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TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue Verwendung eines Pflanzenextraktes,
der aus wenigstens einer zur Gattung Citrus gehörenden
Pflanze oder aus einer Hybride aus der Kreuzung von Pflanzenspezies, von
denen wenigstens eine zur Gattung Citrus gehört, gewonnen
ist, als kosmetischer Wirkstoff insbesondere zum Erzeugen einer
Anti-Aging-Wirkung im Bereich der Haut.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere einen Extrakt aus einer Pflanze
der Gattung x Citrofortunella, beispielsweise einen Extrakt von
Calamondin (x Citrofortunella microcarpa), als kosmetischer Wirkstoff,
sowie den Extrakt enthaltende kosmetische Anti-Aging-Zusammensetzungen
und die kosmetischen Verfahren, welche die Zusammensetzungen verwenden,
um die Aktivität der mitochondrialen Aconitase zu stimulieren
und eine Anti-Aging-Wirkung im Bereich der Haut zu erzielen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Alterung ist ein multifaktorielles Phänomen. Es gibt mehrere
Theorien der Alterung, hierzu gehört die Theorie der freien
Radikale, welche auf der chemischen Art und dem ubiquitären
Vorkommen dieser Radikale basiert (Harman D., J. Gerontol.,
1956; 11, 298–300).
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Diese
freien Radikale, die auch als reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bezeichnet
werden, können exogener Herkunft sein oder durch unterschiedliche
Zellprozesse, insbesondere bei der mitochondrialen Atmung erzeugt
werden (Cadenas E. et al., Free Radic. Biol. Med., 2000;
29, 222–230).
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Während
des Atmens wird eine geringe, aber signifikante Menge des durch
die Atmungskette verbrauchten gesamten Sauerstoffs in Superoxidradikal
O2 2– überführt,
das zur Bildung weiterer noch reaktiverer Sauerstoffspezies, wie
Wasserstoffperoxid H2O2,
Hydroxyl-Radikale und Peroxynitrit führen kann (vgl. Cadenas
et al., supra).
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Unter
den Bedingungen eines oxidativen Stresses führt die Bildung
dieser reaktiven Spezies zur oxidativen Schädigung der
Proteine, der DNA und der Lipide sowie zu Änderungen bei
der Expression der mitochondrialen Proteine und trägt zum
Prozeß der Hautalterung bei (Bulteau et al., Exp
Gerontol, 2006, 41; 653–657).
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Im
Laufe der Alterung wird eine geringere Effizienz des Systems zur
Instandhaltung der zellulären Makromoleküle sowie
eine konstante Erhöhung der ROS-Produktion innerhalb der
Mitochondrien beobachtet (Humphries et al., Free Radic Res,
2006; 40, 1239–1243).
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Nun
spielt aber das Mitochondrium eine wichtige Rolle bei zahlreichen
Zellfunktionen, wie der Erzeugung des durch die Atmungskette aufgebauten
Protonengradienten und der ATP-Produktion mittels des Krebs-Zyklus
(Liu et al., J. Neurochem., 2002; 80, 780–787).
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Die
Häufung der oxidativen Schäden und Strukturanomalien
führt bei dem Mitochondrium zum fortschreitenden Verlust
seiner Fähigkeit, das für das Funktionieren und
für die Unversehrtheit der Zelle notwendige ATP zu produzieren
(FRENZEL et al., 1984).
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Die
Aconitase ist ein essentielles mitochondriales Enzym des Krebs-Zyklus,
das Citrat in Isocitrat umwandelt. Sie spielt auch eine Rolle bei
der Erhaltung der mitochondrialen DNA. Mit Hilfe der Aconitase sind
die Stabilität und die erbliche Übertragung dieser
DNA eng mit dem Stoffwechselzustand der Zelle verbunden (Chen
et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2007; 104, 13738–13743).
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Die
Aktivität der Aconitase hängt von der Unversehrtheit
ihres Eisen-Schwefel-Zentrums [4Fe-4S]2+ (Beiner,
et al., Faseb J, 1993; 7, 1442–1449) ab. Der Angriff
ihres Eisen-Schwefel-Zentrums [4Fe-4S]2+ durch Oxidantien
führt zur Bildung eines Eisen-Schwefel-Zentrums [3Fe-4S]+, das die Aconitase inaktiviert.
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Der
Aktivitätsverlust der mitochondrialen Aconitase ist ein
intrazellulärer Indikator für oxidative Schäden
und Zellalterung. Zahlreiche degenerative Störungen sind
auch mit dem Anstieg der Mengen von Prooxidantien sowie mit dem
Abfall der Aktivität der Aconitase im Mitochondrium verknüpft
(Bulteau et al., Biochemistry, 2003 42, 14846–14855).
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Die
Inaktivierung der Aconitase führt insbesondere zu einer Änderung
der NADH/NAD+-Verhältnisse. Denn die Produktion von NADH
durch α-Ketoglutarat-Dehydrogenase und Isocitrat-Dehydrogenase
wird im Krebs-Zyklus aufgrund des Rückgangs der Aktivität
der Aconitase reduziert (vgl. Humphries et al., supra; Nulton-Persson
et al., J Biol Chem, 2001, 276, 23357–23361).
Unter diesen Bedingungen einer Anhäufung von NAD+ beobachtet
man eine Erhöhung der ROS aufgrund der Autooxidation der
reduzierten Stoffwechselprodukte. Eine solche Inaktivierung der
mitochondrialen Aconitase kann auch eine Abfolge von oxidativen
Reaktionen anstoßen, die zur Häufung geschädigter
Proteine beitragen (vgl. Humphries et al., 2006 supra).
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Es
ist demnach im Laufe der Alterung essentiell, einen ausreichenden
Aktivitätsgrad für die mitochondriale Aconitase
in den Hautzellen aufrechtzuerhalten, um der Anhäufung
dieser Zellschäden vorzubeugen und um die Reparaturprozesse
sowie die Reaktivierung der durch diese ROS geschädigten
mitochondrialen Aconitase zu begünstigen.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nachgewiesen, daß die
Aktivität der mitochondrialen Aconitase in von 70-jährigen
Spendern stammenden kultivierten humanen dermalen Fibroblasten im
Vergleich zu denjenigen von 20-jährigen Spendern, ohne
eine Änderung der Expression des Proteins mit dem Alter,
um etwa 85% abnimmt. Von dieser Feststellung ausgehend haben sie
gezeigt, daß es möglich ist, die mitochondriale
Aconitase vollkommen zu schützen und ihre Aktivität
in diesen kultivierten älteren Fibroblasten durch eine
Behandlung der Fibroblasten mit Hilfe eines Pflanzenextrakts, der
aus wenigstens einer zur Gattung Citrus gehörenden Pflanze
oder aus einer Hybride aus der Kreuzung von Pflanzenspezies, von
denen wenigstens eine zur Gattung Citrus gehört, gewonnen
ist, und insbesondere eines Extraktes von Calamondin wiederherzustellen,
während diese gleiche Behandlung auf die Fibroblasten eines
jungen Spenders angewandt die Aktivität der mitochondrialen
Aconitase nicht verändert.
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Eine
solche Wirkung zur Stimulation der Aktivität der mitochondrialen
Aconitase ermöglicht diesem Enzym, seine zentrale Rolle
im Krebs-Zyklus sowie bei der Erhaltung der mitochondrialen DNA
beizubehalten und so die Funktion, insbesondere Stoffwechselfunktion,
der Hautzellen zu bewahren.
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Aus
der Wiederherstellung der Aktivität der mitochondrialen
Aconitase der Zellen der Haut älterer Menschen resultiert
eine Wirkung zur Verlangsamung der Zellalterung im Bereich der Haut,
die durch eine kosmetische altershemmende oder Anti-Aging-Wirkung
zum Ausdruck kommt.
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Darüber
hinaus haben die Erfinder auch nachgewiesen, daß der obenerwähnte
Extrakt ermöglicht, die Menge oxidierter intrazellulärer
Proteine, welche mit dem Alter der Spender zunimmt, signifikant
zu verringern, so daß dieser Anstieg durch die Behandlung
dieser Zellen mit einem Pflanzenextrakt, wie er zuvor definiert
ist, vollständig umgekehrt wird.
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Diese
antioxidative Aktivität des erfindungsgemäßen
Extraktes, dessen Verbindung mit der Aktivität der mitochondrialen
Aconitase nicht bewiesen ist, verleiht dem erfindungsgemäßen
Extrakt zusätzliche besonders vorteilhafte Eigenschaften
im Bereich der Kosmetik, als kosmetischer Wirkstoff zur Verbesserung
oder Wiederherstellung des Strahlens des Hautteints.
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Die
oxidierten Proteine haben nämlich andere optische Eigenschaften
als die normalen Proteine. Die Technik des zirkularen Dichroismus
hat gezeigt, daß das Licht, das ein oxidiertes Protein
zurücksendet, ein anderes ist als das, welches von einem
normalen Protein zurückgesandt wird. (Friguet et
al, FEBS Lett, 1997, 405(1): 21–5). Aus diesem
Grund beeinträchtigt die Anhäufung oxidierter
Proteine die Haut und insbesondere den Teint der Haut, und zwar
dadurch, daß eine Störung des Zellzyklus im Bereich
der Haut bewirkt wird, die zu einer Änderung ihrer genetisch
bestimmten natürlichen Farbe führt, sowie die
visuelle Wahrnehmung eines Betrachters dieser Haut.
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(Bis
heute unveröffentlichte) Arbeiten wurden von der Anmelderin
durchgeführt, um mittels Glanzmessung (Gerät SAMBA
von der Gesellschaft BOSSA NOVA TECHNOLOGY) an einem Modell rekonstruierter Haut
die Reflexion des Lichts an der Haut sowie den Einfluß der
Oxidation auf die Lichtreflexion zu untersuchen. Auf diese Weise
wurde gezeigt, daß unbehandelte Häute eine stärkere
Reflexion des Gesamtlichts als oxidierte haben (Messen mittels Glanzmessung).
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Die
Gattung x Citrofortunella vereint Pflanzenspezies, die aus der Kreuzung
von Pflanzen der Gattung Citrus mit denjenigen der Gattung Fortunella
hervorgehen.
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Unter
den Pflanzenspezies, die zur Gattung Citrofortunella gehören,
können in nicht einschränkender Weise sowie beispielhaft
x Citrofortunella floridana, x Citrofortunella microcarpa oder aber
x Citrofortunella mitis genannt werden.
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Unter
diesen Pflanzenspezies wird vorteilhafterweise Calamondin (x Citrofortunella
microcarpa) gewählt, die in gleicher Weise auch als Kalamansi
oder auch als Citrus madurensis bezeichnet wird.
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Die
japanische Patentanmeldung
JP
2003-199527 offenbart ein Nahrungsmittel, das die Erhöhung
der Glykämie oder des Blutdrucks hemmt, wobei das Nahrungsmittel
dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Extrakt aus der
ganzen Frucht einer Hybride aus einer Zitruspflanze und einer Kumquat
der Gattung Fortunella enthält.
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Ebenso
offenbart die japanische Patentanmeldung
JP2005029491 ein Verfahren zur
Extraktion des Limonens durch fraktionierte Destillation der Schale
von Citrofortunella mitis.
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Bisher
ist die bemerkenswerte Aktivität eines Pflanzenextraktes,
der aus wenigstens einer zu Gattung Citrus gehörenden Pflanze
oder aus einer Hybride aus der Kreuzung von Pflanzenspezies, von
denen wenigstens eine zur Gattung Citrus, beispielsweise zur Gattung
x Citrofortunella gehört, gewonnen ist, und insbesondere
eines Extraktes von Calamondin (x Citrofortunella microcarpa) hinsichtlich
der oxidierten Proteine der Zellen der Haut und der mitochondrialen
Aconitase nicht offenbart worden.
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Der
Calamondin-Extrakt bildet somit einen neuen Wirkstoff auf dem Gebiet
der Kosmetik, und insbesondere als kosmetischer Wirkstoff in einer
kosmetischen Zusammensetzung, um den Folgen der Hautalterung vorzubeugen,
sie zu verzögern oder zu mildern, insbesondere nachdem
die Haut einem oxidativen Streß ausgesetzt war.
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ZIELE DER ERFINDUNG
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Das
Hauptziel der Erfindung liegt insbesondere in der Bereitstellung
einer neuen Verwendung eines Pflanzenextraktes, der aus wenigstens
einer zu Gattung Citrus gehörenden Pflanze oder aus einer
Hybride aus der Kreuzung von Pflanzenspezies, von denen wenigstens
eine zur Gattung Citrus gehört, gewonnen ist, als kosmetisch
akzeptabler Wirkstoff, insbesondere zum Erzeugen einer Anti-Aging-Wirkung
im Bereich der Haut und/oder für die Pflege geschädigter
Haut, insbesondere durch UV-Strahlung geschädigter Haut, und/oder
um das Strahlen des Teints der Haut zu verbessern oder wiederherzustellen.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere eine neue Verwendung eines Extraktes
aus einer zur Gattung x Citrofortunella gehörenden Pflanze,
und insbesondere eines Extraktes von Calamondin (Citrofortunella
microcarpa), als neuer kosmetischer Wirkstoff, dessen Verwendung
als Wirkstoff in einer kosmetischen Zusammensetzung sowie ein die
Zusammensetzung verwendendes kosmetisches Pflegeverfahren.
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Ein
weiteres Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist eine neue Verwendung
eines Extraktes von Calamondin (x Citrofortunella microcarpa) als
Wirkstoff in einer kosmetischen Zusammensetzung, die wenigstens einen
kosmetisch akzeptablen Hilfsstoff enthält.
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Diese
neue Verwendung hat insbesondere zum Ziel, dem Auftreten von Anzeichen
der Hautalterung vorzubeugen oder dieses zu verzögern oder
die Anzeichen zu behandeln, die insbesondere mit den durch einen Überschuß an
ROS verursachten Schäden verbunden sind, oder eine Anti-Aging-Wirkung
im Bereich der Haut zu erzeugen. Diese neue Verwendung zielt ferner
darauf ab, das Strahlen des Teints der Haut zu verbessern oder wiederherzustellen.
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Ein
Hauptziel der Erfindung ist auch ein kosmetisches Verfahren, das
den genannten Extrakt in einer kosmetischen Zusammensetzung verwendet,
um – durch Auftragen der den erfindungsgemäßen
Extrakt enthaltenden Zusammensetzung auf wenigstens einen betroffenen
Bereich des Körpers oder des Gesichts – den Folgen
der Hautalterung vorzubeugen oder sie zu verzögern und/oder
das Strahlen des Teints der Haut zu verbessern oder wiederherzustellen.
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Ein
weiteres Hauptziel der Erfindung ist es, die Verwendung eines Extraktes
von Calamondin als Wirkstoff in einer kosmetischen Anti-Aging-Zusammensetzung
und/oder als Wirkstoff in einer Zusammensetzung zur Verbesserung
oder Wiederherstellung des Strahlens des Hautteints vorzuschlagen.
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Ziel
der Erfindung ist auch die Verwendung des Extraktes als Wirkstoff
in kosmetischen Zusammensetzungen sowie die die Zusammensetzungen
verwendenden kosmetischen Pflegeverfahren, um dem Auftreten von
Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder dieses zu verzögern
oder um deren Folgen zu mildern und/oder um das Strahlen des Hautteints
zu verbessern oder wiederherzustellen.
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Ein
weiteres Hauptziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines kosmetischen
Pflegeverfahrens, das den Extrakt verwendet, insbesondere um die
nachfolgend genannte kosmetische Pflege durchzuführen.
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BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Ein
erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft somit eine
neue Verwendung eines Pflanzenextraktes, der aus wenigstens einer
zur Gattung Citrus gehörenden Pflanze oder aus einer Hybride
aus der Kreuzung von Pflanzenspezies, von denen wenigstens eine
zur Gattung Citrus gehört, gewonnen ist, als kosmetisch
akzeptabler Wirkstoff, insbesondere zum Erzeugen einer Anti-Aging-Wirkung
im Bereich der Haut, und/oder für die Pflege geschädigter
Haut, insbesondere durch UV-Strahlung geschädigter Haut,
und/oder um das Strahlen des Teints der Haut zu verbessern oder
wiederherzustellen.
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Unter
den Hybriden werden insbesondere diejenigen bevorzugt, die zur Gattung
x Citrofortunella gehören, welche aus der Kreuzung von
Pflanzenspezies der Gattungen Citrus mit Pflanzenspezies der Gattung Fortunella
hervorgeht, und insbesondere Calamondin (x Citrofortunella microcarpa).
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft auch eine
neue Verwendung eines Extraktes von Calamondin als kosmetischer
Wirkstoff, insbesondere zum Erzeugen einer Anti-Aging-Wirkung im
Bereich der Haut und/oder zur Verbesserung oder Wiederherstellung
des Strahlens des Hautteints.
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Das
für die Herstellung des Extraktes verwendete Pflanzenmaterial
kann die vollständige Pflanze oder ein Teil der Pflanze,
wie die Wurzel, das Rhizom oder ein oberirdischer Teil, insbesondere
der Stengel, die Blätter, die Blüten, die Samen,
die Früchte oder die Blütenknospen sein.
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Vorteilhafterweise
kann es von der ganzen Frucht oder von einem Teil der Frucht von
einer der obenerwähnten Pflanzen gebildet sein.
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Ein
bevorzugter Extrakt wird aus der Frucht der Calamondin gewonnen.
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Vor
dem Extraktionsschritt selbst kann das Pflanzenmaterial getrocknet
und/oder gemahlen worden sein oder aber in frisch geerntetem Zustand
vorliegen.
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Der
Extrakt kann durch unterschiedliche, seitens des Fachmannes bekannte
Extraktionsverfahren hergestellt werden.
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Die
Extraktion kann ohne Lösungsmittel, beispielsweise durch
Pressen, insbesondere einer ganzen Frucht oder eines Teils einer
Frucht vollzogen werden.
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Die
Extraktion wird jedoch vorteilhafterweise dadurch vollzogen, daß das
ausgewählte Pflanzenmaterial mit einem polaren Lösungsmittel
oder einem Gemisch polarer Lösungsmittel in Kontakt gebracht
wird, insbesondere durch Einweichen, Mazeration oder Dekoktion des
Pflanzenmaterials in dem geeigneten Lösungsmittel oder
Lösungsmittelgemisch.
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Bei
einer besonders vorteilhaften Variante wird der Extrakt aus einem
Saft von Früchten einer dieser Pflanzen gewonnen, insbesondere
durch Pressen, durch Inkontaktbringen mit einem polaren Lösungsmittel oder
einem Gemisch polarer Lösungsmittel, vorzugsweise einem
wäßrigen Medium.
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Das
für die Extraktion verwendete polare Lösungsmittel
oder Gemisch polarer Lösungsmittel ist vorteilhafterweise
ausgewählt aus Wasser, einem C1-C4-Alkohol, insbesondere ausgewählt
aus Ethanol oder Butanol, einem Glykol, vorzugsweise ausgewählt
aus Glycerin, Butylenglycol und Propylenglycol, Polyglycerin-3 sowie
deren Mischung(en).
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Die
bevorzugten Mischungen sind Mischungen aus wenigstens einem Alkohol
und Wasser oder aus wenigstens einem Glykol und Wasser, mit wenigstens
10% v/v Alkohol oder Glykol, wobei der Rest von Wasser gebildet
ist.
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Bei
einer weiteren besonderen Variante der Erfindung umfaßt
das Lösungsmittelgemisch ein Gemisch aus Wasser und Ethanol
in einem Verhältnis von 50:50 v/v, oder ein Gemisch aus
Wasser und Butylenglycol in einem Verhältnis von 50:50
v/v.
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Bei
einer bevorzugten Ausführung wird die Extraktion vorteilhafterweise
in wäßrigem oder hydroglykolischem Medium durchgeführt.
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Die
Extraktion kann auch optional einen zusätzlichen Schritt
umfassen, der in einer Behandlung des Pflanzenmaterials oder des
Pflanzenextraktes besteht, mit dem Ziel, es bzw. ihn teilweise oder
vollständig zu entfärben, oder zu reinigen, beispielsweise
durch eine Behandlung des Pflanzenmaterials oder des Extraktes mit
einer Lösung aus einem Lösungsmittel oder einem
Gemisch unpolarer Lösungsmittel oder durch eine Behandlung,
die in einem in Kontakt bringen des Extraktes mit Aktivkohlepartikeln
besteht, oder aber durch eine Behandlung mittels CO2 in
superkritischem Zustand.
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Die
Extraktion kann durch einen Schritt zum teilweisen oder vollständigen
Entfernen der Extraktionslösungsmittel vervollständigt
werden. Im ersten Fall wird im allgemeinen der Extrakt bis zum Erhalt
eines wäßrigen Konzentrats ohne signifikante Mengen
eines organischen Lösungsmittels konzentriert, im zweiten
Fall erhält man einen trockenen Rückstand. Alternativ
hierzu kann das Produkt des Extraktionsschrittes in Form eines Pulvers
lyophilisiert oder atomisiert werden.
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Das
Pulver kann so wie es ist in einer erfindungsgemäßen
kosmetischen Zusammensetzung verwendet oder in einem polaren Lösungsmittel
oder einem Gemisch polarer Lösungsmittel dispergiert oder
gelöst oder aber an einem festen Träger adsorbiert
werden.
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Bei
einer Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung wird
der vorgenannte Wirkstoff, in eine kosmetische Zusammensetzung eingebettet,
topisch verabreicht, wobei der Wirkstoff in einer wirkungsvollen
Menge vorhanden ist, um den Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen
oder diese zu verzögern oder deren Folgen zu mildern, und/oder
zur Pflege geschädigter Haut, insbesondere durch UV-Strahlung
geschädigter Haut, und/oder zur Verbesserung oder Wiederherstellung
des Strahlens des Hautteints.
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Der
Wirkstoff kann auch mit wenigstens einem kosmetisch akzeptablen
Hilfsstoff gemischt und kann durch Auftragen dieser Zusammensetzung
auf die Körper- oder Gesichtshaut verwendet werden.
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So
betrifft die Erfindung auch eine kosmetische Zusammensetzung, die
wenigstens einen kosmetisch akzeptablen Wirkstoff sowie wenigstens
einen kosmetisch akzeptablen Hilfsstoff umfaßt und dadurch
gekennzeichnet ist, daß der Wirkstoff ein Pflanzenextrakt
ist, der aus wenigstens einer zur Gattung Citrus gehörenden Pflanze
oder aus einer Hybride aus der Kreuzung von Spezies, von denen wenigstens
eine zur Gattung Citrus gehört, insbesondere einer zur
Gattung x Citrofortunella gehörenden Pflanze gewonnen ist.
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Die
erfindungsgemäße kosmetische Zusammensetzung umfaßt
eine wirkungsvolle Menge des erfindungsgemäßen
Extraktes, um die gewünschte Wirkung zu erzielen.
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Unter „wirkungsvolle
Menge” wird, unter jedem Aspekt der Erfindung, eine Menge
verstanden, die wenigstens gleich der Menge ist, die erforderlich
ist, um dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen
oder dieses zu verzögern oder um deren Folgen zu mildern,
und/oder um geschädigte Haut, insbesondere durch UV-Strahlung
geschädigte Haut zu pflegen und/oder um das Strahlen des
Hautteints zu verbessern oder wiederherzustellen.
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Die
erfindungsgemäße kosmetische Zusammensetzung umfaßt
vorteilhafterweise 0,001 bis 5 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 0,01
und 3 Gew.-% der Zusammensetzung, an Wirkstoff.
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Sie
können auch vorteilhafterweise weitere Wirkstoffe umfassen,
die kosmetische Wirkungen aufweisen, welche denen der Erfindung ähnlich
sind und/oder diese ergänzen, insbesondere wenigstens einen
weiteren Wirkstoff, der zum Erhalt und/oder zur Unversehrtheit der
Struktur der Haut beiträgt, sowie wenigstens einen kosmetisch
akzeptablen Hilfsstoff, der insbesondere aus Pigmenten, Farbstoffen,
Polymeren, oberflächenaktiven Stoffen, Rheologiemitteln,
Duftstoffen, Elektrolyten, pH-Regulatoren, Antioxidantien, Konservierungsmitteln
und deren Mischungen ausgewählt sein kann.
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Die
erfindungsgemäße kosmetische Zusammensetzung kann
beispielsweise in Form eines Serums, einer Lotion, einer Emulsion,
beispielsweise einer Creme, oder aber eines Hydrogels, vorzugsweise
einer Maske formuliert sein oder in Form eines Sticks oder aber
eines Patches vorliegen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft schließlich eine Verwendung
des Extraktes, wie er oben definiert ist, als kosmetischer Wirkstoff,
der dazu bestimmt ist, dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung
vorzubeugen oder dieses zu verzögern oder die Anzeichen
zu behandeln, wobei der kosmetische Wirkstoff die Aktivität
der mitochondrialen Aconitase im Bereich der Zellen der Haut stimuliert.
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Die
Erfindung betrifft auch eine Verwendung des erfindungsgemäßen
kosmetischen Wirkstoffs für die Herstellung einer kosmetischen
Zusammensetzung, die dazu bestimmt ist, dem Auftreten von Anzeichen
der Hautalterung vorzubeugen oder dieses zu verzögern oder
deren Folgen zu mildern, und/oder die dazu bestimmt ist, das Strahlen
des Hautteints zu verbessern oder wiederherzustellen.
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Die
Erfindung betrifft schließlich ein kosmetisches Pflegeverfahren,
welches dazu bestimmt ist, dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung
vorzubeugen oder dieses zu verzögern oder deren Folgen
zu mildern, und/oder das für die Pflege geschädigter
Haut, insbesondere durch UV-Strahlung geschädigter Haut und/oder
zur Verbesserung oder Wiederherstellung des Strahlens des Hautteints
bestimmt und dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Verabreichung
einer wirkungsvollen Menge wenigstens eines kosmetisch akzeptablen
Wirkstoffs auf wenigstens einem betroffenen Bereich der Körper-
oder Gesichtshaut umfaßt, wobei der Wirkstoff ein Pflanzenextrakt
ist, der aus einer zur Gattung Citrus gehörenden Pflanze
oder aus einer Hybride aus der Kreuzung von Pflanzenspezies, von
denen wenigstens eine zur Gattung Citrus gehört, insbesondere einer
zur Gattung x Citrofortunella gehörenden Pflanze, und insbesondere
einer Pflanze der Pflanzenspezies x Citrofortunella microcarpa gewonnen
ist.
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Das
Verfahren ist vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß der
Wirkstoff, der in eine kosmetische Zusammensetzung eingebettet ist,
die ferner wenigstens einen kosmetisch akzeptablen Hilfsstoff enthält, durch
Auftragen der Zusammensetzung auf wenigstens einen betroffenen Bereich
der Körper- oder Gesichtshaut topisch verabreicht wird.
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Das
erfindungsgemäße Pflegeverfahren ist weiterhin
dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkstoffkonzentration
zwischen 0,001 und 5 Gew.-% der kosmetischen Zusammensetzung beträgt.
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Weitere
Ziele, Merkmale sowie Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden
erläuternden Beschreibung anhand mehrerer Ausführungsbeispiele
der Erfindung, die lediglich zur Veranschaulichung gegeben sind
und in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken
können, klar hervorgehen.
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In
der Beschreibung und insbesondere den folgenden Beispielen sind
die Prozentangaben Gewichtsprozente, ist die Temperatur in Grad
Celsius angegeben, ist der Druck der atmosphärische Druck,
es sei denn, es ist etwas anderes angegeben.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
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1 bezieht
sich auf die Modulation der mitochondrialen Aconitase-Aktivität
mit dem Alter, gemessen nach dem Kultivieren und Behandeln humaner
Fibroblasten von 20- und 70-jährigen Spendern, gemäß Beispiel
2: (A) Messung der mitochondrialen Aconitase-Aktivität
(vgl. Bsp. 2, Absatz 3); (B) Bestimmung der mitochondrialen Aconitase
durch Western-Blot (WB) (vgl. Bsp. 2, Absatz 4).
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2 bezieht
sich auf die Modifikationen des aktiven Zentrums der mitochondrialen
Aconitase mit dem Alter, gemessen nach dem Kultivieren und Behandeln
humaner Fibroblasten von 20- und 70-jährigen Spendern,
gemäß Beispiel 2; Auftrennung und Messung der
Formen mitochondrialer Aconitase durch Isoelektrische Fokussierung
(Immunoelectrofocusing (IEF)), anschließend durch Western-Blot
(Bsp. 2, Absatz 5).
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3 bezieht
sich auf die Messung der mitochondrialen Aconitase-Aktivität,
gemessen nach dem Kultivieren humaner Fibroblasten von 20- und 70-jährigen
Spendern, die entsprechend Beispiel 2 kultiviert wurden, dann Behandlung
mit einem 2,5%igen Calamondin-Extrakt für 48 Sunden (vgl.
Bsp. 2, Absatz 3).
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4 bezieht
sich auf die Detektion der oxidierten Proteine durch OxyBlot an
isolierten Mitochondrien (Beispiel 3) aus humanen Fibroblasten von
20- und 70-jährigen Spendern, die kultiviert, dann mit
einem 2,5%igen Calamondin-Extrakt, kosmetischen Wirkstoffen für
48 Stunden behandelt wurden (vgl. Bsp. 2).
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BEISPIELE
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Beispiel 1 – Zubereitung eines
Calamondin-Extrakts für die Durchführung der Tests
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Der
Extrakt von Calamondin (x Citrofortunella microcarpa) wird durch
Pressen ganzer Früchte der Pflanze hergestellt.
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Nach
dem Filtern und anschließendem Zentrifugieren wird das
Fruchtfleisch mittels eines Gemischs aus Wasser und Polyglycerin
extrahiert.
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Der
erhaltene Extrakt enthält 35 bis 45 Gew.-% Trockenmasse.
Dieser Extrakt wird als solcher zur Durchführung der Tests
der Beispiele 2 und 3 sowie für die Herstellung von kosmetischen
Zusammensetzungen, beispielsweise der des Beispiels 4 verwendet.
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Beispiel 2 – Messung der Aktivität
der mitochondrialen Aconitase in humanen Fibroblasten.
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MATERIAL UND METHODEN
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1. Kultivieren der humanen
Fibroblasten und Behandlung
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- Medien und Reagenzien
- Kulturmedium der Fibroblasten
- DMEM 1/ml Glucose (Gibco)
- + 10% FKS
- + 1% Natrium-Pyruvat 100 mM (Gibco)
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Wirkstoff-Stammlösungen
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Die
Stammlösung wird durch Verdünnung der Extraktlösung
in DMEM-Medium hergestellt (Gew.-%).
- – 6%iger
Extrakt von Calamondin im Medium, also etwa 2,4 Gew.-% Trockenmasse.
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a – Zellkultur und Behandlung
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- Humane Fibroblasten in Primärkultur, aus einer
Plastik eines 20-jährigen Spenders und eines 70-jährigen Spenders,
in Passage 12.
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Aussaat am Tag 0
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Fibroblasten
15·105 Zellen/Schale mit 75 cm2 in dreifacher Ausfertigung im DMEM-Medium
(10 ml/Schale)
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Behandlung am Tag 5
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Die
Stammlösung wird in dem DMEM-Medium verdünnt,
um die nachfolgend genannten Konzentrationen zu erhalten:
- – 2,5 Gew.-%iger Extrakt von Calamondin
im Medium, also etwa 1 Gew.-% Trockenmasse.
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Ernten der Zellen am Tag 7
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- Präparation der Mitochondrien
- 2 Spülungen mit PBS
- Auf einem Eisbett; Aufnahme in 2 ml Homogenisierungspuffer.
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b – Isolierung der Mitochondrien
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Für
jeden Spender beginnt man mit 32 T75-Schalen. Die konfluenten Zellen
werden zweimal mit dem PBS-Puffer pH 7.2 gewaschen (Puffer Natriumphosphat
pH 7.2–0,13 M NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 und 1,4 M KH2PO4) und werden abgekratzt, anschließend
bei 1500 g und 4°C für 5 Minuten zentrifugiert.
Der Zellrückstand wird mit dem PBS-Puffer gewaschen, erneut
zentrifugiert, dann in Eis gelegt. Der Rückstand wird in kaltem
Homogenisierungspuffer (0,3 M Mannitol, 0,1% BSA, 0,2 mM EDTA, 10
mM HEPES, einstellen auf pH 7.4 mit KOH, 5-faches Volumen des Rückstands)
aufgenommen, auf Eis mit einem 2 ml-Glashomogenisator homogenisiert.
Die Zellsuspension wird bei 1000 g und 4°C für
10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird erneut bei
10000 g und 4°C für 15 Minuten zentrifugiert.
Der Überstand enthält die zytosolische Fraktion,
der Rückstand stellt die mitochondriale Fraktion dar. Die
mitochondriale Fraktion wird zweimal mit dem kalten Homogenisierungspuffer
gewaschen. Die Proteinkonzentration wird nach der Bradford-Methode
gemessen.
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2. Quantitative Bestimmung der Proteine
(Bradford-Methode).
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a – Herstellen der Standardreihe
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- BSA-Stammlösung: 50 μg/ml (BIORAD; Standardprotein)
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| Proteine
(μg/Röhrchen) |
BSA
(μl) |
H2O (μl) |
| 0 |
0 |
800 |
| 1 |
20 |
780 |
| 2 |
40 |
760 |
| 3 |
60 |
740 |
| 4 |
80 |
720 |
| 5 |
100 |
700 |
| 6 |
120 |
680 |
| 8 |
160 |
640 |
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In
jedes Röhrchen werden 200 μl Coomassie Blau G250
zugegeben. Das Blau wird durch 1:5 Verdünnung der Stammlösung
frisch zubereitet.
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b – Herstellen der Proben
-
- – wenn die Proteinkonzentration > 3 mg/ml ist, werden
die Zellextrakte 1:100 verdünnt, dann werden 100 μl
der Verdünnung entnommen.
- + 700 μl MQ-Wasser
- + 200 μl Blau
-
- – wenn die Proteinkonzentration < 3 mg/ml ist, werden
10 μl Zellextrakt entnommen.
- + 790 μl MQ-Wasser
- + 200 μl Blau
-
c – Quantitative Bestimmung der
Proben
-
Die
Proben werden mittels eines Vortex homogenisiert, anschließend,
nach fünfminütigem Ruhen, wird die optische Dichte
mit dem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 595
nm abgelesen.
-
3. Bestimmung der mitochondrialen
Aconitase-Aktivität
-
a – Reagenzien
-
- – TRIS-Puffer 25 mM pH 7,5 (Sigma)
- – Natriumcitrat (Sigma)
- – Isocitrat-Dehydrogenase (Sigma)
- – MnCl2 (Sigma)
-
b – Prinzip der Bestimmung der
mitochondrialen Aconitase-Aktivität
-
Bestimmt
wird die mitochondriale Aconitase-Aktivität durch Messung
der Absorbanz bei 340 nm in einem Reaktionsmedium, das 0,2 mM NADP+, 5 mM Natriumcitrat und eine Einheit/ml
Isocitrat-Dehydrogenase in 25 mM Tris-HCl plus 0,6 mM MnCl2 und 0,05% Triton X-100 enthält.
-
Für
die Bestimmung werden 50 μg mitochondriale Proteine zu
1,0 ml Reaktionsmedium bei 25°C zugegeben. Die Messungen
bei 340 nm werden in 1 cm-Küvetten in Abständen
von 5 Minuten registriert, und die mitochondriale Aconitase-Aktivität
wird entsprechend der linearen Erhöhung der Absorbanz bei
340 nm über etwa 5 Minuten berechnet. Die Aktivität
wird unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten für NADPH
von 6,22 × 103 M–1 cm–1 und unter Annahme der Umwandlung
durch Isocitrat-Dehydrogenase eines Citratmoleküls in ein
NADPH-Molekül erhalten.
-
4. Bestimmung der mitochondrialen Aconitase
durch Western-Blot (WB).
-
a – Prinzip der Bestimmung
-
Die
Elektrophorese der Proteine wird in Polyacrylamid-Minigel mit einer
Dicke zwischen 1 mm und 1,5 mm, unter denaturierenden und reduzierenden
Bedingungen, im diskontinuierlichen Puffersystem nach der Laemmli-Methode
(Nature, 1970; 227, 680) durchgeführt.
Die Gele mit T = 12%, C = 2,7% ermöglichen, die Proteine
mit geringen Molekulargewichten (20 bis 120 kDa) aufzutrennen. Die
Gele mit T = 8%; C = 2,7% ermöglichen, die Proteine mit
hohen Molekulargewichten (35 bis 250 kDa) aufzutrennen.
-
Die
für die Herstellung der Gele erforderlichen Lösungen
werden in Anhang A vorgestellt.
-
Trenngel
-
Das
Gel wird wenigstens zwei Stunden vor der Migration gegossen.
-
Das
Gießen des Gels erfolgt mit Hilfe einer Pipette bis etwa
0,5 mm vom unteren Ende des für das Sammelgel vorgesehenen
Kamms. Es wird absolutes Ethanol an der Oberfläche zugegeben,
um eine gleichmäßige Basislinie (±1 ml/Gel)
zu erhalten.
-
Sammelgel
-
Das
Ethanol wird entfernt. 2,5 ml Gel werden mit Hilfe einer Pasteur-Transferpipette
aus Polyethylen (Biorad) gegossen, anschließend werden
die Kämme eingesteckt. Das Gel ist nach einer Stunde auspolymerisiert.
-
b – Herstellung der Proben
-
Die
mitochondrialen Proteine werden einer Elektrophorese auf Polyacrylamidgel
T = 12%, unter reduzierenden Bedingungen, nach Laemmli unterzogen.
Die Proben (25 bis 40 μg der Proteine) werden für
5 Minuten bei 100°C in dem Ladepuffer reduziert. Nach Laden
der Proben und der Marker vollzieht sich die Migration bei 200 V
für 1 Stunde in einem Puffer 50 mM Tris-HCl, 100 mM Glycin,
2 mM EDTA pH 8.4 mit 0,1% SDS.
-
c – Elektrophorese
-
Auftragungen
-
Die
Proben werden für 5 Minuten auf 95°C erhitzt.
-
Das
aufzutragende Volumen hängt von der gewünschten
Proteinmenge ab (maximales Volumen = 25 μL für
ein Gel von 1 mm und 40 μL für ein Gel von 1,5
mm). Die Referenzmenge beträgt 10 μg Proteine,
was 10 μl entspricht; sie wird dann entsprechend der Expression
des Zielproteins angepaßt.
-
Die
Kämme werden herausgenommen. Es werden 200 ml des Laufpuffers
1X auf die Gele, in das mittlere Fach zwischen den beiden Gelen,
dann zu einem Viertel in die Küvette gegossen.
-
Man
trägt die Proben mit Hilfe eines auf die Mikropipette aufgesetzten
spitz zulaufenden Endes sowie 10 μl vorgefärbte
Kontrollen mit niedrigen Molekulargewichten (Biorad, Prestained
SOS-PAGE Standards Low Range) oder mit hohen Molekulargewichten
(Amersham, Full Range Rainbow) auf.
-
Migration
-
Die
Elektrophorese wird bei Raumtemperatur, bei 200 V durchgeführt.
Sie wird gestoppt, wenn die Lauffront aus dem Gel ausgetreten ist
(etwa 40 Laufminuten).
-
Semi-Dry-Transfer der Proteine
auf Membran
-
Zwei
dicke Blätter Filterpapier (Biorad) und die Zellulosemembranen
(Biorad) werden in den Transferpuffer nach Towbin (PNAS,
1979, 76(9) 4350–4) getaucht (siehe Anhang B).
-
In
dem Gerät für den Semi-Dry-Transfer (Biorad) wird
ein befeuchtetes dickes Filterpapierblatt auf die Anode aufgelegt.
-
Sobald
die Migration abgeschlossen ist, wird das Sammelgel entfernt und
das Trenngel auf die Zellulosemembran aufgetragen. Die das Gel umfassende
Membran wird auf das Filterpapierblatt aufgelegt. Das zweite Filterpapierblatt
wird auf das Gel aufgelegt.
-
Im
Laufe der Herstellung des „Sandwich” wird dafür
Sorge getragen, daß alle Luftblasen mit Hilfe eines Glasstabs
entfernt werden, um den Transfer nicht zu stören. Das Gerät
wird durch einen von der Kathode gebildeten Deckel verschlossen.
Der Proteintransfer erfolgt bei 10 V für 90 Minuten.
-
Markieren mit Ponceau-Rot
-
Um
die Qualität des Transfers zu kontrollieren, werden die
Proteine mit Ponceau-Rot (Sigma) gefärbt. Die Zellulosemembran
wird mit MilliQ-Wasser gespült, dann einmal für
10 Minuten unter Rühren in ein Ponceau-Rot-Bad getaucht.
Anschließend wird sie in mehreren MilliQ-Wasser-Bädern
gewaschen, bis die Färbung lediglich auf den Proteinbanden
bestehenbleibt. Die Membran wird in einen Plastikbeutel gesteckt
und gescannt. Die Proteinbanden können quantifiziert werden,
um die Gesamtzahl der transferierten Proteine zu bestimmen.
-
Blockieren der unspezifischen
Bindungsstellen
-
Die
Membran wird unter Schütteln für eine Nacht bei
4°C oder für 90 Minuten bei. Raumtemperatur in eine
Lösung zum Blockieren der unspezifischen Bindungsstellen,
bestehend aus 5% Magermilch (Régilait) in PBS-T-Puffer
(vgl. Anhang B) (20 ml/Membran) gelegt.
-
Immundetektion
-
Die
Referenzen und die optimalen Verdünnungen der Antikörper
sind in Anhang C angegeben.
-
Nach
Blockieren der unspezifischen Stellen wird die Membran schnell in
PBS-T gespült. Diese Membran wird mit dem Primärantikörper,
der in PBS-T, je nach Antikörper mit oder ohne 5%ige (m/v)
Milch, auf die optimale Konzentration verdünnt ist, für
60 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur oder für
eine Nacht bei 4°C in Kontakt gebracht.
-
Anschließend
wird sie schnell, dann dreimal 10 Minuten in PBS-T gespült,
um den freien, nicht fixierten Antikörper-Überschuß zu
entfernen. Dann wird sie mit dem angemessenen Peroxidase-gekoppelten
Sekundärantikörper, der in dem PBS-T oder der
5%igen Milch (5 ml) verdünnt ist, unter Schütteln
bei Raumtemperatur in Kontakt gebracht. Nach 45-minütiger
Inkubation wird sie zweimal schnell gespült, dann fünfmal
für 5 Minuten mit PBS-T-Puffer und ein letztes Mal in PBS
1X gewaschen. Nach ihrem Abtropfen wird sie auf eine Lebensmittelfolie
(SARAN), Proteinseite nach oben, gelegt.
-
Die
Membran wird mit Hilfe eines hochempfindlichen Chemilumineszenz-Nachweiskits
(Amersham; ECL Western blotting) entwickelt, der Luminol als Substrat
der Peroxidase verwendet. Unter der Wirkung der Peroxidase und eines
Verstärkers wird das Luminol oxidiert und geht in einen
vorübergehenden erregten Zustand über. Die Rückkehr
in den Grundzustand erfolgt durch Emission von Photonen, die auf
einen auf die Membran aufgelegten autoradiographischen Film einwirken.
-
Es
wird 1 ml einer jeden der beiden Lösungen des Nachweiskits,
also 2 ml, das zum Bedecken der Membran erforderliche Mindestvolumen
gemischt. Alsdann wird das Gemisch gleichmäßig
auf die Membran gegossen und für genau eine Minute bei
Raumtemperatur in Kontakt gelassen. Die abgetropfte Membran wird in
eine Saran-Lebensmittelfolie gehüllt und unter Lichtabschluß in
eine Kassette eingebracht, anschließend mit einem vorgeblitzten
autoradiographischen Film (Amersham, Hyperfilm ECL) bedeckt. Nach
fünfminütiger Belichtung wird der autoradiographische
Film entwickelt. Falls erforderlich, kann ein neuer Film belichtet
werden, um das gewünschte Signal zu optimieren (bis zu
1 Std. Belichtungszeit). Die Banden werden mittels der Software
Gels Analysts 3.01 quantifiziert.
-
5. Bestimmung der mitochondrialen
Aconitase mittels IEF
-
Die
Technik ermöglicht, die drei Formen der mitochondrialen
Aconitase, die aktive Form [4Fe-4S]2+, die
inaktive Form [3Fe-4S]+ und die Apoenzym-Form,
entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt aufzutrennen.
-
50 μg
mitochondrialer Proteine werden auf ein IEF-Gel pH 3–10
(Biorad) aufgetragen. Die Migration erfolgt im Criterion-System
(Biorad) für 1 Stunde bei 100 V; 1 Stunde bei 250 V und
30 Minuten bei 500 V. Nach der Migration wird das Gel auf eine Nitrozellulosemembran
transferiert und ein Western-Blot mitochondriale Anti-Aconitase
gemäß dem in Absatz 4 beschriebenen Protokoll
durchgeführt.
-
ERGEBNISSE
-
Die
mitochondriale Aconitase-Aktivität wurde nach der Isolierung
der Mitochondrien aus diesen Zellkulturen gemessen. Es wird ein
Rückgang der mitochondrialen Aconitase-Aktivität
mit der Alterung nachgewiesen.
-
Diese
Messungen zeigen eine Abnahme der Aktivität der mitochondrialen
Aconitase in den Mitochondrien der 70-jährigen Spender
um etwa 85% im Vergleich zu den 20-jährigen Spendern (vgl. 1).
-
Jedoch
gibt es keine signifikanten Unterschiede bei der Expression des
Enzyms, das heißt im Bereich der in den jungen und in den älteren
Fibroblasten vorliegenden Enzymmenge (vgl. 1).
-
Um
zu prüfen, ob der bei den älteren Fibroblasten
nachgewiesene Rückgang der Aktivität der mitochondrialen
Aconitase nicht auf oxidative Schäden im Bereich des Fe-S-Zentrums
des Enzyms zurückzuführen war, wurde eine Auftrennung
der drei Strukturformen des Enzyms (Apoenzym, aktive Form und inaktive Form)
entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt mittels isoelektrischer
Fokussierung (IEF) durchgeführt. Mit Hilfe dieser Methode
wird ein Unterschied mit dem Alter im Bereich des Apoenzyms nachgewiesen;
es gibt jedoch keinerlei Unterschied im Bereich der anderen Formen
(vgl. 2).
-
Wir
haben gezeigt, daß die Aktivität der mitochondrialen
Aconitase mit dem Alter in kultivierten humanen dermalen Fibroblasten
zurückging. Dieser Aktivitätsrückgang
geht nicht mit einer Änderung der Expression des Proteins
mit dem Alter einher. Von diesem Ergebnis ausgehend haben wir die
Wirkung der getesteten Wirkstoffe auf die Aktivität der
mitochondrialen Aconitase in von diesen Spendern unterschiedlichen
Alters stammenden dermalen Fibroblasten gekennzeichnet (vgl. 3 und
Tabelle 1).
-
Die
Ergebnisse sind in Prozent bezogen auf die Aktivität der
mitochondrialen Aconitase in unbehandelten Fibroblasten eines jungen
Spenders (20 Jahre), die die 100% darstellt, ausgedrückt.
| | unbehandelt
(%) | Calamondin |
| 20
Jahre | 100 | 97 |
| 70
Jahre | 18 | 108 |
Tabelle
1: Aktivität der mitochondrialen Aconitase von Fibroblasten
von Spendern im Alter von 20 Jahren und 70 Jahren.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, daß eine Behandlung mit diesen Extrakten
ermöglicht, die mitochondriale Aconitase vor der Wirkung
von Oxidantien zu schützen. 48 Stunden nach Behandlung
der Fibroblasten von 20-jährigen Spendern mit diesen Extrakten
wird hingegen keine signifikante Aktivierung der mitochondrialen Aconitase
beobachtet. Die gleiche Behandlung an Fibroblasten von 70-jährigen
Spendern führt dagegen zu einem vollständigen
Schutz des Enzyms.
-
Beispiel 3 – Nachweis der oxidierten
Proteine mittels OXYBLOT
-
a – Prinzip
-
Die
Carbonylgruppen (Marker der Oxidation), die mittels der ROS oder
anderer Oxidationsmechanismen, wie der Glykation/Glycoxidation oder
aber der Lipoperoxidation, in die Proteinketten eingebaut sind,
werden gemäß einem site-spezifischen Mechanismus
nachgewiesen.
-
Die
Carbonylgruppen in den Ketten reagieren mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin
(DNPH), um ein Hydrazonderivat zu liefern. Die DNP-Derivat-Proben
werden an einem Polyacrylamidgel durch Elektrophorese aufgetrennt.
An die Auftrennung schließt sich ein Transfer auf eine
Nitrozellulosemembran wie beim Western Blot an. Die Membran wird
dann in Anwesenheit des ersten Antikörpers inkubiert, der
spezifisch ist für das an die eine Carbonylgruppe besitzenden
Proteine gebundene DNP-Molekül. Der folgende Schritt ist
die Inkubation mit dem Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper
anti-Primärantikörper (Anti-Kaninchen). Der Nachweis erfolgt
mit Hilfe der gleichen Reagenzien wie beim Western Blot.
-
b – Protokoll
-
Alle
verwendeten Reagenzien stammen vom OXYBLOT-Kit (Appligene-Oncor,
France).
-
Denaturierung der Proben
-
Man
verwendet eine Proteinmenge zwischen 15 und 20 μg, was
2 μg pro Auftrag entspricht, die aus den Lysaten von Mitochondrien
stammen, welche in 5 μl des gemäß Beispiel
2 erhaltenen Zellextrakts (Material und Methoden, Absatz 1) enthalten
sind. Es werden 10 μl DNPH in einfacher Konzentration,
dann 5 μl 12%iges SDS zugegeben; man läßt
für 15 Minuten bei Raumtemperatur reagieren. Es werden
7,5 μl neutralisierende Lösung sowie der 1 × Probenpuffer
zugegeben. Die Proben sind bereit, aufgetragen zu werden.
-
Die
Proteine werden schließlich durch Elektrophorese auf 12%igem
SDS-Acrylamid-Gel aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran
transferiert.
-
Antigen-Antikörper-Reaktion
-
Die
abgeleiteten Carbonyle werden mit einem Anti-DNP-Kaninchen-Primärantikörper,
1/150 verdünnt, und einem anti-Kaninchen-Sekundärantikörper
nachgewiesen. Man verwendet den ECL-Kit (Amersham), um die Peroxidase
mit Hilfe ihres Substrats nachzuweisen.
-
ERGEBNISSE
-
Es
wird eine Zunahme der oxidierten Proteine mit dem Alter beobachtet
(4). Jedoch ermöglicht die Behandlung
der älteren Fibroblasten mit dem Calamondin-Extrakt, wieder
ein Niveau oxidierter Proteine zu erreichen, das dem der jungen
Fibroblasten entspricht. Diese Ergebnisse zeigen, daß der
obenerwähnte Extrakt eine antioxidative Aktivität
gegenüber den oxidierten Proteinen der Haut besitzt.
-
Beispiele kosmetischer Formulierungen
-
Beispiel 4: kosmetische Zusammensetzung,
die einen Extrakt aus Früchten von Calamondin umfaßt.
-
Der
in Beispiel 1 erhaltene Extrakt wird als solcher in der nachfolgenden
kosmetischen Zusammensetzung verwendet:
| – Pflanzenextrakt
von Calamondi oder Calamansis (Bsp. 1) | 0,1% |
| – oberflächenaktives
Mittel (Arlacel® 165 VP) | 5% |
| – Cetylalkohol
95% | 1% |
| – Stearylalkohol | 1% |
| – Bienenwachs | 1,5% |
| – Öl
(Perleam®) | 8,5% |
| – Caprat/Caprylat-Triglyceride | 3% |
| – Silikonöl
(Dimethicon 100 CS) | 1% |
| – Polymer
(Keltrol®) | 0,35% |
| – Natriumcarbonat | 0,04% |
| – Tetranatrium-EDTA
Pulver | 0,1% |
| – Konservierungsmittel | 0,5% |
| – Wasser | qs
100 |
-
Die
kosmetische Zusammensetzung wird auf übliche, seitens des
Fachmannes wohlbekannte Weise durch Mischen der verschiedenen Bestandteile
in einem oder mehreren Schritt(en) hergestellt.
-
Diese
Zusammensetzung kann über mehrere Wochen täglich
auf die Gesichtshaut aufgetragen werden, um die zuvor erwähnten
kosmetischen Anti-Aging-Wirkungen zu erzielen und einen wieder strahlenden Hautteint
herzustellen.
-
ANHANG A
-
I – Puffer und Lösungen,
die für die Elektrophoresegels unter denaturierenden und
reduzierenden Bedingungen, im diskontinuierlichen Puffersystem verwendet
werden
-
Monomer-Lösung:
-
- Acrylamid/Bis-acrylamid, T = 30%, C = 2,67% (Biorad)
- Trenngelpuffer: Tris-HCL 1,5 M pH 8,8.
| – 18,15
g Tris-Base (Sigma) für 100 ml destilliertes Wasser |
| – pH
eingestellt auf 8,8 mit HCl 12 N |
- Sammelgelpuffer: Tris-HCL 0,5 M pH 6,8.
| – 6
g Tris-Base für 100 ml destilliertes Wasser |
| – pH
eingestellt auf 6,8 mit HCl 12 N |
- Laufpuffer 10X: Tris 0,25 M pH 8,3, Glycin
1,92 M; SDS 1%
| – Tris-Base |
12
g |
| – Glycin
(Research Organics Inc) |
57,6
g |
| – SDS
10% (Sigma) |
40
ml |
| – Destilliertes
Wasser |
qs
400 ml |
- Ammoniumpersulfat: (NH4)2S2O8:
(Sigma) 10%ig (w/v), also 100 mg/ml
- Reduzierender
Probenpuffer nach Laemmli 2X: Tris-HCL 0,06 M pH 6,8; SDS 2,3%;
Glycerin 10%; Bromphenolblau 0,02%
| – Sammelgelpuffer
Tris 0,5 M pH 6,8 |
6,25
ml |
| – SDS
10% |
11,50
ml |
| – Glycerin |
5
ml |
| – Destilliertes
Wasser |
qs
50 ml |
- Bromphenolblau 10X (gesättigte
Lösung):
-
Eine
Spatelspitze Bromphenolblau wird in 5 ml Laemmli 2X-Puffer dispergiert.
Nach dem Rühren, Ultraschallbehandlung und anschließendem
Zentrifugieren wird der Überstand abgenommen.
-
II – Elektrophoresegels
-
– Herstellung des Trenngels T
= 12%
| Lösungen | Volumina
für 2 Gele | Endkonzentration |
| | (10
ml) | |
| Monomerlösung | 4,0
ml | 12%T;
2,7% C |
| Trenngelpuffer | 2,5
ml | 0,375M |
| SDS
10% | 100 μl | 0,1% |
| Ammoniumpersulfat
(10%) | 50 μl | 0,05% |
| TEMED
(Research Organics Inc) | 5 μl | - |
| Destilliertes
Wasser | 3,4
ml | - |
– Herstellung des Sammelgels
T = 8%
| Lösungen | Volumina
für 2 Gele (5 ml) | Endkonzentration |
| Monomerlösung | 2
ml | 8%T;
2,7% C |
| Trenngelpuffer | 1,25
ml | 0,375M |
| SDS
10% | 50 μl | 0,1% |
| Ammoniumpersulfat
(10%) | 25 μl | 0,05% |
| TEMED
(Research Organics Inc) | 5 μl | - |
| Destilliertes
Wasser | 4,2
ml | - |
-
ANHANG B
-
Lösungen für den Transfer
und die Immundetektion
-
Transferpuffer nach Towbin:
-
- Tris-HCL 25 mM, pH 8,3; Glycin 192 mM; 20% Methanol
-
| – Tris-Base |
3,03
g |
| – Glycin
(Research Organics Inc) in 100 ml destilliertem Wasser zu lösen |
14,4
g |
| – Methanol |
200
ml |
| – Destilliertes
Wasser |
qs
1000 ml |
-
PBS-T-Puffer
-
- 1/10-Verdünnung des PBS 10X (Invitrogen)
- + 0,1%iges Tween 20 (Sigma)
-
Ponceau-Rot (Sigma)
-
- 0,1%ige (w/v) Lösung in einer 5%igen Essigsäurelösung
-
ANHANG C
-
Liste Primär- und Sekundärantikörper
| Antikörper | Referenz | Verdünnung | Inkubationszeit |
| humane
Anti-Aconitase | nicht
kommerziell erhältlich (vgl. nachstehende Ref.) | 1:1000 | 1
Stunde |
| Anti-Kaninchen
IgG HRP | Amersham | 1:50000 | 1
Stunde |
- Ref.: Bulteau et al. Biochemistry,
2003; 42, 14846–14855
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - JP 2003-199527 [0025]
- - JP 2005029491 [0026]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Harman D.,
J. Gerontol., 1956; 11, 298–300 [0003]
- - Cadenas E. et al., Free Radic. Biol. Med., 2000; 29, 222–230 [0004]
- - Cadenas et al., supra [0005]
- - Bulteau et al., Exp Gerontol, 2006, 41; 653–657 [0006]
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