JP2010241803A - ミトコンドリアアコニターゼを刺激する美容ケアの方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】皮膚の加齢徴候の現れを防ぐ、若しくは遅らせるための、又はその影響を弱めるための美容組成物の提供。
【解決手段】皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を活性化、又は刺激する美容上許容される少なくとも1種の活性剤の有効量を含む美容組成物。該活性剤としては、シトラス属、若しくはシトラス属にそれらの少なくとも1種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する植物、モリンダ属に属する植物、又はハイビスカス属に属する植物を含む群から選択される少なくとも1種の植物から得られる抽出物であることが好ましい。該活性剤としては、特に、シトラス属とフォーチュネラ属の交雑により得られるシトロフォーチュネラ属に属する少なくとも1種の雑種であるカラモンディン(シトロフォーチュネラ・ミクロカルパ)の果実の抽出物であることが好ましい。
【選択図】図1
【解決手段】皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を活性化、又は刺激する美容上許容される少なくとも1種の活性剤の有効量を含む美容組成物。該活性剤としては、シトラス属、若しくはシトラス属にそれらの少なくとも1種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する植物、モリンダ属に属する植物、又はハイビスカス属に属する植物を含む群から選択される少なくとも1種の植物から得られる抽出物であることが好ましい。該活性剤としては、特に、シトラス属とフォーチュネラ属の交雑により得られるシトロフォーチュネラ属に属する少なくとも1種の雑種であるカラモンディン(シトロフォーチュネラ・ミクロカルパ)の果実の抽出物であることが好ましい。
【選択図】図1
Description
本発明は、ミトコンドリアアコニターゼを刺激することによる、抗加齢美容ケア方法に関する。
より詳細には、本発明は、特に植物由来の、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する分子又は抽出物、美容組成物における活性剤としてのそれらの使用、及び該組成物を用いる美容ケア方法に関する。
加齢は多因子現象である。いくつかの理論が加齢に関して存在し、それらの中には、フリーラジカルの化学的特質及び遍在に基づくフリーラジカル理論がある(Harman D.、J.Gerontol.、1956年;11、298〜300頁)。
これらのフリーラジカル(活性酸素種(reactive oxygen species、ROS)としても知られている)は、外因起源のものであるか、又は、様々な細胞過程を通じて、特にミトコンドリア呼吸の間に、生成され得る(Cadenas E.等、Free Radic.Biol.Med.、2000年;29、222〜230頁)。
呼吸の間に、呼吸鎖によって消費される全酸素の、少ないがかなりの量が、超酸化物ラジカルであるO2 2−に変換され、これは、他の一層活性な酸素種、例えば、過酸化水素H2O2、並びにヒドロキシル及びペルオキシナイトライトラジカルの生成を招き得る(上で引用された、Cadenas等を参照)。
酸化ストレス条件下に、これらの活性種の生成は、タンパク質、DNA及び脂質に酸素障害を、またミトコンドリアタンパク質の発現における変化を生じ、皮膚の加齢の進行に寄与する(Bulteau等、Exp Gerontol、2006年、41;653〜657頁)。
加齢の間に、細胞高分子の維持のためのシステムの有効性の低下、及び、ミトコンドリアにおけるROSの生成の一定の増加が認められる(Humphries等、Free Radic Res、2006年;40、1239〜1243頁)。
ところで、ミトコンドリアは、呼吸鎖によって確立されるプロトン勾配の生成、及びクレブス回路によるATPの生成を含めて、多くの細胞機能において重要な役割を演じている(Liu等、J.Neurochem.、2002年;80、780〜787頁)。
酸素障害の蓄積及び構造異常は、ミトコンドリアに、細胞の機能及び保全(integrity)に必要なATPを産出するその能力の漸進的な低下を引き起こす(Frenzel等、1984年)。
アコニターゼは、クレブス回路の必須のミトコンドリア酵素であり、クエン酸をイソクエン酸に変換する。それはまた、ミトコンドリアDNAの保存にも役割を果たす。このように、アコニターゼによって、このDNAの安定性及び遺伝は、細胞の代謝状態に密接に結び付けられる(Chen等、Proc Natl Acad Sci USA、2007年;104、13738〜13743頁)。
アコニターゼの活性は、その鉄−硫黄中心[4Fe−4S]2+の保全に依存する(Beiner等、Faseb J、1993年;7、1442〜1449頁)。酸化剤による、その鉄−硫黄中心[4Fe−4S]2+の攻撃は、アコニターゼを不活性化する鉄−硫黄中心[3Fe−4S]+の生成を引き起こす。
ミトコンドリアアコニターゼの活性の低下は、酸素障害及び細胞加齢の細胞内指標である。多くの変性障害もまた、酸化促進剤(pro−oxidative agent)のレベルの増加、及びミトコンドリアにおけるアコニターゼの活性の低下に関連している(Bulteau等、Biochemistry、2003年、42、14846〜14855頁)。アコニターゼの不活性化は、特に、NADH/NAD+の比の変化を引き起こす。具体的には、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼによるNADHの産生は、アコニターゼの活性の低下のせいで、クレブス回路において低下するであろう(上で引用されたHumphries等を参照;Nulton−Persson等、J Biol Chem、2001年、276、23357〜23361頁)。これらのNAD+蓄積条件下に、ROSの増加が、還元された代謝物の自動酸化のために、観察される。このような不活性化はまた、損傷を受けたタンパク質の蓄積に寄与する、酸化反応のカスケードも開始させ得る(上で引用されたHumphries等、2006年を参照)。このように、加齢の間、このような細胞損傷の蓄積を防ぎ、またこれらのROSによって損傷を受けたアコニターゼの修復及び再活性化の過程を促進するためには、皮膚細胞におけるミトコンドリアアコニターゼの十分な度合いの活性を保つことが不可欠である。
本発明の発明者等は、70歳のドナーから得た、培養ヒト皮膚線維芽細胞では、20歳のドナーから得たものに比べて、ミトコンドリアアコニターゼの活性が約85%だけ低化しており、年齢によるタンパク質の発現には如何なる変化もないことを実証していた。この発見から出発して、本発明者等は、ミトコンドリアアコニターゼを全て保護すること、及び、これらの老齢の培養線維芽細胞のミトコンドリアアコニターゼの活性を取り戻すことが、植物由来の分子又は抽出物により、該線維芽細胞を処理することによって可能であること、他方、若年のドナーの線維芽細胞に、この同じ処理を適用しても、ミトコンドリアアコニターゼの活性を修飾しないことを実証した。
ミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激するこのような効果は、この酵素が、クレブス回路及びミトコンドリアDNAの保存におけるその中心的な役割を維持すること、並びに、皮膚細胞の機能、特に代謝機能を保つことを可能にする。
これは、年輩の個人の皮膚細胞のミトコンドリアアコニターゼの活性の回復の結果であり、皮膚細胞の加齢を遅らせる効果が、抗加齢美容作用によって引き起こされる。
本発明の主な目的は、特に植物由来の、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する分子又は抽出物、美容組成物における活性剤としてのそれらの使用、及び該組成物を用いる美容ケア方法を提供することである。
本発明の主な目的は、また、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激することによる、抗加齢美容ケア方法を提供することである。
本発明の主な目的は、美容組成物における活性剤としての、美容上許容される(1つ又は複数の)分子、又は植物抽出物の使用を提示することである。
本発明の目的は、また、抗加齢美容組成物における活性剤としての、前記分子又は前記抽出物の使用、及び、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるために、又はその影響を遅らせるために、該組成物を用いる美容ケア方法である。
このように、本発明の主題の1つは、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるための、又はその影響を弱めるための美容ケア方法に関し、該方法は、それが、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を活性化又は刺激する美容上許容される少なくとも1種の活性剤の有効量の、顔又は身体の皮膚の少なくとも一部への送達を含むことを特徴とする。
そして、本発明の別の主題は、また、損傷を受けた皮膚、特に紫外線により損傷を受けた皮膚をケアするための美容ケア方法を対象とし、該方法は、それが、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を活性化又は刺激する美容上許容される活性剤の有効量の、顔又は身体の皮膚の少なくとも一部への送達を含むことを特徴とする。
本発明の方法の1つの特定の特徴によれば、局所送達される活性剤は、美容上許容される少なくとも1種の賦形剤もまた含む美容組成物に組み入れられる。
ミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する許容される美容活性剤は、天然又は合成由来の精製された分子であっても、或いは、代わりに、原材料、特に植物由来の原材料からの抽出プロセスの産物であってもよい。
本発明の特定の一実施形態によれば、前記美容活性剤は、シトラス(Citrus)属、若しくはシトラス属にそれらの少なくとも1種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する植物、モリンダ(Morinda)属に属する植物、又はハイビスカス(Hibiscus)属に属する植物を含む群から選択される少なくとも1種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなる。
本発明の別の特定の実施形態によれば、前記活性剤は、シトラス属とフォーチュネラ(Fortunella)属の交雑により得られる、×シトロフォーチュネラ(Citrofortunella)属に属する少なくとも1種の雑種、特にカラモンディン(Calamondin)(×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ(microcarpa))から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなる。
特定の一実施形態によれば、前記活性剤は、カラモンディンの果実の抽出物である。
本発明の別の特定の実施形態によれば、前記活性剤は、植物種のモリンダ シトリフォリア(citrifolia)に属する少なくとも1種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなる。
特定の一実施変形形態によれば、前記活性剤は、モリンダ シトリフォリアの果実の抽出物である。
本発明のさらに別の特定の実施形態によれば、前記活性剤は、植物種のハイビスカス サブダリファ(sabdariffa)に属する少なくとも1種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなる。
特定の一実施変形形態によれば、前記活性剤は、ハイビスカス サブダリファの花の抽出物である。
抽出物の調製に用いられる植物原料は、その植物の全部、或いはその植物の一部(例えば、根、根茎又は地上部分、特に、茎、葉、花、種子、果実若しくは花芽)であり得る。
それは、有利には、前記の種の1つの果実の全部又は果実の一部からなり得る。
好ましい抽出物は、植物種のハイビスカス サブダリファの花から得られる。このような抽出物は、例えば、グリーンテック(Greentech)社によって、Acides de Fleurs(登録商標)の名称で販売されている。
好ましい抽出物は、カラモンディンの果実から得られる。
別の好ましい抽出物は、モリンダ シトリフォリアの果実から得られる。このような抽出物は、例えば、ソラビア(Solabia)社によって、シトリフォリン(Citrifoline)(登録商標)の名称で販売されている。
抽出ステップ自体の前に、植物原料は、乾燥及び/又は粉砕されていてもよい、又は、代わりに、新たに収穫された状態であってもよい。
抽出物は、当業者に知られている様々な抽出方法により調製され得る。
抽出は、溶媒なしに、例えば、特に果実の全部又は果実の一部を圧搾することによって実施され得る。
しかし、有利には、抽出は、選ばれた植物原料を極性溶媒又は極性溶媒の混合物に接触させることによって、特に、適切な溶媒又は溶媒混合物による前記植物原料の浸漬、柔化(maceration)、煎出によって実施される。
極性溶媒は、有利には、水、C1〜C4アルコール(特に、エタノール又はブタノール)、グリコール(グリセロール、ブチレングリコール及びプロピレングリコールから優先的に選択される)、並びにこれらの混合物から選択される。
好ましい混合物は、少なくとも10v/v%のアルコール又はグリコールを含み、残りの部分は水からなる、少なくとも1種のアルコールと水、又は少なくとも1種のグリコールと水の混合物である。
抽出はまた、植物原料若しくは植物抽出物を部分的に若しくは完全に脱色する又はそれを精製することを目的とした、例えば、非極性溶媒又は溶媒混合物の溶液による植物原料又は抽出物の処理による、或いは、抽出物を活性炭粒子と接触させることからなる処理による、或いは、代わりに、超臨界CO2による処理による、植物原料若しくは植物抽出物の処理からなる追加のステップを任意選択で含んでいてもよい。
抽出は、抽出溶媒の部分的又は完全な除去ステップによって完了され得る。第1の場合には、抽出物は通常、かなりの量の有機溶媒が取り除かれた水性濃縮液が得られるまで濃縮され、第2の場合には、乾燥残留物が得られる。代わりに、抽出ステップからの生成物は、粉末状に、凍結乾燥されても、噴霧乾燥されてもよい。
粉末は、本発明による美容組成物に、得られたままの形態で使用されても、又は極性溶媒若しくは極性溶媒の混合物に分散又は溶解されてもよく、或いは、代わりに、固体担体に吸着させてもよい。
本発明の一実施変形形態によれば、ミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する薬剤は、該薬剤及び美容上許容される少なくとも1種の賦形剤を含む美容組成物の形で、この組成物を身体若しくは顔の皮膚に、又は外皮に付けることによって、局所送達される。
本発明による美容組成物は、所望の効果を生むのに有効な量の本発明の抽出物を含む。
本発明のいずれの態様でも、用語「有効量」は、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるのに、又はその影響を弱めるのに、必要とされる量に少なくとも等しい量を意味する。
有利には、本発明による美容組成物は、ミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する活性剤としての組成物を0.001質量%から5質量%、好ましくは0.01質量%から3質量%の間含む。
有利には、本発明の組成物は、また、本発明のものに類似の、及び/又は本発明のものを補足する美容効果を有する他の活性成分、並びに、顔料、染料、ポリマー、界面活性剤、レオロジー作用剤、芳香剤、電解質、pH調整剤、酸化防止剤、保存剤、及びこれらの混合物から特に選択され得る少なくとも1種の美容上許容される賦形剤も含み得る。
本発明による美容組成物は、セラム(serum)、ローション、クリーム、ヒドロゲル、好ましくは美顔用パック(mask)の形態で配合されても、或いはスティック若しくはパッチの形態であってもよい。
最後に、本発明は、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるための、又はそれらを処置するための美容活性剤としての、上で定義された活性剤の使用に関し、該美容剤は皮膚細胞のミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する。
本発明はまた、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるための、又はそれらを処置するための美容組成物の製造のための、本発明の美容活性剤の使用に関する。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の説明的記述から明瞭に分かってくるであろう、この説明は、本発明のいくつかの実施例(これらは、純粋に例示の目的で記載され、本発明の範囲の限定を決して生じない)に関連させて記載されている。
以下の記述及び実施例において、特に断らなければ、全てのパーセンテージは、質量基準で記載されており、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧である。
実施例1−試験を実施するために用いられるカラモンディン抽出物の調製
カラモンディン(×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ)の抽出物を、植物の果実全体を圧搾することによって調製する。
濾過し、次いで、遠心した後、果肉を、水とポリグリセロールの混合物により抽出する。
得られる抽出物は、35〜45質量%の固形分を含み、実施例2の試験に用いられ、また、美容組成物、特に実施例3のそれの製造にも用いられる。
カラモンディン(×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ)の抽出物を、植物の果実全体を圧搾することによって調製する。
濾過し、次いで、遠心した後、果肉を、水とポリグリセロールの混合物により抽出する。
得られる抽出物は、35〜45質量%の固形分を含み、実施例2の試験に用いられ、また、美容組成物、特に実施例3のそれの製造にも用いられる。
実施例2−ヒト線維芽細胞におけるミトコンドリアアコニターゼ活性の測定
材料及び方法
1.ヒト線維芽細胞の培養及び処理
材料及び方法
1.ヒト線維芽細胞の培養及び処理
・ 試験された抽出物
− 実施例1によるカラモンディンの抽出物
− ハイビスカス サブダリファの花の水性抽出物、グリーンテック社によって、Acides de Fleurs(登録商標)の名称で販売されている、22〜25質量%の固形分を含む
− モリンダ シトリフォリアの葉の水−グリコール抽出物、ソラビア社によって、シトリフォリン(登録商標)の名称で販売されている、1.5質量%から1.8質量%の固形分を含む。
− 実施例1によるカラモンディンの抽出物
− ハイビスカス サブダリファの花の水性抽出物、グリーンテック社によって、Acides de Fleurs(登録商標)の名称で販売されている、22〜25質量%の固形分を含む
− モリンダ シトリフォリアの葉の水−グリコール抽出物、ソラビア社によって、シトリフォリン(登録商標)の名称で販売されている、1.5質量%から1.8質量%の固形分を含む。
・ 培地及び試薬
線維芽細胞培養培地
DMEM 1/mlのグルコース(ギブコ(Gibco))
+10%のSVF
+1%のピルビン酸ナトリウム、100mM(ギブコ)
線維芽細胞培養培地
DMEM 1/mlのグルコース(ギブコ(Gibco))
+10%のSVF
+1%のピルビン酸ナトリウム、100mM(ギブコ)
活性剤の保存溶液
保存溶液は、市販の溶液からDMEM培地で調製する(%は、抽出溶液に関するパーセンテージとして表す)。
− ハイビスカス サブダリファの抽出物、培地中、6質量%
− モリンダ シトリフォリアの抽出物、培地中、6質量%
− カラモンディンの抽出物、培地中、6質量%、すなわち、約2.4質量%の固形分。
保存溶液は、市販の溶液からDMEM培地で調製する(%は、抽出溶液に関するパーセンテージとして表す)。
− ハイビスカス サブダリファの抽出物、培地中、6質量%
− モリンダ シトリフォリアの抽出物、培地中、6質量%
− カラモンディンの抽出物、培地中、6質量%、すなわち、約2.4質量%の固形分。
a−細胞培養及び処理
20歳のドナー及び70歳のドナーの形成外科から得られた初代培養のヒト線維芽細胞、12次継代。
20歳のドナー及び70歳のドナーの形成外科から得られた初代培養のヒト線維芽細胞、12次継代。
0日での継代培養
15×105線維芽細胞/(75cm2のディッシュ)、n=3、DMEM培地(10ml/ディッシュ)
15×105線維芽細胞/(75cm2のディッシュ)、n=3、DMEM培地(10ml/ディッシュ)
5日目の処理
保存溶液を、DMEM培地で希釈して、下記の濃度とする:
− ハイビスカス サブダリファの抽出物、培地中、1.5質量%
− モリンダ シトリフォリアの抽出物、培地中、2質量%
− 培地中2.5質量%のカラモンディン抽出物、すなわち、約1質量%の固形分。
保存溶液を、DMEM培地で希釈して、下記の濃度とする:
− ハイビスカス サブダリファの抽出物、培地中、1.5質量%
− モリンダ シトリフォリアの抽出物、培地中、2質量%
− 培地中2.5質量%のカラモンディン抽出物、すなわち、約1質量%の固形分。
7日目の細胞の回収
ミトコンドリアの調製
PBSにより2回すすぎ
氷ベッド上;2mlのホモジェネート化緩衝液中に回収。
ミトコンドリアの調製
PBSにより2回すすぎ
氷ベッド上;2mlのホモジェネート化緩衝液中に回収。
b−ミトコンドリアの分離
32個のT75ディッシュを各ドナーに用いる。集密した細胞を、2回、pH7.2のPBS緩衝液(リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2−0.13MのNaCl、3mMのKCl、8mMのNa2PO4及び1.4MのKH2PO4)により洗い、擦り取ることによって引き離し、次いで、4℃、1500×gで5分間遠心する。細胞ペレットをPBS緩衝液により洗い、再遠心し、次いで氷の中に置く。ペレットを冷ホモジェネート化緩衝液(0.3Mのマンニトール、0.1%のBSA、0.2mMのEDTA、10mMのHEPES、KOHによりpH7.4に調整、ペレット容積の5倍量)に分散させ、2mlのガラスホモジェナイザーにより氷上でホモジェネートにする。細胞懸濁液を、4℃、1000×gで10分間遠心する。上澄みを、4℃、10000×gで15分間再遠心する。上澄みは、細胞質画分を含み、ペレットはミトコンドリア画分に相当する。ミトコンドリア画分を、冷ホモジェネート化緩衝液により2回洗う。タンパク質濃度は、ブラッドフォード(Bradford)法に従って測定する。
32個のT75ディッシュを各ドナーに用いる。集密した細胞を、2回、pH7.2のPBS緩衝液(リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2−0.13MのNaCl、3mMのKCl、8mMのNa2PO4及び1.4MのKH2PO4)により洗い、擦り取ることによって引き離し、次いで、4℃、1500×gで5分間遠心する。細胞ペレットをPBS緩衝液により洗い、再遠心し、次いで氷の中に置く。ペレットを冷ホモジェネート化緩衝液(0.3Mのマンニトール、0.1%のBSA、0.2mMのEDTA、10mMのHEPES、KOHによりpH7.4に調整、ペレット容積の5倍量)に分散させ、2mlのガラスホモジェナイザーにより氷上でホモジェネートにする。細胞懸濁液を、4℃、1000×gで10分間遠心する。上澄みを、4℃、10000×gで15分間再遠心する。上澄みは、細胞質画分を含み、ペレットはミトコンドリア画分に相当する。ミトコンドリア画分を、冷ホモジェネート化緩衝液により2回洗う。タンパク質濃度は、ブラッドフォード(Bradford)法に従って測定する。
2.タンパク質アッセイ(ブラッドフォード法)
a−検量範囲の製剤
BSA保存溶液:50μg/ml(バイオラッド(BIORAD);標準タンパク質)
a−検量範囲の製剤
BSA保存溶液:50μg/ml(バイオラッド(BIORAD);標準タンパク質)
200μlのクーマシー(Coomassie)ブルーG250を各チューブに加える。このブルーは、保存溶液の5倍希釈によって、用時調製する。
b−試料の調製
− タンパク質濃度>3mg/mlの場合、細胞抽出物は、100倍に希釈し、次いで、100mlの希釈液を取る。
+700μlのミリQ(milliQ)水
+200μlのブルー
− タンパク質濃度>3mg/mlの場合、細胞抽出物は、100倍に希釈し、次いで、100mlの希釈液を取る。
+700μlのミリQ(milliQ)水
+200μlのブルー
− タンパク質濃度<3mg/ml場合、10μlの細胞抽出物を取る。
+790μlのミリQ水
+200μlのブルー
+790μlのミリQ水
+200μlのブルー
c−試料アッセイ
試料は、渦流撹拌(vortexing)によってホモジェネートにし、5分間放置した後、次に、595nmの波長の光学濃度を、分光光度計で読み取る。
試料は、渦流撹拌(vortexing)によってホモジェネートにし、5分間放置した後、次に、595nmの波長の光学濃度を、分光光度計で読み取る。
3.ミトコンドリアアコニターゼ活性のアッセイ
a−試薬
− 25mM、pH7.5のトリス緩衝液(シグマ(Sigma))
− クエン酸ナトリウム(シグマ)
− イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(シグマ)
− MnCl2(シグマ)
a−試薬
− 25mM、pH7.5のトリス緩衝液(シグマ(Sigma))
− クエン酸ナトリウム(シグマ)
− イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(シグマ)
− MnCl2(シグマ)
b−ミトコンドリアアコニターゼ活性のアッセイの原理
ミトコンドリアアコニターゼ活性を、25mMのトリス−HCl+0.6mMのMnCl2及び0.05%のトリトン(Triton)X−100中、0.2mMのNADP+、5mMのクエン酸ナトリウム及び1単位/mlのイソクエン酸デヒドロゲナーゼを含む反応媒体中、340nmでの吸光度を測定することによって定量する。
ミトコンドリアアコニターゼ活性を、25mMのトリス−HCl+0.6mMのMnCl2及び0.05%のトリトン(Triton)X−100中、0.2mMのNADP+、5mMのクエン酸ナトリウム及び1単位/mlのイソクエン酸デヒドロゲナーゼを含む反応媒体中、340nmでの吸光度を測定することによって定量する。
アッセイのために、50μgのミトコンドリアタンパク質を、25℃で、1.0mlの反応媒体に加える。340nmでの測定を、1cmのセルで、5分間隔で記録し、ミトコンドリアアコニターゼ活性は、約5分間に渡る340nmでの吸光度の直線的増加により計算する。活性は、6.22×103M−1cm−1のNADPHの対するモル吸光係数を用いること、及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼによる、1分子のクエン酸の1分子のNADPHへの変換を仮定することによって得る。
4.ウェスタンブロット法(WB)によるミトコンドリアアコニターゼアッセイ
a−アッセイの原理
タンパク質電気泳動を、レムリ(Laemmli)の方法(Nature,1970年;277、680頁)に従って、不連続緩衝液で、変性及び還元条件下に、1mmから1.5mmの厚さのポリアクリルアミドミニゲルで実施する。12%のT及び2.7%のCを含むゲルにより、低分子量タンパク質(20から120kDa)のタンパク質が分離される。8%のT及び2.7%のCを含むゲルにより、高分子量タンパク質(35から250kDa)が分離される。
ゲルの製造に必要な溶液は、付録Aに記載されている。
a−アッセイの原理
タンパク質電気泳動を、レムリ(Laemmli)の方法(Nature,1970年;277、680頁)に従って、不連続緩衝液で、変性及び還元条件下に、1mmから1.5mmの厚さのポリアクリルアミドミニゲルで実施する。12%のT及び2.7%のCを含むゲルにより、低分子量タンパク質(20から120kDa)のタンパク質が分離される。8%のT及び2.7%のCを含むゲルにより、高分子量タンパク質(35から250kDa)が分離される。
ゲルの製造に必要な溶液は、付録Aに記載されている。
分離ゲル
ゲルは、泳動の少なくとも2時間前に注ぐ。
ゲルの注入は、濃縮ゲルのために用意されたコームの最下部から約0.5mmまで、ピペットを用いて実施する。無水エタノールを表面に加えて、均一なベースラインを得る(±1ml/ゲル)。
ゲルは、泳動の少なくとも2時間前に注ぐ。
ゲルの注入は、濃縮ゲルのために用意されたコームの最下部から約0.5mmまで、ピペットを用いて実施する。無水エタノールを表面に加えて、均一なベースラインを得る(±1ml/ゲル)。
濃縮ゲル
エタノールを取り除く。2.5mlのゲルを、ポリエチレン製のパスツール全容(transfer)ピペット(バイオラッド)を用いて注ぎ、次いで、コームを挿入する。ゲルは1時間後に重合している。
エタノールを取り除く。2.5mlのゲルを、ポリエチレン製のパスツール全容(transfer)ピペット(バイオラッド)を用いて注ぎ、次いで、コームを挿入する。ゲルは1時間後に重合している。
b−試料の調製
ミトコンドリアタンパク質を、還元レムリ条件下に、12%のTを含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。試料(25〜40μgのタンパク質)を、付着物緩衝液中、100℃で5分間、還元する。試料及びマーカーを付着させた後、50mMのトリス−HCl、100mMのグリシン、2mMのEDTAのpH8.4の緩衝液(0.1%のSDSを含む)中、200Vで1時間、泳動を実施する。
ミトコンドリアタンパク質を、還元レムリ条件下に、12%のTを含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。試料(25〜40μgのタンパク質)を、付着物緩衝液中、100℃で5分間、還元する。試料及びマーカーを付着させた後、50mMのトリス−HCl、100mMのグリシン、2mMのEDTAのpH8.4の緩衝液(0.1%のSDSを含む)中、200Vで1時間、泳動を実施する。
c−電気泳動
付着
試料は95℃で5分間加熱する。
付着させる容積は、所望の量のタンパク質に応じて決まる(1mmのゲルで、最大容積=25μl、1.5mmのゲルで40μl)。基準量は10μgのタンパク質であり、10μlに相当する;次いで、それは、標的タンパク質の発現に合わせて変える。
付着
試料は95℃で5分間加熱する。
付着させる容積は、所望の量のタンパク質に応じて決まる(1mmのゲルで、最大容積=25μl、1.5mmのゲルで40μl)。基準量は10μgのタンパク質であり、10μlに相当する;次いで、それは、標的タンパク質の発現に合わせて変える。
コームは取り除く。200mlの1×泳動緩衝液を、ゲル上に、2つのゲルの間の中央コンパートメントに、次いで、4分の1のレベルまでタンクに注ぐ。
試料、及び10μlのプレステインド低分子量コントロール(バイオラッド、プレステインド SDS−PAGE標準ローレインジ(Low Range))又は高分子量コントロール(アマシャム(Amersham)、フルレインジレインボー(Full Range Rainbow))は、マイクロピペットに取り付けた、しだいに細くなる先端部を用いて付着させる。
泳動
電気泳動は、室温で、200Vで実施する。この電気泳動は、泳動の先端がゲルを出た時に停止する(約40分間の泳動)。
電気泳動は、室温で、200Vで実施する。この電気泳動は、泳動の先端がゲルを出た時に停止する(約40分間の泳動)。
膜へのタンパク質のセミ−ドライ転写
2枚の厚い濾紙(バイオラッド)及びセルロース膜(バイオラッド)を、トービン(Towbin)転写緩衝液(PNAS、1979年、76(9)4350〜4頁)(付録Bを参照)に浸す。
2枚の厚い濾紙(バイオラッド)及びセルロース膜(バイオラッド)を、トービン(Towbin)転写緩衝液(PNAS、1979年、76(9)4350〜4頁)(付録Bを参照)に浸す。
セミ−ドライ転写装置(ビイオラッド)で、湿った厚い1枚の濾紙をアノードに置く。
一旦、泳動が完了すると、濃縮ゲルを取り除き、分離ゲルをセルロース膜に合わせる。ゲルを含む膜を、1枚の前記濾紙の上に置く。2枚目の濾紙をゲル上に置く。
「サンドイッチ」の作製中、転写を妨げないように、ガラス棒を用いて空気の泡を全て取り除くように注意する。装置を、カソードをなす蓋により閉じる。タンパク質の転写は、10V、90分間で実施する。
ポンソーレッド(Ponceau Red)による染色
転写の良否を調べるために、タンパク質をポンソーレッド(シグマ)により染色する。セルロース膜をミリQ水によりすすぎ、次いで、ポンソーレッドの浴に、撹拌しながら10分間一度浸す。次に、タンパク質のバンドにだけ着色が残るまで、ミリQ水のいくつかの浴で洗う。膜をプラスチックの袋に入れ、スキャンする。タンパク質のバンドは、転写されたタンパク質の全量を求めるために定量され得る。
転写の良否を調べるために、タンパク質をポンソーレッド(シグマ)により染色する。セルロース膜をミリQ水によりすすぎ、次いで、ポンソーレッドの浴に、撹拌しながら10分間一度浸す。次に、タンパク質のバンドにだけ着色が残るまで、ミリQ水のいくつかの浴で洗う。膜をプラスチックの袋に入れ、スキャンする。タンパク質のバンドは、転写されたタンパク質の全量を求めるために定量され得る。
非特異的結合部位のブロッキング
膜は、PBS−T緩衝液(付録B参照)中5%のスキムミルク(Regilait)からなる、非特異的結合部位をブロッキングするための溶液(20ml/膜)中、4℃で一夜、又は室温で90分間、撹拌する。
膜は、PBS−T緩衝液(付録B参照)中5%のスキムミルク(Regilait)からなる、非特異的結合部位をブロッキングするための溶液(20ml/膜)中、4℃で一夜、又は室温で90分間、撹拌する。
免疫検出
抗体の参照事項及び最適希釈は付録Cに記載する。
抗体の参照事項及び最適希釈は付録Cに記載する。
非特異的部位をブロッキングした後、膜はPBS−T中で素早くすすぐ。この膜を、抗体に応じて5%(m/v)のミルクを含む又は含まないPBS−Tで最適濃度に希釈した一次抗体に、撹拌しながら、室温で60分間、又は4℃で一夜接触させる。
次いで、結合していない過剰の遊離抗体を除去するために、それを、PBS−T中で3回、各10分間、素早くすすぐ。次に、それを、室温で撹拌しながら、PBS−T又は5%ミルク(5ml)で希釈した、ペルオキシダーゼに結合した適切な2次抗体に接触させる。45分間のインキュベーションの後、それを、2回素早くすすぎ、次いで、PBS−T緩衝液により5回、各5分間洗い、最後に、1×PBSにより洗う。水気を切った後、それを、タンパク質側を上にして、台所用ラップフィルム(サラン(SARAN))の上に置く。
膜を、ペルオキシダーゼの基質としてルミノールを用いる高感度化学発光検出キット(アマシャム;ECLウェスタンブロッティング)を用いて可視化する。ペルオキシダーゼ及び増幅剤の作用の下で、ルミノールは酸化され、過渡励起状態に移る。基底状態への復帰は、光子の放出によって起こり、これらの光子が、膜上に置かれたオートラジオグラフィーフィルムに当たる。
検出キットの2つの溶液の各々の1ml(すなわち2ml、膜を覆うのに必要とされる最小容積)を一緒に混合する。混合物を直ちに膜の上に均一に注ぎ、室温で正確に1分間、接触させておく。水気を切った膜を、サランラップフィルムで包み、光から保護されたカセットに入れ、次いで、プレフラッシュしたオートラジオグラフィーフィルム(アマシャム、ハイパーフィルム(Hyperfilm)ECL)により覆う。5分間の露光の後、オートラジオグラフィーフィルムは可視化される。所望のシグナルを最適にするために、必要であれば、新しいフィルムが露光されてもよい(1時間の露光時間まで)。バンドは、ゲルズアナリスツ(Gels Analysts)3.01ソフトウェアにより定量する。
5.IEFによるミトコンドリアアコニターゼアッセイ
この技法により、ミトコンドリアアコニターゼの3つの形態、活性形態[4Fe−4S]2+、不活性形態[3Fe−4S]+、及びアポ酵素形態が、それらの等電点に従って分離される。
この技法により、ミトコンドリアアコニターゼの3つの形態、活性形態[4Fe−4S]2+、不活性形態[3Fe−4S]+、及びアポ酵素形態が、それらの等電点に従って分離される。
50μgのミトコンドリアタンパク質を、pH3〜10のIEFゲル(バイオラッド)上に付着させる。泳動は、100Vで1時間;250Vで1時間及び500Vで30分間、クライテリオン(criterion)システム(バイオラッド)で実施する。泳動の後、ゲルをニトロセルロース膜に転写し、抗−ミトコンドリアアコニターゼウェスタンブロット法を、4節に記載のプロトコールに従って実施する。
結果
ミトコンドリアアコニターゼ活性を、これらの培養細胞からミトコンドリアを分離後、評価した。加齢と共にミトコンドリアアコニターゼ活性が低下することが実証される。
ミトコンドリアアコニターゼ活性を、これらの培養細胞からミトコンドリアを分離後、評価した。加齢と共にミトコンドリアアコニターゼ活性が低下することが実証される。
これらの測定は、20歳のドナーと比較して、70歳のドナーのミトコンドリアでは、ミトコンドリアアコニターゼの活性が約85%低下していることを示す(図1参照)。
しかし、この酵素の発現、すなわち、若年及び老年の線維芽細胞に存在する酵素の量には有意な相違はない(図1参照)。
老齢の線維芽細胞で示されるミトコンドリアアコニターゼ活性の低下が、この酵素のFe−S中心の酸素障害に帰因しなかったかどうかを調べるために、酵素の3つの構造形態(アポ酵素、活性形態及び不活性形態)を、等電点電気泳動(isoelectric focusing、IEF)によって、それらの等電点に従って分離した。この方法を用いて、アポ酵素に年齢による違いが示されるが、他の形態には違いがない(図2参照)。
本発明者等は、ミトコンドリアアコニターゼの活性が、培養したヒト皮膚線維芽細胞で、年齢と共に低下することを示した。この活性の低下は、年齢によるこのタンパク質の発現の変化を伴わない。
この結果から出発して、本発明者等は、異なる年齢のこれらのドナーから得られる皮膚線維芽細胞におけるミトコンドリアアコニターゼの活性への、試験された活性剤の効果を評価した(図3及び表1参照)。
結果は、若年ドナー(20歳)からの未処理線維芽細胞におけるミトコンドリアアコニターゼの活性(これが100%のレベルをなす)に対するパーセンテージとして表される。
これらの結果は、これらの抽出物による処理が、酸化作用に対してミトコンドリアアコニターゼを保護することを可能にすることを示す。これらの抽出物により、20歳のドナーからの線維芽細胞を処理した後48時間で、ミトコンドリアアコニターゼの有意の活性化はない。他方、70歳のドナーからの線維芽細胞への同じ処理により、酵素は完全に保護されるという結果が得られる。
美容配合物の例
実施例3:カラモンディン抽出物を含む美容組成物
実施例1で得られた抽出物を、得られたままの形態で、下の美容組成物に用いる。
実施例3:カラモンディン抽出物を含む美容組成物
実施例1で得られた抽出物を、得られたままの形態で、下の美容組成物に用いる。
− カラモンディンの植物抽出物(実施例1) 1%
− 界面活性剤(アルラセル(Arlacel)(登録商標)165VP) 5%
− 95%セチルアルコール 1%
− ステアリルアルコール 1%
− 蜜蝋 1.5%
− オイル(パールリーム(Perleam)(登録商標)) 8.5%
− グリセリドトリカプラート/カプリラート 3%
− シリコーンオイル(ジメチコン100CS) 1%
− ポリマー(ケルトロール(Keltrol)(登録商標)) 0.35%
− 水酸化ナトリウム 0.04%
− EDTA四ナトリウム粉末 0.1%
− 保存剤 0.5%
− 水 100となる量
− 界面活性剤(アルラセル(Arlacel)(登録商標)165VP) 5%
− 95%セチルアルコール 1%
− ステアリルアルコール 1%
− 蜜蝋 1.5%
− オイル(パールリーム(Perleam)(登録商標)) 8.5%
− グリセリドトリカプラート/カプリラート 3%
− シリコーンオイル(ジメチコン100CS) 1%
− ポリマー(ケルトロール(Keltrol)(登録商標)) 0.35%
− 水酸化ナトリウム 0.04%
− EDTA四ナトリウム粉末 0.1%
− 保存剤 0.5%
− 水 100となる量
美容組成物は、様々な成分を1ステップ又は複数ステップで一緒に混合することによって、当業者に知られている通常の仕方で調製する。
この組成物は、先に示された抗加齢美容効果を得るために、数週間、毎日、顔に付けられ得るナイトクリームである。
付録A
I−不連続緩衝液法において、変性及び還元条件下に、電気泳動ゲルのために用いられた緩衝液及び溶液
I−不連続緩衝液法において、変性及び還元条件下に、電気泳動ゲルのために用いられた緩衝液及び溶液
モノマー溶液:
アクリルアミド/ビスアクリルアミド、30%T、2.67%C(バイオラッド)
アクリルアミド/ビスアクリルアミド、30%T、2.67%C(バイオラッド)
過硫酸アンモニウム:(NH4)2S2O8:(シグマ) 10%(w/v)、すなわち、100mg/ml
10×ブロモフェノールブルー(飽和溶液):
スパチュラ先端量のブロモフェノールブルーを、5mlの2×レムリ緩衝液に分散させる。撹拌、超音波処理、次いで遠心後、上澄みを回収する。
スパチュラ先端量のブロモフェノールブルーを、5mlの2×レムリ緩衝液に分散させる。撹拌、超音波処理、次いで遠心後、上澄みを回収する。
付録B
転写及び免疫検出のための溶液
転写及び免疫検出のための溶液
PBS−T緩衝液
10×PBS(インビトロジェン(Invitrogen))の10倍希釈
+0.1%のトゥイーン(Tween)20(シグマ)
10×PBS(インビトロジェン(Invitrogen))の10倍希釈
+0.1%のトゥイーン(Tween)20(シグマ)
ポンソーレッド(シグマ)
0.1%(w/v)溶液、5%の酢酸溶液中
0.1%(w/v)溶液、5%の酢酸溶液中
付録C
1次及び2次抗体のリスト
1次及び2次抗体のリスト
Claims (13)
- 皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるための、又はその影響を弱めるための美容組成物であって、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を活性化若しくは刺激する美容上許容される少なくとも1種の活性剤を有効量含む組成物。
- 損傷を受けた皮膚、特に紫外線により損傷を受けた皮膚をケアするための美容組成物であって、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を活性化若しくは刺激する美容上許容される活性剤を有効量含む組成物。
- 前記活性剤が、美容上許容される少なくとも1種の賦形剤もまた含む美容組成物に組み入れられることを特徴とする、請求項1又は2に記載の美容組成物。
- 活性剤が、シトラス属、若しくはシトラス属にそれらの少なくとも1種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する植物、モリンダ属に属する植物、又はハイビスカス属に属する植物を含む群から選択される少なくとも1種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の美容組成物。
- 活性剤が、シトラス属とフォーチュネラ属の交雑により得られる、×シトロフォーチュネラ属に属する少なくとも1種の雑種、特にカラモンディン(×シトロフォーチュネラ ミクロカルパ)から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の美容組成物。
- 活性剤がカラモンディンの果実の抽出物であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の美容組成物。
- 前記活性剤が、植物種のモリンダ シトリフォリアに属する少なくとも1種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の美容組成物。
- 活性剤がモリンダ シトリフォリアの果実の抽出物であることを特徴とする、請求項1〜4及び7のいずれか一項に記載の美容組成物。
- 前記活性剤が、植物種のハイビスカス サブダリファに属する少なくとも1種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の美容組成物。
- 活性剤がハイビスカス サブダリファの花の抽出物であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の美容組成物。
- 活性剤の濃度が、組成物の0.001質量%と5質量%の間、好ましくは1質量%から3質量%であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の美容組成物。
- アコニターゼの活性の発現を活性化若しくは刺激する活性剤が、ホスホジエステラーゼを阻害する分子若しくは抽出物、好ましくはカフェインと関連する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の美容組成物。
- 本発明による美容組成物が、セラム、ローション、エマルジョン、例えばクリーム、又は、代わりに、ヒドロゲル、好ましくは美顔用パックの形態に配合される、或いはスティック若しくはパッチの形態であり得ることを特徴とする、請求項3〜12のいずれか一項に記載の美容組成物。
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