BRPI0519812B1

BRPI0519812B1 - método para a obtenção de células de algas castanhas liofilizadas

Info

Publication number: BRPI0519812B1
Application number: BRPI0519812A
Authority: BR
Inventors: Mekideche Nicole
Original assignee: Biotechmarine
Priority date: 2005-01-14
Filing date: 2005-12-14
Publication date: 2017-05-16
Also published as: AU2005324815A1; CA2594725C; CA2594725A1; UA94394C2; KR20070096001A; FR2880803B1; EP1841508B1; JP4979592B2; AU2005324815B2; ZA200706646B; WO2006075059A1; KR101087834B1; US20080089851A1; JP2008526929A; BRPI0519812A2; EP1841508A1; FR2880803A1; US20140087448A1

Abstract

método para a obtenção de células de algas castanhas liofilizadas. a presente invenção se refere a algas castanhas liofihizadas, um processo para a obtenção destas, uma composição cosmética que contém estas, um suplemento alimentar que contém estas, e os usos destes.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

Pedido de Patente de Invenção para “MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE CÉLULAS DE ALGAS CASTANHAS LIOFILIZADAS”. A presente invenção se refere a um produto liofilizado de células de algas castanhas, um processo para a obtenção deste, uma composição cosmética que contém este, e um complemento alimentar que contém este.

Campo da Invenção A classe das algas castanhas, também chamada de Fucophycae ou Phaeophyceae, pertence à Divisão Chromophyta ou “algas coloridas”, freqüentemente chamada de chrysophyta. Esta Divisão agrupa algas cujas células contêm pigmentos carotenóides “acessórios”, tais como a fucoxantina, em adição aos pigmentos de clorofila: clorofila a e c. A classe das algas castanhas compreende a ordem de: Ascoseirales, Chordariales, Cutleriales, Desmarestiales, Dictyosiphonales, Dictyolales, Durvilleales, Ectocarpales, Fucales, Laminariales, Notheiales, Scytosiphonales, Sphacelariales, Sporochnales, Syringodermatales, Tilopteridales.

Todos os organismos fotossintéticos utilizam os pigmentos para colher a energia da luz, usualmente uma forma de clorofila. A clorofila padrão é a clorofila a, e é essencial para a transferência da energia da luz obtida às moléculas que farão uso desta energia, A maior parte dos organismos de clorofila tem outros pigmentos para absorver mais luz, mas a energia colhida tem de ser sempre transferida a uma molécula de clorofila a.

As algas castanhas fazem uso de diversos destes pigmentos “acessórios” tais como a clorofila c e os carotenóides. As Phaeophyceae exibem grandes quantidades de carotenóides em seus plastídeos e estes são os pigmentos marrons e amarelos que as conferem esta cor castanha característica. Os pigmentos carotenóides mais importante das algas castanhas é a fucoxantina, cujo nome se origina de Fucus. A fucoxantina absorve comprimentos de onda de 500 a 800 nm.

Os pigmentos carotenóides possuem uma estrutura alifática ou alicíclica. Eles são solúveis em gorduras, o que acentua sua integração em certas membranas. Conseqüentemente, sua solubilidade em água só pode aumentar quando elas estão ligadas a outras moléculas. Esta é também a razão pela qual seu metabolismo está bem frequentemente em relação direta com o metabolismo de lipídios.

Os carotenóides são também chamados de pigmentos acessórios, uma vez que eles são ligados para transferir a energia colhida pela clorofila a. Estes pigmentos são geralmente conhecidos através do caroteno que deu seu nome a esta família de pigmentos. A única fonte de carotenóides, particularmente para animais e plantas, é sua comida. Os carotenóides têm uma função anti-oxidante no plasma humano, especialmente para os lipídios circulantes. A função é expressa também no nível de membrana celular onde eles são incorporados.

Os carotenóides fazem parte direta da coloração da pele (amarelo-laranja) que imita o bronzeamento natural.

Estado da Técnica O caroteno é utilizado como complemento alimentar que deve ser tomado poucos dias antes e durante a exposição à luz solar para acelerar o bronzeamento. O beta-caroteno é o precursor da vitamina A. A ingestão de beta-caroteno atrasa o aparecimento de eritema solar. A vitamina A aumenta a quantidade de melanina produzida sob a ação de uma luz azul. Além disso, a vitamina A tem um papel protetor antioxidante. As vitaminas A e E evitam a desnaturação oxidante da melanina sob a ação de luz UV.

Nos complementos alimentares conhecidos, o caroteno é associado à vitamina C, à vitamina E ou aos flavonóides. A desvantagem do uso de caroteno para coloração de pele é que a coloração resultante é muito mais em tom laranja do que o bronzeamento natural. Além disso, ele é rapidamente degradado para a vitamina A.

Foi demonstrado que a astaxantina é um poderoso antioxidante. O pedido de patente US 6,433,025 descreve o uso oral desta para prevenir e atrasar queimaduras solares. A cataxantina, um outro pigmento carotenóide, foi utilizada como complemento alimentar para colorir a pele e para proteger esta contra raios UV (GB 1 323 800).

Entretanto, este uso da cataxantina é proibido em França por causa do perigo de cegueira enquanto ela esteja atualmente no mercado nos EUA (Canthorex, DELTA® Laboratories). O câncer de pele ou melanoma será, em França, nos próximos anos, o mais freqüente e já há nos EUA 800.000 casos por ano. Mais frequentemente, ele é a conseqüência de uma excessiva proliferação de células de pele resultante de mutações de DNA induzidas por luz ultravioleta (UV).

As pessoas se tomam cada vez mais conscientes deste perigo e se tomam prontas para se proteger contra o sol. No entanto, uma pele bronzeada é ainda uma característica vantajosa e desejável que satisfaz os atuais critérios estéticos.

Conseqüentemente, os fabricantes de preparações cosméticas e farmacêuticas estão atualmente investigando substâncias ativas para pigmentar a pele e para proteger a pele contra efeitos prejudiciais de UV.

Sumário da Invenção O Depositante descobriu inesperada e surpreendentemente que um produto Iiofilizado de células de algas castanhas, em particular de gametófítos, enriquecidas com fucoxantina, permite que se alcance esta combinação de efeitos desejáveis: ele pigmenta a epiderme de uma maneira totalmente inofensiva através do estímulo de melanogênese, mesmo sem irradiação UV, enquanto protege a epiderme por uma atividade anti-radical e estimula a sua regeneração.

Com efeito, as algas castanhas possuem um ciclo digenético complexo. Para as Laminariales (ver Figura 1), a alternância entre um esporófito diplóide desenvolvido em um talo macroscópico e os gametófítos macho microscópicos e haplóides fêmea, pode ser observada, Neste caso, os gametófítos são apenas um conjunto de células resultante de diferentes mitoses do esporo. O gametófito é transiente no tempo e é apenas um estágio da produção de gametas. Como não é desenvolvido em um talo verdadeiro, ele é ífacamente fotossintético e contém uma quantidade máxima de pigmentos protetores: a fucoxantina, em comparação com os verdadeiros pigmentos de fotossíntesc que são clorofilas.

Assim, o Depositante selecionou este estágio de gametófitos de forma a obter um produto liofilizado de células de algas castanhas com um enriquecimento em fucoxantina, facilmente e a um baixo custo, em comparação com uma extração clássica de fucoxantina, a partir de uma biomassa disponível em quantidades ilimitadas e ao longo de todo o ano.

Descrição Detalhada da Invenção Assim, o primeiro objeto da presente invenção é um produto liofilizado de células de algas castanhas enriquecido em fucoxantina, em particular compreendendo pelo menos 1% de fucoxantina. As ditas células de algas castanhas são preferivelmente esporos ou gametófitos, em um modo particularmente preferível, gametófitos. O segundo objeto da presente invenção é um processo para obtenção de um produto liofilizado de gametófitos de células de algas castanhas compreendendo as seguintes etapas: - colheita de esporófitos maduros; - emissão de esporos in viíro; - germinação de esporos in vitro\ - colheita de gametófitos; - liofilização dos gametófitos obtidos. “Esporófito maduro” significa um esporófito que compreende esporos, em especial receptáculos, por exemplo, inflamações, O terceiro objeto da presente invenção é uma preparação cosmética para uso tópico que compreende um produto liofilízado de acordo com a invenção como ingrediente ativo, preferivelmente em uma quantidade na faixa de 0,2 até 5% em peso, mais preferivelmente, de 1 a 2% em peso. O quarto objeto da presente invenção é um complemento alimentar que compreende um produto liofilízado de acordo com a invenção como ingrediente ativo. A preparação cosmética de acordo com a invenção pode ser utilizada para pigmentar a pele, para preparar a pele para a exposição a raios UV, para proteger a pele contra o estresse oxidante induzido por raios UV e/ou para proteger a pele contra o envelhecimento celular. 0 complemento alimentar de acordo com a invenção pode ser utilizado para preparar a pele para a exposição a raios UV, Descrição dos Desenhos Figura 1: ciclo de reprodução de Laminariales Figura 2: seções de epiderme tratada/não tratada indicada com HES (hematoxilina/eosina/safran).

Exemplo 1: Obtenção de Gametófitos de Algas Castanhas Lamínariais Gametófitos foram obtidas para as seguintes espécies: Laminaria saccharina, Laminaria hyperborea, Alaria esculenta, Undaria pinnatifida.

Talos de esporófitos férteis maduros foram colhidos, exibindo esporos (ver Figura 1) em JO nas costas francesas na Grã-Bretanha, entre Outubro e Fevereiro, Eles são lavados com água do mar filtrada e cortados em pedaços de 5 a 10 cm2 que são sucessivamente mergulhados em água do mar filtrada, água sanitária de 0,2% por 20 a 30 seg., em dois tanques com água do mar filtrada.

Então, os pedaços de talo foram secados em papel absorvente, distribuídos por 30 em uma folha de papel absorvente e as folhas de papel absorvente foram enroladas.

As folhas de papel absorvente enrolado contendo os pedaços de talo são incubadas por 12 h a 15 °C. Elas são então colocadas em água do mar filtrada e depois, esporos são emitidos.

Os esporos são incubados em um meio de cultura definido contendo 0,1% de solução Provasoli (ver Tabela 1) em um frasco na presença de luz (1800-2000 lux, 24h/24), com um agitamento sutil, A temperatura é aumentada de meio grau por dia até 22 °C. O meio foi renovado quinzenalmente.

Os esporos germinam após 6 a 20 dias de cultivo e os gametófitos são colhidos após 10-12 dias após a germinação (ver Tabela 2), Tabela 1: Composição da Solução Provasoli para 1L

Tabela 2 Exemplo 2: Obtenção de um Produto Liofilizado de Gametófitos de Algas Castanhas A inibição do gametófíto com um meio de sulfato-kanamicina- e germànio sem dióxidos para prevenir a germinação do gomo. A cultura é filtrada em uma peneira, as células são enxaguadas com água do mar e liofilizadas em um prato liofilizador.

Para titular a fucoxantina por HPLC, uma extração de etanol é realizada a uma taxa de 0,05% de produto liofilizado para 10 ml de etanol 70%, mexendo por 6 h na escuridão, e então filtração, A análise HPLC é realizada era uma coluna de Absorbsphere (.Alltech) com um solvente/gradiente: A = acetato/metanol de Amônio (20:80) B = Acetonitril 90% C = Etil acetato Exemplo 3: Preparação do Produto BB

Um produto liofilizado de gametófitos da macroalga Undaria pinnatifida (Larainaríaciae) é preparado de acordo com o Exemplo 2.

Para se usar este produto liofilizado de uma forma adequada em cultura de pele, o produto liofilizado é colocado de volta no meio de cultura de gametófitos. Esta mistura é ultrasonicada, e então filtrada. O resultado deste produto filtrado é chamado de « BB ».

Exemplo 4: Avaliação da Tolerância Mucosa de um Produto Liofílizado de Gametófitos de Algas Castanhas em Estudos de Citotoxicidade na Córnea Reconstruída SKINETHIC®. 1. - Protocolo Experimental Foram utilizados queratinócitos da linhagem TR 146, transformados espontaneamente, amplificados, por cultura de células em um meio definido MCDB 153 modificado.

Quando cultivados na interface ar/líquido em um meio definido, estes queratinócitos humanos formam um epitélio de múltiplas camadas sem a camada de córnea semelhante à córnea humana. O produto a ser investigado, neste caso o produto BB de acordo com o Exemplo 3, é aplicado a uma taxa de 30 pL sobre a superfície de oito culturas equivalentes utilizando-se uma micro-pipeta. Estas culturas são subseqüentemente incubadas a 37 °C, 5% de CCh, por 10 minutos, 1 hora, 3 horas e 24 horas, a uma taxa de duas culturas por período de incubação.

Controles negativos (solução de soro fisiológico tamponada) e positivos (SDS 0,5% e 1%) são esterilizados e aplicados da mesma maneira em duas culturas, respectivamente.

Estas culturas são subsequentemente incubadas a 37 °C, 5% de C02, por 1 hora e 24 horas, a uma taxa de duas culturas por período de incubação. 2. - Avaliação da Viabilidade Celular A viabilidade celular é ainda medida qualitativamente após indicação com uma tinta vital. O sistema MTT mede a atividade de desidrogenase mitocontrial de células vivas. O componente chave é o 3-[4, 5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-difenil tetrazólio brometo ou MTT.

As soluções salinas tamponadas com MTT, na ausência de fenol vermelho, são de coloração amarela. As desidrogenases mitocondriais de células vivas cortam o ciclo de terazólio, assim induzindo a formação de cristais roxos de formazan, insolúveis em soluções aquosas.

Os cristais formados pelas células viáveis ficam presos nos filtros de policarbonato que servem como suporte a culturas epiteliais. As culturas mudam para uma cor uniforme azul/roxa intensa quando são viáveis, mas permanecem brancas/amarelas no caso de mortalidade de células.

Os resultados são comparados a substâncias de controle negativo e positivo. 0,15 ml de meio de cultura contendo 10% vol/vol de solução MTT são pipetados sob cada suporte de filtro/cultura. Após uma incubação de 30 minutos a temperatura ambiente, a cor das diferentes culturas é observada.

Culturas de controle negativo devem mostrar uma cor azul/roxa intensa, prova da viabilidade de mucosa após estar em contato por 24 horas.

Culturas de controle positivo devem mostrar uma cor branca, prova da morte celular a partir da Ia hora de contato. 3. - Resultados Tabela 3 NI = não irritante 1 = irritante MI = muito irritante 4. - Conclusão Sob as condições experimentais aplicadas, o produto BB de acordo com o Exemplo 3, investigado em forma pura, não é irritante para células que formam o modelo SKINETHIC® de membranas de mucosa reconstruídas in vitro.

Exemplo 5: Avaliação da Tolerância Cutânea de um Produto Liofdizado de Gametófitos de Algas Castanhas, por Estudo da Citotoxicidade em Peles Epidérmicas Reconstruídas SKINETHIC® 1. - Protocolo Experimental Queratinócitos de origem humana são despejados em filtros de policarbonato de 0,63 cm2 em um meio definido e suplementado (MCDB 153 modificado). As células são cultivadas por 10 dias na interface ar/líquido, sendo o meio de cultura renovado a cada dois dias.

As epidermes assim formadas foram utilizadas para conduzir o estudo a partir do 14° dia de cultivo. O teste foi realizado em triplicata após incubação por 24 horas do produto, a uma taxa de 2 μΐ por epiderme. A epiderme de controle não recebeu nenhum produto.

Epidermes fixas em uma solução de 10% de metanal foram embutidas em blocos de parafina, Seções verticais de 4 microns foram indicadas com HES (hematoxilina/eosina/saffan) e fotografias foram tiradas sob microscópio óptico.

Se o produto não é tóxico, as culturas devem apresentar camadas basais e granulares de células e córneas ortoqueratósicas intactas, e a estratificação da pele deve ser regular e normal. As células de camada basal devem ser verticalmente polarizadas. Numerosos grãos de queratohialina devem ser visíveis (em violeta) no stratum granulosum logo abaixo do stratum corneum. 2. - Resultados Conferir Figura 2. 3. - Conclusão Sob as condições experimentais aplicadas, o produto BB de acordo com o Exemplo 3, investigado em forma pura, demonstrou não ser citotóxico em peles SKINETHIC® reconstruídas.

Exemplo 6: Testes de Pigmentação 1. - Materiais e Métodos O produto BB é diluído em etanol e então incorporado em uma formulação cosmética.

Os produtos testados são: a - Produto BB incorporado em formulação a 0,05% b - Produto BB incorporado em formulação a 0,15% c - Produto BB incorporado em formulação a 0,30% Eles são conservados a 4 °C até serem utilizados. 2. - Avaliação Bioquímica Ao fim da incubação, a melanina contida em lisatos de célula foi quantificada por um método espectrofotométrico, Uma faixa de melanina foi conduzida em paralelo com a avaliação.

Os resultados são expressos em pg de melanina por ml de lisato dos carpetes de célula (média +/- desvio padrão DP). O significado estatístico das diferenças observadas entre as condições «tratadas» e os «controles» foi avaliado por análise de variância para um fator (One Way ANOVA) seguido por um teste de Bonferroni t-test (* :p<0,05; ** :p<0,01).

Tabelas 4, 5 e 6: Quantificação Bioquímica do Conteúdo Melânico em Epíderme Humana Melanizada Tratada/não Tratada 3. - Avaliação Histológica As peles de epidermes foram fixadas em metanal a partir do fim da incubação, e então embutidas em blocos de parafina. Subseqüentemente, seções de 4 pm de espessura foram cortadas. A melanina presente nas seções de pele foi revelada por uma indicação específica chamada « Fontana Masson ». Tais telas por condição foram realizadas com uma magníficação de x400. A melanina visualizada nestas telas foi quantificada por análise de imagem utilizando-se o programa ImageJ.

Os resultados são expressos na forma de superfície ocupada pela melanina (número de pixels cujo nível de cinza está entre 0 e 100; (0 = preto/255 - branco) em cada tela (média +/- desvio padrão, DP). O significado estatístico das diferenças observadas entre as condições tratadas e os controles foi avaliado por um teste de Estudante (* : p<0,05, **: p<0,01 ; *** : p<0,001).

Tabela 7: Quantificação do Conteúdo Melânico de Peles de Epiderme Humana Melanizadas Reconstruídas Tratadas/não Tratadas por Análise de Imagem 4, - Resultados A formulação “ETOH BB 0,15” aumenta significativamente o conteúdo melânico de peles epidérmicas humanas melanizadas reconstruídas, não expostas a UVA ou a UVB, sem re-aplicação (+22% por análise bioquímica, +51% por análise de imagem). A formulação “ETOH BB 0,3” aumenta significativamente o conteúdo melânico de peles epidérmicas humanas melanizadas reconstruídas, não expostas a UVA ou a UVB (+28% por análise bioquímica, +36% por análise de imagem).

Exemplo 7: Efeitos no Transporte de Macromoléculas 7.1 - Avaliação da Taxa de Transporte de Macromoléculas (Glicídios, Lipídios e Proteínas) em um Sistema de Microssomos Isolados. Efeito Direto do Produto BB em Microssomos Isolados Os microssomos de queratinócitos humanos formam uma fração de membrana obtida por centrifugação diferencial de alta velocidade de uma célula homogenizada. Esta preparação de microssomos requer a adição de co-fatores exógenos tais como NADPH. 7.1.1 -Transporte de Glicídios (Glicose) A avaliação foi realizada em triplicata após o tratamento direto dos microssomos.

Carga 1: controle negativo que não recebe nenhum produto.

Carga 2: controle positivo (0,25 mM de floretina).

Cargas 3-5; tratadas com 0,25 de floretina e com o produto investigado (3 concentrações), Os microssomos obtidos de queratinócitos humanos em cultura foram lavados 3 vezes com um tampão PBS sem glicose e então pré-incubados em 1 ml do mesmo tampão por 30 minutos a 37 °C. A captura de 3-0-MG é parada por adição de um lml de PBS frio contendo citochalasina B. A cinética da incubação foi realizada entre 30 e 120 segundos. Os microssomos foram lavadas novamente 2 vezes com PBS, e então dissolvidos em NaOH (1M) a 4 °C, durante a noite. A radioatividade foi determinada com um contador de cintilação. O tratamento dos microssomos com o produto BB sozinho ou na presença de floretina foi realizado ao mesmo tempo da introdução de [3H] 3-0MG no meio de incubação. A avaliação de proteína foi realizada seguindo o método de BRADFORD. O aumento no grau de absorção a 595 nm, determinado com um espectrofotômetro, é proporcional à concentração de proteína.

Resultados Os resultados obtidos, após tratamento direto dos microssomos de queratinócitos com o produto BB nas concentrações utilizadas não mostram inibição da taxa de transporte de glicose. A cinética da captura de glicose sob condições fisiológicas é quase idêntica nos microssomos de controle e nos microssomos tratados com o produto BB nas 3 concentrações utilizadas. O tratamento direto de microssomos com floretina inibe fortemente a taxa de transporte de glicose. O tratamento de microssomos com o produto BB nas 3 concentrações simultaneamente com floretina restauram significativamente a taxa de transporte de glicose. A cinética da captura de glicose, sob condições de inibição, é perfeitamente restaurada com o produto BB nas 3 concentrações utilizadas. 7.1.2 -Transporte de Lipídios A avaliação foi realizada em triplicata após o tratamento direto dos microssomos.

Carga 1: controle negativo que não recebe nenhum produto.

Carga 2: controle positivo (1 mM de Difenhidramina).

Cargas 3-5: tratadas recebendo o produto investigado (3 concentrações).

Cargas 6-8: tratadas com 1 mM de Difenhidramina e com o produto investigado (3 concentrações).

Os microssomos obtidos de queratinócitos humanos em cultura foram lavados 3 vezes com 25 mM de tampão Tris, e então pré-incubados em 1 ml do mesmo tampão por 30 minutos a 37 °C. A captura de colina foi parada por adição de um buffer de lise contendo (50 mM de Tris, 140 mM de NaCl, 1,5 mM de MgS04, 0,5% de Igepal-Ca-630, 0,2% de SDS). A cinética da incubação foi realizada entre 30 e 120 segundos. Subseqüentemente, os microssomos foram lavados 2 vezes com PBS e então dissolvidos em NaOH (1M) a 4 °C durante a noite. A radioatividade foi determinada com um contador de cintilação, Os tratamentos de microssomos com o produto BB sozinho ou na presença de Difenhidramina (DPA) foram realizados ao mesmo tempo da introdução de [3H] Colina no meio de incubação. A avaliação de proteína foi realizada seguindo o método de BRADFORD. O aumento no grau de absorção a 595 nm, determinado com um espectrofotômetro, é proporcional à concentração de proteína.

Resultados Os resultados obtidos, após tratamento direto dos microssomos de queratinócitos com o produto BB nas concentrações utilizadas não mostram inibição da taxa de transporte de lipídios, A cinética da captura de colina sob condições Fisiológicas é quase idêntica nos microssomos de controle e nos microssomos tratados com o produto BB nas 3 concentrações utilizadas.

Os resultados obtidos mostram que o tratamento direto de microssomos com Difenhidramina inibe fortemente a taxa de transporte de lipídios. O tratamento de microssomos com o produto BB nas 3 concentrações simultaneamente com Difenhidramina restauram a taxa de transporte de lipídios. A cinética da captura de colina, sob condições de inibição, é moderadamente restaurada com o produto BB nas 3 concentrações utilizadas. 7.1.3 - Transporte de Proteínas (Albumina) A avaliação foi realizada em triplicata após o tratamento direto dos microssomos.

Carga 1: controle negativo que não recebe nenhum produto.

Carga 2: controle positivo (Nocodazol, 6 mg/ml).

Cargas 3-5: tratadas recebendo o produto investigado (3 concentrações).

Cargas 6-8: tratadas com Nocodazol 6 mg/ml, e com o produto investigado (3 concentrações).

Os microssomos obtidos de queratinócitos humanos em cultura foram lavados 3 vezes com um tampão, e posteriormente pré-incubados em 1 ml do mesmo tampão por 30 minutos a 3 °C. Esta solução foi subsequentemente descartada e os microssomos foram colocados no tampão HBSS contendo albumina-FITC mexidos em água a 37 °C. A captura de albumina é parada por adição da solução de Ringer contendo 122,5 mM de NaCl; 5,4 mM de KC1; 1,2 mM de CaCl2; 0,8 mM de MgCl2; 0,8 Na2HP04; 0,2 NaHP04; 5,5 mM de glicose; 10 mM de HEPES, pH de 7,4. Posteriormente, os microssomos foram tratados com Triton X-100 a (0,1 % v/v em 3-(N-morfolino) ácido propano-sulfônico 20 mM, pH de 7,4). A fluorescência foi quantificada com um espectrofotômetro (excitação 480 nm: emissão 520 nm). A cinética da incubação foi realizada entre 30 a 120 segundos. O tratamento dos microssomos com o produto BB sozinho ou na presença de Nocodazol (ND) foi realizado ao mesmo tempo da introdução de albumina-FITC na meio de incubação. A avaliação de proteína foi realizada seguindo o método de BRADFORD, O aumento no grau de absorção a 595 nm é proporcional à concentração de proteínas medida com um espectrofotômetro.

Resultados Os resultados obtidos, após tratamento direto dos microssomos de queratinócitos com o produto BB nas concentrações utilizadas não mostram inibição da taxa de transporte de proteínas. A cinética da captura de albumina sob condições fisiológicas é quase idêntica para os microssomos de controle e os microssomos tratados com o produto BB nas 3 concentrações utilizadas.

Os resultados obtidos mostram que o tratamento direto de microssomos com Nocodazol inibe fortemente a taxa de transporte de proteínas. O tratamento de microssomos com o produto BB nas concentrações de 1/5 e 1/2 ao mesmo tempo que o Nocodazol restauram moderadamente a taxa de transporte de proteínas. Nenhum efeito foi observado em uma concentração de 1/10. 7.2 - Avaliação da Taxa de Transporte de Macromoléculas no Nível normal de Queratinócitos Humanos O método aplicado foi o de explante permitindo que se obtenha, a partir de uma biópsia de pele humana, queratinócitos em culturas primárias. Os exames foram realizados em queratinócitos entre a 2a e a 4a passagens de forma a assegurar uma reprodutibilidade entre as diferentes experiências.

Os queratinócitos foram divididos em pratos de compartimentos múltiplos (6 compartimentos) a uma taxa de 105 células por compartimento em 1 ml de meio de cultura SKINETHIC suplementado com insulina e hidrocortisona. As células foram incubadas na presença e ausência do produto investigado. 7.2.1 -Transporte de Glicídios (Glicose) A avaliação foi realizada em triplicata em queratinócitos humanos normais em cultivo.

Carga 1: controle negativo que não recebe nenhum produto.

Carga 2: controle positivo (0,25 mM de Floretina).

Carga 3: tratada com o produto investigado.

Carga 4: tratada com 0,25 mM de Floretina e com o produto investigado (3 concentrações). O tratamento de queratinócitos com o produto BB na presença e ausência de 0,25 de floretina foi realizado por 20 minutos a 37 °C. Os microssomos de membrana foram separados por centrifugação diferencial, O mesmo protocolo de captura de [3H] 3-0-Metil-Glicose foi adotado para a determinação da taxa de transporte de glicose, (conferir 6,1.1), Resultados Os resultados obtidos, após tratamento dos queratinócitos normais com o produto BB, antes da separação de microssomos, não mostram nenhuma inibição da taxa de transporte de glicose. A cinética da captura de glicose sob condições fisiológicas é quase idêntica para os microssomos de controle de queratinócitos e para os microssomos de queratinócitos tratados com o produto BB nas 3 concentrações utilizadas, O tratamento de queratinócitos normais com floretina, antes da separação de microssomos, inibe fortemente a taxa de transporte de glicose. O tratamento de queratinócitos normais com o produto BB nas 3 concentrações ao mesmo tempo que com floretina restabelece significativamente a taxa de transporte de glicose. A cinética da captura de glicose, sob condições de inibição, é perfeitamente restaurada com o produto BB nas 3 concentrações utilizadas. 7,2.2 -TransportedeLipídios A avaliação foi realizada em triplicata em queratinócitos humanos normais em cultivo.

Carga 1: controle negativo que não recebe nenhum produto.

Carga 2: controle positivo (1 mM de Difenidramina).

Cargas 3-5: tratadas com o produto investigado (3 concentrações).

Carga 6-8: tratadas com 1 mM de Difenidramina e com o produto investigado (3 concentrações). O tratamento de queratinócitos com o produto BB na presença de Difenidramina foi realizado por 120 minutos a 37 ttC. Os microssomos de membrana foram separados por centrifugação diferencial. O mesmo protocolo de captura de colina [3H] foi utilizado para a determinação da velocidade de transporte de colina (conferir 6.1,2).

Resultados Os resultados obtidos, após tratamento dos queratinócitos normais com o produto BB, antes da separação de microssomos, não mostram nenhuma inibição da taxa de transporte de lipídios. A cinética da captura de colina sob condições fisiológicas é quase idêntica para os microssomos de controle de queratinócitos e para os microssomos de queratinócitos tratados com o produto BB nas 3 concentrações utilizadas. O tratamento de queratinócitos normais com Difenidramina, antes da separação de microssomos, inibe moderadamente a taxa de transporte de lipídios. O tratamento de queratinócitos normais com o produto BB em 3 concentrações ao mesmo tempo que com Difenidramina restaura a taxa de transporte de lipídios. A cinética da captura de colina, sob condições de inibição, é moderadamente restaurada com o produto BB nas 3 concentrações utilizadas. 7.2.3 - Transporte de Proteínas (Albumina) A avaliação foi realizada em triplicata em queratinócitos humanos normais em cultivo.

Carga 1: controle negativo que não recebe nenhum produto.

Carga 2: controle positivo (Nacodazol, 6mg/ml).

Cargas 3-5: tratadas com o produto investigado (3 concentrações).

Carga 6-8: tratadas com Nacodazol, 6 mg/ml, e com o produto investigado (3 concentrações). O tratamento de queratinócitos com o produto BB na presença e ausência de 0,25 de Nocodazol, 6 mg/ml, foi realizado por 120 minutos a 37 °C. Os microssomos de membrana foram separados por centrifugação diferencial. O mesmo protocolo de captura de albumina-FITC foi utilizado para a determinação da taxa de transporte de albumina (conferir 3.1.4.2).

Resultados Os resultados obtidos, após tratamento dos queratinócitos normais com o produto BB, antes da separação de microssomos, não mostram nenhuma inibição da taxa de transporte de lipídios. A cinética da captura de colina sob condições fisiológicas é quase idêntica para os microssomos de controle de queratinócitos e para os microssomos de queratinócitos tratados com o produto BB em uma concentração de 1/10. Um sutil aumento na taxa de transporte de proteínas é notado para concentrações de 1/2 e 1/5. O tratamento de queratinócitos normais com Nocodazol, antes da separação de microssomos, inibe a taxa de transporte de proteínas. O tratamento de queratinócitos normais com o produto BB em 2 concentrações ao mesmo tempo que com Nocodazol restabelece moderadamente a taxa de transporte de proteínas. Nenhum efeito foi observado na concentração de 1/10. 7.3 - Avaliação da Taxa de Transporte de Macromoléculas no Nível de Queratinócitos Humanos em Senescência Celular A senescência é um fenômeno de envelhecimento celular, no qual as células são presas na fase G1 do ciclo celular e nunca adentram a fase de síntese que leva à divisão celular. As células senescentes são caracterizadas por seu baixo metabolismo na síntese e no transporte de níveis macromoleculares.

As células em cultivo privadas de plasma sanguíneo param seu crescimento, mas continuam a progredir através do ciclo celular até alcançarem a faseGl. O método aplicado permitiu a obtenção, a partir de uma biópsia de pele humana, de culturas primárias de queratinócitos. As avaliações foram realizadas em queratinócitos, entre a 8a e a 10a passagens, de forma a assegurar a presença de células senescentes no nível de células de controle.

Os queratinócitos foram semeados em pratos de múltiplos compartimentos (6 compartimentos) a uma taxa de 105 células por compartimento em 3 ml de meio de cultura SKINETHIC suplementado com EGF, hidrocortisona, insulina e gentamicina. Posteriormente eles são mantidos por 5 dias em um incubador sob C02. 7.3.1 - Transporte de Glicídios (Glicose) A avaliação foi realizada em triplicata em queratinócitos humanos em senescência.

Carga 1: controle negativo que não recebe nenhum produto.

Carga 2: controle positivo (0,25 mM de Floretina) Carga 3-5: tratadas recebendo o produto investigado Cargas 6-8: tratadas com 0,25 mM de floretina e com o produto investigado (3 concentrações). O tratamento de queratinócitos com o produto BB na presença e ausência de 0,25 mM de floretina foi realizado por 20 minutos a 37 °C. Os microssomos de membrana foram separados por centrifugação diferencial. O mesmo protocolo de captura de [3H] 3-0-Metil-Glicose foi aplicado à determinação da taxa de transporte de glicose (conferir 6.1.1).

Resultados Os resultados obtidos demonstram que a taxa de transporte de glicose é marcadamente baixa nos queratinócitos em nível de senescência em comparação com queratinócitos normais. O tratamento de queratinócitos em senescência com o produto BB, antes da separação de microssomos, mostra um aumento da taxa de transporte de glicose em comparação com as células de controle não tratadas. A cinética de captura de glicose sob condições fisiológicas é maior no nível de microssomos de queratinócitos tratados com o produto BB em comparação com microssmos de controle de queratinócitos. Este resultado é obtido para diferentes períodos de incubação (30,60,90 e 120 segundos). O tratamento de queratinócitos em senescência com floretina, antes da separação de microssomos, inibe fortemente a taxa de transporte de glicose. O tratamento de queratinócitos normais com o produto BB em 2 concentrações (1/5 e 1/2) ao mesmo tempo que com floretina restaura significativamente a taxa de transporte de glicose. Um efeito sutil foi observado na concentração de 1/10. 7.3.2 - Transporte de Lipídios A avaliação foi realizada em triplicata em queratinócitos humanos em senescência, Carga 1: controle negativo que não recebe nenhum produto.

Carga 2: controle positivo (1 mM de Difenidramina) Carga 3-5: tratadas recebendo o produto investigado (3 concentrações) Cargas 6-8: tratadas com 1 mM de Difenidramina e com o produto investigado (3 concentrações). O tratamento de queratinócitos com o produto BB na presença e ausência de 0,25 mM de floretina foi realizado por 120 minutos a 37 °C. Os microssomos de membrana foram separados por centrifugação diferencial. O mesmo protocolo de captura de [3H] Colina foi aplicado para a determinação da taxa de transporte de colina (conferir 6.1.2).

Resultados Os resultados obtidos demonstram que a taxa de transporte de lipídios é marcadamente mais baixa nos queratinócitos em nível de senescência em comparação com queratinócitos normais. O tratamento de queratinócitos em senescência com o produto BB, antes da separação de microssomos, não mostra nenhuma inibição da taxa de transporte de glicose em comparação com as células de controle não tratadas. A cínética de captura de lipídios sob condições fisiológicas é comparável para os microssomos de queratinócitos tratados com o produto BB e os microssmos de controle de queratinócitos. O tratamento de queratinócitos em senescência com Difenidramina, antes da separação de microssomos, inibe fortemente a taxa de transporte de lipídios. O tratamento de queratinócitos em senescência com o produto BB em 2 concentrações (1/5 e 1/2) ao mesmo tempo que com Difenidramina restabelece significativamente a taxa de transporte de lipidios. Nenhum efeito foi observado na concentração de 1 /10. 7.3.3 - Transporte de Proteínas (Albumínas) A avaliação foi realizada em triplicata em queratinócitos humanos em senescência.

Carga 1: controle negativo que não recebe nenhum produto.

Carga 2: controle positivo (Nocodazol, 6 mg/ml) Carga 3-5: tratadas recebendo o produto investigado (3 concentrações) Cargas 6-8: tratadas com Nocodazol, 6 mg/ml, e com o produto investigado (3 concentrações). O tratamento de queratinócitos com o produto BB na presença e ausência de 0,25 mM de Nocodazol, 6 mg/ml foi realizado por 120 minutos a 37 °C. Os microssomos de membrana foram separados por centrifugação diferencial. O mesmo protocolo de captura de albumina-FITC Colina foi aplicado para a determinação da taxa de transporte de albumina (conferir 6.1.3).

Resultados Os resultados obtidos demonstram que a taxa de transporte de proteínas é marcadamente mais baixa nos queratinócitos em nível de senescência em comparação com queratinócitos normais. O tratamento de queratinócitos em senescência com o produto BB, antes da separação de microssomos, não mostra nenhuma inibição da taxa de transporte de proteínas em comparação com as células de controle não tratadas. A cinética de captura de albumina sob condições fisiológicas é comparável para os microssomos de queratinócitos tratados com o produto BB e os microssmos de controle de queratinócitos. 0 tratamento de queratinócitos em senescência com Nocodazol, antes da separação de microssomos, inibe fortemente a taxa de transporte de proteínas. O tratamento de queratinócitos em senescência com o produto BB em 2 concentrações (1/5 e 1/2) ao mesmo tempo que com Nocodazol restaura significativamente a taxa de transporte de proteínas. Um efeito sutil efeito foi observado na concentração de 1/10 Exemplo 8: Efeito na Respiração e na Síntese de ATP 8.1 - Estudo do Efeito do Produto na Respiração Celular e Mitocondrial A quantidade de oxigênio dissolvido em uma solução pode ser determinada com eletrodo de Clark. O oxigênio que se espalha através de um filme de teflon será reduzido ao nível do catodo de platina polarizada a -0,8 Volt. Sob estas condições, a corrente que passa entre este catodo e o anodo de prata é proporcional à concentração de oxigênio na solução. A ponte iônica entre os dois eletrodos é criada por uma solução saturada de KC1. A aquisição e o tratamento das medições são realizados com um microcomputador (IBM-PC) em tempo real, Um programa permite que se visualize continuamente a quantidade de oxigênio no tanque e também a derivada instantânea correspondente à taxa de consumo de oxigênio calculada em tempo real.

Cinco concentrações foram testadas e as determinações foram realizadas em triplicata. Este estudo é realizado dependendo de duas condições diferentes: 8.1.1-Efeito do Produto na Respiração Celular: Medição de Respiração Basal Efeito na taxa de respiração basal em células não permeabilizadas na presença de glicose.

Os queratinócitos furam cultivados em um incubador sob CO2, a uma taxa de 106 por ciclo em um meio de cultura DMEM suplementado com hidrocortisona, EGF eFCS (10%).

Este protocolo foi seguido por aplicação direta do produto nas células no tanque de oxigráfico.

As células (queratinócitos), em uma concentração de 106 células/ml, são suspensas em um “tampão de respiração” (20nM de glicose de Hanks-Hepes), no tanque de oxigráfico termostatizado a 30 °C e equipado com um eletrodo de Clark (1 ml de tampão de respiração contendo sob estas condições 480 átomos de oxigênio).

Sob estas condições uma taxa de consumo de oxigênio (respiração basal de células) pode ser medida. A adição de diferentes quantidades do produto (concentrações finais; 1/10; 1/5 e 1/2) no tanque de oxigráfico permite que se revele um possível estímulo ou inibição desta respiração.

Todas as determinações são resumidas na seguinte tabela: Sob as condições experimentais aplicadas e considerando-se os resultados obtidos, o produto em contato com queratinócitos humanos em cultura induz um aumento significativo da taxa de respiração basal em concentrações (1/5 e 1/2). 8.1.2 - Efeito do Produto na Respiração Mitocondrial Efeito na taxa de respiração de células permeabilizadas na presença de um substrato de respiração, piruvato-malato, para avaliar a respiração mitocondrial.

Os queratinócitos furam cultivados em um incubador sob CO2, a uma taxa de 106 por ciclo em um meio de cultura DMEM suplementado com hidrocortisona, EGF e FCS (10%), Este protocolo foi seguido por aplicação direta do produto nas células no tanque de oxigráfico, As células (queratinócitos), em uma concentração de 106 células/ml, são suspensas em um “tampão de respiração” (20nM de glicose de Hanks-Hepes), no tanque de oxigráfico termostatizado a 30 °C e equipado com um eletrodo de Clark (1 ml de tampão de respiração contendo sob estas condições 480 átomos de oxigênio). As células são permeabilizadas com digitonina. A adição de um substrato respiratório (10 mM de piruvato e 10 mM de malato) permite que se observe uma taxa de consumo de oxigênio (estágio 2 de acordo com Chance). A adição de diferentes quantidades do produto (concentrações finais: 1/10; 1/5 e 1/2) no tanque de oxigráfico permite que se revele um possível estímulo ou inibição desta respiração.

Todas as determinações são resumidas na seguinte tabela: Sob as condições experimentais aplicadas e considerando-se os resultados obtidos, o produto em contato com queratinócitos humanos em cultura induz um aumento significativo da taxa de respiração mitocondrial em concentrações (1/5 e 1/2), 8.2- Estudo do Efeito do Produto em Síntese de ATP Mitocondrial A medição é realizada com um dispositivo do tipo Luminoscan utilizando-se um reagente de monitoramento de ATP (Kit HSII de Avaliação de Bioluminiscência de ATP) por Boehringer Mannheim. A quantidade de ATP presente nesta alíquota pode ser determinada graças à seguinte reação enzimática. A intensidade da luz emitida durante esta reação pode ser medida com um luminômetro (Luminoscan) que transcreve esta em URL (unidades relativas de luminosidade). A URL medida pode ser convertida em mols de ATP com referência a uma faixa de padrões de ATP. A taxa de síntese de ATP é expressa em nmols/min/106 de células.

Cinco concentrações foram testadas e as determinações foram realizadas em triplicata.

Os queratinócitos furam cultivados em um incubador sob CO2, a uma taxa de 106 por ciclo em um meio de cultura DMEM suplementado com hidrocortisona, EGFeFCS (10%).

As células (queratinócitos), em uma concentração de 106 células/ml, são suspensas em um “tampão de respiração” (20nM de glicose de Hanks-Hepes), no tanque de oxigráfico termostatizado a 30 °C. As células são impermeabilizadas com digitonina. A adição de um substrato respiratório (10 mM de piruvato e 10 mM de malato) permite que se observe uma taxa de consumo de oxigênio (estágio 2 de acordo com Chance). Após a adição de diferentes quantidades do produto (concentrações: 1/10; 1/5 e 1/2) no tanque de oxigráfico e em intervalos regulares, uma alíquota é tirada do tanque de oxigráfico para a avaliação de ATP seguindo-se o método descrito acima. A adição de diferentes quantidades do produto no tanque de oxigráfico permite que se revele uma possível ativação ou inibição da síntese de ATP, Todas as determinações são resumidas na tabela seguinte abaixo;

Sob as condições experimentais aplicadas e considerando-se os resultados obtidos, o produto em contato com queratinócitos humanos em cultura induz um aumento significativo da taxa de síntese de ATP mitocondrial em concentrações (1/5 e 1/2). 8.3 - Estudo do Efeito do Produto no Metabolismo Energético A avaliação do efeito do produto no nível de metabolismo energético é feita por medição das concentrações de nucleotídeos adenílicos. O estudo foi realizado em culturas primárias de queratinócitos tratados por 5 dias antes do estudo, A quantidade de ATP, ADP e AMP contida nas células é medida por Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC).

Em um dispositivo Beckman, uma coluna (10 x 0,46 cm) com um suporte Spherisorb NH2 com uma granulometria de 5μιη foi utilizada. O solvente de eluição é uma solução de fosfato de potássio; dependendo da molaridade e do PH desta, o tempo de retenção dos nucleotídeos é mais ou menos longo. A taxa de eluição é de 1 ml/min. O perfil de eluição é monitorado pela medição do grau de absorção a 254 nm em modo isocrático, Uma faixa de padrões é feita entre 0,1 e 1 nmol de ATP, de ADP e de AMP medindo-se a superfície da área sob os respectivos máximos.

As concentrações de ATP, ADP e AMP de um extrato celular (106 células/ml) são avaliadas por HPLC. Elas são expressas em nmol/min/MG de proteína. A carga energética (C. E.) é calculada através da seguinte fórmula: ([ATP] +1/2 [ADP]) / ([ATP] + [ADP] + [AMP]) O cálculo da carga energética é realizado em triplicata em cargas de controle e em cargas tratadas.

Todas as determinações são resumidas na tabela seguinte.

As concentrações de ATP, ADP e AMP são expressas em nmol /mg de proteínas (n=3).

Sob as condições experimentais aplicadas e considerando-se os resultados obtidos, o produto era contato com queratinócitos humanos em cultura não induz modificações da carga energética nas concentrações utilizadas do produto.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para a obtenção de um produto de células garneiófilas de algas castanhas compreendendo pelo menos 1% de íucoxantína, caracterizado por compreender as seguintes etapas: - colheita de esporófitos maduros; - emissão de esporos m vitro; - germinação de esporos in vitro; - colheita de células de gametófito; - lioillização das células de gametófito obtidas,

2. Preparação cosmética para uso tópico caracterizada por conter um produto obtido diretamente do processo definido na reivindicação I como ingrediente ativo.

3. Preparação cosmética de acordo com a reivindicação 2. caracterizada pelo referido produto se encontrar na faixa de 0,2 a 5% em peso.

4. Uso de uma preparação cosmética como definida na reivindicação 2 ou 3, caracterizado por ser para a pigmentação da pele.

5. Uso de uma preparação cosmética como definida na reivindicação 2 ou 3. caracterizado por ser para a preparação da pele para a exposição a raios UV,

6. Uso de urna preparação cosmética como definida na reivindicação 2 ou 3. caracterizado por ser para a preparação da pclc contra o estresse oxídativo induzido por raios UV,

7. Uso de uma preparação cosmética como definida na reivindicação 2 ou 3, caracterizado por ser para a preparação da pele contra o enve 1 heeimento celular.