IT202100019727A1 - Composizione per prevenire e trattare alterazioni e malattie delle unghie - Google Patents

Description

Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo

A 61 P 31 04

Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo

A 61 P 31 10

Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo

A 61 Q 3 02

Titolo

COMPOSIZIONE PER PREVENIRE E TRATTARE ALTERAZIONI E MALATTIE DELLE UNGHIE Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

?COMPOSIZIONE PER PREVENIRE E TRATTARE ALTERAZIONI E MALATTIE DELLE UNGHIE?.

Campo dell?invenzione

La presente invenzione concerne una composizione di combinazione per prevenire e trattare alterazioni e malattie delle unghie.

La presente invenzione origina nel settore farmaceutico e nutraceutico.

In particolare, la presente invenzione riguarda l?uso di una composizione contenente una combinazione di ingredienti biologicamente attivi per ripristinare condizioni fisiologiche di crescita dell?unghia e malformazioni della sua struttura cornea o per prevenire o trattare malattie dell?unghia.

Stato della tecnica

L'unghia ? una lamina quadrangolare semitrasparente e leggermente convessa composta da pi? strati di cheratinociti cheratinizzati trasparenti e appiattiti privi di granuli cheratoialini e di tonofibrille.

L?unghia origina dalla matrice ungueale e cresce lungo il letto ungueale, spuntando attraverso l'iponichio, comunemente riferito come cuticola. L'iponichio ? disposto fra il letto ungueale e il solco distale. La parte finale dell'unghia, staccata dal letto ungueale ? detta margine libero, o bordo distale.

In condizioni fisiologiche la crescita dell'unghia ? continua con un ritmo di circa 0.1? 1 mm al giorno. La velocit? di crescita varia a seconda di alcuni fattori quale l?et? dell?individuo, le condizioni di salute, l?alimentazione e la temperatura dell?ambiente, nei mesi estivi infatti cresce pi? velocemente.

L'unghia svolge principalmente una funzione di ausilio alla presa e di protezione agli agenti esterni costituendo una barriera semipermeabile che sostanzialmente impedisce la penetrazione di agenti inquinanti e di sostanze potenzialmente nocive. Questa funzione di protezione richiede tuttavia che la struttura cornea dell?unghia sia intatta e in buone condizioni.

Alcune circostanze, quali carenze di idonee sostante nutritive nel regime dietetico, traumi e malattie possono concorrere a determinare condizioni che favoriscono lo sfaldamento della struttura cornea e lo sviluppo di malattie delle unghie che a loro volta influiscono la funzionalit? della matrice fino a fermarne temporaneamente l'attivit?.

In queste condizioni si verificano alterazioni morfologiche della struttura cornea dell?unghia che determinano rotture, sfaldamento, sfogliamento e formazione di solchi come i solchi di Beau.

I danni alla struttura dell'unghia possono influenzarne non solo la crescita, la forma e le dimensioni ma anche predisporre l'unghia alle infezioni e conseguente infiammazione per rottura dei tessuti molli con conseguente infiammazione del tessuto sottocutaneo.

Si ? inoltre osservato che la lamina

ungueale e le cheratine da cui essa ? costituita possono essere oggetto di uno stress ossidativo che pu? determinare uno stato infiammatorio locale.

Tar le cause che concorrono a determinare uno stress ossidativo sono ricomprese l?esposizione ai raggi UV, il contatto con prodotti chimici aggressivi quale solventi organici, colle e coloranti sintetici. In questi casi lo stato infiammatorio si accompagna al rilascio di specie reattive dell?ossigeno (ROS) che favoriscono il deterioramento dell?unghia rendendola anche pi? suscettibile alle aggressioni da agenti patogeni, quali batteri e funghi.

Un ulteriore causa di infiammazione ? rappresentata dai traumi nelle porzioni delle mani coperte dalle unghie che determinano una rottura della sua struttura cornea, riducendo in maniera significativa l?effetto barriera nei confronti di agenti esterni, quali prodotti cosmetici e agenti patogeni.

In questi casi i trattamenti locali tradizionali dell?unghia sono inadeguati poich? non intervengono sui processi infiammatori e non risolvono quindi una delle principali cause delle affezioni delle unghie.

Attualmente si sente la necessit? di disporre di prodotti per il trattamento sistemico delle affezioni dell?unghia che agiscano riducendo l?infiammazione che costituisce uno delle concause principali dei danni alle unghie.

Uno degli scopi dell?invenzione consiste quindi nel fornire una composizione contenente una combinazione di sostanze attive per migliorare l?aspetto esteriore dell?unghia o per trattare malattie dell?unga.

Un altro scopo dell?invenzione consiste nel fornire una composizione o integratore alimentare per la prevenzione e/o il trattamento di alterazioni della struttura cornea dell?unghia o di malattie dell?unghia il cui utilizzo sia pressoch? privo di effetti collaterali.

Sommario dell?invenzione

Nell?ambito del settore tecnico dell?invenzione, la Richiedente ha inaspettatamente trovato che combinando selezionate componenti biologicamente attive si ottiene una composizione che accelera il processo di riparazione delle alterazioni strutturali della lamina dell?unghia indipendentemente dall?origine traumatica, infettiva o nutrizionale.

Inoltre, gli inventori hanno osservato come la combinazione delle selezionate componenti biologicamente attive prevengono e riducono lo stress ossidativo cellulare della matrice ungueale e delle aree limitrofe favorendo il recupero di condizioni fisiologiche di crescita dell?unghia.

Questi effetti tecnici riscontrati dalla Richiedente trovano riscontro nelle prove sperimentali riportate nel seguito, le quali peraltro evidenziano l?attivit? sinergica della combinazione dei componenti base della composizione dell?invenzione.

In vista degli scopi precedentemente riferiti e dei riscontri sperimentali ottenuti, la presente invenzione fornisce una composizione comprendente una combinazione di spilantolo o un estratto di Spilanthes acmella che lo contiene con zinco o suo sale preferibilmente zinco bisglicinato e cacao.

In particolare, i test in vitro in modello di co-infezione con C. albicans di cheratinociti HACAT, qui riportati e illustrati nella Figure, evidenziano che la composizione qui descritta inibisce la crescita di C. albicans, riduce la ?-tubulina, e TNF-?, stimola la E-caderina e la Cheratina 15 (K15).

Inoltre, le evidenze sperimentali degli Esempi dimostrano come la composizione qui descritta ha un?attivit? di inibizione del biofilm, riferita nel seguito anche come attivit? anti-biofilm che si manifesta come riduzione dell?adesione sulla componente cheratinica delle unghie e di inibizione dello sviluppo del biofilm.

In particolare, i test in vitro in modello di coinfezione con Staphilococcus aureus dei cheratinociti HACAT evidenziano che la composizione qui descritta inibisce la crescita di S aureus, riduce la formazione di citochine infiammatorie TNF-?, stimola la citocheratina 15 (K15) che in caso di infezione subisce rotture e degradazione. La composizione pu? essere ad uso orale o topico sulle unghie e aree anatomiche circostanti.

In accordo ad alcune forme di realizzazione la composizione pu? ulteriormente comprendere un ingrediente biologicamente attivo scelto tra selenio, valina opzionalmente in forme di sale o estere, vitamina D preferibilmente vitamina D3, ornitina opzionalmente in forma di sale o estere e loro miscele.

In un aspetto l?invenzione fornisce l?uso non terapeutico di una composizione come qui descritta per migliorare l?aspetto estetico delle unghie e/o trattare fratture, sfaldamento, fessurazioni, opacizzazione dell?unghia e/o per accelerare la ricrescita delle unghie.

Nell?ambito delle applicazioni in campo cosmetico o estetico, la composizione dell?invenzione trova specifica indicazione nel prevenire o trattare gli inestetismi dell?unghia in particolare fratture, sfaldamento, fessurazioni, opacizzazione e nel promuovere la crescita fisiologica dell?unghia.

Questi effetti cosmetici della composizione sono riconducibili principalmente alla stimolazione della proliferazione cellulare e di cheratina 15, come evidenziato nelle accluse Figure e dimostrato sperimentalmente negli Esempi.

In un altro aspetto la presente invenzione riguarda la composizione come qui descritta per l?uso medico.

In ambito medico la composizione ? idonea al trattamento o prevenzione di malattie delle unghie di origine traumatica, infettiva e/o infiammatoria.

In particolare, forma ulteriore oggetto dell?invenzione una composizione come qui descritta per l?uso orale o topico nella prevenzione o trattamento di una infezione delle unghie di origine batterica, in particolare da S. aureus o fungina in particolare da C. albicans.

Questi effetti terapeutici della composizione sono riconducibili principalmente all?attivit? antibiofilm, di inibizione dei processi infiammatori connessi con infezioni da patogeni e dalla inibizione dei processi di degradazione della lamina connessi con l?infezione da agenti patogeni, come evidenziato nelle accluse Figure e dimostrato sperimentalmente negli Esempi.

In un altro aspetto viene fornita una composizione per l?uso orale o topico nella prevenzione o trattamento di traumi o distrofie dell?unghia.

In un ulteriore aspetto l?invenzione riguarda una composizione come qui descritta per l?uso orale o topico nella prevenzione o trattamento di forme infiammatorie o psoriasiche.

Breve descrizione delle figure

Le caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno pi? evidenti dalle accluse figure in cui:

la Fig. 1 raffigura una rappresentazione degli stadi del Biofilm di C. albicans La Fig. 2 illustra Grafici a barre relativi all?espressione genica di TNF-? in cellule HACAT co-infettate con C. albicans e trattate con la composizione contenente le tre componenti attive estratto di Sphilantes, cacao e zinco e con i singoli componenti. La Fig. 3 illustra grafici a barre relativi all?espressione genica di E-caderina. nelle cellule HACAT valutata mediante qRT-PCR. Le cellule sono state co-infettate con C. albicans e trattate con la composizione contenente le tre componenti attive estratto di Sphilantes, cacao e zinco e con i singoli componenti.

La Fig. 4 illustra grafici a barre relativi ai dati di espressione genica del marcatore KRT15 (Cheratina 15) dopo 24 ore di incubazione con i composti in analisi e C. albicans.

L?incremento maggiore e significativo dell?espressione genica di KRT15 si evidenzia in presenza del trattamento con la combinazione a tre componenti (1:1000). L?effetto ? ritrovato sinergico rispetto alle altre combinazioni testate.

La Fig. 5 illustra grafici a barre relativi ai dati di espressione genica del marcatore Beta-tubulina dopo 24 ore di incubazione con i composti in analisi e C. albicans. I grafici evidenziano come la maggiore e significativa riduzione dell?espressione genica della Beta-tubulina ? riferibile al trattamento con la combinazione a tre componenti dell?invenzione (1:1000) e tale effetto ? ritrovato sinergico rispetto alle altre combinazioni testate.

La Fig. 6 illustra curve relative alla crescita di C. albicans in presenza dei singoli componenti attivi e della combinazione degli stessi. La riduzione maggiore dell?area coperta da C. albicans si evidenzia in presenza del trattamento con la combinazione dell?invenzione.

La Fig. 7 illustra grafici a barre relativi ai dati di espressione genica della cheratina 15, KRT15 nelle cellule HACAT. La riduzione maggiore dell?espressione genica di KRT15 si evidenzia in presenza del trattamento con la composizione a tre componenti.

Le Fig. 8 -10 illustrano grafici a barre relativi ai dati di proliferazione rispettivamente a 24, 48 e 72h sulle cellule Hacat trattate con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL;16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate rappresentano il controllo negativo

La Figura 11 illustra grafici a barre che mostrano i dati di adesione del biofilm di S. aureus in co-trattamento con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). La diminuzione della vitalit? cellulare corrisponde ad una maggiore attivit? di contrasto dell?adesione del biofilm da parte di S. aureus.

La Figura 12 illustra grafici a barre relativi ai dati di adesione del biofilm di C. albicans (espressi come % di vitalit? rispetto al controllo non trattato) in cotrattamento con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). La diminuzione della vitalit? cellulare ? rappresentativa di una maggiore attivit? di contrasto dell?adesione del biofilm da parte di C. albicans.

La Figura 13 illustra grafici a barre relativi ai dati di sviluppo del biofilm di C. albicans (espressi come % di vitalit? rispetto al controllo non trattato) in co-trattamento con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). <L>a diminuzione della vitalit? cellulare ? rappresentativa di una maggiore attivit? di contrasto dello sviluppo del biofilm da parte di C. albicans.

La Figura 14 illustra grafici a barre relativi ai dati di sviluppo del biofilm di C. in cotrattamento con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Una diminuzione della vitalit? cellulare corrisponde ad una maggiore attivit? di contrasto dello sviluppo del biofilm da parte di C. albicans.

Descrizione dettagliata dell?invenzione

La presente invenzione origina dall?aver trovato che combinando spilantolo, preferibilmente estratto dalla pianta Spilanthes acmella, con zinco e cacao si ottengono alcuni specifici effetti sull?unghia quali una accelerazione della crescita e riparazione dei danni alla struttura cheratinica ed una riduzione dell?adesione e di formazione e sviluppo del biofilm di batteri e funghi.

Questi effetti contribuiscono a inibire lo sviluppo di colonie batteriche e fungine sull?unghia prevenendo e trattando infezioni da agenti patogeni e la correlata infiammazione locale con riduzione della frequenza di sfaldamento, rotture e fessurazioni dello strato corneo dell?unghia.

Inoltre, la combinazione delle componenti biologicamente attive accelera il processo di cheratinizzazione dell?unghia migliorandone l?aspetto esteriore, tipicamente rendendole pi? lisce al tatto, pi? luminose e pi? compatte, riducendone la fragilit?. Conseguentemente, la composizione dell?invenzione trova indicazione anche in ambito non terapeutico nel migliorare l?aspetto esteriore delle unghie di un individuo. In accordo ad un primo aspetto dell?invenzione viene quindi fornita una composizione come definita nelle accluse rivendicazioni 1-4.

Forma un altro oggetto della presente invenzione un integratore alimentare per la somministrazione orale come definito nella rivendicazione 6

Un ulteriore oggetto dell?invenzione riguarda l?uso cosmetico o estetico di una composizione come definito nella acclusa rivendicazione 6.

Secondo un altro aspetto dell?invenzione viene fornito un metodo di trattamento cosmetico che comprende l?applicazione su una unghia di un quantitativo efficace di una composizione ad uso topico come precedentemente descritto. Nelle applicazioni in ambito cosmetico, ad esempio nel migliorare l?aspetto esteriore delle unghie ? possibile applicare un quantitativo cosmeticamente attivo di composizione dell?invenzione sulla zona della pelle interessata una o pi? volte al giorno, convenientemente per un periodo di almeno 2-3 mesi.

In accordo ad un altro aspetto viene fornita una composizione per l?uso secondo un qualsiasi delle rivendicazioni 7-9.

Nello specifico la composizione qui descritta ? per l?uso nel trattamento di patologie dell?unghia che includono un?alterazione della lamina quali forme infettive, di origine batterica fungina, traumatica/distrofica, infiammatoria, incluso ad esempio le forme infiammatorie o distrofiche da psoriasi.

La combinazione delle selezionate componenti biologicamente attive interviene sui principali processi coinvolti nelle forme patologiche quali i processi infiammatori, di ossidazione e deterioramento della lamina dell?unghia, di infezione a carico di specie sia batteriche che fungine.

Vantaggiosamente, la composizione contiene una combinazione di un estratto di Spilanthes acmella, tipicamente titolato in spilantolo, con cacao tipicamente titolato in teobromina, preferibilmente estratto in polvere e zinco.

Preferibilmente i componenti estratto di Spilanthes acmella, cacao e zinco sono presenti nella composizione nei rapporti 10-20:0.5-1.5:2-6, pi? preferibilmente 15:1:4.

In accordo a certe forme di realizzazione la composizione contiene almeno una delle seguenti ulteriori componenti biologicamente attive: selenio in forma libera o in un prodotto che lo contiene, valina opzionalmente in forme di sale o estere, vitamina D, preferibilmente D3, ornitina opzionalmente in forma di sale o estere.

In una forma di realizzazione preferita la composizione contiene l?aminoacido valina opzionalmente in forma di sale o estere. La combinazione di valina con le altre tre componenti della composizione svolge una funzione strutturale e contribuisce a ripristinare la lamina ungueale e accelera i processi naturali di formazione delle cheratine di cui ? costituita. La sua combinazione con le altre tre componenti aumenta l?azione antiossidante riducendo lo stress ossidativo delle strutture dell?unghia, ad esempio conseguenti ad irraggiamento, applicazione di prodotti chimici, traumi. Si ? infatti osservato che il rilascio di specie reattive dell?ossigeno (ROS) favorisce il deterioramento dell?unghia rendendola anche pi? suscettibile alle aggressioni da agenti fisici e patogeni. La combinazione delle componenti biologiche secondo una forma di realizzazione qui descritta contrasta lo stress ossidativo anche a livello della lamina ungueale.

La presenza di zinco e di teobromina del cacao ed eventualmente di selenio, contrasta l?azione dei radicali liberi ed esercita un?azione antinfiammatoria grazie alla capacit? di downregolare le citochine pro?infiammatorie.

In accordo a forme di realizzazione preferite la composizione ulteriormente contiene ornitina, un derivato aminoacidico che quando combinato con le tre componenti della composizione e preferibilmente anche con valina, incrementa la biosintesi della spermidina, una poliammina che stimola la crescita e rigenerazione dell?unghia.

I danni alla struttura dell'unghia possono influenzarne non solo la crescita, la forma e le dimensioni ma anche predisporre l'unghia alle infezioni e conseguente infiammazione per rottura dei tessuti molli con conseguente infiammazione del tessuto sottocutaneo.

L?azione riparatrice sull?unghia della composizione secondo una forma di realizzazione qui descritta previene l?infiltrazione di microrganismi patogeni nei tessuti sottostanti riducendo l?incidenza di infezioni.

In vista di queste attivit? la composizione dell?invenzione ? idonea sia per usi in ambito medico che per usi non terapeutici, nel trattamento delle unghie.

Le componenti biologicamente attive presenti nella composizione sono descritte in dettaglio nel seguito.

Una delle componenti biologicamente attive presenti nella composizione, lo Spilantolo pu? essere di origine naturale o sintetica.

Nella composizione dell?invenzione pu? essere presente spilantolo o una porzione di pianta di Spilanthes acmella o preferibilmente un suo estratto contenente spilantolo.

Spilanthes acmella ? una specie appartenente al genere Spilanthes della famiglia delle Compositae o Asteraceae.

La pianta o sua porzione pu? essere utilizzata intera, macinata, o preferibilmente come estratto. Parti della pianta includono foglie, semi, infiorescenze, radici o lo stelo/fusto. Nell?ambito dell?invenzione ? preferito l?uso di un estratto da infiorescenze o radici della pianta.

I principali composti chimici isolati e contenuti in un estratto vegetale di Spilanthes acmella comprendono alchilamidi o alcammidi preferibilmente spilantolo o affinin (2E,6Z,8E)-N-isobutyl-2,6,8-decatrienamide ( , 1945[31]; 1999[76]) identificato con il numero 1 e/o derivati ammidici 2-9 come illustrati nel seguito.

Tra questi composti per gli usi dell?invenzione ? preferito lo spilantolo ma possono essere usate anche miscele dei nove composti.

? possibile ottenere un estratto vegetale da Spilanthes acmella ricorrendo a tecniche di estrazione convenzionali, ad esempio per macerazione oppure tecniche solido-liquido idonee per separare/estrarre dai tessuti vegetali delle piante e dei loro frutti una o pi? componenti biologicamente attive.

Un idoneo solvente per ottenere l?estratto vegetale di Spilanthes acmella ? un liquido fisiologicamente accettabile in cui le componenti biologicamente attive sono solubili ed in cui non subiscono una alterazione che le privi di attivit?.

Idonei solventi sono solventi apolari come esano (Ramsewak et al., 1999) o polari protici, preferibilmente acqua metanolo, etanolo e loro miscele ad esempio etanolo o metanolo : H2O ad esempio 4:1, v/v.

Un solvente fisiologicamente accettabile preferito ? una miscela idroalcolica preferibilmente acqua-etanolo. L?estrazione idroalcolica ? particolarmente indicata nel caso di utilizzo dell?inflorescenza come materiale di partenza dell?estrazione. A titolo di esempio, il solvente idroalcolico pu? contenere dal 10% al 70% in volume di alcool, preferibilmente etanolo, preferibilmente dal 20% al 60% in volume, ancor preferibilmente dal 30% al 50% in volume, ad esempio il 40% in volume.

L?estrazione pu? essere fatta a freddo o a caldo, ad esempio a 40-70 gradi centigradi.

L?estrazione nel solvente delle componenti biologicamente attive presenti nei tessuti vegetali della pianta pu? cos? avvenire per diffusione ed osmosi

In certe forme di realizzazione l?estrazione viene realizzata utilizzando un rapporto in peso tra solvente e matrice vegetale compreso tra 1:10 e 10:1.

Un idoneo estratto da Spilanthes acmella pu? essere fluido, molle o secco.

Ad esempio, nell?estratto fluido 1 ml di estratto contiene le componenti biologicamente attive solubili in 1 g di droga vegetale, nell?estratto molle il solvente ? evaporato parzialmente in particolare sino a quando l?estratto non bagna una carta da filtro, nell?estratto secco il solvente viene evaporato pressoch? completamente per ottenere una polvere.

Nella formulazione della composizione preferibilmente viene utilizzato un estratto secco, vantaggiosamente da radice o inflorescenza di Spilanthes acmella.

Ad esempio, una fase iniziale della preparazione di un idoneo estratto secco prevede che la pianta o sue porzioni preferibilmente infiorescenze o radici, siano pulite, essiccate e opzionalmente tagliate in pezzi o sminuzzate, macinate o polverizzate. In una fase successiva questo materiale viene estratto utilizzando metodi convenzionali.

Un?idonea estrazione prevede che una porzione o matrice vegetale, preferibilmente infiorescenza di Spilanthes acmella, siano macinati a dare una polvere da cui si effettua l?estrazione utilizzando un idoneo solvente quale una miscela acquaetanolo, o etanolo, ad esempio dal 40 all?80% in etanolo per un tempo idoneo ad arricchire il solvente di una o pi? componenti biologicamente attive, ad esempio 10 minuti.

In certe forme di realizzazione il tempo di macerazione pu? variare tra 10 minuti e 48 ore, 1 e 5 ore.

In queste condizioni l?estrazione nel solvente delle componenti biologicamente attive presenti nei tessuti vegetali della pianta avviene per diffusione ed osmosi. In certe forme di realizzazione l?estratto ottenuto pu? essere sonificato e centrifugato, ad esempio a 3000 rpm per 4-6 minuti. L?estratto ottenuto viene prelevato e pu? essere diluito con un alcol, tipicamente etanolo ad esempio ad ottenere un volume finale di 10 ml se si parte da 1 un grammo di polvere iniziale. Il liquido estratto pu? essere filtrato se necessario. In una fase successiva l?estratto liquido ? essiccato per ottenere la componente biologicamente attiva in forma di polvere secca. L?essiccamento pu? essere realizzato con tecniche convenzionali ad esempio ad aria, riscaldamento o spray-drying.

Ulteriori metodi per ottenere l?estratto vegetale di Spilanthes acmella, titolato in Spilantolo includono tecniche di estrazione mediante digestione, infusione, spremitura, decozione, percolazione, estrazione controcorrente, soxhlet, estrazione con gas supercritici quale CO2, o ultrasuoni.

Secondo alcune forme di realizzazione l?estratto secco di Spilanthes acmella ? un estratto secco dalla pianta intera o preferibilmente da radici titolato in spilantolo. Ad esempio, un estratto secco da Spilanthes acmella contiene dallo 0,5% al 5%, dall?1 al 3% di spilantolo, che rappresenta il principale ingrediente biologicamente attivo contenuto nella pianta.

Vantaggiosamente, nella composizione pu? essere usato un estratto secco da infiorescenza di Spilanthes acmella titolato al 3% in spilantolo.

In certe forme di realizzazione l?estratto vegetale di Spilanthes acmella ? presente nella composizione in un quantitativo da 0,01 a 20% da 0,5 a 20%, da 1 a 10% ad esempio 5% in peso rispetto al peso totale della composizione.

In certe forme di realizzazione la composizione dell?invenzione contiene un estratto secco di Spilanthes acmella in un quantitativo compreso da 5 a 2000mg, da 100 a 1200, da 200 a 600mg, ad esempio 400 mg per unit? di dosaggio.

Un altro selezionato componente della composizione ? cacao preferibilmente in polvere ottenuta dalla pianta Theobroma cacao, appartenente alla famiglia delle Sterculiaceae originaria dell?America meridionale.

Vantaggiosamente nella composizione ? presente polvere di semi di cacao, da Theobroma cacao.

Un idoneo cacao in polvere per la formulazione della composizione qui descritta, pu? essere ottenuto con un processo che comprende le seguenti fasi:

a) fornire fave di cacao fermentate o non fermentate;

b) drenare/sgocciolare le fave della fase a)

c) seccare le fave sgocciolate;

d) scaldare le fave di cacao a temperatura da 70 a 120 ?C per un periodo di tempo idoneo a rimuovere il guscio delle fave, ad esempio per 1 - 30 minuti, ad esempio ad infrarossi o aria calda, ad esempio a 30-70?C, 45.60?C.

e) vagliare/separare le fave scaldate per separare granella/chicchi/semi di cacao dal guscio;

f) macinare chicchi/granella/semi di cacao in un brodo fluido marrone scuro contenente le particelle macinate di solidi di cacao parzialmente senza lipidi (parzialmente delipidati) sospesi nel burro di cacao;

g) Separare i solidi di cacao dal burro di cacao.

Secondo alcune forme di realizzazione il quantitativo di cacao persente nella composizione dell?invenzione varia da 10 a 1000mg, preferibilmente da 50 a 500 mg, pi? preferibilmente da 100 a 300 mg ad esempio 200 mg per unit? di dosaggio. Secondo alcune forme di realizzazione il quantitativo di cacao, preferibilmente in polvere, varia da 10 a 1000mg, preferibilmente da 50 a 500 mg, pi? preferibilmente da 100 a 300 mg, ad esempio 200 mg per unit? di dosaggio.

In particolare, i componenti bioattivi del cacao riducono i processi infiammatori. Questa attivit? si basa sulla loro capacit? di downregolare le citochine proinfiammatorie e le loro vie biochimiche a valle.

Tra le componenti presenti nel cacao da Theobroma Cacao ? la Teobromina, una xantina appartenente al gruppo chimico delle basi puriniche in grado di inibire la fosfodiesterasi, enzima che catalizza la conversione dell?cAMP in 5 AMP (inattivo). Ne consegue pertanto l?accumulo intracellulare di cAMP, non per una sua aumentata produzione, m per un prolungamento dell?emivita per inibizione della sua degradazione.

Queste premesse hanno indirizzato diversi autori verso l?utilizzo topico delle xantine nel decorso androgenetico a concentrazioni variabili dallo 0,2 al 2% nel tentativo di allungare la fase anagen. Numerosi studi in vivo ed in vitro hanno messo in evidenza le propriet? di penetrazione transcutanea delle xantine (Bronaugh R.L. ? Feldmann R.J. ? Rogers J.G. ? Zesch A.). I risultati di questo tipo di approccio terapeutico, controllati con il tricogramma, sono stati ritenuti interessanti (Seiler W.G.) e pertanto, considerata anche la loro assoluta innocuit?, si considera che le xantine, potrebbero essere utilizzate come farmaci topici di routine nel trattamento precoce della calvizie comune. Le xantine agiscono attivando il sistema delle proteine chinasi e modulando la disponibilit? energetica per le sintesi proteiche del capello.

In certe forme di realizzazione l?estratto di cacao, preferibilmente estratto secco, presente nella composizione in un quantitativo da 0,01 a 20% da 0,5 a 20%, da 0,5 a 8% ad esempio 2% in peso rispetto al peso totale della composizione.

In certe forme di realizzazione la composizione dell?invenzione contiene un estratto di cacao, preferibilmente secco in un quantitativo compreso da 1 a 1000mg, da 5 a 500mg, da 20 a 200mg, ad esempio 50 mg.

Un ulteriore componente biologicamente attivo della composizione qui descritta ? lo zinco, un minerale o oligoelemento che svolge un ruolo importante nel metabolismo cellulare e che ? coinvolto in importanti funzioni biologiche, tra cui la sintesi del DNA, l'espressione genica, il controllo ormonale, le reazioni enzimatiche e la proliferazione cellulare.

Lo zinco ? coinvolto come elemento strutturale e/o fattore regolatorio e ha un ruolo in importanti attivit? funzionali all'interno del follicolo pilifero. ? essenziale nella sintesi delle proteine e gioca un ruolo importantissimo anche nello sviluppo di unghie e capelli.

Inoltre, lo zinco ? un inibitore della 5 alfa?reduttasi e contribuisce, quindi, a bloccare il DHT. Come cofattore ? coinvolto in 60 reazioni enzimatiche; ad esempio, l?enzima superossido?dismutasi, antiossidante che contrasta l?azione dei radicali liberi pu? avere come cofattori metalli diversi, tra cui lo zinco.

Lo zinco, inoltre, ? un costituente della lamina ungueale ed una sua carenza nutrizionale pu? influenzare la crescita dell'unghia e provocare patologie.

Nella composizione o integratore, lo zinco pu? essere presente in forma elementare, oppure come ossido o sale ad esempio cloruro di zinco, acetato di zinco, zinco citrato, o zinco picolinato o zinco bisglicinato, ad esempio al 20% di zinco.

Secondo alcune forme di realizzazione, la composizione dell'invenzione contiene zinco, preferibilmente zinco bisglicinato, in un quantitativo compreso da 0,01 a 10% in peso, dal 0,1 a 10% in peso, da 0,5 a 5%, ad esempio il 1% in peso.

Ad esempio, la composizione o l?integratore qui descritto pu? contenere da 0,1 a 100mg, da 1 a 50 mg, da 2 a 20 mg di zinco o zinco bisglicinato per unit? di dosaggio.

Un altro componente vitaminico della composizione ? la vitamina D. Questa vitamina, nota anche come calciferolo, comprende un gruppo di secosteroidi lipososubili che esistono in diverse forme di cui le pi? diffuse e di maggior interesse biologico sono la vitamina D2 nota come ergocalciferolo e preferibilmente la vitamina D3, nota come colecalciferolo.

La vitamina D aumenta l?assorbimento di calcio, un minerale fondamentale per la struttura di ossa e unghie che contribuisce al normale assorbimento del calcio e del fosforo e al mantenimento di livelli fisiologici di calcio nel sangue.

Inoltre la presenza di vitamina D3 nella composizione aumenta l?assorbimento di calcio, un minerale importante per la struttura delle unghie ed inoltre contribuisce alle normali funzioni del sistema immunitario, esercitando un?attivit? immunomodulatoria/immunostimolante, utile per la difesa dalle aggressioni esterne e dagli agenti infettivi.

Secondo alcune forme di realizzazione, la composizione dell'invenzione contiene vitamina D, preferibilmente D3, in un quantitativo compreso da 0,01 a 10% in peso, dal 0,1 a 10% in peso, da 0,5 a 5%, ad esempio il 1% in peso.

Ad esempio, la composizione o l?integratore qui descritto pu? contenere da 0,1 a 100mg, da 1 a 50 mg, da 2 a 20 mg di vitamina D, in particolare D3, per unit? di dosaggio.

La composizione pu? inoltre contenere uno o pi? aminoacici, preferibilmente valina. Questo aminoacido, insieme alla Leucina e all?isoleucina, rientra nel gruppo degli amminoacidi ramificati e come tale rientra nel metabolismo energetico. ? un amminoacido essenziale e come tale indispensabile per la sintesi delle proteine tra cui anche la cheratina di unghie e capelli, in cui ? presente in quantit? significativa (circa il 6%).

Secondo alcune forme di realizzazione, la composizione dell'invenzione contiene valina opzionalmente come sale o estere, in un quantitativo compreso da 0,01 a 10% in peso, dal 0,1 a 10% in peso, da 0,5 a 5%, ad esempio il 1% in peso.

Ad esempio, la composizione o l?integratore qui descritto pu? contenere da 1 a 1000mg, da 20 a 300 mg, da 35 a 150 mg di valina o sale o estere, per unit? di dosaggio.

Un altro idoneo micronutriente che pu? essere presente nella composizione ? il selenio un minerale presente in tracce nell?organismo umano, provvisto di attivit? antinfiammatoria ed antiossidante. Il selenio pu? essere presente nella composizione in forma elementare. In alternativa pu? essere presente in forma di lievito contenente selenio.

Il selenio ? il cofattore di diverse selenoproteine le cui funzioni giocano un ruolo essenziale nel mantenimento di capelli e unghie in condizionifisiologiche.

Il Selenio sierico ? presente nell?organismo:

per circa il 60% nella Selenoproteina P (SePP);

per il 30% legato alla Glutatione perossidasi (GPx);

Dal 5% al 10% legato alla Sieroalbumina;

Meno dell?1% in forma libera.

Pi? del 50% delle selenoproteine possiede attivit? antiossidante. Tra queste le pi? note sono le famiglie delle GPx e delle Thioreduxin reduttasi (Trx R). Le GPx comprendono otto isoforme, che catalizzano la riduzione di vari idroperossidi, agendo sinergicamente con l??? Tocoferolo nella difesa antiossidante contro la perossidazione lipidica.

Le Selenoproteine possono svolgere un ruolo protettivo contro il danno ossidante dell?endotelio. Esse inibiscono l?attivazione, attraverso il segnale redox, del fattore NF??B e quindi fermano la tempesta di citochine nonch? la formazione di specie reattive dell?ossigeno e dell?azoto.

Secondo alcune forme di realizzazione, la composizione dell'invenzione contiene selenio o composto a base di selenio quale selenio l metionina, in un quantitativo compreso da 0,0001 a 1% in peso, dal 0,001 a 0,1% in peso, da 0,005 a 0,05%, ad esempio lo 0,01% in peso.

Ad esempio, la composizione o l?integratore qui descritto pu? contenere da 1 a 1000 mcg, da 5 a 500mcg da 20 a 200 mcg di selenio, ad esempio 60 mcg per unit? di dosaggio.

In accordo ad alcune forme di realizzazione la composizione contiene ornitina o un suo sale od estere, un derivato amminoacidico che origina dall?attivit? dell'enzima arginasi che scinde la L?arginina in ornitina ed urea. Preferibilmente l?ornitina ? in forma di L-ornitina cloridrato.

Nei tessuti non epatici dei mammiferi, il ruolo metabolico principale del ciclo dell'urea ? quello della sintesi dell'arginina, ma anche nella biosintesi della L?prolina e le poliammine, inclusa la spermidina.

L'ornitina svolge un ruolo importante come prodotto intermedio dei processi metabolici. Ha effetti simili a quelli dell'arginina, ma con maggiore efficacia.

In certe forme di realizzazione l?ornitina, preferibilmente ornitina cloridrato, presente nella composizione in un quantitativo da 0,01 a 20% da 0,5 a 20%, da 0,5 a 8% ad esempio 2% in peso rispetto al peso totale della composizione.

In certe forme di realizzazione la composizione dell?invenzione contiene ornitina, preferibilmente ornitina cloridrato in un quantitativo compreso da 1 a 1000mg, da 5 a 500mg, da 20 a 200mg, ad esempio 50 mg.

In una forma di realizzazione la composizione contiene tutti i sei ingredienti biologicamente attivi precedentemente descritti

La composizione dell?invenzione pu? essere destinata sia all?uso esterno che alla somministrazione orale.

La composizione dell?invenzione pu? essere autorizzata al commercio come prodotto cosmetico ad applicazione locale, oppure come farmaco, integratore dietetico o nutrizionale destinato alla somministrazione orale.

Tipicamente, la composizione dell?invenzione comprende un veicolo, diluente o eccipiente fisiologicamente e/o cosmeticamente accettabile.

Tipicamente, il veicolo fisiologicamente o cosmeticamente accettabile della composizione dell?invenzione ? un eccipiente, veicolo o diluente idoneo per l?applicazione topica e/ o per la somministrazione orale.

Nell?ambito della presente il termine ?veicolo? si riferisce ad un eccipiente, veicolo, diluente o coadiuvante che pu? o possono essere presenti nella composizione dell?invenzione. Qualsiasi veicolo e/o eccipiente idoneo per la forma di preparazione desiderata per la somministrazione viene contemplata negli utilizzi dell?estratto vegetale o principi attivi in esso presente quivi descritti.

In certe forme di realizzazione, la composizione dell?invenzione contiene una o pi? componenti di origine vegetale che sono biologicamente attive e sostanzialmente prive di effetti collaterali, quando somministrate per via orale o locale.

Il veicolo, diluente o eccipiente fisiologicamente o farmaceuticamente e/o fisiologicamente accettabile pu? essere scelto in base alla via di somministrazione per cui ? intesa la risultante composizione farmaceutica.

Secondo alcune forme di realizzazione preferite la composizione pu? essere in forma per la somministrazione orale.

Le composizioni per la somministrazione orale possono essere in forma solida o liquida.

Composizioni in forma solida comprendono compresse, capsule, polveri, granuli, pillole.

Composizioni in forma liquida comprendono soluzioni, emulsioni, sospensioni, sciroppi. Tutte le composizioni comprendono anche forme a rilascio controllato delle stesse.

Una forma di realizzazione preferita della composizione ? quella in granuli che possono essere disciolti in acqua al momento della somministrazione.

I granuli comprendono un idoneo veicolo o eccipiente in cui viene disperso i componenti della composizione.

Idonei eccipienti contenuti nella formulazione sono la cellulosa e suoi derivati come idrossimetilcellulosa, idrossipropilmetilcellulosa, metilcellulosa, idrossipropilcellulosa, idrossietilcellulosa, carbossietilcellulosa, etilidrossietilcellulosa, carbossimetilcellulosa, cellulosa acetato butirrato, cellulosa acetato ftalato, e loro miscele.

Ulteriori esempi di idonei eccipienti comprendono i polimeri facenti parte della famiglia dei lattami come pirrolidone e suoi derivati ad esempio polivinilpirrolidone, polivinilpolipirrolidone e loro miscele, i sali inorganici come calcio o dicalcio fosfato, lubrificanti quali ad esempio magnesio stearato, triacilgliceroli e loro miscele.

La comosizione pu? ulteriormente comprendere uno o pi? dei seguenti eccipienti: agenti di carica come fosfati di calcio, stabilizzanti come carbossimetilcellulosa sodica reticolata, agenti di rivestimento come polivinil alcol, polietilen glicole, talco, agenti antiagglomeranti come sali di magnesio degli acidi grassi; biossido di silicio. Le componenti sinergiche biologicamente attive contenute nella composizione dell?invenzione possono essere presenti in quantitativi variabili, ad esempio compresi da 0,0001% in peso al 50% in peso, da 0,1% in peso al 20% in peso tipicamente da 0,5 a 5% in peso.

In accordo a certe forme di realizzazione la composizione dell?invenzione comprende ulteriormente una o pi? sostanze attive come vitamine, minerali, micronutrienti ed altre sostanze attive.

In accordo ad alcune forme di realizzazione la composizione per la somministrazione orale ? un integratore alimentare, un alimento funzionale, una composizione nutraceutica, un prodotto dietetico, un complemento o prodotto nutrizionale o un medical device.

Alimento funzionale significa un qualsiasi alimento o ingrediente alimentare modificato che pu? fornire un beneficio o protezione contro un inconveniente o una affezione fisiologica, oltre ai nutrienti tradizionali che esso contiene.

Prodotto nutraceutico significa un prodotto isolato o purificato da sostanze commestibili. Un nutraceutico ? tale quando si dimostra che possiede un beneficio fisiologico o che fornisce protezione contro un inconveniente o disordine fisiologico. Integratore alimentare o dietetico significa un prodotto che contiene una vitamina, minerale, estratto vegetale, aminoacido, metabolita, estratto, concentrato o miscele di questi ingredienti.

Il quantitativo somministrato e la frequenza della somministrazione della composizione dipender? dalla natura e gravit? della affezione da trattare.

In alcune forme di realizzazione la via di somministrazione della composizione dell?invenzione ? quella topica. In accordo queste forme di realizzazione la composizione ? per uso topico e viene applicata sulla cute.

La composizione per applicazione topica pu? essere in forma solida, semisolida o fluida. Idonee formulazioni in forma solida includono creme, pomate, paste, unguenti.

In altre forme di realizzazione la formulazione per la somministrazione locale ? in forma fluida, ad esempio in forma di lozioni, sospensioni, o semifluida ad esempio in forma di gel ed emulsioni.

In alcune forme di realizzazione le composizioni dell?invenzione possono comprendere eccipienti comunemente utilizzati nella formulazione di preparazioni cosmetiche o farmaceutiche, ad uso locale, quali conservanti, agenti battericidi, stabilizzanti, emulsionanti, tamponi, umettanti, coloranti ed altri eccipienti comunemente utilizzati nelle tecniche di preparazione cosmetiche / farmaceutiche. Le composizioni convenientemente possono essere presentate in una forma di dosaggio unitaria e preparate in accordo a uno qualsiasi dei metodi ben noti nella tecnica della lavorazione dei prodotti alimentari, dietetici.

In alcune forme di realizzazione tali composizioni e preparazioni possono contenere almeno lo 0,1 % di ciascuno delle sostanze biologicamente attive.

Diversi altri materiali possono essere presenti come rivestimenti o materiali idonei a modificare la forma fisica dell?unit? di dosaggio.

Secondo alcune forme di realizzazione, nella composizione dell?invenzione, la combinazione di principi attivi viene formulata in unit? di dosaggio, ad esempio granuli confezionati in bustine. L?unit? di dosaggio pu? contenere ciascuno dei principi attivi nei quantitativi sopra descritti per unit? di dosaggio.

La presente invenzione verr? ora descritta facendo riferimento ai seguenti esempi che vengono forniti a meri fini illustrativi e non devono essere intesi in senso limitativo della presente invenzione.

ESEMPIO N.1

Composizione in forma di granuli in singola unit? di dosaggio, preferibilmente una bustina o stick, contenente le seguenti sostanze attive

Zinco Bisglicinato 20%? ...............................7,50 mg/stick

Lievito al selenio (IaIminSe2000? .................... 0,060mg/stick

Vitamina D3 polvere ........................................0,015 mg/stick

L?Ornithine monohydrochloride (L?Ornitina cloridrato)? 50,00 mg/stick

Theobroma cacao e.s (% theobromina)? .............. 50,00 mg/stick

Valina? .......................................................75 mg/stick

Spilanthes acmella ........................................... 400 mg/stick

ESEMPIO 2

Integratore alimentare per migliorare l?aspetto estetico delle unghie o per trattare infezioni o forme infiammatorie o distrofie avente la seguente formulazione:

ESEMPIO N. 3

Composizione ad uso topico in forma di crema da applicare sulle unghie e nell?area circostante avente la seguente formulazione:

ESEMPIO N. 4

1. SCOPO

Valutazione dell?efficacia della miscela/combinazione di Sphilantes, Zinco e Cacao nelle applicazioni di cui al successivo paragrafo 2. Nelle prove sono stati confrontate le attivit? dei tre singoli componenti della composizione e la loro combinazione nella composizione dell?invenzione al fine di valutare il riscontro dell?effetto sinergico.

2. USI TESTATI

Valutazione di uso cosmetico nel trattamento cosmetico delle alterazioni dell?unghia dovute a traumi e distrofie.

Valutazione di uso medico nel trattamento delle alterazioni dell?unghia dovute a forme infettive

batteriche e/o fungine.

A tale scopo sono stati utilizzati test in vitro microbiologici e test in vitro con linee cellulari (cellule HACAT)

3. MATERIALI

3.1 Campioni testati

Tutti gli estratti sono stati diluiti ad una concentrazione stock pari alla concentrazione nel prodotto finito in terreno di coltura (Stock solution-solubilit? 100%) e filtrati sterilmente. Le stock sono state conservate a - 20?C.

Gli estratti sono stati testati in vitro ad una concentrazione finale pari ad una diluizione da 1:1000 a 1:1000000 sulla coltura cellulare rispetto alla concentrazione nel prodotto finito.

3.2 Reagenti e strumentazione utilizzata

3.3 Materiali

3.3.1 MODELLO CELLULARE DI CHERATINOCITI UMANI, CELLULE HACAT

Si utilizza la linea immortalizzata di cheratinociti umani HACAT (BS CL 168) ottenuta dall?Istituto Zooprofilattico (Brescia, Italy). mantenuta in coltura in fiasche sterili (25 cm<3>), incubate a 37?C in atmosfera umida al 5% di CO2 in terreno di coltura RPMI addizionato con 10% di siero fetale bovino (FBS), in presenza di 1% di penicillina e streptomicina.

Lo split 1:3 si effettua ogni 2 giorni al raggiungimento del monostrato mediante lavaggio con PBS 1X (tampone fosfato senza Ca<2+ >e Mg<2+>) e distacco delle cellule con una soluzione di tripsina- EDTA a 37?C per 2 minuti. Le cellule sono state mantenute in coltura in fiasche sterili da 25cm<3 >e incubate a 37?C in atmosfera umida al 5% di CO2.

3.3.2 COLTURE MICROBICHE

Il ceppo di C. albicans ATCC- 10231? (LGC Standard, Italia) ? stato coltivato in Sabouraud broth a 25 ?C e re- inoculato ogni 24h al 4% in terreno colturale fresco.

Il ceppo di S. aureus ATCC-25923? (LGC Standard, Italia) ? stato coltivato in Mannitol salt broth a 37 ?C e re-inoculato ogni 24h al 4% in terreno colturale fresco.

3.3.3 CONTROLLI

3.3.2.1 Test in vitro in modello di co-infezione delle cellule HACAT con C.

albicans (Kanchanapibon et al., 2020) o S. aureus (Gunarstam et al., 2019)

CONTROLLO NEGATIVO: Cellule non trattate RPMI addizionato con 10% di siero fetale bovino (FBS), , in presenza di 1% di penicillina e streptomicina e mantenute in piastre (12 well) di coltura da 25 cm<2 >a 37?C e 5% CO2.

CONTROLLO POSITIVO: Cellule pre-trattate con C. albicans o S. aureus in RPMI addizionato con 10% di siero fetale bovino (FBS), in presenza di 1% di penicillina e streptomicina e mantenute in piastre (12 well) di coltura da 25 cm2 a 37?C e 5% CO2.

3.3.2.2 Test in vitro di proliferazione cellulare (MTT assay)

CONTROLLO NEGATIVO: Cellule non trattate RPMI addizionato con 10% di siero fetale bovino (FBS), , in presenza di 1% di penicillina e streptomicina e mantenute in piastre (12 well) di coltura da 25 cm2 a 37?C e 5% CO2.

3.3.2.3 Attivit? anti-biofilm

CONTROLLO NEGATIVO: Cellule non trattate RPMI addizionato con 10% di siero fetale bovino (FBS), , in presenza di 1% di penicillina e streptomicina.

CONTROLLO POSITIVO: Cellule trattate con C. albicans o S. aureus in culture medium.

3.4 Metodi

3.4.1 Test in vitro in modello di co-infezione delle cellule HACAT con C. albicans

(Kanchanapibon et al., 2020) o S. aureus ( , 2009)

Per la co-infezione ? stata utilizzata la linea immortalizzata di cheratinociti umani HACAT (BS CL 168) ottenuta dall?Istituto Zooprofilattico (Brescia, Italy). mantenuta in coltura in fiasche sterili (25 cm<3>), incubate a 37?C in atmosfera umida al 5% di CO2 in terreno di coltura RPMI addizionato con 10% di siero fetale bovino (FBS), in presenza di 1% di penicillina e streptomicina. Al raggiungimento della confluenza le cellule sono state seminate in piastre da 24 pozzetti ad una densita cellulare di 0,5*10<6 >cellule/pozzetto e incubate 24h a 37?C, al 5%CO2. Dopo 24h, colture fresche (24h) di C. albicans e S. aureus sono state centrifugate (7500 rpm, 10 min) lavate e risospese in soluzione fisiologica. E? stata calibrata loro densit? cellulare rispettivamente a 1*10<6>cell/well e 4,5*10<5>cell/well per C. albicans e S. aureus mediante misurazione della densit? ottica a 600 nm.

Quindi, 1mL delle rispettive sospensioni cellulari sono stati incubati da soli (controllo positivo) o con le sostanze attive di interesse secondo le concentrazioni riportate in Tabella 1. La Sphilantes (S), lo Zinco (Z) e il Cacaco (C ) sono stati testati singolarmente, in coppia e in tripletta a tutte le concentrazioni sopra indicate per 24h. Cellule non infettate sono state utilizzate come controllo negativo.

Relativamente alla co-infezione con C. albicans al T0 dopo 120 min e dopo 24h di trattamento sono state inoltre acquisite immagini al microscopio (ingrandimento 4x) al fine di monitorare visivamente l?eventuale inibizione di colonizzazione da parte di C. albicans da parte delle sostanze attive testate. Al fine di valutare la protezione dall?infezione fungina o batterica ? stata valutata l?espressione genica dei seguenti markers:

Infezione da C. albicans:

? E-caderina: proteina di adesione la cui degradazione aumenta in presenza di infezione da C. albicans

( 2007)

? TNF-alfa ( 2003)

? Citocheratina 15 (in caso di infezione fungina o batterica la cheratina viene spezzata e degradata dal fungo) ( 2017)

? Inibizione Beta-tubulina (componente principale dei microtubuli, essenziali per mitosi cellulare fungina)

Infezione da S. aureus:

? Citocheratina 15 (in caso di infezione fungina o batterica la cheratina viene spezzata e degradata dal batterio) ( 1996)

L?espressione genica dei vari marcatori ? stata valutata mediante RT-PCR quantitativa relativa (quantitative reverse transcriptionpolymerasechainreaction- qRT-PCR).

Questa analisi ha previsto 3 fasi sequenziali:

? estrazione dell?RNA totale;

? retrotrascrizione in cDNA;

? qRT-PCR.

L?RNA totale ? stato estratto dalle cellule NCTC2544 in accordo a quanto descritto da (1995).

Al termine dell?incubazione con i composti attivi di interesse, le cellule sono state lavate con PBS (1?) ed infine sottoposte a procedura di estrazione dell?RNA. Al termine dell?estrazione, l?RNA estratto ? stato quantificato mediante strumento QiaExpert (Qiagen) e sono state calcolate le concentrazioni in ?g/mL di RNA totale estratto alla lunghezza d?onda di 260 nm.

Infine ? stata valutata l?integrit? dell?RNA (2 ?g/mL) mediante una corsa elettroforetica su gel di agarosio all?1%.

L?RNA totale ? stato convertito in cDNA (DNA complementare), utilizzando un enzima in grado di sintetizzare una molecola di DNA utilizzando come stampo un filamento di RNA; questo enzima DNA polimerasi- RNA dipendente, prende il nome di trascrittasi inversa.

Essa si lega all?estremit? 3? di un singolo filamento di RNA e mediante i random primers e i deossinucleotiditrifosfato (DNTP) sintetizza il filamento di cDNA.

A tale scopo ? stato utilizzato un kit commerciale ?PrimeScript<TM >RT Reagent Kit (perfect Real Time)? (TakaraBioInc., Japan) contenente 5X PrimeScript Buffer (for real Time); PrimeScript RT Enzyme Mix1; OligodTPrimer; Random 6 mers; RNAse free dH2O.

L?RNA estratto e quantificato ? stato diluito ad una concentrazione pari a 2 ?g/mL e retrotrascritto in cDNA.

E? stata preparata una Master Mix di 10 ?L (contenente 5X PrimeScript Buffer (for real Time); PrimeScript RT Enzyme Mix1; OligodTPrimer 50?M; Random 6 mers 100?M) a cui sono stati aggiunti 10 ?L di RNA (2 ?g/mL). I campioni sono stati posti in termociclatore (Stratagene Mx3000P Real Time PCR System, Agilent Technologies Italia S.p.A., Milano, Italia) e sottoposti a retrotrascrizione alle seguenti condizioni:

37?C per 15 minuti; 85?C per 5 secondi; 4?C hold.

Al termine della retrotrascrizione ai campioni sono stati aggiunti 30 ?L di acqua DEPC per ottenere una concentrazione finale di cDNA pari a 40 ng/?L.

La qRT-PCR rappresenta un metodo di amplificazione e quantificazione in tempo reale degli amplificati prodotti monitorando la fluorescenza emessa durante la reazione.

Per l?amplificazione RT-PCR ? stato utilizzato il sistema delle sonde TaqMan? (AppliedBiosystems). Sono state usate le seguenti sonde TaqMan: Hs00174128_m1 (TNF-?), Hs00951967_g1 (KRT15), Hs00742533_s1e (TUBB2A), Hs01023894_m1 (CDH1) e Hs99999905_m1 (GAPDH). Come gene controllo (housekeeping) ? stato utilizzato il GAPDH.

La sonda Taqman ? un tipo di sonda che permette lo sviluppo della fluorescenza all?avanzare dell?amplificazione. Alla sua estremit? 5? ? legato un reporter (fluoroforo FAM<TM>), mentre all?estremit? 3? un quencher. La vicinanza tra il reporter ed il quencher annulla l?emissione del segnale di fluorescenza. Solo con l?attivit? 5? esonucleasica della DNA polimerasi termostabile (Taq polimerasi) si rileva la fluorescenza e l?accumularsi dei prodotti di amplificazione pu? essere valutato mediante l?incremento di fluorescenza del reporter che aumenta ad ogni ciclo.

Per la qRT-PCR ? stata allestita una Master Mix come segue:

? 10 ?L di ?2X Premix Ex Taq? ;

? 1 ?L di ?20? TaqMan Gene ExpressionAssays? (contenente 2 primers e la sonda fluorescente marcata con fluoroforo FAM<TM>);

? 0,4 ?L di Riferimento passivo Rox II;

? 5 ?L di acqua DEPC.

Alla Master Mix sono stati aggiunti 4 ?L di cDNA per il gene target e 1 ?L di cDNA per il gene housekeeping. L?amplificazione ? stata condotta alle seguenti condizioni per 40 cicli:

? 95?C, 30 sec (Amplitaqactivation);

? 95?C, 5 sec (Denaturazione)

? 60?C, 20 sec (Annealing - estensione); Ogni analisi ? stata condotta in duplicato.

I dati ottenuti sono stati analizzati secondo il metodo del 2<-??Ct >ed ? stato cos? possibile calcolare i valori relativi di espressione del gene di interesse, normalizzati rispetto al gene housekeeping e calibrati sul campione controllo (cellule non trattate):

??Ct = ?Ct target-housekeeping(controllo)-?Ct targethousekeeping(cellule trattate)

Assumendo un?efficienza di amplificazione del 100% si ? calcolato il 2<-??Ct >( 2008)

3.4.2 TEST IN VITRO DI PROLIFERAZIONE CELLULARE SU CELLULE HACAT

Il saggio dell?MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) ? un saggio colorimetrico utilizzato per valutare la proliferazione cellulare in vitro, poich? permette di misurare la proliferazione e la vitalit? cellulare attraverso la valutazione dell'attivit? mitocondriale (Mosmann et al., 1983). Questo metodo ? molto utile per misurare la crescita cellulare in seguito al trattamento con agenti mitogeni, stimoli antigenici, fattori di crescita e per studi di citotossicit?.

Il saggio prevede l?utilizzo di un agente ossidante cromogeno, l?MTT, costituito da un sistema policiclico (C18H16BrN5S) dotato di un anello tetrazolico che pu? essere facilmente ridotto dalle deidrogenasi mitocondriali o da altri sistemi di trasporto elettronico, formando, per apertura dell?anello tetrazolico, un composto cromogeno azotato detto formazano. Il formazano forma dei cristalli insolubili nell?ambiente intracellulare, a cui le membrane risultano sostanzialmente impermeabili: ? quindi permessa l?entrata della molecola nella cellula, ma non l?uscita del prodotto se questo ? stato correttamente metabolizzato, cio? se le catene di trasporto elettronico sono ancora metabolicamente attive.

I cristalli di formazano sono successivamente solubilizzati in dimetilsolfossido (DMSO), determinando cos? il viraggio della soluzione da giallo a blu scurovioletto.

Il saggio ? stato condotto seguendo il metodo di Mosmann (1983), con alcune piccole modifiche I cheratinociti umani NCTC2544 sono stati seminati in una piastra da 96 pozzetti alla densit? di 5*10<4 >cellule/pozzetto ed incubati a 37?C, al 5% di CO2, fino al raggiungimento dell?80% di confluenza circa.

Successivamente, le cellule sono state incubate per 24-ore con i composti attivi da testare alle seguenti concentrazioni: 1:1000/1:10000/1:100000/ 1:1000000 (in accordo alle concentrazioni riportate in tabella 1). I prodotti sono stati testati in singolo, in coppia e in tripletta.

Le diluizioni sono state preparate a partire da stock in terreno completo, filtrate sterilmente e utilizzando RPMI medium addizionato con 10% di siero fetale bovino (FBS), in presenza di 1% di penicillina e streptomicina.

Cellule non trattate sono state usate come controllo positivo.

Alla fine di tutti i trattamenti, il terreno ? stato prelevato e sostituito con 100 ?L di una soluzione di MTT (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) 0,5 mg/mL in terreno di coltura completo.

Dopo 3 ore di incubazione a 37?C, il terreno ? stato prelevato e i cristalli di formazano sono stati solubilizzati con 100 ?L per pozzetto di DMSO (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA). La piastra, coperta con alluminio, ? stata posta su un agitatore meccanico (Arhos 160 - PBI International, Milano, Italia) a 120 rpm per 15 minuti a temperatura ambiente.

L?assorbanza della soluzione colorata ? stata misurata mediante un lettore spettrofotometrico per micropiastre (BioTek Instruments Inc., BadFriedrichshall, Germania) ad una lunghezza d?onda di 570 nm (lunghezza d?onda di riferimento a 630 nm).

I dati sono stati espressi come percentuale di vitalit? cellulare rispetto alle cellule controllo (ctr), secondo la formula seguente:

% vitalit? cellulare / ctr =(Abs campione / Absctr) *100.

3.4.3 Attivit? anti-biofilm su S. aureus

L?attivit? anti-biofilm dei composti testati ? stata valutata come descritto da Miao et al., 2019, come riduzione dell?adesione del biofilm di S. aureus. La coltura fresca di S. aureus ? stata seminata ad una densit? di 1*10<8 >CFU/well su micropiastre a fondo piatto da 96 pozzetti, con o senza gli estratti e le loro combinazioni.

Le piastre sono state incubate, indisturbate, a 37 ?C per 24h. Dopo 24h, l?attivit? anti-biofilm ? stata valutata mediante il test di vitalit? cellulare dell?MTT come riportato al paragrafo 3.3.5.

I dati sono stati espressi come percentuale di vitalit? cellulare rispetto alle cellule controllo (Ctr), secondo la formula seguente:

% vitalit? cellulare / ctr =(Abs campione / Absctr) *100.

3.4.4 Attivit? anti-biofilm su C. albicans

L?attivit? anti-biofilm dei composti testati ? stata valutata come descritto da Kanchanapiboon et al., 2020. L?attivit? anti-biofilm ? stata valutata per tutti gli stadi del biofilm: adesione, sviluppo del biofilm e biofilm maturo (Figura 1).

Per lo studio dell?attivit? anti-adesione del biofilm una coltura fresca di C. albicans ? stata seminata ad una densit? di 5*10<6 >CFU/well su micropiastre a fondo piatto da 96 pozzetti, con o senza gli estratti e le loro combinazioni. Le piastre sono state incubate, indisturbate, a 37 ?C per 90 minuti. Dopo 90 minuti, l?attivit? anti-biofilm ? stata valutata mediante il test di vitalit? cellulare dell?MTT come riportato al paragrafo 3.3.5. Per lo studio dell?attivit? di inibizione dello sviluppo del biofilm una coltura fresca di C. albicans ? stata seminata ad una densit? di 5*10<6 >CFU/well su micropiastre a fondo piatto da 96 pozzetti, con o senza gli estratti e le loro combinazioni. Le piastre sono state incubate, indisturbate, a 37 ?C per 90 minuti per favorire l?adesione delle cellule e successivamente le cellule non adese sono state allontanate mediante lavaggi in PBS. Al termine dei lavaggi si ? proceduti all?incubazione con gli estratti e le loro combinazioni a 37 ?C per 24h. Al termine dell?incubazione l?attivit? antibiofilm ? stata valutata mediante il test di vitalit? cellulare dell?MTT come riportato al paragrafo 3.3.5.

Per lo studio dell?attivit? di inibizione sul biofilm maturo una coltura fresca di C. albicans ? stata seminata ad una densit? di 5*10<6 >CFU/well su micropiastre a fondo piatto da 96 pozzetti e le cellule sono state incubate, indisturbate, a 37 ?C per 24h per favorire lo sviluppo del biofilm. Al termine delle 24h si ? proceduti all?incubazione con gli estratti e le loro combinazioni per ulteriori 24h. Al termine dell?incubazione l?attivit? anti-biofilm ? stata valutata mediante il test di vitalit? cellulare dell?MTT come riportato al paragrafo 3.3.5.

I dati di vitalit? sono stati espressi in tutti i casi come percentuale di vitalit? cellulare rispetto alle cellule controllo (Ctr), secondo la formula seguente:

% vitalit? cellulare / ctr =(Abs campione / Absctr) *100.

3.4.5 ANALISI STATISTICA

L?analisi statistica ? stata effettuata mediante test t di Student utilizzando il software Graphpad (versione

7.00 per Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com)

4. RISULTATI

4.1 Test in vitro in modello di co-infezione delle cellule HACAT con C. albicans ( 2020) o S. aureus

In figura 2 sono riportati i dati di espressione genica del marcatore TNF-alfa dopo 24 ore di incubazione con i composti in analisi e C. albicans.

Nel controllo positivo (cellule trattate con C. albicans) si registra un significativo aumento di TNF-alfa.

La riduzione maggiore dell?espressione genica di TNF-alfa si evidenzia in presenza del trattamento con la COMBINAZIONE TROSYD ACTIVE MIX3 (1:1000) e tale effetto ? ritrovato sinergico rispetto alle altre combinazioni testate.

La Fig. 2 illustra Grafici a barre relativi all?espressione genica di TNF-? in cellule HACAT coinfettate con C. albicans e trattate con la composizione contenente le tre componenti attive estratto di Sphilantes, cacao e zinco e con i singoli componenti.

L?espressione genica di TNF-? nelle cellule HACAT ? stata valutata mediante qRT-PCR. Le cellule sono state co-infettate con C. albicans e trattate con gli estratti in singolo, in coppia o tripletta e incubate a 37?C per 24h, 5%CO2. RPMI completo (Controllo); RPMI con C. albicans (Controllo positivo). I valori rappresentano la Media?SEM di due esperimenti condotti in duplicato.

* (p<0,05).

In figura 3 sono riportati i dati di espressione genica del marcatore E-caderina dopo 24 ore di incubazione con i composti in analisi e C. albicans.

Nel controllo positivo (cellule trattate con C. albicans) si registra una significativa diminuzione di E-cadherin. L?incremento maggiore dell?espressione genica di E-cadherin si evidenzia in presenza del trattamento con la COMBINAZIONE TROSYD ACTIVE MIX3 (1:1000) e tale effetto ? ritrovato sinergico rispetto alle altre combinazioni testate.

In particolare la Fig. 3 illustra un grafico relativo ll?espressione genica di E-caderina. L?espressione genica di E-caderina nelle cellule HACAT ? stata valutata mediante qRT-PCR. Le cellule sono state co-infettate con C. albicans e trattate con gli estratti in singolo, in coppia o tripletta e incubate a 37?C per 24h, 5%CO2. RPMI completo (Controllo); RPMI con C. albicans (Controllo positivo). I valori rappresentano la Media?SEM di due esperimenti condotti in duplicato. * (p<0,05), **(p<0,01).

In figura 4 sono riportati i dati di espressione genica del marcatore KRT15 (Cheratina 15) dopo 24 ore di incubazione con i composti in analisi e C. albicans. Nel controllo positivo (cellule trattate con C. albicans) si registra una significativa diminuzione di KRT15. L?incremento maggiore e significativo dell?espressione genica di KRT15 si evidenzia in presenza del trattamento con la combinazione MIX3 (1:1000) e tale effetto ? ritrovato sinergico rispetto alle altre combinazioni testate.

In particolare la Fig. 4 illustra un grafico relativo all?espressione genica di KRT15. L?espressione genica di KRT15 nelle cellule HACAT ? stata valutata mediante qRT-PCR. Le cellule sono state co-infettate con C. albicans e trattate con gli estratti in singolo, in coppia o tripletta e incubate a 37?C per 24h, 5%CO2. RPMI completo (Controllo); RPMI con C. albicans (Controllo positivo). I valori rappresentano la Media?SEM di due esperimenti condotti in duplicato.

* (p<0,05), **(p<0,01).

In figura 5 sono riportati i dati di espressione genica del marcatore Beta-tubulina dopo 24 ore di incubazione con i composti in analisi e C. albicans.

Nel controllo positivo (cellule trattate con C. albicans) si registra una significativa diminuzione della Beta- tubulina.

La maggiore e significativa riduzione dell?espressione genica della Beta-tubulina si evidenzia in presenza del trattamento con la combinazione a tre componenti dell?invenzione (1:1000) e tale effetto ? ritrovato sinergico rispetto alle altre combinazioni testate.

In particolare la Fig. 5 illustra un grafico relativo all?espressione genica della Betatubulina. L?espressione genica della Beta-tubulina nelle cellule HACAT ? stata valutata mediante qRT-PCR. Le cellule sono state co-infettate con C. albicans e trattate con gli estratti in singolo, in coppia o tripletta e incubate a 37?C per 24h, 5%CO2. RPMI completo (Controllo); RPMI con C. albicans (Controllo positivo). I valori rappresentano la Media?SEM di due esperimenti condotti in duplicato. * (p<0,05), **(p<0,01).

In figura 6 ? riportata la crescita della C. albicans in presenza degli estratti e della combinazione degli stessi. Le curve sono ricavate dalla misurazione dell?area (?m<2>) coperta da C. albicans al T0, dopo 120 min e dopo 1440 minuti.

La riduzione maggiore dell?area coperta da C. albicans si evidenzia in presenza del trattamento con la combinazione dell?invenzione (1:1000) e tale effetto ? ritrovato sinergico rispetto alle altre combinazioni testate.

In particolare, nella acclusa Fig. 6 la crescita della C. albicans ? espressa come area (?m<2>) coperta dal fungo. Le immagini sono state acquisite a T0, dopo 120 minuti e dopo 1440 min, tramite un microscopio di fase invertito ad un ingrandimento 4X.

In figura 7 sono riportati i dati di espressione genica del marcatore KRT15 dopo 24 ore di incubazione con i composti in analisi e S. aureus.

Nel controllo positivo (cellule trattate con S. aureus) si registra un significativo aumento di KRT15.

La riduzione maggiore dell?espressione genica di KRT15 si evidenzia in presenza del trattamento con la combinazione a tre componenti (1:1000) e tale effetto ? ritrovato sinergico rispetto alle altre combinazioni testate.

In particolare, la Fig. 7 illustra un grafico rappresentativo dell?espressione genica della KRT15. L?espressione genica della KRT15 nelle cellule HACAT ? stata valutata mediante qRT-PCR. Le cellule sono state co-infettate con S. aureus e trattate con gli estratti in singolo, in coppia o tripletta e incubate a 37?C per 24h, 5%CO2. RPMI completo (Controllo); RPMI con S. aureus (Controllo positivo). I valori rappresentano la Media?SEM di due esperimenti condotti in duplicato. * (p<0,05), **(p<0,01).

4.2 Test in vitro di proliferazione cellulare su cellule HACAT

Nelle figure 8-10 sono riportati i dati di proliferazione rispettivamente a 24, 48 e 72h sulle cellule Hacat trattate con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL;

,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate rappresentano il controllo negativo.

Dopo 24h e 72h di trattamento (Figura 8 e 10) nessuno degli estratti a nessuna delle concentrazioni e delle combinazioni testate ha un effetto citotossico. A 48h le concentrazioni pi? elevate di Cacao (16?g/mL) e Zinco (4?g/mL) esplicano una significativa (p<0,05) attivit? citotossica sulle cellule HACAT. Questo ? vero anche per le due combinazioni pi? elevate di Sphilantes e Zinco (Figura 9).

Dopo 24h di trattamento si registra un significativo (p<0,05) effetto sinergico degli estratti a tutte le diluizioni testate rispetto ai singoli estratti e alle combinazioni in coppia (Figura 8).

Dopo 48h di trattamento si registra un significativo (p<0,05) effetto sinergico degli estratti alle diluzioni pi? concentrate (1:1000 e 1:10000) rispetto ai singoli estratti e alle combinazioni in coppia (Figura 9).

Dopo 72h di trattamento si registra un significativo (p<0,05) effetto sinergico degli estratti alle diluzioni 1:1000, 1:10000 e 1:100000 rispetto ai singoli estratti e alle combinazioni in coppia (Figura 10).

In particolare la Fig.8 illustra grafici a barre rappresentativi della vitalit? cellulare a 24h. % di vitalit? cellulare su cellule HACAT a seguito del trattamento per 24 con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate (Controllo). * (p<0,05), **(p<0,01).

In particolare la Fig.9 illustra grafici a barre rappresentativi della Vitalit? cellulare a 48h. % di vitalit? cellulare su cellule HACAT a seguito del trattamento per 24 con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate (Controllo). * (p<0,05), ** (p<0,01), ***(p<0,005)

In particolare la Fig.10 illustra grafico a barre rappresentativi della vitalit? cellulare a 48h. % di vitalit? cellulare su cellule HACAT a seguito del trattamento per 24 con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate (Controllo). * (p<0,05), **(p<0,01), *** (p<0,005).

4.3 Attivit? anti-biofilm su S. aureus

In figura 11 sono riportati i dati di adesione del biofilm di S. aureus (espressi come % di vitalit? rispetto al controllo non trattato) in co-trattamento con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate rappresentano il controllo negativo. Una diminuzione della vitalit? cellulare corrisponde ad una maggiore attivit? di contrasto dell?adesione del biofilm da parte dell? S. aureus.

Si riscontra un effetto sinergico con la combinazione delle tre componenti (1:1000) sebbene tutti gli altri trattamenti risultino significativi rispetto al controllo (p<0,05). In particolare la Fig.11 illustra grafici a barre rappresentativi della adesione del biofilm di S. aureus. % adesione del biofilm di S. aureus in co-trattamento per 24 con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate (Controllo). * (p<0,05), **(p<0,01), *** (p<0,005).

4.4 Attivit? anti-biofilm (adesione, sviluppo e biofilm maturo) su C. albicans In figura 12 sono riportati i dati di adesione del biofilm di C. albicans (espressi come % di vitalit? rispetto al controllo non trattato) in co-trattamento con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate rappresentano il controllo negativo. Una diminuzione della vitalit? cellulare corrisponde ad una maggiore attivit? di contrasto dell?adesione del biofilm da parte di C. albicans.

Si riscontra un effetto sinergico solo nel con la combinazione o MIX3 (1:1000) sebbene tutti gli altri trattamenti risultino significativi rispetto al controllo (p<0,05). In particolare la Fig.12 illustra grafici a barre rappresentativi della adesione del biofilm di C. albicans. % adesione del biofilm di C. albicans in co-trattamento per 90 minuti con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate (Controllo). * (p<0,05), **(p<0,01), *** (p<0,005).

In figura 13 sono riportati i dati di sviluppo del biofilm di C. albicans (espressi come % di vitalit? rispetto al controllo non trattato) in co-trattamento con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate rappresentano il controllo negativo. Una diminuzione della vitalit? cellulare corrisponde ad una maggiore attivit? di contrasto dello sviluppo del biofilm da parte di C. albicans.

Si riscontra un effetto sinergico solo nel con la COMBINAZIONE delal miscela a tre componenti, (1:1000) sebbene tutti gli altri trattamenti risultino significativi rispetto al controllo (p<0,05).

In particolare la Fig.13 illustra grafici a barre rappresentativi dello sviluppo del biofilm di C. albicans. % di sviluppo del biofilm di C. albicans in co-trattamento per 90 minuti con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; 16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate (Controllo). * (p<0,05), **(p<0,01), *** (p<0,005).

In figura 14 sono riportati i dati di sviluppo del biofilm di C. albicans (espressi come % di vitalit? rispetto al controllo non trattato) in co-trattamento con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL; ,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate rappresentano il controllo negativo. Una diminuzione della vitalit? cellulare corrisponde ad una maggiore attivit? di contrasto dello sviluppo del biofilm da parte di C. albicans. Si riscontra un effetto sinergico solo con la combinazione dell?invenzione (1:1000) sebbene tutti gli altri trattamenti risultino significativi rispetto al controllo (p<0,05).

In particolare la Fig.14 illustra grafici a barre rappresentativi dello sviluppo di Biofilm maturo di C. albicans. % di vitalit? del biofilm maturo di C. albicans in co-trattamento per 90 minuti con Sphilantes (60ng/mL; 6ng/mL; 6?g/mL; 60?g/mL); Cacao (16ng/mL; 160ng/mL; 1,6?g/mL,16?g/mL) e Zinco (4ng/mL; 40ng/mL; 400ng/mL; 4?g/mL). Gli estratti sono stati trattati in coppie e in tripletta in rapporto 15:4:1 a tutte le concentrazioni testate. Cellule non trattate (Controllo). * (p<0,05),

**(p<0,01), *** (p<0,005).

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composizione comprendente una combinazione di spilantolo o un estratto di Spilanthes acmella che lo contiene con zinco o suo sale, preferibilmente zinco bisglicinato e cacao.
2. 2. Composizione secondo la rivendicazione 1 in cui l?estratto di Spilanthes acmella ? ottenuto per estrazione dall?infiorescenza della piante con un solvente polare protico preferibilmente scelto tra acqua, metanolo, etanolo e loro miscele o un solvente apolare preferibilmente esano.
3. 3. Composizione secondo la rivendicazione 1 o 2 comprendente un ulteriore ingrediente biologicamente attivo scelto tra selenio, valina opzionalmente in forme di sale o estere, vitamina D preferibilmente vitamina D3, ornitina opzionalmente in forma di sale o estere e loro miscele.
4. 4. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 comprendente spilantolo o un estratto di Spilanthes acmella che lo contiene, zinco o suo sale o ossido, cacao, selenio, valina opzionalmente in forme di sale o estere, vitamina D preferibilmente vitamina D3, ornitina opzionalmente in forma di sale o estere.
5. 5. Integratore alimentare comprendente una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 ed un veicolo fisiologicamente accettabile.
6. 6. Uso non terapeutico di una composizione cosmetica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, o di un integratore secondo la rivendicazione 5 per migliorare l?aspetto estetico delle unghie e/o trattare fratture, sfaldamento, fessurazioni, opacizzazione dell?unghia e/o per accelerare la ricrescita delle unghie.
7. 7. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 per l?uso orale o topico nella prevenzione o trattamento di una infezione delle unghie di origine batterica, in particolare da Staphilococcus aureus o fungina in particolare da Candida albicans.
8. 8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 per l?uso orale o topico nella prevenzione o trattamento di traumi o distrofie dell?unghia.
9. 9. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 per l?uso orale o topico nella prevenzione o trattamento di infiammazione dell?unghia e dei tessuti e