KR20100109393A

KR20100109393A - 미토콘드리아의 아코니타제를 자극하는 화장 케어의 방법

Info

Publication number: KR20100109393A
Application number: KR1020100024676A
Authority: KR
Inventors: 까린느 니자르드; 마리엘르 모로; 장-크리스토프 아르샹보
Original assignee: 엘브이엠에이취 러쉐르쉐
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2010-10-08
Also published as: JP6238316B2; KR101786070B1; JP2010241802A; DE102010016243A1; FR2943535B1; US20100266650A1; FR2943535A1; JP2015212295A

Abstract

본 발명은 화장품 제제로서 식물 추출물의 사용에 관한 것이다.
화장품 활성 제제로서 이 추출물은 감귤 속에 속하는 식물 또는 감귤 속에 속하는 적어도 하나인 식물 종의 횡 교배로부터 유래된 잡종으로부터 얻어진다.
본 발명은 피부 상에 노화 신호의 발현을 방지하거나 또는 지연하거나 이들의 효과를 희석하거나 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하는 것을 가능하게 한다.

Description

미토콘드리아의 아코니타제를 자극하는 화장 케어의 방법{Method of cosmetic care stimulating mitochondrial aconitase}

본 발명은 화장품 제제로, 보다 자세하게는 피부에 항-노화 효과를 생성하는 화장품 제제로서 감귤류(Citrus) 종자에 속하는 적어도 하나의 식물, 또는 감귤류 종자에 속하는 적어도 하나의 식물 종의 것과 횡 교배로부터 얻어진 잡종으로부터 얻어진 식물 추출물의 신규한 용도에 관한 것이다.

본 발명은 보다 자세하게는 화장품 활성 제제로서 종자 ×시트로포튜넬라(Citrofortunella)의 추출물, 예를 들어 칼라먼딘(Calamondin)(×Citrofortunella microcarpa)의 추출물에 관한 것이고, 또한 상기 추출물을 포함하는 항-노화 화장품 조성물과 미토콘드리아의 아코니타제의 활성을 자극하고 피부에서 항-노화 효과를 얻기 위한 상기 조성물을 사용하는 화장 방법에 관한 것이다.

노화는 다양한 인자에 의해 현상이다. 노화에 대한 몇 가지의 이론들이 존재하고 있는데, 이들 중에 화학적 본질에 기초한 자유 라디칼과 이들 라디칼의 도처에의 존재에 기초한 이론이 있다 (Harman　D., J.　Gerontol., 1956; 11, 298-300).

반응성 산소 종(reactive oxygen species; ROS)으로 또한 알려진 이들 자유 라디칼은 외인성 유래의 것일 수 있거나 또는 다양한 세포질의 과정을 통해, 특히 미토콘드리아의 호흡 동안에 생산되어 질 수 있다 (Cadenas　E. et al., Free Radic. Biol. Med., 2000; 29, 222-230).

호흡을 하는 동안, 호흡계 사슬에 의해 소비된 적지만 유의성 있는 전체의 산소가 과산화 라디칼 O₂ ² ^-로 전환되어, 다른 더욱 더 반응성 산소 종, 예를 들어 과산화수소수 H₂O₂, 하이드록시 또는 퍼옥시니트라이트 라디칼의 형성을 이끌 수 있다 (상기 인용된 Cadenas　et　al. 참고).

산화적 스트레스의 조건 하에서, 이들 반응성 종의 형성은 단백질, DNA 및 지질에 산화적 손상을 초래하고, 그리고 또한 미토콘드리아 단백질의 발현에 변화를 초래하고 피부를 노화하는 과정으로 기여한다 (Bulteau　et　al., Exp Gerontol, 2006, 41; 653-657).

노화 화의 과정 동안, 세포질의 거대분자의 유지를 위한 시스템의 감소된 효용성과 미토콘드리아에서 ROS들의 생성에서의 일정한 증가가 관찰되었다 (Humphries　et　al., Free Radic Res, 2006; 40, 1239-1243).

현재, 미토콘드리아는 호흡계 사슬에 의해 확립된 점진적인 프로톤의 생성 및 크렙스 회로를 통한 ATP의 생산을 포함하는 많은 세포 기능에서 중요한 역할을 수행한다 (Liu　et　al., J.　Neurochem., 2002; 80, 780-787).

산화적 손상의 누적과 구조적 이형은 미토콘드리아에서 세포의 완전성과 기능화를 위해 요구되는 ATP를 생산하는 그 능력의 점진적인 손실을 초래한다 (Frenzel　et　al., 1984).

아코니타제는 클렙스 회로의 필수적인 미토콘드리아의 효소로, 시트레이트를 이소시트레이트로 전환한다. 또한 이것은 미토콘드리아의 DNA의 보전에 있어서 역할을 수행한다. 아코니타제의 수단에 의해, 이 DNA의 안정성 및 유전성의 형질전환이 따라서 세포의 대사적인 상태에 밀접하게 관련되어 진다 (Chen　et　al., Proc Natl Acad Sci USA, 2007; 104, 13738-13743).

아코니타제의 활성은 그의 철-황 센터 [4Fe-4S]²⁺의 완전성에 의존한다 (Beiner, et　al., Faseb J, 1993; 7, 1442-1449). 산화 제제에 의한 그의 철-황 센터 [4Fe-4S]²⁺의 공격은 아코니타제를 불활성화하는 철-황 센터 [3Fe-4S]⁺의 형성을 초래한다.

미토콘드리아의 아코니타제의 활성의 손실은 산화적 손상 및 세포 노화의 세포질 내의 인디케이터이다. 많은 퇴화적인 질환들이 또한 향-산화적 제제의 준위의 증가와 미토콘드리아에서 아코니타제의 활성에서의 저하에 연관되어 진다 (Bulteau　et　al., Biochemistry, 2003 42, 14846-14855).

아코니타제의 불활성화는 또한 NADH/NAD⁺ 비율에서의 변화를 특별하게 초래한다. 자세하게는, α-케토글루타레이트 디하이드로게나제 및 이소시트레이트 다하이드로게나제에 의한 NADH의 생성은 아코니타제의 활성에 있어서의 저하에 기인하여 클렙스 회로에서 보다 낮아질 것이다 (상기 인용된 Humphries　et　al. 참고; Nulton-Persson et al., J Biol Chem, 2001, 276, 23357-23361). NAD⁺ 축적의 이들 조건 하에서, ROS에서의 증가는 감소된 대사산물의 자동 산화의 양으로 관찰되어 진다. 이러한 불활성화는 또한 손상된 단백질의 축적에 기여하는 단계적 산화 반응을 촉발할 수 있을 것이다 (상기 인용된 Humphries　et　al., 2006 참고).

따라서, 노화 간에 이런 세포 손상의 축적을 방지하고 그리고 이들 ROS들에 의해 손상된 아코니타제의 회복의 과정과 반응성을 증진하기 위해서, 피부 세포에서 미토콘드리아의 아코니타제의 활성의 유의성 있는 정도를 유지하는 것이 필수적이다.

본 발명의 발명자 등은 미토콘드리아의 아코니타제의 활성이 나이에 따른 단백질의 발현에 어떠한 변화 없이 20살 연령의 증여자로부터 얻어진 것에 비교하여 70살 연령의 증여자로부터 얻어진 배양에서 인간 상피 섬유아세포에서의 약 85%가 감소하였다는 것을 입증하였다. 이러한 발견으로부터 출발하여, 이들 노화된 섬유아세포에서의 활성을, 상기 섬유아세포를 감귤류 종자에 속하는 적어도 하나의 식물, 또는 감귤류 종자에 속하는 적어도 하나의 식물 종의 것과 횡 교배로부터 얻어진 잡종으로부터 얻어진 식물 추출물, 특히는 칼라먼딘의 추출물로 처리함에 의해, 젊은 증여자의 섬유아세포에 적용된 이 동일한 처리는 미토콘드리아의 아코니타제의 활성을 변화시키지 않으면서 재확립하는 것이 가능하고 그리고 전적으로 미토콘드리아의 아코니타제를 보호하는 것이 가능하다는 것을 입증하였다.

미토콘드리아의 아코니타제의 활성을 자극하는 이러한 효과는 이 효소가 클렙스 회로에 있어서와 미토콘드리아의 DNA의 보전에 있어서의 그 중심적 역할을 보전하게 하고 또한 피부 세포의 기능성, 특히 대사적 기능성을 보존할 수 있게 한다.

이것은 보다 나이 든 개인의 피부 세포의 미토콘드리아의 아코니타제의 활성의 재확립으로부터 귀결되어, 피부 세포의 노화를 늦추는 효과가 항-노화 화장 효과에 의해 반영되어 진다.

더욱이, 본 발명자 등은 또한 상기 언급된 추출물이 증여자의 나이에 따라 증가하여 이러한 증가는 이전에 미리 정의된 것과 같은 식물 추출물로 이들 세포를 처리함에 의해 전반적으로 역전되어 지도록, 세포질 내에서의 산화된 단백질의 준위에 있어서의 유의성 있는 감소를 가능하게 한다는 것을 입증하였다.

미토콘드리아의 아코니타제의 활성과 연계에 대해 확립되어 지지 않은 본 발명의 추출물의 항산화 활성은 본 발명의 추출물에 특히 유익하기로는 부가적인 특성으로 화장품 분야에 있어서 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위한 화장품 활성 제제로서 특성을 제공한다.

자세하게는 산화된 단백질은 정상적인 단백질과는 다른 광학적 특징을 가진다. 서큘러 디크로이즘(circular dichroism)의 기술은 산화된 단백질에 의해 투과된 빛은 정상 단백질에 의해 투과된 것과는 다르다는 것을 나타낸다 (Friguet et al., FEBS Lett, 1997, 405(1): 21-5). 결론적으로, 산화된 단백질의 축적은 상피 세포 주기의 자유화를 야기함에 의해 피부, 특히 피부 외관에 충격을 주어, 관찰자에 의해 피부의 육안 인지와 그리고 그의 본연의 유전적으로 결정된 착색에서의 손상을 초래한다.

(현재까지 공표되지 않은) 연구는 재생된 피부의 모델 상에 글로스메터(주식회사 "Bossa Nova Technologie"에 의해 공급된 삼바 머신(Samba machine))를 사용하여, 피부에 대한 광의 굴절과 광 굴절에 대한 산화의 영향을 조사에 대한 응모자에 의해 수행되어 졌다. 따라서, 비처리된 피부는 산화되어 진 피부에 비하여 보다 높은 전체 광 굴절을 나타냈다(글로스메터에 의해 측정).

속 ×시트로포튜넬라(Citrofortunella)는 감귤 속의 식물을 금귤 속의 식물과 횡 교배한 것으로부터 유래된 식물 종을 포함한다.

시트로포튜넬라 속에 속하는 식물 종 중에서, 여기에 한정되는 것이 아니지만, 예를 들어 ×시트로포튜넬라 플로리다나(Citrofortunella floridana), ×시트로포튜넬라 마이크로카르파(Citrofortunella microcarpa) 또는 ×시트로포튜넬라 미티스(Citrofortunella mitis)가 언급될 수 있다.

이들 식물 종 중에서, 또한 어느 것에 특히 치우치지 않고 칼라만시(kalamansi) 또는 시트러스 맨듀렌시스(Citrus madurensis)로 언급될 수 있는 칼라먼딘(×시트로포튜넬라 마이크로카르파)이 유익하게 선택되어 질 수 있다.

일본 특허출원 JP 2003-199 527호는 글리세미아 또는 혈압의 증가를 저해하는 음식을 개시하고 있는데, 상기 음식은 포튜넬라 속의 금귤과 감귤의 잡종의 전체 과실의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 일본 특허출원 제JP 2005-029 491호는 시트로포튜넬라 미티스의 과피의 분획 증류를 통해 리모넨을 추출하는 방법을 개시하고 있다.

현재까지, 피부 세포와 미토콘드리아 아코니타제의 산화된 단백질에 대해 감귤 속, 예를 들어 ×시트로포튜넬라 속에 속하는 적어도 하나인 식물 종의 횡 교배로부터 유래된 잡종 또는 감귤 속에 속하는 적어도 하나의 식물로부터 얻어진 식물 추출물, 특히는 칼라먼딘(×시트로포튜넬라 마이크로카르파)의 추출물의 주목할 만한 활성의 개시는 없었다.

따라서 칼라먼딘은 피부의 노화, 특히 피부의 산화적 스트레스의 적용에 따른 노화의 효과를 방지하거나, 늦추거나 또는 희석하기 위한 화장품의 분야, 특별하게는 화장품 조성물에서 화장 활성 제제로서 신규한 활성 제제를 구성한다.

따라서, 본 발명의 주요 목적은 특별하게 화장품학적으로 허용가능한 활성 제제로서, 특히는 피부 상에 항-노화 효과를 생성하는 및/또는 손상된 피부, 특별하게는 자외선 방사에 의해 손상된 피부에 대한 케어링을 위해 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위한 화장품 활성 제제로서, 감귤 속에 속하는 적어도 하나인 식물 또는 감귤 속에 속하는 적어도 하나인 식물 종의 횡 교배로부터 유래된 잡종으로부터 얻어진 식물 추출물의 신규한 용도를 제공하기 위한 것이다.

더욱 특별하게는 본 발명은 신규한 화장품 활성 제제로서 속 ×시트로포튜넬라(Citrofortunella)에 속하는 식물의 추출물, 특히는 칼라먼딘(×시트로포튜넬라 마이크로카르파)의 추출물의 신규한 용도에 관한 것과, 화장품 조성물에서 활성 제제로서의 이들의 사용 및 상기 조성물을 사용하는 화장 케어 방법에 관한 것이다.

본 발명의 주요 목적은 또한 적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 화장품 조성물에서 활성 제제로서 칼라먼딘(×시트로포튜넬라 마이크로카르파)의 추출물의 신규한 용도에 관한 것이다.

이 신규한 용도는 특히는 피부 노화의 신호의 발현을 방지하거나 지연하거나 또는 이들, 특히는 과잉의 ROS에 기인된 손상과 연계된 것을 치료하기 위한 것이거나, 또는 피부 상에 항-노화 효과를 생성하기 위한 것이다.

이 신규한 용도는 또한 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 또는 복원하기 위한 것이다.

본 발명의 주요 목적은 또한 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 상기 조성물을 신체 또는 얼굴의 적어도 관련 부위에 적용함에 의해, 피부 상에 노화 효과를 방지하거나 늦추기 위해 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위한 목적으로 화장품 조성물에 상기 추출물을 사용하는 화장 방법이다.

본 발명의 주요 목적은 또한 항-노화 화장 조성물에 활성 제제로서 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위한 화장 조성물에 활성제제로서 칼라먼딘 추출물의 사용을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은 또한 화장 조성물에 활성 제제로서 상기 추출물의 용도, 및 피부의 노화 신호의 발생을 방지하거나 또는 지연하거나 또는 이들의 효과를 희석하거나 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위해 상기 조성물을 사용한 화장 케어 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 특별하게는 상기 언급된 화장 케어를 수행하기 위하여 상기 추출물을 사용하는 화장 케어 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 일 대상은 화장품학적으로 허용가능한 활성 제제로서, 보다 특별하게는 피부 상에 항-노화 효과를 생성하는 및/또는 손상된 피부, 특별하게는 자외선 방사에 의해 손상된 피부에 대한 케어링을 위해 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위한 활성 제제로서, 감귤 속에 속하는 적어도 하나의 식물 또는 감귤 속에 속하는 적어도 하나인 식물 종의 횡 교배로부터 유래된 잡종으로부터 얻어진 식물 추출물의 신규한 용도에 관한 것이다.

특히 바람직한 잡종 중에서는 금귤 속에 속하는 식물 종과 감귤 속의 식물 종의 횡 교배로부터 기인하는 속×시트로포튜넬라에 속하는 것이고, 그리고 더욱 특히는 칼라먼딘(×시트로포튜넬라 마이크로카르파)이다.

본 발명의 다른 대상은 보다 특별하게는 피부 상에 항-노화 효과를 생성하는 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위한 화장품 활성 제제로서, 칼라먼딘 추출물의 신규한 용도에 관한 것이다.

추출물의 제조를 위해 사용된 식물 물질은 전체 식물이거나 또는 뿌리, 근경(땅속 줄기) 또는 대기중의 부분, 특히 줄기, 잎, 꽃, 씨앗, 과실 또는 꽃봉오리와 같은 식물의 일 부분일 수 있다.

유익하기로는 상기 언급된 종의 하나의 과실 전체 또는 과실의 일부로부터 형성되어 질 수 있다.

바람직한 추출물은 칼라먼딘 과실로부터 얻어진다.

추출 단계 전에 그 자체로는, 식물 물질은 건조되어 지거나 및/또는 마쇄되거나, 또는 대안적으로 신선하게 수확되어 진 상태 그대로 일 수 있다.

추출물은 이 기술분야에서 공지된 다양한 추출 공정을 통하여 제조되어 질 수 있다.

추출은 용매 없이, 예를 들어 압착에 의해, 특히는 과실의 전부 또는 과실의 일 부분을 압착함에 의해 수행되어 질 수 있다.

그러나, 추출은 유익하기로는 선정된 식물 재료를 극성 용매 또는 극성 용매의 혼합물과 접촉되는 상태로 둠에 의해, 특히는 상기 식물 재료를 적절한 용매나 용매 혼합물에 침지, 매서레이션 또는 디콕션에 의해 수행되어 진다.

특별하게 유익한 일 변형형태에 따르면, 추출물은 이들 식물의 과일 쥬스로부터, 특히는 압착함에 의해, 바람직하기로는 수성 배지인 극성 용매 또는 극성 용매의 혼합물과 접촉되는 상태로 둠에 의해 얻어진다.

추출을 위해 사용된 극성 용매 또는 극성 용매의 혼합물은 유익하기로는 물, C1-C4 알코올, 특히는 에탄올이나 부탄올에서 선택된 것, 글리콜로서 바람직하기로는 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 그리고 폴리글리세롤-3에서부터 선택된 글리콜, 및 이들의 혼합물로부터 선택되어 진다.

바람직한 혼합물은 적어도 하나의 알코올 및 물의 혼합물이거나 또는 적어도 하나의 글리콜 및 물의 혼합물로, 이들은 적어도 10%　v/v의 알코올 또는 글리콜을 포함하고 잔여분은 물로 구성되어 진다.

본 발명의 다른 특정한 변형형태에 따르면, 용매 혼합물은 50/50 v/v의 비율의 물과 에탄올의 혼합물 또는 50/50 v/v의 비율의 물과 부틸렌 글리콜의 혼합물을 포함한다.

일 바람직한 실시형태에 따르면, 추출은 유익하기로는 수성 또는 물-글리콜 배지에서 수행되어 진다.

추출은 또한 선택적으로 식물 재로 또는 식물 추출물을 부분적으로 또는 전체적으로 탈색하거나 또는 정제하기 위한 처리로, 예를 들어 무극성 용매 또는 용매 혼합물의 용액과 식물 재로 또는 추출물의 처리를 통해 또는 활성탄 입자와 추출물이 접촉되도록 하거나 또는 대안적으로 임계적 이산화탄소(CO₂)로 처리함을 통한 탈색이나 정제 처리로 구성되는 부가적인 단계를 임의적으로 포함할 수 있다.

추출물은 추출 용매의 부분적 또는 완전한 제거의 단계에 의해 완성되어 질 수 있다. 첫 번째 경우에 있어서는, 추출물은 일반적으로 유기용매의 유의성 있는 양의 유리 수성 농축액이 얻어질 때까지 농축되어 지고, 그리고 두 번째 경우에, 건조 잔사가 얻어진다. 대안적으로, 추출 단계로부터 산물은 동결-건조되어 질 수 있거나 또는 분말의 형태로 원자화되어 질 수 있다.

본 발명에 따른 화장품 조성물에서, 얻어진 대로 분말의 형태로 사용되어 질 수 있거나, 또는 극성 용매 또는 극성 용매의 혼합물에 분산되거나 또는 용해되어 질 수 있거나 또는 대안적으로 고형 지지체 상에 흡착되어 질 수 있다.

본 발명의 일 실시 변형 형태에 따르면, 상기 언급된 활성 제제는 화장품 조성물에 국소적으로 합체되어 전달되어 지고, 상기 활성 제제는 피부의 노화 신호를 방지하거나 지연하는, 또는 이들의 효과를 희석하는; 및/또는 손상된 피부, 특별하게는 자외선 방사에 의해 손상된 피부에 대한 케어링을 위해; 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위해 유효한 양으로 존재한다.

상기 활성 제제는 또한 적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 부형제와 혼합되어 질 수 있고, 그리고 이 조성물을 신체 또는 얼굴의 피부에 적용함에 의해 사용되어 질 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 활성 제제와 적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 화장품 조성물에 대한 것으로, 상기 활성 제제는 감귤 속에 속하는 적어도 하나의 식물 또는 감귤 속에 속하는 적어도 하나인 식물 종의 횡 교배로부터 유래된 잡종, 특히는 속×시트로포튜넬라에 속하는 식물로부터 얻어진 식물 추출물임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장품 조성물은 희망하는 효과를 얻기에 유효한 양의 본 발명의 추출물을 포함한다.

본 발명의 어떤 측면에 대해, 용어 "유효한 양"은 피부의 노화 신호의 발현을 방지하거나 또는 지연하거나 또는 이들의 효과를 희석하거나; 및/또는 손상된 피부, 특별하게는 자외선 방사에 의해 손상된 피부에 대한 케어링을 위해; 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기에 필요한 양과 적어도 동일한 양을 의미하는 것이다.

본 발명에 따른 화장품 조성물은 유익하기로는 활성 제제로서 조성물의 0.001 내지 5중량%, 바람직하기로는 0.01 내지 3중량% 사이로 함유한다.

조성물은 또한 유익하기로는 본 발명의 것에 유사하거나 및/또는 보충하는 화장 효과를 갖는 다른 활성 제제, 특별하게는 피부의 구조의 유지 및/또는 완전성에 참여하는 적어도 하나의 다른 활성 제제 및 특별하게는 안료, 염료, 폴리머, 계면활성제, 유동화제제, 향료, 전해액, pH 조절제, 항산화제 및 보존제 및 이들의 혼합물로부터 선택되어 질 수 있는 적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장품 조성물은, 예를 들어 혈청, 로션, 예를 들어 크림과 같은 에멀젼, 또는 대안적으로 하이드로겔, 바람직하기로는 마스크의 형태로 제형화되어 질 수 있거나, 또는 스틱이나 패치의 형태로 될 수 있다.

다음으로, 본 발명은 피부 노화 신호의 발현을 방지하거나 또는 지연하거나 또는 이들을 치료하기 위한 화장품 활성 제제로서 상기 정의된 것과 같은 활성 제제의 사용에 관한 것으로, 상기 화장품 제제는 피부 세포의 미토콘드리아의 아코니타제의 활성을 자극한다.

본 발명은 또한 피부 노화 신호의 발현을 방지하거나 또는 지연하거나 또는 이들의 효과를 희석하거나 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위한 화장품 조성물의 제조를 위한 본 발명의 화장품 활성 제제의 사용에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명은 피부 노화 신호의 발현을 방지하거나 또는 지연하거나 또는 이들의 효과를 희석하거나 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위한 화장 케어 방법에 관한 것으로, 이 방법은 적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 활성 제제의 유효량의 신체나 얼굴 피부의 적어도 관련 영역에 전달하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 활성 제제는 감귤 속에 속하는 식물 또는 감귤 속에 속하는 적어도 하나인 식물 종의 횡 교배로부터 유래된 잡종, 특히는 속×시트로포튜넬라에 속하는 식물과 더욱 특히는 식물 종 ×시트로포튜넬라 마이크로카르파의 식물로부터 얻어진 식물 추출물이다.

상기 방법은 바람직하기로는, 적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 부형제를 또한 포함하는 화장품 조성물에 합체된 상기 활성 제제가 상기 조성물을 신체나 얼굴 피부의 적어도 하나의 관련 영역에 적용함에 의해 국부적으로 전달되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 케어 방법은 또한 활성 제제의 농도가 화장품 조성물의 0.001 중량% 내지 5 중량% 사이로 됨을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 순수하게 상세한 설명을 목적으로 주어지고 그리고 발명의 범주의 제한을 결코 구성하지 않는 발명의 실시형태의 몇 가지 예를 참고로 하여 제공된 다음의 상세한 설명으로부터 보다 명확하게 되어 질 것이다.

다음의 상세한 설명에서 그리고 특히 실시예에서, 달리 명시하는 바가 없으면 모든 백분율은 중량을 기준으로 하여 주어지는 것이고, 온도는 섭씨 온도이며, 그리고 압력은 대기압이다.

상기와 같이 구성되는 발명의 미토콘드리아의 아코니타제를 자극하는 화장 케어의 방법 및 그 조성물은 특정한 식물의 추출물을 활성 제제로 하여 피부의 항-노화 효과를 달성하는 것을 가능하게 한다.

도 1은 연령에 따른 미토콘드리아의 아코니타제 활성의 변동에 관한 것으로, 실시예 2에 따라 20살 및 70살 증여자로부터 얻어진 인간 섬유아세포를 배양하고 처리한 후 측정되었다: (A) 미토콘드리아의 아코니타제 활성의 측정(참고. 실시예　2, 3 문단); (B) 웨스턴 블럿팅(Western blotting; WB)에 의한 미토콘드리아의 아코니타제 어세이(참고. 실시예　2, 4 문단).
도 2는 연령에 따른 미토콘드리아의 아코니타제의 활성 사이트의 변동에 관한 것으로, 실시예 2에 따라 20살 및 70살 증여자로부터 얻어진 인간 섬유아세포를 배양하고 처리한 후 측정되었다: 이뮤노일렉트로포커싱(immunoelectrofocusing; IEF)과 그런 다음 웨스턴 블럿팅에 의해 미토콘드리아의 아코니타제의 형태의 분리 및 측정(실시예　2, 문단　5).
도 3은 미토콘드리아의 아코니타제 활성의 측정에 관한 것으로, 실시예 2에 따라 배양되고, 그런 다음 칼라먼딘 추출물 2.5%로 48시간 동안 처리(참고. 실시예　2, 3 문단)된, 20살 및 70살 증여자로부터 얻어진 인간 섬유아세포를 배양한 후 측정되었다.
도 4는 분리된 미토콘드리아 상에 옥시 블럿팅을 통해 산화된 단백질의 검지( 실시예 3)에 관한 것으로, 배양되고, 그런 다음 화장품 활성 제제로 칼라먼딘 추출물 2.5%로 48시간 동안 처리(참고. 실시예　2)된, 20살 및 70살 증여자로부터 얻어진 인간 섬유아세포를 사용하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 자세하게 설명한다.

실시예 　1-시험을 수행하기 위해 사용된 칼라먼딘 추출물의 제조

칼라먼딘(×Citrofortunella　microcarpa)의 추출물은 식물의 과실 전체를 프레싱함에 의해 제조되어 진다.

여과하고 그런 다음 원심분리한 후, 과육은 물과 폴리글리세롤의 혼합물로 추출되어 진다.

얻어진 추출물은 35 내지 45중량%의 고형분을 함유한다. 이 추출물은 얻어진 그대로 실시예 2 및 3의 시험을 위해 수행하기 위해, 그리고 또한 화장품 조성물, 특히는 실시예 4의 것을 제조하기 위해 사용되어 진다.

실시예 　2- 인간 섬유아세포에서 미토콘드리아의 아코니타제 활성의 측정

재료 및 방법

1. 인간 섬유아세포의 배양 및 처리

● 배지 및 시약

섬유아세포 배양 배지

글루코스의 DMEM 1/ml (Gibco)

+ 10% SVF

+ 1% 소디움 피루베이트 100　mM (Gibco)

활성 제제의 보존 용액

보존 용액은 DMEM 배지에 추출 용액을 희석함에 의해 조제되어 진다(중량 %).

- 배지 내에 칼라먼딘 추출물 6중량%, 즉 약 2.4 중량%의 고형분.

a- 세포 배양 및 처리

20살 연령 및 70살 연령의 증여자의 성형외과로부터 얻어진 일차 배양에서 인간 섬유아세포로, 12차 계대에 있는 것.

D0 상에서 아배양

DMEM 배지 (10　ml/dish)에서 세배로 섬유아세포 15.10⁵ 세포/75　cm²의 디쉬.

D5 상에서 처리

보전 용액은 아래에서 언급된 농도를 생성하기 위해 DMEM 배지에 희석되어 진다:

- 배지 내에 칼라먼딘 추출물 2.5중량%, 즉 약 1 중량%의 고형분.

D7 상에서 세포의 회수

미토콘드리아의 준비

PBS로 두 번 수세

얼음 베드 상에서; 2ml의 균질화 완충액에 회수.

b- 미토콘드리아의 분리

32　T75 디쉬가 각 도너에 대해 사용되었다. 합하여진 세포는 pH　7.2 PBS 완충액 (인산나트륨 완충액 pH　7.2 - 0.13　M의 NaCl, 3　mM의 KCl, 8　mM의 Na₂HPO₄ 및 1.4　M의 KH₂PO₄)으로 이회 수세되었고, 그리고 스크랩핑에 의해 탈리되고 그런 다음 4℃에서 5분 동안 1500×g에서 원심분리되었다. 세포 펠렛은 PBS 완충액으로 수세되고, 재원심분리되고 그런 다음 얼음에 보관된다. 펠렛은 냉 균질화 버퍼(0.3　M 만니톨, 0.1% BSA, 0.2　mM EDTA, 10　mM　HEPES, KOH로 pH　7.4로 조정, 펠렛 부피 5배)에 취하여 지고, 그런 다음 2ml 글라스 호모게나이저로 얼음에서 균질화된다. 세포 현탁액은 4℃에서 10분 동안 1000×g에서 원심분리되었다. 상등액은 4℃에서 15분 동안 10 000×g에서 다시 원심분리되었다. 상등액은 시토졸 분획을 포함하고, 그리고 펠렛은 미토콘드리아 분획을 나타낸다. 미토콘드리아 분획은 냉 균질화 버퍼로 이회 수세되어 진다. 단백질 농도는 브래드포드 방법(Bradford method)에 따라 측정되었다.

2. 단백질 어세이　(Bradford method)

a- 캘리브레이션 범위의 준비

BSA 저장 용액: 50㎍/ml (BIORAD; 표준 단백질)

단백질 (㎍/튜브)	BSA(㎕)	H₂O(㎕)
0	0	800
1	20	780
2	40	760
3	60	740
4	80	720
5	100	700
6	120	680
8	160	640

200㎕의 쿠마시 블루(Coomassie　Blue)　G250이 각 튜브에 부가되어 진다. 블루는 저장 용액의 5-배 희석에 의해 즉각적으로 준비되어 진다.

b- 샘플의 제조

-　만일 단백질 농도 >　3　mg/ml이면, 세포 추출물은 100-배 희석되고, 그런 다음 100㎕의 희석물이 취해지고

+ 700㎕의 밀리큐(milliQ) 물

+ 200㎕의 블루

-　만일 단백질 농도 <　3　mg/ml이면, 10㎕의 세포 추출물 취해지고

+ 790㎕의 밀리큐(milliQ) 물

+ 200㎕의 블루

c- 샘플 어세이

샘플은 볼텍싱에 의해 균질화되어 지고, 5분 동안 정치한 후 그런 다음 광학 밀도가 595　nm의 파장에서 스펙트로포토메터에서 판독되어 진다.

3.　미토콘드리아의 아코니타제 활성의 어세이

a- 시약

- 25　mM pH 7.5 TRIS 버퍼(Sigma)

- 소디움 시트레이트 (Sigma)

- 이소시트레이트 디하이드로게나제 (Sigma)

- MnCl₂ (Sigma)

b- 미토콘드리아의 아코니타제 활성 어세이의 원리

미토콘드리아의 아코니타제 활성은 0.2　mM NADP⁺, 5　mM의 소디움 시트레이트 및 25　mM Tris-HCl 플러스 0.6　mM MnCl₂ 및 0.05% 트리톤(Triton)　X-100 내의 일 단위/ml의 이소시트레이트 디하이드로게나제를 포함하는 반응 배지에 340　nm에서 흡광도를 측정함에 의해 정량화되었다.

어세이를 위해, 50㎍의 미토콘드리아 단백질이 25℃에서 1.0ml의 반응 배지에 부가되었다. 340　nm에서의 측정이 5-분 간격으로 1　cm 세포에 기록되어 지고 그리고 미토콘드리아의 아코니타제 활성이 약 5분에 걸쳐 340　nm에서 흡광도에서의 직선형 증가에 따라 계산되었다. 활성은 6.22×10³　M^-1　cm^-1의 NADPH에 대한 몰 소광계수를 사용함에 의해, 그리고 일 분자의 NADPH 내로 일 분자의 시트레이트의 이소시트레이트 디하이드로게나제에 의한 전환을 인정함에 의해 얻어졌다.

4. 웨스턴 블럿팅(WB)에 의한 미토콘드리아의 아코니타제 어세이

a- 어세이 원리

단백질 일렉트로포러시스가 1　mm 내지 1.5　mm 두께의 폴리아크릴아미드 미니젤에서, 변성 및 환원적 조건하에서, 램리 방법에 따른 불연속적인 버퍼에서 수행되었다 (Nature, 1970; 227, 680). 12% T 및 2.7% C를 함유하는 겔은 낮은 분자량의 단백질(20 내지 120　kDa)이 분리되도록 한다. 8% T 및 2.7% C를 함유하는 겔은 높은 분자량의 단백질(35 내지 250　kDa)이 분리되도록 한다.

겔을 생성하기 위해 요구되어 지는 용액은 첨부 A에 나타냈다.

분리 겔

겔은 적어도 전개 두 시간 전에 부어 진다.

겔을 따르는 것은 농축화 젤에 대하여 제공된 콤브의 바닥으로부터 약 0.5　mm까지 피펫을 사용하여 수행되어 진다. 무수 에탄올이 표면에 부가되어 일정한 기저 라인을 얻는다(±1　ml/gel).

농축화 겔

에탄올이 제거되어 진다. 2.5　ml의 겔은 폴리에틸렌 파스퇴르 트랜스퍼 피펫(Biorad)을 사용하여 부어지고 그런 다음 콤브가 삽입되어 진다. 겔은 한 시간 후에 중합화되어 진다.

b- 샘플의 제조

미토콘드리아 단백질은 환원적 램리 조건 하에서 12% T를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동되어 진다. 샘플(25 내지 40㎍의 단백질)은 증착 완충액에서 100℃에서 5분 동안 환원되어 진다. 샘플의 증착과 머커 후, 전개는 50　mM Tris-HCl, 100　mM 글리신, 0.1% SDS 함유 2　mM EDTA pH　8.4 버퍼에서 1시간 동안 200V에서 수행되어 진다.

c- 전기영동

증착

샘플은 95℃에서 5분 동안 가열되어 진다.

증착되어 지는 부피는 희망하는 단백질의 양에 의존한다(최대 부피 = 1mm 겔에 대해 25㎕ 그리고 1.5mm 겔에 대해 40㎕). 참고 양은 10㎕에 상응하는, 10㎕의 단백질이다; 이것은 그런 다음 타겟 단백질의 발현에 따라 적용되어 진다.

콤브가 제거되어 진다. 200ml의 1× 전개 완충액이 겔 상에, 두 개의 겔 사이의 중앙 분획 안에, 그런 다음 쿼터 레벨까지 탱크 안으로 부어 진다.

샘플은 마이크로피펫 상에 끼워진 테이퍼된 팁을 사용하여 그리고 10㎕의 미리 염색된 저분자량 대조군(Biorad, 미리 염색된 SDS-PAGE 스탠다드 로우 레인지) 또는 고분자량 대조군(Amersham, Full Range Rainbow)을 사용하여 증착되어 진다.

전개

전기 영동은 실온에서, 200V에서 수행되어 졌다. 이 전기영동은 전위 전개가 겔에 남아 있을 때(약 40분 동안 전개) 종료되어 진다.

멤브레인 상에 단백질의 반-건조 전이

두 가지 두께 시트의 여과지(Biorad) 및 셀룰로스 멤브레인(Biorad)이 토우빈 전이 완충액(Towbin transfer buffer)(PNAS, 1979, 76 (9) 4350-4) (첨부　B 참고)에 침지되었다.

반-건조 전이 기구(Biorad)에서, 젖은 두께의 필터 페이퍼가 어노드 상에 위치되어 진다.

일단 전개가 완료되어 지면, 농축화 젤이 제거되어 지고 그리고 분리 젤이 셀룰로스 멤브레인에 장착되어 진다. 젤을 포함하는 멤브레인은 여과지의 시트 상에 증착되어 진다. 여과지의 제 이차 시트는 겔 상에 증착되어 진다.

"샌드위치"의 제조 동안에, 전이를 방해하지 않도록 하기 위해 유리 막대를 사용하여 어떤 공기 기포를 제거하는데 주의를 기울여야 한다. 장치는 캐쏘드를 구성하는 리드로 닫혀 진다. 단백질 전이는 90분 동안 10V에서 수행되어 진다.

폰슈 레드(Ponceau Red)로 염색

전이의 질을 체크하기 위해, 단백질은 폰슈 레드(Sigma)로 염색되어 진다. 셀룰로스 멤브레인은 밀리큐 물로 린스되어 지고 그런 다음 교반하면서 10분 동안 폰슈 레드의 배쓰에 일단 침지되어 진다. 이것은 그런 다음 컬러화가 단지 단백질 밴드에만 남아있을 때까지 밀리큐 물의 배쓰에서 수회 수세되어 진다. 멤브레인은 플라스틱 백에 위치되어 스캔되어 진다. 단백질 밴드는 전이된 단백질의 전체 양을 결정하기 위해 정량되어 질 수 있다.

비-특이적 결합 사이트의 블럭킹

멤브레인은 PBS-T 완충액 내에 5% 탈지유(Regilait)로 구성된, 비-특이적 결합 사이트를 차단하기 위한 용액(참고, 첨부 B)(20　ml/membrane)에 실온에서 90분 동안 또는 4℃에서 밤 세워 교반되어 진다.

면역검지( Immunodetection )

항체의 최적 희석 및 레퍼런스가 첨부 C에 제공되어 진다.

비-특이적 사이트를 차단한 후, 멤브레인은 즉시 PBS-T에서 린스되어 진다. 이 멤브레인은 4℃에서 밤 세워 또는 실온에서 교반하면서 60분 동안 항체에 의존하여 5% 밀크(m/v)가 있거나 또는 없는 PBS-T에 최적의 농도로 희석된 프라이머리 항체와 접촉되게 위치되어 진다.

이것은 그런 다음 여분의 비-결합된 유리 항체를 제거하기 위해 PBS-T 내에 10분간 3회 빠르게 린스되어 진다. 이것은 그런 다음 실온에서 교반하면서 5% 밀크(m/v) 또는 PBS-T에 희석된 퍼옥시다제에 결합된 적절한 제 이차 항체와 접촉되게 위치되어 진다. 45분 동안 배양한 후, PBS-T 완충액으로 빠르게 2회 린스되고 그런 다음 5분 동안 5회 수세되고 최종적으로 1X PBS로 수세된다. 배수 후, 단백질 면이 위로 향하도록 하여 부엌에서 사용되는 크린 랩(SARAN) 상에 놓여 진다.

멤브레인은 퍼옥시다제 기판으로서 루미놀을 사용한, 아주 민감한 케모루미네슨스 디텍션 키트(Amersham; ECL Western　blotting)를 사용하여 벗겨진다. 퍼옥시다제와 앰플리파이어의 작용 하에서, 루미놀은 산화되어 지고 그리고 일시적인 여기 상태로 통과한다. 기저 상태로의 회귀는 광자의 방출에 의해 발생하여, 멤브레인 상에 위치된 오토라디오그라피 필름을 친다.

디텍션 키트의 두 용액의 각각 1ml, 즉 2ml인 멤브레인을 덮기 위해 요구되는 최소한의 부피가 함께 혼합되어 진다. 혼합물은 바로 균일하게 멤브레인 상에 부어지고, 그리고 실온에서 정확하게 일분 동안 접촉되어 진다. 드레인된 멤브레인은 사란(Saran) 랩 필름에 싸여 지고 그리고 빛으로부터 보호된 카셋트에 위치되고, 그런 다음 미리 플래쉬된 오토라디오그라피 필름(Amersham, Hyperfilm ECL)으로 덮혀 진다. 5분 동안 노출 후, 오토라디오그라피 필름은 벗겨진다. 새로운 필름이 만일 필요하다면 희망하는 신호를 최적화하기 위해 노출되어 질 수 있다(노출 시간 1시간까지). 밴드는 겔 어날리스트 3.01 소프트웨어(Gels Analysts 3.01 software)의 수단에 의해 정량되어 진다.

5. IEF 에 의한 미토콘드리아의 아코니타제 어세이

이 기술은 미토콘드리아의 아코니타제의 세 가지 형태를 이들의 등전점에 따라, 활성형 [4Fe-4S]²⁺, 비활성형 [3Fe-4S]⁺ 및 아포엔자임형의 분리를 가능하게 한다.

50㎍의 미토콘드리아 단백질이 pH　3-10　IEF 겔 (Biorad) 상에 증착되어 진다. 전개는 100V에서 1시간 동안; 250V에서 1시간 및 500V에서 30분 동안 표준 시스템(Biorad)으로 수행되었다. 전개 후, 겔은 니트로셀룰로스 멤브레인 상에서 전이되어 지고, 그리고 항-미토콘드리아의 아코니타제 웨스턴 블럿팅은 문단 4에서 기술된 프로토콜에 따라 수행되었다.

결과

미토콘드리아의 아코니타제 활성은 이들 세포 배양으로부터 미토콘드리아를 분리한 후 측정되었다. 노화에 따른 미토콘드리아의 아코니타제 활성에서의 감소가 입증되었다.

이들 측정은 20살 연령의 증여자와 비교하여 70살 연령 증여자의 미토콘드리아에서 미토콘드리아의 아코니타제 활성의 대략적인 85% 감소를 나타냈다(도 1 참고).

그러나, 효소의 발현에 있어서 유의성 있는 차이점, 즉 젊은 및 늙은 섬유아세포에 존재하는 효소의 양에서의 유의성 있는 차이점은 없다( 도 1 참고).

노화된 섬유아세포에서 입증된 미토콘드리아의 아코니타제 활성에서의 감소가 효소의 Fe-S 센터에 산화적 손상에 기인하지 않는지를 체크하기 위해, 효소의 세 가지 구조 형태(아포엔자임, 활성형 및 비활성형)가 이들의 등전점에 따라 등전점 전기영동(IEF)에 의해 분리되어 진다. 이 방법을 사용하여, 나이에 따른 차이가 아포엔자임에서는 입증되었지만, 그러나 다른 형태에서는 아무런 차이가 없었다(도 2 참고).

본 발명자 등은 미토콘드리아의 아코니타제의 활성이 배양에 있어서 인간 상피 섬유아세포에 노화로 감소하였다는 것을 밝혀냈다. 활성에 있어서의 이 감소는 단백질의 발현에 있어서 노화에 따른 변화에 의해 수반되지 않는다.

이 결과로부터 출발하여, 본 발명자 등은 다른 나이의 이들 증여자들로부터 얻어진 상피 섬유아세포에서의 미토콘드리아의 아코니타제 활성에 대해 시험된 활성 제제의 효과를 특정하였다(도 3 및 표 2 참고).

이들 결과는 젊은 증여자(20살 연령)로부터 비처리된 섬유아세포에서 미토콘드리아의 아코니타제 활성에 대해 백분율로 표현되었으며, 이들은 100% 수준을 구성한다.

20살 및 70살 연령 증여자로부터 섬유아세포의 미토콘드리아의 아코니타제 활성

(%)	비처리	칼라먼딘(Calamondin)
20살 연령	100	97
70상 연령	18	108

이들 결과는 이들 추출물로의 처리는 산화제의 작용에 대해 미토콘드리아의 아코니타제를 보호하는 것을 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 그러나, 이들 추출물로 20살 연령의 증여자로부터 섬유아세포를 처리한 48시간 후에 미토콘드리아의 아코니타제의 유의성 있는 활성화는 관찰되지 않았다. 한편, 70살 연령의 증여자로부터의 섬유아세포의 동일한 처리는 효소의 전체적인 보호를 초래하였다.

실시예 　3: 옥시 블럿팅에 의한 산화된 단백질의 발견

a- 원리

ROS 또는 글리케이션/글리코옥시데이션 또는 리포퍼옥시데이션과 같은 다른 산화 메카니즘의 수단에 의해 단백질 사슬 내로 도입된 카르보닐 기(산화 마커)가 사이트-특이적 메카니즘에 따라 밝혀졌다.

사슬 내의 카르보닐 기는 2,4-디니트로페닐히드라진(DNPH)과 반응하여 히드라존 유도체를 제공한다. DNP-유래 샘플이 전기영동에 의해 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리되었다. 분리한 다음 웨스턴 블럿팅에 대한 것으로 미트로셀룰로스 멤브레인 상에 전이가 뒤따랐다. 멤브레인은 그런 다음 카르보닐 기를 담지한 단백질에 결합한 분자 DNP에 특이적인 제일 항체의 존재 하에 배양되어 진다. 다음 단계는 퍼옥시다제에 커플되어 진 항-프라이머리 항체(안티-래빗) 제이 항체와 배양이다. 발견은 웨스턴 블럿팅에서 사용된 동일한 시약을 사용하여 수행되었다.

b- 프로토콜

사용된 모든 시약은 옥시블럿 키트(Appligene-Oncor, France)로부터의 것이다.

샘플의 변성

실시예 2(재료 및 방법, 문단 1)에 따라 얻어진 5㎕의 세포 추출물에 포함된 미토콘드리아의 용해물로부터 유래하는 2㎍의 증착물에 상응하는 15 내지 20㎍ 사이 양의 단백질이 사용되었다. 10㎕의 1×DNPH가 부가되어 지고, 5㎕의 12% SDS의 부가가 따르고; 이 혼합물은 실온에서 15분 동안 교반되었다. 7.5㎕의 중화 용액 및 1×샘플 버퍼가 부가되어 진다. 이 샘플은 바로 증착되어 진다.

단백질은 최종적으로 12% SDS 아크릴아미드 상에서 전기영동에 의해 분리되고 그리고 니트로셀룰로수 멤브레인 상에서 전이되어 진다.

항원-항체 반응

카르보닐 유도체들이 150-배 희석된 안티-DNP 래빗 프라이머리 항체와 안티-래빗 제이 항체로 발견되어 진다. ECL 키트(Amersham)가 그 기판의 보조로 퍼옥시다제를 발견하기 위해 사용되었다.

결과

연령에 따라 산화된 단백질에서의 증가가 관찰되었다( 도 4). 그러나, 칼라먼딘 추출물로 나이 든 섬유아세포의 처리는 젊은 섬유아세포의 것에 상응하는 산화된 단백질의 수준으로 회귀하는 것을 가능하게 하였다. 이들 결과는 상기 언급된 추출물이 피부의 산화된 단백질 상에 항산화적 활성을 갖는다는 것을 증명한다.

화장품 제형의 실시예

실시예 　4: 칼라먼딘 과실의 추출물을 포함하는 화장품 조성물

실시예 1로부터 얻어진 추출물이 그대로 아래의 화장품 조성물 형태에 사용되었다:

- 칼러먼딘 또는 칼라먼시스의 식물 추출물 (실시예 1) 0.1%

- 계면활성제 (Arlacel^ⓡ 165 VP) 5%

- 95% 세틸 알코올 1%

- 스테아레이트 알코올 1%

- 밀납 1.5%

- 오일 (Parleam^ⓡ) 8.5%

- 글리세라이드 트리카프레이트/카프릴레이트 3%

- 실리콘 오일 (Dimethicone　100　CS) 1%

- 폴리머 (Keltrol^ⓡ) 0.35%

- 수산화나트륨 0.04%

- 테트라소디움 EDTA 분말 0.1%

- 보존제 0.5%

- 물 잔량 100

화장품 조성물은 하나 또는 그 이상의 단계에서 다양한 조성분을 함께 혼합함에 의해, 이 기술 분야의 통상인에게 잘 알려진 통상적인 방법으로 제조되어 진다.

이 조성물은 이전에서 이미 기술되어 진 항-노화 화장 효과를 얻기 위하여 그리고 밝게 빛나는 컴플렉션을 회복하기 위해 몇 주 동안 매일 안면에 적용되어 질 수 있을 것이다.

첨부 A

I　-　불연속 완충액에 있어서, 변성 및 환원적 조건 하에서 전기영동 겔을 위해 사용된 완충액 및 용액

모노머 용액:

아크릴아미드/비스아크릴아미드, 30% T, 2.67% C (Biorad)

용해 겔 버퍼: Tris-HCl 1.5M pH　8.8

- 100ml의 증류수 당 18.15g의 Tris 염기(시그마)
- 12N HCl로 8.8로 pH 보정

농축화 겔 버퍼: 0.5M Tris-HCl pH　6.8

- 100ml의 증류수 당 6g의 Tris 염기
- 12N HCl로 6.8로 pH 보정

10X 전개 버퍼: 0.25M Tris pH 8.3, 1.92M 글리신; 1% SDS

- Tris 염기 12g
- 글리신(리서치 오르가닉 사) 57.6g
- 10% SDS(시그마) 40ml
- 증류수 잔량 400ml

암모니움 퍼설페이트: (NH₄)₂S₂O₈: (시그마) 10% (w/v)에서, 즉 100　mg/ml 2X　램리 환원적 샘플 버퍼: 0.06M Tris-HCl pH　6.8; 2.3% SDS; 10% 글리세롤; 0.02% 브로모페놀 블루

- pH 6.8 0.5M Tris 농축화 겔 버퍼 6.25ml
- 10% SDS(시그마) 11.50ml
- 글리세롤 5ml
- 증류수 잔량 50ml

10X 브로모페놀 블루(포화 용액):

브로모페놀 블루의 스패튤러-팁이 5ml의 2X　램리 버퍼에 분산되어 진다. 교반, 초음파처리 그리고 나서 원심분리 후, 상등액이 회수되었다.

II- 전기영동 겔

-　12% T 용해 겔의 조제

용액

모노머 용액
용해 겔 버퍼
10% SDS
암모니움 퍼설페이트(10%)
TEMED(리서치 오르가닉 사)
증류수

2 겔에 대한 부피
(10ml)
4.0ml
2.5ml
100㎕
50㎕
5㎕
3.4ml

최종
농도
12% T; 2.7% C
0.375M
0.1%
0.05%
--
--

-　8% T 농축화 겔의 조제

2 겔에 대한 부피
(5ml)
2ml
1.25ml
50㎕
25㎕
5㎕
4.2ml

최종
농도
8% T; 2.7% C
0.375M
0.1%
0.05%
--
--

첨부 B

전이 및 면역검지용 용액

토우빈 전이 버퍼(Towbin transfer buffer):

25　mM Tris-HCl, pH　8.3; 192　mM 글리신; 20% 메탄올

- Tris 염기 3.03g
- 100ml의 증류수에 용해되어 지는 14.4 g
글리신(리서치 오르가닉 사)
- 메탄올 200 ml
- 증류수 잔량 1000 ml

PBS-T 버퍼

열 배 희석의 10X PBS (Invitrogen)

+　0.1% 트윈　20 (Sigma)

폰슈 레드 (Sigma)

5% 초산 용액 내에 0.1% (w/v) 용액

첨부 C

제 일차 및 제 이차 항체의 리스트

항체	레퍼런스	희석	배양 시간
인간 항- 아코니타제	상용화되지 않음 (아래 참고 참조)	1/1000	1시간
항- 래빗 IgG HRP	어머샴	1/50 000	1시간

참고.: Bulteau et al. Biochemistry, 2003; 42, 14846-14855

Claims

피부 상에 항-노화 효과를 생성하는 및/또는 손상된 피부, 특별하게는 자외선 방사에 의해 손상된 피부에 대한 케어링을 위해 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위한 화장품학적으로 허용가능한 활성 제제로서, 감귤 속에 속하는 적어도 하나의 식물 또는 감귤 속에 속하는 적어도 하나인 식물 종의 횡 교배로부터 유래된 잡종으로부터 얻어진 식물 추출물의 용도.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 속×시트로포튜넬라에 속하는 식물로부터 얻어 진 것이고, 그리고 더욱 특히는 칼라먼딘(×시트로포튜넬라 마이크로카르파)의 추출물임을 특징으로 하는 화장품 용도.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 추출물의 제조를 위해 사용된 식물 물질은 전체 식물이거나 또는 뿌리, 근경(땅속 줄기) 또는 대기중의 부분, 특히 줄기, 잎, 꽃, 씨앗, 과실 또는 꽃봉오리와 같은 식물의 일 부분이거나 또는 과실 전체이거나 일 부분임을 특징으로 하는 화장품 용도.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 건조된 및/또는 마쇄된 식물 물질이거나; 또는 신선하게 수확된 식물 물질로부터 얻어진 것임을 특징으로 하는 화장품 용도.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 칼라먼딘 과실로부터 압착에 의하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 화장품 용도.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 이들 식물의 과일 쥬스로부터, 특히는 압착함에 의해, 극성 용매 또는 극성 용매의 혼합물과 접촉되는 상태로 둠에 의해 얻어짐을 특징으로 하는 화장품 용도.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출을 위해 사용된 극성 용매 또는 극성 용매의 혼합물은 물, C1-C4 알코올, 바람직하기로는 에탄올이나 부탄올에서 선택된 것, 글리콜로서 바람직하기로는 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 그리고 폴리글리세롤-3에서부터 선택된 글리콜, 및 이들의 혼합물로부터 선택되어 진 것임을 특징으로 하는 화장품 용도.
제 7항에 있어서, 상기 바람직한 혼합물은 적어도 하나의 알코올 및 물의 혼합물이거나 또는 적어도 하나의 글리콜 및 물의 혼합물로, 이들은 적어도 10%　v/v의 알코올 또는 글리콜을 포함하고 잔여분은 물로 구성되어 진 것임을 특징으로 하는 화장품 용도.
제 8항에 있어서, 상기 용매 혼합물은 50/50 v/v의 비율의 물과 에탄올의 혼합물 또는 50/50 v/v의 비율의 물과 부틸렌 글리콜의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 화장품 용도.
제 7항에 있어서, 추출은 수성 또는 물-글리콜 배지에서 수행됨을 특징으로 하는 화장품 용도.
제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 추출물은 추출단계로부터 제품을 동결-건조 또는 원자화한 후 분말의 형태로 됨을 특징으로 하는 화장품 용도.
화장품 조성물에 합체되어 국부적으로 전달되는 활성 제제로서 청구항 1 내지 11중 어느 한 항에 정의된 추출물의 용도로, 상기 활성 제제는 피부 상에 노화의 신호를 방지하거나 지연하거나, 또는 이들의 효과를 희석하는; 및/또는 손상된 피부, 특별하게는 자외선 방사에 의해 손상된 피부에 대한 케어링을 위해; 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위한 유효한 양으로 존재하는 추출물의 용도.
적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 활성 제제와 적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 화장품 조성물로, 상기 활성 제제는 감귤 속에 속하는 적어도 하나의 식물 또는 감귤 속에 속하는 적어도 하나인 식물 종의 횡 교배로부터 유래된 잡종, 특히는 속×시트로포튜넬라에 속하는 식물로부터 얻어진 식물 추출물임을 특징으로 화장품 조성물.
제 13항에 있어서, 식물 추출물은 피부의 구조의 유지 및/또는 완전성에 참여하는 적어도 하나의 다른 활성 제제와 조합하여 사용된 칼라먼딘(×시트로포튜넬라 마이크로카르파)의 추출물임을 특징으로 하는 화장품 조성물.
제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 활성 제제는 청구항 3 내지 12의 어느 한 항에 따른 식물 추출물임을 특징으로 하는 화장품 조성물.
제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 상기 조성물에 조성물에 대한 추출물의 0.001 내지 5중량%의 농도로 함유됨을 특징으로 하는 화장품 조성물.
제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 안료, 염료, 폴리머, 계면활성제, 유동화제제, 향료, 전해액, pH 조절제, 항산화제 및 보존제 및 이들의 혼합물로부터 선택되어 질 수 있는 적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 부형제를 포함함을 특징으로 하는 화장품 조성물.
제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 혈청, 로션, 예를 들어 크림과 같은 에멀젼, 또는 대안적으로 하이드로겔, 바람직하기로는 마스크의 형태로 제형화되어 지거나, 또는 스틱이나 패치의 형태로 됨을 특징으로 하는 화장품 조성물.
피부 상에 노화의 신호를 방지하거나 지연하거나 또는 이들의 효과를 희석하는, 및/또는 손상된 피부, 특별하게는 자외선 방사에 의해 손상된 피부에 대한 케어링을 위해, 및/또는 피부 컴플렉션의 밝게 빛나게 함을 개선하거나 회복하기 위한 화장품 조성물로, 상기 조성물은 유효량의 적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 활성 제제를 포함하고, 상기 활성 제제는 감귤 속에 속하는 적어도 하나의 식물 또는 감귤 속에 속하는 적어도 하나인 식물 종의 횡 교배로부터 유래된 잡종, 특히는 속×시트로포튜넬라에 속하는 식물이고, 그리고 더욱 특히는 식물 종×시트로포튜넬라 마이크로카르파의 식물로부터 얻어진 식물 추출물임을 특징으로 화장품 조성물.
제 19항에 있어서, 상기 적어도 하나의 화장품학적으로 허용가능한 부형재를 포함하는 화장품 조성물에 합체된 활성 제제는 신체 또는 얼굴 피부의 적어도 하나의 관련 부위에 상기 조성물을 적용함에 의해 국부적으로 전달되어 짐을 특징으로 하는 화장품 조성물.
제 19항 또는 제 20항에 있어서, 상기 활성 제제의 농도는 화장품 조성물의 0.001중량% 내지 5중량% 사이임을 특징으로 하는 화장품 조성물.