.
차지 2: 양성 대조(1 mM 디펜히드라민)
차지 3-5: 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
차지 6-8: 1 mM 디펜히드라민과 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
1 mM 디펜히드라민의 존재와 부재에서 BB 산물로 각화세포의 처리는 37℃에서 120분간 수행하였다. 막 마이크로솜은 분별 원심분리로 분리하였다.
콜린의 수송 속도를 측정하기 위하여 [3H] 콜린 포획의 동일한 프로토콜을 이용하였다(6.1.2 참조).
결과: [3H] 콜린(pmol/㎎ 단백질) 포획
30초 60초 90초 120초
음성 대조 114 132 164 181
BB 1/10 110 135 166 173
BB 1/5 113 143 188 194
BB 1/2 121 153 187 201
DPA(1 mM) 55 79 106 119
BB(1/10)+DPA 52 69 110 125
BB(1/5)+DPA 67 87 132 141
BB(1/2)+DPA 77 104 137 148
획득된 결과는 지질의 수송 속도가 정상 각화세포에 비하여 노쇠 수준의 각화세포에서 현저하게 낮다는 것을 입증한다.
마이크로솜의 분리에 앞서, BB 산물로 노쇠 각화세포의 처리는 처리되지 않은 대조 세포에 비하여 지질의 수송 속도의 저해 없음을 나타낸다. 생리 조건 하에 지질 포획의 동역학은 BB 산물로 처리된 각화세포의 마이크로솜과 각화세포의 대조 마이크로솜에서 유사하다.
이들 결과는 마이크로솜의 분리에 앞서, 디펜히드라민으로 노쇠 각화세포의 처리가 지질의 수송 속도를 강하게 저해한다는 것을 입증한다. 디펜히드라민과 동시에 2가지 농도(1/5와 1/2)에서 BB 산물로 노쇠 각화세포의 처리는 지질의 수송 속도를 현저하게 복원한다. 1/10 농도에서는 어떤 효과도 관찰되지 않았다.
7.3.3 - 단백질(알부민)의 수송
본 검사는 노쇠한 인간 각화세포 상에서 삼중으로 수행하였다.
차지 1: 산물이 전혀 존재하지 않는 음성 대조.
차지 2: 양성 대조(노코다졸, 6 ㎎/㎖)
차지 3-5: 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
차지 6-8: 노코다졸 6 ㎎/㎖와 조사 산물(3가지 농도)로 처리됨
노코다졸 6 ㎎/㎖의 존재와 부재에서 BB 산물로 각화세포의 처리는 37℃에서 120분간 수행하였다. 막 마이크로솜은 분별 원심분리로 분리하였다.
알부민의 수송 속도를 측정하기 위하여 알부민-FITC 포획의 동일한 프로토콜을 이용하였다(6.1.3 참조).
결과: 알부민-FITC(㎍/㎎ 단백질) 포획
30초 60초 90초 120초
음성 대조 0.17 0.29 0.35 0.49
BB 1/10 0.18 0.34 0.39 0.52
BB 1/5 0.18 0.36 0.41 0.54
BB 1/2 0.2 0.37 0.43 0.55
ND(6 ㎎/㎖) 0.06 0.11 0.19 0.3
BB(1/10)+ND 0.05 0.12 0.22 0.33
BB(1/5)+ND 0.09 0.14 0.27 0.38
BB(1/2)+ND 0.1 0.19 0.3 0.43
획득된 결과는 단백질의 수송 속도가 정상 각화세포에 비하여 노쇠 수준의 각화세포에서 현저하게 낮다는 것을 입증한다.
마이크로솜의 분리에 앞서, BB 산물로 노쇠 각화세포의 처리는 처리되지 않은 대조 세포에 비하여 단백질의 수송 속도의 저해 없음을 나타낸다. 생리 조건 하에 알부민 포획의 동역학은 BB 산물로 처리된 각화세포의 마이크로솜과 각화세포의 대조 마이크로솜에서 유사하다.
이들 결과는 마이크로솜의 분리에 앞서, 노코다졸로 노쇠 각화세포의 처리가 단백질의 수송 속도를 저해한다는 것을 입증한다. 노코다졸과 동시에 2가지 농도(1/5와 1/2)에서 BB 산물로 노쇠 각화세포의 처리는 단백질의 수송 속도를 현저하게 복원한다. 1/10 농도에서는 경미한 효과가 관찰된다.
실시예 8: 호흡과 ATP 합성에 대한 효과
8.1 - 미토콘드리아와 세포 호흡에 대한 산물의 효과 연구
용액 내에서 용존 산소(dissolved oxygen)의 양은 클라크 전극(clark electrode)으로 측정될 수 있다. 테플론 필름을 통하여 확산하는 산소는 -0.8 볼트에서 분극된 백금 캐소드(platinum cathode)의 수준에서 감소될 것이다. 이들 조건 하에, 상기 캐소드(cathode)와 실버 아노드(anode) 사이에 전류 통과(current passing)는 용액 내에서 산소의 농도에 비례한다. 양 전극 사이에 이온 가교(ionic bridge)는 KCl의 포화 용액으로 발생된다.
치수의 획득과 처리는 실시간으로 마이크로컴퓨터(IBM-PC)로 수행된다. 탱크 내에서 산소 양 및 실시간으로 계산된 산소 소비 비율에 상응하는 즉석 유도체를 연속적으로 가시화시킬 수 있는 프로그램이 이용된다.
5가지 농도를 검사하는데, 이들 측정은 삼중으로 수행된다. 본 연구는 2가지 상이한 조건에서 수행된다.
8.1.1 - 세포 호흡에 대한 산물의 효과: 기저 호흡(basal respiration)의 측정
글루코오스의 존재에서 비-투과화된 세포에서 기저 호흡 속도에 대한 효과
각화세포는 CO2 하에 배양기 내에서, 하이드로코르티손, EGF, FCS(10%)로 보충된 배양 배지 DMEM 내에 작업(run)당 106개의 비율로 배양하였다.
이러한 프로토콜은 용존산소계(oxygraph)탱크 내에서 이들 세포에 산물의 직접적인 적용으로 수행하였다.
106개 세포/㎖의 농도에서 이들 세포(각화세포)는 30℃에서 자동 온도 조절되고 클라크 전극이 구비된 용존산소계 탱크 내에서 “호흡 완충액(respiration buffer)(Hanks-Hepes 20 mM 글루코오스)”에 현탁시킨다(이들 조건 하에 1 ㎖의 호흡 완충액은 480개 산소 원자를 보유한다).
이들 조건 하에, 산소 소비 비율(세포의 기저 호흡)을 측정할 수 있다. 용존산소계 탱크 내로 상이한 양의 산물(최종 농도: 1/10; 1/5; 1/2)의 추가는 호흡의 가능한 촉진 또는 저해를 나타낼 수 있다.
모든 측정 결과는 하기 표에 요약된다.
검사 산물(BB) 대조 1/10 1/5 1/2
호흡 속도
(n개의 0 원자/min/106개 세포)
(n=3)		 3.64±0.37 3.72±0.31 4.26±0.25 4.75±0.50
기저 호흡 %(n = 3) 100±6 102±4 117±3 130±5
적용된 실험 조건 하에 획득된 결과는 각화세포와 접촉하는 산물이 2가지 농도(1/5와 1/2)에서 기저 호흡 속도에서 현저한 증가를 유도한다는 것을 입증한다.
8.1.2 - 미토콘드리아 호흡에 대한 산물의 효과
미토콘드리아 호흡을 평가하기 위하여 호흡 기질(respiration substrate), 피루빈산염-능금산염(pyruvate-malate)의 존재에서 투과화된 세포의 호흡 속도에 대한 효과
각화세포는 CO2 하에 배양기 내에서, 하이드로코르티손, EGF, FCS(10%)로 보충된 배양 배지 DMEM 내에 작업(run)당 106개의 비율로 배양하였다.
이러한 프로토콜은 용존산소계 탱크 내에서 이들 세포에 산물의 직접적인 적용으로 수행하였다.
106개 세포/㎖의 농도에서 이들 세포(각화세포)는 30℃에서 자동 온도 조절되고 클라크 전극이 구비된 용존산소계 탱크 내에서 “호흡 완충액(Hanks-Hepes 20 mM 글루코오스)”에 현탁시킨다(이들 조건 하에 1 ㎖의 호흡 완충액은 480개 산소 원자를 보유한다). 이들 세포는 디기토닌(digitonin)으로 투과화된다. 호흡 기질(10 mM 피루빈산염과 10 mM 능금산염)의 추가는 산소 소비 비율의 관찰을 가능하게 한다(우연(chance)에 따른 스테이지 2). 용존산소계 탱크 내로 상이한 양의 산물(최종 농도: 1/10; 1/5; 1/2)의 추가는 호흡의 가능한 촉진 또는 저해를 나타낼 수 있다.
모든 측정 결과는 하기 표에 요약된다.
검사 산물(BB) 대조 1/10 1/5 1/2
호흡 속도
(n개의 0 원자/min/106개 세포)
(n=3)		 2.67±0.21 2.83±0.15 3.25±0.11 3.52±0.09
기저 호흡 %(n = 3) 100±2 106±4 122±3 132±5
적용된 실험 조건 하에 획득된 결과는 배양중인 인간 각화세포와 접촉하는 산물이 2가지 농도(1/5와 1/2)에서 미토콘드리아 호흡 속도에서 현저한 증가를 유도한다는 것을 입증한다.
8.2 - 미토콘드리아 ATP 합성에 대한 산물의 효과 연구
측정은 ATP 모니터링 반응물(ATP 생물발광 검사 키트 HS II; Boehringer Mannheim)을 이용한 Luminoscan 유형의 장치로 수행한다. 상기 분량 내에 존재하는 ATP의 양은 아래의 효소 반응에 따라 결정할 수 있다:
Figure 112007056834737-pct00001
이러한 반응 동안 방출되는 광의 강도는 이를 RLU(상대적 발광 단위, relative luminosity unit)로 전환하는 광도계(luminometer)(Luminoscan)로 측정할 수 있다. 측정된 RLU는 ATP의 기준 범위를 참조하여 ATP의 몰(mol)로 전환될 수 있다.
ATP의 합성 속도는 mmol/min/106개 세포로 표시된다.
5가지 농도를 검사하는데, 이들 측정은 삼중으로 수행된다.
각화세포는 CO2 하에 배양기 내에서, 하이드로코르티손, EGF, FCS(10%)로 보충된 배양 배지 DMEM 내에 작업(run)당 106개의 비율로 배양하였다.
이러한 프로토콜은 용존산소계 탱크 내에서 이들 세포에 산물의 직접적인 적용으로 수행하였다.
106개 세포/㎖의 농도에서 이들 세포(각화세포)는 30℃에서 자동 온도 조절된 용존산소계 탱크 내에서 “호흡 완충액(Hanks-Hepes 20 mM 글루코오스)”에 현탁시킨다. 이들 세포는 디기토닌으로 불투과화된다. 호흡 기질(10 mM 피루빈산염과 10 mM 능금산염)의 추가는 산소 소비 비율의 관찰을 가능하게 한다(우연에 따른 스테이지 2). 규칙적인 간격으로 용존산소계 탱크 내로 상이한 양의 산물(최종 농도: 1/10; 1/5; 1/2)의 추가이후, 앞서 기술된 방법에 따른 ATP 검사를 위하여 용존산소계 탱크 내에서 분량을 채취한다. 용존산소계 탱크 내로 상이한 양의 산물의 이러한 추가는 ATP 합성의 가능한 활성화 또는 저해를 나타낼 수 있다.
모든 측정 결과는 하기 표에 요약된다.
검사 산물(BB) 대조 1/10 1/5 1/2
ATP 합성 속도
(nmol/min/106개 세포)
(n=3)		 5.78±0.25 6.16±0.34 6.96±0.29 7.24±0.54
ATP 합성 %(n = 3) 100±3 107±5 120±8 125±6
적용된 실험 조건 하에 획득된 결과는 배양중인 인간 각화세포와 접촉하는 산물이 2가지 농도(1/5와 1/2)에서 미토콘드리아 ATP 합성 속도에서 현저한 증가를 유도한다는 것을 입증한다.
8.3 - 에너지 대사에 대한 산물의 효과 연구
아데닐 뉴클레오티드(adenylic nucleotide)의 농도 측정에 의한 에너지 대사(energetic metabolism) 수준에서 산물의 효과 평가. 본 연구는 이러한 연구에 앞서 5일동안 처리된 인간 각화세포의 일차 배양액 상에서 수행하였다.
이들 세포에 내포된 ATP, ADP, AMP의 양은 고압 액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography(HPLC)로 측정한다.
Beckman 장치에서, 5 ㎛의 입자표면(granulometry)을 보유하고 서포트 Spherisorb NH2를 포함하는 칼럼(10 x 0.46 ㎝)을 이용하였다. 용리 용매(elution solvent)는 인산칼륨 용액이다; 이의 몰농도(molarity)와 pH에 따라, 뉴클레오티드의 머무름 시간(retention time)이 다소간 길어진다. 용리 속도는 1 ㎖/min이다. 용리 프로필(elution profile)은 등용매(isocratic) 내에서 254 nm에서 흡광도를 측정함으로써 모니터한다.
기준 범위는 0.1 내지 1 nmol의 ATP, ADP, AMP에서, 개별 최대 아래 영역(area under the maximum)의 표면을 측정함으로써 결정한다.
5가지 농도를 검사하는데, 이들 측정은 삼중으로 수행된다.
세포 추출물(106개 세포/㎖)의 ATP, ADP, AMP 농도는 HPLC로 분석한다. 이들은 nmol/min/㎎ 단백질로 표시된다. 에너지 차지(energy charge, E.C.)는 아래의 공식에 따라 계산된다:
([ATP] + 1/2[ADP])/([ATP] + [ADP] + [AMP])
에너지 차지의 계산은 대조 차지와 처리된 차지 상에서 삼중으로 수행한다.
모든 측정 결과는 하기 표에 요약된다.
ATP, ADP, AMP 농도는 nmol/㎎ 단백질로 표시된다(n=3).
조사된 BB 산물 대조 1/10 1/5 1/2
[ATP] 4214 4060 4554 4860
[ADP] 936 1103 1162 936
[AMP] 673 488 719 1178
[ATP/ADP] 4.50 3.68 3.92 5.19
합계 5823 5651 6434 6973
E.C. 0.804 0.816 0.798 0.764
적용된 실험 조건 하에 획득된 결과는 배양중인 인간 각화세포와 접촉하는 산물이 지정된 농도에서 에너지 하중(energetic load)의 변형을 유도하지 않는다는 것을 입증한다.

Claims (12)

  1. 삭제
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  3. 삭제
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  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 활성 성분으로 다시마목(Laminariales)의 갈조류(brown algae)의 배우체 세포(gametophyte cell)의 냉동-건조된 산물을 포함하는, 피부 태닝(tanning)을 위한 미용 제제.
  9. 활성 성분으로 다시마목(Laminariales)의 갈조류(brown algae)의 배우체 세포(gametophyte cell)의 냉동-건조된 산물을 포함하는, UV 광에 노출되는 피부 보호를 위한 미용 제제.
  10. 활성 성분으로 다시마목(Laminariales)의 갈조류(brown algae)의 배우체 세포(gametophyte cell)의 냉동-건조된 산물을 포함하는 UV 광에 의해 유발되는 산화 스트레스(oxidative stress)로부터 피부 보호를 위한 미용 제제.
  11. 활성 성분으로 다시마목(Laminariales)의 갈조류(brown algae)의 배우체 세포(gametophyte cell)의 냉동-건조된 산물을 포함하는 세포 노화로부터 피부 보호를 위한 미용 제제.
  12. 활성 성분으로 다시마목(Laminariales)의 갈조류(brown algae)의 배우체 세포(gametophyte cell)의 냉동-건조된 산물을 포함하는 UV 광에 노출되는 피부 보호용 식품 보조제.
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