JP2015212295A - ミトコンドリアアコニターゼ活性化剤及びそれを含む美容組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせること、又は、その影響を弱めること、及び／又は、皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すことを可能にする活性剤及び該活性剤を配合した組成物の提供。【解決手段】カラモンディン（シトラス属に属する植物種の交雑により得られる雑種）から極性溶媒又は極性溶媒の混合物を抽出剤として得られる抽出物を有効成分として含有するミトコンドリアアコニターゼ活性化剤、該活性化剤を配合した組成物。図１はミトコンドリアアコニターゼ活性の変動を示す。【選択図】図１

Description

本発明は、美容剤としての、より詳細には、皮膚に抗加齢作用を生じるための、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）属、又はシトラス属にそれらの少なくとも１種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する少なくとも１種の植物から得られる植物抽出物の新規使用に関する。

本発明は、より詳細には、美容活性剤としての、×シトロフォーチュネラ（Ｃｉｔｒｏｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ）属の植物の抽出物、例えば、カラモンディン（ｃａｌａｍｏｎｄｉｎ）（×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ（ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ））の抽出物を、さらにまた、該抽出物を含む抗加齢美容組成物、並びに、ミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激するために、また皮膚に抗加齢作用を得るために、該組成物を用いる美容方法も対象とする。

加齢は多因子現象である。いくつかの理論が加齢に関して存在し、それらの中には、フリーラジカルの化学的特質及び遍在に基づくフリーラジカル理論がある（Ｈａｒｍａｎ Ｄ．、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．、１９５６年；１１、２９８〜３００頁）。

これらのフリーラジカル（活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）としても知られている）は、外因起源のものであるか、又は、様々な細胞過程を通じて、特にミトコンドリア呼吸の間に、生成され得る（Ｃａｄｅｎａｓ Ｅ．等、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、２０００年；２９、２２２〜２３０頁）。

呼吸の間に、呼吸鎖によって消費される全酸素の、少ないがかなりの量が、超酸化物ラジカルであるＯ_２ ^２−に変換され、これは、他の一層活性な酸素種、例えば、過酸化水素Ｈ_２Ｏ_２、並びにヒドロキシル及びペルオキシナイトライトラジカルの生成を招き得る（上で引用された、Ｃａｄｅｎａｓ等を参照）。

酸化ストレス条件下に、これらの活性種の生成は、タンパク質、ＤＮＡ及び脂質に酸素障害を、またミトコンドリアタンパク質の発現における変化を生じ、皮膚の加齢の進行に寄与する（Ｂｕｌｔｅａｕ等、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．、２００６年、４１；６５３〜６５７頁）。

加齢の間に、細胞高分子の維持のためのシステムの有効性の低下、及び、ミトコンドリアにおけるＲＯＳの生成の一定の増加が認められる（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ等、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．、２００６年；４０、１２３９〜１２４３頁）。

ところで、ミトコンドリアは、呼吸鎖によって確立されるプロトン勾配の生成、及びクレブス回路によるＡＴＰの生成を含めて、多くの細胞機能において重要な役割を演じている（Ｌｉｕ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、２００２年；８０、７８０〜７８７頁）。

酸素障害の蓄積及び構造異常は、ミトコンドリアに、細胞の機能及び保全（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に必要なＡＴＰを産出するその能力の漸進的な低下を引き起こす（Ｆｒｅｎｚｅｌ等、１９８４年）。

アコニターゼは、クレブス回路の必須のミトコンドリア酵素であり、クエン酸をイソクエン酸に変換する。それはまた、ミトコンドリアＤＮＡの保存にも役割を果たす。このように、アコニターゼによって、このＤＮＡの安定性及び遺伝は、細胞の代謝状態に密接に結び付けられる（Ｃｈｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７年；１０４、１３７３８〜１３７４３頁）。

アコニターゼの活性は、その鉄−硫黄中心［４Ｆｅ−４Ｓ］^２＋の保全に依存する（Ｂｅｉｎｅｒ等、Ｆａｓｅｂ Ｊ、１９９３年；７、１４４２〜１４４９頁）。酸化剤による、その鉄−硫黄中心［４Ｆｅ−４Ｓ］^２＋の攻撃は、アコニターゼを不活性化する鉄−硫黄中心［３Ｆｅ−４Ｓ］^＋の生成を引き起こす。

ミトコンドリアアコニターゼの活性の低下は、酸素障害及び細胞加齢の細胞内指標である。多くの変性障害もまた、酸化促進剤（ｐｒｏ−ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）のレベルの増加、及びミトコンドリアにおけるアコニターゼの活性の低下に関連している（Ｂｕｌｔｅａｕ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、４２、１４８４６〜１４８５５頁）。

アコニターゼの不活性化は、特に、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋の比の変化を引き起こす。具体的には、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨの産生は、アコニターゼの活性の低下のせいで、クレブス回路において低下するであろう（上で引用されたＨｕｍｐｈｒｉｅｓ等を参照；Ｎｕｌｔｏｎ−Ｐｅｒｓｓｏｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、２７６、２３３５７〜２３３６１頁）。これらのＮＡＤ^＋蓄積条件下に、ＲＯＳの増加が、還元された代謝物の自動酸化のために、観察される。このような不活性化はまた、損傷を受けたタンパク質の蓄積に寄与する、酸化反応のカスケードも開始させ得る（上で引用されたＨｕｍｐｈｒｉｅｓ等、２００６年を参照）。

このように、加齢の間、このような細胞損傷の蓄積を防ぎ、またこれらのＲＯＳによって損傷を受けたアコニターゼの修復及び再活性化の過程を促進するためには、皮膚細胞におけるミトコンドリアアコニターゼの十分な度合いの活性を保つことが不可欠である。

本発明の発明者等は、７０歳のドナーから得た、培養ヒト皮膚線維芽細胞では、２０歳のドナーから得たものに比べて、ミトコンドリアアコニターゼの活性が約８５％だけ低化しており、年齢によるタンパク質の発現には如何なる変化もないことを実証していた。この発見から出発して、本発明者等は、ミトコンドリアアコニターゼを全て保護すること、及び、これらの老齢の培養線維芽細胞のミトコンドリアアコニターゼの活性を取り戻すことが、シトラス属、又はシトラス属にそれらの少なくとも１種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する少なくとも１種の植物から得られる植物抽出物、より特定するとカラモンディンの抽出物により、該線維芽細胞を処理することによって可能であること、他方、若年のドナーの線維芽細胞に、この同じ処理を適用しても、ミトコンドリアアコニターゼの活性を修飾しないことを実証した。

ミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激するこのような効果は、この酵素が、クレブス回路及びミトコンドリアＤＮＡの保存におけるその中心的な役割を維持すること、並びに、皮膚細胞の機能、特に代謝機能を保つことを可能にする。

これは、年輩の個人の皮膚細胞のミトコンドリアアコニターゼの活性の回復の結果であり、皮膚細胞の加齢を遅らせる効果が、抗加齢美容作用によって引き起こされる。

さらに、本発明者等は、前記抽出物により、細胞内の酸化されたタンパク質のレベル（これはドナーの年齢と共に増加する）がかなり低下すること、その結果、すでに定義された植物抽出物によりこれらの細胞を処理することによって、この増加が完全に逆転されることもまた実証した。

本発明の抽出物のこの抗酸化活性（これについて、ミトコンドリアアコニターゼの活性との結び付きは確立されていない）は、本発明の抽出物に、皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すための美容活性剤として、美容分野において特に利点のあるさらなる特性を与える。

具体的に言うと、酸化されたタンパク質は、正常なタンパク質とは異なる光学的性質を有する。円２色性の技法により、酸化されたタンパク質によって透過される光は、正常なタンパク質によって透過されるものとは異なることが示された（Ｆｒｉｇｕｅｔ等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、１９９７年、４０５（１）：２１〜５頁）。結果的に、酸化されたタンパク質の蓄積は、皮膚細胞サイクルの調節異常を引き起こし、結果的に皮膚の遺伝的に決められた自然の色を損なうことによって、皮膚に、特に皮膚の色つやに、また見る者による皮膚の目による知覚に影響を及ぼす。

皮膚での光の反射及び光の反射への酸化の影響を調べるための研究（今日までに公開されていない）が、再構成皮膚モデルで、グロスメーター（サンバ（Ｓａｍｂａ）装置、ボサノヴァテクノロジーズ（Ｂｏｓｓａ Ｎｏｖａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社によって供給される）を用いて、出願人によって実施された。こうして、処理されていない皮膚が、酸化された皮膚より大きな全光線反射を有することが示された（グロスメーターによる測定）。

×シトロフォーチュネラ属は、シトラス属の植物とフォーチュネラ（Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ）属の植物の交雑により得られる植物種を含む。

シトロフォーチュネラ属に属する植物種の中で、非限定的に、又は例として、×シトロフォーチュネラ フロリダーナ（ｆｌｏｒｉｄａｎａ）、×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ、又は×シトロフォーチュネラ ミティス（ｍｉｔｉｓ）を挙げることができる。

これらの植物種の中で、カラモンディン（×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ）（好ましくないが、カラマンシー（ｋａｌａｍａｎｓｉ）又はシトラス マデュレンシス（ｍａｄｕｒｅｎｓｉｓ）とも呼ばれる）が、有利には、選択される。

日本国特開２００３−１９９５２７は、血糖又は血圧の増加を抑制する食物を開示し、該食物は、それが、柑橘類（ｃｉｔｒｕｓ）とフォーチュネラ属のキンカン（ｋｕｍｑｕａｔ）との雑種の果実全体の抽出物を含むことに特徴がある。

また、日本国特開２００５−０２９４９１は、シトロフォーチュネラ ミティスの果皮の分別蒸留によるリモネンの抽出方法を開示する。

今日まで、皮膚細胞の酸化されたタンパク質及びミトコンドリアアコニターゼに関して、シトラス属、又はシトラス属にそれらの少なくとも１種が属する植物種の交雑により得られる雑種（例えば、×シトロフォーチュネラ属）に属する少なくとも１種の植物から得られる植物抽出物、特にカラモンディン（×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ）の抽出物の注目に値する活性について、如何なる開示もなされていない。

それゆえに、カラモンディン抽出物は、特に皮膚に酸化ストレスを受けた後で、特に、皮膚の加齢の影響を防ぐ、遅らせる又は弱めるための美容組成物における美容活性剤として、美容の分野における新規活性剤をなす。
［発明の目的］

本発明の目的は、特に、美容上許容される活性剤としての、より詳細には、皮膚に抗加齢作用を生じるための、及び／又は損傷を受けた皮膚、特に紫外線によって損傷を受けた皮膚をケアするための、及び／又は皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すための、シトラス属、又はシトラス属にそれらの少なくとも１種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する少なくとも１種の植物から得られる植物抽出物の新規な使用を提供することである。

より詳細には、本発明は、新規美容活性剤としての、×シトロフォーチュネラ属に属する植物の抽出物、特にカラモンディン（シトロフォーチュネラ ミクロカルパ）の抽出物の新規使用、美容組成物における活性剤としてのその使用、及び該組成物を用いる美容ケア方法を対象とする。

本発明の主な目的は、また、少なくとも１種の美容上許容される賦形剤を含む美容組成物における活性剤としての、カラモンディン（×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ）の抽出物の新規使用である。

この新規使用は、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐこと若しくは遅らせること、又は、特に過剰のＲＯＳによって引き起こされる損傷に付随する、これらの徴候を治療すること、又は皮膚に抗加齢作用を生じることを特に対象とする。

この新規使用は、また、皮膚の色つやの明るい輝きを向上させること又は取り戻すことも対象とする。

本発明の主な目的は、また、本発明による抽出物を含む組成物を身体又は顔の少なくとも１つの心配な部分に付けることによって、皮膚の加齢の影響を防ぐ若しくは遅らせる目的で、及び／又は皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すために、美容組成物における前記抽出物を用いる美容方法である。

本発明の主な目的は、また、抗加齢美容組成物における活性剤、及び／又は皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すための組成物における活性剤としての、カラモンディンの抽出物の使用を提示することである。

本発明の目的は、また、美容組成物における活性剤としての前記抽出物の使用、並びに皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるために、又はその影響を弱めるために、及び／又は皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すために、該組成物を用いる美容ケア方法である。

本発明の主な目的は、また、特に上で示された美容ケアを実施するために前記抽出物を用いる、美容ケア方法を提供することである。

年齢によるミトコンドリアアコニターゼ活性の変動に関し、実施例２により、２０歳及び７０歳のドナーから得られたヒト線維芽細胞を培養し処理した後で測定されたものである：（Ａ）ミトコンドリアアコニターゼ活性の測定（実施例２、３節参照）；（Ｂ）ウェスタンブロット法（ＷＢ）によるミトコンドリアアコニターゼアッセイ（実施例２、４節参照）。 年齢によるミトコンドリアアコニターゼの活性部位の修飾に関し、実施例２により、２０歳及び７０歳のドナーから得られたヒト線維芽細胞を培養し処理した後で測定されたものである；免疫等電点電気泳動（ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ、ＩＥＦ）、次いでウェスタンブロット法による、ミトコンドリアアコニターゼの形態の分離及び測定（実施例２、５節）。 ミトコンドリアアコニターゼの活性の測定に関し、実施例２に従って培養し、次いで、２．５％のカラモンディン抽出物により４８時間処理した、２０歳及び７０歳のドナーから得られたヒト線維芽細胞を培養した後で測定したものである（実施例２、３節参照）。 分離されたミトコンドリアでの、オキシブロット法による、酸化されたタンパク質の検出に関し（実施例３）、培養し、次いで、２．５％のカラモンディン抽出物（美容活性剤）により４８時間処理した、２０歳及び７０歳のドナーから得られたヒト線維芽細胞を用いる（実施例２参照）。

すなわち、本発明の第１の主題は、美容上許容される活性剤としての、より詳細には、皮膚に抗加齢作用を生じるための、及び／又は損傷を受けた皮膚、特に紫外線によって損傷を受けた皮膚をケアするための、及び／又は皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すための、シトラス属、又はシトラス属にそれらの少なくとも１種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する少なくとも１種の植物から得られる植物抽出物の新規使用を対象とする。

特に好ましい雑種の中には、シトラス属の植物種とフォーチュネラ属に属する植物種との交雑による得られる、×シトロフォーチュネラ属に属するもの、より詳細には、カラモンディン（×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ）がある。

本発明の別の主題は、また、美容活性剤としての、より詳細には、皮膚に抗加齢作用を生じるための、及び／又は皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すための、カラモンディン抽出物の新規使用を対象とする。

抽出物の調製に用いられる植物原料は、その植物の全部、或いはその植物の一部（例えば、根、根茎又は地上部分、特に、茎、葉、花、種子、果実若しくは花芽）であり得る。

それは、有利には、前記の種の１つの果実の全部又は果実の一部からなり得る。

好ましい抽出物はカラモンディンの果実から得られる。

抽出ステップ自体の前に、植物原料は、乾燥及び／又は粉砕されていてもよい、又は、代わりに、新たに収穫された状態であってもよい。

抽出物は、当業者に知られている様々な抽出方法により調製され得る。

抽出は、溶媒なしに、例えば、特に果実の全部又は果実の一部を圧搾することによって実施され得る。

しかし、有利には、抽出は、選ばれた植物原料を極性溶媒又は極性溶媒の混合物に接触させることによって、特に、適切な溶媒又は溶媒混合物による前記植物原料の浸漬、柔化（ｍａｃｅｒａｔｉｏｎ）、煎出によって実施される。

特に利点のある一変形形態によれば、抽出物はこれらの植物の果汁から得られ、特に、圧搾によって、極性溶媒又は極性溶媒混合物、好ましくは水性媒体と接触させることによって得られる。

抽出に用いられる極性溶媒又は極性溶媒混合物は、有利には、水、Ｃ１〜Ｃ４アルコール（特に、エタノール及びブタノールから選択される）、グリコール（グリセロール、ブチレングリコール及びプロピレングリコールから優先的に選択される）、及びポリグリセロール−３、並びにこれらの混合物から選択される。

好ましい混合物は、少なくとも１０ｖ／ｖ％のアルコール又はグリコールを含み、残りの部分は水からなる、少なくとも１種のアルコールと水、又は少なくとも１種のグリコールと水の混合物である。

本発明の別の特定の変形形態によれば、溶媒混合物には、５０／５０ｖ／ｖの比の、水とエタノールの混合物、又は５０／５０ｖ／ｖの比の、水とブチレングリコールの混合物が含まれる。

好ましい一実施形態によれば、抽出は、有利には、水性媒体、又は水−グリコール媒体で実施される。

抽出はまた、植物原料若しくは植物抽出物を部分的に若しくは完全に脱色する又はそれを精製することを目的とした、例えば、非極性溶媒又は溶媒混合物の溶液による植物原料又は抽出物の処理による、或いは、抽出物を活性炭粒子と接触させることからなる処理による、或いは、代わりに、超臨界ＣＯ_２による処理による、植物原料若しくは植物抽出物の処理からなる追加のステップを任意選択で含んでいてもよい。

抽出は、抽出溶媒の部分的又は完全な除去ステップによって完了され得る。第１の場合には、抽出物は通常、かなりの量の有機溶媒が取り除かれた水性濃縮液が得られるまで濃縮され、第２の場合には、乾燥残留物が得られる。代わりに、抽出ステップからの生成物は、粉末状に、凍結乾燥されても、噴霧乾燥されてもよい。

粉末は、本発明による美容組成物に、得られたままの形態で使用されても、又は極性溶媒若しくは極性溶媒の混合物に分散又は溶解されてもよく、或いは、代わりに、固体担体に吸着させてもよい。

本発明の一実施変形形態によれば、前記活性剤は、美容組成物に組み入れられた局所送達され、該活性剤は、皮膚の加齢の徴候を防ぐ若しくは遅らせるのに、又はその影響を弱めるのに；及び／又は損傷を受けた皮膚、特に紫外線により損傷を受けた皮膚をケアするのに、及び／又は皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すのに、有効な量で存在する。

前記活性剤は、また、美容上許容される少なくとも１種の賦形剤と混合されてもよく、この組成物を身体又は顔の皮膚に付けることによって用いられ得る。

このように、本発明はまた、美容上許容される少なくとも１種の活性剤、及び美容上許容される少なくとも１種の賦形剤を含み、該活性剤が、シトラス属、又はシトラス属にそれらの少なくとも１種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する少なくとも１種の植物、特に、×シトロフォーチュネラ属に属する植物から得られる植物抽出物であることを特徴とする、美容組成物を対象とする。

本発明による美容組成物は、所望の効果を得るのに有効な量の本発明の抽出物を含む。

本発明のいずれの態様でも、用語「有効量」は、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるのに、又はその影響を弱めるのに；及び／又は損傷を受けた皮膚、特に紫外線により損傷を受けた皮膚をケアするのに、及び／又は皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すのに、必要とされる量に少なくとも等しい量を意味する。

有利には、本発明による美容組成物は、活性剤としての組成物を０．００１質量％から５質量％、好ましくは０．０１質量％から３質量％の間含む。

有利には、本発明の組成物は、また、本発明のものに類似の、及び／又は本発明のものを補足する美容効果を有する他の活性成分、特に、皮膚の構造の維持及び／又は保全に関与する少なくとも１種の他の活性剤、並びに、顔料、染料、ポリマー、界面活性剤、レオロジー作用剤、芳香剤、電解質、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、保存剤、及びこれらの混合物から特に選択され得る少なくとも１種の美容上許容される賦形剤も含み得る。

本発明による美容組成物は、セラム（ｓｅｒｕｍ）、ローション、エマルジョン、例えばクリーム、又は、代わりに、ヒドロゲル、好ましくは美顔用パック（ｍａｓｋ）の形態で配合されても、或いはスティック若しくはパッチの形態であってもよい。

最後に、本発明は、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるための、又はそれらを処置するための美容活性剤としての、上で定義された活性剤の使用に関し、該美容剤は皮膚細胞のミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する。

本発明はまた、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるための、又はその影響を弱めるための、及び／又は皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すための美容組成物の製造のための、本発明の美容活性剤の使用に関する。

最後に、本発明は、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるための、又はその影響を弱めるための、及び／又は損傷を受けた皮膚、特に紫外線により損層を受けた皮膚をケアするための、及び／又は皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻すための美容ケア方法を対象とし、この方法は、身体若しくは顔の皮膚の少なくとも１つの心配な部分への、有効量の美容上許容される少なくとも１種の活性剤の送達を含み、該活性剤が、シトラス属、又はシトラス属にそれらの少なくとも１種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する植物、特に、×シトロフォーチュネラ属に属する植物、殊に、植物種の×シトロフォーチュネラ ミクロカルパの植物から得られる植物抽出物であることに特徴がある。

好ましくは、前記方法は、美容上許容される少なくとも１種の賦形剤もまた含む美容組成物に組み入れられる活性剤が、該組成物を身体若しくは顔の皮膚の少なくとも１つの心配な部分に付けることによって、局所送達されることに特徴がある。

本発明によるケア方法は、また、活性剤の濃度が、美容組成物の０．００１質量％と５質量％の間であることにも特徴がある。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の説明的記述から明瞭に分かってくるであろう、この説明は、本発明のいくつかの実施例（これらは、純粋に例示の目的で記載され、本発明の範囲の限定を決して生じない）に関連させて記載されている。

記述において、特に以下の実施例において、特に断わらなければ、全てのパーセンテージは、質量基準で記載されており、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧である。

実施例１−試験を実施するために用いられるカラモンディン抽出物の調製
カラモンディン（×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ）の抽出物を、植物の果実全体を圧搾することによって調製する。
濾過し、次いで、遠心した後、果肉を、水とポリグリセロールの混合物により抽出する。
得られた抽出物は、３５〜４５質量％の固形分を含む。実施例２及び３の試験を実施し、また美容組成物、特に実施例４のものを調製するために、この抽出物を、得られたままの形態で用いる。

実施例２−ヒト線維芽細胞におけるミトコンドリアアコニターゼ活性の測定
材料及び方法

１．ヒト線維芽細胞の培養及び処理
・ 培地及び試薬
線維芽細胞培養培地
ＤＭＥＭ １／ｍｌのグルコース（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））
＋１０％のＳＶＦ
＋１％のピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭ（ギブコ）

活性剤の保存溶液
保存溶液は、ＤＭＥＭ培地で抽出物溶液を希釈することによって調製する（質量％）。
−培地中６％のカラモンディン抽出物、すなわち、約２．４質量％の固形分。

ａ−細胞培養及び処理
２０歳のドナー及び７０歳のドナーの形成外科から得られた初代培養のヒト線維芽細胞、１２次継代。

０日での継代培養
１５×１０^５線維芽細胞／（７５ｃｍ^２のディッシュ）、ｎ＝３、ＤＭＥＭ培地（１０ｍｌ／ディッシュ）

５日目の処理
保存溶液を、ＤＭＥＭ培地で希釈して、下記の濃度とする：
−培地中２．５質量％のカラモンディン抽出物、すなわち、約１質量％の固形分。

７日目の細胞の回収
ミトコンドリアの調製
ＰＢＳにより２回すすぎ
氷ベッド上；２ｍｌのホモジェネート化緩衝液中に回収。

ｂ−ミトコンドリアの分離
３２個のＴ７５ディッシュを各ドナーに用いる。集密した細胞を、２回、ｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２−０．１３ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＮａ_２ＰＯ_４及び１．４ＭのＫＨ_２ＰＯ_４）により洗い、擦り取ることによって引き離し、次いで、４℃、１５００×ｇで５分間遠心する。細胞ペレットをＰＢＳ緩衝液により洗い、再遠心し、次いで氷の中に置く。ペレットを冷ホモジェネート化緩衝液（０．３Ｍのマンニトール、０．１％のＢＳＡ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ＫＯＨによりｐＨ７．４に調整、ペレット容積の５倍量）に分散させ、２ｍｌのガラスホモジェナイザーにより氷上でホモジェネートにする。細胞懸濁液を、４℃、１０００×ｇで１０分間遠心する。上澄みを、４℃、１００００×ｇで１５分間再遠心する。上澄みは、細胞質画分を含み、ペレットはミトコンドリア画分に相当する。ミトコンドリア画分を、冷ホモジェネート化緩衝液により２回洗う。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法に従って測定する。

２．タンパク質アッセイ（ブラッドフォード法）
ａ−検量範囲の製剤
ＢＳＡ保存溶液：５０μｇ／ｍｌ（バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）；標準タンパク質）

２００μｌのクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーＧ２５０を各チューブに加える。このブルーは、保存溶液の５倍希釈によって、用時調製する。

ｂ−試料の調製
− タンパク質濃度＞３ｍｇ／ｍｌの場合、細胞抽出物は、１００倍に希釈し、次いで、１００ｍｌの希釈液を取る。
＋７００μｌのミリＱ（ｍｉｌｌｉＱ）水
＋２００μｌのブルー

− タンパク質濃度＜３ｍｇ／ｍｌ場合、１０μｌの細胞抽出物を取る。
＋７９０μｌのミリＱ水
＋２００μｌのブルー

ｃ−試料アッセイ
試料は、渦流撹拌（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）によってホモジェネートにし、５分間放置した後、次に、５９５ｎｍの波長の光学濃度を、分光光度計で読み取る。

３．ミトコンドリアアコニターゼ活性のアッセイ
ａ−試薬
− ２５ｍＭ、ｐＨ７．５のトリス緩衝液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
− クエン酸ナトリウム（シグマ）
− イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（シグマ）
− ＭｎＣｌ_２（シグマ）

ｂ−ミトコンドリアアコニターゼ活性のアッセイの原理
ミトコンドリアアコニターゼ活性を、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ＋０．６ｍＭのＭｎＣｌ_２及び０．０５％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００中、０．２ｍＭのＮＡＤＰ^＋、５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１単位／ｍｌのイソクエン酸デヒドロゲナーゼを含む反応媒体中、３４０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量する。

アッセイのために、５０μｇのミトコンドリアタンパク質を、２５℃で、１．０ｍｌの反応媒体に加える。３４０ｎｍでの測定を、１ｃｍのセルで、５分間隔で記録し、ミトコンドリアアコニターゼ活性は、約５分間に渡る３４０ｎｍでの吸光度の直線的増加により計算する。活性は、６．２２×１０^３Ｍ^−１ｃｍ^−１のＮＡＤＰＨの対するモル吸光係数を用いること、及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼによる、１分子のクエン酸の１分子のＮＡＤＰＨへの変換を仮定することによって得る。

４．ウェスタンブロット法（ＷＢ）によるミトコンドリアアコニターゼアッセイ
ａ−アッセイの原理
タンパク質電気泳動を、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法（Ｎａｔｕｒｅ，１９７０年；２７７、６８０頁）に従って、不連続緩衝液で、変性及び還元条件下に、１ｍｍから１．５ｍｍの厚さのポリアクリルアミドミニゲルで実施する。１２％のＴ及び２．７％のＣを含むゲルにより、低分子量タンパク質（２０から１２０ｋＤａ）のタンパク質が分離される。８％のＴ及び２．７％のＣを含むゲルにより、高分子量タンパク質（３５から２５０ｋＤａ）が分離される。
ゲルの製造に必要な溶液は、付録Ａに記載されている。

分離ゲル
ゲルは、泳動の少なくとも２時間前に注ぐ。
ゲルの注入は、濃縮ゲルのために用意されたコームの最下部から約０．５ｍｍまで、ピペットを用いて実施する。無水エタノールを表面に加えて、均一なベースラインを得る（±１ｍｌ／ゲル）。

濃縮ゲル
エタノールを取り除く。２．５ｍｌのゲルを、ポリエチレン製のパスツール全容（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ピペット（バイオラッド）を用いて注ぎ、次いで、コームを挿入する。ゲルは１時間後に重合している。

ｂ−試料の調製
ミトコンドリアタンパク質を、還元レムリ条件下に、１２％のＴを含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。試料（２５〜４０μｇのタンパク質）を、付着物緩衝液中、１００℃で５分間、還元する。試料及びマーカーを付着させた後、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのグリシン、２ｍＭのＥＤＴＡのｐＨ８．４の緩衝液（０．１％のＳＤＳを含む）中、２００Ｖで１時間、泳動を実施する。

ｃ−電気泳動
付着
試料は９５℃で５分間加熱する。
付着させる容積は、所望の量のタンパク質に応じて決まる（１ｍｍのゲルで、最大容積＝２５μｌ、１．５ｍｍのゲルで４０μｌ）。基準量は１０μｇのタンパク質であり、１０μｌに相当する；次いで、それは、標的タンパク質の発現に合わせて変える。

コームは取り除く。２００ｍｌの１×泳動緩衝液を、ゲル上に、２つのゲルの間の中央コンパートメントに、次いで、４分の１のレベルまでタンクに注ぐ。

試料、及び１０μｌのプレステインド低分子量コントロール（バイオラッド、プレステインド ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準ローレインジ（Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ））又は高分子量コントロール（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、フルレインジレインボー（Ｆｕｌｌ Ｒａｎｇｅ Ｒａｉｎｂｏｗ））は、マイクロピペットに取り付けた、しだいに細くなる先端部を用いて付着させる。

泳動
電気泳動は、室温で、２００Ｖで実施する。この電気泳動は、泳動の先端がゲルを出た時に停止する（約４０分間の泳動）。

膜へのタンパク質のセミ−ドライ転写
２枚の厚い濾紙（バイオラッド）及びセルロース膜（バイオラッド）を、トービン（Ｔｏｗｂｉｎ）転写緩衝液（ＰＮＡＳ、１９７９年、７６（９）４３５０〜４頁）（付録Ｂを参照）に浸す。

セミ−ドライ転写装置（ビイオラッド）で、湿った厚い１枚の濾紙をアノードに置く。

一旦、泳動が完了すると、濃縮ゲルを取り除き、分離ゲルをセルロース膜に合わせる。ゲルを含む膜を、１枚の前記濾紙の上に置く。２枚目の濾紙をゲル上に置く。

「サンドイッチ」の作製中、転写を妨げないように、ガラス棒を用いて空気の泡を全て取り除くように注意する。装置を、カソードをなす蓋により閉じる。タンパク質の転写は、１０Ｖ、９０分間で実施する。

ポンソーレッド（Ｐｏｎｃｅａｕ Ｒｅｄ）による染色
転写の良否を調べるために、タンパク質をポンソーレッド（シグマ）により染色する。セルロース膜をミリＱ水によりすすぎ、次いで、ポンソーレッドの浴に、撹拌しながら１０分間一度浸す。次に、タンパク質のバンドにだけ着色が残るまで、ミリＱ水のいくつかの浴で洗う。膜をプラスチックの袋に入れ、スキャンする。タンパク質のバンドは、転写されたタンパク質の全量を求めるために定量され得る。

非特異的結合部位のブロッキング
膜は、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（付録Ｂ参照）中５％のスキムミルク（Ｒｅｇｉｌａｉｔ）からなる、非特異的結合部位をブロッキングするための溶液（２０ｍｌ／膜）中、４℃で一夜、又は室温で９０分間、撹拌する。

免疫検出
抗体の参照事項及び最適希釈は付録Ｃに記載する。

非特異的部位をブロッキングした後、膜はＰＢＳ−Ｔ中で素早くすすぐ。この膜を、抗体に応じて５％（ｍ／ｖ）のミルクを含む又は含まないＰＢＳ−Ｔで最適濃度に希釈した一次抗体に、撹拌しながら、室温で６０分間、又は４℃で一夜接触させる。

次いで、結合していない過剰の遊離抗体を除去するために、それを、ＰＢＳ−Ｔ中で３回、各１０分間、素早くすすぐ。次に、それを、室温で撹拌しながら、ＰＢＳ−Ｔ又は５％ミルク（５ｍｌ）で希釈した、ペルオキシダーゼに結合した適切な２次抗体に接触させる。４５分間のインキュベーションの後、それを、２回素早くすすぎ、次いで、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液により５回、各５分間洗い、最後に、１×ＰＢＳにより洗う。水気を切った後、それを、タンパク質側を上にして、台所用ラップフィルム（サラン（ＳＡＲＡＮ））の上に置く。

膜を、ペルオキシダーゼの基質としてルミノールを用いる高感度化学発光検出キット（アマシャム；ＥＣＬウェスタンブロッティング）を用いて可視化する。ペルオキシダーゼ及び増幅剤の作用の下で、ルミノールは酸化され、過渡励起状態に移る。基底状態への復帰は、光子の放出によって起こり、これらの光子が、膜上に置かれたオートラジオグラフィーフィルムに当たる。

検出キットの２つの溶液の各々の１ｍｌ（すなわち２ｍｌ、膜を覆うのに必要とされる最小容積）を一緒に混合する。混合物を直ちに膜の上に均一に注ぎ、室温で正確に１分間、接触させておく。水気を切った膜を、サランラップフィルムで包み、光から保護されたカセットに入れ、次いで、プレフラッシュしたオートラジオグラフィーフィルム（アマシャム、ハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）ＥＣＬ）により覆う。５分間の露光の後、オートラジオグラフィーフィルムは可視化される。所望のシグナルを最適にするために、必要であれば、新しいフィルムが露光されてもよい（１時間の露光時間まで）。バンドは、ゲルズアナリスツ（Ｇｅｌｓ Ａｎａｌｙｓｔｓ）３．０１ソフトウェアにより定量する。

５．ＩＥＦによるミトコンドリアアコニターゼアッセイ
この技法により、ミトコンドリアアコニターゼの３つの形態、活性形態［４Ｆｅ−４Ｓ］^２＋、不活性形態［３Ｆｅ−４Ｓ］^＋、及びアポ酵素形態が、それらの等電点に従って分離される。

５０μｇのミトコンドリアタンパク質を、ｐＨ３〜１０のＩＥＦゲル（バイオラッド）上に付着させる。泳動は、１００Ｖで１時間；２５０Ｖで１時間及び５００Ｖで３０分間、クライテリオン（ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）システム（バイオラッド）で実施する。泳動の後、ゲルをニトロセルロース膜に転写し、抗−ミトコンドリアアコニターゼウェスタンブロット法を、４節に記載のプロトコールに従って実施する。

結果
ミトコンドリアアコニターゼ活性を、これらの培養細胞からミトコンドリアを分離後、評価した。加齢と共にミトコンドリアアコニターゼ活性が低下することが実証される。

これらの測定は、２０歳のドナーと比較して、７０歳のドナーのミトコンドリアでは、ミトコンドリアアコニターゼの活性が約８５％低下していることを示す（図１参照）。

しかし、この酵素の発現、すなわち、若年及び老年の線維芽細胞に存在する酵素の量には有意な相違はない（図１参照）。

老齢の線維芽細胞で示されるミトコンドリアアコニターゼ活性の低下が、この酵素のＦｅ−Ｓ中心の酸素障害に帰因しなかったかどうかを調べるために、酵素の３つの構造形態（アポ酵素、活性形態及び不活性形態）を、等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ、ＩＥＦ）によって、それらの等電点に従って分離した。この方法を用いて、アポ酵素に年齢による違いが示されるが、他の形態には違いがない（図２参照）。

本発明者等は、ミトコンドリアアコニターゼの活性が、培養したヒト皮膚線維芽細胞で、年齢と共に低下することを示した。この活性の低下は、年齢によるこのタンパク質の発現の変化を伴わない。

この結果から出発して、本発明者等は、異なる年齢のこれらのドナーから得られる皮膚線維芽細胞におけるミトコンドリアアコニターゼの活性への、試験された活性剤の効果を評価した（図３及び表１参照）。

結果は、若年ドナー（２０歳）からの未処理線維芽細胞におけるミトコンドリアアコニターゼの活性（これが１００％のレベルをなす）に対するパーセンテージとして表される。

表１：２０及び７０歳のドナーからの線維芽細胞のミトコンドリアアコニターゼ活性

これらの結果は、これらの抽出物による処理が、酸化剤の作用に対してミトコンドリアアコニターゼを保護することを可能にすることを示す。しかし、これらの抽出物により、２０歳のドナーからの線維芽細胞を処理した後４８時間で、ミトコンドリアアコニターゼの有意の活性化は認められない。他方、７０歳のドナーからの線維芽細胞への同じ処理により、酵素は完全に保護されるという結果が得られる。

実施例３−オキシブロット法による、酸化されたタンパク質の可視化
ａ−原理
ＲＯＳ又は他の酸化機構（例えば、糖化／糖酸化又は脂質過酸化）によってタンパク質鎖に導入されたカルボニル基（酸化マーカー）が、部位−特異的機構により可視化される。

鎖中のカルボニル基は、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と反応して、ヒドラゾン誘導体を与える。このＤＮＰ誘導試料を、電気泳動によってポリアクリルアミドゲルで分離する。分離の後、ウェスタンブロット法のために、ニトロセルロース膜への転写を行う。次いで、膜は、カルボニル基を有するタンパク質に結合したＤＮＰ分子に特異的な、１次抗体の存在下にインキュベートする。次のステップは、ペルオキシダーゼに結合した、抗１次抗体（抗ウサギ）２次抗体によるインキュベーションである。可視化は、ウェルタンブロット法において用いられるものと同じ試薬を用いて実施する。

ｂ−プロトコール
使用された全ての試薬は、オキシブロット（Ｏｘｙｂｌｏｔ）キット（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ−Ｏｎｃｏｒ、フランス）による。

試料の変性
実施例２（材料及び方法、１節）により得られる５μｌの細胞抽出物に含まれるミトコンドリア溶解物に由来する２μｇの付着物に対応して、１５〜２０μｇの間の量のタンパク質を用いる。１０μｌの１×ＤＮＰＨを、その後、５μｌの１２％ＳＤＳ加える；混合物を室温で１５分間撹拌する。７．５μｌの中和液及び１×試料緩衝液を加える。試料は付着させる準備が整う。

タンパク質は、１２％ＳＤＳアクリルアミドでの電気泳動によって最終的に分離され、ニトロセルロース膜に転写される。

抗原−抗体反応
カルボニル誘導体は、１５０倍に希釈した抗ＤＮＰウサギ１次抗体、及び抗ウサギ２次抗体により可視化される。ＥＣＬキット（アマシャム）を用いて、ペルオキシダーゼを、その基質の助けで可視化する。

結果
酸化されたタンパク質が年齢と共に増加することが認められる（図４）しかし、カラモンディン抽出物による老齢の線維芽細胞の処理は、若年の線維芽細胞のレベルに相当する、酸化されたタンパク質のレベルに戻ることを可能にする。これらの結果は、皮膚の酸化されるタンパク質に、前記抽出物が抗酸化活性を有することを示す。

美容配合物の例
実施例４：カラモンディン果実抽出物を含む美容組成物
実施例１で得られた抽出物を、得られたままの形態で、下の美容組成物に用いる。

− カラモンディン又はカラマンシス（Ｃａｌａｍａｎｓｉｓ）の植物抽出物（実施例１）０．１％
− 界面活性剤（アルラセル（Ａｒｌａｃｅｌ）（登録商標）１６５ＶＰ） ５％
− ９５％セチルアルコール １％
− ステアリルアルコール １％
− 蜜蝋 １．５％
− オイル（パールリーム（Ｐｅｒｌｅａｍ）（登録商標）） ８．５％
− グリセリドトリカプラート／カプリラート ３％
− シリコーンオイル（ジメチコン１００ＣＳ） １％
− ポリマー（ケルトロール（Ｋｅｌｔｒｏｌ）（登録商標）） ０．３５％
− 水酸化ナトリウム ０．０４％
− ＥＤＴＡ四ナトリウム粉末 ０．１％
− 保存剤 ０．５％
− 水 １００となる量

美容組成物は、様々な成分を１ステップ又は複数ステップで一緒に混合することによって、当業者に知られている通常の仕方で調製する。

この組成物は、先に示された抗加齢美容効果を得るために、また色つやの明るい輝きを取り戻すために、数週間、毎日、顔の皮膚に付けられ得る。

付録Ａ
Ｉ−不連続緩衝液法において、変性及び還元条件下に、電気泳動ゲルのために用いられた緩衝液及び溶液

モノマー溶液：
アクリルアミド／ビスアクリルアミド、３０％Ｔ、２．６７％Ｃ（バイオラッド）

分離ゲル緩衝液：トリス−ＨＣｌ、１．５Ｍ、ｐＨ８．８

濃縮ゲル緩衝液：０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８

１０×泳動緩衝液：０．２５Ｍのトリス ｐＨ８．３、１．９２Ｍのグリシン；１％のＳＤＳ

過硫酸アンモニウム：（ＮＨ_４）_２Ｓ_２Ｏ_８：（シグマ） １０％（ｗ／ｖ）、すなわち、１００ｍｇ／ｍｌ

２×レムリ還元性試料緩衝液：０．０６Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８；２．３％のＳＤＳ；１０％のグリセロール；０．０２％のブロモフェノールブルー

１０×ブロモフェノールブルー（飽和溶液）：
スパチュラ先端量のブロモフェノールブルーを、５ｍｌの２×レムリ緩衝液に分散させる。撹拌、超音波処理、次いで遠心後、上澄みを回収する。

ＩＩ−電気泳動ゲル
−１２％Ｔ分離ゲルの調製

−８％Ｔ濃縮ゲルの調製

付録Ｂ
転写及び免疫検出のための溶液

トービン転写緩衝液
２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；１９２ｍＭのグリシン；２０％のメタノール

ＰＢＳ−Ｔ緩衝液
１０×ＰＢＳ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の１０倍希釈
＋０．１％のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（シグマ）

ポンソーレッド（シグマ）
０．１％（ｗ／ｖ）溶液、５％の酢酸溶液中

付録Ｃ
１次及び２次抗体のリスト

Claims (10)

1. カラモンディン（×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ）の抽出物を有効成分として含有する、ミトコンドリアアコニターゼ活性化剤。
2. 前記抽出物が、カラモンディン（×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ）の果実から得られる、請求項１に記載のミトコンドリアアコニターゼ活性化剤。
3. 前記抽出物が、カラモンディン（×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ）の果実を、圧搾し、極性溶媒又は極性溶媒の混合物に接触させることによって得られる、請求項１に記載のミトコンドリアアコニターゼ活性化剤。
4. 前記極性溶媒又は極性溶媒の混合物が、水、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコール、グリセロール、ブチレングリコール、プロピレングリコール及びポリグリセロール−３、並びにこれらの混合物から選択される、請求項３に記載のミトコンドリアアコニターゼ活性化剤。
5. 前記極性溶媒の混合物が、５０／５０ ｖ／ｖの比の水とエタノールの混合物、又は５０／５０ ｖ／ｖの比の水とブチレングリコールの混合物である、請求項３に記載のミトコンドリアアコニターゼ活性化剤。
6. 前記極性溶媒の混合物が、水とポリグリセロール−３の混合物である、請求項３に記載のミトコンドリアアコニターゼ活性化剤。
7. 皮膚に抗加齢作用を生じる、及び／又は紫外線によって損傷を受けた皮膚をケアする、及び／又は皮膚の色つやの明るい輝きを向上させる若しくは取り戻す、請求項１に記載のミトコンドリアアコニターゼ活性化剤。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のミトコンドリアアコニターゼ活性化剤を、組成物に対する前記活性化剤の乾燥重量として、０．００１％から５％の間の濃度で含む、美容組成物。
9. 顔料、染料、ポリマー、界面活性剤、レオロジー作用剤、芳香剤、電解質、ｐＨ調整剤、酸化防止剤及び保存剤、並びにこれらの混合物から選択される、少なくとも１種の美容上許容される賦形剤を含む、請求項８に記載の美容組成物。
10. セラム、ローション、エマルジョン、ヒドロゲル、スティック又はパッチの形態である、請求項８又は９に記載の美容組成物。

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