WO2023111458A2 - Fraction bioactive isolée de roses de la variété evanrat - Google Patents

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WO2023111458A2
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Virginie Pecher
Patrick Choisy
Jocelyne Franchi
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L V M H Recherche
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    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/81—Preparation or application process involves irradiation

Definitions

  • TITLE Bioactive fraction isolated from roses of the Evanrat variety
  • the present invention relates to an extract of roses of the Evanrat variety, also called 'Jardin de Granville®' roses, in the form of an isolated bioactive fraction, in particular an extract in the form of an isolated bioactive fraction of rose petals , as well as its method of preparation.
  • the invention further relates to a composition comprising an extract of roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, in the form of an isolated bioactive fraction according to the invention and its use for promoting and/or improving skin nutrition, the skin barrier function, the rhythmic process of skin cells, preventing and/or slowing down the aging of the skin, and moreover preventing and/or slowing down the phenomena of chronic micro-inflammation of the skin.
  • the skin is the body's first protective barrier against the environment. It is daily subject to the effects of factors of exogenous origin (eg: UV radiation, temperature variations, atmospheric pollution, cigarette smoke, etc.) or endogenous (eg, hormones, etc.). All of these factors can disturb its balance, in particular its micro-nutritional balance, and/or alter its barrier function, and/or induce micro-inflammatory stress and ultimately contribute to skin ageing.
  • factors of exogenous origin eg: UV radiation, temperature variations, atmospheric pollution, cigarette smoke, etc.
  • endogenous eg, hormones, etc.
  • Patent application FR3066388 from LVMH Research describes in particular an aqueous extract of roses in the form of a 'cryoextract' and its in vitro effects, in culture of human keratinocytes, on the stimulation of the expression of several clock genes such as CRY2 , PERI and PER3, as well as on the protein expression of keratin 10 (KRT10), a marker of epidermal maturation, and desmoglein 1 (DSG1), a marker of epidermal cohesion.
  • KRT10 keratin 10
  • DSG1 desmoglein 1
  • the Applicant has thus developed a new extract from roses of the Evanrat variety, or ‘Jardin de Granville®’ roses, in particular, a new extract from the petals of said roses, in the form of an isolated bioactive fraction.
  • this new extract in the form of a "bioactive serum fraction”, also called “bioactive fraction isolated from roses” has effects that are further improved compared to those already known and described in the prior art.
  • the extract in the form of a bioactive fraction isolated from roses of the Evanrat variety, or ‘Jardin de Granville®’ roses, according to the invention improves skin nutrition by promoting cell survival in conditions of glucose deprivation.
  • the extract in the form of a bioactive fraction isolated from roses according to the invention acts on certain signaling pathways, and thus promotes and/or improves the skin barrier function, promotes and/or improves the rhythmic process of cells cutaneous, prevents and/or slows down the aging of the skin and prevents and/or slows down the phenomena of cutaneous micro-inflammation.
  • the present invention relates to a rose extract in the form of an isolated bioactive fraction, obtained from fresh roses of the Evanrat variety.
  • said rose extract in the form of an isolated bioactive fraction comprises at least 500 pg/pL of at least one monosaccharide sugar chosen from fructose, glucose and sucrose, and/or at least 500 mg/Kg of at least one mineral selected from potassium, calcium and sodium.
  • said extract in the form of a bioactive fraction isolated from roses according to the invention is characterized in that said extract is obtained from fresh rose petals of the Evanrat variety.
  • said extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh roses of the Evanrat variety according to the invention is characterized in that it is obtained by a process comprising the steps: a) cleaning the plant material, maceration, pressing then mechanical separation of the plant material to obtain an intracellular colloidal dispersion (INN) and a fiber-enriched material (fraction A); b) destabilization of the DCI with electromagnetic waves then mechanical separation of the intracellular colloidal dispersion (DCI) to obtain the supernatant A and a Membrane Fraction (fraction B); c) adjustment of the pH level in supernatant A until a pH greater than 6 is obtained, preferably a pH ranging from 6 to 7, then mechanical separation of supernatant A to obtain supernatant B and fraction C (cytoplasmic fraction) ; d) adjustment of the pH level in super
  • the present invention also relates to a process for the preparation of an extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh roses of the Evanrat variety or 'rose Jardin de Granville®' variety as defined in the present invention comprising the steps of : a) cleaning of the plant material, maceration, pressing then mechanical separation of the plant material to obtain an intracellular colloidal dispersion (INN) and a material enriched in fibers (fraction A); b) destabilization of the DCI with electromagnetic waves then mechanical separation of the intracellular colloidal dispersion (DCI) to obtain the supernatant A and a Membrane Fraction (fraction B); c) adjustment of the pH level in supernatant A until a pH greater than 6 is obtained, preferably a pH ranging from 6 to 7, then mechanical separation of supernatant A to obtain supernatant B and fraction C (cytoplasmic fraction) ; d) adjustment of the pH level in supernatant B until a pH of less than 4.5 is obtained, then mechanical separation of supernatant B to
  • the present invention for a composition for topical application to the skin and/or the lips, in particular the skin of the face and/or the neck, comprising, in a physiologically acceptable medium, at least an effective amount of at least one extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh roses of the Evanrat variety as defined in the present invention.
  • said composition is characterized in that the extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh roses of the Evanrat variety is present in the composition in a content ranging from 0.001 to 50%, in particular from 0.01 to 20%, preferably from 0.01 to 10% and more preferably from 0.011 to 5% by weight of raw material relative to the total weight of said composition.
  • the invention also relates to a method for the cosmetic treatment of the skin and/or the lips, intended to promote and/or improve skin nutrition; promote and/or improve skin firmness promote and/or improve skin barrier function, promote and/or improve rhythmic processing of skin cells, and/or prevent and/or slow skin aging, including application to the skin and/or the lips, in particular the skin of the face and/or the neck, of a cosmetic composition as defined in the present invention.
  • the invention further relates to the use of at least an effective amount of at least one extract of in the form of an isolated bioactive fraction fresh roses of the variety Evanrat as defined in the present invention as an agent for promoting and/or improve skin nutrition; promote and/or improve skin firmness, promote and/or improve the skin barrier function, promote and/or improve the rhythmic process of skin cells, prevent and/or slow down the aging of the skin and/or lips, in particular the face and/or neck skin.
  • the invention also relates to an extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh roses of the Evanrat variety according to the invention or composition comprising it for its use in preventing and/or slowing down the phenomena of micro-inflammation induced by a stress of the skin and/or lips, in particular the skin of the face and/or neck.
  • FIG. 1 extraction process used according to the invention
  • FIG. 2 Effect of different extracts on protein expression of filaggrin in human skin cultures.
  • FIG. 3 Effect of different extracts on the gene expression of 11 B-HSD1 in cell cultures of human keratinocytes.
  • FIG. 4 Effect of different extracts on the protein expression of the CLOCK gene in human skin cultures.
  • FIG. 5 Effect of different extracts on cell survival under conditions of glucose deprivation in cell cultures of human keratinocytes.
  • FIG. 8 Effect of different extracts on fibrilin-1 fiber length in human skin cultures.
  • FIG. 9A Effect of different extracts on the extracellular secretion of HMGB1 in cell cultures of human keratinocytes under LPS stress conditions.
  • FIG. 9B Immunolabelling of the membrane after Western-blot, quantification of the results.
  • FIG. 10 Effect of different extracts on the protein expression of COX-2 in human skin cultures under LPS stress conditions.
  • FIG. 11 Effect of different extracts on protein expression of transglutaminase-1 (TGM-1) in human skin cultures under LPS stress.
  • bioactive fraction or “bioactive serum fraction” or “serum fraction” or “bioactive fraction isolated from roses” is meant an extract of roses of the Evanrat variety, or rose 'Jardin de Granville®', comprising the enzymes, proteins, sugars, ions and other active molecules present in the cytosol of the cells making up the various plant tissues of roses.
  • the extract according to the invention is distinct from a cryoextract of rose petals as described in application FR3066388.
  • keratinous material is meant the skin and/or its appendages, and the lips, in particular the skin of the face and/or of the body and the lips.
  • micro-inflammation or “chronic micro-inflammation of the skin” is meant, according to the invention, invisible (silent) inflammatory processes taking place locally in the skin and which, if they degenerate or are poorly resolved, become chronic. Over time, these repeated micro-inflammatory events contribute to skin aging.
  • cleaning is meant the removal of debris from fresh Granville® roses, and preferably fresh petals, prior to further processing, in a manner that avoids injury to the plant, or the removal of valuable components. For example, it can be done by low pressure rinsing with potable water under conditions where the runoff wash would not substantially contain plant pigments. Excess wash water is then removed from the washed plants.
  • maceration is meant the fact of transforming the fresh Granville® roses, and preferably the fresh petals, into smaller particles to break their integrity and subsequently facilitate the expulsion of the liquid intracellular colloidal dispersion (ICD).
  • suitable maceration implements include, but are not limited to, devices such as a crusher, grinder, or grinder (eg, cutter mill, hammer mill, etc.).
  • the maceration step can include temperature monitoring and selection of maceration parameters to ensure that there is no significant increase in plant material temperature. during this step.
  • pressing is meant the separation of the liquid material from the fresh Granville® roses, and preferably from the fresh petals, by applying a mechanical force. This includes, but is not limited to, techniques such as ambient gravity drainage, pressing by a heavy object, centrifugal force from a rotary expeller, piston pressure from a hydraulic press, or rollers or a screw of the appropriate type for a press.
  • material enriched in fibers or “MEF” or “FEM” (Fibre Enriched Material) we mean a solid and/or semi-solid fraction enriched with fibers of fresh Granville® roses, preferably fresh petals, whose Liquid intracellular colloidal dispersion (ICD) was removed by pressing.
  • intracellular colloidal dispersion or “INN” or “ICD” (Intracellular Colloidal Dispersion) is meant the liquid material expelled by pressing fresh Granville® roses, preferably fresh petals.
  • the resulting liquid contains dispersed solid and/or semi-solid particles and, potentially, water-immiscible liquid droplets of various sizes (collectively referred to as particles), in a contiguous aqueous medium.
  • the particles consist mainly of plant cell organelles, organelle fragments and fiber-enriched waste materials.
  • the aqueous medium is mainly made up of cytosols and vacuoles.
  • Adjustment refers to the modification of the activities of the hydroxide and hydronium ions in the aqueous medium of the INN or of the aqueous fractions produced by a subsequent treatment of the INN, the activity of the hydronium ion remaining in the range found in viable plant cells (for example, between pH 3 and pH 9).
  • This alteration can be accomplished, for example, by a separation process such as S/L filtration, centrifugation, membrane filtration (with bipolar membranes, ultrafiltration and microfiltration, reverse osmosis), and/or by addition of a weak acid or a weak alkali/base and by precipitation.
  • the adjustment parameters are selected to be sufficient for a particular change in physico-chemical parameters, such as pH, or surface potential at the electrolyte-air interface. Such settings facilitate subsequent destabilization and/or separation steps; or create the conditions for good conservation and stabilization.
  • stabilizing is meant the treatment of the adjusted ICD using electromagnetic waves to transiently modify physical properties (such as s0 which is the real component of the low frequency dielectric constant). Particular modifications have been unexpectedly found to degrade the stability of INN by causing particles to agglomerate and/or aggregate into assemblies that are large and stable enough to allow and/or improve after separation into fractions, with some desirable properties.
  • separation is meant the separation of solid and/or semi-solid particles, and droplets of non-aqueous liquid from an aqueous liquid by exploiting the density and/or the size of the particles. This includes, but is not limited to, techniques such as dewatering, filtration (including filtration using a pressure gradient), skimming, ambient gravity sedimentation, decantation, centrifugation, or a combination of the above. Preferably, continuous flow mechanical separation will be used, but this does not exclude batch processing.
  • Separatation 1 and “Separation 2" refer to the respective process steps, carried out with respective parameters.
  • supernatant is meant an aqueous material from which particles have been separated.
  • Supernatant A and Supernatant B refer to the supernatants resulting from the respective separation steps of the process.
  • Precipitate is meant the particles from which an aqueous material has been separated.
  • Fraction B and Fraction C refer to the precipitates resulting from the respective separation steps of the process.
  • fresh Granville® rose serum fraction and “fresh Granville® rose petal serum fraction” refer to compositions produced by the process as shown above and in Figure 1 without preservatives and/or stabilizers added to protect the ingredient composition against environmental factors such as temperature, atmosphere (eg oxygen), light and microorganisms.
  • preservatives and/or stabilizers are meant substances which, when added to a “fresh Granville® rose petal serum fraction”, preferably a “fresh Granville® rose petal serum fraction”, protect it against environmental factors such as temperature, atmosphere (eg oxygen), light and micro-organisms.
  • suitable substances may include, without limitation, a preservative, a stabilizer and/or a mixture thereof.
  • Granville® rose serum or "fresh Granville® rose extract” as used herein means a combination of a fraction of fresh Granville® rose serum and preservatives and/or stabilizers.
  • Gramville® Rose Petal Serum or "Granville® Fresh Rose Petal Extract” as used herein means a combination of a fraction of Granville® Fresh Rose Petal Serum and preservatives and /or stabilizers.
  • Rose extract Bioactive fraction isolated from roses and ed of The present invention therefore relates to a new rose extract obtained by a particular process, in particular implementing a step of destabilization by electromagnetic waves.
  • the extract obtained at the end of this process has a higher activity compared to the aqueous extracts of roses, already known.
  • This extract is also called “Rose De Granville® Serum”
  • the rosebush or rose 'Jardin de Granville®' is a hybrid variety offered exclusively by "Roses Anciennes André Eve S. A. S” and protected by Plant Variety Certificate under No. 20110345 with the name Rosa L. for species and for the variety the name EVANRAT.
  • This shrub rose belongs to the group of modern hybrids, which, from May to October, is permanently covered with roses, thus showing an excellent repeating character.
  • the extract of the invention is therefore an extract of roses, more particularly an extract of roses of the Evanrat variety, or ‘Jardin de Granville®’ roses.
  • the invention preferably uses selected roses, whose properties are preserved by an environment and an organic farming method.
  • the rose extract according to the invention can be prepared from fresh, frozen, freeze-dried roses, or any mixture thereof. In the context of the invention, preferably fresh roses are used.
  • the invention therefore relates firstly to an extract of roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, in the form of an isolated bioactive fraction, obtained from fresh roses.
  • the invention uses summer roses, in particular summer rose petals.
  • winter roses will preferably be used, in particular winter rose petals.
  • the extract according to the invention can be prepared from different parts of the plant, it can therefore be an extract of leaves, an extract of buds, an extract of flowers (petals), an extract of sepals, a wood (stem) extract, a root extract or mixtures thereof.
  • the extract according to the invention is an extract of petals.
  • the extract of the invention is an extract of fresh petals, and more particularly an extract of fresh petals of roses of the Evanrat variety, or ‘Jardin de Granville®’ roses.
  • petals of roses of the Evanrat variety are rich in monosaccharide sugars (fructose, glucose, sucrose), organic acids (citric acid, malic acid), polyphenols (catechin), vitamin C, amino acids (mainly aspartic acid, glutamic acid, asparagine and glutamine), minerals (ash, potassium, calcium), and carotenoids.
  • rich in monosaccharide sugars is meant an extract of roses in the form of an isolated bioactive fraction, in which said extract comprises at least 500 pg/pL of at least one monosaccharide sugar chosen from fructose, glucose and sucrose.
  • “Rich in minerals” means an extract of roses in the form of an isolated bioactive fraction, in which said extract comprises at least 500 mg/Kg of at least one mineral chosen from potassium, calcium and sodium.
  • calcium improves epidermal differentiation and strengthens the structure of the skin, while potassium amplifies skin hydration and boosts energy assimilation.
  • Phyto-sugars fructtose, glucose, sucrose make it possible to gorge the cutaneous cells with energy.
  • the extract of roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, preferably, the extract of rose petals of the Evanrat variety or 'Jardin de Granville®' roses, according to the invention is in the form of an isolated bioactive fraction and more particularly in the form of a bioactive serum fraction.
  • this extract is more concentrated in natural compounds, in particular in sugars, such as fructose or glucose, but also polyphenols or minerals.
  • the rose extract according to the invention is distinct from rose water.
  • fresh roses of the Evanrat variety or ‘Jardin de Granville®’ roses are used as plant material. According to a preferred method, these are fresh rose petals of the Evanrat variety or ‘Jardin de Granville®’ roses.
  • said method does not require the addition of any solvent or exogenous liquid.
  • the method used to obtain the extract according to the invention comprises the main steps of: a) cleaning the plant material, maceration, pressing then mechanical separation of the plant material to obtain an intracellular colloidal dispersion (INN) and a material enriched in fibers (fraction A); b) "Treatment A” then mechanical separation of the Intracellular Colloidal Dispersion (INN) to obtain Supernatant A and a Membrane Fraction (Fraction B); c) "Treatment B” then mechanical separation of Supernatant A to obtain Supernatant B and Fraction C (Cytoplasmic Fraction); d) “Treatment C” then mechanical separation of Supernatant B to give a “Bioactive Serum Fraction” and a Fraction D (Precipitate); and e) Optionally, mixing the "bioactive serum fraction" with at least one preservative and/or stabilizer.
  • the extract of fresh roses preferably fresh rose petals, of the Evanrat variety or 'Jardin de Granville®' rose obtained at the end of this process, is a "bioactive serum fraction" or "bioactive fraction” within the meaning of the invention.
  • the extract according to the invention is obtained by implementing the extraction process disclosed in patents EP2919757, JP 6130924, CN ZL201380057567.6, EP2491939B1, CN1929851 B, US patents no. 8,734,861 and 7,473,435; US Patent Application No. 16/078925, incorporated herein by reference.
  • this extraction process does not involve organic solvents, such as hexane, which could lead to numerous problems of safety of installations and personnel, human health and preservation of the environment.
  • This technology thus makes it possible to reduce emissions of volatile organic compounds (VOCs). It is thus a clean process allowing the extraction without addition of solvent in the form of aqueous extract of proteins, sugars and other co-products of high quality and directly usable in cosmetics.
  • the rose flowers (Roses de Granville®) and 4 to 5 cm of stem are harvested in such a way as to avoid chopping or crushing the collected biomass to avoid disturbance of the cell structure of the flowers.
  • the viability of collected plants can be tested using an 0S5p multi-mode chlorophyll fluorometer (Opti-Sciences Inc, Hudson, NH, USA).
  • the live fresh flowers, including the petals, the pistil and the stamen have been removed from the stem, including the sepal and the receptacle, and packed in storage bags and are placed )s immediately at negative temperatures between -20° C and -80° C, such as -20° C, -40° C or -60° C.
  • the flowers can thus be stored for long periods, such as by several months, or several years, before being used for the purposes of the extraction process.
  • the live fresh flowers, including the petals, pistil and stamen are removed from the stem, including the sepal and receptacle, and packed in storage bags and placed in storage. at a temperature between 0 and 20°C and preferably at a temperature between 2 and 6°C until harvesting is complete.
  • the roses preferably the rose petals
  • the roses are immediately rinsed by spraying with water at 10°C to 15°C for 0.1 to 0.3 minutes with a flow rate of 5 to 6 liters per minute. Excess water is preferably removed from the rinsed flowers by allowing them to drain for at least 1 minute.
  • the rinsed flowers can then undergo maceration, pressing, and separation by mechanical, roller, hydraulic, or juicer pressing to extract the liquid intercellular colloidal dispersion (INN) content from the fiber-enriched material (“Fraction ⁇ ” ).
  • the yield of fraction A is between 30% and 65%, preferably between 35% and 60% and even more preferably between 40% and 55% (weight/weight).
  • the DCI typically comprises from 2% to 20% of dry matter, preferably from 4% to 16% of dry matter, and even more preferably from 6% to 12% of dry matter.
  • the ICD can be frozen for storage. Typically, it is frozen at -20°C.
  • the ICD When the ICD has been frozen for storage, it should first be gently thawed. Typically, it is placed to thaw at 4°C or in ice.
  • A-processing is achieved by destabilizing the DCI with electromagnetic waves produced from magnetrons operating at a frequency between 2.45 and 5.8 GHz.
  • the parameters of the destabilization treatment are set to obtain the decrease in the value of the real component of the low-frequency dielectric constant (s'o) of approximately 20 Farads per meter (F/m) compared to its value before the treatment. .
  • This treatment degrades the stability of INN by causing agglomeration and/or aggregation of particles (i.e. organelles, organelle fragments, residual fibrous material) into assemblies large enough and stable to allow and/or or improve the mechanical separation.
  • the intracellular colloidal suspension obtained is considered to be a relatively stable colloidal dispersion composed of a continuous phase (cytoplasm and contents of vacuoles) and of a dispersed phase (suspended organelles and their fragments).
  • DLVO Derjaguin-Laundau-Verwey-Overbeek
  • the DLVO theory describes the interaction and potential energy of particles as a function of their parameters, their distance from each other and the characteristics of the continuous phase. Changing the values of the variables affecting the repulsive force affects the stability of the dispersion. Under normal conditions of colloidal stability, an increase in potential energy as particles approach each other constitutes a potential energy barrier that cannot be overcome without external energy input. This energy barrier keeps the particles separated and the dispersion stable. The conditions changed during the ⁇ treatment allow the repulsive force of the double layer to decrease to the point that there is no longer any potential energy barrier and the particles can approach and agglomerate freely.
  • Restoring the initial conditions does not restore stability, because the particles have irreversibly agglomerated. They are thus easily removed by mechanical means (Koganov et al., sofw journal 2017).
  • the stage of mechanical separation of the DCI is carried out by centrifugation in order to produce the “Supernatant A” and the “Fraction B”.
  • Fraction B typically comprises from 10% to 30% dry matter, preferably from 13% to 27% dry matter, and more preferably about 15.0% to 25.0% dry matter.
  • Step c The "treatment B" is carried out by adjusting the pH level in the "supernatant A" by titration with, for example, an alkali until a pH greater than 6 is obtained, preferably a pH ranging from 6.5 to 7, 5.
  • an alkali will be potassium carbonate.
  • the step of mechanical separation of the "Supernatant A” is preferably carried out by centrifugation in order to produce the "Supernatant B" and the "Fraction C".
  • Fraction C typically comprises from 5% to 25% dry matter, preferably from 8% to 22% dry matter, and more preferably about 10.0% to 20.0% dry matter.
  • C treatment is carried out by adjusting the pH level in the "supernatant B", in particular by titration with, for example, acid until a pH of less than 4.5 is obtained.
  • a citric acid solution will be used as the preferred acid.
  • the stage of mechanical separation of "Supernatant B” is preferably carried out by centrifugation in order to produce the "serum fraction of fresh Granville® roses", preferably the "serum fraction of fresh Granville® rose petals” (Extract Not Preserved) and “Fraction D”.
  • the "fresh Granville® rose petal serum fraction” typically comprises from 2% to 20% of dry matter, preferably from 4% to 16% of dry matter, and more preferably from 6.0% to 10.0% dry matter.
  • the serum fraction obtained at the end of step d) is mixed with at least one preservative or at least one stabilizer to give a finished ingredient, or with a combination of these to give the fresh Granville® rose extract or “Rose De Granville® Serum”, preferably fresh Granville® rose petal extract or “De Granville® Rose Petal Serum”.
  • Particularly suitable stabilizing agents can include, without limitation, preservative, stabilizer and/or mixtures thereof.
  • Suitable preservatives and stabilizers for use in the present invention include, but are not limited to, sorbate of potassium, sodium benzoate, sodium metabisulphite, glycerin, propylene glycol, dipropylene glycol, butylene glycol, pentylene glycol, hexylene glycol and caprylyl glycol.
  • the stabilizers can comprise at least one preservative, at least one stabilizer, at least one antioxidant or mixtures thereof.
  • the method implemented to obtain the extract according to the invention comprises the steps of: a) cleaning the plant material, maceration, pressing then mechanical separation of the plant material to obtain an intracellular colloidal dispersion (INN) and a material enriched in fibers (fraction A); b) destabilization of the DCI with electromagnetic waves then mechanical separation of the intracellular colloidal dispersion (DCI) to obtain the supernatant A and a Membrane Fraction (fraction B); c) adjustment of the pH level in supernatant A until a pH greater than 6 is obtained, preferably a pH ranging from 6 to 7, then mechanical separation of supernatant A to obtain supernatant B and fraction C (cytoplasmic fraction) ; d) adjustment of the pH level in supernatant B until a pH of less than 4.5 is obtained, then mechanical separation of supernatant B to give a "bioactive serum fraction" and a fraction D (precipitate); and e) Optionally, mixing the "bioactive serum fraction" with at
  • the method used to obtain the extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses comprises the steps of: a) cleaning of fresh roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, maceration, pressing then mechanical separation of the roses to obtain an intracellular colloidal dispersion (INN) and a fiber-enriched material (fraction A); b) destabilization of the DCI with electromagnetic waves then mechanical separation of the intracellular colloidal dispersion (DCI) to obtain the supernatant A and a Membrane Fraction (fraction B); c) adjustment of the pH level in supernatant A until a pH greater than 6 is obtained, preferably a pH ranging from 6 to 7, then mechanical separation of supernatant A to obtain supernatant B and fraction C (cytoplasmic fraction) ; d) adjustment of the pH level in supernatant B until a pH of less than
  • the method used to obtain the extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh rose petals of the Evanrat variety or 'Jardin de Granville®' rose comprises the stages of: a) cleaning of the fresh petals of roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, maceration, pressing then mechanical separation of the roses to obtain an intracellular colloidal dispersion (INN) and a fiber-enriched material (fraction AT) ; b) destabilization of the DCI with electromagnetic waves then mechanical separation of the intracellular colloidal dispersion (DCI) to obtain the supernatant A and a Membrane Fraction (fraction B); c) adjustment of the pH level in supernatant A until a pH greater than 6 is obtained, preferably a pH ranging from 6 to 7, then mechanical separation of supernatant A to obtain supernatant B and fraction C (cytoplasmic fraction) ; d) adjustment of the pH level in supernatant B until a pH of less than
  • the invention relates to an extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh roses of the Evanrat variety or 'Jardin de Granville®' roses, characterized in that it is obtained by a process comprising the steps: a) cleaning of fresh roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, maceration, pressing then mechanical separation of the roses to obtain an intracellular colloidal dispersion (INN) and a fiber-enriched material (fraction A); b) destabilization of the DCI with electromagnetic waves then mechanical separation of the intracellular colloidal dispersion (DCI) to obtain the supernatant A and a Membrane Fraction (fraction B); c) adjustment of the pH level in supernatant A until a pH greater than 6 is obtained, preferably a pH ranging from 6 to 7, then mechanical separation of supernatant A to obtain supernatant B and fraction C (cytoplasmic fraction) ; d) adjustment of the pH level in supernatant B until a pH of
  • the invention relates to an extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh rose petals of the Evanrat variety or 'Jardin de Granville®' roses, characterized in that it is obtained by a process comprising the steps: a) cleaning fresh petals of roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, maceration, pressing then mechanical separation of the roses to obtain an intracellular colloidal dispersion (INN) and a material enriched in fibers (fraction A); b) destabilization of the DCI with electromagnetic waves then mechanical separation of the intracellular colloidal dispersion (DCI) to obtain the supernatant A and a Membrane Fraction (fraction B); c) adjustment of the pH level in supernatant A until a pH greater than 6 is obtained, preferably a pH ranging from 6 to 7, then mechanical separation of supernatant A to obtain supernatant B and fraction C (cytoplasmic fraction) ; d) adjustment of the pH level in supernatant
  • the extract of roses, preferably of rose petals, obtained according to the invention comprises water in a content ranging from 90 to 94%, a dry extract content ranging from 6 to 10%.
  • This extract of roses, preferably rose petals, in the form of an isolated bioactive fraction according to the invention is called the INCI name Rosa Hybrid Flower Extract.
  • the extract of roses, preferably of rose petals, obtained according to the invention comprises water in a content ranging from 89 to 93%, a content of dry extract ranging from 6 to 10% and preservatives and/or stabilizers in a content ranging from 0.3 to 1% by weight relative to the total weight of the extract.
  • the extract of roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, in particular of rose petals of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, according to the invention comprises in particular amino acids (acid aspartic acid, tyrosine, arginine) of total sugars (glucose, fructose), minerals and other co-products, which when applied to a keratin material, in particular the skin, provides a benefit or an improvement in aspect of the keratin material, such as promoting and/or improving skin nutrition, promoting and/or improving the skin barrier function, promoting and/or improving the rhythmic process of skin cells, preventing and/or slowing down the aging of the skin.
  • the present invention relates to a new composition
  • a new composition comprising at least one extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh roses of the Evanrat variety, or ‘Jardin de Granville®’ roses according to the invention, as defined above.
  • the invention relates to a new composition
  • a new composition comprising at least one extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh petals of roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses according to the invention, as defined above.
  • composition of the invention is preferably a cosmetic composition.
  • cosmetic composition any composition for cosmetic purposes, that is to say aesthetic, which can be brought into contact with the superficial parts of the human body and more particularly with keratin materials, in particular the skin and/or the lips, in particular the skin of the face and/or neck.
  • keratin materials is meant the skin and/or its appendages, and more particularly the human skin and/or lips. In particular, it will be the skin of the face and/or of the neck and/or of the body, and of the lips.
  • the keratin materials according to the invention are in particular healthy keratin materials (“healthy” subjects), that is to say not exhibiting disorders or disorders which would be part of a pathological state (“non-healthy” subjects, affected of a pathology). Reference will be made indiscriminately to healthy skin and/or lips or to healthy skin and/or lips in the rest of the description.
  • the present invention therefore relates to a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising, in a physiologically acceptable medium, an effective amount of at least one extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses as defined above.
  • physiologically acceptable medium any excipient suitable for topical use, in contact with keratin materials, without risk of toxicity, incompatibility, instability and/or allergic response.
  • the term “effective amount” denotes the minimum amount of “Jardin de Granville®” rose extract according to the invention which is necessary to obtain the beneficial effect according to the invention, namely a beneficial effect consisting in promoting and/or improve skin nutrition, promote and/or improve the skin barrier function, promote and/or improve the rhythmic process of skin cells, prevent and/or slow down the aging of the skin and/or lips, in particular the skin of the face and /or neck.
  • the cosmetic composition according to the invention is a care composition for keratin materials, in particular the skin and/or the lips and in particular the skin of the face and/or the neck.
  • the extract in the form of a bioactive fraction isolated from fresh roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses is present in the composition in a content ranging from 0.001 to 50%, in particular from 0.01 to 20%, preferably from 0.01 to 10% and more preferably from 0.011 to 5% by weight of raw material relative to the total weight of said composition.
  • the physiologically acceptable medium generally represents from 1 to 99% by weight, relative to the total weight of said composition.
  • the cosmetic composition used according to the invention generally comprises, in addition to the Jardin de Granville® rose extract and the physiologically acceptable medium, one or more cosmetic excipients acceptable from those known to those skilled in the art with a view to obtaining a composition for topical application, for example in the form of a cream, oil-in-water or water-in-oil emulsion or multiple emulsion, solution, suspension, gel, milk, lotion, serum, balm, stick, or more powder.
  • the cosmetic composition of the invention is in the form of a cream, oil-in-water or water-in-oil emulsion or multiple emulsion, solution, suspension, gel, milk, lotion, or serum .
  • said composition used according to the invention is in the form of a cream or a serum.
  • the cosmetic composition according to the invention may be in any galenic form suitable for topical application to the skin and/or the lips and in particular to the skin of the face and/or the neck comprising the extract of roses "jardin de Granville® ", preferably, the extract of rose petals "Jardin de Granville®” and at least one cosmetic adjuvant chosen from antioxidants, perfumes, vitamins, thickening agents, emollient agents, moisturizing agents, anti-aging agents. -aging agents, lifting agents, tightening agents, plumping agents, soothing agents, antipollution agents, lightening or depigmenting agents, fillers, nacres and mixtures thereof.
  • the cosmetic composition according to the invention may also comprise at least one cosmetic adjuvant chosen from the group consisting of: antioxidant agents, emollient agents, moisturizing agents, anti-aging agents, perfumes, and mixtures thereof.
  • one or more cosmetically acceptable excipients will be selected from emulsifiers, polymers, surfactants, rheology agents, electrolytes, pH adjusters, antioxidants, preservatives, colorants, and their mixtures.
  • the cosmetic composition according to the invention may comprise gelling agents, antioxidants, preservatives and mixtures thereof.
  • the cosmetic composition according to the invention may also comprise a fatty (solid fatty substance) or oily phase.
  • oil phase means an oil or a mixture of oils which may or may not be miscible with one another.
  • oil is meant, within the meaning of the invention, a fatty substance, insoluble in water, liquid at 25° C. and atmospheric pressure. These oils can be volatile or non-volatile, vegetable, mineral or synthetic.
  • An oily phase according to the invention can comprise natural oils, hydrocarbons, silicones, and mixtures thereof.
  • the fatty or oily phase content in the cosmetic composition of the invention will generally range from 0.2% to 45%, preferably from 0.5% to 30%, and more preferably from 2% to 25% by weight per relative to the total weight of said composition.
  • the invention also relates to a method for the cosmetic treatment of the skin and/or the lips, intended to promote and/or improve skin nutrition, promote and/or improve the skin barrier function, promote and/or improve the rhythmic process of cells cutaneous, preventing and/or slowing down the aging of the skin, comprising the application to the skin and/or the lips, in particular the skin of the face and/or the neck, of a cosmetic composition as defined above.
  • the invention also relates to the use of at least an effective quantity of at least one extract of fresh roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, in the form of a bioactive fraction isolated according to the invention, as an agent for promoting and/or improving skin nutrition, promoting and/or improving skin barrier function, promoting and/or improving the rhythmic process of skin cells, preventing and/or slowing skin aging and/or lips, in particular the skin of the face and/or neck.
  • the invention finally relates to an extract of fresh roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, in the form of an isolated bioactive fraction or a composition containing it, as defined in the present application, for its use to prevent and/or slow down the micro-inflammation phenomena induced by stress on the skin and/or the lips, in particular the skin of the face and/or the neck.
  • the extracts of fresh roses of the Evanrat variety, or 'Jardin de Granville®' roses, in the form of an isolated bioactive fraction according to the invention, used for the implementation of these methods and uses are those as described in this request.
  • the extracts of roses in the form of an isolated bioactive fraction are extracts in the form of an isolated bioactive fraction of rose petals, in particular of roses of the Evanrat variety, in particular of roses from Jardin de Granville® roses.
  • the bioactive fraction of rose petals according to the invention is obtained according to the following protocol: a1) cleaning fresh rose petals by spraying with water at a temperature of approximately 12° C., for 0.1 to 0 ,3 minutes at a rate of 5 to 6 liters per minute, a2) maceration, pressing then mechanical separation of the roses using a mechanical screw press (model CP-6 Vincent Corporation, FL) to extract the contents of liquid intercellular colloidal dispersion (INN) of the fiber-enriched material ("Fraction ⁇ "); b1) destabilization of the DCI with electromagnetic waves produced from magnetrons operating at a frequency between 2.45 and 5.8 G Hz, b2) centrifugation of the intracellular colloidal dispersion (DCI) to obtain the supernatant ⁇ and a Membrane Fraction (fraction B); c1) adjustment of the pH level in the supernatant A by an alkali (ie, potassium carbonate), in order to obtain a pH ranging from 6 to 7, c2) mechanical separation of the supernatant A
  • Granville® rose petal serum also called “Zêta serum”, or “Zf serum” in the following examples
  • Zêta serum contains 8% dry matter (active matter), 91.5% by weight of water, 0.15 % by weight potassium sorbate and 0.3% by weight sodium benzoate. These contents are by weight relative to the total weight of the extract.
  • the INCI name for this extract is Rosa Hybrid Flower Extract, Potassium Sorbate, and Sodium Benzoate.
  • rose extracts in particular of the Evanrat variety, preferably the Jardin de Granville® rose, can be used in combination with the rose extract, in the form of an isolated bioactive fraction according to the invention to provide complementary effects.
  • the aqueous extract of rose flowers (petals) (Cryoextract) is obtained using a cryo-extraction process such as that described in particular in patent application EP0425391.
  • Such a process comprises in particular the following stages: first grinding of rose flowers at a temperature of between -10°C and -40°C, second grinding of the rose fractions obtained in the preceding stage, at a temperature of between -40 °C and -100°C, in the presence of liquid nitrogen sieving the fractions obtained in the previous step, using a sieve with a particle size ranging from 2 mm to 100 ⁇ m and preferably less than 500 ⁇ m, in particular ranging from 100 ⁇ m at about 500p, pressing of the fractions recovered in the previous step, and brought back to a temperature of 0°C ⁇ 5°C, then subjected to the following cycle of operations: freezing at a temperature between -10°C and -40 ° C, suspending these frozen fractions in a quantity of water approximately equal to the quantity of liquid obtained during the previous step, pressing of the fractions suspended in water and brought to a temperature of 0°C ⁇ 5°C,
  • a Cryoextract is obtained comprising 0.5% by weight of dry matter (active ingredient), 49-50% by weight of water, 49% by weight of glycerol and preservatives.
  • the INCI name for this aqueous rose extract is Water, Glycerin, Rose Extract or Rosa Hybrid Flower Extract, Water, Glycerin.
  • Example 2 Phytochemical characterization of the rose extracts of Example 1
  • Table 1 Compounds detected by gas chromatography coupled with mass spectrometry in the serum of Granville® rose petals according to the invention and in the comparative extract, cryoextract of Granville® rose petals.
  • the Granville® rose petal serum according to the invention is rich in sugars, in particular glucose, fructose, xylose, myoinositol and sucrose.
  • Other compounds of interest are also detected, such as phenols (catechin, Kaempferol-3-O-glucoside), citric acid, malic acid or even quinic acid.
  • phenols catechin, Kaempferol-3-O-glucoside
  • citric acid citric acid
  • malic acid or even quinic acid quinic acid.
  • a concentration of total polyphenols of 7474 ppm (rutin equivalent) is measured in the serum of rose petals from Granville® against 3106 ppm in the extracted cryoextract.
  • Table 2 Quantification of free amino acids in the Granville® rose petal serum according to the invention and in the comparative extract, Granville® rose petal cryoextract.
  • the Granville® rose petal serum according to the invention is richer in free amino acids.
  • Table 3 Quantification of minerals in the Granville® rose petal serum according to the invention and in the comparative extract, Granville® rose petal cryoextract.
  • the Granville® rose petal serum according to the invention is richer in minerals. In particular, it is very rich in calcium and potassium.
  • the keratinocytes used for this study come from normal human epidermis from donors aged 26 to 61 years. They were cultured in serum-free medium for keratinocytes (KSFM, Gibco) with 5 ng/ml of recombinant human EGF (Epidermal Growth Factor) (Gibco), 50 ⁇ g/ml of bovine pituitary gland extract (Gibco) and 100 pg/ml of Primocine (antimicrobial agent, InvivoGen). The cells were cultured at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO2.
  • KSFM serum-free medium for keratinocytes
  • the fibroblasts used for this study come from normal human epidermis from a 48-year-old female donor. They were cultured in DMEM 1 g/L glucose (Lonza) supplemented with 10% FBS (Foetal Bovine Serum; Gibco), 2 mM LGlutamine (Lonza) and 100 ⁇ g/ml Primocine (InvivoGen). Cells were maintained at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO2.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • Oxytocin (Sigma) diluted at 200pM for 24 hours,
  • the primers and probes used for this study were of the “TaqMan Gene expression Assays” type (Life technologies):
  • the primary antibodies used for the study are:
  • the secondary antibodies used for the study are:
  • the cultured cells were homogenized in an ice-cold RIPA (Radioimmunoprecipitation Assay) buffer (Thermo Scientific) containing the cocktail of protease inhibitors Hait and EDTA (Thermo Scientific). Cells were harvested mechanically and centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes at 4°C. A protein assay was carried out according to the recommendations of the kit (Thermo Scientific) on the cell supernatant and the Western-blot was carried out on a standardized quantity of proteins. The proteins were mixed with a loading buffer and a reducing agent, DTT (dithiothreitol, Sigma) and heated at 90° C. for 5 minutes.
  • RIPA Radioimmunoprecipitation Assay
  • the samples were then loaded onto a NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) gel and then electrophoresis was performed.
  • the proteins were then transferred from the gel to a nitrocellulose membrane using the iBlot Dry Blotting System (Invitrogen).
  • the non-specific sites were saturated for 1 hour in a 5% milk solution diluted in 1X TBS buffer (Tris buffered Saline).
  • the nitrocellulose membrane was incubated overnight at 4°C with the primary antibody, diluted in milk. After three washes of 15 minutes with a 0.05% solution of Tween 20 in 1 ⁇ TBS, the secondary antibody, coupled to a peroxidase, was applied for 1 hour at room temperature.
  • Supernatants were collected. 20 ⁇ l of protein was mixed with loading buffer and DTT (Sigma) and heated at 90°C for 5 minutes. The samples were then loaded onto a NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) and electrophoresis was performed. The proteins were then transferred from the gel to a nitrocellulose membrane using the iBlot Dry Blotting System (Invitrogen). The non-specific sites were saturated for 1 hour in a 5% milk solution diluted in 1X TBS buffer. The nitrocellulose membrane was incubated overnight at 4°C in the primary antibody, diluted in milk.
  • RNA reverse transcriptase containing the RNase inhibitor (Life Technologies). Reverse transcription was performed on 2 ⁇ g of total RNA using a thermocycler (MJ Research). Finally, the real-time PCR was carried out on a thermocycler (Applied Biosystems) with a TaqMan Gene Expression Master Mix kit (Life technologies) and TaqMan Gene Expression Assays (Life technologies) which were composed of two primers and a probe specific for the sequence.
  • the Taqman Gene Expression Master Mix contained DNA polymerase, dNTP, UDG (to avoid DNA contamination), ROX (a passive fluorescent reference), and buffer.
  • TaqMan 18S primers were used as an endogenous control because the 18S gene encodes a ribosomal protein whose expression and corresponding mRNA are known to be invariant under all conditions. Additionally, DNA was replaced with water as a negative control.
  • the comparative method of TC was used for the relative quantification of target expressions (Livak K. J. and Schmittgen T.D., 2001) and StepOne software (Applied Biosystems) was used for data processing.
  • Neutral Red is a technique for detecting living cells by absorbing a neutral red dye (eurhodine). Living cells take up neutral red by active transport and incorporate the dye into their lysosomes/endosomes. The cells are then lysed with an acidic solution and the lysosomes/endosomes release neutral red. Thus, the total number of living cells can be determined by measuring the amount of dye released. This measurement is made by reading the optical density (OD) at 540 nm.
  • OD optical density
  • the cells were rinsed with Ca2+/Mg2+ PBS (Lonza) then incubated with a solution of neutral red (Sigma) at 0.05 mg/mL for 3 hours. After washing with Ca2+/Mg2+ PBS, cells were lysed with lysis buffer ((50% ethanol (VWR), 49% H2O, 1% acetic acid (Sigma)) and incubated for 10 minutes with shaking. Detection of the dye released at 540 nm was carried out using a Sinergy 2 Biotek spectrophotometer.
  • the Applicant has studied the impact of the bioactive fraction of rose petals as prepared above, on the skin barrier function, skin cell aging, skin nutrition, the rhythmic process of skin cells, and skin regeneration, as well as in parallel on skin micro-inflammation.
  • Example 4 Effect of the bioactive fraction isolated from rose petals according to the invention on the skin barrier function
  • HMGB1 is a central molecule in various physiological processes. It is found localized in the chromatin, where it is particularly involved in modulating the expression of various genes, and in particular of genes involved in the formation of the stratum corneum and the growth of the epidermis. HMGB1 therefore plays a crucial role in the physiology of the epidermis and more particularly in the skin barrier function.
  • filaggrin a protein playing an essential role in the regulation of epithelial homeostasis and actively involved in the barrier function of the skin.
  • the capacity of the rose petal extract in the form of the bioactive fraction according to the invention to modulate the expression of filaggrin was evaluated on biopsies of human skin.
  • FIG. 2 show that treatment with the bioactive fraction isolated from rose petals according to the invention makes it possible to significantly increase (+49%) the Filaggrin protein expression level in human skin biopsies. No significant effect is observed with cryoextract from rose petals (comparative) or with the placebo solution.
  • Example 5 Effect of the bioactive fraction isolated from rose petals according to the invention on cell aging
  • cortisol in the skin is associated with skin aging and its effects, such as a reduction in the thickness of the epidermis, the degradation of collagen fibers or a reduction in cell proliferation.
  • One of the major pathways involved in cortisol synthesis is through the activation of the enzyme 118-HSD1.
  • 11 B-HSD1 increases with age, and in connection with overexposure to UV, contributes to the appearance of localized skin damage.
  • the bioactive fraction of rose petals according to the invention has a beneficial effect on the skin, making it possible to combat skin cell ageing.
  • Example 6 Effect of the bioactive fraction isolated from rose petals according to the invention on the circadian rhythm
  • the bioactive fraction of rose petals according to the invention has a beneficial effect on the circadian rhythm of skin cells.
  • Example 7 Effect of the bioactive fraction isolated from rose petals according to the invention on skin nutrition
  • rose petal extract comprising an isolated bioactive fraction on skin nutrition was tested.
  • Nutrients and metabolites are essential elements for maintaining cellular homeostasis, notably allowing mitochondrial respiration and the synthesis of ATP. Shutting down glucose metabolism can lead to cell death.
  • 2-deoxy-D-glucose (2-DG) is a well-known inhibitor of this metabolic pathway.
  • the bioactive fraction of rose petals according to the invention has a protective effect against 2-DG stress and proves to be beneficial for skin nutrition.
  • Example 8 Effect of the bioactive fraction isolated from rose petals according to the invention on skin firmness
  • rose petal extract comprising an isolated bioactive fraction on the firmness of skin tissue was tested.
  • Structural proteins such as collagens or fibrillin are essential elements of the extracellular matrix contributing to the firmness of skin tissue. Over time, but also repeated stress, these proteins degrade and are less well renewed, contributing to tissue relaxation and loss of skin firmness.
  • Example 3.2 Methods for obtaining tissue from biopsies are described in Example 3.2.
  • the tissues were frozen in OCT medium (CellPath) using liquid nitrogen and stored at -20° C. Skin biopsies frozen were then cut with a cryotome (Leica) into 6 ⁇ m thick sections and placed on slides (Thermo Scientific).
  • Sections were dried for 30 minutes at 37°C, fixed in a cold acetone bath for 10 minutes, then rinsed in a PBS bath. After saturation of the non-specific sites with a 5% BSA solution (Sigma) for 30 minutes, the primary antibody (described in paragraph 3.4.) was applied and the slides were incubated with shaking, at room temperature, in a damp room. After rinsing the slides with PBS, the secondary antibody (described in paragraph 3.4.) was applied, in the dark, with shaking, at room temperature, in a humid room.
  • a 5% BSA solution Sigma
  • cell nuclei were stained with 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Molecular Probes) at 0.3 ⁇ M for 5 minutes and sections were mounted in Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences Detection was performed using a Nikon Eclipse Ni-E microscope. Pictures were taken with a Nikon DS-Fi3 camera and processed using NiSAR acquisition software (Nikon).
  • DAPI 4',6'-diamidino-2-phenylindole
  • the skin biopsies were treated, or not, in duplicate, with the extract according to the invention “ZF serum” diluted at 0.3% in PBS, twice a day, for 72 hours. PBS alone was applied as a control condition (negative control).
  • the skin biopsies were treated, in duplicate, with cryoextract from rose flowers, described in particular in patent application EP0425391 and its examples, (“benchmark” positive control), or a hydro-glycerin solution (water/glycerol) (“placebo” negative control) at 3%, or with the extract according to the invention “ZF serum” at 0.3% diluted in PBS, twice a day, for 48 hours.
  • PBS alone was applied as a control condition (second negative control).
  • the total dry matter (active matter) contents are equivalent for the 0.3% “ZF fraction” condition (invention) and for the 3% “cryoextract” condition (positive control).
  • a “senescent environment” type culture medium was prepared by mixing the “fresh” culture medium for skin biopsies with the culture medium of senescent fibroblasts (in a 50/50 ratio).
  • the skin biopsies were treated, in duplicate, with cryoextract from rose flowers as described in the paragraph above) (“benchmark” positive control) or the placebo (hydro-glycerin solution, negative control) at 3%, or with the extract according to the invention “ZF serum” at 0.3% diluted in PBS, twice a day, for 48 hours. PBS alone was applied as a control condition (second negative control).
  • UV stress the biopsies were subjected to stress with 5 J/cm2 of UVA (type oven BLX-E365, Fisher Bioblock Scientific) followed by 200 mJ/cm2 of UVB (type oven BLX- E312, Fisher Bioblock Scientific) after the first 24 hours of treatment.
  • UVA type oven BLX-E365, Fisher Bioblock Scientific
  • UVB type oven BLX- E312, Fisher Bioblock Scientific
  • the rose petal extract comprising an isolated bioactive fraction according to the invention is capable of promoting the expression of extracellular matrix proteins. It therefore has a cosmetic interest in promoting and/or improving skin firmness and/or reducing the loss of firmness, in particular linked to aging.
  • HMGB1 In addition to its role in the skin barrier function, HMGB1 plays an active role in skin micro-inflammation phenomena. Under normal conditions, that is to say (without stress condition), HMGB1 is localized in the cell nucleus, however in response to a stimuli, and particularly in response to pro-inflammatory signals, HMGB1 is relocalized in a way active towards the cytoplasm and/or the extracellular space.
  • Oxytocin is typically a stress response hormone. Under stress conditions, oxytocin can modulate the physiological and biological activities of cells, in particular by reducing the release of HMGBI. Thus, by reducing cellular stress, oxytocin contributes to the well-being of the skin.
  • the keratinocytes were treated for 24 hours with the various extracts or control solutions as indicated below. Then, conditions (2) to (6) were treated with the stress factor LPS at a concentration of 0.5 mg/mL for 6 hours.
  • FIG. 9A and in FIG. 9B show that under control conditions (PBS), treatment with the stress factor LPS induces the secretion of all (100%) of HMGB1 towards the outside of the cell.
  • PBS control conditions
  • treatment with the bioactive fraction of rose petals according to the invention induces a reduction (-31%) of the secretion of HMGB1 to the supernatant compared to the PBS control. This reduction is greater than what is obtained with the positive oxytocin control (- 22%) or with the cryoextract (- 19%). Placebo has no effect on HMGB1 secretion.
  • the bioactive fraction of rose petals according to the invention therefore produces an “oxytocin-like” effect.
  • HMGB1 The initial phase of HMGB1 secretion requires a pro-inflammatory signal such as liposaccharide (LPS), IL-1 (interleukin 1) or TNF (tumor necrosis factor). HMGB1 can then interact with Toll-like receptors TLRs to activate certain signaling pathways resulting in the production of cytokines and chemokines such as TNF-a. Under specific conditions of inflammation, HMGB1 induces the expression of the COX-2 protein, notably via the TNF-a signaling pathway.
  • LPS liposaccharide
  • IL-1 interleukin 1
  • TNF tumor necrosis factor
  • the bioactive fraction of rose petals according to the invention therefore makes it possible to negatively regulate the expression of COX-2.
  • the bioactive fraction of rose petals according to the invention exerts beneficial effects on skin micro-inflammation.
  • TGM1 transglutaminase-1
  • TGM-1 is a gene encoding transglutaminase-1, a protein essential for the keratinization of the stratum corneum of the skin.
  • the extract of rose petals in the form of the bioactive fraction according to the invention has, also under stress conditions, a beneficial effect on the barrier function skin.
  • the bioactive fraction isolated from rose petals according to the invention and the preservatives are mixed and homogenized at room temperature with stirring.
  • the sugars are added with stirring, then the carbomer, then the water and the EDTA with stirring.
  • the aqueous gel is then neutralized with the addition of sodium hydroxide with stirring until a homogeneous gel is obtained. Applied to the skin of the face, this aqueous gel gives a fresh effect, and brings suppleness and firmness to the skin.
  • composition in the form of a micronutrient gel-serum for visa e
  • the ingredients of the aqueous phase (water, glycols and carbomer) are mixed at 80°C with stirring.
  • the preservatives are then added, then the gelling agents at 80° C. with stirring, then the temperature is lowered to 75° C.
  • the surfactants are emulsified in the aqueous phase with stirring.
  • the fillers and nacres, impasted and homogenized beforehand, are added at 40° C.
  • the cryoextract, the bioactive fraction isolated from rose petals according to the invention and the other extracts are then added at 40° C., with stirring up to 30 °C.
  • the skin After application to the face, the skin appears nourished, firmer, smoother (reduced appearance of fine lines and wrinkles), hydrated and more even in color.

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Abstract

La présente invention concerne un extrait de roses sous la forme d'une fraction bioactive isolée, obtenue à partir de roses fraiches de la variété Evanrat, son procédé de préparation, une composition en comprenant et ses utilisations, notamment pour favoriser et/ou améliorer la nutrition cutanée, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer le processus rythmique des cellules cutanées, et/ou prévenir et/ou ralentir le vieillissement de la peau.

Description

TITRE : Fraction bioactive isolée de roses de la variété Evanrat
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un extrait de roses de la variété Evanrat, aussi appelées roses ‘Jardin de Granville®’, sous la forme d’une fraction bioactive isolée, en particulier un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de pétales de roses, ainsi que son procédé de préparation. L’invention porte en outre sur une composition comprenant un extrait de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, sous la forme d’une fraction bioactive isolée selon l’invention et son utilisation pour favoriser et/ou améliorer la nutrition cutanée, la fonction barrière cutanée, le processus rythmique des cellules cutanées, prévenir et/ou ralentir le vieillissement de la peau, et par ailleurs prévenir et/ou ralentir les phénomènes de micro-inflammation chronique de la peau.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La peau est la première barrière de protection de l'organisme vis-à-vis de l'environnement. Elle est quotidiennement soumise aux effets de facteurs d’origine exogène (ex : rayonnements UV, variations de température, pollution atmosphérique, fumée de cigarette...) ou endogène (ex : hormones...). Tous ces facteurs peuvent perturber son équilibre, notamment son équilibre micro-nutritionnel, et/ou altérer sa fonction barrière, et/ou induire un stress micro-inflammatoire et concourir in fine au vieillissement cutané.
Il est notoire que la qualité de la nutrition se reflète sur la santé de la peau et que certains désordres cutanés sont associés à des déficiences, en particulier en certains micronutriments (Park K. Role of micronutrients in skin health and function. Biomol. Ther. 2015 ; 23 ; 207- 217). Les micronutriments sont essentiels au développement et à la formation de la peau, au renouvellement physiologique de l’épiderme et à l’adaptation de la peau à son environnement. Notamment, l’utilisation de vitamines (A, E, C) et/ou d’acides gras essentiels est connue dans la formulation de compositions cosmétiques destinées à la peau, en particulier pour leur effet protecteur et/ou nutritionnel.
On connaît également l’utilisation de certains extraits de roses. La demande de brevet FR3066388 de LVMH Recherche décrit notamment un extrait aqueux de roses sous la forme d’un ‘cryoextrait’ et ses effets in vitro, en culture de kératinocytes humains, sur la stimulation de l’expression de plusieurs gènes horloge tels que CRY2, PERI et PER3, ainsi que sur l’expression protéique de la kératine 10 (KRT10), marqueur de la maturation de l’épiderme et de la desmogléine 1 (DSG1 ), marqueur de la cohésion épidermique. Toutefois, il existe un besoin constant de trouver de nouveaux extraits permettant de maintenir et/ou favoriser l’équilibre nutritionnel de la peau et par conséquent de stimuler la régénération de la peau, la barrière cutanée, réduire la micro-inflammation et agir favorablement sur le vieillissement de la peau.
La Demanderesse a ainsi développé un nouvel extrait de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, en particulier, un nouvel extrait de pétales desdites roses, sous la forme d’une fraction bioactive isolée. De manière inattendue, la Demanderesse a mis en évidence que ce nouvel extrait sous la forme d’une « fraction sérique bioactive », aussi appelée « fraction bioactive isolée de roses » présente des effets encore améliorés par rapport à ceux déjà connus et décrits dans l’art antérieur. Notamment, l’extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, selon l’invention améliore la nutrition cutanée en favorisant la survie cellulaire en condition de déprivation en glucose. En outre, l’extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses selon l’invention agit sur certaines voies de signalisation, et ainsi favorise et/ou améliore la fonction barrière cutanée, favorise et/ou améliore le processus rythmique des cellules cutanées, prévient et/ou ralenti le vieillissement de la peau et prévient et/ou ralenti les phénomènes de micro-inflammation cutanée.
EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention porte sur un extrait de roses sous la forme d’une fraction bioactive isolée, obtenue à partir de roses fraîches de la variété Evanrat.
De préférence ledit extrait de roses sous la forme d’une fraction bioactive isolée comprend au moins 500 pg/pL d’au moins un sucre monosaccharide choisi parmi le fructose, glucose et le saccharose, et/ou au moins 500 mg/Kg d’au moins un minéral choisi parmi le potassium, le calcium et le sodium.
De manière préférée, ledit extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses selon l’invention, est caractérisé en ce que ledit extrait est obtenu à partir de pétales frais de roses de la variété Evanrat. Se préférence ledit extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat selon l’invention est caractérisé en ce qu’il est obtenu par un procédé comprenant les étapes : a) nettoyage du matériel végétal, macération, pressage puis séparation mécanique du matériel végétal pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction À) ; b) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques puis séparation mécanique de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant À et une Fraction Membranaire (fraction B) ; c) ajustement du niveau de pH dans le surnageant À jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6 à 7, puis séparation mécanique du surnageant À pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ; d) ajustement du niveau de pH dans le surnageant B jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5 puis séparation mécanique du surnageant B pour donner une « Fraction sérique bioactive » et une fraction D (précipité) ; et e) Optionnellement, mélange de la « fraction sérique bioactive » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant.
La présente invention porte encore sur un procédé de préparation d’un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat ou variété ‘rose Jardin de Granville®’ tel que défini dans la présente invention comprenant les étapes de : a) nettoyage du matériel végétal, macération, pressage puis séparation mécanique du matériel végétal pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction À) ; b) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques puis séparation mécanique de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant À et une Fraction Membranaire (fraction B) ; c) ajustement du niveau de pH dans le surnageant À jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6 à 7, puis séparation mécanique du surnageant À pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ; d) ajustement du niveau de pH dans le surnageant B jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5 puis séparation mécanique du surnageant B pour donner une « Fraction sérique bioactive » et une fraction D (précipité) ; et e) Optionnellement, mélange de la « fraction sérique bioactive » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant. Selon un autre aspect, la présente invention pour sur une composition pour application topique sur la peau et/ou les lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou, comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins une quantité efficace d’au moins un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat tel que défini dans la présente invention.
De préférence, ladite composition est caractérisée en ce que l’extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat est présent dans la composition en une teneur allant de 0.001 à 50%, en particulier de 0,01 à 20%, de préférence de 0,01 à 10% et de préférence encore de 0,011 à 5% en poids de matière première par rapport au poids total de ladite composition.
L’invention porte également sur un procédé de traitement cosmétique de la peau et/ou des lèvres, destiné à favoriser et/ou améliorer la nutrition cutanée ; favoriser et/ou améliorer la fermeté cutanée favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer le processus rythmique des cellules cutanées, et/ou prévenir et/ou ralentir le vieillissement de la peau, comprenant l’application sur la peau et/ou les lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou, d’une composition cosmétique telle que définie dans la présente invention.
L’invention porte en outre sur l’utilisation d’au moins une quantité efficace d’au moins un extrait de sous la forme d’une fraction bioactive isolée roses fraîches de la variété Evanrat tel que défini dans la présente invention comme agent pour favoriser et/ou améliorer la nutrition cutanée ; favoriser et/ou améliorer la fermeté cutanée, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer le processus rythmique des cellules cutanées, prévenir et/ou ralentir le vieillissement de la peau et/ou des lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou.
L’invention porte encore sur un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat selon l’invention ou composition en comprenant pour son utilisation pour prévenir et/ou ralentir les phénomènes de micro-inflammation induits par un stress de la peau et/ou des lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou.
DESCRIPTION DES FIGURES
[Fig. 1 ] procédé d’extraction utilisé selon l’invention [Fig. 2] Effet de différents extraits sur l’expression protéique de la filaggrine dans des cultures de peau humaine.
[Fig. 3] Effet de différents extraits sur l’expression génique du 11 B-HSD1 dans des cultures cellulaires de kératinocytes humains.
[Fig. 4] Effet de différents extraits sur l’expression protéique du gène horloge CLOCK dans des cultures de peau humaine.
[Fig. 5] Effet de différents extraits sur la survie cellulaire en condition de déprivation de glucose dans des cultures cellulaires de kératinocytes humains.
[Fig. 6] Effet de différents extraits sur la quantité de collagène III dans des cultures de peau humaine.
[Fig. 7] Effet de différents extraits sur la quantité de collagène I dans des cultures de peau humaine.
[Fig. 8] Effet de différents extraits sur la longueur des fibres de fibriline- 1 dans des cultures de peau humaine.
[Fig. 9À] Effet de différents extraits sur la sécrétion extra-cellulaire du HMGB1 dans des cultures cellulaires de kératinocytes humains, en condition de stress au LPS.
[Fig. 9B] Immunomarquage de la membrane après Western-blot, quantification des résultats. [Fig. 10] Effet de différents extraits sur l’expression protéique de COX-2 dans des cultures de peau humaine, en condition de stress au LPS.
[Fig. 11 ] Effet de différents extraits sur l’expression protéique de la transglutaminase-1 (TGM-1 ) dans des cultures de peau humaine, en condition de stress au LPS.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Définitions
Par « fraction bioactive » ou « fraction sérique bioactive » ou « fraction de sérum » ou « fraction bioactive isolée de roses », on entend un extrait de roses de la variété Evanrat, ou rose ‘Jardin de Granville®’, comprenant les enzymes, protéines, sucres, ions et autres molécules actives présentes dans le cytosol des cellules composant les différents tissus végétaux des roses. L’extrait selon l’invention est distinct d’un cryoextrait de pétales roses tel que décrit dans la demande FR3066388.
Par « matière kératinique » on entend la peau et/ou ses phanères, et les lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du corps et les lèvres. Par « micro-inflammation » ou « micro-inflammation chronique de la peau » on entend selon l’invention des processus inflammatoires invisibles (silencieux) se mettant en place de façon localisée au niveau de la peau et qui, s’ils dégénèrent ou sont mal résolus, deviennent chroniques. Avec le temps, ces événements micro-inflammatoires à répétition contribuent au vieillissement cutané.
Les définitions qui suivent sont en lien avec les étapes du procédé de préparation de l’extrait selon l’invention.
Par « nettoyage » on entend l'élimination des débris des roses de Granville® fraîches, et de préférence des pétales frais, avant un traitement ultérieur, d'une manière qui évite de blesser la plante, ou l'élimination de composants précieux. Par exemple, il peut être effectué par rinçage à basse pression avec de l'eau potable dans des conditions où le lavage à l'eau de ruissellement ne contiendrait pas sensiblement de pigments végétaux. L'excès d'eau de lavage est ensuite éliminé des plantes lavées.
Par « macération » on entend le fait de transformer les roses de Granville® fraîches, et de préférence les pétales frais, en particules plus petites pour rompre leur intégrité et faciliter par la suite l'expulsion de la dispersion colloïdale intracellulaire (ICD) liquide. Des exemples d'instruments de macération appropriés comprennent, sans s'y limiter, des dispositifs tels qu'un concasseur, une meule ou un broyeur (par exemple, un broyeur à couteaux, un broyeur à marteaux, etc.). Pour éviter une dégradation du matériel végétal induite par la température, l'étape de macération peut inclure une surveillance de la température et la sélection des paramètres de macération garantissant qu'il n'y a pas d'augmentation significative de la température du matériel végétal au cours de cette étape.
Par « pressage » on entend la séparation de la matière liquide des roses de Granville® fraîches, et de préférence des pétales frais, par application d'une force mécanique. Cela inclut, mais sans s'y limiter, des techniques telles que le drainage par gravité ambiante, le pressage par un objet lourd, la force centrifuge d'un expulseur rotatif, la pression du piston d'une presse hydraulique, ou des rouleaux ou une vis de type approprié pour une presse.
Par « matériau enrichi en fibres » ou « MEF » ou « FEM » (Fibre Enriched Material), on entend une fraction solide et/ou semi-solide enrichie en fibres de roses de Granville® fraîches, de préférence de pétales frais, dont la dispersion colloïdale intracellulaire liquide (ICD) a été éliminée par pressage. Par « dispersion colloïdale intracellulaire » ou « DCI » ou « ICD » (Intracellular Colloidal Dispersion) on entend la matière liquide expulsée par pressage de roses de Granville® fraîches, de préférence des pétales frais. Le liquide résultant contient des particules solides et/ou semi-solides dispersées et, potentiellement, des gouttelettes de liquides non miscibles à l'eau de diverses tailles (collectivement appelées particules), dans un milieu aqueux contigu. Les particules sont principalement constituées d'organites de cellules végétales, de fragments d'organites et de matières résiduelles enrichies en fibres. Le milieu aqueux est principalement constitué de cytosols et de vacuoles.
Par « ajustement », il est fait référence à la modification des activités des ions hydroxyde et hydronium dans le milieu aqueux de la DCI ou des fractions aqueuses produites par un traitement ultérieur de la DCI, l'activité de l'ion hydronium restant dans la plage trouvée dans les cellules végétales viables (par exemple, entre pH 3 et pH 9). Cette altération peut être accomplie, par exemple, par un procédé de séparation tel que la filtration S/L, la centrifugation, la filtration membranaire (avec des membranes bipolaires, ultrafiltration et microfiltration, osmose inverse), et/ou par addition d'un acide faible ou d'un alcali/base faible et par précipitation. Les paramètres d'ajustement sont sélectionnés pour être suffisants pour un changement particulier des paramètres physico-chimiques, tels que le pH, ou le potentiel de surface à l'interface électrolyte-air. De tels réglages facilitent les étapes de déstabilisation et/ou de séparation suivantes ; ou créer les conditions d'une bonne conservation et de stabilisation.
Par « déstabilisation » il est fait référence au traitement de la DCI ajusté utilisant des ondes électromagnétiques pour modifier de manière transitoire des propriétés physiques (telles que s'O qui est la composante réelle de la constante diélectrique basse fréquence). Il a été trouvé de manière inattendue que des modifications particulières dégradent la stabilité de la DCI en provoquant l'agglomération et/ou l'agrégation de particules en assemblages qui sont suffisamment grands et stables pour permettre et/ou améliorer après la séparation en fractions, avec certaines propriétés souhaitables.
Par « séparation » on entend la séparation de particules solides et/ou semi-solides, et de gouttelettes de liquide non aqueux à partir d'un liquide aqueux en exploitant la densité et/ou la taille des particules. Cela inclut, mais sans s'y limiter, des techniques telles que l’égouttage, la filtration (y compris la filtration utilisant un gradient de pression), l'écumage, la sédimentation par gravité ambiante, la décantation, la centrifugation ou une combinaison de ce qui précède. De préférence, on utilisera la séparation mécanique en flux continu, mais cela n'exclut pas le traitement par lots. « Séparation 1 » et « Séparation 2 » se réfèrent aux étapes respectives du procédé, effectuées avec des paramètres respectifs.
Par « surnageant », il est fait référence à un matériau aqueux à partir duquel des particules ont été séparées. « Surnageant À » et « Surnageant B » désignent les surnageants résultant des étapes de séparation respectives du procédé.
Par « précipité », il est fait référence aux particules à partir desquelles un matériau aqueux a été séparé. « Fraction B » et « Fraction C » désignent les précipités résultant des étapes de séparation respectives du procédé.
Les termes « fraction de sérum de roses de Granville® fraîches » et « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » désignent des compositions produites par le procédé tel que représenté ci-dessus et dans la figure 1 sans conservateurs et/ou stabilisants ajoutés pour protéger la composition de l'ingrédient contre les facteurs environnementaux tels que la température, l'atmosphère (par exemple, l'oxygène), la lumière et les micro-organismes.
Par « conservateurs et/ou stabilisants » on entend des substances qui, lorsqu'elles sont ajoutées à une « fraction de sérum de roses de Granville® fraîches », de préférence une « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® », la protègent contre les facteurs environnementaux tels que la température, l'atmosphère (par exemple l'oxygène), la lumière et les micro-organismes. Des substances appropriées particulières peuvent comprendre, sans limitation, un conservateur, un stabilisant et/ou un mélange de ceux-ci.
Le terme « sérum de roses de Granville® » ou « extrait de roses de Granville® fraîches » tel qu'utilisé ici signifie une combinaison d'une fraction de sérum de roses de Granville® fraîches et de conservateurs et/ou de stabilisants.
Le terme « sérum de pétales de roses de Granville® » ou « extrait de pétales frais de roses de Granville® » tel qu'utilisé ici signifie une combinaison d'une fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® et de conservateurs et/ou de stabilisants.
Extrait de rose : Fraction bioactive isolée de roses et
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édé de
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La présente invention concerne donc un nouvel extrait de rose obtenu par un procédé particulier, mettant notamment en oeuvre une étape de déstabilisation par ondes électromagnétiques. L’extrait obtenu à l’issu de ce procédé possède une activité supérieure comparativement aux extraits aqueux de roses, déjà connus.
Cet extrait est également appelé « Sérum Rose De Granville® »
Matériel végétal
Dans le contexte de la présente invention, on utilisera comme matériel végétal des roses de la variété Evanrat, aussi appelées roses ‘Jardin de Granville®’, et de préférence encore des pétales de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’.
Le rosier ou rose ‘Jardin de Granville®’ est une variété hybride proposée exclusivement par « Roses anciennes André Eve S. A. S » et protégée par Certificat d’Obtention Végétale sous le N°20110345 avec pour espèce la dénomination Rosa L. et pour la variété la dénomination EVANRAT. Ce rosier buisson appartient au groupe des hybrides modernes, qui, de mai à octobre, se couvre de roses en permanence, montrant ainsi un excellent caractère remontant.
L’extrait de l’invention est donc un extrait de roses, plus particulièrement un extrait de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’.
L’invention utilise de préférence des roses sélectionnées, dont les propriétés sont préservées par un environnement et un mode d’agriculture biologique.
L’extrait de roses selon l’invention peut être préparé à partir de roses fraîches, congelées, lyophilisées, ou d’un mélange quelconque de celles-ci. Dans le contexte de l’invention, on utilise de préférence des roses fraîches.
Les plantes fraîches, c’est-à-dire vivantes, ont une activité métabolique maximale représentant donc une source optimale pour capturer tout le spectre des complexes et composés naturels et en conserver les propriétés. On privilégiera donc l’utilisation de roses fraîches. On pourra notamment vérifier la viabilité des plantes par leur activité photosynthétique. En particulier, la mesure de la fluorescence de la chlorophylle. L’invention porte donc en premier lieu sur un extrait de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, sous la forme d’une fraction bioactive isolée, obtenue à partir de roses fraîches.
On distingue deux types de roses selon le moment de l’année où elles sont récoltées :
Les roses d’hiver, généralement récoltées entre les mois de novembre et d’avril,
Les roses d’été, généralement récoltées entre les mois de mai et d’octobre.
Selon un mode particulier, l’invention utilise des roses d’été, en particulier des pétales de roses d’été. Selon un autre mode, on utilisera de préférence, des roses d’hiver, en particulier des pétales de roses d’hiver.
L’extrait selon l’invention peut être préparé à partir des différentes parties de la plante, il peut donc s’agir d’un extrait de feuilles, un extrait de bourgeons, un extrait de fleurs (pétales), un extrait de sépales, un extrait de bois (tiges), un extrait de racines ou leurs mélanges.
Avantageusement, l’extrait selon l’invention est un extrait de pétales.
Selon un mode de réalisation préféré, l’extrait de l’invention est un extrait de pétales frais, et plus particulièrement un extrait de pétales frais de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’.
Il est particulièrement avantageux d’utiliser les pétales des roses de la variété Evanrat car ils sont riches en sucres monosaccharides (fructose, glucose, saccharose), des acides organiques (acide citrique, acide malique), des polyphénols (catéchine), de la vitamine C, des acides aminés (majoritairement acide aspartique, acide glutamique, asparagine et glutamine), des minéraux (cendres, potassium, calcium), et des caroténoïdes.
Par riche en sucres monosaccharides, on entend un extrait de roses sous la forme d’une fraction bioactive isolée, dans lequel ledit extrait comprend au moins 500 pg/pL d’au moins un sucre monosaccharide choisi parmi le fructose, glucose et le saccharose.
Par riche en minéraux, on entend un extrait de roses sous la forme d’une fraction bioactive isolée, dans lequel ledit extrait comprend au moins 500 mg/Kg d’au moins un minéral choisi parmi le potassium, le calcium et le sodium. Avantageusement, le calcium améliore la différenciation épidermique et renforce la structure de la peau, tandis que le potassium amplifie l’hydratation cutanée et booste l’assimilation de l’énergie. Les phyto-sucres (fructose, glucose, saccharose) permettent de gorger les cellules cutanées d’énergie.
L’extrait de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, de préférence, l’extrait de pétales de roses de la variété Evanrat ou roses ‘Jardin de Granville®’, selon l’invention est sous la forme d’une fraction bioactive isolée et plus particulièrement sous la forme d’une fraction sérique bioactive. Comparativement aux extraits aqueux connus de l’art antérieur (ex : cryoextrait aqueux de fleurs (pétales) de rose de la demande FR3066388), cet extrait est plus concentré en composés naturels, notamment, en sucres, tels que le fructose ou le glucose, mais aussi en polyphénols ou encore en minéraux. Ainsi, de par le procédé particulier mis en oeuvre pour obtenir cet extrait, l’extrait de rose selon l’invention est distinct d’une eau de rose.
Procédé d’extraction
L’extrait de roses fraîches de la variété Evanrat ou roses ‘Jardin de Granville®’ selon l’invention, également appelé « Sérum Rose De Granville » est avantageusement obtenu par la mise en oeuvre du procédé d’extraction décrit ci-après ainsi qu’à la figure 1.
De préférence on utilise comme matériel végétal des roses fraîches de la variété Evanrat ou roses ‘Jardin de Granville®’. Selon un mode préféré, il s’agit des pétales frais de roses de la variété Evanrat ou roses ‘Jardin de Granville®’.
Avantageusement, ledit procédé ne requiert l’ajout d’aucun solvant ou liquide exogène.
Le procédé mise en oeuvre pour obtenir l’extrait selon l’invention comprend les étapes principales de : a) nettoyage du matériel végétal, macération, pressage puis séparation mécanique du matériel végétal pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction A) ; b) « Traitement A » puis séparation mécanique de la Dispersion Colloïdale Intracellulaire (DCI) pour obtenir le Surnageant A et une Fraction Membranaire (Fraction B) ; c) « Traitement B » puis séparation mécanique du Surnageant À pour obtenir le Surnageant B et la Fraction C (Fraction Cytoplasmique) ; d) « Traitement C » puis séparation mécanique du Surnageant B pour donner une « Fraction sérique bioactive » et une Fraction D (Précipité) ; et e) Optionnellement, mélange de la « fraction sérique bioactive » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant.
L’extrait de roses fraîches, de préférence de pétales de roses frais, de la variété Evanrat ou rose ‘Jardin de Granville®’ obtenu à l’issu de ce procédé, est une « fraction sérique bioactive » ou « fraction bioactive » au sens de l’invention.
Dans un mode de réalisation préféré, l’extrait selon l’invention est obtenu par la mise en oeuvre du procédé d’extraction divulgué dans les brevets EP2919757, JP 6130924, CN ZL201380057567.6, EP2491939B1 , CN1929851 B, les brevets américains n° 8 734 861 et n° 7 473 435 ; la demande de brevet US n° 16/078925, incorporée ici à titre de référence.
Avantageusement, ce procédé d’extraction ne fait pas intervenir de solvants organiques, comme l'hexane qui pourrait entrainer de nombreux problèmes de sécurité des installations et des personnels, de santé humaine et de préservation de l'environnement. Cette technologie permet ainsi de réduire les émissions de composés organiques volatiles (COV). Il s’agit ainsi d’un procédé propre permettant d'extraire sans ajout de solvant sous forme d’extrait aqueux des protéines, sucres et autres co-produits de hautes qualités et directement utilisables en cosmétique.
De préférence, les fleurs de roses (Roses de Granville®) et 4 à 5 cm de tige sont récoltés de manière à éviter le hachage ou l’écrasement de la biomasse collectée pour éviter la perturbation de la structure cellulaire des fleurs. La viabilité des plantes collectées peut être testée à l’aide d’un fluoromètre à chlorophylle multimode 0S5p (Opti-Sciences Inc, Hudson, NH, États-Unis).
Selon un mode de réalisation particulier les fleurs fraîches vivantes, y compris les pétales, le pistil et l’étamine, ont été retirées de la tige, y compris le sépale et le réceptacle, et emballées dans des sacs de stockage et sont placé(e)s immédiatement à des températures négatives comprises entre -20° C et -80° C, comme par exemple -20° C, -40° C ou -60° C. Les fleurs peuvent ainsi être stockées sur de longues périodes, comme par exemple plusieurs mois, ou plusieurs années, avant d’être utilisées aux fins du procédé d’extraction. Selon un mode de réalisation préféré, les fleurs fraîches vivantes, y compris les pétales, le pistil et l’étamine, sont retirées de la tige, y compris le sépale et le réceptacle, et emballées dans des sacs de stockage et placées dans un stockage à une température comprise entre 0 et 20°C et de préférence à une température comprise entre 2 et 6°C jusqu’à ce que la récolte soit terminée.
Etape a
Une fois la récolte terminée, les roses, de préférence les pétales de roses, sont immédiatement rincés par pulvérisation avec de l'eau de 10°C à 15°C pendant 0,1 à 0,3 minutes avec un débit de 5 à 6 litres par minute. L'excès d'eau est de préférence éliminé des fleurs rincées en les laissant égoutter pendant au moins 1 minute. Les fleurs rincées peuvent alors subir une macération, un pressage et une séparation par pressage mécanique, à rouleaux, hydrauliques, ou extracteur à jus pour extraire le contenu de la dispersion colloïdale intercellulaire liquide (DCI) du matériau enrichi en fibres (« Fraction À »).
À l’issue de ces étapes, le rendement de la fraction À est compris entre 30% et 65%, de préférence entre 35% et 60% et de manière encore préférée entre 40 % et 55 % (poids/poids).
Le DCI comprend typiquement de 2% à 20% de matière sèche, de préférence de 4% à 16% de matière sèche, et de manière encore préférée de 6 % à 12 % de matière sèche.
À cette étape, le DCI peut être congelé pour stockage. Typiquement, il est congelé à -20° C.
Etape b
Lorsque le DCI a été congelé pour stockage, il doit préalablement être décongelé doucement. Typiquement, il est placé à décongeler à 4°C ou dans de la glace.
Le « traitement À » est réalisé par un traitement de déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques produites à partir de magnétrons fonctionnant à une fréquence comprise entre 2,45 et 5,8 GHz. Les paramètres du traitement de déstabilisation sont fixés pour obtenir la diminution de la valeur de la composante réelle de la constante diélectrique basse fréquence (s'o) d'environ 20 Farads par mètre (F/m) par rapport à sa valeur avant le traitement. Ce traitement dégrade la stabilité du DCI en provoquant l'agglomération et/ou l'agrégation de particules (c'est-à-dire des organites, fragments d'organites, matière fibreuse résiduelle) en assemblages suffisamment grands et stables pour permettre et/ou améliorer la séparation mécanique. En effet, on considère la suspension colloïdale intracellulaire obtenue comme une dispersion colloïdale relativement stable composée d'une phase continue (cytoplasme et contenu de vacuoles) et d'une phase dispersée (organites suspendus et leurs fragments). Selon la théorie de Derjaguin-Laundau-Verwey-Overbeek (DLVO), cette stabilité est maintenue par la somme des forces attractives de van der Waals et des forces répulsives des doubles couches électriques. La barrière énergétique résultant de la force répulsive empêche les particules de la phase dispersée de s'approcher à moins qu'elles n'aient suffisamment d'énergie pour surmonter cette barrière, auquel cas la force d'attraction les mettra en contact (elles adhéreront alors de manière irréversible). La théorie DLVO décrit l'interaction et l'énergie potentielle des particules en fonction de leurs paramètres, de leur distance les unes des autres et des caractéristiques de la phase continue. La modification des valeurs des variables affectant la force répulsive affecte la stabilité de la dispersion. Dans des conditions normales de stabilité colloïdale, une augmentation de l'énergie potentielle à mesure que les particules s'approchent les unes des autres constitue une barrière énergétique potentielle qu'il est impossible de surmonter sans apport énergétique externe. Cette barrière énergétique maintient les particules séparées et la dispersion stable. Les conditions modifiées lors du traitement À, permettent à la force de répulsion de la double couche de diminuer au point qu’il il n'existe plus de barrière énergétique potentielle et que les particules peuvent s'approcher et s'agglomérer librement.
Le rétablissement des conditions initiales ne rend pas la stabilité, car les particules se sont irréversiblement agglomérées. Elles sont ainsi facilement éliminables par des moyens mécaniques (Koganov et coll., sofw journal 2017).
De préférence, à l’issue du « traitement À », on réalise l’étape de séparation mécanique du DCI par centrifugation afin de produire le « Surnageant À » et la « Fraction B ».
Typiquement, le "surnageant À" a une turbidité inférieure à environ 100 NTU.
La « fraction B » comprend typiquement de 10% à 30% de matière sèche, de préférence de 13% à 27% de matière sèche, et de manière encore préférée environ 15,0 % à 25,0 % de matière sèche.
Etape c Le « traitement B » est réalisé par ajustement du niveau de pH dans le « surnageant À » par titrage avec, par exemple, un alcali jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6,5 à 7,5. Typiquement, on utilisera comme alkali préféré le carbonate de potassium.
À l’issue du « traitement B », on réalise de préférence l’étape de séparation mécanique du « Surnageant À » par centrifugation afin de produire le « Surnageant B » et la « Fraction C ».
La « fraction C » comprend typiquement de 5% à 25% de matière sèche, de préférence de 8% à 22% de matière sèche, et de manière encore préférée environ 10,0% à 20,0% de matière sèche.
Etape d
Le « traitement C » est réalisé par ajustement du niveau de pH dans le « surnageant B », notamment par titrage avec, par exemple, de l'acide jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5. Typiquement, on utilisera comme acide préféré une solution d’acide citrique.
À l’issue du « traitement C », on réalise de préférence l’étape de séparation mécanique du « Surnageant B » par centrifugation afin de produire la « fraction de sérum de roses de Granville® fraîches », de préférence la « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » (Extrait Non Conservé) et la « Fraction D ».
La « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » comprend typiquement de 2% à 20% de matière sèche, de préférence de 4% à 16% de matière sèche, et de manière encore préférée de de 6,0% à 10,0% de matière sèche.
Etape e
Selon certains modes de réalisation, la fraction de sérum obtenue à l’issue de l’étape d) est mélangée avec au moins un conservateur ou au moins un stabilisant pour donner un ingrédient fini, ou avec une combinaison de ceux-ci pour donner l'extrait de roses de Granville® fraîche ou « Sérum Rose De Granville® », de préférence l'extrait de pétales frais de roses de Granville® ou « Sérum de pétales de Roses De Granville® ».
Des agents stabilisants particulièrement appropriés peuvent comprendre, sans limitation, un conservateur, un stabilisant et/ou des mélanges de ceux-ci. Les conservateurs et stabilisants appropriés à utiliser dans la présente invention comprennent, sans s'y limiter, le sorbate de potassium, le benzoate de sodium, le métabisulfite de sodium, la glycérine, le propylène glycol, le dipropylène glycol, le butylène glycol, le pentylène glycol, l'hexylène glycol et le caprylyl glycol. Dans un mode de réalisation particulier, les agents stabilisants peuvent comprendre au moins un conservateur, au moins un stabilisant, au moins un antioxydant ou leurs mélanges.
Ainsi, selon un mode préféré de réalisation, le procédé mise en oeuvre pour obtenir l’extrait selon l’invention comprend les étapes de : a) nettoyage du matériel végétal, macération, pressage puis séparation mécanique du matériel végétal pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction A) ; b) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques puis séparation mécanique de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant A et une Fraction Membranaire (fraction B) ; c) ajustement du niveau de pH dans le surnageant A jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6 à 7, puis séparation mécanique du surnageant A pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ; d) ajustement du niveau de pH dans le surnageant B jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5 puis séparation mécanique du surnageant B pour donner une « Fraction sérique bioactive » et une fraction D (précipité) ; et e) Optionnellement, mélange de la « fraction sérique bioactive » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant.
Ainsi selon un mode préféré de réalisation, le procédé mise en oeuvre pour obtenir l’extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’ selon l’invention comprend les étapes de : a) nettoyage des roses fraîches de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, macération, pressage puis séparation mécanique des roses pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction A) ; b) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques puis séparation mécanique de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant A et une Fraction Membranaire (fraction B) ; c) ajustement du niveau de pH dans le surnageant A jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6 à 7, puis séparation mécanique du surnageant A pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ; d) ajustement du niveau de pH dans le surnageant B jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5 puis séparation mécanique du surnageant B pour donner une « fraction de sérum de roses de Granville® fraîches » et une fraction D (précipité) ; et e) Optionnellement, mélange de la « fraction de sérum de roses de Granville® fraîches » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant.
Selon un autre mode préféré de réalisation, le procédé mise en oeuvre pour obtenir l’extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de pétales frais de roses de la variété Evanrat ou rose ‘Jardin de Granville®’ selon l’invention comprend les étapes de : a) nettoyage des pétales frais de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, macération, pressage puis séparation mécanique des roses pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction À) ; b) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques puis séparation mécanique de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant À et une Fraction Membranaire (fraction B) ; c) ajustement du niveau de pH dans le surnageant À jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6 à 7, puis séparation mécanique du surnageant À pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ; d) ajustement du niveau de pH dans le surnageant B jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5 puis séparation mécanique du surnageant B pour donner une « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » et une fraction D (précipité) ; et e) Optionnellement, mélange de la « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant.
De préférence, l’invention porte sur un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat ou roses ‘Jardin de Granville®’, caractérisé en ce qu’il est obtenu par un procédé comprenant les étapes : a) nettoyage des roses fraîches de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, macération, pressage puis séparation mécanique des roses pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction A) ; b) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques puis séparation mécanique de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant À et une Fraction Membranaire (fraction B) ; c) ajustement du niveau de pH dans le surnageant À jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6 à 7, puis séparation mécanique du surnageant À pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ; d) ajustement du niveau de pH dans le surnageant B jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5 puis séparation mécanique du surnageant B pour donner une « fraction de sérum de roses de Granville® fraîches » et une fraction D (précipité) ; et e) Optionnellement, mélange de la « fraction de sérum de roses de Granville® fraîches » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant.
Selon un mode de réalisation préféré, l’invention porte sur un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de pétales frais de roses de la variété Evanrat ou roses ‘Jardin de Granville®’, caractérisé en ce qu’il est obtenu par un procédé comprenant les étapes : a) nettoyage des pétales frais de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, macération, pressage puis séparation mécanique des roses pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction À) ; b) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques puis séparation mécanique de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant À et une Fraction Membranaire (fraction B) ; c) ajustement du niveau de pH dans le surnageant À jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6 à 7, puis séparation mécanique du surnageant À pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ; d) ajustement du niveau de pH dans le surnageant B jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5 puis séparation mécanique du surnageant B pour donner une « fraction de sérum de pétales de roses frais de Granville® » et une fraction D (précipité) ; et e) Optionnellement, mélange de la « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant.
Selon un mode particulier, l’extrait de roses, de préférence de pétales de roses, obtenu selon l’invention comprend de l’eau en une teneur allant de 90 à 94%, une teneur en extrait sec allant de 6 à 10%. Cet extrait de roses, de préférence de pétales de roses, sous forme d’une fraction bioactive isolée selon l’invention est dénommé en nom INCI Rosa Hybrid Flower Extract.
Selon un autre mode particulier, l’extrait de roses, de préférence de pétales de roses, obtenu selon l’invention comprend de l’eau en une teneur allant de 89 à 93%, une teneur en extrait sec allant de 6 à 10% et des conservateurs et/ou stabilisants en une teneur allant de 0.3 à 1% en poids par rapport au poids total de l’extrait.
L’extrait de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, en particulier de pétales de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, selon l’invention comprend notamment des acides aminés (acide aspartique, tyrosine, arginine) des sucres totaux (glucose, fructose), des minéraux et d’autres co-produits, qui lorsqu’on les applique sur une matière kératinique, en particulier la peau, procure un bénéfice ou une amélioration de l’aspect de la matière kératinique, tel que favoriser et/ou améliorer la nutrition cutanée, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer le processus rythmique des cellules cutanées, prévenir et/ou ralentir le vieillissement de la peau.
Ils permettent également de prévenir et/ou ralentir les phénomènes de micro-inflammation induits par un stress.
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La présente invention concerne une nouvelle composition comprenant au moins un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’ selon l’invention, tel que défini ci-dessus.
De préférence, l’invention concerne une nouvelle composition comprenant au moins un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de pétales frais de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’ selon l’invention, tel que défini ci-dessus.
La composition de l’invention est de préférence une composition cosmétique.
Par « composition cosmétique » on entend toute composition à visée cosmétique, c’est à dire esthétique, pouvant être mise en contact avec les parties superficielles du corps humain et plus particulièrement avec les matières kératiniques, en particulier la peau et/ou les lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou.
Par « matières kératiniques » selon l’invention, on entend la peau et/ou ses phanères, et plus particulièrement la peau et/ou les lèvres humaines. En particulier, il s’agira de la peau du visage et/ou du cou et/ou du corps, et des lèvres. Les matières kératiniques selon l’invention sont notamment des matières kératiniques saines (sujets « sains »), c’est-à-dire ne présentant pas de troubles ou de désordres qui relèveraient d’un état pathologique (sujets « non sains », atteints d’une pathologie). On parlera indifféremment de peaux et/ou lèvres saines ou de peaux et/ou lèvres dans le reste de la description.
La présente invention porte donc sur une composition cosmétique comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable, une quantité efficace d’au moins un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’ tel que défini ci-dessus.
Par « milieu physiologiquement acceptable » on entend tout excipient convenant à une utilisation topique, en contact avec les matières kératiniques, sans risque de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité et/ou de réponse allergique.
Par « quantité efficace » on désigne la quantité minimum d’extrait de roses « Jardin de Granville® » selon l’invention qui est nécessaire pour obtenir l’effet bénéfique selon l’invention, à savoir un effet bénéfique consistant à favoriser et/ou améliorer la nutrition cutanée, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer le processus rythmique des cellules cutanées, prévenir et/ou ralentir le vieillissement de la peau et/ou des lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou.
La composition cosmétique selon l’invention est une composition de soin des matières kératiniques, en particulier de la peau et/ou des lèvres et notamment de la peau du visage et/ou du cou.
Selon une variante avantageuse, l’extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’ est présent dans la composition en une teneur allant de 0.001 à 50%, en particulier de 0,01 à 20%, de préférence de 0,01 à 10% et de préférence encore de 0,011 à 5% en poids de matière première par rapport au poids total de ladite composition.
Le milieu physiologiquement acceptable représente généralement de 1 à 99% en poids, par rapport au poids total de ladite composition. La composition cosmétique utilisée selon l’invention comprend généralement, outre l’extrait de roses Jardin de Granville® » et le milieu physiologiquement acceptable, un ou plusieurs excipients cosmétiques acceptables parmi ceux connus de l’homme du métier en vue d’obtenir une composition pour l’application topique par exemple sous forme d’une crème, émulsion huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsion multiple, solution, suspension, gel, lait, lotion, sérum, de baume, de stick, ou encore de poudre.
Selon un mode particulier, la composition cosmétique de l’invention est sous la forme d’une crème, émulsion huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsion multiple, solution, suspension, gel, lait, lotion, ou sérum.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite composition utilisée selon l’invention est sous la forme d’une crème ou d’un sérum.
La composition cosmétique selon l’invention peut se présenter sous toute forme galénique adaptée à une application topique sur la peau et/ou les lèvres et notamment de la peau du visage et/ou du cou comprenant l’extrait de roses « jardin de Granville® », de préférence, l’extrait de pétales de roses « jardin de Granville® » et au moins un adjuvant cosmétique choisi parmi les antioxydants, les parfums, les vitamines, les agents épaississants, les agents émollients, les agents hydratants, les agents anti-âge, les agents liftants, les agents tenseurs, les agents repulpants, les agents apaisants, les agents antipollution, les agents éclaircissants ou dépigmentants, les charges, les nacres et leurs mélanges.
Aussi, selon un mode particulier de l’invention, la composition cosmétique selon l’invention peut comprendre en outre au moins un adjuvant cosmétique choisi dans le groupe constitué par : des agents antioxydants, des agents émollients, des agents hydratants, des agents antiâges, des parfums, et leurs mélanges.
Selon la nature de la composition, on sélectionnera un ou plusieurs excipients cosmétiquement acceptables parmi des émulsionnants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des électrolytes, des ajusteurs de pH, des agents antioxydants, des conservateurs, des colorants, et leurs mélanges.
À titre d’exemple particulier, la composition cosmétique selon l’invention peut comprendre des gélifiants, des antioxydants, des conservateurs et leurs mélanges. La composition cosmétique selon l’invention peut comprendre en outre une phase grasse (corps gras solides) ou huileuse.
On entend par « phase huileuse » une huile ou un mélange d'huiles miscibles entre elles, ou non. Par « huile », on entend, au sens de l'invention, un corps gras, non soluble dans l'eau, liquide à 25° C et pression atmosphérique. Ces huiles peuvent être volatiles ou non volatiles, végétale, minérale ou synthétique.
Une phase huileuse selon l’invention peut comprendre des huiles naturelles, hydrocarbonées, siliconées, et leurs mélanges.
La teneur en phase grasse ou huileuse dans la composition cosmétique de l’invention ira généralement de 0,2 % à 45 %, de préférence de 0,5 % à 30 %, et de préférence encore de 2 % à 25 % en poids par rapport au poids total de ladite composition.
Utilisations cosmétiques et autres utilisations
L’invention concerne également un procédé de traitement cosmétique de la peau et/ou des lèvres, destiné à favoriser et/ou améliorer la nutrition cutanée, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer le processus rythmique des cellules cutanées, prévenir et/ou ralentir le vieillissement de la peau, comprenant l’application sur la peau et/ou les lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou, d’une composition cosmétique telle que définie ci-dessus.
L’invention porte encore sur l’utilisation d’au moins une quantité efficace d’au moins un extrait de roses fraîches de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, sous la forme d’une fraction bioactive isolée selon l’invention, comme agent pour favoriser et/ou améliorer la nutrition cutanée, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer le processus rythmique des cellules cutanées, prévenir et/ou ralentir le vieillissement de la peau et/ou des lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou.
L’invention concerne finalement un extrait de roses fraîches de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, sous la forme d’une fraction bioactive isolée ou une composition le contenant, tels que définis dans la présente demande, pour son utilisation pour prévenir et/ou ralentir les phénomènes de micro-inflammation induits par un stress de la peau et/ou des lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou.
Les extraits de roses fraîches de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, sous la forme d’une fraction bioactive isolée selon l’invention, utilisés pour la mise en oeuvre de ces procédés et utilisations sont ceux tels que décrits dans la présente demande. Dans un mode de réalisation particulier et préférentiel, les extraits de roses sous la forme d’une fraction bioactive isolée sont des extraits sous la forme d’une fraction bioactive isolée de pétales de roses, notamment de roses de la variété Evanrat, en particulier de roses de rosiers Jardin de Granville®.
L’invention va être illustrée désormais dans les exemples non limitatifs suivants. Sauf indication contraire, les % sont exprimés en poids par rapport au poids total de la composition.
EXEMPLES
Exemple 1 : Extraits végétaux
1. 1 Fraction bioactive de pétales de roses ‘jardin de Granville®’ selon l’invention On utilise comme matériel végétal des pétales frais de roses de la variété Evanrat ou rose « Jardin de Granville® ».
La fraction bioactive de pétales de rose selon l’invention est obtenue selon le protocole suivant : a1 ) nettoyage des pétales frais de roses par pulvérisation avec de l'eau d’une température d’environ 12°C, pendant 0,1 à 0,3 minutes à un débit de 5 à 6 litres par minute, a2) macération, pressage puis séparation mécanique des roses à l'aide d'une presse à vis mécanique (modèle CP-6 Vincent Corporation, FL) pour extraire le contenu de la dispersion colloïdale intercellulaire liquide (DCI) du matériau enrichi en fibres (« Fraction À ») ; b1 ) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques produites à partir de magnétrons fonctionnant à une fréquence comprise entre 2,45 et 5,8 G Hz, b2) centrifugation de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant À et une Fraction Membranaire (fraction B) ; c1 ) ajustement du niveau de pH dans le surnageant À par un alkali (i.e., le carbonate de potassium), afin d’obtenir un pH allant de 6 à 7, c2) séparation mécanique du surnageant À pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ; d1 ) ajustement du niveau de pH dans le surnageant B par de l’acide citrique afin d’obtenir un pH inférieur à 4,5, d2) séparation mécanique du surnageant B pour donner une « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » et une fraction D (précipité) ; et e) mélange de la « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » avec du sorbate de potassium et du benzoate de sodium.
Le sérum de pétales de roses de Granville® (aussi appelé « Zêta sérum », ou « Zf sérum » dans les exemples suivants) contient 8% matière sèche (matière active), 91 ,5% en poids d’eau, 0,15% en poids de sorbate de potassium et 0,3% en poids de benzoate de sodium. Ces teneurs s’entendent en en poids par rapport au poids total de l’extrait. Le nom INCI de cet extrait est Rosa Hybrid Flower Extract, Potassium Sorbate, and Sodium Benzoate.
7.2 Autres extraits de roses utilisables en association
D’autres extraits de roses, en particulier de la variété Evanrat, de préférence la rose Jardin de Granville® peuvent être utilisés en association avec l’extrait de roses, sous la forme d’une fraction bioactive isolée selon l’invention pour apporter des effets complémentaires. À titre d’exemple on peut citer l’extrait aqueux de fleurs (pétales) de roses (‘Cryoextrait’). L’extrait aqueux de fleurs (pétales) de roses (Cryoextrait) est obtenu selon un procédé de cryo-extraction tel que celui décrit en particulier dans la demande de brevet EP0425391 . Un tel procédé comprend notamment les étapes suivantes : premier broyage de fleurs de rose à une température comprise entre -10°C et -40° C, second broyage des fractions de roses obtenues à l’étape précédente, à une température comprise entre -40°C et -100°C, en présence d’azote liquide tamisage des fractions obtenues à l’étape précédente, à l’aide d’un tamis de granulométrie allant de 2mm à 100pm et préférentiellement inférieure à 500pm, en particulier allant de 100p à environ 500p, pressage des fractions récupérées à l’étape précédente, et ramenées à une température de 0°C ±5°C, puis soumises au cycle d’opérations suivantes : congélation à une température comprise entre -10°C et -40° C, mise en suspension de ces fractions congelées dans une quantité d’eau approximativement égale à la quantité de liquide obtenu lors de l’étape précédente, pressage des fractions en suspension dans l’eau et ramenées à une température de 0°C ±5°C,
- filtration des quantités de liquides obtenus et récupération des filtrats, concentration des filtrats par élimination de l’eau à froid, avantageusement congélation des solutions concentrées obtenues à l’étape précédente.
On obtient un Cryoextrait comprenant 0.5 % en poids de matière sèche (matière active), 49- 50% en poids d’eau, 49% en poids de glycérol et des conservateurs. Le nom INCI de cet extrait aqueux de rose est Water, Glycerin, Rose Extract ou Rosa Hybrid Flower Extract, Water, Glycerin.
Exemple 2 : Caractérisation phytochimique des extraits de roses de l’Exemple 1
Les résultats des analyses phytochimiques pour l’extrait « sérum de pétales de roses de Granville® » obtenu selon l’exemple 1.1 ci-dessus (pétales frais) sont montrés dans les Tableaux 1 à 3 ci-dessous. Les données sont notamment comparées aux analyses phytochimiques du cryoextrait de fleurs (pétales) de roses de Granville® obtenus en parallèle par le procédé d’extraction décrit à l’Exemple 1.2.
Tableau 1 : Composés détectés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse dans le sérum de pétales de roses de Granville® selon l’invention et dans l’extrait comparatif, cryoextrait de pétales de rose de Granville®.
[Table 1 ]
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On constate donc que, comparativement au cryoextrait, le sérum de pétales de roses de Granville® selon l’invention est riche en sucres, notamment, glucose, fructose, xylose, myoinositol et saccharose. On détecte aussi d’autres composés d’intérêts tels que des phénols (catéchine, Kaempferol- 3-O-glucoside), l’acide citrique, l’acide malique ou encore l’acide quinique. Globalement, on mesure une concentration de polyphénols totaux de 7474 ppm (équivalent rutine) dans le sérum de pétales de roses de Granville® contre 3106 ppm dans le cryoextrait extrait. Tableau 2 : Quantification des acides aminés libres dans le sérum de pétales de roses de Granville® selon l’invention et dans l’extrait comparatif, cryoextrait de pétales de rose de Granville®.
[Table 2]
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On constate donc que, comparativement au cryoextrait, le sérum de pétales de roses de Granville® selon l’invention est plus riche en acides aminés libres. Tableau 3 : Quantification des minéraux dans le sérum de pétales de roses de Granville® selon l’invention et dans l’extrait comparatif, cryoextrait de pétales de rose de Granville®.
[Table 3]
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On constate donc que, comparativement au cryoextrait, le sérum de pétales de roses de Granville® selon l’invention est plus riche en minéraux. Notamment il est très riche en calcium et potassium.
Dans l’ensemble, ces analyses montrent que le sérum de pétales de roses de Granville® selon l’invention est plus concentré en composés d’intérêt, comparativement à un cryoextrait de pétales de roses.
Exemple 3 : Matériel et méthode
3. 1 Cultures cellulaires
Cultures cellulaires de kératinocytes
Les kératinocytes utilisés pour cette étude proviennent d’un épiderme humain normal de donneurs âgés de 26 à 61 ans. Ils ont été cultivés en milieu sans sérum pour kératinocytes (KSFM, Gibco) avec 5 ng/mL d'EGF (Epidermal Growth Factor) humain recombinant (Gibco), 50 pg/ml d'extrait d'hypophyse bovin (Gibco) et 100 pg/ml de Primocine (agent antimicrobien, InvivoGen). Les cellules ont été cultivées à 37° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2.
Cultures cellulaires de fibroblastes
Les fibroblastes utilisés pour cette étude proviennent d’un épiderme humain normal d'une femme donneuse de 48 ans. Ils ont été cultivés dans du DMEM 1 g/L de glucose (Lonza) complété par 10% de FBS (Foetal Bovine Serum ; Gibco), 2 mM de LGlutamine (Lonza) et 100 pg/ml de Primocine (InvivoGen). Les cellules ont été maintenues à 37° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2.
3.2 Peau humaine normale ou biopsie cutanée
La peau humaine normale provient de biopsies cutanées prélevées lors d’interventions de chirurgie plastique sur l'abdomen de donneurs âgés de 26 à 66 ans. Ces biopsies ont été réalisées avec un poinçon de 6 mm de diamètre (pfm médical).
Elles ont été cultivées sur un milieu de culture contenant 50% de DMEM 1 g/L de glucose (Lonza) et 50% de milieu de culture Ham's-F12 (Lonza) complété avec 10% de FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco), 2 mM de L-glutamine (Lonza) et 100 pg/ml de Primocine (InvivoGen). Les biopsies cutanées ont été maintenues en culture à 37° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2. 3.3 Réactifs
Les réactifs utilisés pour cette étude étaient :
Lipopolysaccharide (LPS) (Sigma) dilué à 0,5 mg/mL pendant 6 heures,
Ocytocine (Sigma) diluée à 200pM pendant 24 heures,
- 2-désoxy-D-glucose (2-DG) (Sigma) dilué à 2mM pendant 24 heures, Neutral Red (Sigma) dilué à 0,05 mg/mL pendant 3 heures.
Les amorces et les sondes utilisées pour cette étude étaient de type « TaqMan Gene expression Assays » (Life technologies) :
- 11 -HSD1 (Hs01547870_m1 )
18S contrôle endogène (Hs9999999901_s1 )
3.4 Anticorps
Les anticorps primaires utilisés pour l’étude sont :
- Anti-HMGB1 (Abeam) lapin monoclonal, dilué à 1 /500, pendant la nuit,
- Anti-COX-2 (Abeam) lapin monoclonal, dilué à 1 /500, pendant 1 h30,
- Anti-Filaggrin (Santa Cruz Biotechnology) souris monoclonal, dilué à 1 /100, pendant 1 h30,
- Anti-TGM1 (Santa Cruz Biotechnology) souris monoclonal, dilué à 1 /100, pendant la nuit,
- Anti-CLOCK (Abeam) lapin polyclonal, dilué à 1 /500, pendant la nuit.
- Anti-collagène III (Tebu) lapin monoclonal, dilué à 1 /100, pendant 1 h30,
- Anti-collagène I (Abeam) lapin monoclonal, dilué à 1 /1000, pendant une nuit,
- Anti-fibrilline-1 (R&D Systems) lapin monoclonal, dilué à 1 /500, pendant une heure et demie.
Les anticorps secondaires utilisés pour l’étude sont :
- Chèvre anti-lapin conjugué à la peroxidase (Invitrogen), dilué à 1 /5000, pendant 1 h,
- Alexa Fluor 488 âne, anti-souris (Invitrogen), dilué à 1 /1000, pendant 1 h,
- Alexa Fluor 488 âne, anti-lapin (Invitrogen), dilué à 1 /1000, pendant 1 h.
3.5 Protocole de Western- Blot
Dans le lysat cellulaire :
Les cellules cultivées ont été homogénéisées dans un tampon RIPA (Radioimmunoprecipitation Assay) glacé (Thermo Scientific) contenant le cocktail d’inhibiteurs de protéases Hait et de l’EDTA (Thermo Scientific). Les cellules ont été récoltées par action mécanique et centrifugées à 10 000 tr/min pendant 20 minutes à 4°C. Un dosage des protéines a été effectué selon les recommandations du kit (Thermo Scientific) sur le surnageant cellulaire et le Western-blot a été effectué sur une quantité standardisée de protéines. Les protéines ont été mélangées avec un tampon de charge et un agent réducteur, le DTT (dithiothréitol, Sigma) et chauffées à 90° C pendant 5 minutes. Les échantillons ont ensuite été déposés sur un gel NuPÀGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogène) puis l’électrophorèse a été réalisée. Les protéines ont ensuite été transférées du gel vers une membrane nitrocellulosique à l'aide du système iBlot Dry Blotting System (Invitrogen). Les sites non spécifiques ont été saturés pendant 1 heure dans une solution de lait à 5 % dilué dans le tampon TBS 1X (Tris buffered Saline). La membrane de nitrocellulose a été incubée pendant la nuit à 4°C avec l'anticorps primaire, dilué dans du lait. Après trois lavages de 15 minutes avec une solution à 0,05 % de Tween 20 dans TBS 1X, l'anticorps secondaire, couplé à une peroxydase, a été appliqué pendant 1 heure à température ambiante. Après une deuxième série de trois lavages de 15 minutes avec une solution à 0,05 % de Tween 20 dans le TBS 1X, la révélation des protéines a été réalisée avec du luminol (Thermo Scientific), et l'émission photonique a été lue par chimiluminescence en utilisant une caméra Sensicam associée au cabinet lumineux Multilmage (AIC).
En surnageant cellulaire :
Les surnageants ont été recueillis. 20 pl de protéines ont été mélangées avec un tampon de charge et du DTT (Sigma) et chauffées à 90° C pendant 5 minutes. Les échantillons ont ensuite été déposés sur un gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogène) et une électrophorèse a été réalisée. Les protéines ont ensuite été transférées du gel vers une membrane nitrocellulosique à l'aide du système iBlot Dry Blotting System (Invitrogen). Les sites non spécifiques ont été saturés pendant 1 heure dans une solution de lait à 5 % dilué dans le tampon TBS 1X. La membrane de nitrocellulose a été incubée pendant la nuit à 4°C dans l'anticorps primaire, dilué dans du lait. Après trois lavages de 15 minutes avec une solution à 0,05 % de Tween 20 dans TBS 1X, l'anticorps secondaire, couplé à une peroxydase, a été appliqué pendant 1 heure à température ambiante. Après une deuxième série de trois lavages de 15 minutes avec une solution à 0,05 % de Tween 20 dans le TBS 1X, la révélation des protéines a été réalisée avec du luminol (Thermo Scientific), et l'émission photonique a été lue par chimiluminescence en utilisant une caméra Sensicam associée au cabinet lumineux Multilmage (AIC).
L'intensité des bandes a été quantifiée avec le logiciel d'analyse d'images Scion.
3.6 Protocole d’immunofluorescence
Les sections ont été déparaffinées et réhydratées avec plusieurs bains successifs de xylène, d'alcool et d'eau. Ensuite, un protocole de démasquage a été réalisé comme décrit pour les différentes cibles : - pour COX-2 : exposition aux micro-ondes à 600 W dans un tampon EDTÀ pH 9 (Sigma) jusqu'à ébullition, suivie d'une digestion à 0,25% de pepsine (Zymed, Invitrogen) pendant 15 minutes à 37° C,
- pour la filaggrine : Digestion à 0,25% de pepsine (Zymed, Invitrogen) pendant 15 minutes à 37°C,
- pour TGM1 : exposition aux micro-ondes à 600 W dans un tampon au citrate pH6 (Sigma) jusqu'à ébullition,
- pour CLOCK : exposition aux micro-ondes à 600 W dans un tampon au citrate pH6 (Sigma) jusqu'à ébullition.
Après un lavage au PBS et une saturation de sites non spécifiques avec une solution à 5% de BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma) pendant 30 minutes, l'anticorps primaire a été appliqué et les lames ont été incubées sous agitation, à température ambiante, dans une pièce humide. Après avoir rincé les lames avec du PBS (Phosphate Buffered Saline), l'anticorps secondaire a été appliqué, dans l'obscurité, sous agitation, à température ambiante, dans une pièce humide. Enfin, les noyaux cellulaires ont été colorés avec du 4',6'-diamidino-2- phénylindole (DAPI, Molecular Probes) à 0,3 pM pendant 5 minutes et les sections ont été montées en Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences). La détection a été effectuée à l'aide d'un microscope Zeiss Axiovert ZOOM avec un objectif 20x ou 40x. Les photos ont été prises avec une caméra Qimaging EXI bleue couplée au logiciel d'acquisition Velocity (Improvision).
3.7 Protocole de PCR quantitative
L'ARN total a d'abord été extrait à l'aide d’un kit d'isolation (Ambion) comme suit :
Après le traitement, le milieu de culture a été retiré et les cellules ont été rincées avec du PBS froid et récupérées avec un tampon de lyse. Des colonnes spécifiques ont été utilisées pour purifier l'ARN qui a finalement été élué dans 30 pl d'eau sans RNase. Ensuite, l'ARN total a été rétro-transcrit avec le kit de transcription inverse d'ADNc (ADN complémentaire) contenant l'inhibiteur de la RNase (Life Technologies). La transcription inverse a été effectuée sur 2 pg d'ARN total à l'aide d'un thermocycleur (MJ Research). Enfin, la PCR en temps réel a été réalisée sur un thermocycleur (Applied Biosystems) avec un kit TaqMan Gene Expression Master Mix (Life technologies) et TaqMan Gene Expression Assays (Life technologies) qui étaient composés de deux amorces et une sonde spécifique de la séquence. Le Taqman Gene Expression Master Mix contenait de l'ADN polymérase, du dNTP, de l'UDG (pour éviter la contamination par l'ADN), du ROX (une référence fluorescente passive) et un tampon. Les amorces TaqMan 18S ont été utilisées comme contrôle endogène car le gène 18S code pour une protéine ribosomale dont l'expression et l'ARNm correspondant sont connus pour être invariables dans toutes les conditions. De plus, l'ÀDN a été remplacé par l'eau comme contrôle négatif.
Chaque échantillon a été analysé en trois exemplaires.
La méthode comparative du TC (Threshold cycle - seuil de cycle) a été utilisée pour la quantification relative des expressions cibles (Livak K. J. et Schmittgen T.D., 2001 ) et le logiciel StepOne (Applied Biosystems) a été utilisé pour le traitement des données.
3.8 Protocole d’étude de la viabilité cellulaire au « neutral red »
Le « Neutral Red » est une technique permettant de détecter les cellules vivantes par l’absorption d'un colorant rouge neutre (eurhodine). Les cellules vivantes absorbent le rouge neutre par transport actif et incorporent le colorant dans leurs lysosomes/endosomes. Les cellules sont ensuite lysées avec une solution acide et les lysosomes/endosomes libèrent le rouge neutre. Ainsi, le nombre total de cellules vivantes peut être déterminé par la mesure de la quantité de colorant libéré. Cette mesure se fait par lecture de la densité optique (DO) à 540 nm.
Les cellules ont été rincées avec Ca2+/Mg2+ PBS (Lonza) puis incubées avec une solution de rouge neutre (Sigma) à 0,05 mg/mL pendant 3 heures. Après un lavage au Ca2+/Mg2+ PBS, les cellules ont été lysées avec un tampon de lyse ((50% éthanol (VWR), 49% H2O, 1 % acide acétique (Sigma)) et incubées pendant 10 minutes sous agitation. La détection du colorant libéré à 540 nm a été réalisée à l'aide d'un spectrophotomètre Sinergy 2 Biotek.
Dans les exemples suivants, la Demanderesse a étudié l’impact de la fraction bioactive de pétales de rose telle que préparée ci-dessus, sur la fonction barrière cutanée, le vieillissement cellulaire cutané, la nutrition cutanée, le processus rythmique des cellules cutanées, et la régénération cutanée, ainsi qu’en parallèle sur la micro-inflammation cutanée.
Pour l’ensemble de ces essais, les effets de l’extrait de pétales de roses sous forme de fraction bioactive selon l’invention « ZF sérum » préparé selon le protocole décrit dans l’Exemple 1.1 sont comparés aux effets du « cryoextrait » (comparatif) préparé selon le protocole décrit dans l’Exemple 1.2 et aux effets d’une solution contrôle « placébo » consistant en une solution de conservateurs (benzoate de sodium, sorbate de potassium, acide citrique). Les pourcentages (%) sont exprimés en poids de matière première (MP) par rapport au poids total de la composition sauf indication contraire.
Exemple 4 : Effet de la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention sur la fonction barrière cutanée
L’effet de la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention tel que préparé à l’exemple 1.1 , sur la fonction barrière cutanée a été testé.
HMGB1 est une molécule centrale dans divers processus physiologiques. On la trouve localisée au niveau de la chromatine, où elle est notamment impliquée dans la modulation de l’expression de différents gènes, et en particulier de gènes impliqués dans la formation du stratum corneum et la croissance de l’épiderme. HMGB1 joue donc un rôle crucial dans la physiologie de l’épiderme et plus particulièrement dans la fonction barrière cutanée.
Capacité de la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention à moduler l’expression de la filaggrine
Il a notamment été montré sur des modèles cellulaires de peau que la stimulation d’HMGBI régule négativement l’expression de la filaggrine, protéine jouant un rôle essentiel dans la régulation de l’homéostasie épithéliale et activement impliquée dans la fonction barrière de la peau.
La capacité de l’extrait de pétales de rose sous forme de fraction bioactive selon l’invention à moduler l’expression de la filaggrine a été évaluée sur des biopsies de peau humaine.
Protocole :
- Peau humaine (biopsies selon l’ Exemple 3.2) provenant de deux donneurs indépendants.
- Conditions : les biopsies ont été traitées deux fois par jour pendant 48h par les différents extraits ou solutions contrôles comme indiqué ci-après :
(1 ) « Contrôle » : PBS dilué,
(2) « ZF sérum » à 0.3%,
(3) « Placebo » à 3%,
(4) « Cryoextrait » à 3%.
- Méthode d’analyse : évaluation de l’expression de la filaggrine par immunofluorescence, et quantification des résultats avec Velocity selon le protocole détaillé à l’Exemple 3.6.
Les résultats de la figure 2 montrent que le traitement par la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention permet d’augmenter de façon significative (+ 49%) le niveau d’expression protéique de la filaggrine dans des biopsies de peau humaine. Aucun effet significatif n’est observé avec le cryoextrait de pétales de rose (comparatif) ou avec la solution placebo.
Exemple 5 : Effet de la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention sur le vieillissement cellulaire
L’effet de la fraction bioactive isolée de pétales de rose sur le vieillissement cellulaire cutané a été testé.
Une quantité accrue de cortisol au niveau de la peau est associée au vieillissement cutané et à ses effets, tels que la diminution de l’épaisseur de l’épiderme, la dégradation des fibres de collagène ou encore une réduction de la prolifération cellulaire. Une des voies de majeures impliquée dans la synthèse du cortisol passe par l’activation de l’enzyme 118- HSD1. Dans les cellules de la peau, 11 B-HSD1 augmente avec l’âge, et en lien avec une surexposition aux UV, contribue à l’apparition de dommages cutanés localisés.
Nous avons donc évalué la capacité de la fraction de pétales de rose selon l’invention à moduler l’expression de 11 B-HSD1.
Protocole :
- Cultures cellulaires de kératinocytes humains, en milieu de culture pendant 6h.
- Conditions : les kératinocytes ont été traités une fois au cours des 6 heures de culture par les différents extraits ou solutions contrôles comme indiqué ci-après :
(1 ) « Contrôle » : PBS dilué,
(2) « ZF sérum » à 0.1%,
(2) « Placebo » à 1%,
(4) « Cryoextrait » à 1%.
- Méthode d’analyse : évaluation de l’expression de 11 B-HSD1 par PCR quantitative en temps réel selon le protocole détaillé à l’Exemple 3.7.
Les résultats de la figure 3 montrent que le traitement des kératinocytes par la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention permet de réduire significativement (- 28%) le niveau d’expression de 11 B-HSD1 , connu pour réguler le niveau de cortisol dans les cellules de la peau. Ces effets ne sont pas observés avec le cryoextrait de pétales de roses (comparatif) ni avec la solution placébo.
Ainsi, la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention possède un effet bénéfique sur la peau, permettant de lutter contre le vieillissement cellulaire cutané. Exemple 6 : Effet de la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention sur le rythme circadien
L’effet de la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention sur le processus rythmique des cellules cutanées a été testé. Pour cela nous avons étudié par immunofluorescence l’effet de l’extrait de pétales de roses selon l’invention sur l’expression du gène CLOCK, un facteur de transcription jouant un rôle central dans le dans la régulation de cette voie, notamment en activant plusieurs éléments de la cascade signalétique permettant la génération des rythmes circadiens.
Protocole :
- Peau humaine (biopsies selon l’ Exemple 3.2) provenant de deux donneurs indépendants.
- Conditions : les biopsies ont été traitées deux fois au cours des 24h de culture par les différents extraits ou solutions contrôles comme indiqué ci-après.
(1 ) « Contrôle » : PBS dilué,
(2) « ZF sérum » à 0.3%,
(3) « Placebo » à 3%,
(4) « Cryoextrait » à 3%.
- Méthode d’analyse : évaluation de l’expression de CLOCK par immunofluorescence, et quantification des résultats avec Velocity selon le protocole détaillé à l’Exemple 3.6.
Les résultats de la figure 4 montrent que le traitement par la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention permet d’augmenter significativement (+ 16%) l’expression de la protéine CLOCK dans les biopsies de peau humaine. Un traitement par le cryoextrait de pétales de rose (comparatif) ou par la solution placébo ne permet pas d’obtenir une augmentation significative de l’expression de CLOCK.
Ainsi, la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention possède un effet bénéfique sur le rythme circadien des cellules de la peau.
Exemple 7 : Effet de la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention sur la nutrition cutanée
L’effet de l’extrait de pétales de roses comprenant une fraction bioactive isolée sur la nutrition cutanée a été testé.
Les nutriments et métabolites sont des éléments indispensables au maintien de l’homéostasie cellulaire, permettant notamment la respiration mitochondriale et la synthèse d’ÀTP. L’arrêt du métabolisme du glucose peut entraîner la mort cellulaire. Le 2-deoxy-D- glucose (2-DG) est un inhibiteur bien connu de cette voie métabolique.
Le potentiel effet protecteur de l’extrait de pétales de roses selon l’invention contre la déprivation de glucose suite à un stress 2-DG a donc été évalué.
Protocole :
- Cultures cellulaires de kératinocytes humains, en milieu de culture pendant 48h.
- Conditions : les cultures cellulaires ont été traitées une fois au cours des premières 24 heures de culture par les différents extraits ou solutions contrôles comme indiqué ci-après. Puis, les conditions (2) à (5) ont été traitées par l’inhibiteur 2-DG à la concentration de 200pM pendant les 24 dernières heures de culture.
(1 ) « Contrôle » PBS dilué, non stressé au 2-DG
(2) « Contrôle » : PBS dilué,
(3) « ZF sérum » à 0.1%,
(4) « Placebo » à 1%,
(5) « Cryoextrait » à 1%
- Méthode : analyse de la viabilité cellulaire par évaluation Neutral Red selon le protocole décrit à l’Exemplel .10.
Les résultats de la figure 5 montrent que le traitement par l’inhibiteur 2-DG entraîne une baisse significative (- 27%) de la viabilité cellulaire par rapport au contrôle PBS non traité au 2-DG. Avantageusement, dans des conditions de stress au 2-DG, le traitement par la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention permet d’augmenter significativement (+ 18%) la viabilité cellulaire par rapport à la condition contrôle PBS. Dans ces mêmes conditions de stress, le traitement par le cryoextrait (comparatif) ou le placébo ne permet pas d’augmentation significative de la viabilité cellulaire comparativement à la condition contrôle PBS.
Ainsi, la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention possède un effet protecteur contre le stress 2-DG et se révèle être bénéfique pour la nutrition cutanée.
Exemple 8 : Effet de la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention sur la fermeté cutanée
L’effet de l’extrait de pétales de roses comprenant une fraction bioactive isolée sur la fermeté du tissu cutané a été testé. Les protéines de structure, telles que les collagènes ou la fibrilline sont des éléments indispensables de la matrice extracellulaire contribuant de la fermeté du tissu cutané. Avec le temps mais aussi les stress à répétition ces protéines se dégradent et sont moins bien renouvelées contribuant au relâchement tissulaire et à la perte de fermeté cutanée.
Le potentiel effet protecteur de la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention sur ces protéines de la matrice extracellulaire a donc été évalué.
8.1 . Matériel et méthodes
Les méthodes d’obtention des tissus de biopsies sont décrites à l’ Exemple 3.2.
Les anticorps utilisés sont décrits à l’ Exemple 3.4.
8.1.1. Cryopréservation des biopsies
A l’issue des traitements, pour permettre la conservation et la section de la peau, les tissus ont été congelés dans du milieu OCT (CellPath) à l'aide d'azote liquide et conservés à -20° C. Les biopsies de peau congelées ont ensuite été coupées avec un cryotome (Leica) en sections de 6 pm d'épaisseur et placées sur des lames (Thermo Scientific).
8.1.2. Protocole d’immunofluorescence
Les sections ont été séchées pendant 30 minutes à 37° C, fixées dans un bain d'acétone froid pendant 10 minutes, puis rincées dans un bain de PBS. Après saturation des sites non spécifiques avec une solution de BSA à 5% (Sigma) pendant 30 minutes, l'anticorps primaire (décrit au paragraphe 3.4.) a été appliqué et les lames ont été incubées sous agitation, à température ambiante, dans une pièce humide. Après avoir rincé les lames avec du PBS, l'anticorps secondaire (décrit au paragraphe 3.4.) a été appliqué, dans l'obscurité, sous agitation, à température ambiante, dans une pièce humide. Enfin, les noyaux cellulaires ont été colorés avec du 4', 6'- diamidino-2-phénylindole (DAPI, Molecular Probes) à 0,3 pM pendant 5 minutes et les coupes ont été montées dans du Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences. La détection a été effectuée à l'aide d'un microscope Nikon Eclipse Ni- E. Les photos ont été prises avec un appareil photo Nikon DS- Fi3 et traitées à l'aide du logiciel d'acquisition NiSAR (Nikon).
8.1.3. Etude de l’imagerie (quantification)
La quantification des immunomarquages du collagène I et du collagène III a été faite grâce au logiciel d'analyse d'images Velocity (Improvision), la zone intéressante a été sélectionnée à partir de l'intensité de la fluorescence. Les résultats obtenus sont la somme des intensités des pixels verts dans la zone sélectionnée. Enfin, pour chaque photo, la somme obtenue a été ajustée en considérant l'aire de la zone du derme examinée. Trois à six photos par conditions ont été analysées. La quantification finale (figures 6 et 7) représente la moyenne de 2 expériences indépendantes (n=6-12).
La quantification de la fibrilline-1 a été faite grâce au logiciel Image J, les fibres du derme supérieur ont été sélectionnées avec une profondeur constante pour toutes les conditions. Cette sélection a été utilisée pour l'analyse quantitative. La longueur totale des fibres sélectionnées a été mesurée et normalisée par la longueur de la jonction dermo- épidermique. Cinq photos par condition ont été analysées. La quantification finale (figure 8) représente la moyenne de 2 expériences indépendantes (n=12).
8.1.4. Analyse statistique
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du test t de Student pour échantillons indépendants avec un sens de rejet bilatéral. Les p<0,05 ont été considérés comme significatifs, les p<0,01 comme très significatifs et les p<0,005 comme hautement significatifs.
8.2. Protocole d’étude :
8.2.1 . Pour l’étude sur le collagène III :
Les biopsies de peau ont été traitées, ou non, en dupliquât, avec l’extrait selon l’invention « ZF sérum » dilué à 0,3% dans du PBS, deux fois par jour, pendant 72 heures. Le PBS seul a été appliqué comme condition contrôle (témoin négatif).
Pour chaque expérience et chaque condition testées, 20 pL de solutions ont été appliqués sur les biopsies.
8.2.2. Pour l’étude sur le collagène I :
Les biopsies de peau ont été traitées, en dupliquât, avec le cryoextrait de fleurs de roses, notamment décrit dans la demande de brevet EP0425391 et ses exemples, (« benchmark » témoin positif), ou une solution hydro-glycérine (eau/ glycérol) (« placébo » témoin négatif) à 3%, ou avec l’extrait selon l’invention « sérum ZF » à 0,3% dilué dans du PBS, deux fois par jour, pendant 48 heures. Le PBS seul a été appliqué comme condition contrôle (second témoin négatif). Les teneurs totales en matières sèches (matières actives) sont équivalentes pour la condition « ZF fraction » 0,3% (invention) et pour la condition « cryoextrait » 3% (contrôle positif). Application d’un stress pro-sénescent : un milieu de culture type « environnement sénescent » a été préparé en mélangeant le milieu de culture ‘frais’ pour biopsies de peau avec milieu de culture de fibroblastes sénescents (dans un rapport 50/50). Le milieu de culture type « environnement jeune », utilisé comme contrôle, a été préparé en mélangeant un milieu de culture ‘frais’ pour biopsies de peau avec un milieu de culture de fibroblastes non sénescents (dans un rapport 50/50).
Pour chaque expérience et chaque condition testée, 20 pL de solutions ont été appliqués sur les biopsies.
8.2.3. Pour l’étude sur la fibrilline-1 :
Les biopsies de peau ont été traitées, en dupliquât, avec le cryoextrait de fleurs de roses tel que décrit au paragraphe ci-dessus) (« benchmark » témoin positif) ou le placebo (solution hydro-glycérine, témoin négatif) à 3%, ou avec l’extrait selon l’invention « sérum ZF » à 0,3% dilué dans du PBS, deux fois par jour, pendant 48 heures. Le PBS seul a été appliqué comme condition contrôle (second témoin négatif).
Application d’un stress UV : les biopsies ont été soumises à un stress avec 5 J/cm2 d'UVA (four de type BLX-E365, Fisher Bioblock Scientific) suivi de 200 mJ/cm2 d'UVB (four de type BLX-E312, Fisher Bioblock Scientific) après les 24 premières heures de traitement.
Pour chaque expérience et chaque condition testées, 20 pL de solutions ont été appliqués sur les biopsies.
8.3. Résultats
8.3.1. Résultats sur l’expression du collagène III
Les résultats de la figure 6 montrent que, dans la condition traitée par le sérum ZF Rose de Granville® (selon l’invention), on observe dans les biopsies une augmentation significative la quantité de collagène III (+59%) en comparaison de la condition contrôle (PBS seul).
8.3.2. Résultats sur l’expression du collagène I
Les résultats de la figure 7 montrent que les biopsies de peau cultivées dans un « environnement sénescent » présentent une diminution significative (-27%) la quantité de collagène I par rapport aux biopsies cultivées dans un « environnement jeune ». L'application du sérum ZF Rose de Granville® (selon l’invention) pendant 48 heures est associée à une augmentation hautement significative la quantité de collagène I (+21%, par rapport au contrôle non traité) dans les biopsies de peau cultivées dans un environnement sénescent. Ce résultat est comparable au contrôle positif (cryoextrait de fleurs de roses - « benchmark »).
8.3.3. Résultats sur la longueur des fibres de fibriline-1
Les résultats de la figure 8 montrent que le stress UV induit une diminution de la longueur des fibres de fibriline-1 (-17%). Dans des conditions de stress UV, l'application du sérum ZF Rose de Granville® (selon l’invention) pendant 48 heures est associée à une amélioration très significative de la structure de la fibrilline-1 . Dans ces conditions, l'application du cryoextrait de fleurs de roses (« benchmark ») n'a pas montré d'activité.
8.4. Conclusions
Des tests ex vivo ont été réalisés sur des biopsies de peau humaine normale traitées avec le sérum ZF Rose de Granville® (selon l’invention). Une comparaison avec le produit de référence et un placebo a été effectuée pour évaluer la quantité de collagène I et la longueur de fibres de fibrilline-1 en condition de stress UV. Tout d'abord, une augmentation de la quantité de collagène Ili a été observée en association avec l'application du sérum ZF Rose de Granville® (selon l’invention).
Ensuite, la Demanderesse a pu montrer, dans un modèle sénescent, une restauration de l'expression du collagène I après l'application du sérum ZF Rose de Granville® (selon l’invention). Le même effet a été observé après application du cryoextrait de fleurs de roses (comparatif).
Enfin, l'application du sérum ZF Rose de Granville® (selon l’invention) a permis une amélioration de la fibre de fibrilline-1 dans une peau soumise à des irradiations UVÀ et UVB. Dans ces conditions, aucun effet du cryoextrait de fleurs de roses (comparatif) n'a été observé.
Ensemble, ces résultats montrent que l’extrait de pétales de roses comprenant une fraction bioactive isolée selon l’invention, est capable de promouvoir l’expression des protéines de la matrice extracellulaire. Il présente donc un intérêt cosmétique pour favoriser et/ou améliorer la fermeté cutanée et/ou diminuer la perte de fermeté, notamment liée au vieillissement.
Effet de la fraction bioactive isolée de
Figure imgf000041_0001
de roses sur la microinflammation L’effet de la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention sur la microinflammation cutanée a été testé.
En plus de son rôle dans la fonction barrière cutanée, HMGB1 joue un rôle actif dans les phénomènes de micro-inflammation cutanée. Dans des conditions normales, c’est-à-dire (sans condition de stress), HMGB1 est localisée dans le noyau cellulaire, toutefois en réponse à un stimuli, et particulièrement en réponse à des signaux pro-inflammatoires, HMGB1 est relocalisée de façon active vers le cytoplasme et/ou l’espace extracellulaire.
9.1 Capacité de la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention à produire un effet « oxytocine-like »
L’oxytocine (OXT) est typiquement une hormone de réponse au stress. Dans des conditions de stress, l’oxytocine permet de moduler les activités physiologiques et biologiques des cellules, notamment en réduisant le relargage d’HMGBI . Ainsi, en réduisant le stress cellulaire, l’oxytocine contribue au bien-être de la peau.
La capacité de la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention à produire un effet « oxytocine-like » a ainsi été évaluée en étudiant notamment sa capacité à limiter la sécrétion de HMGB1 dans des conditions de stress cellulaire par le LPS.
Protocole :
- Cultures cellulaires de kératinocytes humains, en milieu de culture pendant 30h.
Conditions : les kératinocytes ont été traités pendant 24h par les différents extraits ou solutions contrôles comme indiqué ci-après. Puis, les conditions (2) à (6) ont été traitées par le facteur de stress LPS à la concentration de 0.5mg/mL pendant 6 heures.
(1 ) « Contrôle » PBS dilué, non stressé au LPS
(2) « Contrôle » : PBS dilué,
(3) « Placébo » à 1%,
(4) « Cryoextrait » à 1%,
(5) « ZF sérum » à 0.1%,
(6) « Oxytocine » (Sigma) à 200pM (contrôle positif).
- Méthode : analyse par western-blot des quantités de protéine HMGB1 dans le surnageant et dans le lysat cellulaire selon le protocole détaillé à l’Exemple 3.5.
Les résultats de la figure 9A et de la figure 9B montrent que dans des conditions contrôles (PBS), le traitement par le facteur de stress LPS induit la sécrétion de la totalité (100%) du HMGB1 vers l’extérieur de la cellule. En condition de stress LPS, le traitement par la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention induit une réduction (- 31%) de la sécrétion de HMGB1 vers le surnageant par rapport au contrôle PBS. Cette réduction est supérieure à ce qui est obtenu avec le contrôle positif oxytocine (- 22%) ou avec le cryoextrait (- 19%). Le placébo n’a pas d’effet sur la sécrétion du HMGB1.
La bande observée sur la figure 9À à 49KDa n’est pas spécifique et n’a pas été prise en compte pour l’analyse des résultats.
La fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention produit donc un effet « oxytocine- like ».
9.2 Capacité de la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention à réguler l’expression de COX2
La phase initiale de sécrétion de HMGB1 requiert un signal pro-inflammatoire tel que le liposaccharide (LPS), IL-1 (interleukine 1 ) ou TNF (tumor necrosis factor). HMGB1 peut alors interagir avec les Toll- like receptors TLRs pour activer certaines voies de signalisation aboutissant à la production de cytokines et chimiokines telles que TNF-a. Dans des conditions spécifiques d’inflammation, HMGB1 induit l’expression de la protéine COX-2 notamment via la voie de signalisation TNF-a.
La capacité de la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention à moduler l’expression de COX-2 suite à un stress pro-inflammatoire (micro-inflammation) induit par le LPS a donc été évaluée.
Protocole :
- Peau humaine (biopsies selon l’ Exemple 3.2) provenant de deux donneurs indépendants.
- Conditions : les biopsies ont été traitées deux fois par jour pendant 48h par les différents extraits ou solutions contrôles comme indiqué ci-après. Additionnellement, les conditions
(2) à (5) ont été traitées par le facteur de stress LPS à la concentration de 0.5mg/mL pendant les 6 dernières heures du traitement.
(1 ) « Contrôle » PBS dilué, non stressé au LPS
(2) « Contrôle » : PBS dilué,
(3) « ZF sérum » à 0.3%,
(4) « Placebo » à 3%,
(5) « Cryoextrait » à 3%
- Méthode d’analyse : évaluation de l’expression de COX 2 par immunofluorescence, et quantification des résultats avec Velocity selon le protocole détaillé à l’Exemple 1.8. Les résultats de la figure 10 montrent que dans des conditions de stress au LPS l’expression de COX-2 dans la condition contrôle PBS est augmentée de façon significative (+ 55%) par rapport au contrôle PBS non stressé. Dans des conditions de stress au LPS, le traitement par la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention permet de retrouver un niveau d’expression de COX-2 comparable à celui observé en l’absence de stress (PBS non stressé au LPS). Cet effet n’est pas observé lors du traitement avec le cryoextrait ou avec la solution placébo.
La fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention permet donc de réguler négativement l’expression de COX-2.
Ainsi, tant par ses effets sur la rétention de HMGB1 dans les cellules, que par ses effets sur l’expression de COX-2, la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention exerce des effets bénéfiques sur la micro-inflammation cutanée.
9.3. Capacité de la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention à moduler l’expression de la transglutaminase- 1 (TGM1)
De façon similaire, la capacité de l’extrait de pétales de rose sous forme de fraction bioactive isolée selon l’invention tel que préparé à l’exemple 1.1 , à rétablir l’expression de TGM1 après un stress inflammatoire induit par le LPS (Lipopolysaccharide, Sigma) a été évaluée. TGM-1 est un gène codant pour la transglutaminase-1 , protéine essentielle pour la kératinisation de la couche cornée de la peau.
Protocole :
- Peau humaine (biopsies selon l’ Exemple 3.2) provenant de deux donneurs indépendants.
- Conditions : les biopsies ont été traitées deux fois par jour pendant 48h par les différents extraits ou solutions contrôles comme indiqué ci-après. Additionnellement, les conditions (2) à (5) ont été traitées par le facteur de stress LPS à la concentration de 0.5mg/mL pendant les 6 dernières heures du traitement.
(1 ) « Contrôle » PBS dilué, non stressé au LPS
(2) « Contrôle » : PBS dilué,
(3) « ZF sérum » à 0.3%,
(4) « Placebo » à 3%,
(5) « Cryoextrait » à 3%
- Méthode d’analyse : évaluation de l’expression de TGM1 par immunofluorescence, et quantification des résultats avec Velocity selon le protocole détaillé à l’Exemple 3.6. Les résultats de la figure 11 montrent que dans des conditions de stress au LPS l’expression protéique de TGM1 dans la condition contrôle PBS est réduite de façon significative (- 49%) par rapport au contrôle PBS non stressé. De façon intéressante, dans des conditions de stress au LPS, un traitement par la fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention permet une augmentation significative (+ 34%) du niveau d’expression de TGM1 par rapport au contrôle PBS. On constate une augmentation plus importante de l’expression de TGM-1 avec la solution placébo et le cryoextrait de pétales de roses (comparatif). On notera que l’augmentation observée avec le placébo était attendue, en effet ce dernier contient de l’acide citrique, un composé notamment utilisé dans les formulations hydratantes. Il n’en reste pas moins que l’effet observé avec l’extrait selon l’invention reste surprenant compte tenu de la concentration à laquelle il est testé (10x moins concentré que le cryoextrait).
Ainsi, de par ses effets sur l’expression de la filaggrine et de TGM-1 , l’extrait de pétales de roses sous forme de fraction bioactive selon l’invention possède, également en conditions de stress, un effet bénéfique sur la fonction barrière cutanée.
Exemple 10 : Formulations cosmétiques
10. 1 Composition sous la forme d’un el aqueux pour le visage [Table 4]
Figure imgf000045_0001
* tel que décrit dans l’Exemple1.1
La fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention et les conservateurs sont mélangés et homogénéisés à température ambiante sous agitation. Les sucres sont ajoutés sous agitation, puis le carbomer, puis l’eau et l’EDTA sous agitation. Le gel aqueux est ensuite neutralisé avec l’ajout d’hydroxyde de sodium sous agitation jusqu’à l’obtention d’un gel homogène. Appliqué sur la peau du visage, ce gel aqueux confère un effet frais, et apporte souplesse et fermeté à la peau.
10.2 Composition sous la forme d’un gel-sérum micronutritif pour le visa e
[Table 5]
Figure imgf000046_0001
* tels que décrits dans l’Exemple 1.1 ou 1.2
Les ingrédients de la phase aqueuse (l’eau, les glycols et le carbomer) sont mélangés à 80° C sous agitation. On ajoute ensuite les conservateurs, puis les gélifiants à 80° C sous agitation puis la température est abaissée à 75° C. Puis les tensioactifs sont émulsionnés dans la phase aqueuse sous agitation. Les charges et nacres, préalablement empâtées et homogénéisées, sont ajoutées à 40° C. Sont ensuite ajoutés à 40° C le cryoextrait, la fraction bioactive isolée de pétales de roses selon l’invention et les autres extraits, sous agitation jusqu’à 30° C.
Après application sur le visage, la peau apparaît nourrie, plus ferme, plus lisse (diminution de l’apparence des rides et ridules), hydratée et de couleur plus homogène.

Claims

46 REVENDICATIONS
1. Extrait de roses sous la forme d’une fraction bioactive isolée, obtenue à partir de roses fraîches de la variété Evanrat, caractérisé en ce qu’il est obtenu par un procédé comprenant les étapes : a) nettoyage du matériel végétal, macération, pressage puis séparation mécanique du matériel végétal pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction A) ; b) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques puis séparation mécanique de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant A et une Fraction Membranaire (fraction B) ; c) ajustement du niveau de pH dans le surnageant A jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6 à 7, puis séparation mécanique du surnageant A pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ; d)ajustement du niveau de pH dans le surnageant B jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5 puis séparation mécanique du surnageant B pour donner une « Fraction sérique bioactive » et une fraction D (précipité) ; et e) Optionnellement, mélange de la « fraction sérique bioactive » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant.
2. Extrait de roses sous la forme d’une fraction bioactive isolée susceptible d’être obtenue par le procédé selon la revendication 1 , dans lequel ledit extrait comprend au moins 500 pg/pL d’au moins un sucre monosaccharide choisi parmi le fructose, glucose et le saccharose, et/ou au moins 500 mg/Kg d’au moins un minéral choisi parmi le potassium, le calcium et le sodium.
3. Extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ledit extrait est obtenu à partir de pétales frais de roses de la variété Evanrat.
4. Procédé de préparation d’un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat ou variété ‘rose Jardin de Granville®’ tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 3 comprenant les étapes de : a) nettoyage du matériel végétal, macération, pressage puis séparation mécanique du matériel végétal pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction A) ; b) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques puis séparation mécanique de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant A et une Fraction Membranaire (fraction B) ; 47 c) ajustement du niveau de pH dans le surnageant À jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6 à 7, puis séparation mécanique du surnageant À pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ; d) ajustement du niveau de pH dans le surnageant B jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5 puis séparation mécanique du surnageant B pour donner une « Fraction sérique bioactive » et une fraction D (précipité) ; et e) Optionnellement, mélange de la « fraction sérique bioactive » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant.
5. Composition pour application topique sur la peau et/ou les lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou, comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins une quantité efficace d’au moins un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 4.
6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que l’extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses fraîches de la variété Evanrat est présent dans la composition en une teneur allant de 0.001 à 50%, en particulier de 0,01 à 20%, de préférence de 0,01 à 10% et de préférence encore de 0,011 à 5% en poids de matière première par rapport au poids total de ladite composition.
7. Procédé de traitement cosmétique de la peau saine et/ou des lèvres saines, destiné à favoriser et/ou améliorer la nutrition cutanée ; favoriser et/ou améliorer la fermeté cutanée favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer le processus rythmique des cellules cutanées, et/ou prévenir et/ou ralentir le vieillissement de la peau, comprenant l’application sur la peau saine et/ou les lèvres saines, en particulier la peau du visage et/ou du cou, d’une composition cosmétique telle que définie dans l’une quelconque des revendications 5 ou 6.
8. Utilisation d’au moins une quantité efficace d’au moins un extrait sous la forme d’une fraction bioactive isolée roses fraîches de la variété Evanrat tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 4 comme agent pour favoriser et/ou améliorer la nutrition cutanée ; favoriser et/ou améliorer la fermeté cutanée, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer le processus rythmique des cellules cutanées, prévenir et/ou ralentir le vieillissement de la peau et/ou des lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou.
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